NL7906447A - Eetlust-remmende stof. - Google Patents

Description

4 f RICHTER GEDEON VEGYESZETI GYSR rt., Boedapest, Hongarije.

Eetlust-remmende stof.

De uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het bereiden van een stof, satiëtine genaamd, die een specifiek effect heeft op de centraalregeling van de voedselopneming. Het specifieke effect van de stof van de uitvinding is terug te voeren op een selectieve 5 inhibitie van voedselopneming, terwijl de stof geen enkel ander effect heeft op het centrale zenuwstelsel, noch een depressief effect, noch een ander effect, dat de motorische activiteit inhibiteert, kon worden waargenomen.

Bij de tegenwoordig ter eetlust vermindering toe-10 gediende stoffen en geneesmiddelen, hoofdzakelijk amfetamine-achtige stoffen, is het anorexogene effect niet helemaal specifiek, want deze stoffen hebben ook andere, ongewenste centraal en perifeer sympathomi-metische of serotonerge effecten. Een verder nadeel is, dat zij een tolerantie tegen het anorexogene effect ontwikkelen, die hun uitwerking aan-15 zienlijk stoort. Cholecystokinine, een verondersteld verzadigingssignaal bij de wijziging van de voedselopneming, is slechts van theoretische betekenis, daar het directe effecten heeft op het gastrointestinale kanaal en een weinig krachtig anorexogeen is. Aldus beschikt men niet over een exonogene of endogene anorexogene stof, die de centraalregeling 20 van de voedselopneming selectief beïnvloedt zonder ongewenste neveneffec ten en een voor therapie gewenste kracht heeft.

Er werd nu een tot dusver onbekende stof gevonden, die men uit menselijk en dierlijk plasma kan afscheiden en een selectief en uitermate sterk effect als verzadigingssignaal heeft, dat voedselopne-25 ming bij gedurende 96 uur van voedsel verstoken ratten inhibiteert,en ook van grote betekenis is voor de medische behandeling van elk type hyperfagie en daarmede gepaard gaande zwaarlijvigheid. Deze -nieuwe stof, die men door membraanfiltratie en gelchramatografische fractionering kan winnen uit menselijk en dierlijk piasna, schijnt een molecuulgewicht van 7906447 if V ‘ 2 meer dan 60.000 te hebben. In het hydrolysaat van deze stof kam men aminozuren en koolhydraten aantreffen, te weten aminozuren als asparagine, leucine, glutaminezuur, lysine in de grootste hoeveelheden en de aminozuren treonine, glycine, cysteine, tyrosine, fenylalanine, arginine, 5 histidine, proline, serine, alanine, valine, methionine, isoleucine en tryptofaan in kleinere hoeveelheden, terwijl men de koolhydraten glucose, galactose, mannose, rhamnose en arabinose in kleinere hoeveelheden kan ' aantreffen naast andere reducerende stoffen. De identificatie van de chemische structuur wordt onder in detail besproken, terwijl het onder-10 zoek van de molecuulstructuur nog voortgaat.

Dit nieuwe glycoprotelne, satiëtine genaamd, met een sterk selectief verzadigingseffect wordt als volgt geproduceerd: menselijk of dierlijk serum wordt gefiltreerd door een membraanfilter,. dat de stof met een molecuulgewicht vein minder dan 50.000 laat passeren, 15 het filtraat wordt gedroogd, opgelost in water, gescheiden door gelchro- raatografie over een gel met holtevolume van minder dan 50.000 en gefrac-tioneerd onder eluëring met zout-houdend water. De fracties met biologische activiteit worden verzameld, gedroogd, in water opgelost, gezuiverd door herchromatografie over gel met holtevolume van minder dan 50.000 en de 20 biologisch actieve fracties worden gevriesdroogd.

De eerste trap van de werkwijze van de uitvinding is de ultrafiltratie van menselijk en dierlijk serum door een filter, dat de stof tot een molecuulgewicht van 50.000 laat passeren. Men kan hiertoe Amicon UM 10 of andere membranen van het Amicon type van Sartori:» mem-25 branen met een soortgelijke poriëngrootte gebruiken. Naar is gebleken zijn Amicon UM 05, UM 2, DM 5, UM 10, PM 10, UM 20, PM 30 en XM 30, of Sartorius 121 33, 121 34 en 121 36 membranen voor dit doel geschikt.

Men voerde de membraanfiltratie onder druk (bij voorkeur 3 atmosfeer) onder constant roeren uit. Het serum wordt door de 30 membraanfiltratie verdeeld in twee fracties: de moleculen, die groter zijn dan de poriënafmeting van het membraan worden gescheiden van de kleinere. Tijdens dit proces ver-schijnt de stof van de uitvinding, satiëtine, verrassenderwijs in haar totale hoeveelheid in de fractie, die stoffen bevat met klein molecuulgewicht (minder dan 10.000 dalton) in 35 weerwil van het feit, dat de filtratie wordt uitgevoerd met een membraan, 7906447 3 dat stoffen met een molecuulgewicht van minder dan 50.000 laat passeren, terwijl satiëtine, als boven reeds gezegd, verondersteld wordt een molecuulgewicht tussen 60.000 en 100.000 dalton te hebben. Dit afwijkende gedrag van de nieuwe stof is voor de werkwijze van de uitvinding voorde-5 lig, omdat hiermee daadwerkelijk de scheiding van de nieuwe stof van andere stoffen met even grote moleculen wordt vergemakkelijkt. Aldus kan men in het filtraat van de membraanfiltratie de nieuwe stof aantreffen in een 10 tot 20 maal grotere concentratie dan het oorspronkelijke droge stof gehalte van het serum, naast andere stoffen met veel kleiner molecuulge-10 wicht.

De tweede trap van de werkwijze is het oplossen in gedestilleerd water van de droge rest, die men door indamping van het filtraat heeft verkregen, waarna men chromatografeert over een gel met een holtevolume van 50.000. Men kan allereerst Sephadex 6-15 en voorts 15 Bio-Gel G-10, G-25, G-50, G-75 en Bio-Gel P-2. P-4, P-6, P-10, P-30 of P-60 gelen met goede resultaten gebruiken. Men elueert de kolom met fysiologische zoutoplossing of met andere oplossingen, die tenminste 0,1 « natriumchloride of ander zout bevatten teneinde zeker te zijn van een neutrale pH. Gedurende de eluëring verschijnt de nieuwe stof bij of nabij 20 het holtevolume (het is bekend, dat bij gelchromatografische scheidingen het "holtevolume" van de gel een belangrijke eigenschap iss alle moleculen, die zich nabij of boven de bovengrens van het selectieve scheidings-volume van de gel bevinden, (in geval van Sephadex G-15 gel is dit 1500) elueren nabij het holtevolume bij een elueervolume van 25-35 % van het 25 kolomvolume), terwijl begeleidende stoffen met kleiner molecuulgewicht, die zelfs na membraanfiltratie aanwezig zijn, later, bij groter elueervolume, gescheiden in een aantal pieken verschijnen. Biologisch actieve fracties worden verzameld en gevriesdroogd. Bij de derde trap van de winning wordt deze droge rest, die de multi-geconcentreerde werkzame stof 30 bevat opnieuw door gelchromatografie gefractioneerd. Ten gevolge van deze trap kan men door eluering met gedestilleerd water, een zuiver, werkzaam product verkrijgen, dat voor therapeutische doeleinden geschikt is. Deze tweede chromatografische zuivering wordt uitgevoerd over een kolom met eveneens een holtevolume van minder dan 50.000. De bij de eerste fractio-35 nering verkregen droge rest wordt in de minimale hoeveelheid gedestilleerd 7906447 4 water opgelost en gescheiden op een kolom van Bio-Gel P-30 en met gedestilleerd water geëlueerd, De biologisch actieve fracties worden verzameld en gevriesdroogd.

Aldus verkrijgt men een zuiver, homogeen product, 5 maar indien elektroforetisch onderzoek van het product de aanwezigheid van enige verontreinigingen zou aantonen, kan men de actieve stof verder zuiveren door chromatografie over een diethylaminoethylcellulose-kolom.

Men voert de stof aan de diethylaminoethylcellulose-kolom toe in oplossing in gedestilleerd water, wast de kolom met gedestilleerd water en elueert 10 daarna met 0,1 N fosfaatbufferoplossing (pH = 6,5) - 0,1 N fosfaatbuffer- oplossing (pH = 6,5), die 5 % NaCl-oplossing gradiënt bevat. De zuivere exi biologisch actieve stof wordt van de kolom geëlueerd met 0,1 N fosfaatbufferoplossing (pH 6,5) plus 0,5-0,7 % NaCl, waarbij de geëlueerde fractie, die de zuivere stof bevat wordt gevriesdroogd, waarna men de 15 stof ontzout van anorganische zuren over Bio-Gel P-30 en elueert met gedestilleerd water.

De homogeniteit van de zuivere stof kan elektroforetisch worden onderzocht op polyacrylzuuramidegel, die 15 % acrylzuur-amide bevat met bufferoplossing pH » 4,5 bij 100 volt en een stroom van 20 4 ampère per buis.

De nieuwe stof, satiëtine, is een witte katoenachtige stof, waarvan de chemische analyse uitwijst, dat zij een glyco-peptide is, want na zure hydrolyse kam men aminozuren en koolhydraten aantonen. De resultaten van het onderzoek naar de chemische samenstelling 25 en structuur van uit menselijk serum verkregen satiëtine luiden als volgt:

Samenstelling in aminozuren en sacchariden van het hydrolyseproduct:

Aminozuren:

Lysine 6,0 gew.% 30 histidine 1,6 gew,% arginine 3,0 gew,% cysteine 2,3 gew.% asparaginezuur 7,0 gew.% treonine 3,1 gew.% 35 glutaminezuur 9,6 gew.% 7906447 5 serine 1,7 gew.% proline 2,2 gew.% glycine 1,2 gew.% alanine 3,8 gew. % 5 valine 3,6 gew.% methionine 1,3 gew.% isoleucine 1,0 gew.% leucine 6,0 gew.% tyrosine 1,8 gew.% 10 fenylalanine 3,5 gew.% tryptofaan 1,9 gew.%

Totaal aminozuurgehalte 60,6 gew.%

In het product bevindt zich 13 % reducerende stoffen, in hoofdzaak koolhydraten.

15 Glucose 2,8 gew,% galactose 2,9 gew.% mannose 2,0 gew.% rhamnose 1,9 gew.% arabinose 1,1 gew.% 20 Totaal koolhydraatgehalte 10,7 gew.%

Watergehalte: Het product bevat ook fysisch gebonden water in een hoeveelheid van 10 %.

N-terminaal reeks analyse: tijdens verder onderzoek van het product gebruikte men de gewone methoden voor N-terminaal 25 rest analyse met dansylderivaten en splitsing met aminopeptidase M enzyme, waarbij men geen rest kon aantonen, hetgeen duidt op de aanwezigheid van gemaskeerde N-terminaal rest.

Enzymatische hydrolyse met trypsine: Satiëtine 30 kan nagenoeg niet worden verteerd met trypsine gedurende 2 uur in pH * 8,3 aranonium-waterstofcarbonaat buffer. De kleurintensiteit van de optredende peptide-zönes is zwak,

Het effect van carboxymethylering op de structuur: Satiëtine, dat een homogene stof schijnt te zijn met een molecuulgewicht 35 van 68.000 gedurende polyacrylzuuramidegel elektroforese na binding van de 7906447 6 SH-groepen met broomazijnzuur, schijnt vier componenten te hebben in het elektroforetische beeld, verkregen door elektroforese met natriumdodecyl-sulfaat: de component met een molecuulgewicht van 68.000 is aanwezig, maar er is een andere met 18.000 en twee soortgelijk mobiele, maar goed 5 gescheiden componenten met 28.000.

Het effect van carboxymethylering op de activiteit; Satiëtine verliest zijn biologische activiteit bij carboxymethylering met broomazijnzuur.

OV-spectrum; Het ultraviolet absorptiespectrum 10 van satiëtine vertoont geen absorptie-maximum; er verschijnt een "plateau” bij 275-280, dat een kenmerk van proteine-peptide kan zijn. Het absorptiespectrum wordt weergegeven in fig. 2.

Molecuulgewicht; De belangwekkende eigenschap van satiëtine is zijn bovengenoemde bijzondere gedrag gedurende de verschil-15 lende metingen van het molecuulgewicht.

1. Tijdens ultrafiltratie door membraan schijnt het moleculair gewicht van minder dan 10.000 te hebben.

2. Bij gelchromatografisch onderzoek schijnt het een molecuulgewicht van meer dan 40.000, tussen 60.000 en 100.000 te 20 hebben.

3. Bij polyacrylzuuramidegel elektroforese loopt het parallel met moleculen met een molecuulgewicht tussen 65.000 en 68.000.

4. Bij ultracentrifugering schijnt het een mole-cuulgewicht van minder dan 10,000 te hebben.

25 De nieuwe stof, die men volgens boven beschreven werkwijze kan bereiden, kan niet alleen uit menselijk serum worden verkregen maar ook uit het serum van verschillende dieren. Hoewel de stoffen, die met dezelfde methode zijn verkregen uit het serum van verschillende dieren, te weten hoornvee, hond, kat, paard, guinese big, konijn, ver-30 schillende rattenstammen (Wistar, CFY, SHR, Long Evans) een verschillende potentie vertonen, is de specificiteit van het effect, dat wil zeggen de selectieve inhibitie van voedselopneming bij elk product hetzelfde.

Het effect van het product op de voedselopneming werd onderzocht aan vrouwelijke CFY ratten van 200-240 g. De dieren werden 35 96 uur voor de proeven van voedsel verstoken, maar water werd vrijelijk 7906447 7 toegevoerd. Gelet op de agressiviteit ten gevolge van de uithongering, werden de dieren elk in een aparte kooi geplaatst. Men gaf elk dier intraveneus een dosis van 10 ng/k? satiêtine, opgelost in 0,5 ml fysiologische zoutoplossing. De dieren van de controlegroep werden slechts geïnjecteerd 5 met 0,5 ml fysiologische zoutoplossing intraveneus, die geen actieve stof bevatte. 1 Uur na de behandeling bood men de dieren voedsel aan, het gebruikelijke eetpersstukje, dat albumine, vet, koolhydraat en vitaminen bevat in onbeperkte hoeveelheden. De voedselconsunptie werd gemeten, 1,5 en 24 uur na de toediening van het voedsel (of 2,6 en 25 uur na behande-10 ling). De resultaten zijn weergegeven in fig. 1. De lege kolommen ver tegenwoordigen de in 1 uur gegeten hoeveelheid voedsel, de gestreepte die van 5 uur en de geschaduwde die van 24 uur. Onder de kolommen zijn de dieren aangegeven, uit wier serum het satiêtine monster was geëxtraheerd. De gegeven resultaten bewijzen de uitermate grote doeltreffendheid van 15 het product van de uitvinding. Zijn effect overtreft dat van de tot dus ver bekende stoffen met hetzelfde effect, terwijl tevens cholecystokinine en arentenine, dat geproduceerd wordt uit duodenum-extract, als beschreven door Ugolev et al in het geheel geen effect hebben op dieren, die 96 uur van voedsel verstoken zijn. Het feit dat de nieuwe stof zelfs in 20 dit geval een totaal effect heeft, bewijst zijn ongeëvenaarde sterke werking.

Ten bewijze van het specifieke en selectieve effect van de nieuwe stof onderzocht men deze op neveneffecten, waargenomen aan stoffen met hetzelfde effect (amfetamine-achtige stoffen). Bij 25 de gemodificeerde springproef, die de methode is voor onderzoek van het centraal depressieve effect (Knoll, J en Knoll, B., Arch. int. Pharmacodyn. 148, 200-217, (1964)) had de nieuwe stof geen invloed op het vermijdingsgedrag, zelfs niet in een dosis, die de dubbele was vein die voor het inhibiteren van voedselopneming. Bij de met de motimeter uitgevoerde 30 proef (Knoll, J., Arch. int. Pharmacodyn. 130, 141-154 (1961)) hadden zelfs de grote intraveneuze doses van de nieuwe stof geen enkel effect van inhibitie of vergroting van de ootiliteit. Het is bekend, dat stoffen met depressief effect, de aangeleerde reflexen sterk beïnvloeden, zodat soortgelijke proeven met de nieuwe stof op ratten werden uitgevoerd bij 35 de springproef (Knoll, J, en Knoll, B. Arzneimittel-Forsch. 8, 330-333, 7906447 ί -fi 8 (1958)), die geschikt is voor het onderzoeken van aangeleerd vermijdingsgedrag. Satiëtine bleek in dit opzicht ook onwerkzaam te zijn. Gezien het feit, dat cholecystokinine een kenmerkend contractie-effect heeft op de longitudinale spier van het ileum van het guinese biggetje (Knoll, et al.

5 Pharmacology, 12^, 283-289 (1974)), onderzocht men de nieuwe stof ook in dit opzicht op dit geïsoleerde orgaan, waarbij werd bewezen, dat de stof onwerkzaam was vergeleken bij cholecystokinine. Al deze proeven bevestigen de gunstige eigenschappen van satiëtine, die men als volgt kan samenvatten; 10 a. satiëtine is een endogene stof van natuurlijke oorsprong.

b. Het vertoont geen toxiciteit van betekenis.

c. Zijn effect is selectief, dat wil zeggen inhibitie van het voedselconsumptiecentrum door inwerking op de centrale 15 regeling van de voedselopneming.

d. Zijn werking verschilt van die van andere anorexigene stoffen door afwezigheid van depressieve of stimulerende effecten.

e. Het is zeer potent, daar het de voedselopne- 20 ming kan inhibiteren bij ratten, die 96 uur van voedsel zijn verstoken.

f. Zijn effect is dosis-afhankelijk. Een maximum inhibitie van voedselopneming werd bereikt met 200-300 /*g/rat bij intra-cerebroventriculaire toediening.

g. Het piekeffect wordt in 5 uur na de intracere- 25 broventriculaire toediening van satiëtine bereikt en het effect houdt lang aan en duurt 24 uur.

h. Het effect is reversibel.

De uitvoering van de werkwijze van de uitvinding wordt door het volgende voorbeeld nader aangetoond: 30 Men ultrafiltreert 100 1 menselijk serum door

Amicon UM 10 membraan. Men verkrijgt 700 ml filtraat, die men vriesdroogt, waarna men het overblijfsel oplost in 30 ml gedestilleerd water. Men scheidt de oplossing over een Sephadex G-15 kolom (middellijn 5 cm, lengte 90 cm) en elueert met 0,9 % natriumchloride-oplossing in water, waarbij 35 men telkens fracties van 10 ml opvangt. De fracties tussen 50 en 60 790644? % 9 (tussen 500 en 600 al) bleken biologisch actief te zijn. Deze fracties werden verzameld, gevriesdroogd en opgelost in 10 ml gedestilleerd water.

De oplossing werd gescheiden over een Bio-Gel P-30 gelkolom met afmetingen 2,5 x 90 cm en geëlueerd met gedestilleerd water. Men ving fracties van 5 10 ml op, waarbij de fracties tussen 11-15 biologisch actief bleken te zijn. Deze fracties werden verzameld en gevriesdroogd. Afhankelijk van de hoeveelheid oorspronkelijk serum, verkreeg men 200-240 mg droog product, in de vorm van een sneeuwwitte, katoenachtige homogene en zuivere stof, geschikt voor therapeutisch gebruik.

10 « 7906447

Claims (5)

1. Anorexogene stof, satiëtine genaamd, met selectief inhibiterend effect op de centraalregeling van de voedselopneming, die kan worden gewonnen uit de biologisch actieve fracties vein de gedroog- 5 de rest vem menselijk en/of dierlijk serum, nadat dit serum eerst is gefiltreerd door een membraan, dat stof met een moleeuulgewieht van minder dan 50.000 doorlaat en is onderworpen aan gelchromatografie over een gel met een holtevolume van minder dan 50.000, van welke stof het hydro-lysaat 60-61 % aminozuur en 10-11 % koolhydraat bevat in de volgende 10 samenstelling: aminozuren: lysine 6,0 %, histidine 1,6 %, arginine 3,0 %, cysteine 2,3 %, asparaginezuur 7,0 %, treonine 3,1 %, glutaminezuur 9,6 %, serine 1,7 %, proline 2,2 %, glycine 1,2 %, alanine 3,8 %, valine 3,6 %, methionine 1,3 %, isoleucine 1,0 %, leucine 6,0 %, tyrosine 1,8 %, fenylalanine 3,5 % en tryptofaan 1,9 % en koolhydraten: glucose 2,8 %, 15 galactose 2,9 %, mannose 2,0 %, rhamnose 1,9 % en arabinose 1,1 %, van welke stof het ultravioletspectrum geen kenmerkende absorptie-maximum vertoont, maar niettemin bij 275-280 een plateau vertoont en welke zuivere, chromatografisch homogene stof een moleeuulgewieht van minder dan 10.000 vertoont bij membraan ultrafiltratie en ultracentrifugering en van meer 20 dan 60.000 bij polyacrylzuuramide-gelelektroforese en gelchromatografie.

2. Werkwijze voor het bereiden van een endogene, anorexogene stof met een verzadigingseffect op de centraalregeling van de voedselopneming, met het kenmerk, dat men menselijk of dierlijk serum . filtreert door een membraan, dat een stof van minder dan 50.000 dalton 25 doorlaat, het filtraat droogt, oplost in water en scheidt over een gel met een holtevolume van minder dan 50.000, fractioneert onder eluering met neutrale oplossing in water, die tenminste 0,1 % zout bevat, de biologisch actieve fracties droogt, oplost in water, verder scheidt over een gel met een holtevolume van minder dan 50.000, fractioneert onder eluering 30 met gedestilleerd water en de biologisch actieve fracties vriesdroogt.

3. Werkwijze volgens conclusie 2, met het kenmerk, dat men bij de eerste gelchromatografische fractionering als elueermiddel natriumchloride-oplossing in water gebruikt,

4. Werkwijze volgens conclusie 2, met het kenmerk, 35 dat men bij de tweede gelchromatografische fractionering de biologisch 7906447 11 actieve fracties van het eluaat verzamelt en desgewenst na een andere chromatografische 2tiivering vriesdroogt.

5. Endogene anorexogene stof, die kan worden bereid volgens de werkwijze van één der conclusies 2-4. 5 7906447 W