NL7905789A - 1-gesubstitueerde-hydroxyiminomethyl-pyridinium zouten, werkwijze voor het bereiden van deze verbindingen, preparaten tegen organo-fosfaatvergiftingingen, alsmede werkwijze voor het bereiden van dergelijke preparaten. - Google Patents

Description

^-5. 1 N.O. 26.857 - 1 -

Nederlandse Organisatie voor Toegepast-Natuurwetenschappelijk Onderzoek ten "behoeve van de Rijksverdediging en Nederlandse Organisatie voor Toegepast-Natuurwetensehappelijk Onderzoek ten behoeve van de Volksgezondheid, beide te ' s-Gravenhage.

- 1-Gesubstitueerde-hydroxyiminomethyl-pyridinium zouten, 5 werkwijze voor het bereiden van deze verbindingen, preparaten tegen organo-fosfaatvergiftigingen, alsmede werkwijze voor het bereiden van dergelijke preparaten -

De uitvinding heeft betrekking op 1-gesubstitueerde-hydroxyiminomethyl-pyridinium zouten, alsmede op een werkwijze 10 voor het bereiden van deze verbindingen, op preparaten tegen organo-fosfaatvergiftigingen, die deze verbindingen bevatten, alsmede op een werkwijze voor het bereiden van deze preparaten.

In de afgelopen 25 jaren zijn een aantal oxim-derivaten ontwikkeld voor therapeutische toepassing bij vergiftiging door 15 organofosfaten met anticholineterase werking. Deze organofos-faten kunnen zowel pesticiden (bv. Parathion) als de zogenaamde ’'zenuwgassen" (bv. Sarin, 7X, tabun) zijn. De toxische werking van deze stoffen berust in hoofdzaak op de blokkering van de zenuwprikkeloverdracht van het parasympatische en sympatische 20 zenuwstelsel aan spieren in het lichaam, middels remming van het enzym acetylcholineterase. Sommige oximen zijn in staa,t om deze remming weer op te heffen door een chemische reaktie aan te gaan met de organofosfaatrest die aan het enzym is gebonden, zodat er sprake is van een causale therapie. 25

Sot op heden is een viertal producten beschikbaar voor praktische toepassing. De eerste twee oximen zijn 1-methyl-2-hydroxyiminomethyt-pyzidinium zouten (formule 1 van het formuleblad waarin X = Cl : Pralidoxim (zie Buil. Org. mond. Santé, 1971? éAi 289-507) en X = MeSO^ : P2S (zie Journal of 30 .....Pharmaceutical Sciences, §χ, 1136-1140 (1972)).

7905789 -I- 2

Yoorts is een tweetal symmetrische biskwaternaire pyridinium-derivaten ontwikkeld, waarbij de twee oxim-groepen zich op de 4-plaats van de pyridinium ringen bevinden (formule 2, waarin Y = CH2 : en Y = 0 : Toxogonin (zie Arch. Toxicol, £6, 71-81 (1976)). 5

Zeer recent zijn een aantal asymmetrische biskwaternaire pyridi- nium-derivaten beschreven, waarbij slechts één oxim groep zich op de 2-plaats van één van beide pyridinium-ringen bevindt formule 3> waarin bv. Z - -4-C(0)j$IÏÏ2> -3-C(0)fenyl, -3-θ(θ) cyclohexyl. 1 o

De monokwaternaire pyridinium-oximen met de formule 1 kenmerken zich in positieve zin doordat zij (i) een goede therapeutische aktiviteit bezitten tegen sarin, XY, en een groot aantal pesticiden, (ii) bij orale toediening een werkzame bloedspiegel doen ontstaan, zodat zij ook bruikbaar zijn voor orale profy- 15 laxe. In negatieve zin onderscheiden de oximen met de formule 1, waarin X de bovengenoemde betekenis heeft, zich doordat zij slechts aktief zijn in hoge dosering (ca. 10 mg/kg, i.m.). Deze hoge doseringen noodzaken tot zeer hoge oximconcentraties (25-50 % gew./ gew.) in de autoinjektoren waarmede sommige krijgsmachten zijn 20 uitgerust voor zelfhulp/kameradenhulp in geval van gebruik van zenuwgassen in oorlogstijd. Op hun beurt geven deze hoge concentraties aanleiding tot stabiliteitsproblemen bij opslag, hevige pijn bij intramuskulaire injectie, en tot aanzienlijke necrose van spierweefsel ter plaatse van de injektie. Tevens zij vermeld dat 25 de oximen met de formule 1 nauwelijks enige positieve invloed uitoefenen bij vergiftigingen met de zenuwgassen tabun en soman, zij het dat er evenmin sprake is van een nadelige invloed op de vergiftiging.

De symmetrische biskwaternaire pyridinium-oximen met de 50“ formule 2 waarin Y de bovengenoemde betekenis heeft kenmerken zich in positieve zin doordat zij (i) in veel geringere dosering therapeutisch aktief zjjn dan de verbindingen met de formule 1, zodat de bovenvermelde problemen met betrekking tot hoge oximconcentraties in autoinjectoren voor deze verbindingen in veel 35 geringere mate gelden, (ii) een goede therapeutische werkzaamheid vertonen tegen het zenuwgas tabun, in tegenstelling tot de 7905789 * 3 verbindingen met de formule 1, terwijl de verbindingen met de formule 2 tevens een goede therapeutische activiteit bezitten tegen organofosfaten waartegen ook de verbindingen met de formule 1 werkzaam zijn. In negatieve zin onderscheiden de verbindingen met de formule 2, waarin Γ de bovengenoemde betekenis 5 heeft zich doordat (i) zy nauwelijks worden geresorbeerd vanuit het maag-darmstelsel, zodat oraal profylactisch gebruik niet mogelyk is, (ii) wordt aangenomen dat toediening van deze oximen na vergiftiging met het zenuwgas soman een nadelige invloed kan hebben op het verloop van de intoxicatie, vanwege de toxiciteit 10 en relatief grote stabiliteit van de reaktieprodukten met de formule 2, waarin Y de bovenstaande betekenis heeft met dit zenuwgas .

De oximen met de formule 3 kenmerken zich door hun specifieke therapeutische werkzaamheid tegen soman. 15

Gevonden werd dat een nieuw type monokwaternair pyridinium-oxim, namelijk 1-(hetero) arylmethyl-hydroxyiminomethyl-pyridi-nium zouten met de formule 4 waarin een al dan niet gesubstitueerde (hetero) arylgroep of een overeenkomstige dihydrogroep, 20 R2 een waterstofatoom, alkylgroep of arylgroep, IU een waterstofatoom of een alkylgroep en Z een voor farmacologische doeleinden geschikt anion voorstellen, in belangrijke mate, enerzijds de goede eigenschappen van de in 25 het voorgaande beschreven verbinding met de formules 1 en 2, waarin X en Y de in het voorgaande beschreven betekenissen bezitten terwijl zy anderzyds de negatieve kenmerken van laatstgenoemde oximen niet vertonen.

De oximen volgens de uitvinding zyn in lage dosering therapeu- 30 tisch aktief tegen bv. sarin.

Bovendien hebben de oximen volgens de uitvinding tegen organofosfaten, die een fosfor-stikstof binding bevatten zoals het zenuwgas tabun, een therapeutische aktiviteit die duidelijk beter is dan die van de verbindingen met de formule 2, waarin 35 Y de bovenstaande betekenissen heeft. Be oximen volgens de uitvinding hebben o.a. tegen tabun, sarin en paraoxon een goede 790578? *r

A

beschermende werking bij orale, profylaktische, toediening. De onderhavige oximen zijn, evenmin als de verbindingen met de formule 1, waarin X de bovenstaande betekenis heeft, werkzaam tegen het zenuwgas soman, maar hebben geen nadelige invloed op vergiftiging met soman, in tegenstelling tot de genoemde ver- 5 bindingen met de formule 2. Tenslotte zij vermeld dat de LD^0/ED(-0-verhouding van de oximen volgens de uitvinding gunstiger is dan voor de beschreven verbindingen met de formule 1.

De uitvinding wordt toegelicht aan de hand van onderstaande voorbeelden, die niet beperkend dienen te worden uitgelegd. 10 VOORBEELD I.

Bereidingswijze A.

De bereiding van 1-benzyl-2-hydroxyaminomethyl-pyridinium bromide (verbinding 1).

Een mengsel van 25,7 g (150 mmol) benzyl bromide en 15 16,7 g (137 mmol) 2-hydroxyiminomethyl-pyridine in dimethyl-formamide (70 ml) werd gedurende 7 dagen bij kamertemperatuur weggezet. Het neerslag werd afgefilterd en gewassen met ethanol en ether. Herkristallisatie uit 96 %-ige ethanol gaf 50,9 g (77 %) van de verbinding 1 in de vorm van witte kristallen. 20" a) Indien (hetero)arylmethyl chlorides in plaats van bromides of jodides werden gebruikt werd het reaktiemengsel gedurende 5-4 uren verwarmd op 60-90°C.

b) Cyclohexylmethyl jodide alkyleerde 2-hydroxyiminomethyl- pyridine zeer moeizaam. Ha reaktie bij 100°C gedurende 25 10 uren werd het produkt met ether neergeslagen. Herkristallisatie leverde een mengsel van verbinding jjO en van het hydrojodide van 2-hydroxyiminomethyl-pyridine, waaruit de verbinding %0 door wassen met water kon worden gewonnen.

VOORBEELD II. 30

Bereidingswijze B.

De bereiding van 1-benzyl-2-hydroxyiminomethyl-pyridinium-_ methaansulfonaat..(verbinding 4)· 7905789 * Λ 5

Aan 22,4 S (76,5 mmol) verbinding 1, opgelost in 250 ml water werd Ïij 70°C onder roeren een oplossing van 15,5 g (76,5 mmol) zilver methaansulfonaat in 50 ml water ("bereid uit vers met HaOÏÏ neergeslagen zilver hydroxyde en 10% ondermaat methaansulfonzuur in aoetonitril) toegevoegd. Ha 10 minuten 5 roeren met geactiveerde kool (norit) op 70°C werd het reaktie-mengsel gefiltreerd, waarna het kleurloze filtraat werd droog-gedamot. De achtergebleven olie werd kristallijn door toevoeging van aceton en aansluitende verdamping van het oplosmiddel onder sterk verminderde druk. Ha wassen met ether en drogen 10 verkreeg men als produkt de kleurloze verbinding 4 die vrij van bromide bleek te zijn.

VQOIRSSirr.T) TTT.

Bereidingswijze C.

De bereiding van 1 -(β-fene thyl)-2-hydroxyiminomethyl-pyri dinium 15 jodide (verbinding 19)·

Een oplossing van 25,2 g (100 mmol) β-fenethyljodide en' van 24j4 S (200 mmol) 2-hydroryiminomethyl-pyridine in ethanol (100 ml) werd gedurende 24 uren onder^terugvloeikoeling gekookt.

Het oplosmiddel werd afgedampt waarna het residu werd behandeld 20 met 250 ml diethylether/aceton (l/5) waarbij een geelgekleurd neerslag werd verkregen. Dit neerslag werd afgefilterd en werd vervolgens herkristalliseerd uit ethanol/aceton (7/2), waaraan in porties ether werd toegevoegd totdat een verhouding ethanol/ aceton/diethylether 7/2/2 (gew./gew.) was verkregen. 25 VOORBEELD 17.

Bereidingswijze D.

De bereiding van 1 -(4*-isothiazolylmethyl)-2-hydrozyiminomethyl-pyridinium bromide (verbinding 25)’.

Een mengsel van 10 g (100 mmol) 4-methyl-isothiazool, 50 18 g (101 mmol) H-broomsuccinimide en 0,5 g (2,1 mmol) diben-zoylperoxide in droge tetrachloorkoolstof (250 ml) werd gedu- 7905789 $-.-¾ 6 rende 3 uren onder terugvloeikoeling gekookt. De reaktie werd 1 gevolgd met H-KSR en werd "beëindigt als te veel dibromering (van de methylgroep) optrad. Na beëindiging van de reaktie was de verhouding uitgangsstof : monobromeringsprodukt : dibrome- Λ ringsprodukt ca. 25 : 65 : 10 ( H-KSR). 5

Na bewaring overnacht werd het neerslag af gefilterd, waarna het filtraat werd drooggedampt onder sterk verminderde druk.

Aan het ruwe, roodbruin gekleurde product werd diethylether (50 ml) toegevoegd. Na filtratie werd aan het filtraat 12,2 g (100 mmol) 2-hydroxyiminomethyl-pyridine en dimethylformamide 10 (25 ml) toegevoegd, waarna de ether onder sterk verminderde druk werd afgedampt. Het mengsel werd gedurende het weekeinde bij kamertemperatuur bewaard, waarna het gevormde neerslag werd afgefilterd en gewassen met aceton en ether. Tenslotte leverde herkristallisatie uit ethanol (96 %) de verbinding 2£ (7,7 g> 15 26 %) kleurloos produkt.

De in tabel A vermelde verbindingen werden op de daar aangegeven wijze bereid.

Yan de in tabel A vermelde verbindingen verdienen de verbindingen met de formules 4> 24, 22, 16 en 8 de voorkeur. 20

De werking van de verbindingen volgens de uitvinding werd op de in het volgende beschreven wijze beproefd.

7905789

* X

• < S> _,__--Ό00·Ν1ονι·*-ΜΜ - 5 \W \ ^ CO to — o s I1?. ! SVü^OpÓ^ftpQQQQ--)' | |o ,3 x re χ x x ‘ χ x i x x x ^ 1 x nT3 jj |λ | IS.

c '5

χχχχχ******311*^ I

ir c i™ to totoioN>MMioioioto-^wM|. }£ ra li- 8 & n " ü

- Qi - q, Q. Q, ° " i i " " " I

1 ω i ‘i 3 CO Ü.

>>>>>>>>>roro>>> I 3 {3 S Ü ‘n.

ft 3 CL

Φ (q Ir* *? I-.

1 re |3

IO

O *5» _, , —· O^-N-'sjO'^SsjC^nj “O * »5 *S| ^ co oo cdniod^Jo"0 o*Nvjsoo- 1 =

In ^" § CQ is V» <*

i “* i^L

«i __l arf —» ·“* i*0 sj ^ \| Ό VJ K3 S 5 5 8 S £ s N » « c- - o _ ^ is - O L V o o o O « V ? ? ? o n: |_ o -LL — — — IO -? Cj ~ Pi Ό NI IO ^ § g S S - S § « ;° ,°1 -Γ0 B I ,1

Ol o, o Oi O In o 01 ° UI ° ° In - cncooiM^M^goco^MN) i·^ K S 2 S « a ,® 5 S S 2 s s % 2

Lvi^ovj r* μ -¾¾ to kj fi — 1- 1_, ? — en 08 en en en en en en en fr, cucoencntoroencnenengo-encntnencnen^' ƒ* _to e- c^ Cm ^ en oo* to co o o to Cu en en®o+»-^-^-^-^·, oS — envitocnN,·; · 3\ L en V o ^ L '>! L "o - - V s s ^ 2 2 2 ? t “* r °* r K & S *p ü,^|Ovio0'0'tj)> e»0-i.-Al· i, i, <n en en h L c!n til c!n ύι g * «· £ en *. to ^ c« ”

θ' *> Μ m en „<=> *> ^ o L o? 'o, L

fs.fw^CO^r^VI'NjOO N3 '“"J *^N5^fc.

fTwSSvi^tnooNi .o . ^ eo ω to —* -t^ <>· p P “ ƒ· ^ P P ί~ ? “ ^ -Γ" -.4^ ?

'V,C0mLeoL.N3loC04^C0'0>0O'0O — “ΜΙΟΟ'^ϊ^έίΐ iS

' ώ Μ λ -L en ^ O' en ^ a L 2 ë 'ü §i - “ § 2 o ^ g: ^ o | N 05 Ο) β Ji, ^ J ^ Ό < ·<1 ^ ,"0 < Ό O ® Ό ί ,Ό Ό ί i 10 * “oSSgSs-SoS^gSCSgSoSoSiïStSio! Z o

”“g'^“oSmg g-ëèo- S

ro o en ^ en o* oi o* nj ^ O' ^*4 vj ^2 'o, q 'N L u 'oj o 'm o i» m vj o-o o '«o 9 S ? K S m os \

Ulü3*JOÜl-‘O'40'0l-,WO*u0'-i“d-i o ^ O V» O X CD

LLnè.LitLLL tb ' l L m to a.? *sj ^ ^ λ». isj Cn O1* en njO'NJ · ·, % ^ S H ^ ^ ^ N * * o^ — Cw OOen 030^0 O 03 —* cocoOenONJ — euO» o-f»··- vjjj CO o O o o 1 1 7905789 Γ1% 1 ‘ * % Ό -· vj en co IO On % * r t ft *1 ÏS)NJN)N3N>K3iONiK)iO--»—* — Γ*Γ* Ξ* S 00 SJ O' ^ — ΟΌ CO “sj O* Ol jjj* Q p—λ α ρ-φ-oq O <3 ·Ρ9 ? i'Q Q p Q 9 ‘ gp ·' xxxxxxixxxxg: A x X % ” Kf 3 ft· χχχχΐχχχχχχχχ^χ ^ c CJ ^ o 3 Λ Έ <Λ Λ IP ^

O-P'0??00 ??-, N

~l 1 V ~ I · , t I t 1 * l 1 1 !' >>>>σσ>>>>η>>>> g® O ü{ «* Λ_ O Öl o. 5' a iü <Λ o o»i- — covjowtno^^.Oi'S'a ^coJivoO-woo — ui o i<o o o -t>. o» iv ^ ft 3

CQ

tn hd » >- — — — lO'NJ;-—. — κ,κ. **

-4 UO-NlOOUlViOCOOOo^^fONJ

0 -N UO co VJ N4 CO co o CO cn CO'vJ^ ^ μ V"*0 o γ1 r Ϋ V1 ^ V cn N3 o Ίι =1 1 * 1 I · i Ui « J. ‘ * l I tl --N 3 2 S « «° °° “ r p> ®· o “ g 8 ~ € o - - o οι oi en — ό _ nq v ' § 4 ui ui tn — 3

M Mm „tOWrONJUlOlWWWWOJ

^νιΚ^οοωοΐοουιοοΜ·*. “SS· ^UiTr^ooco^.ooooÏk'uyD — ω 2 o t, — 1, ", — — Ο'ΝΙίΟΜτ-ίΟΝίΜίΟ ·

^j-^g[jOOCOCO^fONjOOOCNNJtO

, mn?3w -J-H v» ' o o -o o uiui — ~pipipjpJ.'"P) ö o "M d £ β' ^ ^ S 2 § 2 S S § § 5 S S'S 2 ή S 2 2 § J S !5 è 2 COOjWUIhm I , , | w*- f* ^ ί l l I i ί Λ lrj,.f>..^.t».UiCSuiCn >9s 5 M *3 JK o 3 « p» P* ® +* r f* P5 ft - % ö <p vowS o^ijKSo“S^

UI ON ^ ^ ^ £" W CO W tO f-^k ƒ, w OJ ^ W ^ ^ 4 ^ ^ Ül ÜI A

vöC-ftfcJiw co ' CO O M CO 1*0 CO *0 O CO CO *0 Vj Ό N ^"^o'^O^n'rvNCO^V « 0 Co co o c M (i O* N O MÜiCOÜiCJsij^SJüiNSioSÏ^ug^ ö 1 I I ||l | I I ! I | 71 ^ I I l» ui * * ^ ,w ,w *- ƒ* ,w £ ƒ* ^ λ ,°1 »> i Γη-^Τη <^|WW -j-N O O CO 0 ' ΙΟ κ o- [2 _ ft • 3 H < o SCot ω S ω *> >-“.Ρ“,0,·“··*,Γ'ρι·0>,^θΛθρΊνι,ίΒ»0οοβ ~ g *M C s> ω 'da' "α Ό o g o ui 2 2 o « o ö o e 2 - - “ (J » V| o 1

1 OO-UY’0'^'-' 6i 9 ° ® ° W^l C ΐ “ i “ 'f f* M I Ό 7* M UI 0« !oQ

M g Λ Ld w ^ o o ,° P4 j3 ? w Is d S d 'b5Sv3SSü,<,K'<>^5 J * ^ ?'? 2—* £ L* ,s ? ^ 2 o r “ “ s 2 2 s g s ö g- 2·?^ ^8 ^s ? 5 s« 8 S 5 Ü ti ft 3 8 5 2 Γί 8 g is 8 | < t « s Sn ·; i -= g s .4 4 4 s 4 it *SSÉ-'®>40‘52SêS^8i3 8 i ‘ 7905789 |gggg «g -,,5 5 s- % ro m . vi o * \ 9

Eeaktiia:end vermogen van 1-(hetero) arylmethyl ~ •hydroxyimlno-methvl-nyridinium zouten (ΐψ).

Methode

Geremd rundererythrocyte acetyl cholinesterasen werden op de volgende wyze verkregen: 5 a) een mengsel van een oplossing van ongeveer 2 mg enzym (Sigma Chemical Comp., St. Louis, TJSA)/ml in 6,6 mM veronal buffer, pH 7,5, met eenzelfde volumen van een 0£5 uM VX, 0,1 pM tab tin, 0. 5 jpM paraoxon respectievelijk 0,4 uM mevinphos oplossing in dezelfde buffer werd bij 25°C geincubeerd gedurende resp. 10 1, 1, 2¾ of 1 Tg- uur; b) een mengsel van een oplossing van 2 mg enzym/ml in 6,6 mM veronal buffer, pH 9»0, met eenzelfde volume van een 0,2 pM sarin oplossing in dezelfde buffer werd bij 0°C gedurende 100 min geincubeerd; 15 c) een mengsel van 100 volumina van een oplossing van 3,9 ag enzym/ml in 6,6 mM veronal buffer, pH 7» 5» die 0,1 M KC1 bevatte, met één volume van een 51 mM methamidophos oplossing in isopropanol of met twee volumina van een 55 mM crufornaat oplossing in isopropanol werd gedurende resp. 1 of 2 uur by 20 25°C geïncubeerd. De overmaat organofosfaat werd verwijderd door het enzym-organofosfaat mengsel drie maal met ether (1-i; 1 vol/vol) te extraheren, waarna de enzymoplossing gedurende 50 min onder verminderde druk werd gehouden om de meeste ether te verwyderen. De overmaat methamidophos en 25 crufomaat werd verwyderd door gelfiltratie over Sephadex G-25. De hieruit verkregen oplossing van geremd enzym in 6,6 mM veronal buffer, pïï 7,5» die 0,1 M KC1 bevatte, werd met het oplosmiddel verdund tot een enzymconeentratie van 1,5 mg/ml. 30

De reaktivering werd gestart door toevoegen van één volume van een oxim oplossing in 40 mM fosfaat buffer, pH 7» 5» aan vier volumina van de oplossing van het geremde enzym, waarvan de pH zonodig op 7»5 was gebracht.

By de bestudering van de reaktivering van het geremde enzym 55 7905789 t * 10 in afwezigheid van oxim werd slechts fosfaat buffer aan de geremde enzym oplossing toegevoegd. De reaktivering vond plaats o - bij 25 C gedurende 24 uur. Elke 60 - 100 min werd de enzymaktivi- teit in een één ml-monster van het reaktiveringsmengsel (AIR ) t automatisch bepaald door middel van een pH-stat titratie. 5

De aktiviteitsbepaling werd uitgevoerd bij pH 7>5 en 25°C met 23 ml van een 3>2 mM acetylcholine perchloraat oplossing in 0,1 M KC1. De titrant was 0,05 N UaOH. Enzymaktiviteiten werden gecorrigeerd voor spontane hydrolyse van het substraat. Blanko-waarden voor de aktiviteit van het enzym. (A), van het enzym dat 10 met het oxim is gelncubeerd (AR) en van het geremde enzym (Al) werden eveneens bepaald.

Het percentage reaktivering op tijd t (^react^) werd berekend volgens

Amt ÏR - a 15 % neact, = - 100 (1)

A - AI

Snelheidsconstanten van het reaktiveringsproces (k -^ ) en het maximale percentage reaktivering (% react ) werden berekend

Co volgens -k . t obs % react^ = % react^ (1 - e ) (2) 20 door deze vergelijking op grond van kleinste kwadraten criteria te passen aan % react^ - gegevens die verkregen werden bjj verschillende t-waarden.

Resultaten.

In tabel B worden gegevens over het reaktiverend vermogen van 25 verbindingen volgens de uitvinding ten opzichte van door tabun geremd acetylcholinesterase vermeld. Gegevens over het reaktiverend vermogen van één vertegenwoordiger van de verbindingen volgens de verbinding 1-benzyl-2-hydroxyiminomethyl-pyridinium 7905789 1ü » =% methaansulfonaat (4), die werden -verkregen uit reaktiverings-experimenten met door verschillende organofosfaten geremde acetylcholïnesterasen, zijn in tabel C samengebracht. Ter vergelijking zyn gegevens verkregen met drie bekende reaktivatoren met de formules 1 en 2 eveneens opgenomen. 5 7905789

Tabul B. fleaktivering van door tabun geremd acetylcholincstorase me t 10JÜft van verbind iugcn IV bij pil 7>5 en 25°C; percentage reaktivoring {% react) na 2 h, en de uit de roakiiveringts· gegevens berekende ene .the ids c ons tante van bet reaktiveringoproces (k . t) en maximale por-centage reaktivering (% rcactw).

verbinding % react k % react^ O DO « nr« na 2 h (l0“<nin; 1 48 6,7 ±0,1 87,? ±0,2 2 1 (a) ; 4 0,1 5 5 (a) <0,1 - 4 40 5*4 + 0,1 86,7 + 0>4 5 41 5,8? + 0,09 82,7 + 0,2 6 15 1,6 ±0,1 72 ±2 7 25 2,72 ± 0,04 79,7 ± 0,3 8 28 3,44 + 0.06 83,2 ±0,4 9 2 0,44 ± 0,12 48 ± 10 10 19 2,35 ± 0,05 76,6 ±0,5 11 5 0,77 ± 0,04 58 ± 2 12 12 1,62 ± 0,06 69 ± 1 13 4 0,69 ± 0,04 48 ±2 H 5 (a) 40,1 . . - 15 11 1,39 ± 0,03 72 - ± 1 *6 39 4,94 ± 0,05 86,5 ± 0,2 17 7 1,06 ± 0,04 60 ± 1 18 4 (a) 4 0,1 · 19 3 0,60 + 0,04 45 ± 2 20 12 1,38 + 0,06 76 +2 21 33 geen eerste orde 22 38 4,78 ± 0,09 88,2 + 0,3 23 15 1,78 + 0,06 73 ± 1 24 51 7,5 ±0,1 86,8 ±0,2 25 9 1,24 ± 0,04 65 +1 26 10 1,38 + 0,03 66+1 27 3 (a) < 0,1 - 28 2 (a) ^ 0,1 25 33 3,98 + 0,07 85,4 + 0,4 79057»9 P2s · 3 0,55 ± 0,06 36 +3 ®®4 41 geen eerste orde ' Toxonogin . 28 ' · , . . -35- \ ïabei'. C . Percentage realetivering van door organofosfaat geremd acetylcholinesterase na incubatie met 10ywli oxim ’ bij pH 7>5 en 25°C gedurende 2 en 24 h.

--------C

' - A P S TMB . Poxonogin soutane redrtiv 'r ά ^ ring ;

OrganoxosfaaÏ"'^ 2 h 24 h 2 h. 24 h 2 h 24 h__2 h 24 h____2 h 24 h__' VX * 30 95 . 10 (18 h' , sarin* 20 65 55 70 45 85 45 65 ; r tabun 48 87 5 19 41 77 28 71

monitor " 'JO 100 65 95 90 100 90 100 ejQ

t crufornaat 76 98 57 100 55 91 48 94 10 i paraoxon ' 55 95 5° 90 70 90 75 90 15 ‘ mevinphos 37 47 18 43 1

9" ' F

"reactivator concentratie 5 ilU ' 1 i r ' ï ï t \ ; - f r ί 7905789 14 11IH 7170” SESÏÏLTATM Experimentele gegevens

Atropinesulfaat (PH.ÏJED.Vl) werd gekocht hij Brocades-Stheeman en Pharmacia, Amsterdam.

Alle proefdieren werden verkregen uit de eigen kweekstal- 5 len van het Medisch Biologisch Laboratorium TNO. De muizen behoren tot de hybride CC57 stam en wegen ongeveer 18 g. De ratten behoren tot de ¥AG stam en wegen ongeveer 170 g. Zowel van de muizen als van de ratten werden uitsluitend vrouwelijke exemplaren gebruikt. Alle doses die worden vermeld, zijn in milli- 10 liters of milligrammen per kilogram lichaamsgewicht (respectievelijk ml/kg of mg/kg).

De proefdieren die werden gebruikt in experimenten waarbij het oxim oraal werd toegediend, kregen de nacht tevoren geen·· voedsel meer. De oximen werden opgelost in gedemineraliseerd 15 water. Deze oplossingen werden toegediend in een volume van 5 ml/kg lichaamsgewicht, , De organofosfaten werden subcutaan toegediend in de vorm van oplossingen in gedemineraliseerd water (2,5 ml/kg). Tabun werd echter toegediend in een waterige oplossing die maximaal 20 7 % (vol/vol) propyleenglycol bevatte, terwijl paraoxon werd toegediend in dimethylsulfoxide (1 ml/kg).

In therapeutische experimenten met atropinesulfaat of met combinaties van atropinesulfaat en oxim, werden oplossingen van deze stoffen in gedemineraliseerd water intraperitoneaal 25 toegediend in een volume van 1 ml/kg voor de rat en in 10 ml/kg voor de muis.

Yoor intraveneuze toediening werden de oximen opgelost in water dat 0,9 % (gew/vol) natriumchloride bevatte.

7905789 15

Statistische analyse van de resultaten

Het aantal overlevende dieren werd 7 dagen na ieder experiment bepaald. Dosis-respons relaties werden berekend met behulp van de prcbit/log dosis methode. Deze relaties werden getest op lineariteit en op de significantie van de regressie. 5

De relatieve grootheid, die in de tabellen wordt vermeld a 3 "relatieve bescherming" werd berekend na aanvullende controle op de parallelliteit van de dosis-respons curven. De verhouding

LD^/ED™ is de rekenkundige verhouding van deze waarden, zoals oo jO

die werden verkregen uit twee niet-parallelle curven. 10

Resultaten

De toxieiteiten van de gebruikte organofosfaten worden vermeld in tabel D, terwijl de toxieiteiten van de oximen in tabel E worden vermeld. De oximen 1 en 4 zijn beduidend meer toxisch dan de verbinding met de formule 1, waarin X een groep 15

HeSO, voorstelt bij intraveneuze en intraperitoneale toediening. Dit kan erop wijzen dat 1 en 4 een grotere affiniteit voor het actieve centrum van cetylcholinesterase bezitten dan PgS.

Sowel PgS als 4 is veel minder toxisch bij orale toediening, wat duidt op een slechts beperkte opname van deze stoffen uit het 20 maagdarmkanaal.

Bij orale toediening blijkt 4 meer effectief profylacti-cum tegen tabun te zijn dan de conventionele oximen PgS en Toxogonin (tabel P). De profylactische effectiviteit van 4 tegen sarin en paraoxon is vergelijkbaar in grootte met die van PgS. 25

Het oxim 4 is niet profylactisch aktief tegen soman, evenmin als PgS.

By orale profylaxe tegen één bepaalde dosis tabun, blijkt dat er een veel geringere dosis van 4 clan van P^S nodig is om 50 % van de dieren te beschermen (Tabel G). 50

Behalve een effectief profylacticum, blijkt 4 ook een the-rapeuticum te zijn bij vergiftiging met organofosfaten. Uit tabel H volgt, dat een veel geringere dosering van 4 dan van P^S

7905789 16 nodig is om 50 % van de dieren te redden na vergiftiging met tabun. De berekende verhouding LD^0/ED^0 is voor het oxim 4 ongeveer driemaal gunstiger dan voor P2S.

Uit experimenten die vergelijkbaar zijn met de in tabel Ξ vermelde experimenten en waarin de oximen PgS en 4 tezamen met 5 atropinesulfaat i.p. werden toegediend 1,5 min na 0,5 mg/kg sarin s.c., kan geschat worden dat de effectieve therapeutische dosis (50 % overleving) an PgS en van 4 tegen 0,5 mg/kg sarin respectievelijk 0,5 (0,3-0,8) en 0,3 (0,1-0,8) mg/kg is. De geschatte hellingen van de dosis-respons curven waren echter zo 10 gering (resp. -1 en -0,6 probits/log) dat de EDj-q- waarden niet voldoende nauwkeurig kon worden bepaald. Deze geringe hellingen van de dosis-respons curven zijn waarschijnlijk te wijten aan de zeer snelle werking van het zenuwgas sarin, zodat de 1,5 min pauze tussen toediening van sarin en van oxim te lang is om een 15 effectieve oxim-bloedspiegel voldoende snel op te bouwen. Na het bereiken van een voldoende bloedspiegel blijken beide oximen een goede werking tegen sarin te vertonen (Zie tabel F).

Tabel D. Toxiciteit van organofosfaten in de rat na subcutane toediening 20 i

Organofosfaat LD,_0 (^/^g) (95 % waarschijnlykheidsgrenzen) tabun 0,35 (0,29 - 0,37) sarin 0,16 (0,15 - 0,16) soman 0,13 (θ,12 - 0,15) 25 paraoxon 0,39 (0,38 - 0,40) 7905789 ... _v. % 17

Sabel Ξ. Toxiciteit "van oximen.

Oxim Diersoort Toedienings- ^50 (ms/^s) Helling wijze (95% waarschijn- probits/ lijkheidsgrenzen) log P.S rat i.r. 109* 5

<L

P2S rat i.p. 260 (250-270) 31 P2S rat i.p.X2: HO (130-150) 15

PgS rat oraal 3700Xx P2S muis i.p. 170 (170-180) 24 1 rat i.p. 37 (36 - 38) 44 10 1 muis i.p. 31 (29 - 33) 21 4 rat i.v. 16(15-17) 17 4 rat i.p. 29 (17 - 30) 28 4 rat i.p.xx 26 (25 - 27) 34 4 rat oraalXX3C 1400 (1000-1800) 5 ? 9 15 x Literatuurwaarde, zie JPRS 53*615; 16 juli 1971· xx Tezamen met het oxim werd 37s5 mg/hg atropine-sulxaat toegediend.

xxx Yolume van toediening 10 ml/kg 7905789 t *

Tabel F’.. Orale profylaxe tegen organofosfaten in de rat. De oximen (100 mg/kg) werden oraal toegeuiend, 30 minuten vóór toediening(s,c.) van organofosfaat,

Aan alle dieren werd atropine sulfaat (37>5 mg/kg) toegediend (i.p.), 1,5 minuten na toediening van organofosfaat.

Organo- Profy- org.fosf.(mg/kg) - Helling Relatieve bescherming fosfaat laxe (95$ waarsch.grenzen) probits/log {<}% waarsch. grenzer tabun fys.zoutopl. 0,32 (0,30-0,34) 23 ! P2s 0,68 (0,60-0,74) 13 (1,0) | . Toxonogin 0,97 (0,84-1,10) 7,7 1,5 (1,2-1,8) j 4 4,0 (3,6 -4,'8 ) 7,3 6,0 (5,1-7,2) t sarin fys.'zoutopl. 0,19 (0,18-0,21) 15 *2S 0,76 (0,65-0,90) 6,9 (l,0) \ ' * % ï.

* °,59 (0,52-0,66) 8,1 0,78 (0,64-0,93) soman fys.zoutopl. ca. 0.15 Geen aanwijzingen voor een meetbaar effect met enig oxim P2S ca. 0.15 jL Ca. 0.15 ' paraoxon fys.zoutopl. ca. 7 "* -> 1 F2S ca· 130 4 ca. 90 ^ monitor fys.zoutopl.

PjS 79 0 5 78 9 4 > n-> -*s - •r· ·* 19

Tabel G. Effectieve orale doseringen van de oximen P^S en 4 ' tegen tabun in de rat. De oximen werden toegediend tO min vóór toedoening van tabun (s.c., 0,6 mg/kg). Atropinesulfaat werd 1,5 min nè. tabun gegeven (i.p.).

Orim ED^o van het oxim (mg/kg) Helling 5 (95 % waarschijnlijkheidsgrenzen) probits/log P2S 50 (20-45) -2,5 4 7,8 (5,3 - 10,2)' -5,1

Tabel Ξ. Therapie met de oximen PgS en 4 na intoxicatie met tabun. De oximen werden, tezamen met atropinësulfaat, toegediend 10 (i.p.) 1,5 min nè, tabun (s.c., 1 mg/kg)

Oxim EDj-a van het oxim (mg/kg) Helling (95 % waarsehijnlykheidsgrenzen) probits/log P2S 19 (14 - 24) - 5,8 4 1,2 (0,99 - 1,4) - 8,5 15

Tabel I. "Safety ratios" van de oximen PgS en 4 bij therapie van tabun-intoxicatie. De opgegeven "ratio" is die van de BD^q van het oxim (in aanwezigheid van atropine sulfaat, zie tabel E) tot die van de ED^q van het oxim bij intoxicatie met tabun (zie tabel H). 20

Oxim LD50/ED50 P2S '7,4 4 22 7905789 i -20- ! « ! APPENDIX Structuur van de in de tekst genoemde organofosfaten ; ! i i - - - 5.

> t tabun = 0-ethyl N,N-dimethylf osforamidocyanidaat,EtO(Me^N)P(0) CN.

?

sarin = 0-isopropyl methylfosfonfluoridaat, iPr0(Me)P(0)F

soman = 0-pinakolyl methylfosfonfluoridaat Pin0(Me)P(0)P - ( $ YX = 0-ethyl S-2-diisópropylaminoethyl methylfosfonthioaat, ;

Et0(Me)P(0)SCH2CH2N(iPr)2. |

paraoxon = 0,0-diethyl 0-p-nitrofenyl fosfaat, (EtO)2P(0)0CgH^-p-N02 I

methamidophos = monitor = 0,S-dimethyl fosforamidothioaat, MeO(MeS)p(o)M2· | crufornaat = 0-2-chloro-4-t-butylfenyl 0-methyl N-methylfosforamidaat, |

MeO(MeNH)P(0)OCgH^-o-Cl-p-tBu. |

mevihphos = 0,0-d.imethyl 0-(l-methyl 2-carbomethoxy)vinyl fosfaat, I

(phosdrin) (Me0)2P(0)0C(Me) = CH(COOMé). . f • | P.

- .

h ’ * ï \ i 4' r - .

*

L

ï ’ ï 7905789 fc • t ï

Claims (7)

1. 2. Verbinding volgens conclusie 1, gekenmerkt door de formule 4» waarin R^ een fenylgroep, Rg en R^ elk een water- 10 • stofatoom en Z een methaansulfonzuurrest voorstellen en de oximgroep op de 2-plaats is gebonden. 5. · Verbinding volgens conclusie 1,met het kenmerk, dat R.j een 2-thiofenylrest, R^ en beide een waterstofatoom, Z een chloride-ion voorstellen en de oximgroep op de 15 2-plaats is gebonden.
2. 4· Verbinding volgens conclusie 1, gekenmerkt doordat R„ een 5-isothiazolylgro.ep, Rn en R^ elk een waterstofatoom i . ij en Z een bromide-ion voorstellen en de oximgroep op de 2-plaats is gebonden. ' 20
3. 5· Verbinding volgens conclusie 1, gekenmerkt doordat R1 een fenylgroep, R2 een waterstofatoom, R^ een ethylgroep en Z een bromide-ion voorstellen en de oximgroep op de - y * 2-plaats is gebonden.
4. 6. Verbinding volgens conclusie 1, gekenmerkt doordat 25 R.| een p-methylfenylgroep, Rg en R^ elk een waterstofatoom en - Z een bromide-ion voorstellen en de oximgroep op de 2-plaats is gebonden. t 7905789 3—~ V
5. 7. Preparaat ter bestrijding van organofosfaatvergiftigingen, gekenmerkt door een gehalte aan een verbinding met de formule 4> waarin de symbolen de in conclusie 1 vermelde betekenis hebben.
6. 8. Gevormd preparaat, volgens conclusie 1-7· 5
7. 9. Werkwijze voor het bereiden van verbindingen met de formule 4> m e t het kenmerk, dat men een pyridine-carboxaldoxim met een (hetero)arylhalogenide omzet. 7905789 -y*- *= ^+JL_CH=NOH X- CHj L· CH=NOH CH=NOH Ó ό I I ch2-Y-CH2 z - π »- HON—CH ch2—0-ch2 4, R« CH=rNOH ¥ I z- HC — R2 7905789