NL8401255A

NL8401255A - PROCESS FOR THE ORGANIC PREPARATION OF L-AMINO ACIDS.

Info

Publication number: NL8401255A
Application number: NL8401255A
Authority: NL
Original assignee: Grace W R & Co
Priority date: 1983-08-05
Filing date: 1984-04-18
Publication date: 1985-03-01
Also published as: IT1176405B; DE3427494A1; SE8403934D0; FR2550224A1; GB8419144D0; IT8421922A0; IT8421922A1; JPS6043391A; GB2147580A; SE8403934L; AU3040684A

Description

/t <i \ -ι-/ t <i \ -ι-

LL

Werkwijze voor de biolbgische bereiding van L-aminozuren.Method for the biolbgic preparation of L-amino acids.

ƒ ï f /ƒ ï f /

Hat is? bekend dat een L-aminozuur kan worden bereid uit de overeenkomstige alpha-ketozuurvoorloper door het alpfaa-ketozuur te voegen bij een actieve, logaritmisch groeiende cultuur van een geschikt micro-organisrae in een voedingsmedium.Hat is? known that an L-amino acid can be prepared from the corresponding alpha-keto acid precursor by adding the alppha-keto acid to an active, logarithmically growing culture of a suitable microorganism in a nutrient medium.

5 Er zijn talkrijke micro-organismen in staat voor de biotransfor-matie van alpha-ketozuren in L-aminoren.5 Talc-rich micro-organisms are capable of biotransformation of alpha-keto acids in L-aminors.

Gevonden werd nu, dat de optimale snelheid van de alpha-ketozunrvoeding direct kan worden gecorreleerd met veranderingen in de pH van de cultuur, die worden veroorzaakt 10 door veranderingen in de groeisnelheid van de cultuur. Toevoeging van alpha-ketozuur qp deze wijze kan leiden tot een hogere crar zetting van voorloper in L-aminozuur. Bovendien controleert deze werkwijze het cultuurmedium ook cp zodanige wijze, dat de microorganismen worden verschaft met een omgeving, die optimaal 15 is voor het verloop van de logaritmische groeifase.It has now been found that the optimal rate of the alpha-ketozun diet can be directly correlated with changes in culture pH caused by changes in culture growth rate. Addition of alpha-keto acid qp in this manner can lead to a higher crar deposition of precursor in L-amino acid. Moreover, this method also controls the culture medium in such a way that the microorganisms are provided with an environment that is optimal for the course of the logarithmic growth phase.

Het is békend dat alpha-ketozuren enzymatisch in hun overeenkomstige L-aminozuren kunnen worden omgezet. Zo beschrijft bijvoorbeeld het Amerikaanse ocfcrooischrift 2.749.279 een werkwijze, waarbij alpha-ketoglutaarzuur en ammoniak worden 20 behandeld met een biologische enzyme-coenzyme katalysator. Geschikte biologische katalysatoren kunnen worden verkregen uit dierlijk weefsel, uit snelgroeiende planten of uit bacteria in de vorm van autolysaten of extracten van de celcultuur.. . Qp overeenkomstige wijze beschrijft het Amerikaanse octrooischrift 4.304.858 de 25 omzetting van in water oplosbare alpha-ketocarbonzuren in de overeenkomstige aminozuren bij aanwezigheid van een substraat— specifieke dehydrogenase, anrnarrtumionen en nicotinamide-adeniner-dinucleotide (NAD+/NADH). Omzetting van alpha-ketozuren in aminozuren met toepassing van rustende celsuspensies is beschreven 30 in Yamada c.s., The Production of Amino Acids, biz. 440-46 (1972).It is known that alpha keto acids can be enzymatically converted into their corresponding L amino acids. For example, US Pat. No. 2,749,279 describes a process in which alpha-ketoglutaric acid and ammonia are treated with a biological enzyme-coenzyme catalyst. Suitable biological catalysts can be obtained from animal tissue, from fast-growing plants or from bacteria in the form of autolysates or cell culture extracts. Similarly, US Patent 4,304,858 describes the conversion of water-soluble alpha-ketocarboxylic acids to the corresponding amino acids in the presence of a substrate-specific dehydrogenase, tumor tumions, and nicotinamide adeniner dinucleotide (NAD + / NADH). Conversion of alpha keto acids to amino acids using quiescent cell suspensions is described in Yamada et al., The Production of Amino Acids, biz. 440-46 (1972).

Er zijn talrijke micro-organismen in staat tot de biotransformatie van alpha-ketozuren in L-aminozuren. Men kan 8401255 i % -2- gébruik maken van de gekoppelde enzymsystemen in micro-organismen cm de transamineringsreactie te bevorderen, waarbij het alpha-ketozuur wordt omgezet in het L-aminozuur. Door de actief groeiende cultuur op deze wijze te gebruiken blijkt de reactie nagenoeg 5 volledig te verlopen en er is een continue terugvoer mogelijk van de aminodonor (L-glutamaat). en het coënzym (NADPH of NADH). HafcL-aminozuur kan uit de cultuurvloeistof worden gewonnen.Numerous microorganisms are capable of biotransforming alpha keto acids into L amino acids. One can use the coupled enzyme systems in microorganisms to promote the transamination reaction, whereby the alpha-keto acid is converted into the L-amino acid. By using the actively growing culture in this manner, the reaction appears to proceed almost completely and a continuous recycling of the amino donor (L-glutamate) is possible. and the coenzyme (NADPH or NADH). HafcL amino acid can be recovered from the culture fluid.

De bekende werkwijze is verbeterd door verband te leggen tussen de snelheid van de toevoer van alpha-ketozuur 10 en de snelheid van de cultuurgroei. Er zijn inicro-organismen geïdentificeerd, die verschillende zuren produceren als zij in de actieve groeifase zijn. De optredende daling van de pH van de cultuurvloeistof dient als een natuurlijke rem op de celgroei en zal de groei en het metabolisme negatief beïnvloeden, indien 15 deze niet wordt gecontroleerd. Volgens de hier beschreven verbetering wordt een basische oplossing van het alpha-ketozuur toegevoegd in hoeveelheden, die voldoende zijn om deze van nature optredende daling van pH. te corrigeren. Derhalve wordt de alpfaa-ketozuurvoorloper aan de cultuur toégevoerd met een 20 snelheid, die ongeveer evenredig is met de groeisnelheid. Deze snelheid is tegelijkertijd ongeveer evenredig met de mate, waarin het gekoppelde enzymsysteera van het groeiende micro-organisme beschikbaar is voor de biotransformatie. Ook is gebleken dat het controleren van de bovenste pH grens van de cultuurvloeistof 25 een optimale cmgeving zal handhaven voor actief metabolisme.The known method has been improved by relating the rate of the supply of alpha-keto acid 10 to the rate of culture growth. Micro-organisms have been identified which produce different acids when they are in the active growth phase. The occurring drop in the pH of the culture fluid serves as a natural inhibitor of cell growth and will negatively affect growth and metabolism if not controlled. According to the improvement described herein, a basic solution of the alpha-keto acid is added in amounts sufficient to overcome this naturally occurring drop in pH. to correct. Therefore, the alppha-keto acid precursor is fed to the culture at a rate approximately proportional to the growth rate. At the same time, this rate is approximately proportional to the extent to which the coupled enzyme system of the growing microorganism is available for biotransformation. It has also been found that controlling the upper pH limit of the culture fluid will maintain an optimal environment for active metabolism.

Deze verbeterde werkwijze beoogt de groeiende cultuur mogelijk te maken het tijdstip en de snelheid van de alpha-keto-zuurtoevoeging zelf te regelen.This improved method aims to allow the growing culture to control the timing and rate of the alpha-keto acid addition itself.

Een verwante doelstelling is het verschaffen van 30 een werkwijze, waarmee optimale omgevingsomstandigheden voor de groei en het metabolisme van het micro-organisme worden gehandhaafd.A related object is to provide a method that maintains optimal environmental conditions for the growth and metabolism of the microorganism.

Een bijkanende doelstelling van de uitvinding is het verwijderen van een bewerkingstrap bij de biotransformatie, door het mogelijk te maken de alpha-ketozuur oplossing aan de 35 cultuur toe te. voeren zonder dat het nodig is deze eerst te neutra- 8401255 » i \ -3- liseren.An additional object of the invention is to remove a processing step in the biotransformation by making it possible to add the alpha-keto acid solution to the culture. without the need to neutralize them first.

Ben verwante doelstelling is het verhinderen van het mogelijk verlies aan actieve bestanddelen door het achterwege laten van deze neutralisatietrap.A related objective is to prevent the possible loss of active ingredients by omitting this neutralization step.

5 Bovendien wordt beoogd dat de werkwijze van de uitvinding bruikbaar zal zijn net een ruim traject van mirco-orga-nisme en voor de bereiding van een ruim traject van L-aminozuren.In addition, it is contemplated that the method of the invention will be useful with a wide range of mirco-organism and for the preparation of a wide range of L-amino acids.

Ode beoogt de uitvinding een werkwijze te verschaffen, waarbij een enkele stam van micro-organisirien voldoende hoeveelheden 10 van alle gewenste enzymen kan produceren cm een bepaald alpha-keto-zuur in L-aminozuur cm te zetten.It is an object of the invention to provide a method in which a single strain of microorganisms can produce sufficient amounts of all desired enzymes to convert a given alpha-keto acid into L-amino acid.

Een andere, doelstelling is het verschaffen van een hoge waarde van de omzetting van alpha-ketozuur in L-aminozuur in een korte reactietijd.Another objective is to provide a high value of the conversion of alpha-keto acid to L-amino acid in a short reaction time.

15 Nog een andere doelstelling is het verschaffen van een werkwijze, waarbij een hoge opbrengst aan L-aminozuren wordt verkregen bij aanwezigheid van een lage concentratie van de amino-donor.Yet another object is to provide a method in which a high yield of L-amino acids is obtained in the presence of a low concentration of the amino donor.

Beschrijving van de uitvinding 20 Bacteriegroei kan in het algemeen worden onderverdeeld in drie opeenvolgende fasen. De fase met vertraagde groei is een periode, waarin weinig of geen toeneming van het aantal micro-organismen in de cultuur optreedt. In de logaritmische of exponentiële groeifase, neemt het aantal cellen exponentieel met 25 de tijd toe. In de stationaire fase is er wéinig of geen celgroei of verdeling.Description of the Invention Bacterial growth can generally be divided into three successive stages. The delayed growth phase is a period in which little or no increase in the number of microorganisms in the culture occurs. In the logarithmic or exponential growth phase, the number of cells increases exponentially with time. In the stationary phase, there is little or no cell growth or division.

Het is gebleken dat de microbiologische transaminering van een alpha-ketozuur in L-aminozuur met verhoogd rendement kan worden uitgevoerd door het alpha-ketozuur te voegen bij een 3Q logaritmisch, groeiende cultuur van geschikte micro-organismen.It has been found that the microbiological transamination of an alpha-keto acid into L-amino acid with increased efficiency can be performed by adding the alpha-keto acid to a 3Q logarithmic growing culture of suitable microorganisms.

De werkwijze maakt met voordeel gebruik van een koppelenzymsysteem, dat in de groeiende micro-organismen aanwezig is cm de transaminerings-reactie volledig te maken.The method advantageously uses a coupling enzyme system, which is present in the growing microorganisms to complete the transamination reaction.

De hier beschreven uitvinding verbetert deze bio-35 logische transamineringswerkwijze door het regelen van de 8401255 ί » -4- ψ snelheid van de alpha-ketozuurvoeding, zodat deze rechtstreeks overeenkomt met de snelheid van de zuurproductie, die qp zijn beurt nagenoeg overeenkomt met de groeisnelheid van de cultuur. Het alpha-ketözuur wordt aan de cultuur toegevoegd als een waterige basische 5 oplossing. Deze base wordt toegevoegd in hoeveelheden, die in evenwicht zijn met de zuren, die tijdens de groeifase door de micro-organismen worden geproduceerd. Het resultaat is dat de pH van de cultuurvloeistof in een nagenoeg constante toestand wordt gehouden. Deze methode van "behoefte voeding" maakt met voordeel 10 gebruik van de toenemende metabolische mogelijkheden van de cultuur als deze in de logaritmische groeifase karnt. Daarnaast verschaft de constante pH een omgeving, die geoptimaliseerd is voor versterkte bacteriëngroei en mogelijk metabolisme.The invention described herein improves this biological transamination process by controlling the rate of the alpha-keto acid feed 8401255 so that it directly corresponds to the rate of acid production, which in turn substantially matches the rate of growth. of culture. The alpha ketoic acid is added to the culture as an aqueous basic solution. This base is added in amounts that are in equilibrium with the acids produced by the microorganisms during the growth phase. The result is that the pH of the culture fluid is kept in a substantially constant state. This method of "nutritional requirement" takes advantage of the increasing metabolic potential of the culture as it churns in the logarithmic growth phase. In addition, the constant pH provides an environment optimized for enhanced bacterial growth and potential metabolism.

Als het fermenteren vollèdig is, kan het geproduceerde L-amino-15 zuur uit de cultuurvloeistof worden gewonnen.When the fermentation is complete, the L-amino-15 acid produced can be recovered from the culture liquid.

De biotransformatie van het alpha-ketozuur in L-amino-zuur is een enzymatische transamineringsreactie. De biotransformatie wordt bevorderd door een gekoppeld enzyme-co-enzymesysteem, omvattende een·transaminase, een glutamaat-dehydrogenase, het 20 coenzyme NMOP+/NADPH (of NAEH-/NADH) en een dehydrogenase.The biotransformation of the alpha-keto acid into L-amino acid is an enzymatic transamination reaction. The biotransformation is promoted by a coupled enzyme coenzyme system, comprising a transaminase, a glutamate dehydrogenase, the coenzyme NMOP + / NADPH (or NAEH- / NADH) and a dehydrogenase.

Alternatief kan het laatste bestanddeel van het enzymsysteem een hydrogenase zijn voor het terugvoeren van NADP+ (of NAD+) in N&DPH (of NftDHi.Alternatively, the final component of the enzyme system can be a hydrogenase to recycle NADP + (or NAD +) into N & DPH (or NftDHi.

Het gekoppelde reactiesysteem kan als volgt worden 25 weergegeven: (NADPH) L-aminozuur of f hydro- \ (NADHl a-ketoglutaraat ^ genase/ 30 /*ΛThe coupled reaction system can be represented as follows: (NADPH) L-amino acid or hydro- (NADHl-a-ketoglutarate) genase / 30 / * Λ

of---/glY \ — -f—Vor --- / glY \ - -f — V

/ maat ] \inasej/ measure] \ inasej

Uydro- / V genase / \ /Uydro- / V genase / \ /

' ' w \ genase/ Tw \ genase / T

35 (®DP+) ' , L-glutaraat “-tetozuur (31 of (Ml» (21 (1)- 8401255 '* » \ -5-35 (®DP +) ', L-glutarate “-tetoacid (31 or (Ml» (21 (1) - 8401255) * »\ -5-

De gewenste transamineringsreactie (trap (1)), alpiha-ketozuur in L-aminozuur, is normaliter arikeerbaar en zal dan in het algemeen ook slechts tot het evenwicht verlopen, waardoor het rendement van de omzetting in aminozuur wordt beperkt. Door 5 de transamineringsreactie te koppelen met andere enzymatische reacties, kan de transamineringsreactie theoretisch volledig worden gemaakt, hoewel chemische afbraakreacties kunnen optreden, die de werkelijke opbrengst verlagen.The desired transamination reaction (step (1)), alpiha-keto acid in L-amino acid, is normally arachiable and will generally only proceed to equilibrium thereby limiting the yield of conversion to amino acid. By coupling the transamination reaction with other enzymatic reactions, the transamination reaction can theoretically be completed, although chemical degradation reactions can occur, which lower the actual yield.

De gekoppelde enzymatische reactie, die hierboven 10 is aangegeven als trap (21 voert één van de transaminerings- producten, alpha-ketoglutaraat, terug naar L-glutamaat. Deze trap, een reducerende aminering, wordt bevorderd door glutamaat-dehydro-genase en vereist de aanwezigheid van arrmoniumionen. Het L-gluta-maat, dat voor de transaminering van het alpha-ketozuur in L-amino-15 zuur beschikbaar is, wordt door deze terugvoertrap continu vervangen.The coupled enzymatic reaction, indicated above as step (21, returns one of the transamination products, alpha-ketoglutarate, back to L-glutamate. This step, a reducing amination, is promoted by glutamate dehydrogenase. presence of arrmonium ions The L-gluta measure, which is available for the transamination of the alpha-keto acid into L-amino-15 acid, is continuously replaced by this recycle step.

Trap (21 gebruikt één van de coenzymen NADPK of NADH, dat wordt omgezet in NADP+ of t&D+. Een derde enzymatische reactie, trap (3), zet dit NAD+ (NADfl product weer om in NADBH (N&DH) via hetzij een dehydrogenasereactie of een hydrogenase-20 reactie. Derhalve wordt het NADPH (NADHl dat voor trap (2} is vereist ook continu aangevuld·... Het dat voor trap 2 is vereist wordt verschaft in het voedingsmedium.Step (21 uses one of the coenzymes NADPK or NADH, which is converted into NADP + or t & D +. A third enzymatic reaction, Step (3), converts this NAD + (NADfl product back into NADBH (N&DH) via either a dehydrogenase reaction or a hydrogenase -20 reaction Therefore, the NADPH (NADH1 required for step (2}) is also continuously replenished · ... The required for step 2 is provided in the nutrient medium.

Het enzymatische reactiesysteem als zodanig is bekend.The enzymatic reaction system as such is known.

Eerdere toepassingen van dit systeem hebben echter de toevoeging 25 vereist van drie verschillende micro-organismen voor het verschaffen van de reactieccsiponenten van de hierboven weergegeven drie trappen, Amerikaans octrooischrift 3.183.170, of. de toevoeging van micro-organismen, amino-donoren en cofactoren (Yamada c.s, The Microbial Production of Amino Acids, biz. 440-46 (1972)1. Bovendien 30 maken deze békende methoden gebruik van rustende celsuspensies .Previous applications of this system, however, have required the addition of three different microorganisms to provide the reactants of the above three steps, U.S. Patent 3,183,170, or. the addition of microorganisms, amino donors and cofactors (Yamada et al., The Microbial Production of Amino Acids, biz. 440-46 (1972) 1. In addition, these known methods use quiescent cell suspensions.

De eerder beschreven transamineringswerkwijze langs biologische weg maakt gebruik van een enkele micro-organismen stam voor het verschaffen van het gehele gekoppelde enzymatische reactiesysteem. Een logaritmisch groeiende cultuur van geschikte 35 micro-organismen, waarbij in het cultuurmedium aitmoniumionen aan- 8401255 ί * -6- wezig zijn, bevordert alle drie trappen van de biotransforxnatie van alpha-ketozuren in hun respectievelijke L-aminozuren. Trap (3) in het gekoppeld enzymsysteem van de bekende werkwijze naakt gebruik van een dehydrogenasereactie voor het omzetten van 5 NADP+ (NAD+) in NADPH (NADH).The previously described biologically transamination method uses a single microorganism strain to provide the entire coupled enzymatic reaction system. A logarithmically growing culture of suitable microorganisms, where ammonium ions are present in the culture medium, promotes all three stages of the biotransformation of alpha-keto acids into their respective L-amino acids. Step (3) in the coupled enzyme system of the known method naked using a dehydrogenase reaction to convert NADP + (NAD +) to NADPH (NADH).

De reagentiaThe reagents

Het gekoppelde enzymatische reaetiesysteem, dat hierboven is beschreven, is aanwezig in- actief groeiende micro-organismen. Dit natuurlijk voorkomende systeem kan nu worden 10 gebruikt voor de doeltreffende omzetting van alpha-ketozuren in L-aminozuren. Door het verschaffen van geschikte micro-organismen met het juiste substraat, wordt de omzetting uitgevoerd met hoge opbrengsten door de micro-organismen zelf.The coupled enzymatic reaction system described above is present in actively growing micro-organisms. This naturally occurring system can now be used for the efficient conversion of alpha-keto acids to L-amino acids. By providing suitable microorganisms with the correct substrate, the conversion is performed in high yields by the microorganisms themselves.

De typen micro-organismen, die voor deze bio-amzetting 15 geschikt zijn, lopen sterk uiteen. Zo is in de stand van de techniek beschreven dat bactèriënstanmen, die bekend zijn voor het produceren van glutaminezuur, kunnen worden gebruikt. Hiertoe behoren Brevibacterium soorten, Corynebacterium soorten en E. Cöli HB10.1.The types of microorganisms that are suitable for this bio-ammonia vary widely. For example, it has been described in the prior art that bacterial stems known for producing glutamic acid can be used. These include Brevibacterium species, Corynebacterium species and E. Cöli HB10.1.

Het is gebleken (zie de voorbeelden! dat de verbeterde werkwijze 20 van de uitvinding kan worden toegepast met Brevibacterium thiogenita-lis (ATCC No. 31723)., Brevibacterium lactofermentum (ATCC No. 21420! en Brevibacterium flavum (ATCC No. 138261. Het gegeven ATCC nimmer is het nummer, dat iedere cultuur heeft ontvangen in de American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 25 30852, waar elk van de bovengenoemde culturen is gedeponeerd.It has been found (see Examples!) That the improved method of the invention can be used with Brevibacterium thiogenitalis (ATCC No. 31723). Brevibacterium lactofermentum (ATCC No. 21420!) And Brevibacterium flavum (ATCC No. 138261. The ATCC is never given is the number each culture has received in the American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 25 30852, where each of the above cultures is deposited.

Het is te verwachten dat andere micro-organismen, die in staat zijn de basische bioconversie uit te voeren en die belangrijke hoeveelheden zuur afscheiden tijdens een logaritmische groeifase eveneens geschikt zullen zijn om bij de verbeterde werkwijze te 30 worden gebruikt.It is expected that other microorganisms capable of basic bioconversion and which secrete significant amounts of acid during a logarithmic growth phase will also be suitable for use in the improved process.

Het is duidelijk dat er een grote reeks micro-organismen bruikbaar is voor deze bio-conversie-werkwij ze. De eerste eis is dat het micro-organisme in staat moet zijn om een alpha-ketozuur -te absorberen en om te zetten in het overeenkomstige L-aminozuur 35 Om de bioconversie zo doelmatig mogelijk te kunnen uitvoeren moet het micro-organisme in staat zijn voldoende hoeveelheden te 8401255 -7- *' * \ i produceren van <3e enzymen, die bij de trappen (1) t/m (3) van het gekoppeld enzymsysteem zijn betrokken can de transaminerings-reactie voorbij het evenwichtspunt naar voltooiing te kunnen doen voortbewegen. Tenslotte moet het micro-organisme bij voorkeur 5 in staat zijn het L-aminozuur in het cultuurmedium af te scheiden, zodat het doelmatig en economisch kan warden gewonnen.It is clear that a wide range of microorganisms can be used for this bioconversion process. The first requirement is that the micro-organism must be able to absorb an alpha-keto acid and convert it into the corresponding L-amino acid. 35 In order to carry out the bioconversion as efficiently as possible, the micro-organism must be able to to produce amounts of <340 enzymes involved in steps (1) through (3) of the coupled enzyme system to propel the transamination reaction beyond the equilibrium point to completion . Finally, the microorganism should preferably be able to separate the L-amino acid in the culture medium so that it can be recovered efficiently and economically.

De tweede eis is dat het micro-organisme tijdens het logaritmische of exponentiële groeifase belangrijke hoeveelheden zuur produceert en afscheidt. Voorbeelden van zuren, die 10 het meest kenmerkend worden afgescheiden, zijn melkzuur, glutaminezuur en bamsteenzuur, hoewel de afscheiding van andere zuren eveneens geschikt is voor de doelstelling van deze werkwijze. De afgescheiden hoeveelheden moeten voldoende zijn cm de pH van de cultuurvloeistof te verlagen tot een traject 15 van ongeveer 4 tot 6 indien deze niet wordt geregeld langs uitwendige weg door toevoeging van een base.The second requirement is that the microorganism produces and secretes significant amounts of acid during the logarithmic or exponential growth phase. Examples of acids which are most typically separated are lactic acid, glutamic acid and succinic acid, although the separation of other acids is also suitable for the purpose of this method. The separated amounts should be sufficient to lower the pH of the culture fluid to a range of about 4 to 6 if it is not externally controlled by addition of a base.

Het bij deze werkwijze te gebruiken alpha-ketozuur hangt af van het L-aminozuur, dat men wenst te bereiden. Zo wordt bijvoorbeeld fenylpyrodruivenzuur omgezet in L-fenylalanine, 20 alpha-ketoisocapronzuur in L-leucine, alpha-ketoiscvaleriaanzuur in L-valine, pyrodruivenzuur in L-alanine, oxaloazijnzuur in L-aspartinezuur, β-hydroxy-alpha-ketoboterzuur in L-treonine, p-oxyfenyl pyrodxui/enzuur in L-tyrosine, indoolpyrodruivenzuur in L-tryptofaan, alpha-keto-g-methylvaleriaanzuur in L-isoleusine, 25 enz. Zoals blijkt worden bij deze werkwijze de gebruikelijke Ir-aminozuurvoorlopers gebruikt.The alpha-keto acid to be used in this method depends on the L-amino acid that it is desired to prepare. For example, phenylpyruvic acid is converted into L-phenylalanine, 20 alpha-ketoisocaproic acid into L-leucine, alpha-ketoiscvaleric acid into L-valine, pyruvic acid into L-alanine, oxaloacetic acid into L-aspartic acid, β-hydroxy-alpha-ketobutyric acid into L-threonine , p-oxyphenyl pyrodoxy acid in L-tyrosine, indole pyruvic acid in L-tryptophan, alpha-keto-g-methylvaleric acid in L-isoleusine, etc. As shown, the usual Ir amino acid precursors are used in this process.

Het bij deze werkwijze gebruikte alpha-ketozuur bevindt zich bij voorkeur in een waterige basische oplossing. Het alpha-ketozuur kan bijvoorbeeld geschikt worden opgelost in 0,1 MThe alpha-keto acid used in this method is preferably in an aqueous basic solution. For example, the alpha-keto acid can be conveniently dissolved in 0.1 M

30 tot 0,6 M waterig kaliunhydroxydeOok natriunfoydEoxyde, anmoniumr kunnen hydroj^de of ureum iworden gebruikt, evenals iedere andere base, die verenigbaar is met de groeiende cultuur en de transaminerings- reactie. Het is gebleken dat KÖH de voorkeur verdient bij gebruik van fenylpyrodruivenzuur (PPA). als voorloper, omdat PPA is 35 beter oplosbaar, in KDH. Het is te verwachten dat met het oog op 8401255 -8- de oplosbaarheid bepaalde basen voor bepaalde alpha-ketozuren de voorkeur kunnen verdienen. De concentratie kan variëren cm de gewenste pH in de fermenteerinrichting te handhaven, waarbij de toevoersnelheid overeenkomstig wordt ingesteld.30 to 0.6 M aqueous potassium hydroxide. Sodium phosphide, ammonium, hydride or urea can also be used, as can any other base which is compatible with the growing culture and transamination reaction. KÖH has been found to be preferable when using phenylpyruvic acid (PPA). as a precursor, because PPA is more soluble in KDH. In view of the solubility, it is expected that certain bases for certain alpha-keto acids may be preferred. The concentration can vary to maintain the desired pH in the fermenter with the feed rate being adjusted accordingly.

5 Kenmerkend ligt echter de concentratie van de base tussen ongeveer 0,1% (w/v). en ongeveer 20% (w/vl.Typically, however, the concentration of the base is between about 0.1% (w / v). and about 20% (w / vl.

Als het alpha-ketozuur wordt gebruikt in de vorm van een natrium- of kaliumhydrolisaat, is het gewoonlijk niet nodig het alpha-ketozuur in een base op te lossen. Zo geeft 10 bijvoorbeeld een natriumhydrolisaat (natriumfenylpyrodruivezuur) van benzylideenhydantoine (5-EH), dat is bereildv door het 5-BH te koken met waterjNaOH en daarna te koelen in een ijsbad (zie voorbeeld 3), een oplossing met een pH van ongeveer 13,5.When the alpha-keto acid is used in the form of a sodium or potassium hydrolyzate, it is usually not necessary to dissolve the alpha-keto acid in a base. For example, 10 gives a sodium hydrolyzate (sodium phenylpyruvic acid) of benzylidene hydantoin (5-EH) prepared by boiling the 5-BH with water-NaOH and then cooling in an ice bath (see Example 3) a solution with a pH of about 13 , 5.

Op overeenkomstige wijze heeft -Na-alpha-keto-isocapronzuur, 15 gehydroliseerd uit isobutylideenhydantoine, een pH van ongeveer 13,5 en Na-alpha-ketovaleriaanzuur, gehydroliseerd uit iso-propylideenhydantoine, heeft een pH. van ongeveer 13,8. Deze zijn geschikt voor het controleren van de pH bij de werkwijze i volgens de uitvinding.Similarly, -Na-alpha-keto-isocaproic acid, hydrolyzed from isobutylidene hydantoin, has a pH of about 13.5 and Na-alpha-ketovaleric acid, hydrolyzed from iso-propylidene hydantoin, has a pH. of about 13.8. These are suitable for controlling the pH in the method i according to the invention.

20 Het verdient de voorkeur het alpha-ketozuur aan de cultuur toe te voegen in een waterige oplossing, die een geschikte base omvat, daar deze vorm het ponpen van de voorloper in de cultuurvloeistof vergemakkelijkt. Desgewenst kan iet alpha-ketozuur echter worden gebruikt in een brij, die 25 een geschikte base omvat.It is preferable to add the alpha-keto acid to the culture in an aqueous solution comprising an appropriate base, since this form facilitates the punching of the precursor into the culture liquid. However, if desired, alpha-keto acid can be used in a slurry comprising a suitable base.

De concentratie van het alpha-ketozuur in de waterige oplossing, indien dit de vorm is, waarin het aan de cultuur wordt toegevoegd, kan belangrijk variëren. Indien deze uitvinding bijvoorbeeld wordt gebruikt bij het continu fermen-30 teren, zal de oplossing verdunder zijn dan voor discontinu fermenteren. De bovengrens van de concentratie zal in de eerste plaats afhangen van de oplosbaarheid van het alpha-ketozuur in het gewenste oplosmiddel. Het is te verwachten dat gehalten van 1,0 tot ongeveer 200 g/1 geschikt zullen zijn, waarbij de 35 concentratie afhangt van het bepaalde alpha-ketozuur, alsmede 8 A 0 1 2 5 5 * ï \ -9- van de hierboven besproken factoren. Het meest geschikte en economische oplosmiddel is water, maar andere oplosmiddelen, verenigbaar met het systeem, cultuurmedium bijvoorbeeld, kunnen desgewenst worden gebruikt. Het voedingsmedium moet zo worden 5 gekozen, dat optimale groeicrastandigheden worden verschaft voor het gebruikte micro-organisme. De keuze van de media, variatie en regeling ligt binnen het bereik van een deskundige en behoeft hier verder niet te worden besproken.The concentration of the alpha-keto acid in the aqueous solution, if this is the form in which it is added to the culture, can vary significantly. For example, if this invention is used in continuous fermentation, the solution will be more dilute than for batch fermentation. The upper limit of the concentration will primarily depend on the solubility of the alpha-keto acid in the desired solvent. Levels of from 1.0 to about 200 g / l are expected to be suitable, the concentration depending on the particular alpha-keto acid, as well as 8 A 0 1 2 5 5 * -9- discussed above. factors. The most suitable and economical solvent is water, but other solvents, compatible with the system, e.g. culture medium, can be used if desired. The nutrient medium should be selected to provide optimal growth conditions for the microorganism used. The choice of media, variation and control is within the reach of an expert and need not be discussed further here.

Naast de basis-groeihestanddelen moet echter het 10 medium een bron voor NH^+ bevatten. De aimoniumionen worden door de micro-organismsn gebruikt zowel voor het vergroten van de celmassa en voor trap (21 van het gekoppelde enzymatische i reactiesysteem. De gehalten aan annoniumionen in het cultuurmedium moeten derhalve worden aangepast aan de gewenste produc-15 tie van aminozuur en celmassa. Deze aanpassing van het NH^+ gehalte is voor een deskundige algemeen bekend. Als voorbeeld kunnen ionen geschikt worden geleverd door aan het voedingsmedium ammoniumsulfaat toe te voegen in een concentratie van ongeveer 10 tot ongeveer 50 g/1. Alternatief kunnen ureum, ammoniumchlo-20 ride, amnnaniuranitraat, anmoniumacetaat, enz. als NH + donor worden gebruikt.In addition to the basic growth components, however, the medium must contain a source of NH 2+. The aimonium ions are used by the microorganisms both for increasing the cell mass and for step (21) of the coupled enzymatic reaction system. The levels of annonium ions in the culture medium must therefore be adapted to the desired production of amino acid and cell mass. This adjustment of the NH2 + content is well known to a person skilled in the art For example, ions can conveniently be supplied by adding ammonium sulfate to the nutrient medium in a concentration of about 10 to about 50 g / l. Alternatively, urea, ammonium chloride Ride, amnaniuran nitrate, ammonium acetate, etc. are used as NH + donor.

De reactiewerkwi j zeThe reaction process

De bio-canversiewerkwijze van de uitvinding vereist een cultuur van actief groeiende raicro-organismen. Deze cultuur 25 kan worden bereid door het inoculeren van een hoeveelheid steriel voedingsmiddel of groeimedium met een entcultuur van de gewenste stam. Men laat de voor het inoculeren van het voedingsmedium gebruikte entcultuur bij voorkeur 6 tot 40 uur groeien voor het gebruik als inoculum. De tijdsduur voor 3d het groeien van de entcultuur voor het inoculeren varieert afhankelijk van de gebruikte' bacteriënstam. Het is gewenst dat de entcultuur een gezonde, groeiende celmassa cravat, die voldoende is om een goede basis te vormen voor het ontwikkelen en de groei van de fermentatiecultuur.The biocanversion method of the invention requires a culture of actively growing micro-organisms. This culture can be prepared by inoculating an amount of sterile food or growth medium with a seed culture of the desired strain. The seed culture used to inoculate the nutrient medium is preferably grown 6 to 40 hours before use as an inoculum. The time to grow the seed culture for inoculation 3d varies depending on the bacterial strain used. It is desirable that the seed culture cravat a healthy, growing cell mass sufficient to provide a good basis for the development and growth of the fermentation culture.

35 De afmeting van de fermenteerinrichting hangt af 8401255 i ψ -10- van de ferrnentatiecultuur. De afineting van de fermenteerinriditing hangt af van de specifieke toepassing van deze werkwijze.The size of the fermenter depends on the fermentation culture 8401255 i ψ -10-. The size of the fermentation initiation depends on the specific application of this method.

Het ligt binnen het bereik van deskundigen de hoeveelheden medium en entcultuur aan te passen aan de vereiste van een 5 specifieke reactor of een gewenste opbrengst.It is within the scope of those skilled in the art to adapt the amounts of medium and seed culture to the requirement of a specific reactor or a desired yield.

Men laat de cultuur in de fermenteer inrichting - groeien tot deze voldoende aan de reactoramgeving is aangepast en is gegroeid tot een celmassa, die voldoende is om weerstand te kunnen bieden aan de toevoeging van het alpha-ketozuur.The culture in the fermenter is allowed to grow until it is sufficiently adapted to the reactor design and has grown to a cell mass sufficient to resist the addition of the alpha-keto acid.

10 Dit is van bijzonder belang als onzuivere voorloper wordt gebruikt. Optische dichtheid kan een geschikte maat voor de celgroei zijn. Een optische dichtheid ("O.D.") (640 hm) van ongeveer 10 geeft aan dat de cultuur gereed is voor de toevoeging van het alpha-ketozuur. Dit komt overeen met een 15 groeiperiode van ongeveer 6-40 uur, afhankelijk van het organisme en de groeionstandigheden. Dit kan echter enigszins variabel zijn en moet niet als strikte eis worden beschouwd, maar veeleer worden overgelaten aan de ervaring en het inzicht van de werker.10 This is of particular importance when impure precursor is used. Optical density can be a suitable measure of cell growth. An optical density ("O.D.") (640 hm) of about 10 indicates that the culture is ready for the addition of the alpha-keto acid. This corresponds to a growth period of about 6-40 hours, depending on the organism and growing conditions. However, this can be somewhat variable and should not be considered a strict requirement, but rather be left to the experience and understanding of the worker.

De cultuur groeit bij een temperatuur, die verenigbaar 20 is met maximale groei van de gébruikte bacteriënstam. Het algemene traject varieert van kamertemperatuur tot ongeveer 37°C. Voor Corynebacteria en Brevibacterium soorten bedraagt de temperatuur bij voorkeur ongeveer 30°C. De pH van de cultuur moet bij voorkeur ongeveer 7-8 bedragen voor de pH daling op-25 treedt, die gepaard gaat met het begin van de logaritmische groei. Beluchten kan plaatsvinden indien dit voor de gekozen bacteriënstam noodzakelijk is.The culture grows at a temperature compatible with maximum growth of the bacteria strain used. The general range ranges from room temperature to about 37 ° C. For Corynebacteria and Brevibacterium species, the temperature is preferably about 30 ° C. The pH of the culture should preferably be about 7-8 before the pH drop occurs, which is accompanied by the onset of logarithmic growth. Aeration can take place if this is necessary for the chosen strain of bacteria.

Tijdens de vertraagde en logaritmische groei produceren vele micro-organismen, bijvoorbeeld Brevibacterium en Corynebac-30 terium soorten, verschillende zuren en scheiden deze af. Tot deze zuren kunnen behoren glutaminezuur, melkzuur, bamsteenzuur en andere. De toevoeging van deze zuren aan het cultuurmedium verlaagt de pH. tot ongeveer 4-6 indien niet gecontroleerd door toevoeging van base. Dit verlaagde pH traject heeft belangrijke 35 nadelige invloed op de bacteriëngroei en de metabolische snel- 8401255 -11- - * \ hederx.During the slowed and logarithmic growth, many microorganisms, for example Brevibacterium and Corynebac-terium species, produce and secrete different acids. These acids can include glutamic acid, lactic acid, succinic acid and others. The addition of these acids to the culture medium lowers the pH. to about 4-6 if not controlled by addition of base. This reduced pH range has a significant adverse effect on bacterial growth and the metabolic rate.

Omgekeerd is gebleken dat indien de groei de stationaire fase begint te bereiken, de zuurproductie door de micro-organismen vertraagt en vrijwel ophoudt. Daar delen 5 van de celpopulatie af sterven, kanen basische componenten, zoals aminen, vrij in de fermentatievloeistof. Indien niet gecontroleerd kan dit vrijkanen van base· ' de pH verhogen tot boven ongeveer 8. Hoge pH waarden zijn nadelig voor de cultuur en ramen zowel het metabolisme en doden tenminste delen van IQ de overblijvende levende celpopulatie.Conversely, it has been found that when growth begins to reach the stationary phase, acid production by the microorganisms slows and virtually ceases. Since parts of the cell population die off, basic components, such as amines, are free in the fermentation broth. If left unchecked, this release of base can raise the pH above about 8. High pH values are detrimental to the culture and estimate both metabolism and kill at least parts of IQ the remaining living cell population.

Het is de actief groeiende en metaboliserende cel-cultuur die het gekoppelde enz^msysteem verschaft, dat de transamineringsreactie van de werkwijze cbetverlopen. Gevonden werd nu, dat het toevoegen van een basische oplossing van de 15 alpha-ketozuurvoorlcper aan de cultuur in antwoord op de pH-behoefte, de voorloper aan de micro-organisme verschaft met een snelheid, die nagenoeg evenwijdig loopt met hun vermogen cm deze om te zetten in het. iraminozuurproduct. Als de cultuur in de logaritmische groeifase komt en de pH begint te dalen, 20 wordt een basische oplossing van het alpha-ketozuur ingeleid met een snelheid, die de pH houdt op of boven een voorafbepaalde waarde, bij voorkeur in het traject van ongeveer 6,5 tot ongeveer 7,5.It is the actively growing and metabolizing cell culture that provides the coupled etc system that progresses the transamination reaction of the method. It has now been found that adding a basic solution of the alpha-keto acid precursor to the culture in response to the pH requirement provides the precursor to the microorganism at a rate substantially parallel to their ability to to put in it. iramino acid product. When the culture enters the logarithmic growth phase and the pH begins to drop, a basic solution of the alpha-keto acid is introduced at a rate that keeps the pH at or above a predetermined value, preferably in the range of about 6, 5 to about 7.5.

Daarnaast kan het gewenst zijn een bovengrens voor 25 de pH in te stellen in het traject van ongeveer 7,5 tot 8. Dit bevordert het handhaven van de gezondheid en de metabolische activiteit van de micro-organismen, zelfs nadat de actieve groei vertraagt. Deze bovengrens van de pH kan worden gehandhaafd door aan de cultuur een zuur toe te voeren, dat met 30 de fermentatie verenigbaar is. Geschikte zuren zijn onder andere geconcentreerd ijsazijn, zwavelzuur, citroenzuur, fosforzuur, enz. Ieder zuur kan worden gebruikt, dat verenigbaar is met de groei of het metabolisme van de micro-organismen en met de transamineringsreactie.In addition, it may be desirable to set an upper limit of pH in the range of about 7.5 to 8. This promotes maintenance of the health and metabolic activity of the microorganisms even after active growth slows. This upper limit of pH can be maintained by adding an acid compatible with the fermentation to the culture. Suitable acids include concentrated glacial acetic acid, sulfuric acid, citric acid, phosphoric acid, etc. Any acid that is compatible with the growth or metabolism of the microorganisms and with the transamination reaction can be used.

35 Alle geschikte middelen kunnen worden gebruikt voor het 8401255 ~ e * -12- continu registreren van de pE van de cultuurvloeistof en het toevoegen van base of zuur, indien dit nodig is cm de pH binnen bepaalde voorafgestelde grenzen te handhaven. Ter wille van de eenvoud en de nauwkeurigheid verdient het de 5 voorkeur een geautomatiseerde pE-aftaster of ccmtroleerinrichting te gebruiken,, die in staat is tot het signaleren van één of meer parpen voor het uitdrijven van base of zuur in de fermenteer-inrichting met een voorafbepaalde snelheid. Op deze wijze kan een onmiddellijk antwoord worden gegeven op veranderingen 10 of schommelingen in de pE van de cultuurvloeistof. Dit komt overeen met een nagenoeg onmiddellijk antwoord op veranderingen in snelgroei en metabolische snelheden.Any suitable means can be used to continuously record the pE of the culture liquid and add base or acid if necessary to maintain the pH within certain predetermined limits. For the sake of simplicity and accuracy, it is preferred to use an automated pE scanner or controller capable of signaling one or more bases to drive out base or acid in the fermenter with a predetermined speed. In this way, an immediate answer can be given to changes or fluctuations in the pE of the culture fluid. This is consistent with an almost immediate response to changes in rapid growth and metabolic rates.

De snelheid van de voeding van base of zuur zal natuurlijk afhangen van de pH en de concentratie van de toe te 15 voegen oplossing, alsmede van de pE-behoefte van de cultuurvloeistof. Daarnaast wordt beoogd dat de base of het zuur hetzij continu of in de vorm van een bri.j wordt toegevoegd tot het gewenste gehalte van de pE is bereikt. Het is gebleken dat toevoer snelheden van ongeveer 1 tot 3 rol per minuut geschikt 20 zijn voor een fermenteerinrichting van 700 ml, met voedings-perioden, die uiteenlopen van 1,0 sec. tot ongeveer 10 min., al naar behoefte.The rate of base or acid feed will, of course, depend on the pH and concentration of the solution to be added, as well as the pE requirement of the culture fluid. In addition, it is contemplated that the base or acid is added either continuously or in a brine form until the desired pE content is reached. Feed rates of about 1 to 3 rolls per minute have been found to be suitable for a 700 ml fermenter, with feeding periods ranging from 1.0 sec. to about 10 minutes, as required.

Tijdens de aanvankelijke (vertraagde! groeifase, dat wil zeggen na het enten met de entcultuur, kunnen de 25 benedengrenzen van de pE worden gecontroleerd door toevoeging van iedere base, die met de groeiende cultuur verenigbaar is. Tijdens deze beginperiode heeft de cultuur niet de logaritmische groeifase bereikt, tijdens welke de alpha-ketozuurvoorloper actief wordt omgezet, in L-aminozuur. Eoewel de basische 3Q alpha-ketozuur oplossing kan worden gebruikt voor de regeling van de pH tijdens de beginnende groeifase, kan dit nadelig zijn voor de gezondheid van de cultuur, in het bijzonder als onzuivere voorloper wordt gebruikt. In ieder geval treedt een volledig gébruik van de voorloper niet op tot de logaritmische 35' groei is bereikt. Om deze reden verdient het de voorkeur §401255 -13- , \ tijdens de beginnende groeifase een geschikte base te gebruiken, dat wil zeggen één die verenigbaar is met de groeiende cultuur, die de voorloper niet bevat. Geschikte basoi zijn bijvoorbeeld aimoniumhydroxide, ureum, natriumhydroxide, kaliumhydroxide en 5 amnoniakgas.During the initial (delayed!) Growth phase, ie after inoculation with the seed culture, the lower limits of the pE can be controlled by adding any base, which is compatible with the growing culture. During this initial period, the culture does not have the logarithmic growth phase, during which the alpha-keto acid precursor is actively converted, into L-amino acid.Although the basic 3Q alpha-keto acid solution can be used to control the pH during the initial growth phase, this can be detrimental to the health of the culture , especially if impure precursor is used In any case, full utilization of the precursor does not occur until the logarithmic 35 'growth is achieved. For this reason, it is preferable §401255 -13- during the initial growth phase to use a suitable base, that is, one that is compatible with the growing culture, which does not contain the precursor Suitable bases are, for example, aimon ium hydroxide, urea, sodium hydroxide, potassium hydroxide and ammonia gas.

Te beginnen na ongeveer 6 tot 10 uur, als de O.D.Starting after approximately 6 to 10 hours, if the O.D.

(640 nm) een waarde van ongeveer 10 heeft bereikt en de pH is gedaald tot ongeveer 6,8 tot 7,0, worden verdere dalingen van de pH gecontroleerd door toevoeging van het alpha-ketozuur in een IQ basische' oplossing, zoals hiervoor beschreven. De toevoer- snelheid tijdens deze logaritmische groei (of zuur-producerendel fase wordt in wezen bepaald door de pïï-behoefte, maar het is ook gewenst on de alpha-ketoconcentratie in de vloeistof beneden ongeveer 15 g/1 te houden. Hogere concentraties kunnen schadelijk 15 zijn voor de groeiende cultuur, in het bijzonder als onzuivere voorloper wordt gebruikt.(640 nm) has reached about 10 and the pH has fallen to about 6.8 to 7.0, further drops of the pH are controlled by adding the alpha-keto acid in an IQ basic solution as described above . The rate of feed during this logarithmic growth (or acid-producer lendel phase is essentially determined by the need for pi, but it is also desirable to keep the alpha-keto concentration in the liquid below about 15 g / l. Higher concentrations can be harmful 15 are used for the growing culture, especially when impure precursor.

Zo veel mogelijk voorlqperqplossing wordt in de cultuurvloeistof geleid als respons op de pH behoefte. Ms de bacteriële vorming van zuur , - afneemt tot een punt, 20 dat niet langer voldoende is cm de pH van de media te brengen beneden ongeveer 6,8 tot ongeveer 7,5 en bij voorkeur 7,2, kan de grens van de pH worden verhoogd cm extra voorloper toe te voeren cp basis van de pH behoefte. Zo kan bijvoorbeeld de onderste pH grens worden verhoogd tot ongeveer 7,8.As much solution as possible is introduced into the culture liquid in response to the pH requirement. As the bacterial acid formation decreases to a point no longer sufficient to bring the pH of the media below about 6.8 to about 7.5 and preferably 7.2, the pH limit be increased by an additional precursor to be fed based on the pH requirement. For example, the lower pH limit can be raised to about 7.8.

25 Na het afsluiten van het voeden qp basis van de pH25 After finishing feeding qp based on the pH

behoef te,wordt de rest van het totale volume alpha-ketozuur, dat men in L-aminozuur wenst cm te zetten, aan de vloeistof toegevoerd. Het is gebleken, dat indien de rest van het alpha-ketozuur wordt toegevoerd in een periode tot 24 uur of 30 langer, bij voorkeur 2 tot 8 uur, het in belangrijke hoeveelheden in L-aminozuur zal worden cmgezet. Indien het bijvoorbeeld gewenst is 300-400 cc van een 80 g/1 oplossing voorloper toe 3 te voeren aan een voluraecultuurvloeistof van 700 cm , kan ongeveer 1/3 tot de helft van de voorloper worden toegevoegd 35 als respons qp de pH behoefte tijdens de logaritmische groeifase.need, the remainder of the total volume of alpha-ketoacid desired to be put into L-aminoacid is fed to the liquid. It has been found that if the remainder of the alpha-keto acid is supplied over a period of up to 24 hours or longer, preferably 2 to 8 hours, it will be converted to L-amino acid in significant amounts. For example, if it is desired to add 300-400 cc of an 80 g / l precursor solution 3 to a 700 cm volea culture fluid, about 1/3 to half of the precursor may be added in response to the pH requirement during the logarithmic growth phase.

8401255 .· r -14-8401255.r -14-

De rest wordt toegevoegd in de volgende 2 tot 8' uur of langer.The rest is added in the next 2 to 8 hours or more.

De bovengrens van de pH wordt ingesteld op een voorafbepaald punt in het traject van ongeveer 7,5 tot 8,0, 5 bij voorkeur ongeveer 7,8. Zoals beschreven wordt deze grens geregeld voor optimale gezondheid en metabolische activiteit van de cultuur. Evenals bij het regelen van de onderste pH, verdient het de voorkeur een automatische pH aftaster te hébben, die de toevoeging van zuur aan de cultuurvloeistof regelt.The upper limit of the pH is adjusted to a predetermined point in the range of about 7.5 to 8.0, preferably about 7.8. As described, this limit is regulated for optimal health and metabolic activity of the culture. As with the control of the lower pH, it is preferred to have an automatic pH sensor that controls the addition of acid to the culture fluid.

10 Het zuur wordt toegeveegd met een snelheid die voldoende is om de pH van de vloeistof te handhaven beneden de aangegeven bovengrens. De concentratie aan zuur kan bijvoorbeeld variëren van ongeveer 1% (w/vl tot ongeveer 30% (w/vl. Geconcentreerde oplossingen verdienen echter de voorkeur, in het bijzonder 15 bij discontinue werkwijze!), daar zij minder bijdragen tot totale volume van de fermentatiemedia.The acid is swept at a rate sufficient to maintain the liquid's pH below the indicated upper limit. For example, the acid concentration can range from about 1% (w / vl to about 30% (w / vl. Concentrated solutions are preferred, however, especially in discontinuous process!), Since they contribute less to the total volume of the fermentation media.

Bij een discontinue werkwijze kan het gevormde L-aminozuur uit de cultuurvloeistof worden gewonnen nadat de cultuur de stationaire groeifase heeft bereikt, zoals 20 blijkt O.D. waarden in het traject van ongeveer 20 tot 70.In a discontinuous process, the L-amino acid formed can be recovered from the culture fluid after the culture has reached the stationary growth phase, as shown by O.D. values in the range of about 20 to 70.

Als een continue werkwijze wordt gebruikt bij de onderhavige uitvinding, kan continu product worden gewonnen. Het L-amino-zuur kan uit de cultuurvloeistof worden gssonnen op de gebruikelijke wijze.If a continuous process is used in the present invention, continuous product can be recovered. The L-amino acid can be discharged from the culture liquid in the usual manner.

25 De volgende voorbeelden dienen uitsluitend ter toelichting en zijn niet als beperking bedoeld. In de voorbeelden worden de volgende afkortingen gebruikt.The following examples are illustrative only and are not intended to be limiting. The following abbreviations are used in the examples.

°C - graden Celcius cc - kubieke centimeters 30 g - gram(menl 1 - liter LEM - liter (sl per minuut μ - micron(s! M - molair 35 min - minuten ml - milliliter (sl 8401255 -15- ' ’ \ * \ mm —' millimeters. (s ï irMolen - millimolen N - normaal *nm - nananeter(s)t 5 % - procent REM - omwentelingen per minuut vol - volume wt - gewicht° C - degrees Celcius cc - cubic centimeters 30 g - gram (menl 1 - liter LEM - liter (sl per minute μ - micron (s! M - molar 35 min - minutes ml - milliliter (sl 8401255 -15- '' \ * \ mm - 'millimeters. (s ï irMill - millimoles N - normal * nm - nananeter (s) t 5% - percent REM - revolutions per minute full - volume wt - weight

Voorbeeld 1 10 Ent- en groeimedia werden per liter gedeioniseerd water bereid cp de volgende wijze:Example 1 10 Grafting and growth media were prepared per liter of deionized water in the following manner:

Ent Bestanddeel Groei 30 g Glucose1 100,0 g 2,5 g Maisweekvloeistof 2,5 g 2 15 2,5 g NZ amine B 2,5 g 1.0 g ^ÜEÜ^ 1,0 g 0,25 g MgSO^T^O 0,2 g 10,0 g (NH412S04 40,00 g 1.0 ml Biotine voorraadoplossing3 1,0 ii 4Graft Ingredient Growth 30 g Glucose1 100.0 g 2.5 g Corn steep liquor 2.5 g 2 15 2.5 g NZ amine B 2.5 g 1.0 g ^ ÜEÜ ^ 1.0 g 0.25 g MgSO ^ T ^ O 0.2 g 10.0 g (NH412S04 40.00 g 1.0 ml Biotin stock solution3 1.0 ii 4

20 1,0 ml Tiamtine-HCL-voorraadpplossing 1,0 iriL1.0 ml of Tiamtine HCL stock solution 1.0 µl

20 g CaCO^ — 1 - aan 70% (w/vi glucose voorraadqplossing.20 g of CaCO3 - 1 - at 70% (w / vi glucose stock solution.

2 - Sheffield Caipany 3 - 100 mg d-biotine per liter gedeioniseerd water.2 - Sheffield Caipany 3 - 100 mg d-biotin per liter of deionized water.

25 4 - 1,0 g hamine-ïKIEi per liter gedeioniseerd water.4-1.0 g of hamine-KIEI per liter of deionized water.

5 - Toegevoegd aan entmedia voor buffer-doeleinden.5 - Added to seeding media for buffer purposes.

Alle bestanddelen werden gecombineerd en 10 min. bij 110°C in een autoclaaf behandeld voor steriliteitsdoeleinden.All ingredients were combined and autoclaved for 10 min at 110 ° C for sterility purposes.

Na de behandeling in de autoclaaf werd de pH van de media met 30 NaOH op 7,4 ingesteld.After autoclaving, the media was adjusted to pH 7.4 with 30 NaOH.

3 33 3

Vijftig cm -aliquote monsters van entmedium in 250 cm schudkolven werden geïnoculeerd met Brevibacterium thiogenitalis ATCC No. 31723. De cultures liet men bij 30°C groeien, onder schudden met 300 REM gedurende een periode van 17 uur voor het 35 gebruik als incolum voor de fermenteerinrichting.Fifty cm aliquots of seed medium in 250 cm shaking flasks were inoculated with Brevibacterium thiogenitalis ATCC No. 31723. The cultures were grown at 30 ° C with shaking with 300 REM for a period of 17 hours before use as the incubator incolum.

% 8401255 -16-% 8401 255 -16-

Er werd een door instrumenten gecontroleerde Multigen-fementeerinrichting van twee liter (werkvolume een liter) van de New Brunswick Company gebruikt. Voor het gebruik werd ongeveer 0,2 ml polyethyleen glycol 2000 aan de fermenteer-5 inrichting toegevoegd om schuinen te verhinderen. De inrichting werd daarna 10 min. aan behandeling in een autoclaaf onderworpen. Een beginvolume van 700 ml groeimedium werd in de fermenteer inrichting gebracht. Ongeveer 50 ml entoplossing (O.D. (640 nm) = 22) werd toegevoegd. De fermenteerinrichting 10 werkte bij 30°c, 600 REM, 1,0 - 1,25 liter per min. (LEM) lucht in de fermenteerinrichting voor beluchting.An instrument controlled two liter Multigen fementer (working volume one liter) from the New Brunswick Company was used. Before use, about 0.2 ml of polyethylene glycol 2000 was added to the fermenter to prevent skewing. The device was then autoclaved for 10 min. An initial volume of 700 ml of growth medium was placed in the fermenter. About 50 ml of seed solution (O.D. (640 nm) = 22) was added. The fermenter 10 operated at 30 ° C, 600 REM, 1.0-1.25 liters per minute (LEM) of air in the fermenter for aeration.

De fermenteerinrichting werd met de hand op de pH gecontroleerd met geconcentreerde NH4OH (29%) oplossing gedurende de eerste 8 uur groeiperiode. De eerste 4 uur trad weinig of 15 geen verandering in de pH. op. De tweede 4 uur werd de pH-meter constant waargenomen. Zonodig werd NH^OH toegevoegd, waarbij het totaal toegevoegde volume tijdens "deze periode ongeveer 2,0 cc bedroeg.The fermenter was checked for pH by hand with concentrated NH 4 OH (29%) solution during the first 8 hours of growth. Little or no change in pH occurred during the first 4 hours. on. The pH meter was constantly observed for the second 4 hours. NH 2 OH was added as necessary, the total volume added during this period being about 2.0 cc.

Na de eerste 8 uur werd de pH automatisch gecontroleerd 20 met een pH-regelaar model 5997 (Horizon Ecology Company) en een pH electrode (200 mm) (INgold). Het systeem, werd zo geprogrammeerd, dat de pH van de cultuurvloeistof bleef boven 6,8 en onder 7,8.After the first 8 hours, the pH was automatically checked with a pH controller model 5997 (Horizon Ecology Company) and a pH electrode (200 mm) (INgold). The system was programmed to maintain the pH of the culture fluid above 6.8 and below 7.8.

Als de pH van het medium, daalde tot 6,8, werd de pH regelaar voorgeprogrammeerd voor het signaleren van een peristaltische ' ' -----Ί j 25 pomp (Cole Parmer Company) cm basé toe te voegen met een snelheid van ongeveer 1-3 rol per min. om de pH boven '6,8 te houden.When the pH of the medium dropped to 6.8, the pH controller was preprogrammed to signal a peristaltic pump (Cole Parmer Company) to add cm base at a rate of approximately 1-3 rolls per min to keep the pH above 6.8.

De base omvatte fenylpyruvaat in waterige kaliurohydrox-yde. Gezuiverd fenylpyruvaat (PPA) werd verkregen van de Aldrich Chemical Company in de vorm Na.PPA.H2O (98%, molecuul-30 gewicht 204.16). Dit werd opgelost in 0,6 M waterig KOH om een oplossing te verkrijgen met een concentratie van 98 gram per liter of 0,144 M in een totaal volume van 300 cc.The base included phenylpyruvate in aqueous potassium hydroxide. Purified phenylpyruvate (PPA) was obtained from the Aldrich Chemical Company in the form Na.PPA.H2O (98%, molecular weight 204.16). This was dissolved in 0.6 M aqueous KOH to obtain a solution at a concentration of 98 grams per liter or 0.144 M in a total volume of 300 cc.

De waterige PPA oplossing werd door het systeem als pH controle eerst gébruikt na ongeveer 8 uur in het fermenteren ei 35 eindigde bij ongeveer 24 uur. In totaal 175 crn^ van deze oplossing werd automatisch tijdens de logaritmische groei in de 8401255 e - \ -17- fermenteerinrichting geleid. De totaal toegevoerde hoeveelheid Na.PPA.H^O tijdens deze periode bedroeg 17,15 gram (84nMolen).The aqueous PPA solution was first used by the system as a pH control after about 8 hours in the fermentation egg and ended at about 24 hours. A total of 175 cr of this solution was automatically fed into the 8401255 th -17 fermenter during logarithmic growth. The total amount of Na.PPA.H2 O supplied during this period was 17.15 grams (84nMoles).

Op dit moment, na 24 uur fermenteren, was de zuur-productie door de micro-organismen niet langer voldoende 5 cm de pH van het medium op of beneden 6,8 te brengen. Derhalve 3 werd de resterende 125 cm van het waterige PPA, dat 12,25 gram (60 irMolen) bevatte, in de fermenteerinrichting gepoept in de loop van twee uur (62,5 cm?/uur) . Men liet het fermenteren nog 24 uur voortschrijden, hetgeen een totale fermenteert!jd 3 10 opleverde van 48 uur. Tijdens de laatste 17 uur werd 25 cm 5N KDH als controlerende base gebruikt.At this time, after 24 hours of fermentation, the acid production by the microorganisms was no longer sufficient to raise the pH of the medium to or below 6.8 by 5 cm. Therefore, the remaining 125 cm 2 of the aqueous PPA containing 12.25 grams (60 µMoles) was pooped in the fermenter over two hours (62.5 cm 2 / hr). Fermentation was allowed to proceed for an additional 24 hours, giving a total fermentation time of 48 hours. During the last 17 hours, 25 cm 5N KDH was used as the controlling base.

De pE regelaar werd ook voorgeprogramneerd cm te voorkomen dat de pH boven 7,8 kwam door het signaleren van een tweede peristaltische pomp (Cole Panter Corporation) voor 3 15 het toevoegen van geconcentreerd ijsazijn. In totaal werd 15 cm toegevoegd.The pE controller was also pre-programmed to prevent the pH from rising above 7.8 by signaling a second peristaltic pump (Cole Panter Corporation) before adding concentrated glacial acetic acid. A total of 15 cm was added.

Glucose (70% w/v) voorraadoplossing werd zonodig toegevoegd cm te voorkomen dat de concentratie aan glucose in de fermenteervloeistof .-..>töt‘ nul daalde. Dit geschiedde 20 cm te verzekeren dat glucose, veeleer dan de voorloper yan^^-i-v, het product, als koolstofbron werd gébruikt.Glucose (70% w / v) stock solution was added as necessary to prevent the concentration of glucose in the fermentation broth to drop to zero. This was done for 20 cm to ensure that glucose, rather than the precursor yan-i-v, the product, was used as a carbon source.

Het uiteindelijk gewonnen volume bedroeg 1029 cc.The final volume recovered was 1029 cc.

Het uiteindelijke berekende volume was: oorspronkelijk medium 700 cc 25 inoculum 50 cc waterig Na.PPA 300 cc azijnzuur 15 cc NH.OH 2 cc 4 glucose -100 cc 30 5N KDH 25 ccThe final calculated volume was: original medium 700 cc 25 inoculum 50 cc aqueous Na.PPA 300 cc acetic acid 15 cc NH.OH 2 cc 4 glucose -100 cc 30 5N KDH 25 cc

Semi totaal = :H92 cc verwijderd 7 x 10 cc monsters = 70 ccSemi total =: H92 cc removed 7 x 10 cc samples = 70 cc

Totaal = _;1122 ccTotal = _; 1122 cc

Het verdanpingsverlies over de fermentatieperiode 35 van 48 uur bedroeg ongeveer 8,3 %.The evaporation loss over the 48 hour fermentation period was about 8.3%.

8401255 -18-8401255 -18-

Monsters van de fermentatievloeistof wedden geanalyseerd op L-fenylalanine met een hoge druk-vloeistof chramatograaf (HEDC) systeem. Door miliporiën gefiltreerde (0,22 μ poriën-afrreting) cultuurmonsters werden afgeleid met behulp van een 5 Dansylchloride techniek voor injectie op het HELC. De resultaten waren als volgt: 24 uur - 13.20 g/1 L-fenylalanine 28 " - 17.06 g/1 31 " - 19.20 ;.g/l " 10 48 " - 18.69 g/l "Samples of the fermentation broth were analyzed for L-phenylalanine with a high-pressure liquid chromatograph (HEDC) system. Milipore filtered (0.22 μ pore size) culture samples were derived using a 5 Dansyl chloride technique for injection at the HELC. The results were as follows: 24 hours - 13.20 g / l L-phenylalanine 28 "- 17.06 g / 1 31" - 19.20; .g / l "10 48" - 18.69 g / l "

De lagere opbrengst bij 48 uur was een gevolg van ontleding van het product.The lower yield at 48 hours was due to decomposition of the product.

üit een totaal van 144 mMolen Na.PPA.^O (29,4 gram) werd in totaal 115,93 itMolen L-fenylalanine (19,15 gram), tijdens 15 het fermenteren geproduceerd. De molaire opbrengst bedroeg:From a total of 144 mMoles Na.PPA. ^ O (29.4 grams), a total of 115.93 moles Na-phenylalanine (19.15 grams) was produced during the fermentation. The molar yield was:

nM L-fenylalanine x 100 nM Na.PPA.H^OnM L-phenylalanine x 100 nM Na.PPA.H ^ O

=5 115.94 x 100 = 80.51 114.00 „„ Voorbeeld 2 20 ——------= 5 115.94 x 100 = 80.51 114.00 „„ Example 2 20 ——------

De media, micro-organisme-stam en basis-bewerkingen van voorbeeld 1 werden toegepast bij de volgende verschillen in hoeveelheden en controle van de pH. De waterige Na-EPA oplossing werd gebruikt als base-controle, te beginnen ongeveer 7 uur na 25 het inoculeren van de fermenteerinrichting» De voorgeprograirmeer-de pH-controle-instelpunten bedroegen 7,2 en 7,8.The media, microorganism strain and basic operations of Example 1 were used in the following amounts and pH control. The aqueous Na-EPA solution was used as a base control, starting about 7 hours after inoculating the fermenter. The preprogrammed pH control set points were 7.2 and 7.8.

De waterige Na.PPA.H„0 oplossing bevatte 168 nMolen ^ 3 (34,3 gram) in een totaal volume van 350 cm . Het volume van de waterige Na.PPA, die als basiscontrole werd gebruikt in 3Q de periode te beginnen bij ongeveer 7 uur en eindigende na ongeveer 24 uur, bedroeg 175 cm . Azijnzuur werd toegevoegd voor het regelen van de bovengrens van de pH, als in voorbeeld 3 1, waarbij in totaal 41 cm aan de fermenteerinrichting werd toegevoerd. Na het einde van 24 uur werd het onderste instel-25 punt van de pH-regelaar voor de rest van het fermenteren verhoogd tot 7,5. De rest van de Na.PPA oplossing (175 cc), werd vanaf 8401255 ~ - \ -19- dit mcmant in een periode van twee uur in de reactor gepompt.The aqueous Na.PPA.H2 O solution contained 168 nMoles ^ 3 (34.3 grams) in a total volume of 350 cm. The volume of the aqueous Na.PPA used as the basic control in 3Q the period starting at about 7 hours and ending at about 24 hours was 175 cm. Acetic acid was added to control the upper limit of pH, as in Example 3, adding a total of 41 cm to the fermenter. After the end of 24 hours, the bottom set point of the pH controller was increased to 7.5 for the remainder of the fermentation. The remainder of the Na.PPA solution (175 cc) was pumped into the reactor over a period of two hours from 8401255 ~ - -19-.

Men liet het fermenteren nog 24 uur verlopen, waarbij de totale fermentatietijd 48 uur bedroeg.Fermentation was allowed to proceed for an additional 24 hours, the total fermentation time being 48 hours.

Het uiteindelijk gewonnen volume bedroeg 1025 cc.The final volume recovered was 1025 cc.

5 _ Het uiteindelijk berekende volume was als volgt: beginmedium 700 cc inoculum 50 ccThe final calculated volume was as follows: initial medium 700 cc inoculum 50 cc

Na.PPA 350 cc azijnzuur 41 cc 20 glucose 100 cc NH^Cïï (geconcentreerd, 29% NH).. 2 ccNa.PPA 350 cc acetic acid 41 cc 20 glucose 100 cc NH4 Cl (concentrated, 29% NH) .. 2 cc

Semi-totaal = 1.243 cc Verwijderd 11 x 15 cc monsters = 155 ccSemi-total = 1,243 cc Removed 11 x 15 cc samples = 155 cc

Totaal * 1.378 ccTotal * 1,378 cc

Het verdairpingsverlies tijdens de fermentatieperiode van 48 uur was ongeveer 4,92%.The evaporation loss during the 48 hour fermentation period was about 4.92%.

Monsters van de cultuurvloeistof werden geanalyseerd al.? in Voorbeeld 1.Culture fluid samples were analyzed already. in Example 1.

De HPDC resultaten waren als volgt: 2° 24 uur - 16,7 ;g/l L-fenylalanine 26 -17,4 g/1 29 * - 19,5 -g/1 ” 32 “ - 20,1 g/1 48 “ - 21,8 g/1 2^ Uit in totaal. 168,00 ritolen Na.PPA.H^O (34,3 gram! werd in totaal 145.77 mttolen L-fenylalanine (24,08 graml tijdens het fermenteren geproduceerd. De molaire opbrengst bedroeg 86,8%.The HPDC results were as follows: 2 ° 24 hours - 16.7; g / l L-phenylalanine 26 -17.4 g / 1 29 * - 19.5-g / 1 "32" - 20.1 g / 1 48 ”- 21.8 g / 1 2 ^ Off in total. 168.00 ritols Na.PPA.H2 O (34.3 grams!) A total of 145.77 mtoles of L-phenylalanine (24.08 grams were produced during fermentation. The molar yield was 86.8%.

Voorbeeld 3 30 Het volgende entmedium werd bereid:Example 3 The following seed medium was prepared:

Bestanddeel HoeveelheidIngredient Quantity

Glucose 20 gramGlucose 20 grams

Bacto-Pepton (Difcol 10 gramBacto-Pepton (Difcol 10 grams

Gisfeextract 10 gram 35 NaCl 3 gram 8401255Gisfee extract 10 gram 35 NaCl 3 gram 8401255

y' V' Vy 'V' V

-20--20-

De bestanddelen werden gecombineerd en de pH werd met 5N NaOH op 7,2 ingesteld* Het medium werd 10 min. bij 110°C in een autoclaaf behandeld.The ingredients were combined and the pH adjusted to 7.2 with 5N NaOH. The medium was autoclaved at 110 ° C for 10 min.

Het volgende groeimedium werd bereid: 5 Bestanddeel HoeveelheidThe following growth medium was prepared: 5 Ingredient Amount

Rietsuiker Melasse ,.l.JlO% 100,00 gram als glucose) K2HB04 0,50 gram KH^PO^ 0,50 gram 10 MgSO^.T^O 0,25 gram NH^SO^ 20,00 gramCane sugar molasses, .l / .lO% 100.00 grams as glucose) K2HB04 0.50 grams KH ^ PO ^ 0.50 grams 10 MgSO ^ .T ^ O 0.25 grams NH ^ SO ^ 20.00 grams

Maisweekvloeistof 5,00 gramCorn steep liquor 5.00 grams

CaCO^ 20,00 gramCaCO ^ 20.00 grams

De bestanddelen werden gecombineerd en de pH werd 15 met 5N NaOH op 7,2 ingesteld. Het medium werd 10 min. bij 110°C in een autoclaaf behandeld.The ingredients were combined and the pH adjusted to 7.2 with 5N NaOH. The medium was autoclaved at 110 ° C for 10 min.

De entcultuur weed geïnoculeerd vanaf een 18 uur Auxo-Sy Agar (Difco) "slant" van Brevibacterium lactofermentum ATCC No. 21420 volgens de werkwijze van voorbeeld 1. Men liet 20 de entcultuur 7 uur groeien, waarna de O.D. (640 ïfcn) een waarde 25 had bereikt. De pH van het fermenteer-medium werd met NH^OH ingesteld op 6,5 tot 7,0. Een volume van 20 ml entcultuur-vloei-stof werd gebruikt voor het inoculeren van de fermenteer inrichting, eveneens volgens de werkwijze van voorbeeld 1. De 25 fermenteerinrichting werkt bij 30°C, 400 REM en 1,0 LEM. Het onderste pH-instelpunt bedroeg 6,8 en het bovenste pH-instelpunt was 7,8 gedurende de eerste 24 uur.The seed culture was inoculated from an 18 hour Auxo-Sy Agar (Difco) "slant" of Brevibacterium lactofermentum ATCC No. 21420 according to the method of Example 1. The seed culture was allowed to grow for 7 hours, after which the O.D. (640fcn) had reached a value of 25. The pH of the fermentation medium was adjusted to 6.5 to 7.0 with NH 2 OH. A volume of 20 ml of seed culture liquid was used to inoculate the fermenter, also according to the method of Example 1. The fermenter operates at 30 ° C, 400 REM and 1.0 LEM. The lower pH set point was 6.8 and the upper pH set point was 7.8 for the first 24 hours.

Een waterige kaliuith-fenylpyrodruivezuur oplossing (K-PPA) werd gebruikt als alpha-ketozuurvoorloper. De oplossing 30 was een ongezuiverd natriumhydroxide-hydrolysaat van 5-benzyl- ideenhydantoine. Bereiding van het hydrolysaat van 5-benzylideen-hydantoine (Hamsphire Chemical Company) geschiedde als volgt: 1598,85 gram gedioniseerd water en 168,3 gram KOH werden gecombineerd in een roestvrij stalen beker van 3 liter en tot 35 koken verhit. Terwijl het koken werd voortgezet werd 188,2 gram 5-benzylideenhydantoine toegevoegd en gemengd tot opgelost.An aqueous potassium phenylpyruvic acid solution (K-PPA) was used as the alpha-keto acid precursor. The solution 30 was a crude sodium hydroxide hydrolyzate of 5-benzylidene hydantoin. Preparation of the hydrolyzate of 5-benzylidene hydantoin (Hamsphire Chemical Company) was done as follows: 1598.85 grams of deionized water and 168.3 grams of KOH were combined in a 3 liter stainless steel beaker and heated to boiling. While boiling continued, 188.2 grams of 5-benzylidene hydantoin was added and mixed until dissolved.

8401255 -21- * " \8401255 -21- * "\

Daarna werd nog 2 uur gekookt. Water werd toegevoegd om zonodig het oorspronkelijke volume te handhaven. Na het koken werd het mengsel snel afgekoeld in een ijswatefbad. Een ëên molaire oplossing van het kaliumrfenylpyruvaat-hydrolysaat bevatte 5 ongeveer 'vl/2M KDH, ongeveer ^r5M kaliumcarbonaat en ongeveer ^ Q,5M ureum. Het hydrolysaat werd vervolgens gesteriliseerd met een Milli-porienfilter (poriënafmeting 0,22 μ ).Then it was boiled for another 2 hours. Water was added to maintain the original volume, if necessary. After cooking, the mixture was quickly cooled in an ice water bath. One molar solution of the potassium phenylpyruvate hydrolyzate contained about 1 / 4M / 2M KDH, about 1 / 5M potassium carbonate and about 1 / 5M urea. The hydrolyzate was then sterilized with a Milli pore filter (pore size 0.22 μ).

Dit hydrolysaat, met een pH van ongeveer 13, werd gebruikt voor base-ccntrole vanaf het. begin van de fermentatie.This hydrolyzate, with a pH of about 13, was used for base control from the. start of fermentation.

10 In totaal werd in 40 uur 225 ml toegevoegd.A total of 225 ml was added over 40 hours.

Geconcentreerd ijsazijn werd gebruikt voor het verlagen van de pH. Een volume van 5 ml werd tijdens de eerste 17 uur toegevoegd. De pH van de cultuurvloeistof in de latere stadia van het fermenteren steeg niet boven 7,8, zodat verder geen 15 zuur behoefde te worden toegevoegd.Concentrated glacial acetic acid was used to lower the pH. A volume of 5 ml was added during the first 17 hours. The pH of the culture liquid in the later stages of the fermentation did not rise above 7.8, so that no further acid had to be added.

Na 24 uur fermenteren, werden de pH-instelpunten geregeld op 7,8 en 8,0. Op dit moment werd een hoeveelheid van 50 ml glucose toegevoegd om de concentratie van de vloeistof op 10% te brengen. Na 65 uur werd 20 ml glucose toegevoegd.After fermentation for 24 hours, the pH set points were adjusted to 7.8 and 8.0. At this time, 50 ml of glucose was added to bring the concentration of the liquid to 10%. After 65 hours, 20 ml of glucose was added.

20 Monsters van de cultuurvloeistof werden geanalyseerd als in voorbeeld 1.Samples of the culture fluid were analyzed as in Example 1.

De HEDC resultaten waren als volgt: 40 uur - 6,8 -3/1 L-fenylalanine 43 - 7,8 S/1 25 45 " - 8,5 g/1 48 " - 9,4 g/1 65 " - 10,2 ..g/1The HEDC results were as follows: 40 hours - 6.8 -3/1 L-phenylalanine 43 - 7.8 S / 1 25 45 "- 8.5 g / 1 48" - 9.4 g / 1 65 "- 10.2 ..g / 1

Uit in totaal 111,23 mMolen K-fenylpyrodruivezuurop-lossing werd in totaal 75,67 xtMolen L-fenylalanine geproduceerd 30 tijdens het fententeren. De malaire opbrengst bedroeg 68,0%.From a total of 111.23 mMoles of K-phenylpyruvic acid solution, a total of 75.67 xMoles of L-phenylalanine was produced during phententation. The malar yield was 68.0%.

Voor deze proef werd het verdaitpingsverlies niet bepaald.The evaporation loss was not determined for this test.

Voorbeeld 4Example 4

De ent- en groemedia van voorbeeld 1 werden gebruikt, behalve dat in zcwel de ent- als de groeimedia 30 gram (NH^®^ 35 werd gebruikt en 20,9 gram MDPS (morfolinopropaan-sulfonzuurl als buffer in plaats van CaCO^· De kweek- en inoculatie-be- 840 1 2 5 5 / ν' -22- werkingen van voorbeeld 1 werden gevolgd met gebruik van Brevibacterium flavum ATCC Nb. 13626. De fermenteerinrichting, bij deze proef maakte de eerste 18 uur 500-600 RPM en daarna 650 RPM.The seed and growth media of Example 1 were used, except that both the seed and growth media used 30 grams (NH ^ ® ^ 35 and 20.9 grams of MDPS (morpholinopropane-sulfonic acid) as a buffer instead of CaCO3 · De culture and inoculation operations of Example 1 were followed using Brevibacterium flavum ATCC Nb. 13626. The fermenter, in this run, made 500-600 RPM for the first 18 hours and then 650 RPM.

5 De voor de controle van de pH gébruikte base was K-fenylpyruvaathydrolysaat als beschreven in voorbeeld 3. De pH werd met C02 op 10 ingesteld. Het onderste instelpunt voor de pH bedroeg 7,2 en het bovenste instelpunt bedroeg 7,8. Het hydrolysaat werd gebruikt als basèscontrole bij het begin van 10 de fermentatie. In totaal 400 ml werd in de fermenteerinrichting geleid als respons qp de pH-behoefte. Na ongeveer 25 uur fermenteren werd 50 ml glucose toegevoegd aan de resterende 60 ml hydrolysaat-base-oplossing, die verder als base-controle werd gebruikt. In totaal werd extra 25 ml glucose toegevoegd bij 15 ongeveer 48 uur.The base used to control the pH was K-phenylpyruvate hydrolyzate as described in Example 3. The pH was adjusted to 10 with CO2. The lower pH setpoint was 7.2 and the upper setpoint was 7.8. The hydrolyzate was used as a base control at the start of the fermentation. A total of 400 ml was introduced into the fermenter in response to the pH requirement. After about 25 hours of fermentation, 50 ml of glucose was added to the remaining 60 ml of hydrolyzate base solution, which was further used as a base control. In total, additional 25 ml of glucose was added at about 48 hours.

Geconcentreerd ijsazijn werd gébruikt voor het handhaven van de bovenste ρβ grens en om het mogelijk te maken extra hydrolysaat-base-oplossing aan de cultuur toe te voegen. In totaal werd 42 ml aan de fermenteerinrichting toegevoegd.Concentrated glacial acetic acid was used to maintain the upper ρβ limit and to allow the addition of additional hydrolyzate base solution to the culture. A total of 42 ml was added to the fermenter.

De HPIC resultaten waren als volgt: 17 uur - 3,33 gm/1 L-fenylalanine 19 " - 3,96 gm/1 25 22 " - 6,19 gm/1 24 " - 7,60 gm/1 42 " - 11,60 gm/1 " 45 " - 14,IQ gm/1 65 " - 11,90 gm/1 30 De lagere opbrengst bij 65 uur was een gevolg van de afbraak van het product.The HPIC results were as follows: 17 hours - 3.33 gm / 1 L-phenylalanine 19 "- 3.96 gm / 1 25 22" - 6.19 gm / 1 24 "- 7.60 gm / 1 42" - 11.60 gm / 1 "45" - 14, IQ gm / 1 65 "- 11.90 gm / 1. The lower yield at 65 hours was due to the degradation of the product.

Uit in totaal 176,33 irMolen K-fenylpyruvaatvoeding werd in totaal 111,99 mMolen L-fenylalanine geproduceerd in 45 uur. De molaire opbrengst bij 45 uur bedroeg 63,5%.From a total of 176.33 irMoles K-phenylpyruvate feed, a total of 111.99 mMoles L-phenylalanine was produced in 45 hours. The molar yield at 45 hours was 63.5%.

35 Bij deze proef werd geen rekening gehouden met ver- dampingsverliezen.Evaporation losses were not taken into account in this test.

84012558401255

Claims

Soaking method for the preparation of L-amino acids, characterized in that (a) miaro organisms, which are alpha-keto acids, are grown in a nutrient medium. in their corresponding Ir amino acids and which produce and secrete acids during the growth phases, (b) supply the desired alpha-keto acid to the growing culture of microorganisms at a rate substantially corresponding to the growth rate of the culture and 10 (c) allows the microorganisms to convert said alpha keto acid to the corresponding L amino acid.

Process according to claim 1, characterized in that the L-amino acid is recovered from the fermentation broth.

3. A method according to claim 1, characterized in that the rate of the alpha-ketoic acid addition in step (b) is determined by the pH of the culture liquid.

Method according to claim 3, characterized in that the addition of the alpha-keto acid is started about 6 to 10 hours after inoculation of the nutrient medium with said microorganisms.

Method according to claim 4, characterized in that the addition of the alpha-keto acid is started when the optical density (640 ran) of the growing culture has reached a value of about 10.

Process according to claim 5, characterized in that the pH of the culture is controlled before the start of the supply of alpha-keto acid by adding a base compatible with the fermentation, which base is free or substantially free of the alpha -ketoic acid.

A soaking method according to claim 6, characterized in that the pH of the culture is maintained in the range from about 6.8 to 7.2 before the introduction of the alpha-keto acid.

8. Process according to claim 6, characterized in that the base is selected from armonium hydroxide, potassium hydroxide, 8401255-24 sodium hydroxide, urea and ammonia gas.

Process according to claim 3, characterized in that the alpha-keto acid is added in a solution / containing a base compatible with the fermentation.

10. Process according to claim 9, characterized in that the base is selected from ammorrLum hydroxide, -curic trihydroxide and urea.

11. A method according to claim 9, characterized in that the addition of the alpha-keto acid is started when the pH of the culture liquid falls in the range between about 7/2 and about 7/5.

12. A method according to claim 11, characterized in that the alpha-keto acid is added as necessary to maintain the pH of the culture liquid at or above a predetermined value in the range of about 6.8 to 7.5.

Process according to claim 12, characterized in that the basic alpha-keto acid solution is pumped into the culture liquid at a signal from an automated pH controller.

Method according to claim 13, characterized in that the pK controller automatically signals a pump to start the addition of the basic solution when the pE of the liquid falls below a preset limit within said range.

A method according to claim 3, characterized in that the addition of an acid compatible with the fermentation is started when the pH of the culture liquid rises in the range from about 7.5 to about 7.8.

16. A method according to claim 15, characterized in that the acid is added as necessary to maintain the pH of the culture liquid at or below about 8.0.

Method according to claim 16, characterized in that the pH of the culture liquid is controlled by an automated pEi controller.

Method according to claim 17, characterized in that the pH controller automatically signals a ραπρ cm to add the acid to the culture liquid if the piï of the liquid rises above a predetermined limit in said range.

19. Process according to claim 12, characterized in that a first part of the total amount of alpha-ketoacid that one wishes to add to the growing culture for bioconversion is added to this culture on the basis of pH requirement and that a second part of the alpha-keto acid is added to the culture over a period of up to 24 hours after cessation of the feed based on the pH requirement.

Method according to claim 19, characterized in that the first part comprises one third to one half of the total amount.

21. A method according to claim 19, characterized in that the second part of the alpha-keto acid is added to the culture over a period of up to about 8 hours. • *

A method according to claim 21, characterized in that the second part is added to the culture in one or more portions or continuously.

23. Method for biologically converting alpha-keto acid precursors into L-amino acids by adding the precursors to a logarithmically growing culture of microorganisms capable of bioconversion and separating acids during the active growth phase with the characteristic that (ai registers changes in the sH of the fluid of the growing culture and (b) the alpha-keto acid precursor is added in a basic solution in amounts / which are in equilibrium with the acids separated by the micro-organisms .

A method according to claim 21, characterized in that the addition of the alpha-keto acid is started when the pH of the culture liquid drops to a predetermined value in the range of about 7.2 to about 7.5. 35

25. A method according to claim 22, characterized in that 8401255 # - -w- -26- that the alpha-keto acid is added so as to maintain the pH of the culture fluid at or above a predetermined value in the range of about 6.8 to about 7 , 5. 8401255