NL8901576A - Werkwijze voor het bereiden van een alfa-amylase-adsorbent, geschikt voor gebruik in de affiniteitschromatografie, werkwijze voor het omzetten van een dergelijk adsorbent van de poedervorm in de granule-vorm, het verkregen adsorbent in poeder- en granulevorm alsook werkwijze voor het winnen van alfa-amylase, in het bijzonder bacterieel alfa-amylase, met behulp van het betreffende adsorbent. - Google Patents

Description

Werkwijze voor het bereiden van een g-amylase-adsorbent, geschikt voor gebruik in de affiniteitschromatografie, werkwijze voor het omzetten van een dergelijk adsorbent van de poedervorm in de granule-vorm, het verkregen adsorbent in poeder- en granuleform alsook werkwijze voor het winnen van q-amylase, in het bijzonder bacterieel α-amylase, met behulp van het betreffende adsorbent.

Als uitvinders worden genoemd: W.A.C. Somers-*-, H.J.Rozie^>3, K.van ’t Riet^, F.M. Rombouts^ en J.Visser^· * Laboratorium voor Proceskunde Landbouwuniversiteit Wageningen Bomenweg 2 6703 HD Wageningen 2 Laboratorium voor Levensmiddelenchemie en Levensmiddelenmicrobiologie Landbouwuniversiteit Wageningen Bomenweg 2 b703 HD 'Wageningen 3 Laboratorium voor Erfelijkheidsleer Landbouwuniversiteit Wageningen Dreijenlaan 2 6703 HA Wageningen

De uitvinding heeft op de eerste plaats betrekking op een werkwijze voor het bereiden van een adsorbent, dat geschikt is voor het winnen van α-amylase, in het bijzonder bacterieel α-amylase, met behulp van affiniteit schromatograf ie.

Zoals algemeen bekend, zijn amylasen zetmeelsplitsende enzymen, welke in vele takken der techniek, in het bijzonder de levensmiddelentechniek worden toegepast. Belangrijke amylasen zijn de a-amylaseproduk-ten, welke zetmeel in dextrinen en oligosacchariden omzetten. a-Amylasen komen in planten, bijvoorbeeld in mout, tezamen met β-amylasen voor. Dergelijke a-amylasen worden op technische schaal uit o.a. cultuurvloei-stoffen van bacteriën en schimmels gewonnen. Voor het isoleren en het zuiveren van α-amylase is getracht een adsorbent voor α-amylase te ontwikkelen, dat in de affiniteitschromatografie kan worden toegepast. Een der mogelijkheden is het binden van specifieke liganden aan "Sepharose"- dragers. Uit Silvanovich, M.P., and Hill, R.D. (1976) Anal.Biochein. 73, blz. 430-433 is bekend, dat ct-amylase uit tarwe gezuiverd kan worden met geïmmobiliseerd (S-cyclodextrine. Deze β-cyclodextrine-ligand bezit echter het nadeel, dat deze niet het op industriële schaal bereide bacteriële α-amylase bindt. Andere ligand-drager-adsorbentia, welke voor het isoleren en zuiveren van bacteriële en fungale α-amylases, welke uit economisch oogpunt de belangrijkste α-amylases voorstellen, zijn volgens aanvraagster niet uit de stand der techniek bekend.

Een andere mogelijkheid voor het bereiden van een adsorbent voor α-amylase is het modificeren van het daarbij behorende substraat. In dit verband wordt naar voren gebracht, dat zetmeelgranules, in het bijzonder aardappelzetmeelgranules, op grond van hun kristalliniteit langzaam door α-amylase worden gedegradeerd. Een modificatie door bijvoorbeeld een verknopingsreaktie, waarbij de granules intakt blijven, leidt echter slechts tot een sterke afname van de affiniteit voor α-amylase. Gebleken is echter, dat na verstijfseling van de granules, welke voor of tijdens de verknopingsreaktie wordt uitgevoerd, het gemodificeerde polymeer α-amylase kan adsorberen. Bijvoorbeeld wordt bacterieel a-amylase specifiek aan verknoopt tarwezetmeel geadsorbeerd (Weber, M., et al. (1976), Biochimie 58, blz. 1299-1302). Hierbij zijn evenwel geen degra-datieproeven aangaande de afbraak van het zetmeel door het geadsorbeerde α-amylase uitgevoerd. In dit verband wordt volledigheidshalve naar voren gebracht, dat volgens Mateescu, M-A. et al, (1983), Carbohydr.Res. 124, blz· 319-323 de degradatie van verknoopt amylose door bacterieel a-amylase afhangt van de mate van verknoping.

Uit proeven van Aanvraagster is echter gebleken, dat verknoopt zetmeel, in het bijzonder verknoopt aardappelzetmeel, met een voldoende weerstand tegen degradatie vanwege de inwerking van het α-amylase een onvoldoende affiniteit resp. een onvoldoende adsorptiesnelheid voor α-amylase bezit.

Gevonden werd nu, dat de bovengenoemde nadelen kunnen worden opgeheven, wanneer men het adsorbent voor α-amylase, dat door middel van het verknopen van voor of tijdens de verknoping verstijfselde zetmeelkorrels met een op zich voor dit doel bekend verknopingsmiddel is bereid, aan een verkleiningsbewerking en/of een enzymatische aktivering onderwerpt. Bij voorkeur past men zowel de verkleiningsbewerking als de enzymatische aktivering toe.

Met betrekking tot de overeenkomstig de uitvinding uit te voeren verkleiningsbewerking wordt naar voren gebracht, dat deze op elke, uit de stand der techniek bekende wijze zoals malen, fijnwrijven enz. kan worden uitgevoerd. Verrassenderwijs is namelijk gebleken, dat na het uitvoeren van de verkleiningsbewerking niet alleen de adsorptiesnelheid van het adsorbent voor het α-amylase opmerkelijk toeneemt, maar dat vooral de degradatie, veroorzaakt door de inwerking van het α-amylase op het adsorbent, niet noemenswaardig verandert. Op grond van de kortere incubatietijd kan derhalve een hoge absorptiegraad voor het ot-amylase en een geringe mate van degradatie van het adsorbent in de adsorptietrap en desorptietrap worden bereikt.

Ten aanzien van de overeenkomstig de uitvinding uit te voeren enzymatische aktivering van verknoopte verstijfselde zetmeelkorrels wordt naar voren gebracht, dat de adsorptie-eigenschappen voor aramylase van het volgens de uitvinding enzymatisch geaktiveerde zetmeel verrassenderwijs in aanzienlijke mate zijn verbeterd ten opzichte van de absorptie-eigenschappen van het uitgangsmateriaal, t.w. het niet-geaktiveerde verknoopte verstijfselde zetmeel. Bijvoorbeeld is de adsorptiesnelheid voor α-amylase sterk toegenomen terwijl de degradatie veroorzaakt door de inwerking van het α-amylase op het substraat, niet of nauwelijks vermeldenswaard wordt geacht.

Met een bijzondere voorkeur heeft de uitvinding betrekking op u-amylase-adsorbentia, welke op basis van zowel de bovenaangeduide verkleiningsbewerking als de enzymatische aktivering zijn bereid. Dergelijke zetmeelprodukten bezitten o.a. een bijzonder hoge adsorptiesnelheid voor het met behulp van affiniteitschromatografie te winnen a-amylase.

Met het oog op de vele procesparameters bij het verknopen van verstijf seld zetmeel wordt in het kader van de uitvinding onder de terra "verknoopt verstijfseld zetmeelprodukt" een produkt verstaan, dat onder gestandaardiseerde omstandigheden een degradatie door een bepaald a-amylase van minder dan 6 gew.% vertoont. Deze gestandaardiseerde omstandigheden worden in dit onderstaande voorschrift nader gepreciseerd:

Bepaiing van de mate van degradatie.

200 mg verknoopt zetmeel wordt in 10 ml van een Maxamyl-oplossing (50 ü/ml) (een warmtestabiel bacterieel α-amylase van Bacillus licheni-formis (Gist Brocades, Seclin, Frankrijk) in een 0,1 M natriumacetaat-buffer gesuspendeerd. Het reaktiemengsel wordt gedurende 20 uren in een reageerbuis-roteerinrichting bij 40°C gemengd. Vervolgens wordt 200/ul van de bovenstaande vloeistof aan 790/ul van een 0,1 M natriumacetaat-buffer (pH: 5,0) en 10/ul van een 1%'s (v/v) amyloglucosidase-oplos-sing (afkomstig van Aspergillus niger, Sigma, St.Louis, U.S.A.) toegevoegd. Dit mengsel wordt 20 uren bij 30°C geïncubeerd. De hoeveelheid reducerende suikers wordt onder toepassing van een autoanalyseerinrichting (Skalar, Breda, Nederland) met behulp van de neocuproine-proef bepaald, hierbij wordt D-glucose als standaard gekozen.

Bereidingsvoorbeelden van zetmeelprodukten, welke aan de bovenvermelde voorwaarde voldoen, worden onderstaand vermeld.

De bij de verknoping van het zetmeelprodukt toe te passen verkno-pingsmiddelen zijn uit de stand der techniek bekend. Voorbeelden hiervan zijn fosforoxychloriden, natriumtrimetafosfaat, adipinezuuranhydride en epi'halogeeiihydrinen zoals in het bijzonder epichloorhydrien.

Bij toepassing van het verkleinde en/of enzymatisch geaktiveerde verknoopte verstijfselde zetmeelprodukt volgens de uitvinding als adsor-bent voor α-amylase in de affiniteitschromatografie voert men bijvoorbeeld de adsorptie van α-amylase bij een temperatuur in het trajekt van -20°C tot 3ü°C, met voordeel van 2-S°C en bij voorkeur bij + 4°C en de desorptie van het α-amylase bij een temperatuur in het traject van 3ü-90°C, bij voorkeur bij + 7G°G uit. Tevens voegt men met voordeel aan het desorptiemiddel een geschikte hoeveelheid glycerol van bijvoorbeeld 10-50 gew.% toe, aangezien deze toevoeging in een sterke afname van de degradatie van het als adsorbent toegepaste zetmeelprodukt volgens de uitvinding resulteert.

Zoals bovenstaand reeds is aangegeven, kunnen de adsorptie-eigen-schappen alsook de desorptie-eigenschappen van verknoopte zetmeelproduk-ten sterk verbeterd worden door het uitvoeren van een verkleiningsbewer-king volgens de uitvinding. Als mogelijke verkleinbewerkingen worden het fijnmaken in een mortier resp. net malen in een maalinrichting genoemd. De falctor, waarmee het betreffende zetmeelprodukt wordt verkleind, is in principe niet kritisch en kan binnen wijde grenzen variëren. Bijvoorbeeld kan het betreffende zetmeelprodukt met een faktor 1-100 worden verkleind.

Zoals vermeld, kunnen de als substraat voor α-amylase dienende verknoopte verstijfselde zetmeelprodukten naast de bovenvermelde'verklei-ningsbewerking tevens een enzymatische aktivering ondergaan. Deze enzymatische aktivering kan met een amylase in het bijzonder een a-amylase worcien uitgevoerd. Als mogelijke omstandigheden voor de enzymatische aktivering met een α-amylase zoals ldaxamyl (Gist Brocades) worden een incubatietijd van tenminste 0,5 dag, met voordeel 1-3 dagen, een incuba-tietemperatuur van -20°C tot 30°C, met voordeel 2-10°C en bij voorkeur + 4°ü alsook een hoeveelheid van ten minste 0,25 ü (eenheid), met voordeel 2-12,5 U (eenheuen) enzym per mg zetmeel genoemd. De toegepaste enzym-concentratie bedraagt hierbij bijvoorbeeld 50-500 U/ml, met voordeel 100-250 U/ml. De enzymatische aktivering wordt bij voorkeur bij aanwezigheid van een buffer in het trajekt van 4-12 zoals een HAc/NAc-buffer met een pH van 6 uitgevoerd.

Na de enzymatische aktivering wordt het geaktiveerde zetmeelprodukt voor gebruik aan een desorptietrap onderworpen. Een dergelijke desorp-tietrap wordt op de bovenstaand beschreven wijze, bijvoorbeeld bij een temperatuur van + 70°C en met een HAc/NAc-buffer met een toevoeging van + 20% (v/v) glycerol uitgevoerd.

Bij het toepassen van de volgens de uitvinding geprefereerde combinatie van enerzijds verkleinen en anderzijds enzymatisch aktiveren van de verknoopte verstijfselde zetmeelprodukten voert men bij voorkeur eerst de verkleiningsbewerking en daarna de enzymatische aktivering van het verkleinde produkt uit.

Voorts kunnen de op bovengenoemde wijze verkregen poeders met gelerende middelen, zoals bijvoorbeeld alginaat, carrageen, agarose en agar in een granulevorm worden getransformeerd, welke granules bij een fluidisatieproces voor het winnen van α-amylase kunnen worden toegepast. Deze transformatie kan bijvoorbeeld uitgevoerd worden door het bereiden van bijvoorbeeld 5-30% (w/v) suspensies van de gemalen poeders in alginaatoplossingen met een concentratie van 0,1-2,5% w/v. Met behulp van deze suspensies kunnen granules worden bereid door het druppelen ervan in een CaCl2-oplossing van ten minste 0,1 M, bijvoorbeeld een 0,1-0,5 M CaCl2-oplossing onder vorming van het Ca^+-alginaatcom-plex. De op deze wijze verkregen granules zijn een bruikbare adsorbent voor het α-amylase in gefluidiseerde bed-processen, zoals in een continu adsorptie/desorptie-proces.

Voor de desorptie van het aan het adsorbent gebonden amylase kan in principe elke buffer met een pH in het trajekt van 5-12 worden toegepast. Voorbeelden van als desorptiemiddel te gebruiken buffers zijn een NaAc-buffer in water (pH: 5,0-6,0), een Na-succinaatbuffer in water (pH: 5,0-6,0) en een Na-fosfaatbuffer in water (pH: 6,0-9,0).

Als in de voorbeelden gebruikte uitgangsmaterialen zijn geëxtru-deerde aardappelzetmeelgranules (Prejel EXP, Avebe, Veendam, Nederland) en gewalsdroogde aardappelzetmeelgranules (Prejel WA4, Avebe, Veendam, Nederland) toegepast.

Onderstaand volgt een beschrijving van de in het kader van de uitvinding uitgevoerde omzettings- en bepalingsmethoden.

(A) Het verstijfselen en precipiteren van aardappelzetmeel

Het verstijfselen werd in een Brabender-viscograaf uitgevoerd. Hierin werd 450 ml van een 4%'s (w/v) aardappelzetmeelsuspensie in water in 10 min. op 50°C verwarmd en vervolgens met een snelheid van l,5°C/min tot 95°C. Na 30 min. werd de oplossing met een snelheid van l,5°C/min tot 50°C afgekoeld. De suspensie werd aan 500 ml ethanol (96%'s) toegevoegd, waarna een neerslagvorming optrad. De bovenstaande vloeistof werd gedecanteerd, waarna 300 ml ethanol werd toegevoegd. Deze procedure werd twee maal herhaald, ‘een maal met ethanol en daarna met aceton. Het poeder werd gefiltreerd en aan de lucht gedroogd.

B) Bepaling van de polymeerlengte

De gemiddelde polymeerlengte van ge’êxtrudeerd en trommelgedroogd zetmeel werd bepaald door het vaststellen van de hoeveelheid reducerende groepen onder toepassing van een autoanalyseerinrichting met behulp van de neocuproine-proef (Stephens, B.G. et al. (1974), Anal.Chem. 46, blz. 692-696), waarbij maltose als standaard werd toegepast.

C) Het verknopen van aardappelzetmeel

Verstijfseld aardappelzetmeel werd in een mengsel van ethanol en water gesuspendeerd. De reaktie werd in een kolf met een inhoud van 100 ml uitgevoerd. Achtereenvolgens werden epichloorhydrien en 5 M natriumhydroxide toegevoegd. De verhouding van het ethanol/water-mengsel en de hoeveelheden van de reagentia zijn afhankelijk van de gekozen reaktie-omstandigheden. De E/W-verhouding (ethanol/water-verhouding) werd bepaald na het toevoegen van de 5 M NaOH-oplossing. Het totale vloeistof-volume bedroeg ongeveer 45 ml. Het reaktiemengsel werd in een roterende incubator gedurende 4 uren bij 45°C geschud en daarna met 7%’s-azijnzuur geneutraliseerd. Het verknoopte zetmeel werd door middel van filtreren geïsoleerd en achtereenvolgens met water (2 x 50 ml), ethanol (2 x 50 ml) en aceton (2 x 50 ml) gewassen, waarna het produkt aan de lucht werd gedroogd.

D) Het bepalen van de mate van degradatie

Deze procedure is reeds bovenstaand beschreven.

E) Bepaling van de enzymactiviteit

De α-amylase-activiteit werd met behulp van een gemodificeerde ferricyanideproef bepaald (Rozie, H. et al. (1988), Biotechnol.Appl. Biochem. 10, blz. 346-358). Het reactiemengsel bevatte 1,9 ml van een 0,5%'s (w/v) oplosbaar zetmeel in een 0,1 M natriumacetaatbuffer (pH: 6,0) en 100/ul van een enzymoplossing (0-30 U/ml). Het mengsel werd 15 min. bij 30°C geïncubeerd, waarna 0,5 ml van deze oplossing werd toegevoegd aan 1,5 ml van een 1%'s natriumcarbonaat-oplossing, welke met ijs werd gekoeld. Daarna werd 2,5 ml van een vers bereid mengsel (1:1) van een cyanide-oplossing (0,25% KCN, 1% Νη200β) en een ferricyanide-oplossing (0,08% K3Fe(CN)g, 1% Na2C03) toegevoegd.

Nadat men het mengsel gedurende 20 min. bij kamertemperatuur had laten staan, werd het reactiemengsel (4,5 ml) in een bad met kokend water gedurende 10 min. ondergedompeld en vervolgens onmiddellijk in ijs gekoeld. De ontkleuring werd spectrofotometrisch bij 420 nm na 1 uur bepaald. De absorptie-veranderingen werden in termen van gereduceerde suikers met behulp van een standaardkromme voor maltose geïnterpreteerd. Een eenheid (U) wordt gedefinieerd als de hoeveelheid enzym, welke 1/umol van de reducerende groep per minuut vrijmaakt bij een pH van 6,0 en een temperatuur van 30°C.

Enzymaktiviteiten werden ook onder toepassing van een autoanaly-seerinrichting (Skalar, Breda, Nederland) bepaald, waarbij de incubatie en de determinatie van de reducerende groepen met behulp van de neo-cuproine-proef werden uitgevoerd. De geregistreerde pieken werden gerelateerd aan de eenheid, welke door middel van een standaardgrafiek voor de oramylase-oplossing was gedefinieerd.

F) Adsorptie van q-amylase aan verknoopt zetmeel 10 ml Maxamyl (50 ü/ml) in 0,1 M natriumacetaatbuffer (pH: 6,0) werd met 200 mg verknoopt zetmeel geïncubeerd. Het reaktiemengsel werd in een reageerbuis-roteerinrichting gedurende 20 uren bij 4°C gemengd. Monsters van de bovenstaande vloeistof werden onttrokken voor het bepalen van de enzymactiviteit en de mate van degradatie. De fraktie van de oorspronkelijke α-amylase-activiteit, die na incubatie niet kon worden gedetecteerd, werd geacht te zijn gebonden aan het adsorbent.

G) Desorptie van ot-amylase van verknoopt zetmeel 10 g verknoopt zetmeel werd geïncubeerd met 500 ml Maxamyl (5C U/ml) in 0,1 M natriumacetaatbuffer, (pH: 6,0) onder continu roeren bij 4°C. Na 20 uren werd de adsorbent door middel van filtratie geïsoleerd en met koud water (100 ml, 4°C) gewassen. Monsters van het filtraat werden genomen voor het bepalen van de enzymactiviteit. Een deel van de verkregen natte vaste stof (2%) werd toegevoegd aan 10 ml van een desorptiebuffer. Het verkregen reactiemengsel werd in een reageerbuis-roteerinrichting gedurende 1 uur bij 70°C gemengd.

Als desorptiebuffers werden 0,1 M natriumacetaat (pH: 5,0-6,0), 0,1 M natriumsuccinaat (pH: 5,0-6,0) en 0,1 M natriumfosfaat (pH: 6,0-9,0) toegepast. De ionsterkte van de natriumacetaatbuffer (pH: 6,0) werd met NaCl tot een waarde van 1 M verhoogd. Deze buffers werden ook ondei adsorptie-omstandigheden beproefd. Monsters van de bovenstaande vloeistof werden na 1 uur bij 70° C en na 20 uur bij 4°C getrokken voor het bepalen van de enzymactiviteit en de mate van degradatie.

LEGENDA

Fig. 1 : Adsorptie van Maxamyl-monsters (concentratie op tijdstip 0 i£ 50 U/ml) aan a) 20 mg/ml onverkleind verknoopt verstijfseld zetmeel (·); b) 20 mg/ml in een mortier verkleind verknoopt verstijfselc zetmeel (0); en c) 20 mg/ml in een Retsch-maalinrichting (0 = 0,08 nm) verkleind verknoopt verstijfseld zetmeel <A> ; in een buffer van 0,1 M HAc/NaAc (pH = 6,0).

Fig. 2 : Adsorptie-isothermen t.o.v. Maxamyl voor a) onverkleind verknoopt verstijfseld zetmeel (·); b) in een mortier verkleind verknoopt verstijfseld zetmeel (0); en c) in een Retsch-maalinrichting (0 = 0,08 mm) verkleind verknoopt verstijfseld zetmeel (Δ)·

Fig. 3a ; Korrelatie tussen het totaalvolume aan granules versus de zetmeelconcentratie in de suspensie bij 0,5% (w/v) alginaat-oplossing; deze figuur is opgesteld aan de hand van 5 ml

Fig. 3b : Korrelatie tussen zetmeelconcentratie in de granules versus zetmeelconcentratie in de suspensies bij 0,5% (w/v) alginaat-oplossingen.

Fig. 4 : Adsorptiekinetiek van geïmmobiliseerde zetmeelgranules t.o.v.

twee Maxamyl-concentraties (50 U/ml = (o) en 100 U/ml = (Δ)) omstandigheden: hoeveelheid zetmeel: 5 g alginaat/zetraeel in 25 ml Maxamyl : buffer: 0,1 M HAc/NaAc (pH = 6,0).

Fig. 5a : Adsorptie geaktiveerde matrices met een beginconcentratie (Co) van 50 U/ml Maxamyl-oplossing (Ct is enzymconcentratie op tijdstip t en Co is enzymconcentratie op tijdstip o) (+) : Retsch-maalinrichting: geaktiveerd met 50 U/ml (Δ ) : Retsch-maalinrichting: geaktiveerd met 250 U/ml (0) : ongemalen : geaktiveerd met 50 U/ml (+) : ongemalen : geaktiveerd met 250 U/ml

Fig. 5b : Adsorptie geaktiveerde matrices met een beginconcentratie (C0) van 250 U/ml Maxamyl-oplossing (C^ is enzymconcentratie op tijdstip t en C0 is enzymconcentratie op tijdstip o) (+) : Retsch-maalinrichting: geaktiveerd met 50 U/ml (Δ) : Retsch-maalinrichting: geaktiveerd met 250 U/ml (0) : ongemalen : geaktiveerd met 50 U/ml (+) : ongemalen : geaktiveerd met 250 U/ml

Fig. 6a : Adsorptiekinetisch zetmeelgranules met een beginconcentratie (C0) van 50 U/ml Maxamyl-oplossing (Ct) is enzymconcentratie op tijdstip t en C0 is enzymconcentratie op tijdstip o) (+) : gemalen zetmeel ( Δ ): gemalen en geaktiveerd zetmeel

Fig. 6b : Adsorptiekinetisch zetmeelgranules met een beginconcentratie (o) van 100 U/ml Maxamyloplossing (C+ is enzymconcentratie op tijdstip t en C0 is enzymconcentratie op tijdstip o).

(+) : gemalen zetmeel ( Δ ) : gemalen geaktiveerd zetmeel

De onderstaande voorbeelden I-VI betreffen uitvoeringsvormen inzake het bereiden van verknoopte verstijfselde zetmeelprodukten, waarin de procesparameters worden toegelicht. De Voorbeelden VII resp. VIII en IX betreffen uitvoeringsvormen volgens de uitvinding, waarin poedervormige produkten resp. granules worden toegepast.

Voorbeeld I

Op de bovenstaande algemene methodiek voor het verknopen van aardappelzetmeel werd gewalsdroogd aardappelzetmeel en geëxtrudeerd aardappelzetmeel in een concentratie van 150 mg/ml met epichloorhydrien onder de omstandigheden ECH/GM = 2,0, NaOH/ECH = 1, E/W = 2,00 en bij een temperatuur van 45°C gedurende 240 min. omgezet. De resultaten worden in Tabel A vermeld.

ECH = epichloorhydrien GM = glucose-monomeren E = ethanol W = water

Gezien de geringe mate van degradatie door α-amylase van gewalsdroogd zetmeel, dat een grotere gemiddelde polymeerlengte dan geëxtru-deerd zetmeel had, werd het gewalsdroogde aardappelzetmeel als uitgangs-produkt voor de onderstaande voorbeelden toegepast.

Voorbeeld II

Op de bovenstaand aangegeven algemene verknopingsmethodiek van zetmeel werd volgens dit voorbeeld gewalsdroogd zetmeel in een concentratie van 150 mg/ml, een ECH/GM-verhouding van 0,65, een NaOH/ECH- verhouding van 1,00 en een E/W-verhouding van 2,0 omgezet. De resultaten worden In de onderstaande Tabel B vermeld.

Uit tabel B blijkt, dat onder de bovengeschetste omstandigheden een temperatuur van 45°C en een reaktietijd van 240 min. nodig zijn om een geschikt uitgangsprodukt voor de werkwijze volgens de uitvinding te verkrijgen.

Voorbeeld III

Op de bovenstaand beschreven algemene wijze werd gewalsdroogd zetmeel in een concentratie van 150 mg/ml, een ECH/GM-verhouding van 0,65, een NaOH/ECR-verhouding van 1,0 bij 45°C gedurende 240 min. onder de in Tabel B vermelde E/W-verhoudingen omgezet. De resultaten worden in Tabel C vermeld.

Zelfs bij toepassing van slechts ethanol (96%) voor het suspenderen van het verstijfselde zetmeel bevat de oplossing toch een bepaalde hoeveelheid water vanwege het toevoegen van 5M NaOH. Gebleken is, dat de ethanol/water-verhouding (E/W) van de resulterende oplossing van belang is voor wat betreft de mate van verknoping. Een dalende E/W-verhouding resulteert in een toenemende opbrengst en een afnemende degradatie door α-amylase. De absorptie van α-amylase in dit traject is bijna onafhankelijk van de E/W-verhouding. Echter wanneer de E/W-verhouding minder dan 2,0 bedraagt begint de suspensie te klonteren, wat tot een enigszins geringere reproduceerbaarheid leidt.

Voorbeeld IV

Overeenkomstig de bovenstaande algemene bereidingsmethodiek werden verscheidene hoeveelheden zetmeel in hetzelfde reactievolume verknoopt. De reaktieomstandigheden hierbij waren: ECH/GM = 0,65, NaOH/ECH = 1,0, E/W = 2,00. De reaktietemperatuur bedroeg 45°C en de reactietijd 240 min. De verkregen resultaten zijn in de onderstaande Tabel D vermeld.

Uit de bovenstaande tabel blijkt, dat een toenemende zetmeel-concentratie leidt tot een toenemende opbrengst en een afnemende degra-datiewaarde. De absorptie van amylase neemt af bij een afnemende degradatie. Het geringe adsorptiepercentage bij een zetmeelconcentratie van 107 mg/ml kan verklaard worden door de degradatie van het adsorbent. Bij een zetmeelconcentratie van meer dan 150 mg/ml treedt het verschijnsel van klonteren op, wat resulteert in een enigszins geringere reproduceerbaarheid en mogelijkerwijs een lagere verknopingsgraad.

Voorbeeld V

Overeenkomstig de bovenstaand weergegeven algemene methodiek voor het verknopen van zetmeel wordt onder het toepassen van wisselende hoeveelheden epichloorhydrien gewalsdroogd zetmeel onder een drietal omstandigheden omgezet: a) zetmeelconcentratie = 150 mg/ml; E/W = 3,65 b) zetmeelconcentratie = 115 mg/ml; E/W = 2,70 en c) zetmeelconcentratie = 150 mg/ml; E/W = 2,00 bij een temperatuur van 45° C gedurende 240 min. bij een NaOH/ECH-ver- houding van 1,0. De resultaten worden in de onderstaande Tabel E weergegeven.

Toenemende hoeveelheden epichloorhydrien in het reactiemengsel leiden tot vergrote opbrengsten en afnemende degradatiewaarden (Tabel E-I). Uit de opbrengst van verknoopt produkt kan worden berekend, dat slechts een klein deel van het epichloorhydrien met het verknoopte zetmeel reageert. De benodigde hoeveelheid epichloorhydrien voor het verkrijgen van een adsorbent, dat stabiel is ten aanzien van α-amylase, kan verlaagd worden door het verhogen van de zetmeelconcentratie en/of het verlagen van de E/W-verhouding. Een verknoopt zetmeelprodukt met gelijke eigenschappen ten aanzien van α-amylase kan worden verkregen door het verlagen van de E/W-verhouding van 3,65 tot 2,70 en een verlaging van de ECH/GM-verhouding van 1,25 tot 1,0 (zie Tabel E-II). Een dergelijk adsorbent kan eveneens verkregen worden met een ECH/GM-verhouding van 0,65. Gerelateerd hieraan is een verdere afname van de E/W-verhouding en een toename van de zetmeelconcentratie (zie Tabel E-III).

Voorbeeld VI

Op de bovenstaande wijze werd verknoopt zetmeel bereid onder de onderstaande reactieomstandigheden: zetmeelconcentratie = 150 mg/ml; ECH/GM-verhouding = 0,65, E/W-verhou-ding is 2,00, reactietemperatuur: 45°C, reactietijd: 240 min. en verschillende NaOH-hoeveelheden. De verkregen resultaten worden in de onderstaande Tabel F weergegeven.

Voorbeeld VII

25 g gewalsdroogd zetmeelpoeder (PaSELLI WA4, AVEBE, Veendam, Nederland) werd in 153 ml ethanol gesuspendeerd. Vervolgens werden 30,9 ml gedestilleerd water, 12,6 ml epichloorhydrien (Merck, Darmstadt, Duitsland) en 30,85 ml 5M NaOH toegevoegd. Het reactiemengsel werd 4 uren in een orbitale incubator (Gallenkamp) met 200 onw/min. (T = 45°C) geschud. De reactie werd door het toevoegen van 200 ml 7%'s (v/v) azijnzuur gestopt. Vervolgens werd het reactiemengsel over een glazen filter (G2, Schott, Mainz, Duitsland) gefiltreerd. Het verknoopte poeder werd met 100 ml ethanol, water (twee maal), ethanol (twee maal) en aceton (twee maal) gewassen en vervolgens aan de lucht gedroogd.

Het verkregen verknoopte zetmeelpoeder werd vervolgens op twee verschillende manieren geactiveerd: (1) 25 g verknoopt poeder werd gedurende 15 min. in een porseleinen mortier handmatig fijngewreven; (2) 25 g verknoopt poeder werd in een Retsch-maalinrichting met een zeefwijdte van 0,08 mm gemalen. Het op deze wijze verkregen poeder had een maximale deeltjesgrootte van 0,08 mm.

Voor het bepalen van de adsorptieisothermen werd 0,1 g zetmeelpoeder in 5 ml enzym in een adsorptiebuffer (0,1 M HAc/NaAc-buffer met een pH van 6,0) met variërende hoeveelheden o-amylase (0-500 U/ml) geïn-cubeerd. De hoeveelheid geadsorbeerd enzym werd gevonden door het bepalen van de afname van de enzymaktiviteit in de vloeibare fase bij evenwichtstoestand.

In fig. 1 is de adsorptie van een Maxamyl-monster (50 U/ml) aan het op bovenstaande wijze verkregen verknoopte zetmeelpoeder alsook in een mortier verkleinde en in een Retsch-maalinrichting gemalen fractie van het poeder weergegeven. Zoals uit deze figuur blijkt is de adsorptie-snelheid in grote mate door deze maalmethoden verhoogd. Uit fig. 1 blijkt voorts, dat slechts 10-15% van het aanwezige enzym door het verknoopte poeder is geadsorbeerd, terwijl het in een mortier verkleinde respectievelijk gemalen poeder 65% resp. 80% van het enzym in het eerste uur heeft geadsorbeerd. In dit verband wordt naar voren gebracht, dat de capaciteit van de poeders voor het enzym niet in grote mate verschillen, wat duidelijk wordt, wanneer de isothermen worden bepaald. In de bijgaande fig. 2 worden de adsorptie-isothermen voor deze drie poeders weergegeven. In de onderstaande Tabel H worden gegevens aangaande deze isothermen vermeld.

Het is gebleken, dat de capaciteit van. het adsorbent enigszins vergroot is voor wat betreft de gemalen poeders, maar deze verschillen kunnen geenszins het grote verschil in reaktiesnelheid tussen de poeders verklaren.

Ter illustratie van de onverwachte eigenschappen van het verknoopte gemalen zetmeel aangaande de degradatie door het α-amylase, wordt verwezen naar Tabel I.

Zoals uit deze tabel I blijkt is de afbraak van het poeder bij een temperatuursverhoging van 4°C tot 40°C enigermate verhoogd wanneer een uit een mortier afkomstig of een gemalen poeder wordt toegepast. Verrassenderwijs is gebleken, dat dit nadelige effekt opgeheven kan worden door toevoegen van glycerol (in een hoeveelheid van 10-50 % v/v bijvoorbeeld 2U% v/v) aan het adsorptiemedium. Op grond hiervan wordt bij voorkeur het desorptiemedium met een hoeveelheid van ongeveer 20% (v/v) glycerol uitgevoerd.

Daar het winnen van ot-amylase plaats vindt met een veelvoud van adsorptie- en desorptietrappen werden met de bovenstaande drie typen poeders dienovereenkomstig proeven uitgevoerd. De poeders werden in zes reactiegangen gebruikt. Ter verkrijging van een goed onderscheid tussen de drie verschillende typen poeders zijn in Tabel J de gemiddelde waarden aangaande de herhaalde adsorptie- en desorptietrappen van a-amylasen voor elk type poeder weergegeven.

Zoals uit de bovenstaande tabel J kan worden afgeleid bezitten de verkleinde verknoopte zetmeelprodukten volgens de uitvinding aanzienlijk betere eigenschappen als adsorbent resp. desorbent voor α-amylase dan het enkel verknoopte verstijfselde zetmeelprodukt. Benadrukt wordt in dit geval, dat bij het verknoopte zetmeel van de 51 U/ml-enzym na 1 uur nog 36,7 U/ml-enzym niet geadsorbeerd was, welke laatste waarde bij het poeder uit de mortier 11,2 U/ml bij het gemalen zetmeelpoeder 15,2 U/ml bedroeg. Eenzelfde groot verschil wordt waargenomen bij de resultaten, verkregen bij de desorptietrap.

Voorbeeld VIII

Vervaardigen van granules van het geactiveerde verknoopte zetmeelpoeder volgens de uitvinding.

Natriumalginaat (Manucol DM van Alginate Industries, Londen) werd in een concentratie van 0,5 w/v in gedestilleerd water opgelost. Het al-ginaat werd daarbij onder toepassing van een ultraturrax-menginrichting gedurende 5 min. gesolubiliseerd. Het gemalen verknoopte zetmeelpoeder volgens Voorbeeld VII werd aan deze oplossing in concentraties van 5-30% w/v toegevoegd. De granules werden vervaardigd door het druppelsgewijs toevoegen van deze oplossingen aan een 0,5 M CaCl2-oplossing onder continu roeren. De diameter van de granules kon geregeld worden door het vari’éren van de naaldopening en door toepassen van een luchtstroom voor het afblazen van de gevormde druppels. De verkregen granules werden 24 uur in 0.5 M CaCl2-oplossing geroerd. Tenslotte werden de granules in een 0.1 M CaCl2-oplossing geëquilibreerd en vervolgens in een oven gedurende 24 uur bij 90°C gedroogd.

In de figuren 3a en 3b is de zetmeelconcentratie in de granules ge-korreleerd aan de concentratie in de suspensies voor 0,5% (w/v) algi-naatopiossingen. Meer in het bijzonder wordt in fig. 3a de hoeveelheid granules weergegeven, welke uit 5 ml suspensie voor verschillende zet-meelconcentraties was verkregen. Zoals kan worden waargenomen is het krimpen van het materiaal zeer verschillend in het onderzochte traject van de zetmeelconcentraties.

Alhoewel voor een l%*s (w/v) zetmeelsuspensie het uitgangsvolume van 5 ml tijdens het complexatie-proces tot 1,6 ml werd verminderd, bedroeg de volumeafname voor een 26% (w/v) zetmeelsuspensie niet meer dan een faktor 1.4.

In fig. 3b wordt een concentratie van het zetmeel in de suspensie vergeleken met de concentratie van het zetmeel in de granules.

Voorbeeld IX

In fig. 4 wordt de adsorptie van Maxamyl (50 U/ml, resp. 100 U/ml) aan op in Voorbeeld VIII weergegeven wijze geïmmobiliseerde zetmeel-granules (10% w/v) in 1% (w/v) alginaat weergegeven. In deze figuur wordt zowel de adsorptie van de enzym-aktiviteit alsook van het eiwit weergegeven. Na 60 min. werd een specifieke aktiviteit van ongeveer 23ü U/mg berekend voor de geabsorbeerde fraktie van het enzym; deze waarde is vergelijkbaar met de aktiviteit, die bij het overeenkomstig de uitvinding verkleinde verknoopte zetmeelpoeder wordt verkregen.

Voorts is duidelijk, dat de absorptiereaktie door diffusie geregeld wordt.

Uit fig. 4 zijn met behulp van het KK-model diffusiecoëfficiënten gefit op de curves. Voor deze curves zijn de volgende waarden gebruikt en berekend:

dichtheid: 1,06 kg/m^; R = 0,096 cm, 5g deeltjes en 25 ml vloeistof.

Voor wat betreft de desorptie van het enzym uit de alginaat/zet-meel-granules kan worden gesteld, dat deze eveneens door diffusie geregeld wordt en de snelheid ervan klein is vergeleken met de desorptie-snelheid van het enzym uit het overeenkomstig de uitvinding verkleinde poeder. In de eerste vijf minuten werd een fraktie vrijgegeven, welke een relatief lage specifieke aktiviteit bezit. Vervolgens werd de specifieke aktiviteit van de gedesorbeerde fraktie hoger, resulterend in waarden van 230-260 U/mg.

Ook deze waarden zijn zeer goed vergelijkbaar met de frakties, welke aan poeder zijn geabsorbeerd (zie Tabel J). Resumerend volgt onderstaand de balans over de adsorptie-desorptie van de Maxamyl-oplossing met behulp van de granules op de bovenbeschreven wijze:

TABEL K

Startconcentratie 54 ü/ml 106 U/ml t = 24 uur 15 U/ml 25 U/ml geadsorbeerd 39 U/ml 80 U/ml vrijgekomen 38 U/ml 75 U/ml

Resumerend kan worden gesteld, dat verknoopt zetmeel, dat overeenkomstig de uitvinding is verkleind, alsook de hierop gebaseerde granu-les, op geschikte wijze kunnen worden toegepast voor het isoleren resp. zuiveren van aramylase uit o.a. cultuurvloeistoffen, welke bij de industriële bereiding van α-amylase worden verkregen.

Voorbeeld X

Behalve met behulp van de verkleiningsbewerking kunnen de eigenschappen van verknoopt verstijfseld zetmeelpoeder als α-amylase-adsorbent met behulp van een enzymatische aktiveringstrap worden verkregen. Bij de onderstaand beschreven enzymatische aktiveringstrap werden twee typen matrices als uitgangsmateriaal toegepast: 1) ongemalen verknoopt verstijfseld zetmeel, verkregen overeenkomstig Voorbeeld VII; en 2) in een Retsch-maalinrichting gemalen verknoopt verstijfseld zetmeel, eveneens verkregen overeenkomstig Voorbeeld VII.

De beide bovenstaande uitgangsmaterialen werden onder de volgende omstandigheden enzymatisch geaktiveerd: a) uitgangsmateriaal : 20 mg zetmeel/ml b) enzymconcentraties : zowel 50 U/rnl als 250 U/ml Maxamyl (Gist Bro- cades)

c) temperatuur : 4°C

d) buffer : 0,1 M HAc/NaAc; pH = 6 e) incubatietijd : 24 uur.

Op basis van de met twee enzymconcentraties uitgevoerde aktiveringstrap van de twee als uitgangsmateriaal toegepaste zetmeelproduk-ten werden vier matrices verkregen, welke alle op de onderstaande wijze werden gedesorbeerd: a) geaktiveerd zetmeel : 24 mg/ml

b) temperatuur : 70°C

c) tijd : 30 min.

d) buffer : 0,1 M HAc/NaAc; (pH = 6,0) met glycerol (20% v/v)

Van de op bovenstaande wijze geprepareerde zetmeelprodukten voor de adsorptie van oc-amylase werd de adsorptie kinetiek onder de volgende omstandigheden onderzocht: a) zetmeel : 24 mg/ml b) enzym : 50 U/ml Maxamyl (Fig. 5a) 250 U/ml Maxamyl (Fig. 5b) c) buffer : 0,1 M HAc/NaAc (pH = 6,0)

d) temperatuur : 4°G

De resultaten van de adsorptiekinetiek van de vier typen zetmeelprodukten aangaande α-amylase worden in de figuren 5a (enzymconcentra-tie: 50 U/ml) en 5b (enzymconcentratie 250 ü/ml) weergegeven.

Uit de figuren 5a en 5b kan worden afgeleid, dat - alle vier typen matrices goede adsorptie-eigenschappen voor a-amylase bezitten; - de adsorptiesnelheid afhangt van de startenzymconcentratie (CQ); (vergelijk de figuren 5a en 5b); - de adsorptiesnelheid het grootst is aan de gemalen produkten; - de enzymatische aktivering van het zetmeelsubstraat beter verloopt wanneer de bij de aktiveringstrap toegepaste enzymconcentratie hoger is (de onder inwerking van 250 U/ml enzym geaktiveerde substraten bezitten de betere adsorptie-eigenschappen).

Voorbeeld XI

Dit voorbeeld vermeldt de immobilisatie van enzymatisch geaktiveerde zetmeelpoeder in een alginaatmatrix (granule). Het hierbij toegepaste zetmeelpoeder werd onder de volgende aktiveringsomstandigheden geprepareerd: a) uitgangsmateriaal : in een Retsch-maalinrichting gemalen ver knoopt, verstijfseld zetmeel, verkregen overeenkomstig Voorbeeld VII in een hoeveelheid van 20 mg/ml b) enzymconcentratie : 50 U/ml Maxamyl (Gist Brocades)

c) temperatuur : 4°C

d) buffer : 0,1 M HAc/NaAc (pH = 6,0) e) incubatietijd : 60 uur.

Het onder bovenstaande omstandigheden geaktiveerde zetmeelprodukt werd vervolgens onder de onderstaande omstandigheden gedesorbeerd: a) geaktiveerd zetmeel : 40 mg/ml

b) temperatuur : 70°C

c) tijd ; 30 min.

d) buffer : 0,1 M HAc/NaAc (pH = 6) met 20% (v/v) glycerol.

De immobilisatie van het op bovenstaande wijze verkregen geaktiveerde zetmeelprodukt alsook van niet-geaktiveerd in een Retsch-maal-inrichting gemalen zetmeelpoeder, verkregen overeenkomstig Voorbeeld VII in de vorm van granules vond plaats onder de in Voorbeeld VIII beschreven omstandigheden. De verkregen granules of bolletjes, welke een gelijke diameter van + 2 mm bezitten, hadden een samenstelling van 10% (w/v) zetmeel en 1% (w/v) alginaat.

Van de op bovenstaande wijze geprepareerde twee typen zetmeelgranu-les werd de absorptiekinetiek voor α-amylase onder de volgende omstandigheden uitgevoerd: 1) adsorbent: zetmeel/alginaat : 2,5 g/15 ml 2) buffer : 0,1 M HAc/NaAc (pH = 6,0)

3) temperatuur : 4°C

4) enzymconcentratie : 50 ü/ml Maxamyl 100 U/ml Maxamyl

De resultaten van de adsorptiekinetiek van de beide typen zetmeel-adsorbentia aangaande α-amylase worden in de figuren 6a (enzymconcentratie: 50 U/ml) en 6b (enzymconcentratie: 100 U/ml) weergegeven. Zoals uit deze figuren 6a en 6b kan worden afgeleid verloopt de absorptie van α-amylase aan de enzymatisch geaktiveerde matrix sneller.

Claims (21)

1. Werkwijze voor het bereiden van een α-amylase-adsorbent door middel van het verknopen van voor of tijdens de verknoping verstijfselde zetmeelkorrels met een op zich voor dit doel bekend verknopingsmiddel, met het kenmerk, dat men het verknoopte zetmeelprodukt aan een verklei-ningsbewerking en/of een enzymatische aktivering onderwerpt.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat men het verknoopte zetmeelprodukt aan een maalbewerking onderwerpt.

3. Werkwijze volgens conclusie 1 of 2, met het kenmerk, dat de ver-kleiningsbewerking een verkleining van het verknoopte zetmeelprodukt met een faktor 1-100 oplevert.

4. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat men de enzymatische aktivering van het verknoopte zetmeel met α-ainylase in een hoeveelheid van tenminste 0,23 eenheid (U) per mg zetmeel gedurende een incubatietijd van tenminste 0,5 dag bij een incubatietemperatuur van -2ö°C tot 30°C uitvoert.

5. Werkwijze volgens conclusie 4, met het kenmerk, dat men de enzymatische aktivering van het verknoopte zetmeel met een α-amylase in een hoeveelheid van 2-12,5 eenheden (U) per mg zetmeel gedurende een incubatietijd van 1-3 dagen bij een incubatietemperatuur van 2-10°C uitvoert.

6. Werkwijze volgens conclusie 4 of 5, met het kenmerk, dat men de enzymatische aktivering bij aanwezigheid van een buffer in het pH-tra-jekt van 4-12 uitvoert.

7. Werkwijze volgens een of meer van de conclusies 1-6, met het kenmerk, dat men het verknoopte verstijfselde zetmeelprodukt zowel aan een verkleiningsbewerking als een enzymatische aktivering onderwerpt.

8· Werkwijze volgens een of meer der conclusies 1-7, met het kenmerk, dat men poedervormig zetmeelprodukt volgens een of meer der conclusies 1-7 met een gelerend middel en eventueel vervolgens met een zoutoplossing in een granulevorm brengt.

9. Werkwijze volgens conclusie 8, met het kenmerk, dat men het poedervormige zetmeelprodukt met behulp van een waterige alginaat-oplossing als gelerend middel en vervolgens een waterige calciumzoutoplossing in een granulevorm brengt.

10. Werkwijze volgens conclusie 9, met het kenmerk, dat men aan een alginaatoplossing in gedestilleerd water het poedervormige zetmeelpro-dukt suspendeert en de verkregen suspensie druppelsgewijs aan een waterige calciumzoutoplossing toevoegt onder vorming van het Ca^+- algi-naat-complex.

11. Werkwijze volgens conclusie 9 of 10, met het kenmerk, dat men een 0,1-2,5% w/v alginaatoplossing in water toepast.

12. Werkwijze volgens een of meer der conclusies 9-11, met het kenmerk, dat men het poedervormige zetmeelpreparaat als 5-30% w/v-suspensies in water toepast.

13. Werkwijze volgens een of meer der conclusies 9-12, met het kenmerk, dat men een CaCl2~oplossing van ten minste 0,1 M toepast.

14. Zetmeel-adsorbent in poeder- of granulevorm, verkregen volgens een of meer der conclusies 1-13.

15. Werkwijze voor het winnen van ot-amylase door middel van affiniteitschromatografie met behulp van verknoopt verstijfseld zetmeel als adsorbent, met het kenmerk, dat men het zetmeel-adsorbent, verkregen volgens een of meer der conclusies 1-13 toepast.

16. Werkwijze volgens conclusie 15, met het kenmerk, dat men als desorptiemiddel een buffer met een pH in het trajekt van 5-12 toepast.

17. Werkwijze volgens conclusie 16, met het kenmerk, dat men als desorptiemiddel een NaAc-buffer in water (pH: 5,0-6,0), een Na-succinaat-buffer in water (pH: 5,0-6,0) of een natriumfosfaatbuffer in water (pH: 6,0-9,0) toepast.

18. Werkwijze volgens een of meer der conclusie 15-17, met het kenmerk, dat men de adsorptie van het α-amylase bij een temperatuur in het trajekt van -20°C tot 30°C en de desorptie van het α-amylase bij een temperatuur in het trajekt van 30-90°C uitvoert.

19. Werkwijze volgens conclusie 18, met het kenmerk, dat men de adsorptie bij een temperatuur van ongeveer 4°C en de desorptie bij een temperatuur van ongeveer 70°C uitvoert.

20. Werkwijze volgens een of meer der conclusies 15-19, met het kenmerk, dat men het desorptiemiddel met glycerol verrijkt.

21. Werkwijze volgens conclusie 20, met het kenmerk, dat men een desorptiemiddel toepast, dat 10-50 vol.% glycerol bevat.