NO115686B

NO115686B -

Info

Publication number: NO115686B
Application number: NO166243A
Authority: NO
Inventors: A Dahlqvist
Original assignee: Kabi Ab
Priority date: 1966-01-05
Filing date: 1967-01-03
Publication date: 1968-11-11
Also published as: SE317532B; FI48017B; FI48017C; DK117110B; IL27053A

Description

Diagnostiseringsmiddel for å påvise sukkerarter i animalske biologiske materialer.

Nærværende oppfinnelse vedrører et diagnostiseringsmiddel for å påvise sukkerarter i

urin og lignende animalske biologiske materialer.'

Metoder basert på spesifike oxydaseinnvirk-ning på den sukkerart man ønsker å påvise, er

kjent, likeledes fremgangsmåter ved oxydasjon

av en samtidig nærværende farveindikator å

fremkalle en forskyvning av indikatorens lys-absorbsjon mot den synlige del av spektret.

Disse kjente metoder kan i en viss omfang også

tilpasses til prøveremser som er impregnert med

oxydase, peroxydase og farveindikator.

I oppløsninger som utelukkende inneholder

den sukkerart man ønsker å påvise, virker hit-til anvendte prøveremser tilfredsstillende. Dette

gjelder såvel glykose som galaktose (kfr. Ana-lytical Biochemistry 3 (1962) : 230—235). Ved

prøver i mere komplekse biologiske materialer

som urin varierer metodikkens anvendelighet

sterkt fra en sukkerart til en annen. Likeledes

kan variasjoner mellom forskjellige prøver som inneholder den samme sukkerart forekomme. Mens glykose i urin tilfredsstillende kan påvises i de fleste urinprøver med en på vanlig måte preparert prøveremse, gjelder dette ikke for galaktose i urin, hvor ingen sikre data oppnås.

Grunnen til de av og til betydelige variasjoner ved sukkerbestemmelser i forskjellige urin-prøver er de samtidig forekommende, varierende mengder av kroppsegne stoffer samt rester eller metabolitter av næringsmidler eller legemidler.

Ved nærværende oppfinnelse er det blitt mulig å eliminere innflytelsen av de stoffer som forestiller påvisningen av den sukkerart man ønsker opplysning om i urin og lignende animalske biologiske materialer.

Den prøve man ønsker å undersøke får passere et ionutbyttermaterial som absorberer de med sukkerarten samtidig forekommende stoffer som kan interferere med den efterfølgende påvisning av den aktuelle sukkerart.

Diagnostiseringsmiddelet ifølge oppfinnelsen utformes hensiktsmessig som en prøveremse av filtrerpapirtype med en ionutbyttende oppsugningssone som prøven får passere innen den når reagenssonen, hvor ved farveforandring fore-komsten av sukkerarten påvises.

Fortrinnsvis behandles det oppsugede celluloseholdige materiale som tjener som bærer av det spesifike reagens for den aktuelle sukkerart slik at cellulosen substitueres med sure eller basiske rester hvorved den oppnår ionutbytteregenskaper. Cellulosederivat av den første type er cellulosefosfat, cellulosesulfat og karboxy-metylcellulose, mens aminoetylcellulose, dietyl-amino etylcellulose og ecteolacellulose, fremstilt fra cellulose, epiklorhydrin og trietanolamin, til-hører den sistnevnte type. I den celluloseholdige bærer kan ved papirtilberedning innarbeides andre typer av ionutbyttermateriale, f. eks. Am-berlite SB-2 eller Dowex 2x8. Sterke anionut-byttere har vist seg å gi de beste resultater ved bestemmelse av galaktose.

Følgende eksempler belyser oppfinnelsen: Eksempel 1

Dietylaminoetyl-ionutbytter-papir — oppnådd ved behandling av et oppsugende cellulose-holdig materiale, hvor cellulosen foreligger som natrium- eller annet alkalisalt, med dietylaminoetylklorid — behandles efter utvaskning med vann og tørkning i 10 minutter med 0,01 M natriumfosfatbuffer, pH = 7,0, vaskes med destillert vann og tørkes.

Ca. 50 x 50 cm av det slik behandlede papir impregneres derefter med en farveindikator, o-tolidin-metanol, fremstilt ved oppløsning av 0,75 g o-tolidin i 50 ml metanol, og får tørke i mørke. Papiret klippes i remser på ca. 10 x 60 cm.

Med begrensning av fuktningen til bare en del av papirremsen, ca. det halve papiret, appliseres pr. remse ca. 40 yd av en oppløsning med følgende sammensetning:

Papirremsene får tørke i mørke og oppbeva-res tørt. I stedet for o-tolidin kan en annen farveindikator med lignende karakteristika velges, f. eks. o-dianisidin.

Eksempel 2

Ecteola-ionutbytter-papir — oppnådd ved behandling av cellulose i form av alkalisalt med epiklorhydrin, fulgt av omsetningen med trietanolamin under vannutskillelse ■— behandles efter vaskning med vann og tørkning i 15 minutter med 0,01 M natriumfosfatbuffer, pH = 7,0, hvorefter papiret tørkes.

. Ca. 50 x 50 cm av det slik behandlede papir impregneres derefter med en farveindikator, o-tolidin-metanol — fremstilt ved oppløsning av

0,75 g o-tolidin i 50 ml metanol — og får tørke i mørke. Papiret klippes i remser ca. 10 x 60 mm.

Med begrensning av fuktningen til bare en del av papirremsen, ca. det halve papiret, appliseres pr. remse ca. 40 |il av en oppløsning med følgende sammensetning:

Eksempel 3

Aminoetyl-ionutbytterpapir — oppnådd ved behandling av natriumcellulose med aminoetyl-klorid — vaskes med destillert vann og får tørke. Materialet gjennomtrekkes med en bufferløsning pH = 7,0 og får tørke.

Ca. 50 x 50 cm av det slik behandlede papir impregneres derefter med en farveindikator,

o-tolidin-metanol — oppnådd ved oppløsning av 0,75 g o-tolidin i 50 ml metanol — og får tørke i mørke. Papiret klippes i remser ca. 10 x 60 mm.

Med begrensning av fuktningen til bare en del av papirremsen, ca. det halve papiret, appliseres pr. remse ca. 40 \ d av en oppløsning med følgende sammensetning:

Eksempel 4

Påvisning av galaktose i urin. Det anvendes en 1—2 ml urinprøve i et 10 ml beger. En prøve-remse fremstilt ifølge oppfinnelsen plaseres med sin ionutbytter impregnerte del delvis nedført i prøven, som ved kapillarkrefter suges opp til den med reagensen impregnerte del. Under passasjen under ionutbytterpapiret absorberes de substan-ser i urinen som kan interferere med og forstyrre galaktosebestemmelsen, mens nærværende galaktose passerer oppsugningssonen og frembrin-ger et utslag i den med farveindikator og reagens preparerte sone. Med o-tolidin opptrer hur-tig en blå-blågrønn farve ved nærvær av galaktose i prøven. En urinprøve fra en pasient med galaktoseurea og som inneholder 400 mg galaktose pr. 100 ml gir farvereaksjon innen 15 se-kunder.

Urinprøven som inneholder 100 mg galaktose pr. 100 ml gir farvereaksjon innen 1—2 min. Urinprøven uten galaktose gir ingen farvereaksjon.

Eks em pel 5

Dietylaminoetyl-ionutbytterpapir — oppnådd ved behandling av et oppsugende cellu-loseholdig materiale, hvor cellulosen foreligger som natrium- eller et annet alkalisalt, med dietylaminoetylklorid — behandles efter utvaskning med vann og tørring i 10 min. Med 0,01 M natriumfosfatbuffer, pH = 7,0, vaskes med destillert vann og får tørke.

Ca. 50 x 50 cm av det slik behandlede papir impregneres derefter med farveindikator, o-tolidin-metanol — oppnådd ved oppløsning av 0,75 g o-tolidin i 50 ml metanol — og får tørke i mørke. Papiret klippes i remser ca. 10 x 60 mm.

Med begrensning av infuktningen til bare en del av papirremsen, ca. det halve papiret, appliseres pr. remse ca. 40^1 av en oppløsning med følgende sammensetninng:

Eksempel 6

Ecteola-ionutbytterpapir — oppnådd ved behandling av cellulose i form av alkalisalt med epiklorhydrin, fulgt av omsetningen med trietanolamin under vannutskillelse — behandles efter vaskning med vann og tørkning i 15 min. med 0,014 natriumfosfatbuffer, pH = 7,0, hvorefter papiret tørkes.

Ca. 50 x 50 cm av det slik behandlede papir impregneres derefter med en farveindikator, o-tolidin-metanol — oppnådd ved oppløsning av 0,75 g o-tolidin i 50 ml metanol — og får tørke i mørke. Papiret klippes i remser ca. 10 x 60 mm.

Med begrensning av fuktningen til bare en del av papirremsen, ca. det halve papiret, appliseres pr. remse ca. 40 |xl av en oppløsning med følgende sammensetning:

Eksempel 7

Eksempel 8

Dietylaminoetyl-ionutbytterpapir — oppnådd ved behandling av et oppsugende cellulose-holdig materiale, hvor cellulosen foreligger som natrium- eller et annet alkalisalt, med dietylaminoetylklorid — behandles efter vaskning med vann og tørkning i 10 min. med 0,01 M natriumfosfatbuffer, pH = 7,0, vaskes med destillert vann og får tørke.

Eksempel 9

Påvisning av glykose i urin. Med en prøve-remse uten ionutbytteregenskaper i den oppsugende del ligger følsomhetsgrensen ved 30 til 60 mg/100 ml. Positiv reaksjon kan av og til oppnås ned til ca. 20 mg/100 ml og negativt svar opp til ca. 130 mg/100 ml.

Over 95 % av en normal befolkning har lavere verdi enn 20 mg/100 ml. De verdier som oppnås med en upreparert prøveremse er herved meget usikre.

Det foreligger et diagnostisk behov for å påvise glykosemengder av størrelsesorden mindre enn 3 mg/100 ml. Dette er mulig med i fore-gående eksempel beskrevne prøveremser som til-later påvisning av størrelsesorden 0,5-3 mg/100 ml urin med positiv farvereaksjon i løpet av 3 min. Ved et nivå over 4 mg/100 ml oppnås positiv farvereaksjon i løpet av 1 min.

Claims

Diagnostiseringsmiddel for påvisning av sukkerarter, fortrinnsvis galaktose eller glykose, i animalske biologiske materialer, fortrinnsvis urin, i form av en prøveremse som delvis er impregnert med en reagensblanding bestående av peroksydase, farveindikator og for sukker

arten spesifikk oxydase, karakterisert ved at prøveremsens oppsugningssone består av ioneutbyttermateriale, fortrinnsvis et an-ioneutbyttermateriale som dietylaminoetylcel-lulose.