NO158380B - Nye 10-(1,2-propadienyl)steroider og antikonsepsjonsmidler inneholdende disse. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår nye 10-(1,2-propadienyl)-steroider som er irreversible inhibitorer av aromatase-. enzymer, og antikonsepsjonsmidler inneholdende disse.

Innbyrdes forskjellige kjønnshormoner som syntetiseres av kjønnskjertlene og i mindre grad av binyrene er i første rekke ansvarlig for tilkjennegivelsen av sekundær kjønnska-rakteristikk av enten menn eller kvinner. Disse steroider reguleres av et flertall enzymer. Enzymaromatase er det hastighetsbegrensende enzym i omdannelsen av androgener (mannlige hormoner) til østrogener (kvinnelige hormoner). Den ikke-reversible omdannelse av androgener til østrogener innbefatter også oxydasjonen og elimineringen av methylgrup-pen fra CIO som maursyre. 1(3- og 23 hydrogenene fra Cl og C2 tapes også under dannelse av den aromatiske A-ring i øs-trogenene. Androgenene, testosteron og androstendion, eller østrogenene, østradiol og østron kan mellomomdannes av 170-hydroxy-steroid-dehydrogenase (fig. 1).

Reguleringen av omdannelsen av androgen til østrogen eller inhiberingen av denne omdannelse har anvendelse ved regulering av kliniske tilstander som potensieres av nærværet av østrogener.

Aromataseinhibitorer har vist seg å være effektive ved behandling av mannlig sterilitet og når det gjelder forhind-ring av den østrogenproduksjon som er nødvendig for eggløs-ning hos kvinner. Da østrogensyntesen er nødvendig for im-plantering av befruktet egg i mange arter, har postcoital administrering av aromataseinhibitorer den styrke at de regu-lerer befruktningen.

Oppfinnelsen angår således nye 10-(1,2-propadienyl)-steroider, hvilke steroider er kjennetegnet ved at de har generell formel I

hvori betegner en enkelt- eller dobbeltbinding, og R5 er oxygen eller to hydrogenatomer.

Forbindelsene kan fremstilles som beskrevet i norsk

utlegningsskrift 156.694.

De nye forbindelser har en høy affinitet overfor aromatase-enzymer. I tillegg bindes aromatase-inhibitorene til enzymet på en tidsavhengig måte og inaktiverer derved enzymet progressivt.

Den aromataseinhiberende virkning av forbindelsene kan studeres under anvendelse av et radioenzymatisk forsøk. Et aromataseenzympreparat fra microsomalfraksjonen isolert fra human placenta anvendes. Stereospesifikk eliminering av 10 og 23 tritiummerker fra androgensubstrater slik som testosteron eller androstendion og efterfølgende tilsynekomst av tritiert vann anvendes for å måle graden av enzymreaksjon under in vitro inkuberinger.

Aromataseinhibitorene ble vurdert med hensyn til enzymaffinitet ved måling av deres konkurrerende inhibering av omdannelsen av 3 H-testosteron til østrogener. 13,2(3- 3H-testosteron (40 -- 60 Ci/mM spesifikk aktivitet) ble oppløst i en prøvebuffer for å gi en prøvekonsentrasjon på 1,7 x 10 -9M med ca. 200000 disintegrasjoner pr. minutt i 100 jul. Prøve-buffer inneholder 100 mM KC1, 10 mM KH2P04, 10 mM dithio-threitol og 1 mM EDTA ved pH 8,0. ^10 mg inhibitorforbindel-ser ble oppløst i ethanol og/eller dimethylsulfoxyd og fortynnet med prøvebuffer under dannelse av prøvekonsentrasjo--4 -9

ner varierende fra 10 M til 10 M. 100 jul tritium-merket testosteron (substrat) og 100 / a1 enzyminhibitor ble tilsatt til et 35 ml's sentrifugerør inneholdende 600 /^l av et NADPH utviklende system. Aromatase krever NADPH som cofaktor, og derfor er et utviklende system innbefattet som anvender 0,5 mM NADF<+>, 2,5 mM glucose-6-fosfat, og 1,0 enhet/ml glucose-6-fosfatdehydrogenase i prøvebuffer. Enzymreaksjonen startes ved tilsetning av 700 jj. 1 aromatasepreparat, vanligvis 50 g microsomalt protein pr. ml prøvebuffer. Disse preparater blandes under anvendelse av en hvirvelblander og inku— beres 30 minutter ved 37°C med en 95 % 02:5 % C02 gassfase i en Dubinbff risteinkubator.

Den enzymatiske reaksjon avsluttes ved tilsetning av 10 ml CHCl-j. Ef ter hvirvelblanding 20 sekunder dispergeres de vandige/organiske emulsjoner, og faseseparasjon ble opp-nådd efter sentrifugering ved 600 x g i 10 minutter. Doble 500. / Al' s prøver av den øvre vandige fase av hver inkuberings-prøve ble tilsatt til 10 x 75 mm dyrkningsrør. Til disse rør ble tilsatt 500 ^1 kold 0,25 % dextran-belagt kullsuspen-sjon, denne ble hvirvelblandet og inkubert 15 minutter ved 4°C, og derefter sentrifugert ved 2600 x g i en avkjølt sentrifuge (4°C). Supernatantfraksjonen ble dekantert i en 20 ml's scintillasjonsampulle, og 15 ml vandig scintilla-sjonsvæske ble tilsatt. Radioaktiviteten av 3 H^ O resulterende fra frigitte 1 og 2 tritiumatomer under den enzymatiske reaksjon ble bestemt ved telling 10 minutter i en væske-scintillasjonsteller. Denne prøveprosedyre er bearbeidet efter prosedyrene beskrevet av Reed et al, J. Biol. Chem., 251, 1625 (1976) og Thompson et al, J. Biol. Chem., 249, 5364 og 5374 (1974) .

Den enzymatiske aktivitet står i forbindelse med prosenten av tritium som frigis fra <3>H-testosteron som kommer tilsyne som <3>^O. Aktiviteten av hver konsentrasjon av inhibitor beregnes som en prosent av bærerkontrollen, som vilkårlig er satt til 100 %. Den molare konsentrasjon av hver inhibitor som reduserer enzymaktiviteten med 50 % kal-les 50 % inhiberingskonsentrasjon, IC^q. Disse verdier for en inhibitor ifølge oppfinnelsen, 10-(1,2-propadienyl)østr-4-en-3,17, og referanseforbindelsene aminoglutethimid, androsta-1,4,6-trien-3,17-dion og 1-dehydrotestololacton, er vist i tabell 1. 10-allenylforbindelsen har større enzymaffinitet enn andre kjente inhibitorer, som har vært anvendt som befruktningshindrende midler i gnagere.

Forbindelsene som utviste god inhibering, IC5Q 10 ^M, ble vurdert med hensyn til tidsavhengig inhibering. I dette forsøk ble inhibitoren preinkubert med enzymet før prøving for enzymaktivitet i nærvær av høye substratnivåer. En tidstilknyttet nedsettelse i enzymaktivitet er indikativ for irreversibel binding av inhibitoren med enzymet.

I det tidsavhengige forsøk tilsettes en mengde av enzym-inhibitoren i 100 /<1 av den tidligere beskrevne prøvebuffer som vil gi prøvekonsentrasjoner som er ca. én og ti ganger ICj-0 verdiene til 35 ml' s sentrif ugerør inneholdende 600 f* l av det ovenfor beskrevne NADPH utviklende system. Preinku-beringen startes ved tilsetning av 700 yu.1 aromatasepreparat, vanligvis 500 - 800 ^g av microsomaltprotein pr. ml prøve-buffer. Disse preparater blandes under anvendelse av en hvirvelblander og inkuberes 0, 10, 20 eller 40 minutter ved 25°C. Derefter tilsettes 100 1 1B,20-<3>H testosteron i prøvebuffer for å gi en prøvekonsentrasjon av substrat

-7

(4,5 x 10 M) som er minst ti ganger Km for testosteron (0,045 ^M). Efter hvirvelblanding fortsettes enzyminkuber-ingen 10 minutter før den avsluttes ved tilsetning av kloro-form. Mengden av radioaktivitet i den vandige fraksjon bestemmes ved scintillasjonsprosedyrer. Den enzymatiske aktivitet beregnes fra prosenten av <3>H-testosteron omdannet til. <3>H20. Enzymaktiviteten for hver konsentrasjon av inhibitor ved hver preinkuberingsperiode beregnes som en prosent av "0" minuttet for bærerkontrollen vilkårlig satt til 100 %. Den prosentvise inhibering uttrykkes derfor som en prosent av 100 % enzymaktivitetsverdien.

Forbindelser som viser tidsavhengig inhibering ble derefter undersøkt for å fastslå inh:'.beringskonstanten K^, som er den tilsynelatende dissosiasjonskonstant for enzym-inhibitorkomplekset. Denne bestemmelse krever målinger ved begynnelseshastigheter for enzymreaksjon. Enzymaktiviteten bestemmes efter forskjellige preinkubasjonstider ved forskjellige inhibitorkonsentrasjoner når den prøves ved en substratkonsentrasjon på minst ti ganger Km for testosteron. Enzymhalveringstiden (t-jy2) vec^ disse forskjellige inhiber-ingskonsentrasjoner ( [In]) anvendes for å bestemme K^ ved lineær regresjonsutligning av t^y2 vs. l/[In]. K.^ er ekvi-valent med inhibitorkonsentrasjonen når t^y2 er lik 0- Re~ sultatene av de tidsavhengige forsøk er vist i tabell 2.

Tabell 2 viser den prosentvise inhibering efter forskjellige preinkubasjonstider før tilsetning av det merkede substrat, for forskjellige konsentrasjoner av 10-(l,2-pro-padienyl)-østrendion og referanseforbindelser. Allenylforbindelsen utviser signifikant tidsavhengig inhibering av aromatase ved meget lave konsentrasjoner, dvs. 0,01-0,05 ^M. Basert på disse aktiviteter kan det fastslåes at 10-(1,2-propadienyl)østrendion har bedre aktivitet til kjente tera-peutiske midler som anvendes ved brystkreftterapi og som også inhiberer aromatase.

K.^ for 10-(1,2-propadienyl)østrendion er 1,4x10 — 8M. Disse data indikerer at denne inhibitor er irreversibelt bun-det til enzymet med en affinitet for enzymsetet som er tre ganger større enn verdien for det naturlige substrat testo-_Q steron, som har en enzymaffinitet (Km) på 4,4 8 x 10 M. Enzymaktiviteten for 10-allenylforbindelsen overstiger enzymaffiniteten av androsta-1,4,6—trien-3,17-dion med en faktor på 8.1, overstiger aktiviteten av 1-dehydrotestololacton med 58,1 og anlnciglutethimid med 1.491,2.

Disse data viser at 10-(1,2-propadienyl)østr-4-en-3,17-dion er overlegent overfor kjente aromataseinhibitorer.

Generelt kan forbindelsene av formel I administreres analogt med kjente aromataseinhibitorer slik som androsta-1,4,6-trien-3,17-dion, testololacton eller aminoglutethimid. De kan administreres oralt eller parenteralt enten i fast eller flytende form, og i nærværet av en farmasøytisk akseptabel bærer om ønsket. Faste doseringsformer.slik som f.eks. kapsler, piller, tabletter og lignende er egnede. Individuelle faste doseringsenheter kan inneholde, i tillegg til de aktive bestanddeler, en farmasøytisk akseptabel bærer, f.eks. stivelse, sukker, sorbitol, gelatin, smøremidler, sili-ciumsyre, talkum og lignende. Alternativt kan væskedoserings-former enten for oral administrering eller sterile injiserbare oppløsninger anvendes. Mer enn én administreringsform kan anvendes hvor slike finnes å være nyttige.

Oral administrering av forbindelsene utføres med fordel med kapsler eller tabletter med individuelle doseringsenheter inneholdende fra 1,0 til 250 mg av aromataseinhibitoren, fortrinnsvis fra 10 til 50 mg. En daglig dose på fra 50 til 1000 mg, fortrinnsvis fra 10 til 150 mg, anbefales.

Forbindelsene av formel I kan også admini-

streres som væskesuspensjoner eller oppløsninger under anvendelse av en steril væske slik som olje, vann, en alkohol, eller blandinger derav, med eller uten tilsetning av et farma-søytisk egnet overflateaktivt middel, suspenderingsmiddel eller emulgeringsmiddel for oral eller parenteral administrering .

De etterfølgende eksempler illustrerer oppfinnelsen.

I eksemplene er alle temperaturer angitt i °C, og alle deler og prosenter er på vektbasis.

EKSEMPEL 1 Fremstilling av 10-(1,2-propadienyl)østr-4-en- 3, 17- dion ( 5)

1,8 g (4,4 mmol) 3,17-bis(ethylendioxy)-19-ethynyl-androst-5-en-19-ol 2 (Covey et al, Tet.Let. 2105 (1979)) i 20 ml pyridin ble avkjølt til 0°C og derefter behandlet med

700 mg (6 mmol) methansulfonylklorid. Blandingen ble holdt ved -20°C 48 timer, derefter fortynnet med ether og vasket med IN HC1, mettet NaHC03 og saltvann, og ble derefter tør-ket og konsentrert.

Det resulterende urene mesylat 3 ble oppløst i 50 ml toluen og avkjølt til -70°C, derefter behandlet med 2 ml (70 % i benzen) natrium bis(methoxyethoxy)-aluminiumhydrid og fikk stå 12 timer ved -20°C. Vann ble derefter forsiktig tilsatt, og blandingen ble ekstrahert med ether. Etheropp-løsningen ble vasket med IN HC1, og vandig NaHC03, derefter tørket og konsentrert under dannelse av et residuum som ble renset ved krorcatografi på silicagel i ethylacetat/hexan under dannelse av allen 4.

Allenet 4 ble oppløst i 30 ml aceton, 50 mg p-toluen-sulfonsyre ble tilsatt, og oppløsningen omrørt over natten ved romtemperatur og derefter konsentrert. Residuet ble tatt opp i ether, vasket med vandig natriumbicarbonat, tørket, konsentrert og kromatografert på silicagel. Diketonproduktet ble ytterligere renset ved omkrystallisering fra hexan under dannelse av produkt 5 sam farveløse krystaller med sm.p. 104 - 105°C.

EKSEMPEL 2 Fremstilling av 10-(1,2-propadienyl)østra-4, 6- dien- 3, 17- dion ( 10)

En blanding av 250 mg diketon 5 og 460 mg kloranil i 17 ml t-butylalkohol ble oppvarmet ved tilbakeløpskokning 3 timer. Blandingen ble fortynnet med ethylacetat og filtrert. Filtratet ble vasket med IN NaOH og saltvann, derefter tørket og konsentrert. Kromatografi av residuet på silicagel under anvendelse av ethylacetat/hexan gav produktet 10 som ble omkrystallisert fra diklormethan/hexan, sm.p. 152 - 154°C.

EKSEMPEL 3 Fremstilling av 10-(1,2-propadienyl)ø str-4-en-3, 6, 17- trion( 19)

80 mg ketol 18 ble oppløst i 50 ml benzen, 15 mg p-to-luensulfonsyre ble tilsatt, og blandingen ble oppvarmet ved tilbakeløpskokning 30 minutter under anvendelse av en Dean-

Stark vannseparator. Den avkjølte oppløsning ble derefter vasket med vandig Na2C03 og saltvann, derefter tørket og for-■ dampet. Residuet ble omkrystallisert fra diklormethan/hexan under dannelse av trion 19; sm.p. 18 7 - 190°C.

EKSEMPEL 4 Tablettformulering

En illustrativ tablettformulering egnet for anvendelse som antikonsepsjonsmiddel, er som følger.

En granulering erholdt efter blanding av lactosen med endel av stivelsen og en granulert stivelsespasta fremstilt av resten av stivelsen tørkes, siktes og blandes med de aktive bestanddeler (a) og (b) og magnesiumstearatet. Blandingen presses til 1000 tabletter, som hver veier 218 mg.

Claims (3)

1. Nye 10-(1,2-propadienyl)steroider, karakterisert ved at de har generell formel I hvori betegner en enkelt- eller dobbeltbinding, og R g er oxygen eller to hydrogenatomer.

2. 10-(1,2-propadienyl)steroid ifølge krav 1, karakterisert ved at dette er 10-(1,2-propadienyl)østr-4-en-3,17-dion.

3. Antikonsepsjonsmidler, karakterisert ved at de som aktiv bestanddel inneholder et 10-(1,2-propadienyl)steroid ifølge hvilket som helst av kravene 1-2.