NO115914B

NO115914B -

Info

Publication number: NO115914B
Application number: NO14439662A
Authority: NO
Inventors: K Ahlen
Original assignee: Srm Hydromekanik Ab
Priority date: 1961-05-26
Filing date: 1962-05-15
Publication date: 1968-12-30
Also published as: BE618151A; CH425366A; AT242190B

Description

Fremgangsmåte for ekstrahering av penicillin fra dyrkningsvæsker. Procedure for the extraction of penicillin from culture fluids.

Foreliggende oppfinnelse angår verdi-fulle forbedringer i fremgangsmåter for ekstrahering av penicillin fra fermenter-ingsvæsker som er fremstillet ved produk-sjon av penicillin ved submers kultur av en penicillinproduserende stamme av penicillium. The present invention relates to valuable improvements in methods for extracting penicillin from fermentation liquids which have been produced by the production of penicillin by submerged culture of a penicillin-producing strain of Penicillium.

Hittil har det vært praksis ved ekstrahering av penicillin fra slik dyrkningsvæske å anvende fremgangsmåter som omfatter følgende trinn i fremstillingen. Væsken klargjøres, det vil si de soppvekster Hitherto, it has been practice when extracting penicillin from such culture liquid to use methods which include the following steps in the preparation. The liquid is clarified, that is, the mushroom growths

som er tilstede fjernes ved filtrering, filtratet ansyres til en pH på omtrent 2 ved which are present are removed by filtration, the filtrate is acidified to a pH of about 2 by

tilsetning av mineralsyre, og den ansyrede addition of mineral acid, and the anacidified

væske ekstraheres i et passende apparat, liquid is extracted in a suitable apparatus,

idet det anvendes vesentlig vannuopp-løselig middel, slik som butylacetat. using a substantially water-insoluble agent, such as butyl acetate.

Oppløsningsmiddelekstraktet inneholdende The solvent extract containing

det rå penicillin kan underkastes videre the crude penicillin can be submitted further

rensningstrinn før omdannelse til et purification step before conversion to a

fast penicillinsalt. Det er i alminne-lighet tilfellet at ekstraksjonen av penicil-linholdige væsker med et vannuoppløselig solid penicillin salt. It is generally the case that the extraction of penicillin-containing liquids with a water-insoluble

oppløsningsmiddel resulterer i dannelse av solvent results in the formation of

emulsjoner, som byr på vanskeligheter og emulsions, which present difficulties and

forsinkelser under ekstraksjon i stor målestokk. Det er blitt foreslått et stort antall delays during extraction on a large scale. A large number have been proposed

fremgangsmåter til å overkomme eller ned-sette emulsjonsproblemet, og en av de methods to overcome or reduce the emulsion problem, and one of them

fremgangsmåter som mest almindelig be-nyttet er tilsetning av et fuktningsmiddel methods most commonly used is the addition of a wetting agent

eller en blanding av fuktningsmidler til or a mixture of wetting agents to

den klargjorte væske før ekstraheringen. the prepared liquid before the extraction.

Bruken av forskjellige typer fuktningsmiddel for de ovennevnte formål er beskrevet The use of different types of wetting agent for the above purposes is described

f. eks. i tysk patent nr. 598.597 og 606.940. e.g. in German Patent Nos. 598,597 and 606,940.

Slike fuktningsmidler er imidlertid dyre å However, such moisturizers are expensive

anvende i stor målestokk, og bestemte av de mer effektive midler er blitt funnet å apply on a large scale, and certain of the more effective means have been found to

fremkalle eller akselerere spaltning av penicillinet under ekstraheringen. Det er' induce or accelerate cleavage of the penicillin during the extraction. It is'

videre blitt funnet at bestemte av midlene kan føres gjennom til og bringe vanskeligheter i etterfølgende trinn ved rensningen av penicillinet, og kan endog komme til syne i det endelige produkt. it has further been found that certain of the agents can be carried through to cause difficulties in subsequent steps in the purification of the penicillin, and may even appear in the final product.

Det er også blitt foreslått å salte ut proteinene ved tilsetning av konsentrerte saltoppløsninger (se dansk patent, nr. 71.871). It has also been proposed to salt out the proteins by adding concentrated salt solutions (see Danish patent, no. 71,871).

Det er nu blitt funnet at de ovennevnte vanskeligheter som fremkalles ved dannelse av emulsjoner under ekstrahering av penicillinet fra dyrkningsvæske, inneholdende denne, kan unngås ved hjelp av en ny fremgangsmåte som er gjenstanden for foreliggende oppfinnelse. Det er blitt opp-daget at tilsetning av en liten mengde av et oppløselig salt av kalsium, slik som kalsiumklorid, til dyrkningsvæsken i en slik mengde at det fåes en konsentrasjon som ikke er større enn 1/50 av den molare konsentrasjon har den overraskende fordel at dyrkningsvæsken etter filtreringen kan ekstraheres med vannuoppløselig oppløs-ningsmiddel, slik som et alkylacetat, etter ansyring uten at det er nødvendig med It has now been found that the above-mentioned difficulties caused by the formation of emulsions during the extraction of the penicillin from the culture liquid, containing it, can be avoided by means of a new method which is the subject of the present invention. It has been discovered that the addition of a small amount of a soluble salt of calcium, such as calcium chloride, to the culture liquid in such an amount as to obtain a concentration not greater than 1/50 of the molar concentration has the surprising advantage that the culture liquid after filtration can be extracted with a water-insoluble solvent, such as an alkyl acetate, after acidification without the need for

noen videre behandling, slik som tilsetning, some further processing, such as addition,

av fuktningsmidler for å unngå vanskeligheter, som skriver seg fra dannelse av en of wetting agents to avoid difficulties, which arise from the formation of a

emulsjon. Det hersker den oppfatning at kalsiumsaltet virker på denne måte ved å fremkalle utfelling av oppløselige kvel-stoffholdige forbindelser, som ellers ville ha en uheldig virkning på ekstrasjonspro- emulsion. The prevailing opinion is that the calcium salt acts in this way by inducing the precipitation of soluble nitrogen-containing compounds, which would otherwise have an adverse effect on the extraction process.

sessen, men det skal forstås at denne for- session, but it must be understood that this pre-

klaring bare er teoretisk. Tilsetningen av kalsiumsalt til dyrkningsvæsken foretas fortrinnsvis før filtreringen av soppres- clearance is only theoretical. The addition of calcium salt to the culture liquid is preferably carried out before the filtration of the fungal

tene, og filtreringen utføres etterpå på tene, and the filtering is carried out afterwards on

vanlig måte. Som et alternativ kan tilset- usual way. As an alternative, add-

ningen gjøres til filtratet etter at soppres- the filtrate is made after the fungal

tene er fjernet ved filtrering, og i dette tilfellet er det nødvendig med nok en filt- have been removed by filtration, and in this case another filter is required

rering for å klargjøre væsken før oppløs-ningsmiddelekstraheringen. Kalsiumsaltet kan settes til i fast form eller i vandig oppløsning, fortrinnsvis under bevegelse slik som omrøring. Det kan brukes et hvilket som helst oppløselig salt av kalsium, men det foretrekkes å an- stirring to clarify the liquid before the solvent extraction. The calcium salt can be added in solid form or in aqueous solution, preferably during movement such as stirring. Any soluble salt of calcium may be used, but it is preferred to

vende kalsiumklorid. Det skal forstås at den mengde kalsiumsalt som er nødvendig for å oppnå det ønskede resultat kan vari- turn calcium chloride. It should be understood that the amount of calcium salt necessary to achieve the desired result can vary

ere, da sammensetningen av fermen-teringsvæsken som skal behandles ikke er konstant. Det er mulig å bestemme meng- ere, as the composition of the fermentation liquid to be treated is not constant. It is possible to determine the amount of

den av kalsiumsalt, som er nødvendig ved behandling av aliquote deler av fermente-ringsvæsken med økende mengde kalsium- that of calcium salt, which is necessary when treating aliquots of the fermentation liquid with increasing amounts of calcium

salt opp til det punkt er nådd, ved hvilket det ikke lenger produseres noen emulsjon, salt until the point is reached at which no emulsion is produced,

når den behandlede aliquote del rystes med oppløsningsmidlet som skal anvendes ved ektraksjonen. Som et alternativ kan be-handlingen av en aliquot del anvendes for å<*> bestemme den mengde kalsiumsalt som skal settes til væsken, slik at den videre tilsetning av kalsiumsalt til væsken ikke resulterer i noen videre dannelse av bunn- when the treated aliquot part is shaken with the solvent to be used in the extraction. As an alternative, the treatment of an aliquot part can be used to<*> determine the amount of calcium salt to be added to the liquid, so that the further addition of calcium salt to the liquid does not result in any further formation of bottom

fall. Det er blitt funnet at dette siste van- fall. It has been found that this latter dis-

ligvis forekommer når konsentrasjonen av kalsiumsalt i væsken har nådd omtrent M/50. Det skal forståes at en mengde kal- apparently occurs when the concentration of calcium salt in the liquid has reached approximately M/50. It should be understood that a quantity of cal-

siumsalt i overskudd av de mengder som således er bestemt kan settes til væskeh, sium salt in excess of the amounts thus determined can be added to liquid h,

men dette overskudd vil begrenses av øko- but this profit will be limited by eco-

nomiske grunner. nomic reasons.

Andre oppløselige kalsiumsalter,. slik Other soluble calcium salts. such

som nitrat, bromid, iodid - eller tiosulfat kan også anvendes ved fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse. such as nitrate, bromide, iodide or thiosulphate can also be used in the method according to the present invention.

Den nye fremgangsmåten fremkaller The new procedure induces

en vesentlig reduksjon i fremstillingsom-kostningene og resulterer ikke i" noe bety- a significant reduction in manufacturing costs and does not result in" any significant

delig tap av penicillin ved spaltning under prosessen. partial loss of penicillin by cleavage during the process.

Foreliggende oppfinnelse består derfor The present invention therefore consists

i en forbedret framgangsmåte'for ekstra- in an improved procedure'for extra-

hering av penicillin fra dyrkningsvæske framstilt ved submers fermentering av en penicillinproduserende stamme av penicil- hering of penicillin from culture fluid produced by submerged fermentation of a penicillin-producing strain of penicillin

lium og som omfatter tilsetning av et vannoppløselig kalsiumsalt til dyrknings- lium and which includes the addition of a water-soluble calcium salt to the cultivation

væsken, etterfulgt av ekstrahering med et oppløsningsmiddel som i det vesentlige the liquid, followed by extraction with a solvent which essentially

er uoppløselig i vann, slik som et lavere al- is insoluble in water, such that a lower al-

kylacetat, og den karakteriseres ved at kalsiumsaltet i fast form eller i oppløsning tilsettes i en slik mengde at konsentrasjo- alkyl acetate, and it is characterized by the fact that the calcium salt in solid form or in solution is added in such an amount that the concentration

nen av kalsiumsaltet i oppløsning ikke er mer enn 1/50 av en molar konsentrasjon, of the calcium salt in solution is not more than 1/50 of a molar concentration,

hvoretter væskene filtreres for å fjerne den dannede utfelling, hvoretter den an- after which the liquids are filtered to remove the precipitate formed, after which the

syres og ekstraheres på kjent måte. acidified and extracted in a known manner.

Følgende eksempler illustrerer oppfin- The following examples illustrate the invention

nelsen : Nelson:

Eksempel 1: Example 1:

En oppløsning inneholdende 68 kg kal- A solution containing 68 kg cal-

siumklorid i 90 1 vann settes til 13.500 1 gjæringsvæske inneholdende' 2500 enheter penicillin pr. cm3 i et gjæringskar. Blan- sium chloride in 90 1 water is added to 13,500 1 fermentation liquid containing 2,500 units of penicillin per cm3 in a fermentation vessel. Blan-

dingen omrøres i 30 minutter. Utfellingen, the thing is stirred for 30 minutes. The precipitation,

som er utskilt, isoleres ved filtrering i en passende apparatur, f., eks. en Paxman ro- which is secreted, is isolated by filtration in a suitable apparatus, e.g. a Paxman ro-

terende vakuumfilter, og myceliet og ut- tering vacuum filter, and the mycelium and out-

fellingen vaskes med 675 1 vann. Det klare filtrat ansyres til pH lik 2 ved tilsetning av 30 volum-pst. fosforsyre, og den an- the precipitate is washed with 675 1 water. The clear filtrate is acidified to a pH equal to 2 by adding 30 volume percent. phosphoric acid, and the an-

syrede væske ekstraheres-med butylacetat i en Podbielniak-apparatur. Penicillinet kan isoleres fra butylacetatet og omdan- acidified liquid is extracted with butyl acetate in a Podbielniak apparatus. The penicillin can be isolated from the butyl acetate and converted

nes til et krystallinsk salt ved hjelp av kjente fremgangsmåter. nes to a crystalline salt using known methods.

Eksempel 2: Example 2:

13.500 1 gjæringsvæske inneholdende omtrent 2.500 enheter penicillin pr. cm3 13,500 1 fermentation liquid containing approximately 2,500 units of penicillin per cm3

og klares ved filtrering i en passende appa- and is managed by filtering in a suitable appa-

ratur, f. eks. en Paxman roterende va-kuum-filter. Den klare væske behandles deretter under omrøring med en oppløs- rature, e.g. a Paxman rotary vacuum filter. The clear liquid is then treated with stirring with a solvent

ning inneholdende 68 kg kalsiumklorid i 900 1 vann. Blandingen omrøres videre i 30 minutter etter at tilsetningen er til- ning containing 68 kg of calcium chloride in 900 1 of water. The mixture is stirred further for 30 minutes after the addition has been

endebrakt og utfellingen som er dannet fjernes ved filtrering. Det klare filtrat an- brought to the end and the precipitate formed is removed by filtration. The clear filtrate an-

syres til pH lik 2,0 ved tilsetning av 30 acidified to pH equal to 2.0 by adding 30

volum-pst. fosforsyre, og den ansyrede væske ekstraheres med butylacetat i en Podbielniak-apparatur. Penicillinet kan volume pst. phosphoric acid, and the deacidified liquid is extracted with butyl acetate in a Podbielniak apparatus. Penicillin can

isoleres fra butylacetatoppløsningen og omdannes til et krystallinsk salt ved hjelp av kjente fremgangsmåter. is isolated from the butyl acetate solution and converted into a crystalline salt using known methods.

Claims

1. Process for extracting penicillin from culture fluids prepared by submerged fermentation of a penicillin-producing strain of Penicillium, comprising adding a water-soluble calcium salt to the culture fluid followed by extraction with a solvent

which is essentially insoluble in water, such as a lower alkyl acetate, characterized in that a calcium salt in solid form or in solution is added in such an amount that the concentration of the calcium salt in solution is not more than 1/50 of the molar concentration, after which the liquid is filtered to remove the scum that has formed, after which they are acidified and extracted in a known manner.

2. Method according to claim 1, characterized in that the culture liquid to which the water-insoluble calcium salt has been added contains unfiltered mycelia.

3. Method according to one of claims 1 or 2, characterized in that the calcium salt used is calcium chloride.