NL8800794A

NL8800794A - Werkwijze voor het bereiden van als cacaoboter-equivalent of als component van een cacaoboter-equivalent te gebruiken vetten.

Info

Publication number: NL8800794A
Application number: NL8800794A
Authority: NL
Original assignee: Wessanen Nederland Bv
Priority date: 1987-04-02
Filing date: 1988-03-29
Publication date: 1988-11-01

Description

te N.0. 35079 ·*

Werkwijze voor het bereiden van als caeaoboter-equivalen£ of als component van een cacaoboter-equivalent te gebruiken vetten»

Als uitvinders worden genoemd: E.C. Verbree, A. Ykema, I.I.G.S. Verwoert 5 en H. Smit.

De uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het bereiden van als cacaoboter-equivalent of als component van een cacaoboter-equi-valent te gebruiken vetten door het in een medium cultiveren van een 10 vetproducerend microorganisme en vervolgens het uit het microorganisme winnen van de daarin geaccumuleerde vetten.

Een der meest gewaardeerde plantaardige vetten is cacaoboter. Dit is een in de natuur voorkomend produkt, dat gewonnen wordt uit zaden van de cacaoboom (Theobroma cacao). Meer in het bijzonder is cacaoboter een 15 produkt, dat grotendeels opgebouwd is uit l,3-diverzadigde-2-onverzadig-de triglyceriden, welke stearine-, olie- en palmitinezuur als vetzuur— componenten bevatten. Meer in het bijzonder wordt in de onderstaande Tabel A de (gewichts)gemiddelde vetzuursamenstelling van cacaoboter weergegeven, zoals vermeld in Fincke A. (1965), Handbuch der Kakao-20 erzeugnisse, blz. 333, Springer Verlag.

TABEL A

Palmitinezuur (C 16) 23 - 30 gew.%

Stearinezuur (C 18) 32-37 gew.% 25 Oliezuur (C'18) 30 - 37 gew.%

Linolzuur (C,fl8) 2 - 4 gew.%

Linoleenzuur (C,,118) 0-0,3 gew.%

Arachidezuur (C 20) 0-1 gew.%

Beheenzuur (C22) 0-0,2 gew.% 30 Lignocerinezuur (C 24) spoor

Gezien de algemeen erkende unieke eigenschappen van cacaoboter, waarvan echter het aanbod, kwaliteit en prijs sterk fluctueert, is de 35 behoefte aan dit produkt nog steeds groeiend en kan de natuurlijke pro-duktie van dit produkt niet of nauwelijks meer aan de vraag voldoen. Alhoewel in de toenemende behoefte aan cacaoboter gedeeltelijk kan worden voorzien door analoga met een vergelijkbare triglyceride-opbouw (cacao-boter-equivalenten), leveren deze geen werkelijke bijdrage tot de oplos-40 sing van het probleem daar deze analoga, naast een palmitinezuur- .8800794 y 2 -oliezuur-palmitinezuurrijke (POP-rijke) palmoliecomponent voor een aanzienlijk deel op stearinezuur-oliezuur-stearinezuurrijke (SOS-rijke) exotische vetten zoals Sheavet en Tengkawan zijn gebaseerd, waarvan de eigenschappen, prijs en beschikbaarheid een duidelijke beperking inhou-5 den. Gezocht is derhalve naar een alternatieve bereidingswijze voor cacaoboter-equivalenten, resp. voor de exotische SOS-rijke component daarvan, welke zowel een goede en constante kwaliteit als een lage kostprijs bezitten.

Bekend is, dat vetten en oliën bereid kunnen worden met behulp van 10 olie/vetproducerende microorganismen zoals algen, bacteriën, schimmels en gisten. Dergelijke microorganismen synthetiseren de lipiden tijdens het normale verloop van het cellulaire metabolisme. Getracht is nu die microorganismen alsook media en procesomstandigheden te vinden, welke op economische schaal een produktie van dergelijke cacaoboter-equivalenten 15 of componenten daarvan mogelijk maken.

In de stand der techniek zijn velerlei voorstellen betreffende de bereiding van cacaoboter-equivalenten aangedragen. Bijvoorbeeld is uit de Nederlandse octrooiaanvrage 78.04549 een werkwijze voor het micro-biëel bereiden van als cacaoboter-surrogaat te gebruiken vetten bekend, 20 waarbij het medium voor het vetproducerende microorganisme een gemengde koolstofbron bevat, die uit ten minste een stearylderivaat en ten minste een palmitylderivaat, een oleylderivaat en een saccharide bestaat. Als voor de omzetting geschikte microorganismen worden stammen van de genera Candida, Torulopsis, Trichosporon, Pichia en Sporobolomyces genoemd. 25 Een dergelijke werkwijze bezit echter het nadeel, dat een medium dient te worden toegepast, dat aan bepaalde hoge eisen dient te voldoen. Dergelijke media zijn echter kostbaar zodat de werkwijze volgens deze Nederlandse octrooiaanvrage 78.04549 niet of nauwelijks op economische schaal kan worden toegepast.

30 Uit het Europese octrooischrift 0.005.277 is een microbiologische bereidingswijze van oliën en vetten bekend, welke gebaseerd is op: a) het bereiden van een groeimedium, waarin de koolstofbron vetzuren met 10-20 koolstofatomen bevat, b) het inocculeren van het groeimedium met olieproducerende gistcellen, 35 zoals stammen van de genera Rhodosporidium, Lipomyces, Candida,

Saccharomyces, Endomyces en Khodotorula, c) het aëroob cultiveren van de gistcellen bij een pH tussen 4,0 en 6,0 en een temperatuur van 20-40°C, d) het afscheiden van de gecultiveerde cellen uit het groeimedium, en 40 e) het winnen van de olie uit de gecultiveerde cellen.

.8800794 3 ¥

<V

Als voorbeelden van dergelijke als koolstofbron te gebruiken vetzuren worden palmitine-, olie- en stearinezuur en mengsels hiervan genoemd.

Ook aan deze laatstgenoemde werkwijze kleeft het nadeel, dat deze voor de bereiding van een cacaoboter-equivalent vanwege het benodigde sub-5 straat niet op economische wijze kan worden uitgevoerd. In dit verband wordt nog gewezen op de in de hoofdconclusie vermelde zinsnede, dat de samenstelling van de gesynthetiseerde olie afhankelijk is van de verhouding tussen het in het medium aanwezige verzadigde vetzuur ten opzichte van het daarin aanwezige onverzadigde vetzuur.

10 Uit de Amerikaanse oetrooischriften 4.485.172 en 4.485.173 zijn eveneens werkwijzen bekend voor het bereiden van vetten en oliën met behulp van vetproducerende microorganismen, waarbij in het substraat als koolstofbron ten minste een vetzuur met 10-20 koolstofatomen dient te worden toegepast. Met voordeel worden als koolstofbron palmitine-, olie-15 en stearinezuur of mengsels hiervan toegepast, waarbij de relatieve concentratie van deze zuren echter zodanig wordt ingesteld, dat cacaoboter--equivalenten kunnen worden bereid. Als geschikte gisten worden stammen van de genera Rhodosporidium, Lipomyces, Candida, Endomyces, Saccharo-myces, Rhodotorula, Triehosporon en Torulopsis genoemd. Daar voor het 20 bereiden van cacaoboter-equivalenten substraten dienen te worden toegepast, waarin een koolstofbron met bovenaangeduide specifieke samenstelling dient te worden toegepast, wordt naar voren gebracht, dat de toepassing van de uit deze Amerikaanse oetrooischriften bekende werkwijzen in economisch opzicht niet haalbaar geacht wordt.

25 Voorts wordt in het bovenvermelde Amerikaanse octrooischrift 4.485.173 tevens de toepassing van een desaturase-enzym-inhibitor zoals sterculinezuur vermeld, waarmee een hogere verhouding van stearinezuur ten opzichte van oliezuur in de bereide triglyceriden kan worden bereikt. In dit Amerikaanse octrooischrift wordt aangegeven, dat een 30 dergelijke inhibitor de desaturatie van stearinezuur in oliezuur sterk vermindert. In dit verband wordt mede gewezen op de Europese octrooiaanvrage 0.159.137, waarin velerlei cyclopropeen-vetzuren als desaturase--enzym-inhibitors voor de bereiding van cacaoboter-equivalenten worden beschreven. Met betrekking tot dergelijke desaturase-enzym-inhibitoren 35 welke alle vetzuren zijn, wordt naar voren gebracht, dat deze door de microorganismen in de te vormen triglyceriden worden ingebouwd en derhalve onderdeel van het geproduceerde cacaoboter-equivalent vormen. Dit verschijnsel is echter in toxocologisch oogpunt ongewenst, aangezien uit velerlei literatuurplaatsen zoals Chemical Abstracts, vol.70 (1969) 40 9676c, vol.92 (1980) 20804t, vol.65 (1966) 4520e en vol.62 (1965) 6866a ♦ 8 8 0 0 7 c 4 4 Λ blijkt, dat dergelijke desaturase-enzym-inhibitoren na consumptie door proefdieren zeer schadelijke effekten kunnen sorteren.

Tenslotte is uit het Amerikaanse octrooischrift 4.235.933 een werkwijze voor het bereiden van oliën met behulp van een olieproducerende 5 stam van Candida curvata bekend, waarbij als goedkoop substraat een door ultrafiltratie verkregen weipermeaat wordt toegepast. Als voorbeelden van toe te passen microorganismen worden de stammen Candida curvata stam D, ATCC No. 20509 en Candida curvata stam R, ATCC No. 20508 toegepast.

Het bij deze werkwijze verkregen produkt bezit echter een ten opzichte 10 van cacaoboter onvoldoende kwaliteit vanwege een te hoog gehalte aan onverzadigde vetzuren en wordt derhalve in diervoeder verwerkt.

De uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het op economisch rendabele wijze bereiden van cacaoboterequivalenten of componenten daarvan doordat men als microorganisme 15 - een mutant van een gist behorende tot een der geslachten Apiotrichum,

Candida, Cryptococcus, Endomyces, Hansenula, Lipomyces, Pichia, Rhodosporidium, Rhodotorula, Saccharomyces, Sporobolomyces,

Torulopsis, Trichosporon en Yarrowia ofwel - een fusant van in totaal twee, drie of vier, in genetisch opzicht ver-20 schillende mutanten en/of gistcellen, alle behorende tot de bovenvermelde geslachten toepast, waarin het voor de omzetting van stearinezuur in oliezuur verantwoordelijke enzymsysteem genetisch geheel of gedeeltelijk is geblokkeerd .

25 In het kader van de uitvinding wordt onder de term "cacaoboter equi valent” een vetmengsel verstaan, dat voor meer dan 25%, bij voorkeur meer dan 50%, opgebouwd is uit l,3-diverzadigde-2-onverzadigde triglyce-riden, welke al dan niet verzadigde vormen van C^g- en C^g-vetzuren als vetzuurcomponenten bevatten. Voorts wordt onder de term 30 “component van een cacaoboter-equivalent” een vetmengsel verstaan, dat voor meer dan 25%, bij voorkeur meer dan 50%, opgebouwd is uit 1,3-di-verzadigde-2-onverzadigde triglyceriden, welke verzadigde en onverzadigde vormen van C^g-vetzuren als vetzuurcomponenten bevatten.

De bij de werkwijze volgens de uitvinding toe te passen mutanten 35 van vetproducerende gistsoorten zoals met voordeel Apiotrichum curvatum, ook wel desaturase-mutanten genoemd, worden door middel van mutagenisa-tie verkregen. Deze mutagenisatie kan bijvoorbeeld met behulp van chemische mutagentia zoals N-methyl-N'-nitroso-guanidine, ethylmethaan-sulfonaat of door middel van bestraling met UV-licht worden uitgevoerd.

40 De screening van de desaturase-mutant kan geschieden door toepassing van .8800784 - ...................;__Λ V' 5 voedingsbodems, waaraan wel of geen oliezuur is toegevoegd.

In het kader van de uitvinding worden eerst die mutanten geïsoleerd, waarin het enzym desaturase, dat de omzetting van stearinezuur in oliezuur katalyseert, niet werkzaam is. De op deze wijze geïsoleerde 5 desaturase-mutanten zijn voor hun groei afhankelijk van de toevoeging van oliezuur aan het groeimedium. In dit verband wordt mede naar voren gebracht, dat uitgaande van de geïsoleerde absolute desaturase-mutanten, waarbij het desaturase volledig geremd is, eventueel na inductie met een mutagens, partiële desaturase-mutanten waarbij het desaturase gedeelte-10 lijk geremd is, geïsoleerd zijn, die deze oliezuurbehoefte niet meer bezitten.

De morfologie van de geïsoleerde absolute desaturase-mutanten is, gezien onder een fase-contrast-mieroscoop, duidelijk verschillend van die van het wilde type Apiotrichum curvatum (ATCC 20509). Sommige 15 mutant-cellen zijn groter en hebben een duidelijke neiging tot de vorming van pseudomycelia. Onder vetproducerende condities worden in deze desaturase-mutanten bij aanwezigheid van beperkte hoeveelheden oliezuur niet zoals bij het wilde type intracellulaire oliedruppels waargenomen, maar een korrelige structuur die duidt op vast vet bij de 20 gehanteerde kweektemperatuur van 30°C.

De resultaten in schudcultures en fermentorkweken wijzen erop dat de absolute desaturase-mutanten in aanwezigheid van geringe hoeveelheden oliezuur en de partiële desaturase-mutanten ook in afwezigheid van oliezuur, een vrij normale groeifase en vetproductiefase doorlopen.

25 Een van de absolute desaturase-mutanten van Apiotrichum curvatum ATCC 20509 is overeenkomstig het verdrag van Boedapest onder het nummer CBS 199.87 bij het Centraal Bureau voor Schimmelcultures te Baarn,

Nederland, gedeponeerd.

Daar desaturase-mutanten van Apiotrichum curvatum oliezuur nodig 30 hebben voor de synthese van membraanlipiden hebben partiële revertanten van desaturase-mutanten de voorkeur, aangezien deze slechts gedeeltelijk in de desaturase-activiteit geremd zijn en derhalve in staat zijn bij afwezigheid van oliezuur te groeien. Dit voordeel manifesteert zich in een gunstige invloed op de kostprijs van het groeimedium.

35 Het groeimedium voor het kweken van gisten volgens de uitvinding bestaat in het algemeen uit verdunde, waterige oplossingen met daarin koolstof- en stikstofbronnen, meestal in hoeveelheden van minder dan 6 gewichtsprocent berekend op het gewicht van het groeimedium. Als koolstof- en energiebron worden gewoonlijk suikers, bij voorkeur glucose 40 of lactose toegepast. Als stikstofbron worden veelal ammoniumzouten . 8 8 0 0 7 S 4 Λ 6 toegepast, maar er kunnen ook andere stikstofhoudende verbindingen zoals ureum, asparagine, glutamine en pepton worden aangewend.

In het algemeen zijn hoge koolstof/stikstof-verhoudingen gunstig voor de vetproduktie, waarbij de stikstof de groei en de deling van de 5 gistcellen tijdens de groeifase bevordert en de daarna resterende koolstof tijdens de vetproduktiefase wordt omgezet in opslaglipiden. Normaliter ligt de koolstof/stikstofverhouding in het groeimedium tussen 10 en 100 (gram koolstof per gram stikstof) en bij voorkeur tussen 20 en 70.

10 Naast koolstof en stikstof dient het medium voorts ook de voor de groei van gistcellen noodzakelijke elementen zoals kalium, natrium, magnesium, ijzer, zwavel, calcium en eventueel zink te bevatten. Deze worden in de vorm van zouten toegevoegd. Het groeimedium is daarbij zodanig gebufferd, dat de pH, afhankelijk van de gistsoort, een waarde 15 tussen 2,5 en 9,0 bezit. De temperatuur waarbij wordt gekweekt ligt tussen 20 en 40°C, afhankelijk van de gebruikte gistsoort. Voorts heeft zuurstof een positief effekt op de groei en vetproduktie van de gistcellen.

In aansluiting op het bovenstaande wordt naar voren gebracht, dat 20 bij de werkwijze volgens de uitvinding als substraat goedkope wei of weipermeaten alsook melasse kunnen worden toegepast. Voor het verkrijgen van een optimale C/N-verhouding kan bijvoorbeeld NH4+ aan het groeimedium worden toegevoegd. Door gebruik te maken van fed batchkweken en met name partial recycle kweken van Apiotrichum curvatum in weipermeaat 25 zijn zeer hoge vetproductiesnelheden bereikt op grond waarvan een economisch rendabele productie van gistlipiden binnen bereik is gekomen.

Wanneer de koolstofbron in het medium volledig of nagenoeg volledig is verbruikt, worden de gistcellen volgens algemeen bekende methoden van het groeimedium gescheiden en de lipiden uit de gistcellen verwijderd. 30 Bijvoorbeeld kan de celstructuur door middel van bevriezen, hydrolyse of verhoogde druk worden verbroken, waarna de lipiden met een geschikt oplosmiddel geëxtraheerd kunnen worden.

Uit de analyse-resultaten kan worden afgeleid, dat het met behulp van de mutanten volgens de uitvinding mogelijk is triglyceriden te be-35 reiden die een percentage verzadigde vetzuren bezitten, dat vergelijkbaar is met dat van cacaoboter.

Naast de genoemde desaturase-mutanten van Apiotrichum curvatum zijn ook absolute desaturase-mutanten van Saccharomyces cerevisiae ATCC 25657 geïsoleerd. Ook deze absolute mutanten zijn voor hun groei afhankelijk 40 van oliezuur. Proefresultaten met een absolute desaturase-mutant van .8800794 7

Saccharomyces, gekweekt bij aanwezigheid van verschillende hoeveelheden oliezuur geven aan, dat het percentage verzadigde vetzuren in de gist-lipiden zodanig kan worden gevarieerd, dat een met cacaoboter vergelijkbare verzadigingsgraad kan worden verkregen. Afgaande op de resultaten 5 met de desaturase-mutanten van Apiotrlchum en Saccharomyces kan worden gesteld, dat de werkwijze volgens de uitvinding om, uitgaande van desaturase-mutanten van gist, cacaoboter-equivalenten te bereiden in principe voor elke gistsoort van de bovenvermelde genera toepasbaar kan worden geacht.

10 Naast de bovenbeschreven absolute en partiële desaturase-mutanten, welke door middel van mutagenisatie zijn verkregen, heeft de uitvinding tevens betrekking op het samenstellen en toepassen van fusanten op basis van in totaal twee, drie of vier, in genetisch opzicht verschillende mutanten en/of gistcellen, alle behorende tot een of meer der geslachten 15 Apiotrichum, Candida, Cryptocoecus, Endomyces, Hansenula, Lipomyces, Pichia, Rhodosporidium, Rhodotorula, Saccharomyces, Sporobolomyces, Torulopsis, Trichosporon en Yarrowia. Heer in het bijzonder worden deze fusanten verkregen door het samensmelten van protoplasten van de twee fusiepartners. Een fusant volgens de uitvinding is derhalve een nieuwe 20 giststam, welke de genetische informatie van beide ouders kan bevatten en op zijn nakomelingen kan overdragen.

In het kader van de uitvinding zijn fusanten geïsoleerd, waarbij een aminozuur-auxotrofe mutant van Apiotrichum curvatum en een desatura-se-mutant van Apiotrichum curvatum (CBS 199.87) als fusiepartners werden 25 gebruikt. Een deel van de uit deze fusie resulterende nieuwe stammen vertoonden een goede groei in weipermeaat en bezaten een bevredigende produktie aan vet, welke de kwaliteit van cacaoboter benaderde. Een dergelijke fusant is overeenkomstig het Verdrag van Boedapest onder het nummer CBS 159.88 bij het Centraal Bureau voor Schimmelcultures te 30 Baarn, Nederland, gedeponeerd.

Eveneens zijn fusies tussen giststammen van verschillende genera, waaronder Apiotrichum, Saccharomyces, en Yarrowia (intergene fusies) tot stand gebracht, üit de literatuur is bekend, dat fusanten vaak het volledige genoom van een van de ouderstammen, maar slechts een gedeelte 35 (enkele chromosomen of maar enkele genen) van de andere oüderstam bevatten. (Peberdy, J.F. (1987) Microbiol. Sciences 4 (4):108). Hierdoor kan een intergene fusant bepaalde genen wel en andere genen niet in tweevoud bevatten. Bij hybriden volgens de uitvinding, die ontstaan uit intergene fusie-experimenten, is daarom in principe een grote onderlinge verschei-40 denheid te verwachten. Op basis van de eigenschappen kunnen echter op .8800754 8 eenvoudige wijze de meest geschikte fusanten worden getraceerd.

Ter verdere illustratie van de uitvinding worden de onderstaande voorbeelden vermeld; deze voorbeelden dienen niet beperkend te worden uitgelegd.

5

Voorbeeld I

A) Isolatie procedure welke is toegepast voor het verkrijgen van desatu-rase-mutanten van de vetproducerende gistsoort Apiotrichum curvatum 10 ATCC 20509.

In de onderstaande tabel B volgt een weergave van de parameters, welke bij het verkrijgen van desaturase-mutanten van Apiotrichum curvatum in acht zijn genomen. Als stam is Apiotrichum curvatum ATCC 20509 15 toegepast, welke overeenkomt met de in het bovenstaande besproken Amerikaanse octrooischrift 4.235.933 vermelde stam Candida curvata ATCC 20509.

TABEL B

20

Isolatiemethode van absolute desaturase-mutanten

Uitgangsstam: Apiotrichum curvatum ATCC 20509

Mutagens: N-methyl-N'-nitroso-guanidine (NG) 25 dosis: 500-1000 microgram NG/ml incubatiemedium: 0.1 M fosfaatbuffer pH 7.0 groeifase: logaritmisch dichtheid suspensie: ^660 = 10 incubatietijd: 30-180 min.

30 incubatietemperatuur: 30°C

o aantal behandelde cellen: 2.10 % overleving: 0.0014 - 0.025% aantal desaturase mutanten: 6 mutantfrequentie: 1 per 16.000 a 1 per 80.000 35 B) Isolatieprocedure, welke is toegepast voor het verkrijgen van partiële desaturase-mutanten, waarbij is uitgegaan van een absolute desatu-rase-mutant van de vetproducerende gistsoort Apiotrichum curvatum ATCC 20509.

40 . 8 8 0 0 7 8 4’ 9

In onderstaande Tabel C volgt een weergave van de parameters welke voor het verkrijgen van partiële desaturase-mutanten in acht zijn genomen. Als stam is de bij het CBS onder nummer CBS 199.87 gedeponeerde absolute desaturase-mutant van Apiotrichum curvatum ATCC 20509 toegepast.

5

TABEL C

Isolatiemethode van partiële desaturase-mutanten 10 Uitgangsstam; Absolute desaturasemutant CBS 199.87

Mutagenese: N-methyl-N-nitroso-guanidine (NG) dosis: 200-500/ug NG/ml incubatiemedium: 0.1 M fosfaatbuffer pH 7.0 groeifase: logaritmisch 15 dichtheid suspensie: E660 “ 10 incubatietijd: 30-120 min.

temperatuur tijdens incubatie: 30° C

% overleving: 0,00008 - 2,5Z

(dubbel) mutant frequentie: 1 per 140.000 tot 1 per 1.500.000 20

Voorbeeld II

Toepassing van de geïsoleerde absolute mutant en van daaruit geïsoleerde 25 partiële desaturase-mutanten alsmede een analyse van het bereide produkt.

In een continu geroerd fermentatievat, voorzien van een beluch-tingsleiding en pH-regelapparatuur werd een reinculture van een absolute 30 of partiële desaturase-mutant van Apiotrichum curvatum ATCC 20509 geënt op een medium met de volgende samenstelling: ,8800794 10

Glucose 10 g

Oliezuur 0 tot 0.12 g

Tween 80 0 tot 0.3 g 5 NH4CI 0.25 g KH2P04 3.5 g

Na2HP04 1.0 g

MgS04 0.75 g

Gistextract 0.75 g 10 CaCl2 50 mg

FeCl3 5 mg

ZnS04 0.5 mg

Water 1 liter

15 De cellen werden gekweekt bij pH 5.0, bij een temperatuur van 30°C

en werden geoogst nadat de glucose in het groeimedium was verbruikt. De lipiden werden geëxtraheerd met organische oplosmiddelen en geanalyseerd op triglyceriden-samenstelling en vetzuursamenstelling (volgens algemeen gangbare methoden).

20

In onderstaande Tabel D worden de proefresultaten weergegeven van een absolute desaturase-mutant, gegroeid in aanwezigheid van verschillende hoeveelheden oliezuur en van een viertal partiële desaturase-mutanten volgens de uitvinding in vergelijking met die van het wilde 25 type (Apiotrichum curvatum ATCC 20509).

.8800794’ 11

**^**OOOOppOOO O<<CrQOQOQ CO

* M B

o>|| g g* ^ β £* ** t t * * » 05 3 g Ü H. »* * V* » ? W co c M «5J. £

. „ 0 fl) M O H P* 3 N

^ , (6 C ^ rour _ 5 3 Λ O 00 OP _ {i £

££ OJ ^ O <? 3 H

Hm rt v B HO W ö £

MN m /n u |_>- . OP'S

OP P EL 3 3 (D- fl> B

MP* £ o η (S> *<ί M lj. OO N < 9 ooq araco m ro co ro o* (5 $ & m. a n

» ro ” 1 1 p pc' CD

M P Μ M

P < (t> 3 M

Λ Π) OP M

3 rt >3

N H <J OP

e o p ro ft O 3 3 ro 3 to 3“ < iS^-MOOMvoÊwo»o ω o o o g > g ^ 3 W ΰ « Η ΰ ° M g O - « g ! KSom^-ioovoow N g ° · g e 1 8 rt CU fl> (D Ö co

SjvDtoOOM^JvPtoO MO gooo ^ g 33 i-CO^JovOPVIHPO^ Μ M O OW 2> 00.>«OUJ^IOU>WU>LnOO 03 O ^ ^ 03 3 vj ro μ o

Μ ft 3 H

^MtoOOMvjS gMMO gOOO MO <n

UM(O^00MMNi-MNINl g g CDW ÓqH

^w^oovojsooc^oo ^ ° g ^ φ 3 h MO > M3 - W μ. a k K < f m p

3 rt O

voen NOW MO LnOOO £

SvOMOOMOOCOgMVD^ 00 ?o ^ ^ Sm B B

h-4>03N3M00OOMO O 00 ΓΤΜ

P

ro op ro < P* fö ro ro

t \ t \ rt (D

SwOOtOMLnVDUiltoO O O O O g g1-* OUTO'OO-f^-P'l-n 00 ut M a Hi

MtOOOUlOUi^IM W'J n> ffi

P OP

B ro ro p 3 ro SS^MOOMLnOoiolOM ο-OOO g {L J? ωουιωΜ'^οσ' μ 4> m |r mm \ooo»j^iooooo- O 00 N3 p op ?r

<J OP

p ro

SSoomo mSSiSm o o o o K g· I

ó'vo'viMtoM'ao' g ο m g ^ 2, ~JU3J>03^JI-O00 o oo to m

SomOmoo-^jO'm I Km O O O O g ········ ·" * u -ΟΜΌΟΟΌ-ΟΜ OOM M r- ^03UiV0tOvJOO O Ό tO o <W* 3-* O O w co to o w , W O O -to O to - w g ** 1+ Ό I . 1 f i I I o VO O I 1 t I I I rj* 03 LP O O o a » o w ω ω o tOM»-C''J'00 v

W H

,880 0794 12

Voorbeeld III

In dit voorbeeld worden nadere gegevens verstrekt aangaande de verdeling van de verzadigde en onverzadigde vetzuren over de 1- en 3-plaat-sen respectievelijk de 2-plaats van het glycerolmolecuul inzake de met 5 behulp van mutanten volgens de uitvinding respectievelijk met behulp van het wilde type Apiotrichum curvatum ATCC 20509 verkregen vetprodukten. Een dergelijke positieverdeling wordt belangrijk geacht aangezien het kenmerkend voor plantaardige lipiden zoals cacaoboter is, dat onverzadigde vetzuren (oliezuur) preferentieel op de 2-plaats van het glycerol-10 molecuul zijn gelocaliseerd. Als mutanten volgens de uitvinding zijn de absolute desaturase mutant CBS 199.87 en een tweetal partiële desaturase mutanten t.w. de revertanten R33.192 en R38.ll genomen.

Voor de positiebepaling van de vetzuren in de verkregen vetprodukten is gebruik gemaakt van een IÜPAC-methode, namelijk IUPAC 2.210: 15 Determination of fatty acids in the 2-position in the triglycerids of oils and fats.

Uit de onderstaande Tabel E blijkt, dat bij Apiotrichum curvatum ATCC 20509, bij de absolute desaturase mutant CBS 199.87 en de partiële 20 desaturase mutanten R33.192 en R38.ll de onverzadigde vetzuren, evenals bij cacaoboter, bij voorkeur de 2-plaats van het glycerolmolecuul bezetten.

. 8 8 0 0 7 S 4 13 οοΩοηοο <! ^ 2222222 m d?

νλ u ι_α t—it—it—if--» fD 0) tO Μ Μ M t—1 r-* t—' IB MJ

4s co oo oo oo σ» o\ rt cr ^ co oo co oo on ^ rt

UMH 2 C H* C M

g S «

w M

H· OP Ο· < 3$ ss Ί ^ rt Η· 01 N Hn«c

HUt0 M p. CC I i-H I Μ Η· ΓΤ < C

N to w O M u » OP rt Η H MVDCOUJ 00 OP rt pH

. ·*«·· u m 05 tO · · · · * r·* UJ πΌ on ωωβωνο ^-¾ mo ^ισ'^ίνο m ^*ö co g » » ” ! '5 H-Sci* Η- £ S £ &, c rt p S' H. 2 2*

ro to c p ^m to-S

« "S s 8¾

Si ÖOO oK

OOQ Up o CTO

*ë' (D · OQ Ό g Ot?

£j J-* <J

N5 H· v£>>0 „ ^ Jf* to O' I O top t-*00 I 2, Ο M 03 Ο N U Η Ό C Η I OtOUH I N ^L5f «.»«··· μ rt rt · · · · * r Π pm £ ° g5 pop: p ^ rt P I-1 m2 m η ft» 01 2 0 £ p 5 c 5.

m -» w <5 p ®

H

>

W

H

!Γ1

M

2222222 p p 2 2 2 2 2 2 2 p p ^ oo oo oo oo m O' rt σ' ¢- co oo co co O' O' π- σ^ wnh h e Μ w w 2 2 c ^ ® g H .5 . · H· OP O- < K- 0® JÓ! C P P P 2 2 2.

sj m rt —Sm rt H· P N P i ë I-J O rt C P. 2 ë μ· o* C C £· £ £ 00 rt η ι-j OP rt n i i—* (jj uj m Gj >0 ΓΌ (jO fr-1 Μ M *Ö

Η H VO ^ ^ O OJ ^ tj 030 HHCOCOUlHVO ^"5 S

....··· om mm .······ om m toLnui-JsjstooN m n h· vo o σ\ Ni nj νβ ίο mn £

ι-ί O 0 rt Π 2 II

h· m c h* £· 2 a

p. 0 rt P g* g. JL

(T> rt p σ' $ £ £f p p P 3 ® ® OP rt Ό 'Sm pp ® £, pp i-1 r WH· £· 00 S ^ o OP · OP 2 m 05 * 2 * § n

[sO H* 03 tO H· W

lj vi i o rt M Ui I O co

Ot-‘0'->t-‘OW O D' It HHHWS'UU fl ? , »»«·* t_i rt H· ····*·· H-* rt * 1 οι η η N oo ω to pm p: ot-,vow-p't-‘'J pp >9 to ό η P *5 rt P P £ ® * m H “S3 ft g 3 3.

1 « .8800794 5 c 14

Voorbeeld IV

A) Isolatie-procedure welke is toegepast voor het verkrijgen van desatu-rase-mutanten van de gistsoort Saccharomyces cerevisiae ATCC 25657.

In de onderstaande Tabel F volgt een weergave van de parameters, welke voor het verkrijgen van desaturase-mutanten van Saccharomyces cerevisiae ATCC 25657 in acht zijn genomen.

10 TABEL F

Isolatiemethode van absolute desaturase-mutanten uitgangsstam: Saccharomyces cerevisiae ATCC 25657 15 mutagens: ethylmethaansulfonaat (EMS) dosis: 2,9% (v/v) incubatiemedium: 0.1 M fosfaatbuffer pH 7,0 groeifase: logaritmisch dichtheid suspensie: E660 = 10 20 incubatietijd: 120 min.

incubatietemperatuur: 30°C

inactivatie EMS: 5% natriumthiosulfaat inactivatietijd: 30 min.

inactivatietemperatuur: kamertemperatuur 25 aantal behandelde cellen: 250.000 % overleving 15 aantal desaturase-mutanten: 3 mutantfrequentie: 1 per 6250 30 B) Vetzuursamenstellingen van een desaturase-mutant van Saccharomyces cerevisiae ATCC 25657.

In onderstaande Tabel G worden de proefresultaten weergegeven van een absolute desaturase-mutant van Saccharomyces cerevisiae (UFA3), 35 gekweekt bij aanwezigheid van verschillende hoeveelheden oliezuur in vergelijking met die van het wilde type (Saccharomyces cerevisiae ATCC 25657).

40 .8800794 4 15

TABEL G

Vetzuursamenstellingen van een absolute desaturase-mutant van Saccharo-5 myces cerevislae (UFA3) bij aanwezigheid van verschillende hoeveelheden oliezuur, in vergelijking met vetzuursamenstellingen van het wilde type zijnde ATCC 25657.

Stam ATCC ÜFA3 UFA3 ÜFA3 UFA3 10 25657 medium M5** M5** M5** M5** M5** mg oliezuur/g glucose 0 0.1 0.5 1.0 10 mg Tween 80/g glucose 0 2.5 12.5 25.0 250 15 vetzuursamenstelling: CIO 1.34 1.31 4.46 1.90 3.38 C12 4.88 6.01 7.63 11.88 3.32 C14 6.19 8.20 11.33 8.05 4.22 20 C16 17.98 39.18 31.24 21.41 10.39 C16.1 35.43 0.00 0.00 6.96 11.74 C18 8.55 10.79 18.93 8.67 4.01 C18.1 19.63 21.26 18.12 20.36 54.81 C18.2 4.52 6.54 7.42 12.01 1.99 25 C18.3 1.49 7.03 0.85 8.74 2.41 XSFA* 38.94 65.50 73.59 51.91 25.32

* %SFA = % verzadigde vetzuren 30 ** M5 medium is beschreven in Voorbeeld II

.8800754 6 16

Voorbeeld V

In de onderstaande Tabel H volgt een weergave van de parameters, welke bij het verkrijgen van fusanten van een door mutagenese met behulp van nitroso-guanidine verkregen aminozuur-auxotrofe Apiotrichum 5 curvatum-mutant en de desaturase-mutant van Apiotrichum curvatum met het depotnummer CBS 199.87 in acht zijn genomen

TABEL H

10 Isolatiemethode voor het verkrijgen van fusanten (hybriden) van CBS 199.87 en een aminozuur auxotrofe mutant van A.curvatum ATCC 20509.

I. Isolatie van protoplasten a) cultures van CBS 199.87 en de aminozuur auxotrofe mutant van 15 ATCC 20509 worden geoogst in de logaritmische groeifase d.m.v.

centrifugatie.

b) de celpellets worden lx gewassen met steriele bidest.

c) na centrifugatie worden de pellets opgenomen in buffer met 1M sorbitol, 25 mM EDTA + 50 mM DTT.pH=8.0.

20 d) de suspensies worden 30 minuten geïncubeerd in een schudwaterbad bij 30°C.

e) na centrifugatie worden de pellets opgenomen in 1,2 M sorbitol.

f) na centrifugatie worden de pellets opgenomen in buffer met 1,2 M sorbitol, 100 mM Na-citraat, 5 mM DTT + 2 mg/ml Novozym 234, 25 pH=5.8.

g) de suspensies worden 15-30 minuten geïncubeerd in een schudwaterbad bij 30°C.

h) de gevormde protoplastsuspensies worden 3x gewassen in buffer met 1,2 M sorbitol + 10 mM Tris-HCl, pH=8.0.

30 i) na centrifugatie worden de pellets opgenomen in buffer met 1,2 M sorbitol + 10 mM Tris-HCl, pH=8.0.

(II) Fusie van protoplasten en isolatie van fusanten (hybriden).

O

a) ongeveer 5.10 protoplasten van elke fusiepartner worden 35 samengevoegd en goed gemengd.

b) na centrifugatie wordt een PEG-oplossing (35% polyethyleenglycol 4000 + 10 mM CaCl2 + 10 mM Tris-HCl, pH=8.0) op de pellet gegoten en wordt vervolgens gemengd.

c) het fusiemengsel wordt 30 minuten geïncubeerd in een schudwaterbad 40 bij 30°C.

.8800794 ' * 17 d) na centrifugatie wordt de pellet lx gewassen in buffer met 1,2 M sorbitol + 10 mM Tris-HCl pH=8.0 en geresuspendeerd in dezelfde buffer.

e) deze suspensie wordt uitgespateld op selectief medium bestaande 5 uit 0,67% bacto yeast nitrogen base without amino acids, 2% dextrose, 1,2 M sorbitol + 1,5-3% agar.

f) na 4-7 dagen incubatie bij 30°C verschijnen kolonies van fusanten (hybriden).

(N.B. de oorspronkelijke fusiepartners kunnen op dit medium niet 10 groeien).

Een op bovenstaande wijze verkregen fusant is overeenkomstig het Verdrag van Boedapest onder nummer CBS 159.88 bij het Centraal Bureau voor Schimmelcultures te Baarn, Nederland, gedeponeerd.

15 Voorbeeld VI

Toepassing van enkele in Voorbeeld V verkregen fusanten alsmede een analyse van het daaruit verkregen produkt.

In een continu geroerd fermentatievat, voorzien van een beluch- 20 tingsleiding en pH-regelapparatuur werd een reinculture van een drietal volgens de in Voorbeeld V beschreven methoden verkregen fusanten alsook van A. curvatum ATCC 20509 geënt op een medium van weipermeaat, waarin met behulp van NH4CI de koolstof/stikstof-verhouding op 30 (g/g) was gebracht.

25 De cellen werden gekweekt bij een pH van 5,0 en een temperatuur van 30°C en werden geoogst, nadat de lactose in het groeimedium was verbruikt. De lipiden werden geëxtraheerd met organische oplosmiddelen en geanalyseerd op triglyceriden-samenstelling en vetzuursamenstelling (volgens algemeen gangbare methoden).

30 In de onderstaande Tabel I worden de proefresultaten weergegeven van het drietal volgens de in Voorbeeld V beschreven methode verkregen fusanten volgens de uitvinding en van het wilde type (Apiotrichum curvatum ATCC 20509).

35 . 8 8 0 Ö7S4 18

TABEL I

Stam_CBS 159.88 F 33.54 F 33.05 ATCC 20509 Cacaoboter C14 1.72 1.61 1.52 0.53 C16 23.75 27.85 32.39 28.10 23 - 30 C16-1 0.35 - 0.39 0.39

Cl8 31.21 24.13 25.42 13.90 32 - 38 C18-1 29.58 31.64 28.81 43.70 30 - 37 C18-2 5.61 7.33 6.41 9.57 2-4 C18-3 1.07 0.92 0.52 1.74 0 - 0,3 C20 1,54 1,29 1,11 0,31 0-1 C22 0.16 0.62 0.50 0.30 0 - 0,2 C24 3.64 3.38 1.69 1.05 Spoor %SFA* 62.57 59.05 62.63 44.25 60+3 %TGL**_95_95_95_95 g 96_ *) %SFA = % verzadigde vetzuren **) %TGL = % triglyceriden .6800754 19 *

Voorbeeld VII

In dit voorbeeld worden de vetzuursamenstellingen van een aantal intergene fusanten in vergelijking met die van de ouderstammen vermeld·

TABEL J

Stam_1 2_3_4_5_6_7 C14 0·53 8.36 0.24 1.11 2.09 1.54 1.24 C16 28.10 13.54 17.74 20.48 23.26 29.04 13.14 C16-1 0.39 28.11 9.70 1.87 0.30 0.24 6.61 C18 13.90 5.35 7.45 11.46 6.35 13.74 6.05 C18-1 43.70 29.69 47.12 32.95 24.04 26.48 36.94

Cl8-2 9.57 3.69 13.10 23.42 33.51 16.18 12.31

Cl8-3 1.74 4.66 0.23 2.30 5.03 2.05 1.02 C20 0.31 - - 0.38 0.11 0.62 1.71 C22 0.30 - 0.40 0.63 2.14 4.67 2.72 C24 1.05 - 2.1 1.94 2.13 2.18 1.56 %SFA* 44.25 31.44 27.93 36.50 37.62 52.40 26.42 *) ZSFA = Z verzadigde vetzuren 1 Apiotrichum curvatum ATCC 20509 2 = Saccharomyces cereviseae ATCC 25657 3 = Yarrowia lipolytica CBS 599 4 = fusant AS1 (A.curvatum ATCC 20509 x S.cerevisiae ATCC 25657) 5 = fusant Aufa S2 (A.curvatum CBS 199.87 x S.cereviseae ATCC 25657) 6 * fusant Aufa S5 (A.curvatum CBS 199.87 x S.cerevisiae ATCC 25657) 7 s fusant AufaY3 (A.curvatum CBS 199.87 x Y.lypolytica CBS 599) .8800794

Claims

1. Werkwijze voor het bereiden van als cacaoboter-equivalent of als component van een cacaoboter-equivalent te gebruiken vetten door het in 5 een medium cultiveren van een vetproducerend microorganisme en vervolgens het uit het microorganisme winnen van de bereide vetten, met het kenmerk, dat men als microorganisme - een mutant van een stam behorende tot een der geslachten Apiotrichum, Candida, Cryptococcus, Endomyces, Hansenula, Lipomyces, Pichia, Rhodo- 10 sporidium, Rhodotorula, Saccharomyces, Sporobolomyces, Torulopsis, Trichosporon en Yarrowia ofwel - een fusant van in totaal twee, drie of vier, in genetisch opzicht verschillende mutanten en/of gistcellen, alle behorende tot de bovenver- 15 melde geslachten toepast, waarin het voor de omzetting van stearinezuur in oliezuur verantwoordelijke enzymsysteem genetisch geheel of gedeeltelijk is geblokkeerd.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat men als microorganisme een mutant van Apiotrichum, Candida, Cryptococcus, Endo- 20 myces, Hansenula, Lipomyces, Pichia, Rhodosporidium, Rhodotorula, Saccharomyces, Sporobolomyces, Torulopsis, Trichosporon en Yarrowia toepast, waarin het voor de omzetting van stearinezuur in oliezuur verantwoordelijke enzymsysteem genetisch gedeeltelijk is geblokkeerd.

3. Werkwijze volgens conclusie 1 of 2, met het kenmerk, dat men als 25 microorganisme een mutant van de soort Apiotrichum curvatum toepast.

4. Werkwijze volgens conclusie 3, met het kenmerk. dat men als microorganisme een mutant van de stam Apiotrichum curvatum ATCC 20509 toepast·

5. Werkwijze volgens conclusie 4, met het kenmerk, dat men als 30 microorganisme de mutant van Apiotrichum curvatum toepast, welke onder het nummer CBS 199.87 bij het Centraal Bureau voor Schimmelcultures is gedeponeerd.

6. Werkwijze volgens conclusie 5, met het kenmerk, dat men als microorganisme een partiële desaturase-mutant toepast, welke afgeleid is 35 uit de absolute desaturase-mutant, die onder het nummer CBS 199.87 bij het Centraal Bureau voor Schimmelcultures te Baarn is gedeponeerd.

7. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat men als microorganisme een fusant toepast, welke verkregen is door samensmelting van protoplasten van twee genetisch verschillende gistcellen van de 40 soort Apiotrichum curvatum. .8800794 <1

8. Werkwijze volgens conclusie 7, met het kenmerk, dat men als microorganisme een fusant toepast, welke verkregen is door samensmelting van protoplasten van twee genetisch verschillende gistcellen, afgeleid van de stam Apiotriehum curvatum ATCC 20509 respectievelijk door samen- 5 smelting van de stam ATCC 20509 en een daarvan afgeleide gisteel·

9. Werkwijze volgens conclusie 8, met het kenmerk, dat' men als microorganisme een fusant toepast, welke verkregen is door samensmelting van de protoplasten van enerzijds een aminozuur auxotrofe mutant van de stam ATCC 20509 en anderzijds de stam CBS 199.87.

10. Werkwijze volgens conclusie 9, met het kenmerk, dat men als microorganisme de fusant toepast, welke onder het nummer CBS 159.88 bij het Centraal Bureau voor Schimmelcultures in Nederland is gedeponeerd.

11. Werkwijze volgens een of meer der conclusies 1-10, met het kenmerk, dat men een medium met daarin melasse, wei of wei-permeaat als 15 koolstofbron plus eventueel oliezuur en een in water oplosbare stikstof-bron toepast.

12. Cacaoboter-equivalent of een component daarvan, verkregen overeenkomstig de werkwijze volgens een of meer der conclusies 1-11.

13. Genot- en voedingsmiddelen, welke het cacaoboter-equivalent of 20 een component daarvan volgens conclusie 12 bevatten.

14. De mutant van de soort Apiotriehum curvatum, welke onder het nummer CBS 199.87 bij het Centraal Bureau voor Schimmelcultures in Nederland is gedeponeerd.

15. Fusanten, verkregen door het samensmelten van de protoplasten 25 van enerzijds de stam ATCC 20509 en anderzijds de stam CBS 199.87.

16. Fusant volgens conclusie 15, welke onder het nummer CBS 159.88 bij het Centraal Bureau voor Schimmelcultures in Nederland is gedeponeerd . **** .8800794