NO140306B

NO140306B - Analogifremgangsmaate ved fremstilling av terapeutisk aktive everninomicin-derivater

Info

Publication number: NO140306B
Application number: NO734703A
Authority: NO
Inventors: Ashit K Ganguly; Olga Sarre
Original assignee: Scherico Ltd
Priority date: 1972-12-14
Filing date: 1973-12-10
Publication date: 1979-04-30
Also published as: FR2210384B1; DE2361582A1; NO140306C; DD111575A5; CH601337A5; AU6347573A; PH10211A; NL7316867A; IL43789A0; BG23542A3; GB1454548A; IE38626B1; IE38626L; JPS4987674A; HU168868B; FR2210384A1; CA1013739A

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en analogifremgangsmåte ved fremstilling av nye everninomicin-derivater.

I US patentskrift 3 499 078 er det beskrevet en gruppe antibiotica betegnet som evernlnomocin-antibiotica, innbefattet everninomicin B, C og D, og fremstilling av disse ved dyrkning av en mikroorganisme av arten Micromonospora carbonacea under submerse, aerobe betingelser.

Det er nå funnet at ved reduksjon av disse everninomiciner

B, C og D etterfulgt om ønsket av kondensasjon med et aldehyd,

eller av oxydasjon dannes en ny gruppe everninomicin-detivater,

som utviser anti-bacteriell aktivitet overfor Gram-positive bakterier som er sammenlignbare med aktiviteten av everninomicin B, C og D utgangsmaterialet, men som hurtigere absorberer og umu-liggjør oppnåelse av høyere serumkonsentrasjoner enn med everninomicin B, C og D utgangsmaterialene.

Den nye gruppe everninomicin-derivater utgjøres av nitrosoeverninomicin B, C og D, hydroxylamino-everninomicin B, C og D, nitroner av disse hydroxylamino-everninomicin B, C og D og farma-søytisk akseptable salter derav. Disse forbindelser er oligosac-charider, hver inneholdende en diklor-iso-everninoylestergruppe,

en redusert evernitrosegruppe (dvs. en gruppe hvor nitrofunksjonen i evernitrose er erstattet av en nitrosogruppe eller en hydroxylaminogruppe eller en nitrongruppe som kan avledes fra hydroxylaminogruppen), to ortoesterfunksjoner og flere anomerisk bundne mono-saccharidgrupper.

De nye everninomicin-derivatene har følgende plane struktur-formel I:

og innbefatter de farmasøytisk akseptable salter derav, i hvilken formel X betegner en nitrosogruppe, en hydroxylaminogruppe, eller ■gruppen

hvor R betegner en hydrocarbongruppe med opp til

10 carbonatomer eller en fenyl- eller furylgruppe.

Y betegner hydrogen eller en hydroxylgruppe, og Z betegner grup-

pen

når Y er hydroxyl og representerer hydrogen eller

når Y er hydrogen.

Nitrogengrupperingen kan avledes fra hydroxylaminogruppen ved omsetning med det tilsvarende aldehyd.

Spesifike eksempler på grupperingen R, uttrykt ved det til-

svarende aldehyd RCHO fra hvilket nitronet

kan avledes, er alifatiske aldehyder slik som formaldehyd, acetaldehyd, propanol, heptanal, decanal,.benzaldehyd og 2-furfuraldehyd. Forbindelsene ifølge formel I hvor Y betgener hydroxyl og Z betegner betegnes som nitrosoverninomicin B og hydroxylaminoeverninomicin B (eller nitronderivat av den sistnevnte) når X er -NO og -NHOH (eller det tilsvarende nitronderivat derav). Tilsvarende når Y og Z begge er hydrogen er forbindelsene av formel I de tilsvarende everninomicin C derivater, mens når Y er hydrogen og Z er

er forbindelsene de tilsvarende everninomicin D

derivater.

Forbindelsene av formel I inneholder en sur fenolisk hydroxyl-funksjon som kan lett omdannes til et tilsvarende farmasøytisk akseptabelt salt. Typiske farmasøytisk akseptable salter er metall-salter slik som alkalimetallsalter (f.eks. natrium og kalium), jordalkalimetallsalter (f.eks. kalsium) og aluminiumsalter, og aminsalter som trilaverealkylaminer (f.eks. triethylamin), procain, dibenzylamin, N-benzylbetaf enethylamino ,N ,N 1 -dibenzylethylen-diair.in, N,N<1->bis-dehydroabiethyl-ethylendiamin,N-lavere-alkylpiperidiner (f.eks N-ethyl-piperidin) og N-methylglucaminsalter.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er kjennetegnet ved at

a) et everninomicin B, C eller D reduseres ved nitrogruppen, eller b) et hydroxylaminoeverninomicin B, C eller D oxyderes til det tilsvarende nitrosoeverninomicin B, C eller D,

hvoretter den således erholdte forbindelse av formel I isoleres,

og at fremgangsmåtealternativene a) og b) om ønsket etterfølges av ett eller flere av de følgende trinn:

omsetning av et erholdt hydroxylaminoeverninomicin B, C eller

D med benzaldehyd, 2-furfural eller et alifatisk aldehyd med

inntil 10 carbonatomer.

- omdannelse av den erholdte forbindelse av generell formel I til et farmasøytisk akseptabelt salt derav.

Som ovenfor angitt fremstilles forbindelsene ved å underkaste de kjente everninomicin B, C og D en nærmere bestemt reduksjonspro-sess. Undersøkelser over strukturen av utgangsmaterialene og slutt-produktene har vist at det under reduksjonsprosessen reduseres en spesiell gruppering, en nitrogruppering, til en tilsvarende nitroso- eller hydroxylaminogruppering, og den sistnevnte gruppering kan lett omdannes til et tilsvarende nitroderivat.

Ved denne fremgangsmåten reduseres et everninomicin B, C eller D utgangsmateriale med aluminiumamalgam i en reaksjonsblanding omfattende en vandig lavere alkanol, hvoretter reduksjonspro-duktet isoleres. Den lavere alkanol kan hensiktsmessig være en inneholdende opp til 4 carbonatomer, og er fortrinnsvis ethanol. Det nøyaktige forhold mellom alkanol og vann er ikke ansett å være kritisk, men vil avhenge av slike faktorer som valget av alkanol og løseligheten av det spesielle everninomicin-utgangsmateriale i det valgte alkanol-vann-system, og dette forhold kan lett bestemmes i et hvert spesielt tilfelle. For et ethanol-vann-system er det funnet at et forhold fra 60:40 - 40:60 (volum/volum)

kan fordelaktig anvendes og det er spesielt anvendt et 50:50-forhold. Hensiktsmessig kan vektforholdet mellom aluminium-amalgam (beregnet som aluminium) og everninomicin-utgangsmateriale være ca. 0,2:1.

Reduksjonsprosessen kan hensiktsmessig utføres ved omgi-vende temperatur. Under reduksjon av everninomicin-utgangsmaterialet med aluminiumamalgamet omrøres fortrinnsvis reaksjonsblandingen, og reaksjonen tillates å forløpe inntil amalgamet forsvinner. Selv om reaksjonen kan utføres i nærvær av luft, er det antatt fordelaktig å utføre reduksjonen under en inert atmosfære av f.eks. nitrogen eller argon. Fremstilling av aluminium-amalgam utføres på kjent måte, typisk ved å etse aluminiumfoliet med natriumhydroxyd og deretter behandle den fremstilte folie med kvikksølvkloridløsning én eller flere ganger, og deretter vaske aluminium-amalgamproduktet. Den anvendte aluminiumfolie er fortrinnsvis én inneholdende 98 til

99,5 % aluminium med spormengder av minst én av kobber, silicium og jern, og det.er funnet fordelaktig å anvende en kommersielt tilgjengelig under varemerket Reynolds Wrap som omfatter 99,35 % aluminium og ca. 0,12 % kobber. Ved fremstilling av amalgam, kan aluminium-folien hensiktsmessig kuttes i 0,5 cm kvadrater og brettes til ball-lignende former. Fortrinnsvis bør aluminium-amalgamet være friskt fremstilt før bruk for å lette reduksjonsprosessen.

Everninomicin B, C og D utgangsmaterialene kan, som tidligere angitt, fåes ved å dyrke en mikroorganisme av arten Micromonospora carbonacea som beskrevet I US patentskrift 3 499 078 ' Isolering og rensing av everninomicin B, C og D kan utføres etter i og for seg kjente metoder, slik som de som er beskrevet under hen-visning til everninomicin B og D i US patentskrift 3 499 078. Selv om det urene everninomicin B, C eller D, eller en blanding av everninomicin B, C og D om ønsket kan anvendes som utgangsmaterialet, er fortrinnsvis utgangsmaterialet et renset everninomicin B, C eller D. For dette formål kan separasjonen av en blanding av everninomicin B, C eller D utføres kromatografisk, f.eks. ved anvendelse av en silicagelkolonne med et benzen-acetonsystem som elueringsmiddel. Rensing kan utføres ved bruk av løsningsmiddelutfelling og kromatografi. Således kan f.eks. rensing av everninomicin D hensiktsmessig utføres ved å løse materialet i aceton, utfelle materialet ved tilsetning av en petroleumether-diethyletherblanding, filtrere fra bunnfallet og deretter gjenta operasjonssyklusen minst én gang, og hvor denne prosedyre etterfølges en kromatografisk rensing ved bruk av en silicagelkolonne med et benzen-acetonsystem som elueringsmiddel. Spesifike metoder er beskrevet i forbindelse med eksemplene.

De rensede everninomicin B, C og D utgangsmaterialer lagres fortrinnsvis ved relativt lave temperaturer, som 5 til 10° C, under vannfrie betingelser og i en inert atmosfære.

Som det fremgår fra det foregående kan strukturformelene til everninomicin B, C og D utgangsmaterialene representeres av formel I, med det unntak at X i hvert tilfelle er en nitrogruppering.

Det umiddelbare produkt ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen vil normalt være en blanding omfattende det tilsvarende nitroso- og/eller hydroxylaminoeverninomicin med hydroxylamino-everninomicin som den dominerende bestanddel. Ved f.eks. reduksjon av everninomicin D ved den nærmere angitte prosess (eksempel 1) er-holdes det et vektprosentutbytte, basert på vekten av utgangsmaterialet, på 33 % renset hydroxylaminoeverninomicin D sammenlignet med noe mindre enn 1 % renset nitrosoeverninomicin D.

Isolering og rensing av nitrosoeverninomicin og hydroxyl-aminoeverninomicinproduktene kan utføres ved kjente metoder innbefattet ekstraksjon og kromatografi og omkrystallisasjon og utfellinger. Fortrinnsvis utføres separasjonen av hydroxylaminoeverninomicin og den tilsvarende nitrosoforbindelse fra en blanding av disse mate-rialer kromatografisk slik som ved tynnskiktskromatografi hvor det typisk anvendes silicagelplater med et hvilket som helst egnet fremkallende løsningsmiddel, og hvor representative eksempler på slike er aceton-benzensystemer og aceton-ethylacetat-benzensystemer. Om det anvendes omkrystallisasjon kan et hvilket som helst hensiktsmessig løsningsmiddel anvendes. Når det gjelder rensing av everninomicin C er det anvendt ethylacetat som omkrystallisasjonsmedium.

Nitronderivatene kan fremstilles ved omsetning av den tilsvarende hydroxylaminoforbindelse med hensiktsmessige aldehyd, på i og for seg kjent måte, slik.som å blande reaktantene i et inert, omrørt løsningsmiddel (f.eks. ethanol). Rensing kan utføres ved kjente metoder, fortrinnsvis kromatografisk.

Farmasøytisk akseptable salter fremstilles ifølge oppfinnelsen etter kjente metoder, slik som ved å omsette ekvimolare mengder av det hensiktsmessige everninomicin-derivat (f.eks. hydroxylaminoeverninomicin D) og base (f.eks. natriumhydroxyd) i vandig løsning og lyofilisere produktblandingen under dannelse av det ønskede salt.

Forbindelsene fremstilt ifølge oppfinnelsen lagres fortrinnsvis under vannfrie betingelser i en inert atmosfære, slik som under nitrogen eller argon, og ved relativt lave temperaturer slik som 5 - 10°C. På denne måte unngås eller nedsettes uønsket oxydasjon (av f.eks. hydroxylaminofunksjonen) og hydrolyse (av ortho-estergrupperingen).

Nitrosoeverninomicin B, C og D kan som sagt også fremstilles ved oxydasjon av det tilsvarende hydroxylaminoeverninomicin. Ved dette fremgangsmåtealternativ oxyderes det tilsvarende hydroxylaminoeverninomicin med et hensiktsmessig oxyderingsmidde1 under dannelse av det ønskede nitrosoeverninomicinprodukt. Hensiktsmessig kan utgangsmaterialet oxyderes i et aprotisk løsningsmiddel med et alkalimetallhypobromit. Alkalimetallhypobromitter som kan anvendes er kaliumhypobromit, lithiumhypobromit og fortrinnsvis, natriumhypobromit mens representative aprotiske løsningsmidler innbefatter dioxan, diethylenglycoldimethylether (også kalt dig-lym), methanol, ethanol og fortrinnsvis tetrahydrofuran. Ved ut-førelse av oxydasjonen behandles vanligvis en 10 % vekt/volumløs-ning av utgangsmaterialet i det aprotiske løsningsmiddel med et ekvivalent volum av en vandig natriumhypobromitløsning (fremstilt som beskrevet i Organic Synthesis COLL., Vol. 4, 45 (1963)). Så-snart reaksjonen er fullstendig, som indikert ved tynnsjiktskromatografi, kan det resulterende nitrosoeverninomicinprodukt deretter isoleres ved tilsetning av vann til reakjsonsblandingen etterfulgt av ekstraksjon med et hensiktsmessig halogenert løsningsmiddel slik som methylenklorid. Ytterligere rensing kan deretter utføres ved bruk av tynnsjiktskromatografi. Totale utbytter på 60 % kan oppnås.

Som et alternativ til hypobromitoxydasjonsprosessen, kan hydroxylaminoeverninomicin-utgangsmaterialet underkastes luftoxyda-sjon i et alkalisk løsningsmiddel, slik som ved å boble luft gjennom en løsning av utgangsmaterialet i fortynnet vandig natriumhydroxyd.

Om det ønskes å omdanne et nitrosoeverninomicinprodukt til den tilsvarende hydroxylaminoeverninomicin-forbindelse, er det for-utsatt at dette kan oppnås ved bruk av kjente metoder for omdannelse av en nitrosogruppe til en hydroxylaminogruppe.

Det er å bemerke at ved å underkaste et everninomicin, spesielt everninomicin D, konvensjonell reduksjon slik som hydroge-nering i nærvær av en katalysator slik som palladium, Raney-nikkel, palladium på kull, platina og lignende katalysatorer, fåes det resultat at everninomicin-utgangsmaterialet forblir hovedsakelig uforandret. På basis av dette må det betraktes som overraskende at everninomicin-utgangsmaterialene ved foreliggende fremgangsmåte kan reduseres til de tilsvarende nitroso- og hydroxylaminoeverninomicin-derivater.

Forbindelsene fremstilt ifølge oppfinnelsen utviser et sne-vert spektrum av in vitro antibakterielleaktivitet overfor Gram-positive bakterier (f.eks. Staphylococcus aureus, Staph., 11631, Staph. W. Streptococcus pyogenes C, Strep. pyogenes C-203 og Bacillus subtilis) og er også aktive overfor visse Gram-negative bakterier (f.eks. Neisseria gonorrhea og Neisseria meningitis). Forbindelsene betraktes å være nyttige som laboratoriereagenser for å bestemme nærvær av Gram-negative tarmbakterier såvel som Klebsiella pneumonia og Eschorichia coli. I lys av deres virk-ning overfor Gram-positive og Gram-negative organismer, kan forbindelsene også anvendes for å sterilisere utstyr slik som det som anvendes i operasjonsrom og i hospitaler.

Foretrukne forbindelser er de som avledes fra everninomicin D, spesielt hydroxylaminoeverninomicin D og de farmasøytisk akseptable salter derav, spesielt natriumsaltet. I denne forbindelse har everninomicin D derivater den ytterligere fordel at everninomicin D utgangsmaterialet er et dominerende produkt ved fremgangsmåten ifølge US patentskrift 3 499 078. På grunn av

løselighet og stabilitetsfaktorer vil de farmasøytiske akseptable salter hyppig være den foretrukne form av forbindelsene. Representative salter er natrium og N-methylglucaminsalter av føl-gende: hydroxylaminoeverninomicin D,

hydroxylaminoeverninomic in D-benzylnitron,

hydroxylaminoeverninomicin D-heptylnitron og

hydroxylaminoeverninomicin D-furfurylnitron.

Sammenligning av hydroxylaminoeverninomicin D, en represen-tativ forbindelse fremstilt, ifølge oppfinnelsen, og dens everninomicin D forløper har vist at hydroxylaminoeverninomicin D utviser sammenlignbar antibakteriell aktivitet overfor Gram-positive bakterier med hva som utvises av everninomicin D, mens den absorberes hurtigere, og danner høyere serumkonsentrasjoner, og utsondres hurtigere enn everninomicin D. De anvendte testmetoder og de erholdte resultater er angitt i det etterfølgende.

Den in vitro antibakterielle aktivitet overfor Gram-positive mikroorganismer ble bestemt ved bruk av standard prøverørs for-tynningsmetoder. I hvert tilfelle ble det anvendt 10 ^ fortyn-ninger av 24 timer gamle næringskulturer som podestoff med ende-punkter alt etter inkubering i 24 timer ved 37°C i et Difco Penassaynæringsmedium (Difco Labs., Detroit, Michigan). For å bestemme in vitro aktiviteten overfor Gram-negative mirkoorganis-mer ble det anvendt en platefortynningsmetode med et Thayer-Martin-medium og under anvendelse av den kjente Thayer-Martin-prosedyre.

(Manual of Clinical Microbiology (1970), utgitt av Blair, Lanette & Truant publisert av American Soc. for Microbiology). Resultatene er oppført i tabell I.

Den in vivo antibacterielle aktivitet i mus er oppført i tabell II uttrykt i en dose som er nødvendig til å beskytte 50 % av de testede dyr (ED,-0)• Det ble anvendt grupper på 7 mus (albino hanmus CF-1, som hver veide 18 - 20 g), og hver ble undersøkt ved fem dosekonsentrasjoner med 10 mus som kontrolldyr. Musene ble hver behandlet med en enkelt subcutan eller oral dose 1 time etter intra-peritoneal infeksjon med ca. 10^ organismer. Kontrolldyrene døde vanligvis 18 - 24 timer etter infeksjon. Overlevende i de behand-lede grupper ble bestemt 48 timer etter infeksjon. Sannsynlighets-beregninger ble anvendt for å bestemme PDgQ-verdier i mg pr. kg.

De toksiske konsentrasjoner som oppnås for de spesifike forbindelser ble bestemt ved å administrere en enkeltdose av testforbindelsen til testdyret, hvor dosen var 25 mg/kg for rotter og 10 mg/kg for hunder. Etter administrering ble det periodevis tatt blodprøver og mengden av testforbindelsen i serumet ble bestemt på kjent måte (Agar-diffusion-assay - Weinstein et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, s. 24 (1964)). Resultatene er oppført i

Toksisitetdata for hydroxylaminoeverninomicin D (natrium og N-methylglucaminsalter ble anvendt) ved bruk av CF-1 hanmus med vekt 20 g er oppført i tabell IV.

På grunn av deres aktivitet er forbindelsene fremstilt iføle oppfinnelsen betraktet som nyttige for å frembringe en antibakteriell respons i varmblodige dyr, innbefattet ikke-menneske-lige dyr, med en bakteriell infeksjon ved administrering av en ikke-toksisk, antibakteriell effektiv mengde av en forbindelse fremstilt ifølge oppfinnelsen. Administrering av den aktive forbindelse kan utføres topisk, oralt eller fortrinnsvis parenteralt, hvor den aktive forbindelse normalt foreligger i form av en hensiktsmessig farmasøytisk blanding omfattende den aktive forbindelse sammen med en egnet farmasøytisk akseptabel bærer. De far-masøytiske blandinger kan fremstilles på hensiktsmessig måte og foreligge i form av enhetsdoser, vanligvis tabletter, kapsler, dragéer og lignende for oral administrering, salver, lotions og lignende for topisk administrering og ampuller med en steril løs-ning ved suspensjon for parenteral administrering. Forbindelsene kan om ønsket, anvendes i kombinasjon med andre aktive bestandde-ler som vanligvis anvendes i antibakterielle formuleringer.

Fortrinnsvis administreres forbindelsene parenteralt og for denne administreringsmetode anvendes fortrinnsvis saltene av hy-droxylamonieverninomicin B og C og spesielt D.

Den individuelle enhetsdose og administreringshyppighet bestemmes ikke bare av arten og graden av bakterieinfeksjon, men også av alder, vekt art underliggende fysikalske betingelser og administreringsmetode. Den eksakte mengde som administreres bør være ikke-toksisk, likevel farmasøytisk effektiv til å lindre symptomene på bakteriell infeksjon. Ved behandling av bakterielle infeksjoner generelt, anses det at når blandingene administreres parenteralt, anses en daglig dose på fra 1 til ca. 15 mg/kg av en everninomicinforbindelse å være hensiktmessig.

Oppfinnelsen illustreres ytterligere i de etterfølgende eksempler hvor eksempel 1 - 7 og 9 - 12•illustrerer fremstilling av de nye forbindelser og eksempel 8 illustrerer fresmtilling av spesifike utgangsmaterialer for bruk ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen.

Eksempel 1

Hydroxylaminoeverninomicin D

A. Fremstilling og rensing av everninomicin D

1. Evernimomicin D ble fremstilt ved dyrkning av Micromonospora carbonacea var carbonacea NRRL 2972 eller Micromonospora carbonacea var. aurantiaca NRRL 2 992 under submerse aerobe betingelser i et vandig næringsmiddel inneholdende en assimilierbar kilde av carbon og nitrogen, hvoretter det således erholdte everninomicin D ble isolert fra den resulterende antibiotiske blanding ved de metoder som er beskrevet i US patent nr. 3 499 078. 2. En løsning av 66 g everninomicin D fremstilt som beskrevet i trinn 1, i 300 ml aceton ble behandlet med 7 g benkull ved romtemperatur. Blandingen ble filtrert og benkullet ble vasket med 100 ml aceton. Det kombinerte acetonfiltrat og vaskevann ble heldt over i

en løsning av 10,5 liter petroleumether (k.p. 60° C) og 2,7 liter diethyiether.. Det resulterende bunnfall av everninomicin D ble filtrert og tørket, hvorved det ble erholdt 56 g.

3. Det everninomicin D som ble erholdt i trinn 2, ble ytterligere renset ved utfelling i 250 ml acetonløsning med 10 liter av en løsningsmiddelblanding omfattende petroleumether/diethylether (4:2). Det resulterende bunnfall ble filtrert fra og tørket til en konstant vekt ved 60° C, .hvorved det ble erholdt 52 g everninomicin

D.

4. Ytterligere rensing ble utført som følger: 30 g av det

erholdte everninomicin D ble løst i en minimal mengde aceton, hvoretter det ble tilsatt 120 g friskt silicagel og løsningsmidlet ble fordampet ved 60° C inntil det ble erholdt en konstant vekt. Denne blanding ble tilsatt på toppen av en 150 x 4 cm kromatografisk kolonne med 450 g silicagel fremstilt i benzen. Kolonnen ble først eluert med ca. 7 liter av en løsningsmiddelblanding omfattende på volumbasis 15 % aceton - 85 % benzen, etterfulgt av en løsningsmid-delblanding omfattende 20 % aceton og 80 % benzen. 1 liters fraksjoner ble oppsamlet, hver fraksjon ble analysert ved tynnskiktskromatografi. Dén 8nde til 16nde liter fraksjon ble kombinert og konsertrert i vakuum ved 50° C til et residuum av renset everninomicin D (ca. 18 g) med en Rf på 0,79 ved tynnskiktskromatografi i 60 % aceton og 40 % benzen (volum/volum).

Molekyl formel: C66H99//35NC12' molekylvekt: 1537 (beregnet).

Spesifikk optisk rotasjon: (°0D 2 6 -34,2° (kloroform). Nøytralisasjonsekvivalent: 1563 (beregnet for CggH9g035NC12:1537). pKa: 7,2. 5. Det rensede everninomicin D ble lagret under en nitrogenatmosfære i ca. 5° C.

B. Fremstilling av aluminiumamalgam

Aluminiumsfolie (spesielt det som markedsføres under varemerket Reynolds Wrap Aluminium Foil ble anvendt i dette eksempel) oppkuttet i 0,5 cm kvadrater ble etset med en fortynnet natrium-hydroxydløsning inntil det foregikk en sterk utvikling av hydrogen-gass. Løsningen ble dekantert fra og metallet ble vasket én gang overfladisk med vann slik at det bibeholdt noe alkali. Metallet ble behandlet med en 0,5 %-ig kvikksølvkloridløsning i ca. 1-2 min. Kvikksølvkloridløsningen ble dekantert fra og behandlingen ble gjen-tatt. Det resulterende skinnende amalgamerte aluminium ble vasket med vann, ethanol og deretter ether og ble anvendt øyeblikkelig i trinn C.

C. Fremstilling av hydroxylaminoeverninomicin D

Til en løsning av 4,5 g renset everninomicin D erholdt i trinn A i 100 ml 95 %-ig ethanol og 85 ml vann ble tilsatt under om-røring ved romtemperatur aluminiumamalgam fremstilt fra 810 mg alu-miniumf olie ved den metode som er beskrevet i trinn B. Reaksjonsblandingen ble omrørt ved romtemperatur inntil alt amalgam var forsvunnet (ca. 2 timer). Den grå reaksjonsblanding ble filtrert på en Bucher-trakt ved bruk av en filterpute og det uløselige residuum ble vasket med 95 % etanol. Filtratet og ethanolvaskevæskene ble kombinert og konsentrert til et volum på ca. 100 ml. Konsentratet ble avkjølt i et isbad i ca. 1 time, den resulterende uløselige fraksjon ble filtrert fra, hvorved det ble erholdt 2,9 g hydroxylaminoeverninomicin D, som ble tørket i vakuum ved romtemperatur før videre rensing.

D. Rensing av hydroxylaminoeverninomicin D

2,9 g av det urene hydroxylaminoeverninomicin D erholdt i trinn C ble kromatografisk renset ved bruk av 20 silicagelplater (2000 /• tykke) og under anvendelse av 50 vol% aceton i benzen som fremkallende væske. Det rensede hydroxylamineverninomicin D (Rj= 0,45) ble gjort synlig med ultrafiolett lys og det rensede hydroxylaminoeverninomicin D-bånd (dvs. Rf20,45-båndet) ble ekstrahert fra platen ved bruk av aceton. Acetonekstraktene ble kombinert og løs-ningsmidlet destillert fra, hvorved det ble erholdt et residuum på 1,5 g renset hydroxylaminoeverninomicin D med følgende egenskaper:

Molekylformel: C6gH101<O>34<N>Cl2,

molekylvekt: 1523 (beregnet)

sm.p.: 190 - 200° C Kofler blokk,

Spesifikk optisk rotasjon: (ct)D -39,3° (kloroform),

Ultrafiolett absorpsjon: , methanol ~1C , ,n „

X maks 215 mJJ' *" = 19'2'

282 my, e = 3,4

Infrarødt absorpsjonsspektrum i kloroform: 2,92, 5,80, 5,37, 6,92, 7,13, 7,26, 8,06 (bred), bred absorpsjon mellom 9,13 og 9,70 micron (se fig. 1).

Når ultrafiolett absorpsjonsdata i denne beskrivelse er angitt ved "e" menes "e, %cm" som er definert som den optiske tetthet til en 1 %-ig løsning av forbindelsen målt i en 1 centimeter celle.

Kjernemagnetisk resonansspektrum i deutorokloroform er angitt på fig. 2.

Eksempel 2

Nitrosoeverninomicin D

A. Fremstilling ved oxydasjon av hydroxylaminoeverninomicin D

Natriumhypobromitreagenset ble fremstilt ifølge Organic Synthesis, COLL., Vol, 4, 45 (1936).

Til 1 mmol hydroxylaminoeverninomicin D (som en 10 %-ig vekt/volum løsning i tetrahydrofuran), ble tilsatt 1 mmol vandig natriumhypobromitløsning ved romtemperatur. Reaksjonsforløpet ble fulgt ved tynnskiktskromatografi (silicagelplater med tykkelse 250 micron, løsningsmiddelsystem aceton/ethylacetat/benzen (2:2:1)). Etter at utgangsmaterialet var forsvunnet ble vann tilsatt reaksjonsblandingen som ble ekstrahert med methylenklorid. De kombinerte methylenkloridekstrakter ble fordampet til et residuum av nitrosoeverninomicin D (utbytte ca. 60 % av det teoretiske) som ble videre renset som beskrevet nedenfor.

100 mg nitrosoeverninomicin D ble kromatografert på en preparativ tynnskiktskromatografisk plate (2000 micron tykk) ved bruk av aceton/ethylacetat/benzen (2:2:1) (på volumbasis) som fremkallende løsningsmiddel. Det rensede nitrosoeverninomicin D ble gjort synlig ved hjelp av ultrafiolett lys og båndet i R^-området på 0,75 - 0,85 ble ekstrahert fra platen ved hjelp av aceton. De kombinerte acetonekstrakter ble fordampet til et residuum på ca. 60 mg nitrosoeverninomicin D med følgende egenskaper:

Molekylformel: C66<H>9<9>°34<N>C12'

Molekylvekt : 1521 (beregnet)

sm.p. 163 - 165° C Kofler block

Spesifikk optisk rotasjon: (a)D "30,8 (kloroform),

Ultrafiolett absorpsjonsspektrum: ^maks<*>"<101> 212 my'£ = 16'05,

292 my, e = 5,60,

Infrarødt absorpsjonsspektrum i kloroform: 2,9, 3,4, 5,8, 6,4, 6,5, 6,9, 7,2, 9,0, 9,6, 10,2, 10,5 micron (se fig. 3).

Kjernemagnetisk resonansspektrum: som angitt på fig. 4.

Bioprøve: 14 60 Y/ml.

B. Fremstilling ved reduksjon av everninomicin D

På tilsvarende måte som beskrevet i eksempel 1C ble everninomicin D behandlet i vandig ethanol med aluminiumamalgam og det resulterende urene produkt omfattende nitrosoeverninomicin D i blanding med hydroxylaminoeverninomicin D ble isolert. Det urene produkt inneholdende nitrosoeverninomicin D ble renset ved bruk av 20 silicagelplater (2000 my tykk) og under anvendelse av aceton/ ethylacetat/benzen (2:2:1) som fremkallende løsningsmiddel. Det rensede nitrosoeverninomicin D (Rf ca. 0,78) ble gjort synlig med ultrafiolett lys. 0,78 Rg-båndet ble ekstrahert fra platen ved bruk av aceton. Acetonekstraktene ble kombinert og destillert i vakuum til et residuum av nitrosoeverninomicin D.

Eksempel 3

Hydroxylaminoeverninomicin D- benzylnitron

Til 400 mg hydroxylaminoeverninomicin D i 15 ml vannfri ethanol ble tilsatt 0,2 ml benzaldehyd. Blandingen ble omrørt ved romtemperatur i 72 timer og deretter destillett i vakuum til et residuum. Residuet ble triturert med hexan og det resulterende bunnfall omfattende hydroxylaminoeverninomicin D benzylnitron ble fraskilt ved filtrering og lufttørket.

Produktet ble renset ved tynnskiktskromatografi ved bruk av silicagel med aceton/benzen (1:1) som fremkallingsmiddel. Ben-zylnitronderivatet ble gjort synlig med ultrafiolett lys og båndet innen Rf-sonen på 0,5 - 0,7 ble ekstrahert med aceton. Acetonet ble fordampet i vakuum til et residuum på 200 mg renset hydroxylamino-everninomicin D benzylnitron som et farveløst fast materiale med følgende karakteristika:

sm.p. 168 - 170° C Kofler block,

molekylarformel: C73HiQ5N034C12>

molekylvekt : 1611 (beregnet)

Spesifikk optisk rotasjon: (°0D 2 6 ~ 67° (kloroform) ,

Ultrafiolett absorps jonsspektrum: ^a^g3"01 292 my' e = 1495 •

Infrarødt absorpsjonsspektrum i kloroform: 2,9, 3,4, 5,75, 5,8, 6,35, 6,9, 7,2, 9,1, 9,6, 10,5, 11,0 micron (se fig. 5). Bioforsøk: 1309,0 Y/ml.

Eksempel 4

Hydroxylaminoeverninomicin D 2- furfurylnitron

Til 375 mg hydroxylaminoeverninomicin D i 25 ml vannfri ethanol, ble tilsatt 1 ml 2-furfural (2-furfuraldehyd). Blandingen ble omrørt ved romtemperatur over natten og deretter destillert i vakuum til et residuum. Residuet ble triturert med hexan og det resulterende bunnfall omfattende hydroxylaminoeverninomicin D furfurylnitron ble tørket.

Produktet ble renset ved preparativ tynnskiktskromatografi ved bruk av silicagel med aceton/benzen (1:1) som fremkallende løs-ningsmiddel. Furfurylnitronderivatet ble gjort synlig ved hjelp av ultrafiolett lys og båndet med en R^ innen området fra 0,75 til ca. 0,85, ble ekstrahert med aceton- Acetonløsningen ble konsentrert i vakuum under dannelse av .186 mg (50 % utbytte) hydroxylaminoeverninomicin D furfurylnitron med følgende karakteristika:

sm.p. 173 - 175° C Kofler block,

Molekylærformel: C7lH103'NO35Cl22H2O,

.Molekylvekt: 1637 (beregnet)

Spesifikk optisk rotasjon: (a}^<6> -63,2° (kloroform).

Ultrafiolett absorps jonsspektrum: ^^aks^01 302 my' E = 18'35,

Infrarødt absorpsjonsspektrum: 2,9, 3,4, 5,8, 6,2, 6,3, 6,8, 7,2, 8,0, 9,0, 9,6, 10,5, 10,9 micron (se fig. 6).

Bioprøve: 1063,4 y/ ml.

Eksempel 5

Hydroxylaminoeverninomicin D heptylnitron

Til 375 ml hydroxylaminoeverninomicin D i 25 ml vannfri ethanol ble tilsatt 1 ml n-heptanal. Blandingen ble omrørt ved romtemperatur over natten og ble deretter destillert i vakuum til et residuum. Residuet ble triturert med hexan og det resulterende hydroxylaminoeverninomicin D heptylnitron (utbytte 280 mg, 75 % av teoretisk) ble fraskilt ved filtrering og lufttørking. Produktet var et farveløst fast materiale med følgende karakteristika:

o

sm.p. 159 - 160 C Kofler block.

Molekulær formel: C-,-,H, , oN0_ .Cl0.

73 113 34 2

Molekylvekt: 1619 (beregnet)

Spesifikk optisk rotasjon: ia)^ -46,0° (kloroform).

Ultrafiolett absorps jonsspektrum: ^maks3"0^ 29^ my, e = 5,25.

Infrarødt absorpsjonsspektrum i kloroform: 2,9, 3,5, 5,7, 6,3, 6,9, 7,2, 9,0, 9,6, 10,5, 10,9 micron (se fig. 7).

Bioprøve: 892 y/ ml.

Eksempel 6

Alkalimetall og jordalkalimetallsalter av hydroxylaminoeverninomicin Di nitrosoeveriririomicin D og hitronene av hydroxylaminoeverninomicin

D

A. Til en kraftig omrørt suspensjon av 1 g hydroxylamino-everninomicin D i 25 ml vann under en nitrogenatmosfære ble sakte tilsatt 0,1 N-natriumhydroxyd (ca. 6,8 ml)inntil reaksjonsblandingens pH var 9,5 og det faste materiale var i løsning. Løsningen ble om-rørt ved romtemperatur i ytterligere 1 time (slutt pH på ca. 8,5). Den klare løsning, ble lyofilisert hvorved det ble erholdt 0,95 g hydroxylaminoeverninomicin D natriumsalt som et hvitt fast stoff.

B. Ved å erstatte natriumhydroxyd med ekvimolare mengder av andre alkalimetallhydroxyder (f.eks. kaliumhydroxyd og lithiumhydr-oxyd) eller med jordalkalimetallhydroxyder (f.eks. kalsiumhydroxyd og bariumhydroxyd) ble det etter den ovenfor angitte metode erholdt de tilsvarende alkalimetaller eller jordalkalimetallsalter, f.eks. hydroxylaminoeverninomicin D kaliumsalt, hydroxylaminoeverninomicin D lithiumsalt, hydroxylaminoeverninomicin D kalsiumsalt og hydroxylaminoeverninomicin D bariumsalt. C. På tilsvarende måte som beskrevet i trinn A, ble hver av følgende forbindelser behandlet med 0,1 N-natriumhydroxyd:

nitrosoeverninomicin D,

hydroxylaminoeverninomicin D benzylnitron,

hydroxylaminoeverninomicin D furfurylnitron og

hydroxylaminoeverninomidin D heptylnitron.

Det resulterende produkt ble isolert som beskrevet i trinn A under dannelse av:

nitrosoeverninomidin D natriumsalt,

hydroxylaminoeverninomicin D benzylnitronnatriumsalt, hydroxylaminoeverninomicin D furfurylnitron-natriumsalt og hydroxylaminoeverninomicin D heptylnitron-natriumsalt.

Eksempel 7

N- methylglucaminsalt av hydroxylaminoeverninomicin D, nitrosoeverninomicin D og nitroner av hydroxylaminoeverninomicin D

A. Til 300. mg hydroxylaminoeverninomicin D løst i 1,5 ml methanol ble tilsatt 40 mg N-methylglucamin og reaksjonsblandingen ble omrørt ved romtemperatur i 1,5 time. 40 ral ether bl.e sakte tilsatt under god omrøring. Det resulterende bunnfall ble fraskilt ved filtrering og lufttørking, hvorved det ble erholdt 175 mg hydroxylaminoeverninomicin D N-methylglucamin som et hvitt fast materiale.

På tilsvarende måte ble følgende forbindelser behandlet med N-methylglucamin i methanol:

nitrosoeverninomicin D,

hydroxylaminoeverninomicin D benzylnitron,

hydroxylaminoeverninomicin D furfurylnitron og

hydroxylaminoeverninomicin D heptylnitron.

Det resulterende produkt ble isolert som ovenfor beskrevet, hvorved det ble erholdt: nitrosoeverninomicin D N-methylglucaminsalt, hydroxylaminoeverninomicin D benzylnitron-N-méthylglucaminsalt, hydroxylaminoeverninomicin D furfurylnitron-N-methylglucaminsalt og hydroxylaminoeverninomicin D heptylnitron-N-methylglucaminsalt.

Eksempel 8

Fremstilling og rensing av everninomicin B og everninomicin C

A. Fremstilling av antibiotisk blanding omfattende everninomicin B, everninomicin D og everninomicin D

1893 liter fermenteringsvæske ble fremstilt som beskrevet i US patentskrift 3 499 078, eksmepel 1, ved å dyrke en mikroorganisme valgt fra gruppen bestående av Micromonospora carbonacea var. carbonacea NRRL 2972 og Micromonospora carbonacea var. Aurantiaca NRRL 2992 under submerse aerobe betingelser i et vandig nærings-medium inneholdende en assimilerbar kilde av carbon og nitrogen 1893 liter av fermenteringsvæsken ble ekstrahert med 1893 liter methylenklorid hvoretter ethylenkloridekstraktene ble konsentrert i vakuum til et volum på ca. 3 liter. Konsentratet ble heldt over i 30 liter hexan, og det resulterende bunnfall omfattende en antibiotisk blanding av everninomicin B, everninomicin D og everninomicin D ble filtrert fra og lufttørket.

B. Separasjon av den antibiotiske blanding

En kromatografisk kolonne ble fremstilt ved å oppslemme 11,35 kg silicagel for kromatografi (spesielt som er tilgjengelig som "Bakers" silicagel) i benzen/aceton (60:40 på volumbasis). Opp-slemmingen ble deretter overført til to 1,5 x 10 cm kolonner og kolonnene fikk avleire over natten. De to kolonner ble plasert i serie slik at de virket som en kontinuerlig kolonne.

300 g av blandingen av everninomicin B, C og D fremstilt som beskrevet i trinn A ble løst i 1 liter benzen/aceton (60:40) under kraftig omrøring. Denne løsning ble overført til kolonnene.

Kolonnen (dvs. to kolonner i serie) ble eluert med benzen/ aceton (60:40) og eluatet ble oppsamlet i 1800 ml fraksjoner. Like fraksjoner som bestemt ved tynnskiktskromatografisk analyse (silicagel: benzen: aceton (60:40) ble kombinert). De kombinerte fraksjoner ble deretter fordampet til et residuum omfattende everninomicin D, everninomicin C og everninomicin B som følger: Fraksjonene 14 - 18 ga et residuum omfattende 76,9 g everninomicin D, fraksjon 21 ga et residuum omfattende 5 g everninomicin C og de kombinerte fraksjoner 22 - 27 ga et residuum omfattende 29,5 g everninomicin B. Everninomicin D-materialet kunne deretter renses som beskrevet i eksempel IA, mens everninomicin B og C materialene ble renset som beskrevet nedenfor.

C. Rensing av everninomicin B og C

(1) Everninomicin C

Residuet av fraksjon 21 erholdt som beskrevet i trinn B ble krystallisert fra ethylacetat hvorved det ble erholdt det rene everninomicin C med følgende egenskaper: Spesifik optisk rotasjon: (a)<26> -33,7° (kloroform).

Ultrafiolett absorpsjon: ^makg31101 208 m^' e = 19 >8' 211 e=19>5.

Infrarødt absorpsjonsspektrum i kloforom: 2,9, 3,4 (bred), 5,75, 6,32, 6,45, 6,85, 7,1, 7,2, 7,4, 7,7, 8,0, 9,0, 9,6, 10,2 og 11,0 microner (se fig. 8).

(2) Everninomicin B

28 g everninomicin Berholdt som beskrevet i trinn B fra fraksjoner 22 - 27 ble kromatografert på 900 g silicagel G (tynn-skiktskvalitet, fremgangsmåte ifølge Stahl) og eluert med 35 % aceton i benzen. 20 ml's fraksjoner ble oppsamlet og like fraksjoner som bestemt ved tynnskiktskromatografisk analyse ble kombinert. De kombinerte fraksjoner 211. - 310 ble fordampet i vakuum til et residuum omfattende renset everninomicin. B (12,6 g) med følgende egenskaper :

Molekylærformel: cg6<H>99°36NC12*

Molekylvekt : 1553 (beregnet)

sm.p. 184 - 1,85° C Kofler block

Spesifikk Optisk rotasjon: (a)D 2 6 -33° (kloroform).

Ultrafiolett absorps jons spektrum: ^aksT"<101> 210 my' e <=> 17'

285 my, e= 1,5.

Infrarødt absorpsjonsspektrum (i kloroform): 2,9, 3,4, 5,75, 6,3, 6,45, 6,85, 7,20, 8,0, 8,5, 9,0, 9,6, 10,2 og 10.5 microner.

Eksempel 9

Hydroxylaminoeverninomicin C

A. På tilsvarende måte som beskrevet i eksempel 1C ble everninomicin C (fremstilt og renset som beskrevet i eksempel 8) behandlet i vandig ethanol med aluminiumamalgam. Det resulterende produkt ble isolert som tidligere beskrevet, hvorved det ble erholdt hydroxylaminoeverninomicin C.

B. Det urene hydroxylaminoeverninomicin C ble renset på tilsvarende måte som beskrevet i eksempel ID ved bruk av preparative silicagelplater (2000 micron tykke) og under anvendelse av 50 % aceton-benzen som fremkallende løsningsmiddel. Det rensede hydroxylaminoeverninomicin C (Rf 2 0,27) ble gjort skinnende med ultrafiolett lys og det rensede hydroxylaminoeverninomicin C-bånd ble ekstrahert fra platen ved hjelp av aceton. Acetonekstraktet ble kombinert og løsningsmidlet bleddestillert fra hvorved det ble erholdt et residuum omfattende renset hydroxylaminoeverninomicin C med følgende egenskaper:

sm.p. 165 - 168° C Kofler block.

Spesifikt optisk rotasjon: (a)D 2 6 -21,6° (methanol)

Ultrafiolett absorps jonsspektrum: \ m^ iks^ 0^ 2^"2 e" = -^,32, 290 my, £ = 3,33.

Infrarødt absorpsjonsspektrum (i kloroform): 2,9, 3,4, 5,8, 6,9, 7,2, 8,0, 9,1, 9,6, 10,25 og 11,0 microner (se fig. 9). C. På tilsvarende måte som beskrevet i eksempel 6 ble hydroxylaminoeverninomicin C behandlet med natriumhydroxyd under dannel se av hydroxylaminoeverninomicin C-natriumsalt. D. På tilsvarende måte som beskrevet i eksempel 7 ble hydroxylaminoeverninomicin C i methanol behandlet med N-methylglucamin under dannelse av hydroxylaminoeverninomicin C N-methylglucamin.

Eksempel 10

Hydroxylaminoeverninomicin B

A. På tilsvarende måte som beskrevet i eksempel 1C ble everninomicin B (fremstilt og renset som beskrevet i eksempel 8) behandlet i vandig ethanol med aluminiumamalgam. Det resulterende produkt ble isolert og renset som beskrevet i eksempel 1C hvorved det ble erholdt et produkt omfattende hydroxylaminoeverninomicin B.

B. På tilsvarende måte som beskrevet i eksempel ID ble det urene hydroxylaminoeverninomicin B fremstilt i trinn A renset under anvendelse av preparative silicagelplater (2000 micron tykke) under anvendelse av 50 % aceton i benzen som fremkallende løsningsmiddel. Det rensede hydroxylaminoeverninomicin B (R^ = 0,18) ble gjort synlig med ultrafiolett lys og det rensede hydroxylaminoeverninomicin B-^bånd ble ekstrahert fra platen ved bruk av aceton. Acetonekstraktene ble kombinert og residuet ble destillert fra hvorved det ble erholdt renset hydroxylaminoeverninomicin B med følgende egenskaper:

Molekylær formel: C66Hioi°35(NC12*

Molekylvekt : 1535 (beregnet).

Sm.p. 171 - 173° C Kofler block

Spesifik optisk rotasjon: (a}D 2 6 -19,9 (methanol)

Ultrafiolett absorpsjonsspektrum: ^aks<3>"<01> 215 my' e ~ 17'15'

299 my, e = 3,15.

Infrarød absorpsjonsspektrum i kloroform: 2,9, 3,4, 5,8, 6,35, 6,9, 7,2, 8,0, 9,1 (bred -S), 9,6 (bred -S), 10,5, 11,0 micron (se fig.10).

C. På tilsvarende måte som beskrevet i eksempel 6 ble hydroxylaminoeverninomicin B behandlet med natriumhydroxyd under dannel-

se av hydroxylaminoeverninomicin B-natriumsalt.

Eksempel 11

Nitrosoeverninomicin B og C

På tilsvarende måte som beskrevet i eksempel 2A ble hver

av hydroxylaminoeverninomicin B (fremstilt og renset som beskrevet i eksempel 10) og hydroxylaminoeverninomicin C (fremstilt og renset som beskrevet i eksempel 9) i en tetrahydrofuranløsning og behandlet med vandig natriumhypobromit ved romtemperatur. De resulterende produkter ble isolert og renset hvorved det ble erholdt nitrosoeverninomicin B og nitrosoeverninomicin C.

Eksempel 12

Nitroner av hydroxylaminoeverninomicin B og C

På tilsvarende måte som beskrevet i eksempel 3-5 ble hver av hydroxylaminoeverninomicin B og hydroxylaminoeverninomicin C i vannfri ethanol behandlet med benzaldehyd, 2-furfuraldehyd og n-heptanal.

Hver av resulterende produkter ble isolert og renset som beskrevet i eksemplene 3-5, hvorved det ble erholdt benzyl-nitronet, furfurylnitronet og heptylnitron-derivatene av hydroxylaminoeverninomicin B og hydroxylaminoeverninomicin C.

Claims

1. Analogifremgangsmåte ved fremstilling av terapeutisk aktive everninomicinforbindelser av generell formel I: og farmasøytisk akseptable salter derav, hvor X betegner en nitrosogruppe, en hydroxylaminogruppe, eller gruppen hvor R betegner en hydrocarborigruppe med opp til 10 carbonatomer eller en fenyl- eller furylgruppe. Y betegner hydrogen eller en hydroxylgruppe, og Z betegner gruppen når Y er hydroxyl og representerer hydrogen eller når Y er hydrogen, karakterisert ved at a) et everninomicin B, C eller D reduseres ved nitrogruppen, eller b) et hydroxylaminoeverninomicin B, C eller D oxyderes til det tilsvarende nitrosoeverninomicin B, C eller D, hvorefter den således erholdte forbindelse av formel I isoleres, og at fremgangsmåtealternativene a) og b) om ønsket efterfølges av ett eller flere av de følgende trinn: omsetning av et erholdt hydroxylaminoeverninomicin B, C eller D med benzaldehyd, 2-furfural eller et alifatisk aldehyd med inntil 10 carbonatomer, omdannelse av den erholdte forbindelse av generell formel I til et farmasøytisk akseptabelt salt derav.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1a) for fremstilling av hydroxylaminoeverninomicin D, karakterisert ved at der som utgangsmateriale anvendes everninomicin D.