NL9001404A - Niet-toxisch pseudomonas exotoxine a. - Google Patents

Description

Titel: Niet-toxisch Pseudomonas exotoxine A.

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op een niet-toxisch Pseudomonas exotoxine A, zijn bereiding en zijn gebruik in de bereiding van een PE vaccin.

Pseudomonas aerucrinosa zijn gramnegatieve bacillen. Zij zijn wijd verspreid in de natuur en omvatten ongeveer 10% van de normale darmbacteriën. Dergelijke bacteriën infecteren zelden gezonde personen, maar infecteren mensen met een deficiënte immuniteit zoals patiënten die leiden aan brandwonden, cystische fibrose, kwaadaardige tumoren, of patiënten die immuunsuppressieve medicijnen innemen. Pseudomonas aeruginosa produceren Pseudomonas exotoxine A (PE) na infectie. PE toxine is werkzaam tegen levercellen en vernietigt de leverfunctie, hetgeen tot de dood leidt. Pseudomonas aeruqinosa zijn de belangrijkste pathogenen in ziekenhuizen. Daarbij komt, dat zij een sterke tolerantie voor de meeste antibiotica hebben; infecties resulteren meestal in therapeutische moeilijkheden. Om dit probleem op te lossen is vaccinatie de beste methode.

PE is een enkele polypeptideketen die 613 aminozuren omvat. De drie-dimensionale moleculaire structuur van PE wordt in de drie structurele domeinen, zoals die beneden getoond zijn, verdeeld, te weten domein I, dat domein Ia (residuen 1-252) en domein Ib (residuen 365-404) omvat, domein II (residuen 253-364) en domein III (residuen 405-613)

Ia II Ib III

0 252 364 404 613 aminozuren

Domein Ia is het domein waarin het toxine zijn receptor kan herkennen op het membraan van toxine-gevoelige cellen. Domein II is het translocatiedomein van PE dat het toxine van het endosoom naar het cytoplasma verplaatst. Domein III en de aangrenzende 20 aminozuren (residuen 385-404) van domein Ib zijn de ADP-ribosylatie enzymatische domeinen van PE (Gray et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA £1, 2645-2649; Hwang et al. (1987) Cell 4&, 129-136; Douglas en Collier (1987) J. Bacteriol. 169, 4967-4971; en Chen et al. (1987) J. Gen. Microbiol. 133. 3081-3091).

Het mechanisme van het PE intoxicatieproces begint met de binding van PE aan zijn specifieke receptor op het oppervlak van toxine-gevoelige cellen. Het PE receptorcomplex gaat vervolgens de cel binnen via door de receptor gemedieerde endocytose. Uiteindelijk wordt het PE getransloceerd naar het cytosol waar het de overgang van de ADP-ribose-eenheid van NAD+ naar elongatiefactor 2 katalyseert. Dit maakt EF-2 inactief in de eiwitsynthese en leidt tot de dood van aangetaste cellen (Fitz Gerald et al. (1980) Cell 21, 867-873; Fitz Gerald et al. (1982) Infect. Immunol. 35r 715-720;

Morris et al. (1983) Infect. Immunol. 40, 806-811;

Eidels et al. (1983) Microbiol. Rev. 47, 596-620; en Middlebrook en Dorland (1984) Microbiol. Rev. 48, 199-221).

Het volgende toont het evenwicht van ADP-ribosylatie van EF-2 met PE: EF-2 + NAD+ (overvloedig in cellen) === ADP-ribose-EF-2 + nicotinamide + H+

De traditionele werkwijzen voor het bereiden van vaccins omvatten ontgiftiging van de pothogenen door hitte of chemicaliën, of zuivering van het oppervlakte-antigeen van de pathogenen. Dergelijke methoden hebben gebreken; bijvoorbeeld blijft er toxine over, is de antigeniciteit niet sterk genoeg, of bestaat de mogelijkheid dat zij, die de vaccins bereiden, geïnfecteerd worden.

Marburg et al. stelden in 1983 voor dat het PE toxoïde, bereid door fotoaffiniteit-inactivatie, gebruikt kan worden als vaccin. Het principe bestaat uit het produceren van een covalente binding tussen NAD+ en PE door UV-bestraling om het verlies van ADP-ribosylatie enzymatische werking van PE te veroorzaken (Marburg et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 22870-2873).Een gebrek van deze werkwijze is echter dat een dergelijke reactie niet verzekeren kan dat alle PE moleculen fotoaffinitief geïnactiveerd zijn en derhalve blijven er toxines over. Daarom is het PE toxoïde bereid door zo'n methode niet geschikt.

Tegenwoordig omvat de beste werkwijze het ligeren van de structurele genen van de oppervlakte-antigenen van het pathogeen in een vector door genetische manipulatie, het transformeren van de vector in E. coli. gist of zoogdiercellen voor expressie, gevolgd door zuivering. In deze uitvinding worden niet-toxische PE fragmenten bereid door deze techniek en gebruikt voor de bereiding van een nieuw vaccin tegen PE. Het gebruik van dergelijk niet-toxisch PE als vaccin is absoluut veilig en heeft een sterke antigeniciteit.

Deze uitvinding heeft betrekking op niet-toxische PE's. Dergelijke gemodificeerde PE's verliezen hun ADP-ribosylatiewerking volledig en hebben geen cytotoxiciteit vanwege het feit dat 36 of meer carboxyterminale aminozuren weggenomen zijn.

Dergelijk niet-toxisch PE wordt geïsoleerd van dat wat tot expressie wordt gebracht in de gastheer waarin het plasmide met sequentiële deleties van de structurele genen van het carboxy-uiteinde van PE tot uitdrukking wordt gebracht.

Aangezien het PE zonder cytotoxiciteit de cytotoxiciteit van intact PE kan blokkeren, kan het gebruikt worden als vaccin tegen de ziektes veroorzaakt door PE.

Dienovereenkomstig is het een doel van de onderhavige uitvinding om te voorzien in een niet-toxisch PE met een deletie van 36 of meer carboxyterminale aminozuren.

Het is een ander doel van de onderhavige uitvinding om te voorzien in een plasmide met sequentiële deleties van de structurele genen van het carboxy-uiteinde van PE.

Het is nog een ander doel van de onderhavige uitvinding om te voorzien in een bereidingswerkwijze voor het PE.

Het is een verder doel van de onderhavige uitvinding om te voorzien in niet-toxisch PE voor de bereiding van het nieuwe vaccin tegen PE.

Deze en andere doelen, eigenschappen en voordelen van de onderhavige uitvinding zullen duidelijk worden uit de volgende beschrijving, welke, samen met de bijgaande tekeningen, de momenteel geprefereerde uitvoeringsvorm van de onderhavige uitvinding openbaart. Men moet begrijpen dat deze beschrijving eerder illustratief dan limitatief is, waarbij het bereik van de onderhavige uitvinding gedefinieerd wordt door de conclusies .

De onderhavige uitvinding zal verder uitgelegd worden onder verwijzing naar de aanhangige tekeningen waarin: fig. 1 (Ά) de eigenschappen van het structurele PE gen toont; en (B) constructies van plasmiden, gebruikt voor de expressie van PE met verschillende deleties aan het carboxy-uiteinde. pJH4 werd partieel met Hhal geknipt. Gelineariseerd DNA van 5,9 kilobasen werd vervolgens volledig met EcoRI geknipt. DNA fragmenten variërend van 4,4-5,9 kilobasen werden geïsoleerd en geligeerd met een synthetische oligonucleotide linker, welke stopcodons in alle drie leesramen bevatte; fig. 2 PE deletieklonen tot expressie gebracht door de gemodificeerde plasmiden toont; fig. 3 de ADP-ribosylatie enzymatische werking van het PE toont van de expressie van het gemodificeerde plasmide in gastheer BL21(DE3). PE van volledige lengte verkregen uit BL21(DE3)/pJH4 werd gebruikt als een positieve controle en staat voor 100% ADP-ribosylatiewerking. BL21(DE3)/- werd gebruikt als negatieve controle. De relatieve ADP-ribosylatié-activiteiten van alle andere PE fragmenten verkregen uit BL21(DE3)/pJJl tot BL21(DE3)/pJJ14 werd gemeten. De specifieke ADP-ribosylatie-activiteiten van PE-deleties werden vergeleken met deze van PE met volledige lengte verkregen uit BL21(DE3)/pJH4.

Volgens de onderhavige uitvinding behoudt het niet-toxische PE waarin 36 of meer aminozuur residuen aan het carboxy-uiteinde van PE polypeptide weggenomen zijn door recombinant DNA techniek, toxine-bindende werking, maar verliest het ADP-ribosylatie enzymatische werking en verliest het overeenkomstig zijn cytotoxiciteit.

Het niet-toxische PE van de onderhavige uitvinding kan bereid worden door het transformeren van het plasmide met deleties van het structurele PE gen van 36 of meer aminozuren van de carboxy-terminus naar een gastheer en het tot expressie brengen van het getransformeerde plasmide in de gastheer. De constructie van het plasmide omvat een partiële digestie van een plasmide dat de volledige coderende sequentie bevat van rijp PE met Hhal en isolatie van het gelineariseerde DNA; volledige digestie van het gelineariseerde DNA met EcoRI; en ligatie van het DNA fragment met een linker.

De domeinen van de ADP-ribosylatie enzymatische werking van PE zijn geïdentificeerd als zijnde domein III en een deel van domein Ib. Voor het verder bepalen van het gedeelte van het carboxy-uiteinde van het toxine dat noodzakelijk is voor de ADP-ribosylatiewerking werden de plasmiden, geconstrueerd volgens de onderhavige werkwijze, individueel overgebracht in E. coli voor expressie. De grootte van de deletie in het plasmide werd opgehelderd door restrictieanalyse en mapping naar grootte.

De transformanten, verkregen uit de expressie van de deletieplasmiden in gastheren, werden op geschikte wijze gekweekt en de ADP-ribosylatiewerkingen van de verkregen PE clonen werden in een assay bepaald (Collier en Kandel (1971) J. Biol. Chem. 246. 1496-1503). De resultaten geven aan dat klonen met deleties van de carboxy-terminale aminozuurresiduen van Arg-609 tot Lys-613 en vervangen door Arg-Asn een wild-type PE ADP-ribosylatiewerking behielden. Deletie van de terminale aminozuurresiduen van Ala-596 tot Lys-613 en vervangen door Val-Ile-Asn verminderde de ADP-ribosylatie-werking met 75%, terwijl deleties van 36 of meer aminozuren van het carboxy-uiteinde hun ADP-ribosylatiewerking volledig verloren.

Deze gemodificeerde PE's werden ook onderzocht op hun cytotoxiciteit en mogelijkheid om PE cytotoxiciteit te blokkeren. De resultaten laten zien, dat gemodificeerde PE's, die hun ADP-ribosylatiewerking verloren, overeenkomstig hun cytotoxiciteit verloren. Bovendien waren extracten, die PE fragmenten zonder ADP-ribosylatiewerking bevatten, in staat de cytotoxische werking van intact PE te blokkeren. Gebaseerd op dit principe is het gebruik van de PE's met deleties van 36 of meer aminozuren van het carboxy-uiteinde de beste keuze voor nieuwe PE vaccins tegen de ziektes veroorzaakt door PE. Daarnaast is de hoeveelheid van het gemodificeerde PE geproduceerd door de expressie van de plasmiden met de deletie van 36 aminozuren van het carboxy-uiteinde van het PE gen in £. coli overvloedig. Met betrekking tot de veiligheid zijn de vaccins bereid door deze genetische manipulatiewerkwijze absoluut veilig, terwijl zij met betrekking tot de antigeniciteit absoluut effectief zijn. Met betrekking tot de produktie zijn de kosten niet hoog en is de werkwijze gemakkelijk.

De volgende voorbeelden worden gegeven voor een beter begrip van de onderhavige uitvinding en zijn niet gemaakt om het bereik daarvan te begrenzen.

VOORBEELD 1

Constructie van plasmlden met seriële deleties aan het 3' eind van het structurele PE oen

Plasmiden (pJJl-pJJ14) met seriële deleties aan de carboxyterminus van het structurele PE gen werden geconstrueerd uit het plasmide pJH4, dat de volledige coderende sequentie van rijp PE bevat met een extra methionine aan de amino-terminus met behulp van de werkwijze als getoond in fig. 1.

Gebruikmakend van de sequentiegegevens gerapporteerd door Gray et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 2645-2649 digesteerden wij eerst partieel pJH4 met Hhal. Het gelineari-seerde DNA van 5,9 kilobasen werd geïsoleerd en vervolgens volledig gedigesteerd met EcoRl. DNA fragmenten variërend van 4,4 tot 5,9 kilobasen werden geïsoleerd. Een synthetisch oligonucleotide duplex met cohesieve einden voor Hhal en EcoRl werd gebruikt om de gelineariseerde fragmenten te ligeren. De synthetisch oligonucleotide duplex, die gebruikt werd om de twee niet-complementaire einden aan elkaar te koppelen, omvatte een universele sequentie voor de terminatie van proteïnesynthese. Het bevatte stopcodons in alle drie leesramen.

pJJl tot pJJ14 werden individueel overgedragen naar de gastheer (£. coli) en de deletiegrootte in elk plasmide werd opgelost door restrictieanalyse en mapping naar grootte. De resultaten worden getoond in fig. 2.

VOORBEELD 2

De bereiding van niet-toxische PE's

Plasmiden pJJl tot pJJ14 werden individueel overgedragen naar gastheer BL21(DE3), die gelysogeniseerd was met een faag (DE3) die het T7 RNA polymerase gen onder controle van een lacUVS promotor droeg, volgens de methode volgens Davis et al. (1986) Basic Methods in Molecular Biology, blz. 90-92, Elsevier Scientific Publishing Co., New York. De resulterende transformanten werden onmiddellijk gekweekt in LB broth met 50 μg/ml ampicilline bij 37°C. Wanneer de absorptie bij 650 nm 0,3 bereikte, werd isopropyl-l-thio-B-D-galacto-pyranoside(IPTG) toegevoegd tot een eindconcentratie van 0,5 mM om de synthese van T7 polymerase, dat op de BL21(DE3) lysogene faag gelegen was, te induceren. De cellen werden 90 minuten later geoogst om de PE klonen met seriële deleties aan het carboxy-uiteinde dat tot expressie werd gebracht in BL21(DE3), te winnen.

Voor een assay naar ADP-ribosylatieactiviteit werd de algemene procedure van Collier en Kandel gevolgd (J. Biol.

Chem. 246. 1496-1503, 1971). Tarwekiemextracten, verrijkt voor EF-2, werden als een bron voor EF-2 gebruikt. Assays (500-μ1 totaalvolume) bevatten ongeveer 10 pmol EF-2, 37 pmol [U-14C]NAD+ (0,06 μΟΙ), lysaat van BL21(DE3) met verschillende PE klonen en buffer (40 mM dithiothreitol, 1 mM EDTA, en 50 mM Tris, pH 8,1). De cellen werden gelyseerd met 2 mg/ml lysozym bij kamertemperatuur in 50 mM Tris, pH 8,0, en 50 mM EDTA, gevolgd door centrifugatie om supernatant van pellet te scheiden. Het pellet werd vervolgens opgelost in 8 M ureum. Activiteit in het supernatant en pellet werd gemeten in picomol ADP-ribose overgedragen naar EF-2 in 30 minuten in afzonderlijke reacties. Na incubatie gedurende 30 minuten, 37°C, werd 0,5 ml 12%*s trichloorazijnzuur toegevoegd aan elk assay-mengsel. De assay-mengsels werden vervolgens in een ijsbad gezet gedurende 15 minuten gevolgd door centrifugatie bij 4°C, 3000 g gedurende 10 minuten. Het pellet werd gewassen met 1 ml 6%'s trichloorazijnzuur en gecentrifugeerd als boven. Het 14C-gehalte van het pellet werd gemeten in een vloeibare scintillatieteller als een index voor de ADP-ribosylatiewerking.

PE van volledige lengte, verkregen uit BL21(DE3)/pJH4, werd gebruikt als een positieve controle en staat voor 100% ADP-ribosylatieactiviteit. BL21(DE3)/- werd gebruikt als negatieve controle. De relatieve ADP-ribosylatiewerking van alle andere PE fragmenten verkregen uit BL21(DE3)/pJJl tot BL21(DE3)/pJJ14 werd gemeten. De specifieke ADP-ribosylatie-activiteiten van PE deleties werden vergeleken met die van PE van volledige lengte verkregen BL21(DE3)/pJH4. De resultaten staan in fig. 3.

Het PE fragment van plasmide pJJl, dat een deletie van de carboxy-terminale aminozuurresiduen van Arg-609 tot Lys-613 bevat en vervangen wordt door Arg-Asn, behield wild-type PE ADP-ribosylatieactiviteit. Echter een deletie van carboxy-terminale aminozuurresiduen van Ala-569 tot Lys-613 en vervangen door Val-Ile-Asn verminderde de ADP-ribosylatieactiviteit dramatisch met 75%. Deleties van 36 of meer aminozuren van de carboxy-terminus reduceerde alle enzymatische activiteit tot het niveau van BL21(DE3) gastheercellen welke blootgesteld werden aan gelijke inductieomstandigheden.

VOORBEELD 3 Celbeschermincrsassay

Testen van de PE fragmenten voor de bescherming van de PE cytotoxiciteit werden uitgevoerd in Swiss 3T3 cellen.

Swiss 3T3 cellen werden 24 uur voor de beschermingsassay "gezaaid". Elke put bevatte 2 x 104 cellen. Na incubatie gedurende 72 uur in aanwezigheid van verschillende concentraties van PE alleen of met BL21(DE3) celextracten, die PE fragmenten bevatten, werden de monolagen vervolgens gekleurd met methyleenblauw om de overlevende cellen te detecteren.

De pJJ3- en pJJ4-deletiefragmenten, welke geen enkele ADP-ribosylatiewerking behielden, bleken eveneens hun cytotoxiciteit verloren te hebben. Deze deletiefragmenten behielden echter hun mogelijkheid om de cytotoxiciteit van natief PE op Swiss 3T3 cellen competitief te blokkeren. Bij hogere concentraties konden de gemodificeerde fragmenten geproduceerd door plasmiden pJJ3 en pJJ4, effectief intoxicatie door PE voorkomen.

Hoewel de uitvinding beschreven is met betrekking tot bepaalde voorkeursvoorbeelden en -uitvoeringsvormen, wordt de uitvinding niet geacht beperkt te zijn tot dit bereik, maar alleen tot de conclusies die hierna komen.

Claims (9)

1. Niet-toxisch Pseudomonas exotoxine A (PE), met het kenmerk, dat het een PE polypeptideketen is met een deletie van 36 of meer aminozuurresiduen van de carboxy-terminus, en dat het in staat is om de cytotoxiciteit van intact PE te blokkeren.

2. Het gebruik van een PE volgens conclusie 1 in de bereiding van een PE vaccin.

3. Plasmide met deleties van het structurele PE gen van 36 of meer aminozuren van de carboxy-terminus.

4. Werkwijze voor de constructie van het plasmide volgens conclusie 3, omvattende: (A) partiële digestie van een plasmide dat de volledige coderende sequentie van rijp PE bevat met Hhal en isolatie van gelineariseerd DNA; (B) volledige digestie van het gelineariseerde DNA met EcoRI; (C) ligatie van het DNA fragment met een linker om het gewenste plasmide te verkrijgen.

5. Werkwijze volgens conclusie 4, waarin het plasmide, dat de volledig coderende sequentie van rijp PE bevat, pJH4 is.

6. Werkwijze volgens conclusie 4, waarin de linker een synthetisch oligonucleotide duplex is, welke een universele sequentie voor de terminatie van proteïnesynthese omvat.

7. Werkwijze volgens conclusie 6, waarbij de linker is 31TAATTAATTAG GCATTAATTAATCTTAA 5'.

8. Werkwijze voor de bereiding van een niet-toxisch PE, welke omvat het transformeren van het plasmide volgens conclusie 3 naar een gastheer en het tot expressie brengen van het getransformeerde plasmide in de gastheer om het gedeleteerde PE te verkrijgen.

9. Werkwijze volgens conclusie 8, waarin de gastheer E. coli is.