NL8120168A - - Google Patents

Description

? 812 0 16 8

Br/Bl/lh/2

Werkwijze ter bereiding van ethanol.

De uitvinding heeft betrekking op een werkwijze ter bereiding van ethanol door fermentatie van een lactose bevattende oplossing met een lactase bevattend micro-organisme. - 5 De bereiding van alcoholische dranken door fermen tatie van lactose, dat wil zeggen melksuiker, is sinds onheugelijke tijden bekend. Een dergelijke fermentatie laat een direkt bereiken van alcoholpercentages tot 3,0% toe, terwijl de alcoholconcentratie door destillatie kan 10 worden verhoogd.

De bereiding van alcohol op basis van wei was tot de tweede wereldoorlog economisch niet gerechtvaardigd. Verder kon de alcohol op basis van wei niet concurreren .met de alcohol op basis van aardappelen en melasse als 15 uitgangsmaterialen.

Het benutten van het lactosegehalte van de wei voor het bereiden van alcohol heeft echter in de afgelopen . jaren hernieuwde belangstelling gekregen in verband met de milieuproblemen, die optreden door het afvoeren van wei 20 in afvalwater. De bereiding van ethanol op basis van wei wordt in dit verband beschouwd als een alternatief voor de gebruikelijke biologische zuivering, omdat de verkoop van de geproduceerde ethanol de kosten, die aan de biologische zuivering zijn verbonden, geheel of gedeeltelijk kan dekken.

25 De ontwikkeling in de zuivelindustrie, waar de bereiding van zuivelprodukten, met inbegrip van kaas, in steeds grotere fabrieken wordt geconcentreerd, heeft het probleem met betrekking tot het kwijtraken van de wei doen toenemen.

Deze ontwikkeling beeft de bereiding van ethanol uit wei 3Ö tegelijkertijd gezien vanuit een economisch standpunt aantrekkelijker gemaakt.

In het artikel "Alkohoiherstellung aus Molke" in het tijdschrift "Die Branntweinwirtschaft" van december 1977 is een methode beschreven voor het bereiden van ethanol 8120168 I ' · ......

-2- uit wei. Volgens deze methode wordt een gekozen gistsoort, Saccharomyces fragiliS/chargegewijs in twee trappen gekweekt en vervolgens overgebracht in de eerste van twee in serie met elkaar verbonden fermentatie-inrichtingen en wordt aan 5 deze fermentatie-inrichting tevens weipermeaat afkomstig van een ultrafiltratie toegevoerd. Wanneer de eerste fermentatie-inrichting tot een tevoren bepaald niveau is gevuld, komt een overloop naar de tweede fermentatie-inrichting -tot stand en nadat ook deze tweede fermentatie-inrichting 10 is gevuld, begint een afvoer naar een schelder. Een gedeelte van de afgescheiden drijvende gist wordt naar de eerste 'fermentatie-inrichting teruggevoerd, terwijl het van gist bevrijde wort via een buffervat naar een destil-latie-inrichting wordt geleid, waarin de alcohol continu 15 wordt af gedestilleerd.

Bij de vergisting wordt de gistsoort Saccharomyces fragilis in concentratiesvan 2 tot 4 gram droge gist per liter gistend wort; gebruikt bij een lactosecondentratie in het weipermeaat van 5 tot 9% lactose-anhydraat. De vér-20 gisting wordt uitgevoerd bij een temperatuur van 25-30°C en pH van 3,7 tot 4,2.

Dit gistingsproces kan meestal slechts gedurende ten hoogste een week continu worden voortgezet, omdat het lactose bevattende medium gemakkelijk besmet 25. raakt met micro-organismen, die de vergisting op ongewenste wijze beïnvloeden. Dit aspect is in het bijzonder van toepassing op het gebruik van Saccharomyces fragilis, die in vergelijking met het grootste aantal van de andere Saccha-romyces-soorten bijzonder gevoelig is voor besmetting.

30 Saccharomyces fragilis wordt volgens de bekende methode voor de bekende weifermentatie gebruikt ondahks de bijzonder grote gevoeligheid daarvan voor besmetting, in verband met vermogen daarvan enerzijds om lactose te splitsen en anderzijds zowel galactose als de bij de split-35 sing van lactose gevormde glucose te vergisten.

De gebruikelijke voorzorgsmaatregelen tegen besmetting zijn een behandeling van de betreffende gist met verdund zuur. Deze desinfectering kan echter niet worden 8120168 -3- toegepast op Saccharomyces fragilis in verband met de algemene gevoeligheid daarvan. Door deze gevoeligheid is eveneens een centrifugeren ongeschikt voor het recirculeren van de drijvende gist, hetgeen in tegenstelling daarmee 5 bijvoorbeeld wel kan worden uitgevoerd in het geval van

Saccharomyces cerviciae, die gewoonlijk voor de vergisting van melasse wordt gebruikt. ·

Zo maakt de bekende methode omzettingssnelheden-van lactose tot ethanol van 1-5 g lactose per gram droge 10 gist per uur mogelijk. De opbrengst van het proces komt overeen met 75-80% van de theoretisch bereikbare opbrengst, dat wil zeggen, dat ongeveer 80% van de lactose in ethanol wordt omgezet, terwijl de resterende lactose verloren gaat tengevolge van het groeien van. de gist, nevenreakties als-15 mede de genoemde besmetting. Volgens het reaktieschema: S2 H22°ll + ^ ^ 4C2H5OH + 4C02 zijn dus ongeveer 42 liter wei met eèn lactosegehalte van 20 4,4% noodzakelijk voor de bereiding van 1 liter 100%'s ethanol bij een opbrengst van 78%.

De onderhavige uitvinding heeft nu betrekking op een werkwijze ter bereiding van ethanol door fermentatie van een lactose bevattende oplossing met een lactase 25 bevattend micro-organisme, welke werkwijze het kenmerk bezit, dat het micro-organisme in geïmmobiliseerde vorm wordt gebruikt.

Het immobiliseren van micro-organismeri is als zodanig bekend en wo'rdt bijvoorbeeld uitgevoerd door micro-30 organismen in een polymeer in te kapselen. Polyacrylamide is ëën van de méést toegepaste polymeren, maar bezit het nadeel, dat de polymerisatie moeilijk kan worden uitgevoerd, onder 'handhaving van de levensvatbaarheid van het geïmmobiliseerde micrQ-organisme, Verder is het 35 voor het immobiliseren toegepaste monomeer toxisch.

Sinds enige tijd is ; bekend, dat een aantal polymere koolhydraten bruikbaar is voor het immobiliseren van micro-organismen. Voorbeelden van koolhydraten, die in 812 0 16 8 -4- N' ditverband zijn beschreven, zijn *-carrageenan, ^-carrageenan, furcellaran, cellulosesulfaat, alginaten en pepti-naten.

Deze stoffen zijn bekend door het gebruik daarvan S op grote schaal in de voedingsmiddelenindustrie, bijvoorbeeld als verdikkingsmiddelen in jam, ijs,en als schuimstabi-liseermiddelen in bier. Het immobiliseren van micro-orga-nismen met behulp van deze stoffen kan worden uitgevoerd door eerst een waterige oplossing van het polymere kool-10 bydraat en de micro-organismen te mengen en uit het verkregen mengsel vervolgens een gel te vormen, bijvoorbeeld door afkoeling of . door in kontakt brengen met kationen, zoals kaliumionen, ammoniumionen, calciumionen, magnesium-ionen, stanno-ionen, ferri-ionen- of aluminiumionen.

15 Het immobiliseren kan bijvoorbeeld worden uitge voerd door het mengsel van koolhydraat en micro-organismen druppelsgewijs over te brengen in een waterige oplossing, die één van de ionen bevat, welke de vorming van een gel veroorzaken. Als resultaat worden vaste deeltjes in druppel-20 vorm verkregen, die micro-organismen bevatten.

Polymere koolhydraten zijn technisch reeds toegepast voor het immobiliseren van Escherichia coli met een aspartase-activiteit, vergelijk het artikel "Immobilization of Escherichia coli cells having aspartase activity with 25 carrageenan and locust bean gum". Enzyme Microb. Technol., 1979, vol. 1, april.

De technische toepassing van polymere koolhydraten is echter tot nog toe niet benut voor het immobiliseren van lactase bevattende micro-organismen.

30 Volgens de uitvinding bleek het mogelijk te zijn lactase bevattende micro-organismen op zodanige wijze te immobiliseren, dat de geimmobiliseerde cellen gebruikt kunnen worden voor het fermenteren van lactose bevattende oplossingen. Zo werd gevonden, dat de lactase bevattende 35 micro-organismen door de immobilisering een zeer ongebruikelijke bestandheid tegen besmetting bereikèn.

Volgens de uitvinding kunnen één of meer van de micro-organismen gekozen uit Torula cremoris, Torula sphaerica, Torula lactosa, Saccharomyces fragilis, 8.11 01 6 8 -5- , » .......... ' \j.

Saccharomyees lactis en Candida pseudotropicalis, worden gebruikt.

Volgens een voorkeursuitvoeringsvorm van de uitvinding kan het micro-organisirte Saccharomyces fragilis 5 voor de werkwijze worden toegepast. Verrassenderwijse werd gevonden, dat de gewoonlijk zeer gevoelige Saccharomyces fragilis onder toepassing van-koolhydraat bevattende polymeren kan . worden geïmmobiliseerd, terwijl de levens-, vatbaarheid en het vermogen tot fermentatie van lactose 10 van het organisme volledig behouden.

Een geïmmobiliseerd lactase bevattend micro-organisme kan daarom gedurende een aanzienlijk langere periode voor een technisch proces worden gebruikt dan het overeenkomstige niet-geimmobiliseerde micro-organisme.

15 Dit aspect is in het bijzonder van belang vóór de fermentatie van lactose bevattende media, omdat de daarvoor gebruikte micro-organismen zich in het bijzonder in de sterkste mate tot een glucose bevattend medium vermenigvuldigen en daardoor bij het begin van de fermentatie aanleiding 20 geven tot een inductieperiode. Zo verloopt meestal een periode van 6-8 uren vanaf het moment, dat het micro-organisme met het lactose bevattende medium in kontakt is gebracht, tot het moment, waarop de lactosefermentatie plaatsvindt. Deze faktor brengt met zich mee, dat de fer-25 mentatie-inrichting gedurende deze periode niet produktief is. Een verlenging van de gebruiksduur van het micro-organisme brengt daarom in het bijzonder bij lactosefermentatie een toename van de produktiviteit van de fermentatie-inrichting met zich mee.

30 Bij de gebruikelijke industriële fermentatie- processen op grotere schaal is het gewoonlijk evenwel moeilijk het toegepaste substraat in voldoende mate te zuiveren, waardoor de polymeerdeeltjes dikwijls op een of ander moment gedesactiveerd raken tengevolge van verstopping, ·'·'· 35 veroorzaakt door verontreinigingen.

Volgens een voorkeursuitvoeringsvorm van de uitvinding is de lactose bevattende oplossing aan ultrafiltratie onderworpen toei. Als gevolg daarvan bleek het moge- 6 i2 o 168 -6- * * lijk een desactivering van het toegepaste geïmmobiliseerde materiaal grotendeels te voorkomen en bleek dus weiper-meaat bijzonder goed geschikt te zijn voor de fermentatie met een geïmmobiliseerd micro-organisme, in het bijzonder 5 een geimmobiliseercfe gistsoort.

Volgens een van voordeel zijnde uitvoeringsvorm van de uitvinding wordt de fermentatie uitgevoerd met behulp van één enkele fermentatie-inrichting.

Voor de continue fermentatie van weipermeaat 10 was bet op reaktie-kinetische gronden noodzakelijk de fermentatie in tenminste twee fermentatie-inrichtingen uit te voeren, waarbij een lactoseconcentratie van ongeveer! 1% in stand werd gehouden in de overloop tussen de twéev.i fermentatie-inrichtingen. Dit houdt verband met het feit, 15 dat bij de lactosefermentatie de zeer speciale faktor optreedt/ dat de onder invloed van het lactase uit lactose gevormde galactose het lactase remt. Deze speciale enzym-kinefische faktor brengt met zich mee, dat het in de praktijk noodzakelijk v/as verscheidene in serie met elkaar 20 verbonden fermentatie-inrichtingen te gebruiken om een Optimale produktiviteit te bereiken.

Volgens de uitvinding wTerd echter verrassender-wijze gevonden, dat de fermentatie van een lactose-oplossing met geïmmobiliseerde lactase bevattende micro-organismen 25 in één enkele fermentatie-inrichting kan worden uitgevoerd, terwijl een hoge produktiviteit in stand wordt gehouden. Afgezien van de vermindering van het fermentatievolume met een faktor van ongeveer 5-10, die door de hoge concentratie van de micro-organismen in de toegepasté polymere matrix 30 mogelijk wordt gemaakt, wordt dus bij de lactosefermentatie een aanzienlijke vereenvoudiging van de noodzakelijke inrichtingen bereikt.

Bij de werkwijze volgens de uitvinding verdient het de voorkeur kleine hoeveelheden lucht tijdens de fer-35 raentatie toe te voegen, bij voorkeur ongeveer 0,1-0,05 liter lucht per liter van het fermentatievolume per minuut.

Het zuurstofgehalte in de van de weifermentaties afkomstige spoeling, zoals bepaald wordt door het bio- 8120 168 .....; ............. "...... ........ \' -7- chemische zuurstofverbruik, is echter kléiner dan gewoonlijk, omdat minder residu's, dode cellen in het gefermenteerde produkt aanwezig zijn. Bovendien wordt een centrifugeren van grote hoeveelheden vloeistof vermeden door de 5 toepassing van geïmmobiliseerde gisten. Dit voordeel is te danken aan de bovenvermelde toename van de produktiviteit, hetgeen met zich meebrengt, dat dezelfde produktiviteit : volgens de werkwijze van de uitvinding kan worden bereikt-door vergelijking met de toepassing van de niet-geiramobili-10 seerde gist. Dit wordt mogelijk gemaakt bij toepassing van een fermentatie volume van ongeveer 1/5 tot 1/9)0 van het volume, dat volgens de bekende techniek wordt toegepast.

De uitvoering van de uitvinding wordt toegelicht aan de hand van het volgende voorbeeld.

15 Voorbeeld

Bereiding van ethanol door fermentatie van wei-permeaat met geïmmobiliseerde Saccharomyces fragilis.

Als ferment wordt een monster van de stam Saccharomyces fragilis gebruikt, die bewaard wordt in reageer-20 buizen op een schuine agar met de volgende samenstelling: 3 g gistextract 5 g vleespepton 3 g moutextract 10 g glucose 25 20 g agar tot 1000 ml water.

Met deze kweek wordt met behulp van een platina-naald melasse in flessen geent. Na 2 dagen wordt de inhoud van de melasseflessen overgebracht in Erlenmeyer-kolven 30 van 2 liter, die één liter steriele voedingsoplossing met de volgende, samenstelling bevatten: 130 g melasse 3 g diamoniumwaterstoffosfaat tot 1000 ml water, waarbij de pH-waarde met 35 behulp van zwavelzuur op 4,0 wordt ingesteld.

De voedingsoplossing, die eveneens in de melasse-flessen wordt gebruikt, wordt voor het enten gesteriliseerd door gedurende 30 minuten bij 121°C in de autoclaaf te $120168 h -8- behandelen.

De gist wordt bij 30°C in de melasseflessen en Erlenmeyer-kolven gekweekt in een schudthermostaat. Na 48 uren wordt de toegepaste melasse door decanteren ver-5 wijderd, waarna de kolven met verse melasse (voedingsoplos-sing) worden gevuld. Na 24 uren wordt de behandeling herhaald, terwijl de geproduceerde gist de volgende dag wordt verzameld,

De gist wordt gesuspendeerd in een volume van 10 3% natriumalginaat, waarna het mengsel druppelsgewijs wordt overgebracht in een koude 0,1 molaire calciumchloride-oplossing. De geimmobiliseerde gist wordt daarin gedurende 24 uren bij 3°C bewaard.

Als lactose bevattend substraat wordt een 9 gew.% 15 oplossing van lactose in water gebruikt. De fermentatie ,· wórdt uitgevoerd in een met een thermostaat op temperatuur gehouden fermentatie-inrichting, die voorzien is van een overloop, x^elke bij een volume van meer dan 1 liter in werking treedt. Het totale volume van de fermentatie-20 inrichting bedraagt 1½ liter, waarin 0,5 liter geïmmobiliseerde gist wordt gebracht, hetgeen overeenkomt met ongeveer 40 g droog ferment.

Vervolgens wordt 0,5 liter van 9 gew.%'s lactose-oplossing toegevoegd en wordt de fermentatietemperatuur 25 op 32°C gehouden. Na een inductieperiode van 6-8 uren vangt de fermentatie aan, hetgeen blijkt uit de ontwikkeling van kooldioxide en een daling van het soortelijke gewicht van de fermentatie-oplossing. Vervolgens worden 2,5 liter van de 9 gew.%'s lactose-oplossing per uur toegevoegd met 30 behulp Van een slangenpomp.

De fermentatie wordt gedurende 2-4 weken uitgevoerd, terwijl een hoeveelheid ethanol wordt geproduceerd overeenkomende met 4,5 vol.%,zoals door gaschromatografie in de afvoer van de fermentatie-inrichting wordt bepaald.

8120168

Claims (8)

1. Werkwijze ter bereiding van ethanol door fermentatie van een lactose bevattende oplossing met een lactase bevattend micro-organisme, met het kenmerk, dat het micro-organisme in geïmmobiliseerde vorm wordt gebruikt.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk', dat als micro-organisme één of meer. organismen gekozen uit Torüla cremoris, Torula sphaerica, Torula lactosa, Saccharomyces. fragilis, Saccharomyces lactis en Candida pseudotropicalis wordentoegepast. 10 3.. Werkwijze volgens conclusie 2, met het kenmerk, dat het micro-organisme Saccharomyces fragilis is.

4. Werkwijze volgens conclusie 1, 2 of 3, met het kenmerk, dat het micro-organisme geïmmobiliseerd wordt door inkapseling in een polymeer. -15 5. Werkwijze volgens conclusie 4, met het kenmerk, dat het polymeer een koolhydraat is.

6. Werkwijze volgens conclusie 5, met het kenmerk, dat het koolhydraat gekozen is uit alginaten, pectinaten, carrageenanen en furcellaran.

7. Werkwijze volgens conclusie 5, met het kenmerk, dat het polymeer calciumalginaat is.

8. Werkwijze volgens één der voorafgaande conclusies, met het kenmerk, dat de lactose bevattende oplossing ; aan ultrafiltratie onderworpen wei is.

9. Werkwijze volgens één der voorafgaande conclu sies, met het kenmerk, dat de fermentatie uitgevoerd wordt onder toepassing van één enkele fermentatie-inrichting. ;

10. Werkwijze volgens één der voorafgaande conclusies, met het kenmerk, dat tijdens de fermentatie kleine 30 hoeveelheden lucht worden toegevoegd, bij voorkeur ongeveer 0,01-0,05 liter lucht per liter fermentatievolume per minuut. &120168