NL8401322A

NL8401322A - Nefrotoxiciteitsinhibitoren voor aminoglycoside antibiotica.

Info

Publication number: NL8401322A
Application number: NL8401322A
Authority: NL
Original assignee: Bristol Myers Co
Priority date: 1983-04-29
Filing date: 1984-04-25
Publication date: 1984-11-16
Also published as: IT8420727A0; CH660457A5; CA1227135A; MY100388A; SE8402333D0; SE8402333L; IE57409B1; FR2544986A1; GB2139087A; HK74791A; BE899542A; FR2544986B1; US4526888A; ZA843075B; AU560158B2; AU2744284A; GB2139087B; SE466288B; JPS59206311A; DE3415805A1

Description

r - * VO 6249

Nefrotoxiciteitsinhibitoren voor aminoglycoside antibiotica.

De nefrotoxiciteit van aminoglycoside antibiotica wordt in hoge mate verminderd of uitgeschakeld door het gezamenlijke gebruik daarmee van een polymeer van asparagine (bijvoorbeeld poly-l-asparagine) of aspartinezuur (bijvoorbeeld poly-l-aspartinezuur), een copolymeer daar-5 van, of een copolymeer van asparagine of aspartinezuur met een comono-meer.

Aminoglycoside antibiotica zoals bijvoorbeeld genta-micine worden gebonden aan en getransporteerd in de proximale tubulus-cellen in de nieren [Humes et al., Am. J. Kidney Diseases 11: 5-29 10 (1982)]. Proximale tubules celnecrose en erop volgende verstoring van de nierfuncties zijn het gevolg [Cronin, Clinical Nephrology 11? 251 -256 (1979)]. Deze nefrotoxiciteit beperkt de klinische toepassing van deze levensreddende antibiotica [Cronin, Clinical Nephrology 11: 251-256 (1979)? Bennett, Mineral Electrolyte Metab. 6: 277 - 86 (1981)? 15 Schor et al·., Kidney International 19: 288 - 296 (1981)]. Momenteel bestaat er geen veilige manier om de aminoglycoside nefrotoxiciteit te beperken of te verhinderen [Francke et al., Infections in Surgery March: 205 - 214 (1983)].

Er is aangetoond dat een aantal polyamines, waarvan 20 sommige zelf potentieel nefrotoxisch zijn, de binding en het transport van aminoglycoside antibiotica in nierweefsel [Josephovitz et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 223: 314 - 321 (1982)] of subcellulaire nier-fracties [spermine - Lipsky et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 215: 390 - 393 (1980)? en polamines zoals spermine, spermidine, polymyxin B 25 en polylysine - Kornguth et al., J. Antimicrob, Chemother., 6: 121 - 131 (1980)], belemmeren. Josephovits et al., supra, hebben vraagtekens geplaatst bij het gebruik van organopolykationen om het nefrotoxische vermogen van aminoglycosiden te verminderen, in verband met de aan polv-kationen als klasse verbonden mogelijke nefrotoxiciteit.

30 Methoden om het transport van geneesmiddelen en endo gene stoffen door epitheelcellen zoals die in de nier te bestuderen, omvatten het gebruik van geïsoleerde membraan vesiculae, Mürer et al., 8401322 n

** V

2 J. Membrane Biol», 55: 81 - 95 (1980). Procedures voor het isoleren en zuiveren van borstelrandmembranen van nierweefsel voor het hierin beschreven gebruik (in vitro membraantransport-inhibitieonderzoek) zijn beschreven; Williams et al., Toxicology and Applied Pharmacology/ 61: 5 243 - 251 (1981) en Kinsella et al., Biochimica et Biophysica Acta., 552: 468 - 477 (1979). Gentamicine transport/bindingsonderzoeken, gebruikmakend van geïsoleerde niermembraan-visiculae zijn beschreven;

Lipsky et al., supra, Sastraskih et.al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 222: 350 - 358 (1982); ook is gebruik gemaakt vein nier-mitochondriale 10 en microsomale bindingsinhlbitie; Kornguth et al., supra. Josephovitz et al., supra, hebben in vivo onderzoeken uitgevoerd naar de inhibitie van gentamicineopname in de nier-cortex van ratten door organische polykationen.

Door de uitvinders is gevonden dat bepaalde neutrale 15 en anionische polyaminozuren het membraantransport (in vitro) en de nefro-toxiciteit (in vivo) van aminoglycoside antibiotica verhinderen of vertragen. Eerder was van polykationen. alleen medegedeeld dat ze de nier-membraanbinding of weefselaccumulatie van aminoglycosiden belemmeren. Rapporten over aminoglycoside nefrotoxiciteitsinhibitoren waren beperkt 20 tot niet verwante stoffen zoals fosfomycine [Inouye et al., J. Pharm.

Dyn., _5: 659 - 669 (1982)], glucarolactonen/glycarolactamen [Furunto et al., Japan J. Pharmacol., 27: 371 - 378 (1977); J. Antibiotics, 29: 950 - 953 (1976); Furunto et al., J. Antibiotics, 29: 187 - 194 (1976); U.S.-4.122.171; ü.S.-3.929.583, ü.S.-3.962.429] en natriumformaldehyde •25 bisulfiet [Pindell et al., Chemotherapia., J3: 163 - 174 (1964); U.K.-957.433; DE-2.641.388].

Thans is gevonden, dat polymeren van het neutrale aminozuur asparagine, bijvoorbeeld poly-l-asparagine en polymeren van het zure aminozuur aspartinezuur, bijvoorbeeld poly-l-aspartinezuur, 30 indien tezamen met een nefrotoxisch.aminoglycoside antibioticum toegediend aan een zoogdier, de .nefrotoxiciteit van het aminoglycoside-antibioticum verminderen, kennelijk door de nieropname of de binding van het aminoglycoside.te belemmeren.

Het aminoglycoside antibioticum dat samen met de nier-35 opname belemmerende polymeren volgens de uitvinding kan worden gebruikt, is elk aminoglycoside antibioticum dat in nierweefsel. accumuleert, 8401322 ♦ % 3 en omvat derhalve elk aminoglycoside antibioticum. Voorbeelden van dergelijke aminoglycoside antibiotica omvatten kanamycine (Merck Index 9de ed. #5132), gentamieine (Merck index 9de ed. #4224), amikacine (Merck Index 9de ed. # Al), dibekacine (Merck Index 9de ed. #2969), tobramy-5 cine (Merck Index 9de ed. #9193), neomycine (Merck.Index 9de ed. #6278), streptomycine (Merck Index 9dê ed. #8611/8612), paromomycine (Merck Index 9de ed. # 6844); sisomicine (Merck Index 9de ed. # 8292), en netilmicine, die alle op zichzelf bekend zijn. De bruikbare antibiotica omvatten dê verscheidene structuurvarianten van de bovengenoemde verbin-10 dingen (bijvoorbeeld kanamycine A, B en C; gentamieine A, C^, C^a, C^ en D; neomycine B en C en dergelijke).

Alle tot op heden geteste aminoglycoside antibiotica accumuleren in nierweefsel en bezitten een bepaald nefrotoxisch vermogen [Puft et al·., J. Inf. Dis., 138(4): 541 - 595 (1978)). De onderhavige 15 uitvinding is derhalve bruikbaar bij elk aminoglycoside antibioticum.

Zowel de vrije basen als de farmaceutisch aanvaardbare zuuradditiezou-ten van deze aminoglycoside antibiotica kunnen worden gebruikt.

In deze beschrijving betekent de term "farmaceutisch aanvaardbaar zuuradditiezout" een mono- of polyzout, gevormd door de 20 interactie van een molecuul van het aminoglycoside antibioticum met een of meerdere moleculen van een farmaceutisch aanvaardbaar zuur. Tot die zuren behoren azijnzuur, waterstofchloride, zwavelzuur, malelnezuur, fosforzuur, salpeterzuur, waterstofbromide, ascorbinezuur, appelzuur en citroenzuur, en de andere zuren die gewoonlijk worden gebruikt voor 25 het maken van zouten van amine-bevattende geneesmiddelen.

De nieropname-inhibitors volgens de uitvinding die samen met de nefrotoxische aminoglycosiden worden gebruikt, zijn polymeren van asparagine of aspartinezuur, met inbegrip van homopolymeren van beide, copolymeren met elkaar en farmaceutisch aanvaardbare copolymeren 30 van asparagine en/of aspartinezuur met comonomeren, welke copolymeren een overheersende hoeveelheid asparagine of aspartinezuur bevatten.

De bruikbare polymeren hebben een molecuulgewicht tussen ongeveer 1000 en ongeveer 100.000, bij voorkeur tussen ongeveer 5500 en 16.000, en liefst tussen ongeveer 8000 en.15.000. Wanneer'het polymeer poly-l-aspar-35 tinezuur is of als copolymeer aspartinezuur bevat, kan het als een farmaceutisch aanvaardbaar zout, bijvoorbeeld als het natriumzout worden 8401322

** V

4 toegepast.

De combinaties volgens de uitvinding kunnen samen op verscheidene wijze worden toegepast. Bij voorkeur worden het aminoglycoside antibioticum en het inhibitore polymeer gecombineerd in één enkel-5 voudige doseringseenheid, bij voorkeur samen met een farmaceutisch aanvaardbare drager, bijvoorbeeld een gemeenschappelijke oplossing of dispersie in een inert farmaceutisch aanvaardbaar, oplosmiddel of dispergeer-middel en dergelijke. Farmaceutisch aanvaardbare dragers kunnen typerend al die dragers zijn die hiervoor· gebruikt werden of verenigbaar wa-10 ren met het aminoglycoside antibioticum alleen.

Een andere maar minder geprefereerde mogelijkheid is dat het aminoglycoside afzonderlijk met farmaceutisch aanvaardbare materialen tot een preparaat is verwerkt en afzonderlijk wordt toegediend, bij voorkeur vrijwel tegelijkertijd, met het aminoglycoside antibioticum 15 of, hetwelk minder voorkeur heeft, binnen ongeveer 1 uur vddr of na de toediening van het aminoglycoside antibioticum.

De wijze van toediening, de dosering en de frequentie van toediening worden beheerst door de toedieningswijze en doserings-overwegingen, die gewoonlijk bij.het aminoglycoside antibioticum een 20 rol spelen. Bijvoorbeeld kunnen verscheidene combinaties volgens de uitvinding intramusculair of intraveneus of anderszins worden toegediend, al naargelang de medische en farmacologische praktijk in samenhang met het gewenste gebruik van het toegepaste antibioticum voorschrijven.

De relatieve.en absolute hoeveelheden van het 25 antibioticum en het inhibitore polymeer zijn aan variaties onderhevig.

- Het antibioticum wordt typerend toegepast in zijn conventionele bekende therapeutische hoeveelheden. In de in de voorbeelden beschreven tests leidde het inhibitore polymeer niet. tot een vermindering van de anti-microbiële werkzaamheid van.het aminoglycoside antibioticum.

30 De hoeveelheid inhibitoor polymeer die samen met het aminoglycoside antibioticum wordt gebruikt, is een aminoglycoside antibioticum nefrotoxiciteit-verminderende hoeveelheid. De hoeveelheid varieert al naargelang het gebruikte aminoglycoside. De toegepaste hoeveelheid inhibitoor polymeer bedraagt typerend tenminste ongeveer 0,002 35 mol en bij voorkeur tenminste ongeveer 0,005 mol van het polymeer per mol aminoglycoside antibioticum. De bovengrens wordt bepaald door prak- 8401322 « *“ * 5 tisohè overwegingen met betrekking tot het gewicht en de kosten. Hoeveelheden van wel 10 mol polymeer per mol antibioticum zijn overwogen, maar blijken onnodig te zijn omdat veel kleinere hoeveelheden een uitstekende inhibitie blijken te verschaffen.

5 Fig. 1 is een grafische weergave van gentamicine- transport gekarakteriseerd naar tijd en concentratieafhankelijkheid en naar specificiteit.

Fig. 2 is een grafische vergelijking van de transport-inhibitiesterkten van in vivo nefrotoxiciteitsinhibitie van poly-l-aspa-10 ragine en poly-l-aspartinezuur.

De volgende voorbeelden dienen slechts ter toelichting van de uitvinding en dienen niet beperkend te worden opgevat. Alle delen en percentages in de beschrijving zijn betrokken op het gewicht tenzij anders is aangegeven. Opgemerkt wordt dat in de volgende voorbeelden 15 commercieel gentamicine wordt gebruikt, dat een mengsel is van de ganta-micines (ong. 28%), (ong. 37%) en C^a (ong. 35%). Het gewichtsgemid-delde molecuulgewicht is derhalve ongeveer 462.6. De in de voorbeelden toegepaste poly-l-asparagines zijn polymeren die uit ongeveer 80 - 90 terugkerende eenheden bestaan met molecuulgewichten van ongeveer 9000 -20 10.000 (volgens de specificaties die door de producent zijn verstrekt).

De in de voorbeelden toegepaste poly-l-aspartinezuren zijn de natrium-zouten van polymeren die uit ongeveer 90 - 100 terugkerende eenheden bestaan met een molecuulgewicht van ongeveer 14.000 (volgens de door de producent verstrekte specificaties).

25 Voorbeeld I

Er werd een in vitro onderzoekprogramma uitgestippeld om de selectieve inhibitie van aminoglycoside-transport door de borstel-randmembranen van proximale tubules-cellen van de nieren te onderzoeken.

In de onderzoeken werden geïsoleerde, gezuiverde borstelrandmembranen 30 gebruikt zoals beschreven door Kinsella et al., Biochem. Biophys. Acta, 552: 468 - 477 (1979) en Williams et al., Tox. Applied Pharmacol., 61: 243 - 251 (1981), omvattende een isolatie en zuivering van niercortex-membranen van ratten via differentiële centrifugatie, kationische preci-pitatie en discontinue sucrosegradiënt-technieken. De transportanalyse 3 35 werd uitgevoerd door - incubatie van H-gentamicinesulfaat met borstel- randmembraan-vesiculae gevolgd door verzamelen van de vesiculae op milli- 8401322 ! i « * t 6 pore filters onder vacuum.. Het transport werd gekwantificeerd door vloeistof scintillatietechnieken zoals beschreven door Kinsella et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 209: 443 - 450 (1979). Het hentamicine-trans-port werd (fig. 1) gekarakteriseerd naar zijn tijd en concentratie-5 afhankelijkheid, en naar zijn specificiteit. Het gentamicine-transport werd vervolgens gemeten bij een vaste gentamicineconcentratie (0,5 mM) in tegenwoordigheid van vermoedelijke inhibitors in een 5 keer molaire concentratie.

In het bijzonder omvatte de membraantransportanalyse '3 3 10 de incubatie van 0,4 millimolaire H-gentamicine of H-amikacine met 100 - 200 microgram membraan .in een 100 microliter reactievolume gedurende 30 seconden (de reactie werd op gang gebracht door de toevoeging van het membraan-eiwit - ongeveer 20.microliter).. Na de 30 seconden reactie werd het transport afgebroken door toevoeging van 2,0 milliliter ijs- 15 koude buffer (250 millimolair mannitol, 15 millimolair KC1 en 20 millimo-lair Hepes-pH 7,4 met THIS). Het reactiemedium werd vervolgens op 0,3 micron millipore filters, vacuum-gefiltreerd. De filters werden 2 keer met 2 ml van de buffer gewassen en. werden verwijderd en geteld met behulp van vloeistofscintillatie-spectroscopietechnieken.

20 De transportinhibitie werd gemeten door de bovenstaan de transportanalyses in tegenwoordigheid van de vermoedelijke inhibitors .bij aanvangsconcentraties variërend van 1 tot 10 keer de aminoglycoside molaire concentratie te volgen.. De inhibitors werden in de bovenstaand beschreven buffer opgelost.

25 Onderstaande tabel A vat de verscheidene in deze in vitro test onderzochte chemicaliën samen.

TABEL A

In vitro onderzochte chemicaliën

Suikers/derivaten (16) polyatn-ines (14) acetylgalactosamine agmatine 30 acetylglucosamine diaminodecaan acetylmannosamine diaminodipropylamine galactosamine diaminododecaan glucarolactam diaminoheptaan glucarolacton diaminooctaan 35 gluconolacton diëthyleentriamine-penta- , . , 'azijnzuur

glucuronamide J

8401322 « t % * 7 T & B E L & (Vervolg)

Suikers/derivaten (16) Polyamlnes (14) glucuronzuur dimethylanLinopropylamine glucuronolacton glucose hexaandiamine 5 lyxosylamlne spermine mannose tributylamine..

methylglucamine triëthyleendiamine 3-O-methylglucose triëthyleentetramine xylose tripropylamine 10 diversen (19) aminozuren amikacine tetragluconaat mono (8) poly (12) caffeine alanine alanine..

42 calciumchloride asparagine asparagine..

yu gekationiseerd ferritine arginine arginine,.

15 cytidine cystathion ornithine^ fosfomycine cysteine histidine glutaraldehyde glutamine glutamine^

glutaarzuur glycine glutaminezuur^Q

lysozyme lysine lysine2f4fl0f2Q

20 myoinositolfosfaat aspartinezuuTg^ polyadenylzuur polycytidylzuur nierdipeptidase inhibitor (BCH-1) 25 siaalzuur natriumacetonbisulfiet natriumaldehydebisulfiet natriumbisulfiet natriumformaldehydebisulfiet 30 natriumglutaraldehydebisulfiet tertiaire aminen (4) choline tetrabutylammoniumbromide tetraëthylammoniumbromide 35 tetrahexylammoniumbromide 8401322 * * \ 8

Tabel B geeft de viertien chemicaliën die in deze onderzoeksprocedure het gentamicine-transport bleken te belemmeren.

Deze transportinhibitors verschillen aanmerkelijk in sterkte zoals tot uiting komt in de waarden voor de molaire veelvouden die 50% transport-5 inhibitie geven.

TABEL· B

Membraantransport inhibitors

Inhibitors 1^.

Polyamines

diaminodipropylamine 10X

. 10 spermine 3X

Polyaminozuren

lysine 10X

lysineIX lysine20 0,05x 15 asparagine^ 0,lx

aspartinezuuTgg < 0,IX

glutaminezuur^Q < 0,IX

ornithineqq < 2X

histidine70 IX

20 arginine^gQ 0,05X

diversen

natriumformaldehyde bisulfiet 10X

natriumglutaraldehyde bisulfiet 10X

gekationiseerd ferritine 10-9X· -25 Nefroprotectieve middelen werden onderzocht op hun ver enigbaarheid met amikacine of gentamicine door de Bacillus subtilis .cup plaat analyse. In geen van de combinaties werd enig bewijs voor verlies van aminoglycoside activiteit waargenomen. De membraantransport-inhibitors werden ook alleen onderzocht om enige antibioticum-werkzaam-30 heid vast te stellen die de interpretatie van de gegevens van de combinaties zou kunnen beïnvloeden. Geen.van de inhibitors vertoonde enige detecteerbare antimicrobiële werkzaamheid tegen Bacillus subtilis.

In vivo gegevens voor 9 transportinhibitors van het in vitro onderzoek worden in tabel C verstrekt.

84 0 1 3 2 2 .....^^^— • « ' 9

TABEL· G

Membraantransport-inhibitors in vivo

Inhibitor Veelvoud van de AG dosis Nefroprotectieve ________ mg activiteit lysine4 16 25 0 5 lysine^0 0,3 15 0 lysine^Q 0,1 0,7 +

NaFormBisulfiet 136 .40..· +

NaGlutBisulfiet 5 2,5 0 diaminodipropylamine 5 1 0 10 aspartinezuuTg0 0,3 10 +++ glutaminezuuTgQ 1 15 0 asparagine^ 1,0 20 +++ 0,5 10 +++ " 0,3 6 + 15 0,15 3 + " 0,10 2 + + » minder dan 50% reductie +++ = reductie 100%

Voor verbindingen zoals polyasparagine en polyaspartine-20 zuur, die de grootste mate van.in vivo nefroprotectieve activiteit vertonen, bestaat een uitstekende correlatie tussen de molaire In vitro en in vivo sterkte. Dit verband wordt in fig. 2 aangetoond. In de polyly-sine-serie van membraantransport-inhibitors,. vertoonde de in vitro sterkte een correlatie met de grootte van het polymeer, en vertoonde 25 alleen de sterkte transportinhibitor (polylysine^g) enige nefroprotectieve werkzaamheid (zie tabel C).

Voorbeeld II

Een aantal kandidaten uit het bovenstaande in vitro onderzoek werden aan in vivo onderzoeken onderworpen.

30 In vivo diermodel

Voor het testen van de werkzaamheid in vivo van aminoglycoside transport-inhibitorcombinaties werd gebruik gemaakt‘van een 14 dagen subcutaan nefrotoxiciteitsmodel in ratten. Dit model loopt evenwijdig aan kortdurende behandelingsschema's in klinische toepassingen.

35 Hoewel het bloed-ureumstikstofgehalte (BUN) als klinische parameter van 8401322 4 9 10 de nierfunctie werd gevolgd, houdt de primaire evaluatie van de nefrotoxi-citeit in dit model een histopathologisch onderzoek van het nierweef-sel in, dat een nauwkeuriger en gevoeliger methode voor het beoordelen van de nefrotoxiciteit is [Hottendorf et al.·, Antimicrob. Agents Chemo-5 ther., 18: 176 - 181 (1980)]. De gentamicinedosis die nodig is om een significante en reproduceerbare nefrotoxische respons in dit model op te roepen, bedraagt 20 mg/kg/dag (bid, 14 dagen).

Testdieren:

Sprague-Dawley mannetjesratten [Charles River Breeding 10 Laboratories, Inc.,. (CRL: COBS CD (SD) BR)] van ongeveer 6 weken oud en met een gewicht van 140 - 160 g per aankomst werden, gebruikt. Ze werden gedurende tenminste 5 dagen voorafgaande aan het begin van het onderzoek in conditie, gebracht. Er werden alleen dieren uitgekozen die klinisch gezond werden bevonden. De ratten werden individueel geidenti-15 ficeerd door een nummer op de staart met zwarte, markeerpennen. Gedurende het onderzoek werden.de ratten individueel gehuisvesd in kooien van gepaste afmetingen en type in een temperatuur-gecontroleerde ruimte. Rodent Laboratory Chow (pellet, Purina Ralston Company) en water werden ad libitum aangeboden.

20 Testartikelen en controleprocedures:

Garamycine (gentamicinesulfaat) dat 40 mg gentamicine base/ml bevat.

Poly-1-asparagine^ (PAsp^), (Sigma Chemical Co., St.

Louis, Missouri).

25 poly-l-aspartinezuuTgg (PAA^q, (Sigma Chemical Co., St.

Louis, Missouri).

Poly-l-glutaminezuur^Q (PGlUg^), (Sigma Chemical Co.,

St. Louis, Missouri).

Tetralysine (PLys^), pentahydrochloridezout, (Sherbrooke 30 Dniversiteit, Sherbrooke, Quebec, Canada).

Gentamine-baseconcentraties werden in alle doserings-oplossingen eenmaal gedurende het onderzoek bepaald. De activiteit werd bepaald met de Bacillus.subtilis cup plaat-analyse.

Dosis bereiding en procedures: 35 De aminoglycoside en aminoglycoside-inhibitormengsels werden tweemaal daags gedurende.' 14 dagen subcutaan toegediend.

8401322 * « *

II

De gentamicinedoseringsoplossingen werden bereid door het in de handel verkrijgbare gararaycine (40 mg/ml) te verdunnen tot een concentratie van 4 mg/ml (1 : 10 verdunning). Deze oplossing werd met gelijke volumehoeveelheden water of de gepaste oplossingen van de 5 andere testmiddelen verdund tot een uiteindelijke concentratie van 2 mg gentamicine base/ml. De rattengroepen en beschrijvingen van doserings-oplossingen en volumehoeveelheden worden in de onderstaande tabellen D en E gegeven.

TABEL P Groep identificatie-.- 10 Groep Dier- Mol- Doses nummer nummer Behandeling verhouding (mg/kg ) . I 51-60 zoutoplossing II 26-30 Gentamicine - 10 III 31-35 Gentamicine - 20 15 IV 1-5 Gentm/PAsp90 7:1 20:60 V 6-10 Gentm/PAspgo 3,5:1 20:120 VI 11-15 Gentm/PAAgo 3:1 20:200 VII 16-20 Gentm/PGlUgQ 1:1 20:350 VIII 21-25 Gentm/PLys4 1:16 20:500 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 8401322

In verband met de troebelheid en verminderde activi 2 teit van groep IV doseringsoplossing Gentm/PAspgo molverhouding 7:1 (20: 3 60 mg/kg) werd de dosering aan de onderzoeksdieren nrs. 1 - 5 op onder 4 zoeksdag 2 afgebroken en werden de zoutoplossing controledieren nrs. 56- 5 60 gedoseerd met een andere concentratie van die combinatie en in de 6 plaats gesteld van en aangeduid als onderzoeksdieren nrs. 1-5, groep 7 IV.

TABEL E

8

Doseringsoplossingen en volumehoeveelheden 9

Groep- Aanvangsconc.(mg/ml) Eindconc.(mg/ml) Dagelijkse 10 nummer Behandeling Aminogly. andere Aminogly. andere halve dosis 11 _ __ _ __ _ _ (ml/100 g) I zoutopl. - - - - 1,00 II Gentm 4,00 - 2,00 - 0,25 III Gentm 4,00 - 2,00 - 0,50 IV Gentm/PAspgo 20,0 60,0 10,0 30,0 0,10 it iff 12 TABEL E (Vervolg)

Groep- Aanvangsconc.(mg/ml) Eindconc.(mg/ml) Dagelijkse nummer Behandeling Aminogly. andere Aminogly. andere halve dosis _ _ _ _' _;_ _ (ml/100 g) V Gentm/PAspgo 4,00 24,00 2,00 12,00 0,50 5 VI Gentm/PAAgo 4,00 40,00 2,00 20,00 0,50 VII Gentm/PGlu . 4,00 · 70,00 2,00 35,00 0,50

OU

VIII Gentm/PLys4 4,00 100,00 2,00 50,00 0,50

Anatomische pathalogie:

Alle ratten werden op onderzoeksdag 15 door een overdosis 10 natriumpentobarbital gedood. De nieren werden verwijderd, aan een grof onderzoek onderworpen en in 10% neutraal gebufferde formaline gebracht voor een daaropvolgende histopathologische evaluatie.

De resultaten van de histopathologie-evaluatie worden als volgt samengevat.

TABEL F

15 Groep I Groep II

controles (zoutoplossing) GENTM 10 diernummer Histopath. diernummer Histopath.

— score (totaal) _ score (totaal) 51 2 26 1 20 52 0 27 5 53 3 28 6 54 2 29 4 55 3 30. 5 2,0 4,2 1 2 3 4 5 6 8401322

Groep III Groep IV

2 GENTM 20 GENTM/PAsp (20:60) 3 diernummer Histopath. diernummer Histopath.

4 _ score (totaal) __ score (totaal) 5 31 4 12 6 32 3 2 2 33 5 . 3 3 34 4 4 3' 35 8 5 4 4,8 2,8 t «5 .

9 13 TABEL F (Vervolg)

Groep V Groep VI

GBNTM/PAsp (20;120) GENTM/PAA (20;200) dier- Histopath. diernummer Histopath.

nummer score (totaal) _ score (totaal) 56 3 11 2 7 4 12 0 8 3 13 3 9 3 14 3 1° _2_ 15 JL_ 10 3,0 1,8

Groep VII Groep VIII

GENT/PGlu (20i350) GENTM/Plys^ (20:500) dier- Histopath. diernummer Histopath.

nummer score (totaal) -_ score (totaal) 15 16 6 21 4 17 8 22 7 18 5 23 5 19 10 24 5 20 _8_ 25 8 20 7,4 5,8

De groepen II en III tonen de nefrotoxiciteit van gentami-cine. De groepen IV, V en VI tonen het inhibitore effect van de uitvinding. De groepn VII en VIII tonen het vergelijkenderwijze ontbreken van een inhxbitoor effect van andere potentiële inhibitors buiten de omvang 25 van de uitvinding.

Voorbeeld lil

Teneinde het vermogen van verschillende in vitro inhibitors van gentamicine-transport vast te stellen om aminoglycoside nefrotoxiciteit in ratten te verhinderen, werden poly-l-lysine (Plys^ ^ , po-30 ly-l-asparagine^Q (PAsp^^J en natriumformaldehyde-bisulfiet (MeS) tezamen met amikacine en gentamicine als mengsels subcutaan gedurende 14 dagen toegediend. De nefrotoxiciteit werd gevolgd door bloed-ureumstikstof (BON) analyse en histopathologisch onderzoek van nierweefsel.

Testprodukten en controleprocedures 35 a) Amikine (amikacinesulfaat) dat .250 mg amikacinebase per ml bevat.

8401322 % 14 ï.

b) Garamicine (gentamicinesulfaat) dat. 40 mg gentamicinebase per ml bevat.

c) Poly-l-lysine^Q (Plys^), Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri.

d) Poly-l-lysinel2 (Plys12), Miles Laboratories, Inc., Elkhart, Indiana.

e) Poly-l-asparaginegQ (PAspgQ) (PAspgQ), Sigma Chemical Co.,. St. Louis, 5 Missouri.

f) Natriumformaldehyde bisulfiet.(MeS), Eastman. Kodak Co., Rochester,

New York.

g) Amikacine en gentamicine-baseconcentraties werden in alle doserings-oplossingen eenmaal gedurende, het onderzoek vastgesteld. De middelen, 10 die in mengsels met amikacine of gentamicine waren geprepareerd, werden eveneens afzonderlijk, in de in de mengsels toegepaste concentraties op hun biologische activiteit geanalyseerd. De activiteit werd bepaald door. de Bacillus subtllis cup plaatanalyse.

Testdieren: 15 Sprague-Dawley mannetjesratten [Charles River Breeding

Laboratories, Inc., [CRL: COBS CD (SD) BR)] van ongeveer 6 weken oud en met een gewicht van 130 - 150 g bij aankomst werden gebruikt. Zij werden gedurende tenminste 5 dagen.voorafgaande aan de start van het onderzoek in conditie gebracht. Er werden alleen dieren geselecteerd die kli-20 nisch gezond bleken te zijn. De ratten werden individueel door een nummer op de staart met zwart-schrijvende pennen geïdentificeerd.

Tijdens het onderzoek werden de ratten individueel gehuisvest in kooien van gepast type en grootte in een ruimte waarin de temperatuur werd geregeld. Rodent Laboratory. Chow (pellet, Purina Ral-25 ston Company) en water.werden ad libitum aangeboden.

Dosisbereiding en procedures:

Aminoglycosiden en aminoglycoside-inhibitormengsels werden subcutaan tweemaal per dag gedurende 14 dagen toegediend.

Amikacine-oplossingen.werden bereid door eerst het in 30 de handel verkrijgbare amikine (250 mg/ml) te verdunnen met steriel water.voor injectie, USP, tot een concentratie van 20 mg/ml (1:12,5 verdunning) . Gentamicine-oplossingen werden eveneens bereid door het in de handel verkrijgbare garamycine (40 mg/ml) te verdunnen tot een concentratie van 4 mg/ml (1:10 verdunning).. Deze oplossingen werden verdund met 35 gelijke volumehoeveelheden water of de gepaste oplossingen van de andere testmiddelen tot een eindconcentratie.van 10 mg amikacine of 2 mg genta-micine-base/ml.. De. rattengroepen en beschrijvingen van doseringsoplossin- 8401322 “Z * % 15 * gen en volumehoeveelheden worden in de onderstaande tabellen gegeven.

TABEL· G ·

Groep identificatie

Groep- Dier- Mol- Doses nummer nummer Behandeling verhouding (mg/kg*) 5 I 46-55 zoutopl. - - II 36-40 gentamicine - 20 III 11-15 Gentm/PAspgo 1:1 20:400 IV 1-5 Gentm/Plys12 1:1 20:125 V 6-10 Gentm/Plysjg 1:3 20:275 10 VI 16-20 Gentm/MeS 1:68 20:400 VII 21-25 Gentm/MeS 1:136 20:800 VIII 26-30 Amik/MeS 1:9 200:400 IX 31-35 Amik/MeS 1:18 200:800 X 41-45 Amikacine - 200 15 x in termen van base-activiteit

TABEL· B

Doseringsoplossingen en volumehoeveelheden

Groep- Aanvangsconc.(mg/ml) Eindconc.(mg/ml) Dagelijkse nummer Behandeling Aminogly. andere Aminogly. andere halve dosis _ _ _ _ _ _ (ml/100 g) 20 I zoutopl. - - - - 1»0 II gentamicine 4,00 - 2,00 - 0,5 III Gentm/PAspg0 4,00 80,00 2,00 40,00 0,5 IV Gentm/Plys12 4,00 25,00 2,00 12,50 0,5 V Gentm/Plys10 4,00 55,00 2,00 27,50 0,5 25 VI Gentm/MeS 4,00 80,00 2,00 40,00 0,5 VII Gentm/MeS 4,00 160,00 2,00 .80,00 0,5 VIII Amik/MeS .· 20,00 40,00 10,00 20,00 1,0 IX Amik/MeS 20,00 80,00 10,00 40,00 1,0 X Amikacine 20,00 - 10,00 - 1,0 1 8401322

Klinische en anatomische pathologie:

Bloed werd van alle ratten op onderzoeksdag 15 verzameld om het bloed-ureumstikstofgehalte (BON) te bepalen.

' 16 < r' v *

Alle ratten werden door een overdosis natriumpento-barbital op onderzoeksdag 15 gedood. De nieren werden verwijderd, grof onderzocht en in 10% neutraal gebufferde formaline gebracht voor een daaropvolgende histopathologische evaluatie.

TABEL I

5 Resultaten van het histopathologische onderzoek

Groep I Groep II

Controles (zoutopl.) Gentamicine (20 mg/kg) rat histopath. rat histopath.

nr. score (totaal) nr. score (totaal) 10 46 2 36 8 47 2 37 9 48 2 38 9 49 0 39 8 50 0 40 _10 15 51 3 8,8 52 3 53 2 54 0 55 _2 20 1,6

Groep lil Groep IV

GENT/PAsp9 Qit GENT/Plys^ (1:1) rat histopath. rat histopath.

nr, score (totaal) nr. score (totaal) 25 11 1 1 11 12 5 2 6 13 2 3 5 14 2 4 5 15 _1_ 5 _4 30 2,2 6,2 8401322 1 y « 17 T & B E L I (Vervolg)

Groep V Groep VI

GENT/Plys1Q (1;3) GENT/MeS (ls68) rat nr. histopath. rat histopath.

_ score (totaal) nr. score (totaal) 56 4 16 5 7 8 17 7 8 4 18 4 9 8 19 8 10 11_ 20 _5 10 7,0 5,8

Groep VII Groep VIII

GENT/MeS (Ir 136) AMIK/MeS (1:9) rat histopath. rat histopath.

nr. score (totaal) nr. score (totaal) 15 21 3 26 14 22 7 27 15 23 3 28 14 24 3 29 13 25 8 30 20 4,8 13,4

Groep lx Groep X

AMIK/MeS (I1I8) AMIKACINE (200 mg/kg) rat histopath. rat histopath.

nr. score (totaal) nr. score (totaal) 25 31 13 41 15 32 14 42 11 33 14 43 12 34 8 44 14 35 _10 45 14 30 11,8 13,2

Bij deze dosis veroorzaakte PAsp vaculolatie in de proximale tubule welke verband schijnt te hebben met de aanwezigheid van PAsp. De significantie van deze verandering is niet bekend.

Groep II toont de nefrotoxiciteit van gentainicine in 35 deze test. Groep II toont het inhibitore effect van de uitvinding. De groepen IV - IX tonen het vergelijkenderwijze ontbreken van een inhibi- 8401322 ¢- 4 18

toor effect van andere potentiële inhibitors buiten de omvang van de uit- . vinding. Goep X toont de nefrotoxiciteit van amikacine in deze test. Voorbeeld IV

Het vermogen van poly-1-asparagine en poly-l-aspartine-5 zuur om de nefrotoxiciteit van amikacine in ratten te verhinderen, werd bepaald door deze middelen tegelijk met amikacine als mengsels subcutaan gedurende 14 dagen toe te dienen. De nefrotoxiciteit werd gevolgd door een histopathologisch onderzoek van nierweefsel.

Testproedukten en controleprocedures: 10 a) Amikine (amikacinesulfaat) dat 250 mg amikacine-base per ml bevat.

b) Poly-l-asparaginegg (PAspgg), molecuulgewicht ongeveer 9000.

c) Poly-l-aspartinezuur^qq (PAA^qq), molecuulgewicht ongeveer 14.000.

d) De amika-baseconcentraties werden aan alle doseringsoplossingen eenmaal tijdens het onderzoek vastgesteld. De activiteit werd bepaald door de 15 Bacillus subtilis cup plaatanalyse.

Testdieren:.....

Vijfentwintig (25) Sprague-Dawley mannetjesratten [Charles River Breeding Laboratories, Inc., (CRL: COBS CD (SD) BR) ] van ongeveer 6 weken oud en met een gewicht van 130 - 150 g bij aankomst 20 werden gebruikt. Ze werden gedurende tenminste 5 dagen voorafgaande aan de start van het onderzoek in conditie gebracht. Er werden alleen dieren geselecteerd die klinisch gezond bleken te zijn. De ratten werden individueel geïdentificeerd door een nummer (1 - 25) op de staart met zwart schrijvende pennen.

25 Tijdens het onderzoek werden de ratten individueel ge huisvest in kooien van gepaste type en grootte in een ruimte waar de temperatuur werd geregeld. Rodent Laboratory Chow (pellet, Purina Ralston Company) en water werden ad libitum aangeboden.

Dosisbereiding en procedures: 30 Amikacine en amikacinemengsels werden subcutaan tweemaal per dag gedurende 14 dagen toegediend.

De amikacine-doseringsoplossingen werden bereid door het in de handel verkrijgbare amikine (250 mg/ml) te verdunnen met steriel water voor injectie, USP, tot een aanvangsconcentratie van 20 mg/ml (1 : 35 12,5 verdunning). Deze oplossing werd vervolgens met gelijke volumehoe- veelheden steriel water of de gepaste oplossingen van de andere testmid- 8401322 19 delen verdund tot een eindconcentratie van 10 mg amikacine/ml.

I&BEL J Groep identificatie

Groepnusmer Diemummer Behandeling Mol verhouding Doses _ _ ____(mg/kg *) 5 1 1-5 Amik/PAspgQ 5:1 200:600 II 6-10 Jünik/PA&100 10:1 200:500 III 11-15 Amikacine - 200 IV 16-25 Zoutópl. - - J£ in termen van base-activiteit

TABEL· K

Doseringsoplossingen en volumehoeveelheden 10 Groep Behandeling Aanvangsconc. (mg/ml) Bindconc.(mg/ml) Dagelijkse nr. Amikacine andere Amikacine andere halve dosis _ __ _ _ _ _ (ml/100 g) 1 &nik/PAsport 20 60 10 30 1,00 11 Amik/PAA100 20 50 10 25 1,00 15 III Amikacine 20 - 10 - 1,00 IV Zoutopl. - - - - 1,00

Anatomische pathologie:

Alle ratten werden door een overdosis natrium-pentobar-bital op onderzoeksdag 15 gedood. De nieren werden verwijderd, grof on-20 derzocht en in 10% neutraal gebufferde formaline gebracht voor een daaropvolgende histopathologische evaluatie.

TABEL· L

Resultaten van het histopathologische onderzoek

Groep I Groep II

Amikacine/PAsp„Q (5:1) Amikacine/PAA^(10:1) 25 rat nr. hisfopath. rat nr. histopath.

_ score (totaal) _ score (totaal) 12 6 0 2 3 7 6 3 5 8 3 30 4 5 9 3 5 _1 10 _4 84 0 1 3 2 2 3,2 3,2

-II

t 20 TABEL L (Vervolg)

Groep III Groep IV

Amikacine Zoutoplossing rat nr. histopath. rat nr. histopath.

_ score (totaal) _ score (totaal) 5 11 12 16 3 12 13 17 3 13 11 18 3 14 13 19 2 15 __15 20 1 10 12,8 21 3 22 0 23 2 24 1 25 1 15 1,9 8401322

Claims

1. Samenstelling, omvattende a) een aminoglycoside, of farmaceutisch aanvaardbaar-zout daarvan, met een nefrotoxisch vermogen en b) tenminste 0,002 mol per mol aminoglycoside van 5 i) polyasparagine, ii) polyaspartinezuur of een farmaceutisch aanvaardbaar zout daarvan, iii) een copolymeer van polyasparagine en polyaspartinezuur, of een farmaceutisch aanvaardbaar zout 10 daarvan, of iv) een copolymeer van polyasparagine of polyaspar tinezuur, of een farmaceutisch aanvaardbaar zout daarvan, met een farmaceutisch aanvaardbaar co-monomeer, welk copolymeer een substantiële hoe-15 veelheid asparagine of aspartinezuur bevat, waarin het polymeer of copolymeer een molecuulgewicht van ongeveer 1000 tot 100.000 heeft.

2. Samenstelling volgens conclusie 1, omvattende a} een aminoglycoside, of farmaceutisch aanvaardbaar 20 zout daarvan, met een nefrotoxisch vermogen, en b) tenminste 0,005 mol per mol aminoglycoside van poly- 1-asparagine of poly-l-aspartinezuur, of een farmaceutisch aanvaardbaar zout daarvan, waarin het polymeer een molecuulgewicht heeft van ongeveer 5500 tot onge-25 veer 16.000.

3. Samenstelling volgens .conclusie 2, waarin het aminoglycoside gentamicine of amikacine is.

4. Samenstelling volgens conclusie 1, omvattende genata-micine of een farmaceutisch aanvaardbaar, zout daarvan, en tenminste onge- 30 veer 0,005 mol per mol gentamicine. van poly-l-asparagihe met een molecuulgewicht van ongeveer 8000 tot.ongeveer 15.000.

5. Samenstelling volgens conclusie 1, omvattende gentamicine of een farmaceutisch aanvaardbaar zout daarvan en tenminste ongeveer 8401322 * V * 0,005 mol per mol gentamicine van poly-l-aspartinezuur met een molecuul-gewicht van ongeveer 8000 tot ongeveer 15.000, of een farmaceutisch aanvaardbaar zout daarvan.

6. Samenstelling volgens conclusie 1, omvattende amikacine, 5 of een farmaceutisch aanvaardbaar zout.daarvan, en tenminste ongeveer 0,005 mol per mol amikacine van poly-1-asparagine met een molecuulge-wicht van ongeveer 8000 tot ongeveer 15.000.

7. Samenstelling volgens volgens conclusie 1, omvattende amikacine of een farmaceutisch aanvaardbaar zout daarvan, en tenminste 10 ongeveer 0,005 mol per mol amikacine van poly-l-aspartinezuur met een molecuulgewicht van ongeveer 8000 tot ongeveer 15..000 of een farmaceutisch aanvaardbaar' zout daarvan.

8. Samenstelling volgens een. van de conclusies 1-7, waarin het farmaceutisch aanvaardbare zuuradditiezout een mono- of poly- 15 zout is, gevormd door interactie van.1 molecuul van het aminoglycoside-antibioticum met een of meerdere; moleculen, van een farmaceutisch aanvaardbaar zuur, gekozen uit de groep bestaande .uit azijnzuur, waterstofchloride, zwavelzuur, malelnezuur, fosforzuur, salpterzuur, waterstofbromide, ascorbinezuur, appelzuur en citroenzuur.

9. Doseringseenheid, omvattende: a) een therapeutisch werkzame hoeveelheid van een aminoglycoside antibioticum met een nefrotoxisch vermogen en b) een.nefrotoxiciteit-verminderende hoeveelheid van i) polyasparagine, 25 ii) polyaspartinezuur of een farmaceutisch aanvaard baar zout daarvan, iii) een .copolymeer van polyasparagine en polyaspartinezuur, of een farmaceutisch aanvaardbaar zout daarvan, of 30 iv) een copolymeer van polyasparagine of polyaspartine zuur of een .farmaceutisch aanvaardbaar zout daarvan, met een farmaceutisch aanvaardbaar comono-meer, welk copolymeer een substantiële hoeveelheid asparagine of aspartinezuur bevat, 35 waarin het polymeer of copolymeer een molecuulgewicht heeft van ongeveer 1000 tot ongeveer 100.000. 8401322 t tl _

10. Doseringseenheid volgens conclusie 9, die bovendien een farmaceutisch aanvaardbare drager bevat.

11. Doseringseenheid volgens conclusie 9, waarin het polymeer of copolymeer een molecuulgewicht heeft van ongeveer 5500 tot 5 ongeveer 16.000.

12. Doseringseenheid volgens conclusie 9, waarin het polymeer of copolymeer een molecuulgewicht heeft van ongeveer 8000 tot ongeveer 15.000.

13. Doseringseenheid volgens conclusie 12, die bovendien 10 een farmaceutisch aanvaardbare drager bevat.

14. Doseringseenheid volgens conclusie 12, waarin het polymeer poly-l-asparagine of poly-l-aspartinezuur, of een farmaceutisch aanvaardbaar zout daarvan, is en in een hoeveelheid van tenminste ongeveer 0,005 mol per mol aminoglycoside-antibioticum aanwezig is.

15. Doseringseenheid volgens conclusie 14, die bovendien een farmaceutisch aanvaardbare drager bevat.

16. Doseringseenheid volgens conclusie 14, waarin het aminoglycoside gentamicine of amikacine is.

17. Doseringseenheid volgens conclusie 16, die bovendien 20 een farmaceutisch aanvaardbare drager bevat.

18. Doseringseenheid volgens een van de conclusies 9-17, waarin het farmaceutisch aanvaardbare zuuradditiezout een mono- of poly-zout is, gevormd door interactie van één molecuul van het aminoglycoside-antibioticum met een of meerdere moleculen van een farmaceutisch aan- 25 vaardbaar zuur, gekozen uit de groep bestaande uit azijnzuur, waterstof-chloride, zwavelzuur, malelnezuur, fosforzuur, salpterzuur, waterstof-bromide, ascorbine, appelzuur en citroenzuur.

19. Werkwijze voor het verminderen van de nefrotoxiciteit van een aminoglycoside-antibioticum, waarbij gezamenlijk worden toege- 30 diend: a) een therapeutisch werkzame hoeveelheid van een aminoglycoside-antibioticum met een nefrotoxisch vermogen en b) een nefrotoxiciteit-verminderende hoeveelheid van 35 i) polyasparagine, ii) polyaspartinezuur of een farmaceutisch aanvaard- 8401322 » w A A baar zout daarvan, iii) een copolymeer van polyasparagine en polyasparti-nezuur, of een farmaceutisch aanvaardbaar zout daarvan, of 5 iv) een copolymeer van polyasparagine of polyaspar- tinezuur, of een farmaceutisch aanvaardbaar zout daarvan, met een farmaceutisch aanvaardbaar como-nomeer, welk copolymeer een substantiële hoeveelheid asparagine of aspartinezuur bevat, 10 waarin het polymeer of copolymeer een molecuulgewicht heeft van ongeveer 1000 tot ongeveer 100.000.

20. Werkwijze volgens conclusie 19, waarin het aminoglyco side en het polymeer of copolymeer in een farmaceutisch aanvaardbare drager worden toegediend. 15

21, Werkwijze volgens conclusie 19, waarin het polymeer of copolymeer een molecuulgewicht heeft van ongeveer 5500 tot ongeveer 16.000.

22. Werkwijze volgens conclusie 19, waarin het polymeer of copolymeer een molecuulgewicht heeft van ongeveer 8000 tot ongeveer 20 15.000.

23. Werkwijze volgens conclusie 22, waarin het aminoglycoside en het polymeer of copolymeer in een farmaceutisch aanvaardbare drager worden toegediend.

24. Werkwijze volgens conclusie 22, waarin het polymeer 25 poly-l-asparagine of poly-l-aspartinezuur, of een farmaceutisch aanvaardbaar zout daarvan, is, en in een hoeveelheid van tenminste 0,005 mol per mol aminoglycoside-antibioticum aanwezig is.

25. Werkwijze volgens conclusie 24, waarin het aminoglycoside en het polymeer in een farmaceutisch aanvaardbare drager worden 30 toegediend.

26. Werkwijze volgens conclusie 24, waarin het aminoglycoside gentamicine of amikacine is.

27. Werkwijze volgens conclusie 26, waarin het aminoglycoside en het polymeer in een farmaceutisch aanvaardbare drager worden toe- 35 gediend.

28. Werkwijze volgens een van de conclusies 19 - 27, waarin 1401322 Η J * het farmaceutisch aanvaardbare zuuradditiezout een mono- of polyzout is, gevormd door interactie van één molecuul van het aminoglycoside-antibioticum met een of meerdere moleculen van een farmaceutisch aanvaardbaar zuur, gekozen uit de groep bestaande uit azijnzuur, waterstofchlo-5 ride, zwavelzuur, malelnezuur, fosforzuur, salpeterzuur, waterstofbromi-de, ascorbinezuur, appelzuur en citroenzuur. 8401322