NO158004B - Fremgangsmaate for fremstilling av et preparat med cytolytisk aktivitet. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for fremstilling av et preparat med cytolytisk aktivitet overfor prokaryotiske og eukaryotiske celler.

Et fyldig bevismateriale har vist at kombinasjonen

av Visse peroxydaser med hydrogenperoxyd og et halogenidion gir et system med sterke cytotoxiske egenskaper. Myeloperoxydase-hydrogenperoxyd-kloridsystemet danner et kraftig cytotoxisk system som er effektivt overfor bakterier, sopp, virus, mycoplasma og forskjellige pattedyrceller. På lignende måte har lactoperoxydase-hydrogenperoxyd-thiocyanatsystemet og pepperrotperoxydase-hydrogenperoxyd-kloridsystemet vist seg å ha kraftig cytotoxisk aktivitet.

Et like cytotoxisk system erholdes når man i stedet for hydrogenperoxyd anvender et hydrogenperoxyd-utviklende system. Således gir glucoseoxydase-pepperrotperoxydase-kloridkombinasjonen et kraftig cytotoxisk system ved tilsetning av glucose. Galactoseoxydase og xanthinoxydase har også vist seg å være effektivt i dette henseende. Ennvidere er det vist at den endogene NADH-oxydase-aktivitet av pepperrotperoxydase også er istand til å aktivere den cytotoxiske aktivitet av enzymet i nærvær av kloridioner.

En stor mengde av bevismateriale indikerer at cytotoxiske systemer slik som de ovenfor beskrevne kan være opera-tive i polymorfonucleare leukocyter, eosinofiler, macrofager og andre celletyper med cytotoxiske egenskaper. Slike celler synes generelt å anvende en NADH-eller NADPH-oxydase som det peroxyd-utviklende enzym.

Macrofager er en nødvendig komponent ved forsterk-ningen av naturlig celledreperaktivitet av Bacillus Calmette-Guerin (BCG) i mus. BCG øker også peroxyd-og superoxyd-produk-sjonen i macrofager. Det eksisterer således en mulighet for at peroxydasesystemet hos macrofagene spiller en rolle ved for-sterkningen av den naturlige celledreperaktivitet. På lignende måte inneholder perifere lymfocyter, som i overveiende grad er T-celler, en cytotoxisk peroxydase. K jemilumin.escens resulterende fra peroxyd-utviklende oxydativ metabolisme observeres når T-lymfocyter stimuleres av Concanavalin A. Ennvidere be-virker immunisering av mus med enten løselige eller partikkel-formede antigener en økning i peroxydaseaktivitet i milten som går forut for utviklingen av spesifikt antistoff. Disse obser-vasjoner antyder at oxydase-og/eller peroxydaseaktivitet på

en eller annen måte er involvert i utvikling av spesifikke immunresponser.

Hittil har ingen av de cytotoxiske systemer som ovenfor beskrevet vært anvendt i noen in vivo-forsøk. Imidlertid har enkelte relevante forsøk vært foretatt for en viss tid siden av Schultz et al. Schultz, Snyder, Wer, Berger og Bonner; Chemical Nature and Biological Activity of Myeloperoxydase: Molecular Basis of Electron Transport, Academic Press, New York, N.Y., s. 301-321 (1972); og Schultz, Baker og Tucker; Myeloperoxidase, Enzyme-Therapy of Rat Mammary Tumors; Cancer Enzymology, Academic Press, New York, N.Y. s. 319-334 (1976).

Ved anvendelse av mus bærende 20-methylcholanthren-induserte tumorer injiserte disse forfattere myeloperoxydase i kombinasjon med thio-TEPA, et antitumorlegemiddel.. De observerte en signifikant reduksjon i tumorvekst i den behandlede mus, men ingen fullstendig tilbakedannelse. Verken myeloperoxydase eller thio-TEPA alene var effektive til å redusere tumorvekst. Inhiberingen av tumorvekst varte så lenge som behandlingen med myeloperoxydase og thio-TEPA ble fortsatt.

Disse resultater indikerte at aktiviteten av myeloperoxydase kunne spille en rolle ved regulering av tumorvekst, enten direkte eller indirekte. Sikre konklusjoner er vanskelig å trekke på grunnlag av slike eksperimenter da den biologiske halveringstid til myeloperoxydase bare er ca. 24 timer. Det er verdt å legge merke til at den toxiske aktivitet syntes å være spesifikt rettet mot tumorvevet.

Ifølge oppfinnelsen er det tilveiebragt en fremgangsmåte for fremstilling av et preparat som utviser cytolytisk aktivitet overfor prokaryotiske og eukaroyotiske celler, og som er kjennetegnet ved at et første oxydaseenzym og et andre peroxydaseenzym som er istand til kjemisk å tverrbindes med det første enzym og med et protein, for eksempel bovint eller humant serumalbumin, hvorved begge enzymer forblir aktive, oppløses i en bufferoppløsning, hvoretter et polymeriserende middel tilsettes og løsningen polymeriseres,

og eventuelt nedfryses og lyofiliseres en uoppløselig gel isolert etter avkjøling av den polymeriserte oppløsning, og eventuelt oppmales gelen.

Ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen fremstilles det altså et preparat omfattende et første oxydase-enzym, ét andre peroxydase-enzym og et protein, hvilke første og andre enzymer og hvilket protein er kjemisk tverrbundet, og hvilket preparat utviser cytolytisk aktivitet overfor prokaryotiske og eukaryotiske celler.

Det fremstilte preparat er ment for anvendelse ved cytolyse av prokaryotiske og eukaryotiske celler i levende organismer. Preparatet fremstilles altså som en,blanding av et bæremedium og en sammensetning utvisende cytolytisk aktivitet overfor prokaryotiske og eukaryotiske celler, hvilken sammensetning er dannet ved oppløsning av et første oxydase-enzym, et andre peroxydase-enzym og et protein i en bufferløsning, og polymerisering av sammensetningen ved tilsetning av et polymeriseringsmiddel dertil. Ved anvend-elsen innføres preparatet i en levende organisme.

Det er således et mål ved oppfinnelsen å fremstille et preparat for anvendelse ved en fremgangsmåte for kontroll av tumorvekst og infektiøse sykdommer i pattedyr.

Det er funnet at flere peroxydaser, når slike anvendes i kombinasjon med et hydrogenperoxyd-og/eller superoxyd-utviklende system, utvikler en kraftig cytotoxisk aktivitet når de administreres til tumor-bærende dyr. Det er ytterligere blitt funnet at denne cytotoxiske aktivitet synes utelukkende å være rettet mot neoplastisk vev.

For å oppnå den tumoricidale aktivitet er det nød-vendig at de to enzymer holdes nært til hverandre og at enzymene er stabilisert slik at dette signifikant øker deres halveringstid in vivo. Begge disse krav kan oppfylles ved immobilisering av enzymene, enten separat eller i kombinasjon, på en uløselig bærer. Denne immobilisering kan foretas ved enten kjemisk festing av enzymmolekylene på den uløselige bærer eller ved innelukking av enzymmolekylene innen den. molekylære matriks av bæreren.

I denne beskrivelse menes med immobilisering for-bindelsene mellom aktive proteinmolekyler og et uløselig macro-molekyl på en hvilken som helst måte som forhindrer protein-molekylene fra å bevege seg bort fra den uløselige bærer. En uløselig forbindelse er definert som en forbindelse som ikke danner en virkelig løsning i et vandig medium ved fysiologiske pH-verdier; i det vandige media er vandige buffermedia såvel som hvilke som helst kroppsvæsker.. Forbindelser som danner colloidale løsninger i de ovenfor angitte vandige media be-traktes som å være uløselige forbindelser.

En eller flere injeksjoner av det ovenfor beskrevne immobiliserte enzymkonjugat i tumor-bærende dyr resulterer i en delvis eller fullstendig tilbakedannelse av tumorvevet. Det er fordelaktig at materialet injiseres i tumoren eller nær tumoren, imidlertid underkastes primære tumorer såvel som metas-taserte tumorer den cytotoxiske virkning av de immobiliserte enzymer.

Det er ytterligere funnet at de immobiliserte enzym-systemer virker som kraftige aktivatorer av den spesifikke immunrespons i tumor-bærende dyr. Denne aktivering av den spesifikke immunrespons kan derfor fullstendig eller delvis være ansvarlig for tilbakedannelsen av tumorene. På lignende måte resulterer injeksjonen av kraftige inhibitorer av den cytotoxiske aktivitet av det immobiliserte enzymsystem i en ned-settelse av den spesifikke immunrespons og gjør dyrene mer mot-takelige til å utvikle tumorvekst.

Det foregående indikerer at det immobiliserte enzymsystem forsterker og/eller aktiverer den naturlige mekanisme som kropper anvender for å eliminere overførte eller fremmede celler tilstedeværende i kroppen, mens inhibitorer av det cytotoxiske system er istand til å inhibere denne naturlige for-

svarsmekanisme til kroppen mot. veksten av abnormale celler.

Av hensiktsmessige grunner vil det uløselige tverrbundne cytotoxiske oxydase-peroxydasesystem

heretter bli angitt som "ICCOPS". I tillegg skal det også be-merkes at tre til fire ukers gamle Sprague-Dawley rotter hver ble injisert intraperitonealt med 0,5 til 1,0 ml Novikoff hepatonwsuspensjon. Tumorene fikk utvikles i fem dager eller inntil ascites ble fastslått. Ved dette tidspunkt ble enkelte dyr avlivet for å fastslå nærvær av tumor. De gjenværende tumor-bærende dyr ble deretter oppdelt i test-og kontrollgrup-per og behandlingen ble startet.

Fremstilling av ICCOPS

Det tverrbundne enzym ble fremstilt ved oppløsning av 10 mg pepperrotperoxydase og 300 mg kvegserumalbumin eller humant serumalbumin i en løsning inneholdende 2 ml glucoseoxydase (2400 enheter) og 2,5 ml av 0,1 M fosfatbuffer, pH 6,9. Polymeriseringen ble initiert ved tilsetning av 75 vil 25 %-ig glutaraldehyd til enzymløsningen. Blandingen ble inkubert i minst 24 timer ved 4°c eller inntil en gel ble dannet. Gelen ble senket i 100 ganger dets volum av destillert vann. Vannet ble dekantert fra og gelen ble ytterligere vasket med 100 ytterligere volumer destillert vann over et sintret glass-filter. Gelen ble deretter fryst og lyofilisert. Den lyo-filiserte gel ble malt i en morter med en støter til en stør-relse som passerte gjennom en 18 gauge hypodermisk nål når denne var svellet i fosfatbufret saltvann (PBS), pH 7,4.

Det pulverformede ICCOPS ble lagret ved -20°C inntil bruk.

Peroxydaseaktivitet av immobilisert enzym

Oxydase og peroxydaseaktivitet ble kvalitativt bes-temt ved tilsetning av 1 mg av det immobiliserte enzymsystem til 0,1 % glucose i PBS, pH 7,4, inneholdende 1,5 mg ABTS pr. ml. Hvis den grønne løsningen gikk over i blått i løpet av en time ble oxydasen og peroxydasen betraktet som aktive.

Prosedyrer for behandling av tumor- bærende rotter

Hovedprosedyren for behandling med ICCOPS krevet

tre fortløpende behandlingsdager med 5 mg av preparatet suspendert i 1 ml PBS, pH 7,4, inneholdende 0,1 % glucose. Suspensjonen ble injisert i det abdominale hulrom i rotter som

bar 5-dagers gamle tumorer. Variasjoner i behandlingssystemene ble anvendt som angitt i de resultater som er beskrevet senere.

Prøve på cellulær immunologisk respons i rotter

En enkelt-cellesuspensjon ble fremstilt fra milt ved passering gjennom en rustfri stålsikt. Cellene ble vasket en gang i Hanks balanserte saltløsning (HBSS), og ble deretter suspendert i en Tris-ammoniumkloridløsning. Tris-ammonium-kloridløsningen ble fremstilt fra 10 ml 0,17 M Tris og 90 ml 0,16 M ammoniumklorid og løsningen ble justert til pH 7,2. Suspensjonen ble inkubert i et vannbad ved 37°C for å lyse erythrocytene. Cellene ble sentrifugert ved 1000 omdreininger pr. minutt i en "CRC 5000" DAMON/IEC Division sentrifuge i 10 minutter og supernatanten ble fjernet. Cellene ble vasket i HBSS og igjen sentrifugert. Pelleten ble suspendert i modi-fisert Eagles medium supplert med 10 % (V/V) normalt kanin-serum, Hepes buffer 10 mM, ikke-essensielle aminosyrer (Gibco) og penicillin-streptomycin. En 100 yl's aliquot av ;celler ble tatt ut og blandet med 100 yl 0,4 % trypanblått. Etter tre minutter ble cellene og farveblandingen fortynnet med 19,8 ml fysiologisk saltløsning resulterende i en 1:200 fortynning av celler. Cellene ble tellet i et hemocytometer og deres konsentrasjon justert til 2x10^ levende celler/ml. Levedyktig-heten var større enn 90 %.

De forskjellige antigener og mitogener ble lagret sterilt ved 4°C oppløst i PBS, pH 7,2, ved konsentrasjoner på 1 mg/ml, 100 yg/ml og 10 yg/ml. Dyrkninger ble utført i stan-dart 96-brønners mikrotiterplater konstruert fra plast av vev-dyrkningskvalitet. Til brønnene som krevde antigen til et yg/ml ble 10 yl antigen med konsentrasjon 10 yg/ml tilsatt. For å oppnå sluttkonsentrasjoner på 10 yg/ml eller 100 yg/ml ble eksempelvis 10 yl av konsentrasjonen 100 yg/ml eller 1 mg/ml tilsatt. Andre konsentrasjoner av forskjellige mitogener ble fremstilt på lignende måte. Det spesifikke antigen som ble anvendt var "Keyhole Limpet Hemocyanin" (KLH) med hvilket rottene ble inokulert subcutant 14 dager før innføring av tumorceller. Hver rotte mottok 200 yg KLH i 0,1 ml PBS,

pH 7,6. Concanavalin A (ConA) var det mitogen som ble anvendt i prøvene. Den negative kontroll besto av tilsetning av 10

pl PBS ved pH 7,2 til hver kontrollbrønn. Etter tilsetning av antigen eller mitogen mottok hver brønn 100 vi av celle-suspensjonen. Platene ble inkubert ved 37°C i en fuktig atmo-sfære inneholdende 5 % C02 i 2 4 timer. Deretter ble brønnene pulset med 100 yl MEM inneholdende tritiert-thymidin ved 5 yCi/ml, spesifikk aktivitet 2Ci/mmol. Etter 48 timers dyrk-ning ble cellene høstet på glassfiberfiltere etter anvendelse av en "titertech" cellehøster. Etter tørkning ble filtrene tellet i en scintillasjonsvæske bestående av toluen, PPO og

POPOP.

Erholdte testresultater ved anvendelse av den foretrukne ut-førelsesform dg prosess

Tilbakegang av Novikoff hepatomer i rotter

Unge Sprague-Dawley hunnrotter ble intraperitonealt inokulert hver med 0,5 ml av en Novikof f hepatom--cellesuspensjon. Fem dager senere var tumorer blitt utviklet og i de fleste tilfeller var ascitesvæsken tilstede i det peritoneale hulrom.

Ved dette punkt ble hver rotte injisert intraperitonealt med 5 mg ICCOPS suspendert i 0,1 %-ig glucoseløsning. Den følgende dag ble rottene igjen gitt 5 mg ICCOPS, og dette ble gjentatt på den tredje dag. Kontrollforsøk ble foretatt ved injisering av ICCOPS fra hvilken enten glucoseoxydasen eller peroxydasen var utelatt eller ved injisering av bare glucoseløsningen. Fem dager etter den siste behandling ble fire av de syv dyr som var behandlet med det komplette ICCOPS-system avlivet sammen med alle kontrolldyrene som fremdeles var i live. Alle kontrolldyr hadde utviklet massive abdominale tumorer som utgjorde så meget som 25 g tumorvev. Dyrene som ble behandlet med det komplette ICCOPS-system utviste på den annen side nærvær av noe gult fibrøst bindevev, men ingen tegn på aktiv tumorvekst. De tre dyr som ikke ble avlivet forble levende i 8 måneder uten tegn til sykdomseffekter. (Se tabell I).

Totalt 24 Novikoff hepatom,r bærende rotter ble behandlet med det komplette ICCOPS-system. En fullstendig tilbakedannelse av tumorvev fant sted i hvert av dyrene, og i alle tilfeller fremkom det ikke noen sykdomseffekter etter behandlingen.

Effekt av ICCOPS , på hepatom - tumorer

En ung hunnrotte ble inokulert intraperitonealt med 0,5 ml Ni.ovikoff hepatom.-cellesuspens jon og tumoren fikk utvikles i 5 dager. Ved dette punkt ble bukhulen åpnet under anestesi. Typisk tumorutvikling ble observert ledsaget av ascites. Bukhulen ble deretter lukket og 5 mg ICCOPS blé injisert intraperitonealt. Rotten ble deretter gitt to ytterligere doser av 5 mg ICCOPS på de to etterfølgende dager etter den første administrering, og bukhulen ble åpnet igjen på den tiende dag etter den siste behandling. Ved dette punkt var tumoren omdannet til en hard, knuteformet gul fibrøs masse. Rotten formerte seg to måneder senere og gav et normalt kull med unger. Dette forsøk illustrerte at den peroxydaseaktiverte tumorregresjon fant sted ved hjelp av tumorcellelyse. Meste-parten av ICCOPS-partiklene ble funnet i det omentale vev. Tilsynelatende er det liten eller ingen direkte kontakt mellom ICCOPS-partiklene og tumorcellene, hvilket antyder at den cytotoxiske aktivitet av ICCOPS-partiklene overføres til tumorcellene via én eller flere løselige mellomprodukter.

Histopatologisk analyse

Et hematoxylin-og eosinpreparat av aktiv voksende Novikoff hepatom ble undersøkt. Tumorcellene syntes å være av epitelisk opprinnelse og lite bindevevstroma eller innkaps-ling var tilstede. Cellene var dårlig differensierte. Tumoren besto av et sammenhengende hele av celler som danner tilfel-dige små cystisklignende strukturer. Vevet viste en tilfeldig begrenset differensiering mot pseudorosetter av cellene rundt vaskulaturen, og i enkelte områder en differensiering mot et papillært mønster. Mitotiske figurer var felles. Vaskulari-tet var begrenset og det var utallige områder av necrose tilstedeværende i vevet. Tumoren ble derfor betegnet som et u-differensiert carcinom med enkelte karakteristika for papillært cystisk adenocarcinom.

Den samme preparering av de gule rester, av tumoren tatt 10 dager etter den sluttelige behandling med ICCOPS ble

undersøkt. Vevet besto av øyer av necrotiske celler innkapslet av en aktiv fibroblastisk respons. Det var en markert sammen-brytning av det neoplastiske vev og necrose synes å være total. Vevet utviste således vevnecrose med sekundær fibroplasi.

De mesentriale lymfeknuter i samme dyr viste sammen-brudd ved en infiltrering av neoplastiske celler i knutene.

De neoplastiske celler hadde startet dannelsen av adskilte øyer av vev, som er en indikasjon på aktiv neoplastisk metastase. Således hadde dette dyr allerede gjennomgått metastase når den primære tumor var blitt ødelagt. Hvis denne observasjon er representativ for andre dyr, kan man bare konkludere med at enhver metastasert tumor deretter ble ødelagt, da alle gjenværende rotter ble fullt ut restituert.

Effekt av peroxydase- inhibitorer

For å. oppnå ytterligere bevis på at den observerte tumor-tilbakedannelse virkelig var aktivert av ICCOPS-systemet, ble et forsøk utført i hvilket enkelte dyr ble injisert med en kraftig peroxydase-inhibitor. DOPA-analogen 3-aminotyrosin er en kraftig inhibitor av pepperrotperoxydase med på 5 yM.

I dette forsøk ble ICCOPS administrert til 8 hepatom-bærende rotter. 4 av dyrene ble også imjisert med 100 yg 3-aminotyrosin.

Resultatene indikerte at 3-aminotyrosinet inhiberte virkningen av ICCOPS og alle fire rotter som mottok 3-aminotyrosin døde til slutt av tumoren, mens den fjerde rotte som bare mottok ICCOPS viste en fullstendig remisjon. Dette be-krefter at tilbakegangen av hepatomer virkelig aktiveres av

ICCOPS.

Effekt av ICCOPS på normalt vev

To av hannrottene med tilbakedrevet Novikoff hepatom ble avlivet på den tiende dag etter behandlingen med ICCOPS for å vurdere virkningene av behandlingen på hurtig-formerende normale celler. For dette formål ble testiklene av dyrene undersøkt ved elektronmikroskopi og det ble funnet atser-tolicellene og spermatogenesen synes å være fullstendig nor-mal .

100 mg ICCOPS ble også injisert i tre normalt friske dyr i tre etterfølgende dager. På den fjerde dag ble en av dyrene avlivet. Mikroskopisk undersøkelse viste at ICCOPS-partiklene igjen var innleiret i det omentale vev. De andre to rotter ble holdt i live i ytterligere seks måneder. Under dette tidsrom ble ingenting observert som kunne skille disse fra andre normalt friske dyr.

Effekt av ICCOPS på andre tumorer

For å bestemme hvorvidt eller ikke den cytotoxiske virkning av ICCOPS in vivo er spesifikk for rotteadenocarci-nomer, ble effekten av ICCOPS testet på forskjellige typer av tumorer.

Et malignt musemelanom (B16-F1) ble dyrket i mus,

og etter at en betydelig mengde av tumorceller var tilstede i dyrene ble behandlingen med ICCOPS startet. Resultatene viste at tumor-necrose fant sted som et resultat av ICCOPS-behandlingen. Behandling i fire til fem fortløpende dager var imidlertid nødvendig for å oppnå fullstendig remisjon.

Flere spontane rottebrysttumorer ble også behandlet. I disse tilfeller ble 5 mg ICCOPS injisert i nærheten av tumoren i tre til fire fortløpende dager. En biopsi tatt ti dager etter den siste dag med behandling viste at fullstendig remisjon av tumoren hadde funnet sted. Patologisk under-søkelse fastslo at både et spontant brystcarcinom og et bryst-sarcom med hell kunne behandles med ICCOPS.

Ennvidere ble en hund med fremskredet Hodgkin's syk-dom (et malignt lymfom) behandlet. ICCOPS ble injisert direkte i en av de syke lymfeknuter i tre dager. Ved dette punkt døde hunden. Imidlertid ble alvorlig necrose av lymfom observert i de behandlede lymfeknuter som indikerer at dette lymfom. også er følsomt overfor virkningen av ICCOPS.

På lignende måte ble en fullstendig remisjon av en godartet tumor (et fibroadenom) i en rotte også oppnådd.

Disse data indikerer at minst flere typer av tumorer påvirkes av den cytotoxiske aktivitet av ICCOPS, og at dyr som bærer slike tumorer med hell kan behandles på denne måte. Slike data indikerer imidlertid at ikke alle tumorer reagerer like godt på ICCOPS-behandling; et forskjellig behandlingsopp-legg er nødvendig for hver type av tumor for å oppnå fullstendig remisjon.

Antitumor- aktivitet av andre peroxydaser

Anvendelse av lactoperoxydase i stedet for pepperrotperoxydase i ICCOPS-preparatet gir et produkt som også er effektivt når det gjelder å fremme tumortilbakegang in vivo. Dets in vivo-aktivitet overfor rottehepatomer er noe mindre enn av <p>epperrotperoxydasesystemets; administreringen måtte fortsettes i fire fortløpende dager for å oppnå de samme resultater som tre dager for ICCOPS-administrering.

Disse resultater viser at den tumoricidale aktivitet ikke er spesifikk for pepperrotperoxydase men kan altså frem-mes av visse andre pattedyrperoxydaser.

Forsterkning av tumorvekst av aminotyrosin

For å vurdere hvorvidt eller ikke endogene peroxydaser spiller en rolle i den naturlige resistens overfor en neoplastisk vekst, ble enkelte rotter injisert med en kraftig inhibitor av den cytotoxiske aktivitet av peroxydaser og dyrene ble deretter utfordret med en suspensjon av hepatom-celler.

Fire voksne hannrotter ble injisert intraperetonealt med 1 mg 3-aminotyrosin i 1 ml vann. Fire kontrollrotter ble injisert med 1 ml vann. Den neste dag ble alle rotter injisert med 1 ml av en fortynnet Novikoff hepatom-cellesuspensjon; i det antallet av celler normalt var utilstrekkelig for å fremkalle tumorvekst. På samme dag ble ytterligere 1 mg aminotyrosin administrert til rottene som mottok inhibitoren den foregående dag, og dette ble gjentatt i ytterligere tre dager. De fire kontrollrotter mottok på lignende måte vann-

injeksjoner.

På den niende dag etter innpodningen med tumor, ble alle rotter avlivet og undersøkt med hensyn til nærvær av tumor. Ingen tumor var til stede i noen av kontrolldyrene.

På den annen side hadde hver av dyrene som var behandlet med aminotyrosin utviklet tumorvekst. En rotte hadde en stor sentral omental tumor, mens de andre tre rotter inneholdt et antall små tumorer spredd gjennom det mesentrale omentum og over overflaten av tynntarmen.

Denne dramatiske forskjell indikerer at 3-aminotyrosin inhiberer den naturlige mekanisme ved hvilken dyrene be-skytter seg selv mot neoplasi. Som sådan er denne virkning lik virkningen av forskjellige immunundertrykkende forbindelser.

Effekter av ICCOPS på immunsystemet

Tabell II illustrerer forandringen i respons på Concanavalin A stimulering av miltceller erholdt fra tumor-bærende rotter og fra rotter med tilbakedannede tumorer sammenlignet med normalt friske dyr.

Dataene viser at miltceller fra tumor-bærende dyr

er meget aktive når det gjelder inkorporering av thymidin og er ufølsomme overfor ytterligere stimulering av Concanavalin A. Selv ved lave konsentrasjoner virker faktisk mitogenet som en inhibitor. Miltceller erholdt fra dyr med tilbakedannede tumorer kan på den annen side stimuleres av mitogenet, selv om de er mere aktive enn cellene fra friske rotter.

Når miltceller fra dyr med aktivt tilbakedannende tumorer ble testet ble et mønster observert lik det av dyr med fullstendig tilbakedannede tumorer. Disse resultater antyder at forandringene i immunresponsen oppstår raskt etter administreringen av ICCOPS. Lignende resultater ble erholdt med miltceller fra rotter som på forhånd var immunisert med KLH. (Tabell III). Celler fra dyr med aktivt tilbakedannende tumorer oppførte seg igjen mer som celler fra normale dyr i deres respons på stimulering med KLH enn celler fra tumor-bærende dyr.

Disse data indikerer at forandringer i immun-systemet oppstår samtidig med tumortilbakedannelse som et resultat av virkningen av peroxydasesystemet. Hvorvidt disse forandringer oppstår som et resultat av den tilbakedannende tumor eller er direkte forårsaket av nærværet av peroxydasesystemet kan ikke fastslås for tiden.

Konklusjon

Dataene presentert i foreliggende beskrivelse viser at ICCOPS, et immobilisert system med glucoseoxydase og pepperrotperoxydase som dets funksjonelle komponenter, hurtig og selektivt ødelegger et meget ondartet og langt fremkommet adenocarcinom i rotter. I tillegg underkastes andre ond-artede tumorer, innbefattet melanom, sarcom, og lymfom selektiv ødeleggelse av ICCOPS. Tidligere in vitro-undersø-kelser av andre under anvendelse av løselig glucoseoxydase og pepperrotperoxydase viste ingen spesifisitet overfor tumorceller sammenlignet med normale celler. En lignende mangel på spesifisitet ble observert med myeloperoxydase-og lacto-peroxydasesystemene. I en in vivo-undersøkelse ble på den annen side en meget høy, grad av selektivitet erholdt som illustrert ved følgende to fakta.

For det første ble ingen åpenbar skade funnet i normalt vev, innbefattende hurtig formerende testikkelceller; og for det andre viste histopatologiske vevsnitt at fibroblaster lokali-sert i umiddelbar nærhet til necroserende tumorceller er hovedsakelig normale.

Det ble også vist at peroxydaser forskjellig fra pepperrotperoxydase kan anvendes i ICCOPS. Tumortilbakedannelse ble erholdt under anvendelse av lactoperoxydase og cytotoxisk aktivitet in vitro ble demonstrert under anvendelse av myeloperoxydase og slangeskinnperoxydase.

Funksjonen av glucoseoxydasen i ICCOPS-systemet er bare å tilveiebringe hydrogenperoxydet og/eller superoxydet som trenges for å omdanne peroxydasen til den cytotoxiske form. Glucoseoxydase ble valgt av praktiske grunner da dets substrat (glucose og oxygen) er lett tilgjengelig for dets bruk in vivo. Imidlertid kan dets funksjon oppfylles av et hvilket som helst system som produserer enten hydrogenperoxyd eller superoxyd.

Det ble også funnet at peroxydasesystemet aktiverer en sekundær antitumormekanisme. Dette sekundære system synes å være den celle-formidlede del av immunsystemet. Den spontane blastogene aktivitet av miltceller fra rotter med aktivt voksende tumor indikerer et maksimalt stimulert immunsystem som ikke lykkes i å produsere en effektiv respons. Innføring av ICCOPS modifiserer imidlertid hurtig immunsystemet ved å redusere den ineffektive respons og restituere den mitogene og spesifikke immunrespons. Disse resultater indikerer at ICCOPS virker som et immunostimulerende middel i dyr hvis normale respons er utilstrekkelig. Den økede føl-somhet av dyrene overfor en utfordring med tumorceller som et resultat av 3-aminotyrosinadministrering, som således virker som et immunoundertrykkende middel, understøtter også denne konklusjon.

Således kan ICCOPS såvel som peroxydaseinhibitorer være anvendbare som terapeutiske midler ved sykdommer som på-virker immunsystemet, ved regulering av immunsystemet etter organtransplantasjoner og andre vevimplantasjoner, såvel som innen hver terapi som krever enten en undertrykkelse eller

aktivering av den endogene immunrespons.

Det er selvsagt mange variasjoner over de spesifikke trinn, teknikker, doser, materialer og lignende som kan foretas i det her beskrevne arbeidet.

Claims (4)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av et preparat med cytolytisk aktivitet overfor prokaryotiske og eukaryotiske celler, karakterisert ved at et første oxydaseenzym og et andre peroxydaseenzym som er i stand til kjemisk å tverrbindes med det første enzym og med et protein, for eksempel bovint eller humant serumalbumin, hvorved begge enzymer forblir aktive, oppløses i en bufferoppløsning, hvoretter et polymeriserende middel tilsettes og løsningen polymeriseres, og eventuelt nedfryses og lyofiliseres en uoppløselig gel isolert etter avkjøling av den polymeriserte oppløsning, og eventuelt oppmales gelen.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at en glucoseoxydase anvendes som det første enzym.

3. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert ved at pepperrotperoxydase anvendes som det andre enzym.

4. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av <i>kravene 1 til 3, karakterisert ved at lactoperoxydase anvendes som det andre enzym.