NO122031B - - Google Patents

Description

o

Fremgangsmåte ved fremstilling av

levende kusmavirusvaksine.

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte ved fremstil-

ling av en vaksine inneholdende et svekket, levende kusmavirus.

Som folge av dets svekkede natur forårsaker viruset liten eller ingen klinisk reaksjon. Det befordrer imidlertid dannelse av en be- .r tydelig mengde motstoff mot viruset hos mennesker, og dette motstoff er vesentlig for å oppnå beskyttelse mot infeksjon av viruset og mot sykdom forårsaket av dette.

Kusma ansees på samme måte som meslinger som en av de mindre alvorlige barnesykdommer. Ved vanlig klinisk infeksjon er dette riktig. I spesielle tilfeller kan imidlertid de kliniske folger av virusinfeksjonen være alvorlige, og ettersykdommene kan være like odeleggende som ved meslinger.

I det vanlige tilfelle av kusma inntrer den akutte febertilstand etter en inkubasjonstid på 18 - 21 dager. De viktigste kliniske symptomer er feber med ledsagende opphovning av spyttkjertlene på den ene side eller på begge sider, av og til også under medvirkning av de submaxillære og sublinguale kjertler.

Viremia ledsager ofte kusmavirusinfeksjon, og en rekke organer eller organsystemer kan være innblandet. Disse kan innbefatte bite-stikkelen, blærehalskjertelen, eggstokken, leveren, bukspyttkjertelen, milten, skjoldbruskkjertelen, nyrene, labyrinten, oynene, brisselen, myocardium, brystkjertlene og sentralnervesystemet. De viktigste syk-dommer er encephalitis, encephalomyelitis, neuritis i ansikts-nervene, i trigeminus eller i synsnervene, aseptisk meningitis (0,5-10 % av tilfellene), : scleritis, pancreatitis, som enkelte ganger forer til sukkersyre; og orchitis eller ovaritis, som av og til forer til atrophia og sterilitet. Alvorlige komplikasjoner er minst hyppige blant barn. De mer alvorlige tilfeller inntrer ved infeksjon av voksne mennesker som har unngått sykdommen som barn.

o

Kusma uten komplikasjoner hos barn er avkreftende, anstrengende for foreldrene og resulterer i. betydelig fravær fra skolen. Kusma med komplikasjoner, enten det gjelder barn eller voksne, kan variere fra en mild sykdom med tilsynelatende fullstendig helbredelse til ødeleggelse eller nedsatt kapasitet av viktige organsystemer som kan gjore pasienten til kropling'for livet eller være dbdelig.

Det var kjent for denne oppfinnelse ble gjort - jfr. en artikkel av J.E. Prier i Basic medical virology, s. 259-26<*>+ (Baltimore 1966) - at kusmavirus kan tilpasses'til vekst i fosterholdig honseegg med suksessive passeringer gjennom dette medium, og at meget godt til-passet virus kan dyrkes i kyllingfosterkultur. Samme kilde viser likeledes at det var kjent å fremstille en levende kusmavaksine ut fra virus dyrket i fosterholdig honseegg , Det var imidlertid ikke kjent at man ved på nærmere bestemt måte å kombinere passeringer gjennom fosterholdig honseegg med dyrkning i kyllingfostervevkultur kan fremstille en sikker men effektiv levende kusmavaksine. ;Ved hjelp av oppfinnelsen tilveiebringes der således nu en fremgangsmåte ved fremstilling av levende kusmavirusvaksine ut fra virus som er dyrket suksessivt i fosterholdig honseegg, hvilken fremgangsmåte utmerker seg ved at man anvender kusmavirus som har passert minst ti suksessive ganger gjennom fosterholdig hSnseegg og deretter er blitt dyrket i kyllingfostervevkultur inneholdende vev fra 9 til ;11 dager gamle kyllingfostere ved 30 - 38°C. ;Fremgangsmåten omfatter de folgende trinn: (A) isolering av det livskraftige virus i fosterholdig honseegg og tilpasning av dette til kyllingfostervevkultur, (B) utvikling av det svekkede, levende virus ved hjelp av dyrkninger i kyllingfostervevkultur og (C) fremstilling av vaksinen ut fra det erholdte svekkede, levende virus. Disse trinn skal beskrives hvert for seg. ;A. Isolering og tilpasning av livskraftig virus ;Kusmaviruset skaffes fra klinisk materiale, nemlig fra personer som vites å ha kusma. Isolering og tilpasning av kusmaviruset full-fores i kyllingfostervevkultur etter at det på forhånd er blitt formert i fosterholdig honseegg. Inkubasjon av infiserte kulturer kan utfores ved 30 - 3^-°C (optimalt 32°C) eller ved 35 - 38°C ;(optimalt 36°C) ;B. Fremstilling av svekket, levende kusmavirus ;Viruset som under A er påvist å være kusmavirus, anbringes i ;glassflasker inneholdende kyllingfostervevkulturer tilberedt av finhakkede og trypsinerte, omtrent ti dager gamle kyllingfostere. Dyrkningsmediet kan f.eks. være det kjente medium 199 til hvilket det er tilsatt kalveserum. Etter tilsetningen av serumet inkuberes de infiserte cellekulturer ved suksessive dyrkninger ved 30 - 38°C i varierende tidsrom, hvorunder viruset svekkes. De virusholdige væsker innsamles deretter og lagres i fryst tilstand eller ved annen lav temperatur for å opprettholde virusets infektivitet. ;De ovennevnte suksessive dyrkninger utfores under anvendelse av et fortynnet innpodningsmateriale, og flere^innhøstninger foretas med varierende mellomrom. Infektivitetstitreringer utfores i HeLa-kultur, grivetapenyrevevkultur eller kyllingfostervevkultur. ;C. Fremstilling av vaksine ;Kusmaviruset som ble hostet etter disse suksessive dyrkninger, viste seg ikke å fremkalle sykdom hos aper og gnagere, å fremkalle liten eller ingen klinisk reaksjon hos mennesker og å fore til dannelse av en betydelig mengde motstoff. Virusinfektiviteten stabi-liseres ved hjelp av et egnet stabiliseringsmiddel såsom sucrose menneskealbumin, glutamin, fosfat eller blandinger derav. Etter titrering for bestemmelse av dets styrke fylles viruspreparatet på ampuller. Produktet kan lagres og utdeles i fryst tilstand, men blir fortrinnsvis frysetorret og oppbevart fritt for fuktighet. ;Forsok på mennesker: Omtrent 150 barn som ikke tidligere hadde hatt kusma, ble parenteralt gitt en dose av en vaksine av svekket kusmavirus. Praktisk talt samtlige barn reagerte ved en betydelig mot-stofftiter innen en måned etter vaksineringen. Barna viste få eller ingen kliniske symptomer, alt etter stammen av kusmavirus og antall dyrkninger i fosterholdig honseegg og kyllingfostervevkulturer. ;Eksempel ;Innpodningsmaterialet er det som fåes ved den ovenfor beskrevne isolasjonsmetode etter 10 suksessive passeringer gjennom fosterholdig honseegg. ;Ni til elleve dager gamle kyllingfostere finhakkes under aseptiske betingelser etter at hode- og halepartier er fjernet, og det finhakkede vev vaskes flere ganger med Hanks' BSS. Det vaskede vev trypsineres ved 36°C under anvendelse av 0,25 % trypsin ("Difco" 1:250) i tris(hydroxymethyl)-aminomethan-puffer i 2 - 3 timer. Tryp-sincelleoppslemningen oppsamles gjennom to lag sterilt osteklede og sentrifugeres med en hastighet av 1500 omdr./min i 5 minutter. Sammenpakkede celler oppslemmes på ny i dyrkningsmedium for telling. Dyrkningsmediet er medium 199 inneholdende 2 % agamma-kalveserum (oppvarmet ved 56°C i 30 minutter) og 50 mcg/ml "Neomycin". Flaske-kulturer plantes i en konsentrasjon av 350.000 levedyktige celler pr. milliliter. Etter inkubering ved 36°C i et tidsrom fra *+8 til 72 timer kan flaskekulturene anvendes for suksessive dyrkninger eller for vaksinefremstilling.

Kyllingfostervevkulturer fremstilles i glassflasker under anvendelse av medium 199'inneholdende 2 % inaktivert kalveserum som dyrkningsmedium. Tre eller fire dager etter plantingen tas dyrkningsmediet ut under aseptiske forhold, og flaskekulturene vaskes fire ganger med Hans' BSS, idet der benyttes 100 ml pr, vask, og podes med 2,5 ml fortynnet viruspreparat pr. flaske. 70 ml av medium 199 inneholdende 10 % av et egnet stabiliseringsmiddel for virusinfektiviteten tilsettes hver flaskekultur, og flaskene inkuberes ved 30 - 3^-°C. "Neomycin" i en konsentrasjon av 50 mcg/ml innlemmes i vekst-og vedlikeholdsmediet. Det foretas flere innhøstninger med 2 - •+ dagers mellomrom, og flaskene påfylles nytt vedlikeholdsmedium inneholdende det ovennevnte stabiliseringsmiddel. Ti suksessive dyrkninger utfores alle ved omtrent 32°C. Infektivitetstitreringer av hver innhostning utfores i HeLa-kultur eller i grivetapenyrekultur. Hver innhostning foretas aseptisk, idet der benyttes en steril be- holder. Det tas ut prover for bestemmelse av den mikrobielle sterilitet, og den resterende del skallfryses i et bad av torris og alko-hol. De virusholdige væsker lagres ved -70°C i en elektrisk drevet fryseenhet, for ett eller flere innhostede materialer velges ut for fremstilling av vaksinen.

Ett eller flere egnede innhostede materialer velges ut etter at det er foretatt infektivitetstitreringer. Det utvalgte materiale tas ut fra fryseren og tines opp. En prove tas ut for kontroll og for å undersbke hvorvidt den er sikker. Den gjenværende væske klares, og en prove tas ut for å teste materialet på aper. Passende mengder ytter-ligere stabiliseringsmiddel tilsettes den gjenværende væske. Væsken fordeles på skåler og torres. Etter torring blir skålene lukket og forseglet og holdt i beredskap for tilberedelse av en vaksine ved tilsetning av sterilt vann.

Færre eller flere suksessive dyrkninger av viruset i kylling-fostervevkulturen kan foretas i den hensikt å svekke viruset. Eksempelvis ga tyve suksessive passeringer gjennom fosterholdig honseegg ved 30 - 38°C med to påfolgende passeringer gjennom kyllingfoster-vevkul tur ved 30 - 38°C et godt resultat.

Claims (1)

1. Fremgangsmåte ved fremstilling av levende kusmavirusvaksine ut fra virus som er dyrket suksessivt i fosterholdig honseegg,karakterisert vedat man anvender kusmavirus som har passert minst ti suksessive ganger gjennom fosterholdig honseegg og deretter er blitt dyrket i kyllingfostervevkultur inneholdende vev fra 9 til 11 dager gamle kyllingfo stere ved 30 - 38°C.