NL1035244C2 - Automatisch gebalanceerde microcentrifuge device met minimotor en methode voor verzamelen en centrifugeren van bloed en voor stabiliseren en bewaren van plasma/serum in hetzelfde device. - Google Patents

Description

AUTOMATISCH GEBALANCEERDE MICROCENTRIFUGE DEVICE MET MINIMOTOR EN METHODE VOOR VERZAMELEN EN CENTRIFUGEREN VAN BLOED EN VOOR STABILISEREN EN BEWAREN VAN PLASMA/SERUM IN HETZELFDE DEVICE

BESCHRIJVING

ACHTERGROND INFORMATIE

Bloed is samengesteld uit bloedvloeistof, ook wel plasma genoemd, witte bloedcellen, rode bloedcellen en bloedplaatjes. Wanneer na afname bloed gaat stollen en fibrinogeen wordt omgezet in fibrine heet de bloedvloeistof serum. Wanneer na afname bloed wordt ontstold met gebruikelijke anticoagulantia heet de bloedvloeistof plasma. Het scheiden 5 van plasma of serum van bloedcellen is cruciaal voor klinisch chemisch en biochemisch onderzoek. Het meeste onderzoek in bloed vindt plaats in plasma of serum. Het is van groot belang dat deze scheiding van plasma/serum en bloedcellen snel, volledig en efficiënt gebeurt, zonder dat er lysis optreedt van bloedcellen. Met name lysis van rode bloedcellen heeft, enerzijds vanwege de intens rode kleur een dramatisch effect op 10 diverse analyses in plasma of serum en anderzijds vanwege een geheel andere samenstelling dan plasma een dramatisch effect op de concentratie van diverse componenten in plasma, zoals bijvoorbeeld kalium, fosfaat en LDH. Verder gaat in volbloed de metabole processen ook na bloedafname door en beïnvloedt dit de samenstelling van het plasma, zo vindt er bijvoorbeeld daling plaats van glucose, 15 pyruvaat en alanine en stijging van lactaat, 3-hydroxyboterzuur en ammoniak binnen een uur na afname. Dit onderstreept het belang van het zo snel mogelijk scheiden van bloedcellen en plasma/serum, bij voorkeur binnen een half uur. De in het laboratorium meest gebruikte methode voor scheiding van bloedcellen en plasma/serum is centrifugeren. Hiervoor wordt bloed in een buis of cup in een centrifuge krachtig 20 gecentrifugeerd (1600 - 2500 G), waarna de cellen zich onderin en het plasma/serum zich boven in de buis bevinden. Om deze scheiding te verbeteren en te voorkomen dat 1035244 2 na centrifugeren de cellen zich deels weer mengen met plasma/serum is het gebruikelijk om centrifuge buizen te gebruiken met een plasma/serum gel separator op basis van bijvoorbeeld polydimethylsiloxaan, reeds in 1981 gepatenteerd door L. Prandi (US Patent 4387031; filed july 1981) of meer recent op basis van cyclopentadiene oligomeer 5 door H. Anraku (US Patent 7090970; filed dec 2002). Deze plasma/serum separator heeft een soortelijke massa van 1.03 - 1.07 g/ml juist tussen die van plasma/serum (1.02 g/ml) en van bloedcellen (1.08 g/ml) en heeft thixotrofe eigenschappen, waardoor het na centrifugeren als Vaste massa' een afscheiding vormt tussen bloedcellen en plasma/serum.

10

De klassieke bloedafname voor het verzamelen van plasma/serum is een venapunctie in een vacuüm buis met bovenbeschreven serum/plasma gel separator. Voor het verkrijgen van plasma bevat de buis tevens een anticoagulans, bij voorkeur heparine, EDTA, citraat of oxalaat, terwijl voor het verkrijgen van serum veelal een stollingsactivator 15 wordt gebruikt. Het volume van deze klassieke bloedafname buizen is ca 4 - 10 ml, maar er zijn ook microcups met een bloedvolume van 250 - 500 μΐ. Met de huidige chemie analysers voor klinisch chemisch onderzoek in plasma/serum is echter veelal ca 2 - 10 μΐ plasma/serum nodig voor analyse en een minimum cuvetvolume van 50-100 μΐ. Het af te nemen bloedvolume kan derhalve sterk verminderd worden. Deze reductie 20 kan nog verder doorgevoerd worden door gebruik te maken van verdund plasma/serum voor analyse. Een groot aantal testen heeft voldoende sensitiviteit en lineariteit om voldoende nauwkeurig in verdund plasma gemeten te kunnen worden. Uitgaande van bloed met een hematocriet van 0,45 en een 3-maal verdunning, is een bloedvolume van 40 - 80 μΐ, overeenkomend met één a twee druppels, en een overeenkomstig 25 plasmavolume van 22 - 44 μΐ en een verdund plasmavolume van 66 - 132 μΐ ruimschoots voldoende voor ca. 4 - 10 klinisch chemische analyses.

Voor het centrifugeren van bloed in het laboratorium worden grote en zware centrifuges gebruikt, voor meerdere buizen tegelijk. Voor microcups worden kleinere tafelmodel 30 centrifuges gebruikt, voor meerdere cups tegelijk. Turvaville (US patent 5924972) beschrijft een portable lichtgewicht DC centrifuge voor twee microbuisjes met 12 V stroomvoorziening via sigarettenaansteker van de auto. Deze centrifuge vergt echter nauwkeurige balancering, welke gerealiseerd door twee recht tegenover elkaar 3 geplaatste buisjes van hetzelfde gewicht, waarvan één buisje bloed bevat en het andere buisje hetzelfde volume aan willekeurige vloeistof als contragewicht. De gehele centrifuge moet waterpas worden gezet voor gebruik. Door zijn afmeting en gewicht is het bruikbaar op kantoor of in auto van bijvoorbeeld huisarts, maar vanwege 5 complexiciteit van balanceren en waterpas zetten niet geschikt voor thuisgebruik door (ondeskundige) patiënt of cliënt.

Door bovengenoemde beperkingen is het de dagelijkse praktijk dat het bloed altijd decentraal, bijvoorbeeld in een laboratorium of eventueel bij huisarts moet worden 10 gecentrifugeerd. Vanwege het transport naar decentraal laboratorium is de tijdsduur tussen bloedafname en centrifugeren veelal meer dan twee uur of langer. Daarom wordt er voor onderzoek naar metabolieten additieven gebruikt om metabole processen te vertragen, zoals natrium fluoride voor glucose onderzoek. Dit werkt slechts ten dele en heeft verder als nadeel dat dit plasma alleen nog geschikt is voor onderzoek naar 15 glucose. Voor onderzoek naar stollingsfactoren wordt het bloed meestal ontstold met citraat, maar treedt er desalniettemin stollingsactivatie op als niet binnen een uur het citraatplasma van de bloedcellen wordt gescheiden. De meest ideale oplossing is derhalve een microcentrifuge die ook geschikt is voor thuisgebruik door (ondeskundige) patiënt of cliënt, bij voorkeur met dusdanige afmetingen dat deze per post kan worden 20 verstuurd.

Er is een veelheid aan patenten verschenen die technieken beschrijven voor 'micro bloed verzameling’ en scheiding van plasma gekoppeld aan een analytisch device voor het meten van bijvoorbeeld cholesterol of glucose, de zgn. 'point of care testen' of 'thuis 25 testen'. Ervaring uit de praktijk leert dat de juistheid en precisie van deze testen veelal onvoldoende is voor diagnostisch gebruik en de ontwikkeling van nieuwe testen complex en duur is. Slechts een beperkt aantal testen zijn in de vorm van 'point of care testen' of 'thuis testen' commercieel beschikbaar. Verder is in het algemeen voor elk soort analyse een nieuw type meter nodig.

30 Bij het merendeel van deze devices wordt gebruik gemaakt van diverse soorten filters voor scheiding van plasma/serum en bloedcellen (US patents 5064541; 5266219; 5423989; 5262067). Zulke filters bestaan meestal uit glasfiber materiaal met een poriegrootte die zo gekozen is dat bloedcellen in het filter achterblijven en plasma kan 4 worden opgevangen in een absorptiefilter. Het nadeel van deze methode is dat slechts een deel van het plasma eenvoudig kan worden opgevangen, en de rest achterblijft in het filter. Om de scheidingsefficiency en de recovery van het plasma te verhogen worden diverse technieken toegepast: toevoegen van een agglutinerend middel 5 beschreven door bijvoorbeeld Jeng (US Patent 5064541), Sand (US Patent 5118428) en Wilk (US Patent 5262067), zoals zuren, lectins, polylysine of rode bloedcel antistoffen, waarbij de retentie van rode bloedcellen in het separatiefilter wordt verhoogd; agglutinerend middel geconjugeerd aan kunststof deeltjes, waarbij grotere agglutinaten voor meer retentie van de rode bloedcellen zorgt (Patent 5652148); agglutinerend 10 middel geconjugeerd aan metaal deeltjes, waarbij een magnetisch veld de geagglutineerde deeltjes wegvangt (Murto, WO/2002/029406). Daarnaast beschrijft Zander (US Patent 6194138) de toevoeging van gelatine en andere additieven om de plasmaflow door het filter te verhogen. Dit alles leidt echter in het algemeen nog tot te geringe plasma opbrengst. Vaak wel voldoende voor de devices waarbij aan het 15 separatiefilter een geïntegreerd analytisch systeem is gekoppeld, zoals bijvoorbeeld directe glucose meting op de filterstrip. Wanneer echter het plasma verzameld moet worden voor decentraal uit te voeren diagnostische testen worden nog hogere eisen gesteld aan de kwaliteit, snelheid en efficiëntie van de plasmascheiding. Recent is voor dit doel door De Rooij (US patent 6245244; NL Patent 1002296) een combinatie van 20 technieken en additieven beschreven om ca 80 % plasma op te kunnen vangen: een agglutinerend middel, verdunning van plasma en een subatmosfere druk in de buis achter het filter om plasma hieruit te zuigen. Voor een aantal analyses kan echter geen gebruik worden gemaakt van verdund bloed of verdund plasma. Aan klinisch chemische analyses voor componenten die binnen nauwe grenzen in het bloed gereguleerd worden, 25 dus een geringe biologische variatie kennen zoals natrium, calcium, albumine en magnesium, worden zeer hoge analytische eisen gesteld. Verdunning van plasma tijdens afname kan dan leiden tot ontoelaatbare toename in onnauwkeurigheid. Ook kan voor een aantal analyses geen gebruik worden gemaakt van verdund plasma/serum vanwege verandering in vrij en gebonden fractie van de te meten stof, zoals vrij thyroxine, vrij 30 trijood thyronine, testosteron en cortisol. Verdunning kan ook leiden tot een ontoelaatbaar verlies aan sensitiviteit, zoals bij serologische testen voor HIV en hepatitis. Voor stollingsonderzoek mag slechts een minimale verdunning plaats vinden 5 van 1:9 met citraat, hetgeen in filterscheidingstechnieken niet of moeilijk realiseerbaar is.

In die gevallen waarbij wel verdund plasma kan worden gebruikt moet de verdunningsfactor van het bloed vastgesteld worden. Deze verdunningsfactor kan op 5 twee manieren worden vastgesteld: a. Een exact bekend bloedvolume mengen met een exact bekend buffervolume. In de praktijk kan hierbij gebruik worden gemaakt van gekalibreerde 'end to end' capillairen voor het bloedvolume en van vooraf gepipetteerd buffervolume in het device. Dit vereist echter zorgvuldig en deskundig gebruik van 'end to end' capillairen en is derhalve gevoelig voor verdunningsfouten. Complicerend 10 hierbij is tevens dat de verdunningsfactor afhankelijk is van het hematocriet en deze dus bekend moet zijn. b. Een willekeurig bloedvolume mengen met een verdunningsbuffer met exact bekende hoeveelheid volumekalibrator. In de praktijk kan voor een volumekalibrator gebruik worden gemaakt van een stabiele en eenvoudig in plasma te meten stof die zich alleen verdeelt in het plasma en niet in het intracellulaire 15 compartiment. Een andere methode om een klein volume plasma nauwkeurig te verkrijgen is beschreven door Jeng (US Patent 5064541) waarbij in een opvangfïlter een reproduceerbare hoeveelheid plasma per oppervlakte eenheid wordt opgenomen. Vanwege indroging is dit niet stabiel gedurende langere periode en niet geschikt voor transport en decentrale analyse. Hetzelfde principe wordt toegepast bij de opvang van 20 volbloed in de zgn. 'dried blood spot' filter, momenteel gebruikt voor neonatale screening, waarbij het bloed juist wel wordt gedroogd en stabiel is gedurende langere periode. Een pons uit de gedroogde bloed spot met nauwkeurig vastgesteld oppervlak bepaald het bloedvolume in de pons. Na extractie van bloed uit het filter kunnen hier klinisch chemische analyses in worden uitgevoerd. Er zijn echter een aantal nadelen 25 verbonden aan de dried blood spot' methode: 1. er treedt een chromatografisch effect op als het bloed zich door het filter verspreid zodat de concentratie van te meten componenten niet overal exact gelijk is in het filter, 2. kan alleen gebruikt worden voor volbloed/hemolysaat metingen, 3. concentratie van te meten componenten wordt beïnvloed door hematocriet van het bloed. Deze nadelen maakt de ’dried blood spot’ 30 methode ongeschikt voor klinisch chemische analyses waarbij hoge eisen worden gesteld aan juistheid en precisie.

6

Derhalve is het mijn doel om een kleine en lichtgewicht microcentrifiige te ontwikkelen inclusief ingebouwde balanceer techniek, waarbij het verzamelen van bloed, scheiden van plasma/serum van bloedcellen en (langdurig) opslag voor transport, in één en hetzelfde device plaatsvinden. Daarnaast is het mijn doel om het verkregen 5 serum/plasma langdurig te stabiliseren zodat ook na transport alle componenten in serum/plasma nog gemeten kunnen worden met de huidige hoge eisen aan juistheid en precisie.

GEDETAILLEERDE BESCHRIJVING

10 De hier beschreven vinding is gericht op het oplossen van bovengenoemde problemen die zich voordoen bij de huidige werkwijze van bloedafname en scheiding van bloed in plasma/serum en bloedcellen. Het doel is om een device en een methode te ontwikkelen voor eenvoudig door patiënt of cliënt thuis zelf verzamelen van bloed, scheiden van plasma/serum en bloedcellen, stabiel bewaren van plasma/serum voor transport en 15 daarna per post versturen naar een laboratorium voor analyse. Hiervoor is een automatisch gebalanceerde microcentrifuge device ontwikkeld voor zowel verzamelen van bloed, scheiden van plasma/serum en bloedcellen door centrifugeren en stabiele opslag voor transport, in één en hetzelfde device. Het resultaat is een scheidingsmethode met een opbrengst van nagenoeg 100 % plasma/serum, langdurig 20 stabiel bij kamertemperatuur. Het geheel kan via reguliere post verstuurd worden naar een laboratorium, waar de analyses kunnen worden uitgevoerd in plasma/serum met state of the art geavanceerde en goed gekalibreerde en gecontroleerde apparatuur.

Om de eigenschappen van deze vinding verder te verduidelijken en om bijkomende 25 voordelen en bijzonderheden ervan aan te duiden volgt nu een meer gedetailleerde beschrijving van de microcentrifiige device volgens de uitvinding. Het weze duidelijk dat niets in de hierna volgende beschrijving geïnterpreteerd kan worden als een beperking van de in de conclusies opgenomen bescherming voor deze uitvinding.

30 In de bijgevoegde figuren zijn de details van een prototype weergegeven van de microcentrifuge device, waarbij de cijfers tussen haakjes in de tekst verwijzen naar de cijfers in de tekeningen, waarbij: figuur 1 een bovenaanzicht is van de gehele microcentrifuge device.

7 figuur 2 een gedeeltelijke doorsnee is van de microcentrifuge device figuur 3 detailtekeningen met dwarsdoorsnede zijn van huishouder figuur 4 een bovenaanzicht van rotor met centrifugebuis 5 In overeenstemming met een specifiek aspect van de microcentrifuge device is de constructie van de rotor (1), de buishouder (2) en de centrifugebuis (3). Door de centrifugebuizen (3) recht tegenover elkaar onder een hoek te plaatsen ten opzichte van de as (4) van de minimotor, bij voorkeur een hoek van 90°, is de afstand tussen de beide centrifugebuizen het grootst en wordt maximaal gebruik gemaakt van de 10 centrifugaalkracht en is sprake van maximale stabiliteit tijdens centrifugeren. Deze constructie kan op dezelfde wijze uitgebreid worden met meerdere centrifugebuizen recht tegenover elkaar. Door de microcentrifuge device verticaal te plaatsen op een minimotor of high speed rotary tooi en axiaal te centrifugeren gedurende ca. 0,5 tot 5 minuten, bij voorkeur ongeveer 1 minuut en afhankelijk van de afstand tussen beide 15 centrifugebuizen bij 10.000 tot 60.000 rpm, bij voorkeur ongeveer 20.000 rpm ontstaat er optimale scheiding tussen bloedcellen en serum/plasma. De thixotrofe separatie gel (5) in de centrifugebuizen (3) voorkomt terugstromen van bloedcellen en mengen met plasma/serum na centrifugeren. De state of the art gebruikte gel is een thixotrofe gel, die in commercieel verkrijgbare centrifugebuizen wordt geleverd door diverse firma's zoals 20 Becton Dickinson, Sekisui, Terumo, Kabe of Greiner. De centrifugebuis (3) wordt geklemd om het buisvormige uitstekende deel (6) van de buishouder (2). De buishouder (2) met centrifugebuis (3) wordt van bovenaf in de daarvoor beschikbare ruimte (7) in de rotor (1) geschoven. Het onderste deel van de buishouder (8) wordt geklemd tegen een opstaande binnenrand (9) van de rotor (1), terwijl de bovenrand (10) van het 25 centrifugebuis exact past in de inkeping (11) van de rotor (1). Een uitsparing (12) aan de bovenkant van de buitenrand van de rotor (1) zorgt ervoor dat de centrifugebuis (3) van boven geklemd wordt en niet naar boven kan bewegen bij hoge rotatiesnelheden. In de praktijk blijkt dat deze constructie van de microcentrifuge device leidt tot grote stabiliteit tijdens centrifugeren met behulp van minimotor of high speed rotary tooi, 30 waarbij een trillingvrije rotatie wordt waargenomen onder alle mogelijke posities en houdingen, en het zelfs niet nodig is de microcentrifuge rechtop te houden. Dit is een groot voordeel ten opzichte van de huidige bloedcentrifuges die handmatig gebalanceerd moeten worden, rechtop en waterpas moeten staan. Dit biedt veel 8 voordelen bij (ondeskundig) thuisgebruik door patiënt of cliënt. Verder zijn met deze microcentrifuge en deze methode van plasma/serum scheiding veel problemen opgelost die zich voordoen met filterscheiding: volledige recovery van plasma/serum; langdurige stabilisatie van gevormd plasma/serum (zie hieronder); kan worden gebruikt voor zowel 5 verdund als onverdund plasma/serum; is het geschikt voor elk metabool onderzoek zonder gebruik te maken van metabole remmers; er vindt geen chromatografisch effect plaats en het is onafhankelijk van het hematocriet, dit in tegenstelling tot gebruik van volbloed in 'dried blood spot' filters.

De microcentrifuge device wordt gemaakt van bijvoorbeeld polycarbonaat of 10 polyethylene terephthalate (PET) of elk ander geschikte kunststof of lichtgewicht materiaal. De rotor (1) wordt via een tussenstuk of adapter op de as van een minimotor of high speed rotary tooi geplaatst en kan na centrifugeren, eventueel na transport, worden afgekoppeld. De minimotor of high speed rotary tooi en de rotor (1) met doos en veiligheidsdeksel worden hergebruikt, terwijl de huishouders (2) en de 15 centrifugebuizen (3) disposable zijn. Voor de huidige toepassing is gebruik gemaakt van een commercieel verkrijgbare centrifugebuis van de firma Kabe Labortechnik (Duitsland) type GK 150 met diverse anticoagulantia en met separatie gel. Het brede deel (13) van deze centrifugebuis (3) wordt opgevuld door het buisvormige uitstekende deel (6) van de huishouder (2), waardoor de resterende ruimte van het smalle deel (14) 20 van de centrifugebuis (3) ongeveer 250 μΐ is. De minimotor is een DC minimotor die via een adapter aan het elektriciteitsnet of via een (oplaadbare) batterij wordt gevoed. De DC minimotor kan een commercieel verkrijgbare minimotor zijn met afmetingen van ongeveer 1 tot 3 cm hoogte, bij voorkeur ongeveer 2 cm. Als alternatief kan het ook een commercieel verkrijgbare high speed rotary tooi zijn zoals een Dremel® van de 25 firma Bosch. De minimotor bevat een aan-uit schakelaar met variabele of vastgestelde centrifugetijd. De microcentrifuge device wordt beschermd door een beschermkap die eventueel na sluiten de minimotor automatisch activeert. Het gehele microcentrifuge device in doos met beschermkap en minimotor heeft geringe afmetingen, bij voorkeur maximaal ongeveer 10 x 10 x 3 cm (1 x b x h), in ieder geval zodanig dat het op elke 30 locatie zoals bijvoorbeeld thuis of artsenpraktijk gebruikt kan worden voor plasma/serum bereiding en per reguliere post verstuurd kan worden naar een laboratorium. In het laboratorium kan het verzamelde en opgestuurde plasma/serum worden geanalyseerd met de meest geavanceerde state of the art en goed gekalibreerde 9 en gecontroleerde apparatuur. De juistheid en precisie van deze apparatuur is in veel gevallen beter dan van de huidige 'point of care’ meters en thuismeters, zoals glucose meters, PSA meters, TSH meters, etc. Verder heeft het als groot voordeel dat er met de huidige laboratoriumapparatuur meerdere bepalingen, met een keuze uit een groot en 5 divers aanbod van enkele honderden testen, uit dezelfde druppel(s) plasma/serum gemeten kunnen worden. De hier beschreven microcentrifuge device is universeel en geschikt voor het bereiden en verzamelen van zowel serum als alle soorten plasma, in zowel verdunde als onverdunde vorm.

10 In overeenstemming met een ander aspect van de microcentrifuge device is de constructie voor het verzamelen van bloed. De bovenkant van de capillaire buis voor bloeddoorvoer (15) is voorzien van een flexibele cup (16) met een holle ruimte waar juist een vingertop met de druppel bloed inpast. Deze holle ruimte heeft een doorsnee van 3 - 9 mm, bij voorkeur 5-7 mm en een diepte van 2-8 mm, bij voorkeur 4-6 mm. 15 Door deze constructie wordt de druppel bloed aan de vinger eenvoudig en hygiënisch in het capillair geleid. Om tijdens het vullen met bloed overdruk in de centrifugebuis (3) te voorkomen is een kleine inkeping (17) van ongeveer 0,1 - 0,4 mm, bij voorkeur 0,2 mm, aangebracht aan de bovenkant op de beide buisvormige uitstekende delen (6) van de huishouder (2), die functioneren als ontluchtingsopeningen (17). Dit bevordert een 20 snelle en spontane bloedstroom in het bloeddoorvoer capillair naar de centrifugebuizen (3).

In overeenstemming met een specifiek aspect van de microcentrifuge device is de constructie van het vloeistofreservoir (18) met een capillaire buis (19) tussen 25 centrifugebuis (3) en vloeistofreservoir (18) en een ontluchtingsopening (20) enerzijds uitmondend aan de bovenkant van de huishouder (2) en anderzijds uitmondend in het vloeistofreservoir (18). Het vloeistofreservoir (18) wordt vooraf gevuld met balanceervloeistof (zie hieronder) via de ontluchtingsopening (20). Door deze constructie kan bij gesloten ontluchtingsopeningen (17 en 20) en gesloten capillaire buis 30 voor bloeddoorvoer (15) de balanceervloeistof langdurig in het vloeistofreservoir (18) worden bewaard zonder in contact te komen met de separatiegel (5) in de centrifugebuizen (3). Na openen van bovenste ontluchtingsopening (17) en capillaire buis voor bloeddoorvoer (15) kunnen één of meerdere druppels bloed worden 10 ingebracht zonder dat balanceervloeistof uit het vloeistofreservoir (18) stroomt ongeacht de houding van de microcentrifuge device. Direct na het begin van het centrifugeren zal onder invloed van de centrifugaalkracht de balanceervloeistof met eventueel andere vloeistoffen uit het vloeistofreservoir (18) in de centrifugebuis (3) stromen. Vanwege 5 het iets grotere volume van het vloeistofreservoir (18) ten opzichte van het voor vloeistof beschikbare volume van de centrifugebuis (14) zal de overmaat aan balanceervloeistof via de bovenste ontluchtingsopening (17) wegstromen. Vanwege de lage soortelijke massa bevindt zich deze balanceervloeistof tijdens het centrifugeren vóór de plasma/serum laag en voorkomt dit hiermee uitstroom van bloed en/of 10 plasma/serum via de bovenste ontluchtingsopening (17). De centrifugebuizen (3) zijn derhalve tijdens centrifugeren altijd volledig gevuld. Dit garandeert een trillingsvrije rotatie tot een rotatiesnelheid tot maximaal 60.000 rpm. Eén van de unieke aspecten van deze vinding is het op bijzonder eenvoudige wijze automatisch balanceren van de microcentrifuge device zonder hiervoor enige handelingen te hoeven uitvoeren, een 15 groot voordeel ten opzichte van de meeste huidige centrifuges. Een optimale balancering verhoogt de scheidingsefficiency, verbetert de levensduur van de minimotor en veroorzaakt minder geluid. Daarna kan na centrifugeren het gevormde plasma/serum samen met de balanceervloeistof terugstromen in het vloeistofreservoir (18). Na afsluiten van ontluchtingsopeningen (17 en 20) en capillaire buis voor bloeddoorvoer 20 (15) kan het plasma/serum samen met de balanceervloeistof (langdurig) in het vloeistofreservoir (18) worden bewaard, waarbij de balanceervloeistof tevens dient als plasma/serum stabilisator (zie hieronder voor meer details). Het openen en sluiten van ontluchtingsopeningen (17 en 20) en capillaire buis voor bloeddoorvoer (15) kan door middel van indrukken van flexibele cup (16) met afsluitrand (21) of een stop, plug, 25 afsluitklep of elk ander mechanisme. De voordelen van deze constructie zijn dat: a. de vloeistoffen in het vloeistofreservoir (18) niet (langdurig) in contact komen met de thixotrofe gel (5) in het centrifugebuis (3) en tijdens bewaren geen interactie kan aangaan met deze gel; b. de vloeistoffen in het vloeistofreservoir (18) luchtdicht zijn afgesloten er geen verdamping kan plaatsvinden, zodat bijvoorbeeld buffer met 30 volumekalibrator of antistolmiddelen stabiel hierin kunnen worden bewaard, c. tijdens het vullen met bloed de bovenste ontluchtingsopening (17) niet kan worden afgesloten met aanwezige vloeistoffen in de centrifugebuis en bloeddoorvoer niet kan verhinderen, d. tijdens het vullen met bloed er geen vloeistoffen kunnen weglekken via de 11 ontluchtingsopening (17). Een alternatieve constructie waarbij bijvoorbeeld een capillaire buis voor bloeddoorvoer verticaal is geplaatst en rechtstreeks uitmondt in een groter vloeistofreservoir heeft als voordeel dat het bloed sneller naar binnen stroomt, maar heeft als nadeel dat tijdens bloedafname vloeistoffen uit het vloeistofreservoir 5 kunnen lekken. Hierna kan de gehele microcentrifuge device worden verstuurd naar een laboratorium voor analyse. In het laboratorium kunnen de huishouders (2) met centrifugebuizen (3) eenvoudig van de rotor (1) worden afgeschoven en vervolgens kan vervolgens de huishouder (2) uit de centrifugebuis (3) worden genomen en met een dop afgedicht tot analyse. Eventueel kan ook het plasma/serum via de ontluchtingsopening 10 (20) uit het vloeistofreservoir (18) worden gepipetteerd. Om dit te vereenvoudigen is een insparing (22) gemaakt aan de onderkant van het vloeistofreservoir (18).

In overeenstemming met een ander specifiek aspect van de microcentrifuge device is het gebruik van een specifieke balanceervloeistof in het vloeistofreservoir (18) en een 15 methode voor automatisch balanceren van de microcentrifuge device. De balanceervloeistof is een apolaire vloeistof die niet mengt met plasma/serum en voldoet aan de volgende fysische kenmerken: absorbeert geen water en mengt niet met plasma/serum; neemt geen componenten op uit plasma/serum; is vluchtig; heeft lage soortelijke massa en drijft op de plasma-/serumlaag en sluit deze luchtdicht af. In de 20 huidige toepassing gebruiken we daarvoor het vluchtige ‘pure silicone fluid’ (Dow Coming 200 fluids) met een super lage viscositeit van bijvoorbeeld 0.65, 1.0,1.5, 2 of 3 cSt, bij voorkeur 1 cSt en een lage soortelijke massa van < 0.90 g/ml. Het totaal volume van de vloeistofreservoir (18) met ‘pure silicone fluid’, is tenminste 10 tot 100 μΐ, bij voorkeur ongeveer 20 μΐ, meer dan het volume van de vrije ruimte in de centrifugebuis 25 (14). Op deze wijze wordt direct na het begin van het centrifugeren de beide, één of enkele druppels bloed bevattende, centrifugebuizen aangevuld met de ‘pure silicone fluid’. Vanwege de lage soortelijke massa bevindt de ‘pure silicone fluid’ zich tijdens centrifugeren als voorste laag op de waterige vloeistoffen. Hierdoor ontstaan achtereenvolgens vier verschillende lagen; bloedcellen, thixotrofe gel (5), serum/plasma 30 eventueel gemengd met buffer of andere waterige vloeistoffen en tenslotte 'pure silicone fluid'. Door deze constructie verdwijnt, direct na het begin van het centrifugeren, alleen het overtollige 'pure silicone fluid' via de bovenste ontluchtingsopening (17). Een bijkomend voordeel van de hierboven beschreven 'pure 12 silicone fluid' is dat het op het plasma/serum drijft en hiermee een luchtdichte afscherming geeft en verdamping volledig tegengaat. Verdamping is een groot probleem wanneer zeer kleine volumina langdurig bewaard moeten worden. In Tabel 1 is te zien dat een klein volume heparineplasma van 100 μΐ gedurende 9 dagen bij 5 kamertemperatuur in een open cuvet afgedekt met 200 μΐ 'pure silicone fluid', een stabiel volume behoudt, afgeleid van stabiele concentraties van diverse plasma componenten gedurende deze periode. In een niet afgesloten microbuis was ten gevolge van verdamping al na 1 dag een toename in concentratie of activiteit waarneembaar van alle componenten van ongeveer 35 % (Tabel 1). Verder geven deze resultaten aan dat er 10 geen absorptie van water plaatsvindt door de 'pure silicone fluid' en dat er geen interferentie is tussen componenten uit het plasma/serum en de 'pure silicone fluid'. Een tweede bijkomend voordeel is dat er, zelfs na 9 dagen bewaren bij kamertemperatuur, geen stolsel vorming was waar te nemen in gehepariniseerd plasma. Het is een bekend gegeven uit de praktijk dat de activiteit van heparine in bij kamertemperatuur bewaard 15 plasma vermindert en er (micro)stolsels kunnen ontstaan, tevens kan er na ongeveer drie dagen een gelatineachtige massa ontstaan. Zelfs geringe microstolsels kunnen technische problemen en grote analytische fouten geven bij het pipetteren in geautomatiseerde analyse apparatuur. Gebruik van de genoemde ‘pure silicone fluid’ verhoogt de houdbaarheid van heparine plasma met minstens 9 dagen en voorkomt 20 stolselvorming en zorgt ervoor dat het plasma volledig vloeibaar blijft. Dit zijn belangrijke voordelen die transport bij kamertemperatuur mogelijk maken.

In overeenstemming met het brede aspect van de huidige vinding kan de microcentrifuge device een stollingsactivator bevatten om stolling (fibrinevorming) te 25 versnellen voor het verkrijgen van serum of een antistolmiddel om fibrinevorming tegen te gaan voor het verkrijgen van plasma. Het antistolmiddel kan zich bevinden in de capillaire buis (15) voor bloeddoorvoer en/of in de centrifugebuis (3) en/of in het vloeistofreservoir (18), in gedroogde vorm of opgelost in een buffer. Het antistolmiddel is bij voorkeur één van de gangbare middelen met gebruikelijke concentraties, zoals 30 heparine, EDTA, citraat of oxalaat. Verder is er door het gebruik van twee capillaire buizen (15) voor bloeddoorvoer naar elk van de centrifugebuizen (3) de mogelijkheid om twee verschillende antistolmiddelen te gebruiken en bij één bloedafname twee 13 verschillende soorten plasma's te verzamelen. Hierdoor ontstaat een universele en breed toepasbare methode voor het verzamelen van zowel serum als alle soorten plasma.

Het is vanzelfsprekend dat diverse veranderingen en modificaties op de hier beschreven 5 en voorgestelde vindingen mogelijk zullen blijken te zijn door deskundigen binnen dit vakgebied. Zulke veranderingen en modificaties kunnen worden gemaakt binnen de kaders van de beschreven vindingen zonder de letter en de geest van de beschreven vindingen te verlaten en zonder de beschreven bijgaande voordelen in te perken. Het is de nadrukkelijke bedoeling dat zulke veranderingen en modificaties worden gecoverd 10 door de in dit octrooi beschreven conclusie.

1035244

Claims (16)

1. Microcentrifuge device voor het verzamelen van bloed, scheiden van bloed in plasma/serum en bloedcellen, en stabiel bewaren van plasma/serum, met het kenmerk dat de genoemde microcentrifuge device een rotor (1), minstens twee huishouders (2) en minstens centrifugebuizen (3) omvat, waarbij exact midden 5 onder de rotor (1) ruimte voor een as (4) is gemaakt voor aansluiting op een minimotor of high speed rotary tool met batterijvoeding, zodat microcentrifuge device in zijn geheel bij hoge snelheid axiaal kan worden gecentrifugeerd.

2. Microcentrifuge device volgens conclusie 1 met het kenmerk dat de genoemde 10 huishouders (2) een buisvormig uitstekend deel (6) omvat voor daaromheen passende centrifugebuis (3), een capillaire buis (15) voor bloeddoorvoer en een vloeistofreservoir (18) omvat voor respectievelijk vullen van centrifugebuis (3) met bloed en opslag van diverse vloeistoffen.

3. Microcentrifuge device volgens conclusie 1 met het kenmerk dat de genoemde rotor (1) uitsparingen (7) omvat voor daarin passende huishouder (2) en uitsparingen (11) omvat voor daarin passende centrifugebuis (3) en precies middenonder ruimte omvat voor een as (4) voor aansluiting op bij conclusie 1 genoemde minimotor of high speed rotary tooi. 20

4. Microcentrifuge device volgens conclusie 1 met het kenmerk dat de genoemde centrifugebuizen (3), een thixotrofe plasma/serum separator gel (5) omvat voor scheiden en gescheiden houden van plasma/serum en bloedcellen. De genoemde centrifugebuizen (3) kunnen tevens commercieel verkrijgbare disposable 25 microcentrifuge buisjes zijn, met daarin eventueel een antistolmiddel, zoals één van de state of the art gebruikte middelen met gebruikelijke concentraties, bijvoorbeeld heparine of EDTA voor verkrijgen van plasma, of een stollingsactivator voor verkrijgen van serum.

5. Microcentrifuge device volgens conclusie 2 met het kenmerk dat de genoemde capillaire buis (15) één van de state of the art gebruikte antistolmiddelen kan 1035244 omvatten met gebruikelijke concentraties, zoals bijvoorbeeld heparine of EDTA voor vroegtijdig ontstollen van bloed.

6. Microcentrifuge device volgens conclusie 2 met het kenmerk dat de genoemde 5 vloeistofreservoir (18) een aan de bovenzijde geplaatste ontluchtingsopening (20) omvat en een capillaire buis (19) uitmondend onderin de centrifugebuis (3) omvat, welke vóór centrifugeren dient als reservoir voor balanceervloeistof voor het automatisch balanceren van de device en als reservoir voor een eventueel vloeibaar antistolmiddel of andere vloeibare additieven en na centrifugeren dient als opvang- 10 en bewaarreservoir voor (verdund) plasma/serum en stabilisator.

7. Microcentrifuge device volgens conclusie 6 met het kenmerk dat het genoemde vloeibaar antistolmiddel citraat of oxalaat is of een ander gebruikelijk antistofmiddel met gebruikelijke concentraties.

8. Microcentrifuge device volgens conclusie 6 met het kenmerk dat de genoemde balanceervloeistof ‘pure silicone fluid’ (Dow Coming 200 fluids) is met super lage viscositeit van 0.65, 1.0, 1.5 of 2 cSt, bij voorkeur 1 cSt, met vluchtigheid dat hoger is dan water en soortelijke massa dat lager is dan water, of een andere niet met water 20 mengbare vloeistof met vergelijkbare fysische eigenschappen.

9. Microcentrifuge device volgens conclusie 8 met het kenmerk dat de genoemde ‘pure silicone fluid’ tevens functioneert als plasma/serum stabilisator voor het langdurig stabiel houden van plasma/serum bij kamertemperatuur zonder verandering van 25 activiteit of concentratie van te meten componenten.

10. De constructie van de bij conclusie 1 tot en met 9 genoemde microcentrifuge device gekoppeld aan een met batterij gevoede minimotor of high speed rotary tooi voor het centrifugeren van het bloed. 30

11. De constructie van de bij één van voorgaande conclusies genoemde centrifugebuizen (3) die exact tegenover elkaar geplaatst zijn aan de bij voorgaande conclusies genoemde huishouders (2) die als één geheel in de bij voorgaande conclusies genoemde rotor (1) zijn geplaatst en waarbij de rotor via een as exact middenonder aan de bij voorgaande conclusies genoemde minimotor of high speed rotary tooi is gekoppeld, waardoor genoemde microcentrifuge device trillingsvrij centrifugeert tot een maximum van ongeveer 60.000 rpm.

12. De constructie van de bij één van voorgaande conclusies genoemde capillaire buis (15) voor bloeddoorvoer met hier bovenop een flexibele cup (16) geplaatst met holle ruimte waar precies een vingertop in past en de bij één van voorgaande conclusies genoemde ontluchtingsopening (17) enerzijds uitmondend aan de bovenkant van de huishouder (2) en anderzijds uitmondend in de holle ruimte (14) van de 10 centrifugebuis (3), waardoor een bloeddruppel uit een vingertop eenvoudig en hygiënisch via de capillaire buis (15) in de centrifugebuis (3) kan stromen.

13. De constructie van het bij één van voorgaande conclusies genoemde vloeistofreservoir (18), die een capillaire buis (19) heeft tussen centrifugebuis (3) en 15 vloeistofreservoir (18) en die een ontluchtingsopening (20) heeft enerzijds uitmondend aan de bovenkant van de huishouder (2) en anderzijds uitmondend in het vloeistofreservoir (18), waarbij door middel van openen en sluiten van de ontluchtingsopeningen (17 en 20) het vloeistofreservoir (18) vóór centrifugeren dienst doet als reservoir voor balanceervloeistof en na centrifugeren als reservoir 20 voor plasma/serum tezamen met bij conclusie 9 genoemde stabilisator.

14. Een methode voor het verzamelen van kleine hoeveelheden bloed, scheiden van het bloed in plasma/serum en bloedcellen en langdurig stabiel bewaren van het gevormde plasma/serum in één en hetzelfde bij conclusie 1 tot en met 9 genoemde 25 microcentrifuge device.

15. Een methode voor langdurig stabiel bewaren van plasma/serum bij kamertemperatuur zonder verlies of afname van te meten componenten gebruik makend van de bij conclusie 8 en 9 genoemde ‘pure silicone fluid'. 30

16. Een methode voor het automatisch balanceren van de bij conclusie 1 tot en met 9 genoemde microcentrifuge device, waarbij onbalans door inbrengen van verschillende hoeveelheden bloed in de centrifugebuizen wordt gecorrigeerd door, direct na het begin van het centrifugeren, instromen van een overmaat aan balanceervloeistof vanuit het vloeistofreservoir (18) in de centrifugebuis (3) en door vervolgens automatisch uitstromen van de overtollige balanceervloeistof via de bovenste ontluchtingsopening (17), zodat ongeacht het ingebrachte bloed volume de centrifugebuizen altijd volledig met vloeistof zijn gevuld en hierdoor optimaal zijn 5 gebalanceerd. GECITEERDE PATENTEN