NL9401082A

NL9401082A - Method for detecting mutations.

Info

Publication number: NL9401082A
Application number: NL9401082A
Authority: NL
Inventors: Erik Mullaart; Jan Vijg; Gert Johannis De Vos
Original assignee: Ingeny Bv
Priority date: 1994-06-28
Filing date: 1994-06-28
Publication date: 1996-02-01
Also published as: AU2684295A; WO1996000796A1

Description

WERKWIJZE VOOR HET DETECTEREN VEN MUTATIESMETHOD FOR DETECTING MUTATIONS

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het detecteren van mutaties in het genoom van een individu.The present invention relates to a method of detecting mutations in an individual's genome.

Het genetische materiaal verschilt van individu tot individu, omdat elk genoom uniek is. Genetische variatie kan vastgesteld worden door middel van hybridisatie-analyse na electroforetische scheiding van DNA-fragmenten, die gegenereerd zijn door het fragmenteren van bijvoorbeeld het genoom-DNA. Het electroforetische patroon kan van de gel overgebracht worden naar een nitrocellulose-filter. Door middel van een bijvoorbeeld radioactief gelabelde probe kunnen de delen van het genoom die met de probe hybridiseren met behulp van een röntgenfoto van het filter zichtbaar gemaakt worden. De positie van het zichtbaar gemaakte fragment is een maat voor de grootte van het fragment.The genetic material differs from individual to individual because each genome is unique. Genetic variation can be determined by hybridization analysis after electrophoretic separation of DNA fragments generated by fragmentation of, for example, genomic DNA. The electrophoretic pattern can be transferred from the gel to a nitrocellulose filter. By means of, for example, a radiolabeled probe, the parts of the genome that hybridize with the probe can be visualized by means of an X-ray of the filter. The position of the visualized fragment is a measure of the size of the fragment.

Wanneer bij het gebruik van één probe de positie van een band varieert tussen individuen is er sprake van polymorfisme. Polymorfisme wordt veroorzaakt door mutaties in bepaalde gebieden in het genoom. Dergelijke mutaties kunnen basesubstituties, maar ook inserties en deleties zijn. Door dergelijke mutaties wordt het loopgedrag van een fragment in een gel beïnvloedt. Polymorfisme kan bijvoorbeeld gebruikt worden voor het identificeren van een individu, zoals bij vaderschapsbepalingen en in de forensische geneeskunde.When using a single probe the position of a band varies between individuals, it is called polymorphism. Polymorphism is caused by mutations in certain areas of the genome. Such mutations can be base substitutions, but also insertions and deletions. Such mutations affect the walking behavior of a fragment in a gel. For example, polymorphism can be used to identify an individual, such as in paternity and forensic medicine.

Een hoge mate van polymorfisme wordt over het algemeen aangetroffen in niet-coderende delen van het genoom. In de genen komt logischerwijze minder polymorfisme voor. Genen kunnen echter wel enigszins gemuteerd zijn. Dergelijke mutaties kunnen leiden tot mutaties in de gecodeerde eiwitten of zelfs volledige inactivatie van het gen. Dergelijke fenomenen kunnen bepaalde ziektebeelden of andere afwijkingen veroorzaken. Bepaalde polymorfe gebieden, die zeer nabij de gemuteerde genen gelegen zijn kunnen samen met deze genen, die bijvoorbeeld erfelijke ziekten veroorzaken, overerven. Polymorfisme kan in dergelijke gevallen gebruikt worden bij het opsporen van de defecte genen.A high degree of polymorphism is generally found in non-coding parts of the genome. Logically, less polymorphism occurs in the genes. Genes may be slightly mutated, however. Such mutations can lead to mutations in the encoded proteins or even complete inactivation of the gene. Such phenomena can cause certain syndromes or other abnormalities. Certain polymorphic regions very close to the mutated genes can inherit together with these genes, which cause, for example, hereditary diseases. Polymorphism can be used in such cases to detect the defective genes.

Omdat niet alle defecte genen gekoppeld zijn aan polymorfe gebieden en omdat informatie omtrent mutaties in coderende gebieden zelf belangrijk kan zijn voor de analyse van de genetische basis van bepaalde ziekten is het van belang om ook die mutaties in de coderende gebieden zelf te kunnen opsporen.Because not all defective genes are linked to polymorphic regions and because information about mutations in coding regions themselves can be important for the analysis of the genetic basis of certain diseases, it is important to be able to detect those mutations in the coding regions themselves.

Zoals boven reeds vermeld, wordt bij het opsporen van variaties in het genoom over het algemeen gebruik gemaakt van de electroforetische scheiding van DNA-fragmenten op een gel. De scheiding kan in één of twee dimensies plaats vinden, waarbij een tweedimensionale scheiding vaak een betere resolutie van de fragmenten geeft.As mentioned above, the detection of variations in the genome generally uses the electrophoretic separation of DNA fragments on a gel. The separation can take place in one or two dimensions, whereby a two-dimensional separation often gives a better resolution of the fragments.

De werkwijze voor het bepalen van DNA-sequentie-variaties door middel van een tweedimensionale polyacrylami-degel is bekend uit Europees octrooi 349.024. Bij deze werkwijze wordt dubbelstrengs DNA geknipt met één of meerdere restrictie-enzymen. De verschillende fragmenten worden door middel van electroforese in twee richtingen gescheiden op basis van twee onafhankelijke criteria, bijvoorbeeld lengte en basepaarsequentie. Door het overbrengen van het schei-dingspatroon naar een nitrocellulose filter, het met de gescheiden fragmenten laten hybridiseren van een radioactieve probe en het vervolgens autoradiograferen van het filter kan het scheidingspatroon zichtbaar gemaakt worden.The method for determining DNA sequence variations by means of a two-dimensional polyacrylamide gel is known from European patent 349,024. In this method, double-stranded DNA is cut with one or more restriction enzymes. The different fragments are separated by two-way electrophoresis based on two independent criteria, for example, length and base pair sequence. By transferring the separation pattern to a nitrocellulose filter, hybridizing a radioactive probe with the separated fragments, and then autoradiographing the filter, the separation pattern can be visualized.

Bij de bekende werkwijze verschijnen de fragmenten in de vorm van een donkere vlek op de film. De positie van een fragment is specifiek voor zijn lengte en basepaarsamen-stelling. Tussen fragmenten die op dezelfde plaats terecht komen kan echter geen onderscheid gemaakt worden. Met de bekende methodes kan dus slechts één set fragmenten tegelijk geanalyseerd worden.In the known method, the fragments appear on the film in the form of a dark spot. The position of a fragment is specific to its length and base pair composition. However, no distinction can be made between fragments that end up in the same place. Thus, with the known methods, only one set of fragments can be analyzed at a time.

Daarnaast is de bekende werkwijze door de verschillende stappen zeer arbeidsintensief. Bovendien is voor elke te onderzoeken set DNA-fragmenten naast een aparte gel en een apart filter ook nog een röntgenfilm nodig. Deze materialen en ook de voor ontwikkeling van de film benodigde chemicaliën brengen uiteraard ook extra kosten roet zich mee. Afvalchemicaliën zijn tevens milieubelastend en radioactieve probes kunnen schadelijk zijn voor de gezondheid van degene die ermee werkt. Bovendien ontstaat bij het werken met radioactieve probes radioactief afval. Daarnaast kan het resultaat van het experiment pas na enige tijd verkregen worden.In addition, the known method is very labor-intensive due to the various steps. In addition, an X-ray film is required for each set of DNA fragments to be examined, in addition to a separate gel and a separate filter. These materials and also the chemicals required for the development of the film naturally also entail additional costs. Waste chemicals are also environmentally damaging and radioactive probes can be harmful to the health of those who work with them. In addition, working with radioactive probes generates radioactive waste. In addition, the result of the experiment can only be obtained after some time.

Het is het doel van de uitvinding een werkwijze voor het detecteren van mutaties in DNA van één of meer individuen te verschaffen, waarbij op eenvoudige en snelle wijze DNA van verschillende individuen tegelijkertijd onderzocht kan worden.The object of the invention is to provide a method for detecting mutations in DNA of one or more individuals, wherein DNA of different individuals can be examined in a simple and rapid manner.

Dit wordt door de uitvinding bereikt door het detecteren van mutaties in het genoom van een individu, omvattende de stappen: a) het amplificeren van tenminste één te onderzoeken fragment uit het genoom; b) het koppelen van een voor het individu uniek label aan het (de) geamplificeerde DNA-fragment (en); c) het verschaffen van (een) van een ander uniek-label voorzien(e), met het (de) te onderzoeken fragment(en) overeenkomend(e) referentiefragment (en); d) het mengen van het (de) fragment (en) en het (de) referentiefragment(en); e) het vervolgens door middel van electroforese scheiden van het mengsel; f) het zichtbaar maken van de unieke labels; en g) het vergelijken van het labelpatroon van het (de) testen fragment (en) met het labelpatroon van het (de referentiefragment(en).This is accomplished by the invention by detecting mutations in an individual's genome, comprising the steps of: a) amplifying at least one test fragment from the genome; b) linking an individual unique label to the amplified DNA fragment (s); c) providing (a) a different unique label (s) corresponding to the fragment (s) to be examined, reference fragment (s); d) mixing the fragment (s) and the reference fragment (s); e) subsequently separating the mixture by electrophoresis; f) making the unique labels visible; and g) comparing the label pattern of the test fragment (s) with the label pattern of the reference fragment (s).

Het voordeel van de werkwijze volgens de uitvinding is dat meerdere personen of meerdere genen op één enkele polyacrylamidegel gescanned kunnen worden. Dit spaart naast veel tijd ook materiaal en wordt er minder af val gegenereerd. Bovendien is het resultaat direct na de scheiding reeds beschikbaar.The advantage of the method according to the invention is that multiple persons or multiple genes can be scanned on a single polyacrylamide gel. In addition to a lot of time, this also saves material and less waste is generated. In addition, the result is available immediately after the divorce.

Bij voorkeur is de scheiding een tweedimensionale scheiding, waarbij het mengsel in één richting wordt ge- scheiden op basis van verschillen in grootte en in de andere richting op basis van verschillen in basepaarsamenstelling van de fragmenten. De scheiding in de tweede dimensie kan bijvoorbeeld plaats vinden in een denaturerende gradiënt. Fragmenten met een hoog GC-gehalte zullen bij een hogere concentratie van het denaturerende middel uitsmelten en stoppen dan fragmenten met een hoog AT-gehalte. Op deze wijze worden verschillen in basepaarsamenstelling zichtbaar gemaakt. Een tweedimensionale scheiding heeft daardoor een hogere resolutie dan een ééndimensionale scheiding.Preferably, the separation is a two-dimensional separation, where the mixture is separated in one direction based on size differences and in the other direction based on differences in base pair composition of the fragments. For example, the separation in the second dimension can take place in a denaturing gradient. Fragments with a high GC content will melt at a higher concentration of the denaturing agent and stop than fragments with a high AT content. In this way, differences in base pair composition are visualized. A two-dimensional separation therefore has a higher resolution than a one-dimensional separation.

In een praktische uitvoering van de werkwijze worden de te onderzoeken DNA-fragmenten met behulp van een DNA-amplificatiemethode vermenigvuldigd. Een dergelijke amplificatiemethode is bijvoorbeeld de polymerasekettingre-actie (PCR). Met de geamplificeerde fragmenten wordt een heteroduplexing uitgevoerd. Vervolgens worden de fragmenten van een individu van een voor dat individu specifiek label, bijvoorbeeld een fluorochroom, voorzien. Daarna worden de fragmenten op een polyacrylamidegel in twee richtingen gescheiden.In a practical embodiment of the method, the DNA fragments to be examined are multiplied by means of a DNA amplification method. One such amplification method is, for example, the polymerase chain reaction (PCR). Heteroduplexing is performed with the amplified fragments. Subsequently, the fragments of an individual are provided with a label specific for that individual, for example a fluorochrome. The fragments are then separated in two directions on a polyacrylamide gel.

Bij de scheiding zullen identieke fragmenten van verschillende personen op exact dezelfde plaats in de gel terechtkomen. Wanneer vervolgens het label zichtbaar gemaakt wordt zullen fragmenten, die ten opzichte van het overeenkomende niet- (of anders) gemuteerde fragment van een tweede individu gemuteerd zijn, op een andere plaats in de gel terechtgekomen. Nu is zichtbaar welk fragment één of meer mutaties bevat doordat de twee labels niet samenvallen.During the separation, identical fragments from different people will end up in the exact same place in the gel. Subsequently, when the label is made visible, fragments that have been mutated relative to the corresponding un- (or otherwise) mutated fragment of a second individual will be repositioned in the gel. It is now visible which fragment contains one or more mutations because the two labels do not coincide.

Bij voorkeur is het label een fluorochroom dat na met zichtbaar of onzichtbaar licht van een bepaalde golflengte te zijn aangeslagen terugvalt onder uitzending van licht met een voor dat fluorochroom specifieke golflengte. Daarnaast kan iedere andere chemische verbinding gebruikt worden, die aan een DNA-molecuul gekoppeld kan worden, op de één of andere manier aangeslagen kan worden en binnen korte tijd onder uitzending van licht met een specifieke golflengte terugvalt naar de grondtoestand.Preferably, the label is a fluorochrome which, after being excited with visible or invisible light of a certain wavelength, falls back emitting light having a wavelength specific for that fluorochrome. In addition, any other chemical compound can be used, which can be coupled to a DNA molecule, can be excited in one way or another and fall back to the ground state in a short time with the emission of light of a specific wavelength.

Het aanslaan kan eventueel ook plaatsvinden met behulp van electromagnetische straling.Striking can also take place with the aid of electromagnetic radiation.

De labels kunnen ook onafhankelijk van elkaar of in elke gewenste combinatie zichtbaar gemaakt worden. Zo zouden bijvoorbeeld de patronen van een groot aantal patiënten één voor één met de controle vergeleken kunnen worden.The labels can also be displayed independently or in any desired combination. For example, the patterns of a large number of patients could be compared with the control one by one.

Het "uniek label" wordt verder ieder ander molecuul bedoeld dat zich door middel van een waarneembaar kenmerk onderscheidt van andere overeenkomende moleculen. Naast fluorochromen valt daarbij te denken aan elementen, die elk een uniek NHR-spectrum vertonen. Voorbeelden van te gebruiken elementen zijn goud, zilver, nikkel, ijzer etc..The "unique label" is further meant any other molecule that distinguishes itself from other corresponding molecules by an observable characteristic. In addition to fluorochromes, this includes elements that each have a unique NHR spectrum. Examples of elements to be used are gold, silver, nickel, iron, etc.

De fragmenten van een persoon worden dan voorzien van een voor die persoon uniek element dat later met behulp van bijvoorbeeld NMR, röntgendiffractie of andere technieken onderscheiden kan worden.The fragments of a person are then provided with a unique element for that person, which can later be distinguished using, for example, NMR, X-ray diffraction or other techniques.

In een voorkeursuitvoeringsvorm van de uitvinding wordt het label gevormd door fluorochromen, die na excitatie elk licht met een duidelijk waarneembare kleur uitzenden. Wanneer de set DNA-fragmenten van één patiënt met een geel fluorochroom gelabeld wordt en de controle met een blauw fluorochroom zullen samenvallende fragmenten aanleiding geven tot groene spots. In geval van een mutatie zal enerzijds een blauwe spot op de plaats van het niet-gemuteerde gen en anderzijds een gele spot op een geheel andere plaats waarneembaar zijn.In a preferred embodiment of the invention, the label is formed by fluorochromes, which upon excitation emit any light of a clearly perceptible color. When the set of DNA fragments from one patient is labeled with a yellow fluorochrome and the control with a blue fluorochrome, coincident fragments will give rise to green spots. In case of a mutation, on the one hand, a blue spot on the site of the non-mutated gene and on the other hand, a yellow spot on a completely different site will be visible.

Wanneer de DNA-fragmenten van meerdere patiënten, welke per persoon gelabeld zijn met een voor die patiënt specifiek label, tezamen met een controle op een gel gebracht worden kan tegelijkertijd het DNA van een groot aantal patiënten onderzocht worden. Niet alleen wordt de tijdrovende stap van het overbrengen van de fragmenten naar een nitrocellulosefilter, het hybridiseren en vervolgens autoradiograferen, hiermee vermeden maar tevens bestaat nu de mogelijkheid om met behulp van één gel een groot aantal patiënten tegelijk te screenen. Dit spaart naast materiaal ook tijd. Een bijkomend voordeel is dat doordat de fragmen- ten niet overgebracht hoeven te worden naar een filter er ook geen fragmenten meer verloren kunnen gaan.When the DNA fragments of several patients, which are labeled per person with a label specific for that patient, are applied to a gel together with a control, the DNA of a large number of patients can be examined simultaneously. Not only is this avoiding the time-consuming step of transferring the fragments to a nitrocellulose filter, hybridizing and then autoradiographing, but there is now also the possibility of screening a large number of patients simultaneously using one gel. In addition to material, this also saves time. An additional advantage is that because the fragments do not have to be transferred to a filter, fragments can no longer be lost.

De uitvinding betreft verder een inrichting voor het uitvoeren van de werkwijze volgens de uitvinding. De inrichting bestaat uit een drager voor een gel, een aan één zijde van de gel geplaatste lichtbron, die licht uitzendt met een zodanig golflengtebereik dat alle in het labelpa-troon voorkomende exciteerbare labels daarmee aangeslagen kunnen worden, een aan de andere zijde van de gel geplaatst filter, dat het door de lichtbron uitgezonden licht niet en het door de exciteerbare labels uitgezonden licht wel doorlaat, en middelen voor het waarnemen van het patroon van door de exciteerbare labels uitgezonden licht.The invention further relates to a device for carrying out the method according to the invention. The device consists of a support for a gel, a light source placed on one side of the gel, which emits light with a wavelength range such that all excitable labels occurring in the label pattern can be excited therewith, one on the other side of the gel placed filter, which does not transmit the light emitted from the light source and the light emitted by the excitable labels, and means for observing the pattern of light emitted by the excitable labels.

Het labelpatroon kan uiteraard ook met het oog waargenomen worden. In geval van een klein aantal patiënten met duidelijk onderscheidbare kleurlabels is dat nog wel doenlijk. Wanneer echter het aantal patiënten groter wordt en de labels minder gemakkelijk van elkaar te onderscheiden zijn bevat de inrichting bij voorkeur een scanner, die de door elke spot uitgezonden golflengten kan detecteren.The label pattern can of course also be seen by eye. In the case of a small number of patients with clearly distinguishable color labels, this is still feasible. However, as the number of patients increases and the labels are less easily distinguishable from each other, the device preferably includes a scanner which can detect the wavelengths emitted by each spot.

Bij voorkeur is de inrichting verder voorzien van een verwerk ingseenheid voor het analyseren van het door de waarnemingsmiddelen waargenomen lichtpatroon. Wanneer het mogelijk is de scheiding te standaardiseren kunnen de resultaten automatisch vergeleken worden met in de verwerkings-eenheid opgeslagen gegevens. Hierdoor kan de diagnostiek voor een groot deel geautomatiseerd worden.Preferably, the device is further provided with a processing unit for analyzing the light pattern observed by the observation means. When it is possible to standardize the separation, the results can be automatically compared with data stored in the processing unit. This allows the diagnostics to be largely automated.

Wanneer het gewenst is het uitgezonden labelpatroon vast te leggen kan de inrichting tevens een registra-tie-eenheid bevatten. Hierbij valt te denken aan een foto-of videocamera.If it is desired to capture the broadcast label pattern, the device may also include a recording unit. This could include a photo or video camera.

Toepassingen van de uitvinding worden bijvoorbeeld gevonden in de prenatale of preconceptieve diagnostiek.Applications of the invention are found, for example, in prenatal or preconceptive diagnostics.

In de begeleidende figuren 1 en 2 wordt het principe van de uitvinding geïllustreerd. In figuur 3 wordt schematisch een uitvoeringsvorm van de inrichting volgens de uitvinding getoond.In the accompanying figures 1 and 2 the principle of the invention is illustrated. Figure 3 schematically shows an embodiment of the device according to the invention.

De figuren 1 en 2 worden besproken in het bijgaande voorbeeld.Figures 1 and 2 are discussed in the accompanying example.

Figuur 3 toont een schematisch overzicht van een uitvoeringsvorm volgens de uitvinding. De gel 1 bevindt zich op een niet getoonde drager. De drager kan een aparte drager zijn maar ook gevormd worden door één of beide glasplaten van de oorspronkelijke gelopstelling. Daarnaast kan de gel ook direct op het filter geplaatst worden. Hierbij doet het filter dienst als drager. Aan één zijde van de gel bevindt zich een filter 2. Aan de andere zijde bevindt zich een lichtbron 3 met een geschikt golflengtebereik, bijvoorbeeld een UV-lamp. Aan de van de gel af gekeerde zijde van het filter bevindt zich een scanner 4. Het filter 2 laat het door de lamp 3 uitgezonden en door de gel vallende licht niet door naar de scanner 4. Het door de fluorochromen in de gel 1 geëmitteerde licht wordt echter wel doorgelaten. Met behulp van de scanner kan vastgesteld worden op welke plaats welke golflengte wordt uitgezonden. Aan de hand van die gegevens kan het spotpatroon geanalyseerd worden.Figure 3 shows a schematic overview of an embodiment according to the invention. The gel 1 is on a carrier (not shown). The support can be a separate support, but can also be formed by one or both glass plates of the original gel arrangement. In addition, the gel can also be placed directly on the filter. The filter serves as a carrier. On one side of the gel there is a filter 2. On the other side there is a light source 3 with a suitable wavelength range, for example a UV lamp. On the side of the filter facing away from the gel there is a scanner 4. The filter 2 does not transmit the light emitted by the lamp 3 and the gel passing through it to the scanner 4. The light emitted by the fluorochromes in the gel 1 however, is allowed to pass. Using the scanner, it can be determined at which place which wavelength is transmitted. The spot pattern can be analyzed on the basis of this data.

De onderhavige uitvinding zal verder worden verduidelijkt aan de hand van de bijgaande voorbeelden, die hierbij slechts als illustratie gegeven worden en niet de bedoeling hebben de uitvinding op enigerlei wijze te beperken.The present invention will be further elucidated on the basis of the accompanying examples, which are given by way of illustration only and are not intended to limit the invention in any way.

VOORBEELD 1EXAMPLE 1

In dit voorbeeld wordt het gen dat gemuteerd aanleiding geeft tot de ziekte cystische fibrose vergeleken met het overeenkomende niet-gemuteerde gen. Door middel van PCR wordt een amplificatie van de exons van het gen uitgevoerd. Hierbij wordt gebruik gemaakt van primers die hybri-diseren met de uiteinden van de verschillende exons. De op deze wijze gevormde fragmenten van het gemuteerde gen, die in hoofdzaak de gehele exons omvatten, worden gelabeld met een geel licht-emitterend fluorochroom. De fragmenten die gevormd zijn uitgaande van het niet-gemuteerde gen worden met een blauw licht-emitterend fluorochroom gelabeld.In this example, the mutated gene giving rise to cystic fibrosis disease is compared to the corresponding unmutated gene. Amplification of the exons of the gene is performed by PCR. Primers that hybridize with the ends of the different exons are used. The fragments of the mutated gene formed in this way, comprising substantially the entire exons, are labeled with a yellow light-emitting fluorochrome. The fragments generated from the non-mutated gene are labeled with a blue light-emitting fluorochrome.

De beide sets fragmenten worden vervolgens gemengd en op een tweedimensionale polyacrylamidegel gescheiden. Na de scheiding wordt de gel belicht waardoor de fluorochromen worden aangeslagen. Het vervolgens door de fluorochromen uitgezonden gele en blauwe licht wordt gedetecteerd als een groene vlek op plaatsen waar de fragmenten identiek zijn, als een blauwe vlek op een plaats waar een fragment van het niet-gemuteerde gen terechtgekomen is, en als een gele vlek op plaatsen waar de gemuteerde fragmenten van het gemuteerde gen aanwezig zijn.The two sets of fragments are then mixed and separated on a two-dimensional polyacrylamide gel. After the separation, the gel is exposed, whereby the fluorochromes are excited. The yellow and blue light subsequently emitted by the fluorochromes is detected as a green spot in places where the fragments are identical, as a blue spot in a place where a fragment of the unmutated gene has entered, and as a yellow spot in places where the mutated fragments of the mutated gene are present.

Het resultaat wordt getoond in de figuren IA t/m IC. Figuur IA is een gel met alleen de fragmenten van een patiënt. De fragmenten van het niet-gemuteerde gen worden zichtbaar gemaakt in de gel in figuur 1B. Figuur IC toont de combinatie van beide gels.The result is shown in Figures 1A through IC. Figure 1A is a gel containing only the fragments of a patient. The fragments of the non-mutated gene are visualized in the gel in Figure 1B. Figure IC shows the combination of both gels.

Hierin worden de verschillende kleuren aangeduid zoals aangegeven in het onder staande overzicht.Here the different colors are indicated as indicated in the overview below.

VOORBEELD 2EXAMPLE 2

In dit experiment wordt op dezelfde wijze als in voorbeeld 1 een niet-gemuteerd gen gecombineerd met twee verschillende gemuteerde genen. Het niet-gemuteerde gen is opnieuw gelabeld met een blauwe kleurstof, de gemuteerde genen zijn gelabeld met respectievelijke rode en een groene fluorochromen. De mengkleur van deze drie kleuren licht is wit. Na belichting wordt op alle plaatsen waar zich fragmenten van de drie individuen bevinden wit licht uitgezonden. Het grootste deel van de fragmenten is niet waarneembaar.In this experiment, an unmutated gene is combined with two different mutated genes in the same manner as in Example 1. The unmutated gene has been relabeled with a blue dye, the mutated genes have been labeled with red and a green fluorochromes, respectively. The mixing color of these three colors of light is white. After exposure, white light is emitted in all places where fragments of the three individuals are located. Most of the fragments are imperceptible.

Een gemuteerd fragment van de met rood gelabelde persoon is zichtbaar als een rode lichtvlek. Op de oorspronkelijke plaats van dat fragment blijft slechts de combinatie van blauw en groen over omdat het rode licht daar verdwenen is. Op de plaatsen waar het groene licht verdwenen is blijft een paarse vlek over terwijl de groene vlek op een andere plaats zichtbaar is.A mutated fragment of the person labeled with red is visible as a red spot of light. In the original place of that fragment, only the combination of blue and green remains because the red light has disappeared there. In the places where the green light has disappeared, a purple spot remains, while the green spot is visible in another place.

In de figuren 2A t/m 2D wordt het resultaat van het bovenstaande experiment schematisch geïllustreerd.Figures 2A through 2D schematically illustrate the result of the above experiment.

De onderhavige uitvinding verschaft een werkwijze en inrichting waarmee op snelle en eenvoudige wijze een groot aantal individuen op mutaties in hun genoom onderzocht kan worden. De uitvinding is met name van belang voor de diagnostiek, maar is daartoe niet beperkt.The present invention provides a method and apparatus for quickly and easily screening a large number of individuals for mutations in their genome. The invention is particularly important for diagnostics, but is not limited thereto.

Claims

A method for detecting mutations in an individual's genome, comprising the steps of: a) amplifying at least one test fragment from the genome; b) linking an individual unique label to the DNA fragment (s); c) providing (a) a different unique label (s) corresponding to the fragment (s) to be examined, corresponding reference ragment (s); d) mixing the fragment (s) and the reference fragment (s); e) subsequently separating the mixture by electrophoresis; f) making the unique labels visible; and g) comparing the label pattern of the test fragment (s) with the label pattern of the reference fragment (s).

A method according to claim 1, characterized in that the separation is carried out by means of two-dimensional electrophoresis, the mixture being separated in one direction on the basis of differences in size and in the other direction on the basis of differences in base pair composition of the fragments

Method according to claim 1 or 2, characterized in that the DNA is amplified by the PCR technique.

Method according to claim 1, 2 or 3, characterized in that the unique label is a fluorochrome.

Method according to claim 4, characterized in that the fluorochrome is made visible with the aid of light.

A method according to claim 1, 2 or 3, characterized in that the unique label is a chemical element.

A method according to claim 6, characterized in that the chemical element is visualized using NMR or X-ray diffraction techniques.

Apparatus for displaying a label pattern, for example generated by the method according to any one of claims 1-5, comprising a carrier for a gel, a light source placed on one side of the gel, which emits light with such a wavelength -provide that all excitable labels occurring in the label pattern can be struck therewith, a filter placed on the other side of the gel, that the light emitted by the light source does not transmit and the light emitted by the excitable labels, and means for detecting of the pattern of light emitted from the excitable labels.

Device as claimed in claim 8, characterized in that the means for detecting the emitted light pattern are formed by a scanner.

The apparatus of claim 8 or 9, further comprising a processing unit for analyzing the light pattern perceived by the sensing means.

The device of any one of claims 8-10, further comprising a recording unit for recording the light pattern.