NL1018211C2 - Het winnen van een stress-eiwit. - Google Patents

Description

t

Titel: Het winnen van een stress-eiwit

De uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het verhogen van het stress-eiwit gehalte in een vloeistof, op een stress-eiwit product en op het gebruik ervan.

Stress-eiwitten (ook wel chaperon-eiwitten genoemd) worden door 5 micro-organismen, planten en dieren gevormd wanneer ten gevolge van een verandering in de omgeving, zoals blootstelling aan hitte, straling of chemicaliën, zogenaamde stress-gevoelige genen tot expressie komen. Volgens huidige inzichten kunnen dergelijke eiwitten bijdragen aan een bescherming tegen schadelijke effecten ten gevolge van dergelijke 10 omgevingseffecten. Om die reden staat het gebruik van stress-eiwitten in grote belangstelling van onder andere de geneeskunde, de moleculaire biologie, de cosmetische industrie en de gewasbeschermingsmiddelen producerende industrie.

Het is bekend dat stress-eiwitten een aantal belangrijke 15 natuurlijke therapeutische functies hebben in planten en dieren, inclusief mensen. Deze eiwitten betrokken als regulator van eiwitsynthese en eiwitvouwing. Daarnaast ligt een belangrijke functie in de regulatie van genfunctie tijdens groei, maar ook tijdens celdood. De stress-eiwitten zijn in staat zowel humane als dierlijke immuunsystemen te stimuleren en uit 20 klinisch onderzoek is gebleken dat de chaperon eiwitten een positieve bijdrage hebben in de bestrijding van kanker.

De beschikbaarheid van stress-eiwitten, zoals HSP70, is echter een probleem, omdat deze veelal worden geïsoleerd uit runderhersenen. Naast de geringe hoeveelheden die hieruit kunnen worden geïsoleerd en de daarbij 25 gepaard gaande extreem hoge kostprijs, is de mogelijke aanwezigheid van BSE in hersenen een grote hindernis voor het gebruik van deze eiwitten. HSP 70 kan ook gewonnen worden uit micro-organismen en kankercellen, 101 8.Π 2 maar ook deze productiewijzen zijn duur en geven slechts een lage opbrengst.

Alternatieven voor de productie van de stress-eiwitten, met name voor medische toepassingen, liggen op het gebied van de productie van fusie-5 eiwitten met behulp van expressiesystemen. Deze relatief gecompliceerde manier van productie maakt het mogelijk om de stress-eiwitten te verkrijgen zonder de risico’s die het gebruik van runderhersenen heeft. Mogelijke problemen die kunnen blijven bestaan zijn de hoge kostprijs en de kleine hoeveelheden die geproduceerd kunnen worden.

10 Stress-eiwitten van plantaardige origine zouden een alternatief kunnen bieden. Aangezien de productie van de stress-eiwitten afhankelijk is van de toestand waarin de cel zich bevindt, kan door verandering van de omstandigheden buiten de cel, de synthese van de stress- eiwitten in de plantencel enorm worden verhoogd.

15 In WO 00/70931 wordt een werkwijze beschreven voor de bereiding van stress-eiwitten uit plantaardig materiaal. Door de planten een hittebehandeling te geven, kan de hoeveelheid stress-eiwit worden verhoogd. Een nadeel van het gebruik van planten als bron voor stress-eiwitten is de grote hoeveelheid andere eiwitten (bulkeiwitten) en andere 20 bulkverbindingen die aanwezig zijn. Hierdoor is de zuivering van stress-eiwitten moeilijk en ook slecht opschaalbaar, omdat de standaard zuiveringstechnieken, zoals ultrafiltratie en kolomchromatografie worden bemoeilijkt door de hoge concentraties aan andere eiwitten. De verhouding stress-eiwitten / bulkeiwitten is in het algemeen zo laag dat een gedegen 25 afscheiding van bulkeiwitten uit de stress-eiwitten fractie nodig is om een product met een geschikte hoeveelheid stress-eiwit zonder een overmaat bulkeiwitten te verkrijgen. Bij toepassing van een ongezuiverd stress-eiwit product in een voedingsmiddel of farmaceutische toepassing zou bijvoorbeeld de toe te dienen hoeveelheid product om een gewenste 30 hoeveelheid stress-eiwit toe te dienen zo hoog zijn dat er een overmaat aan 1018211 ' 3 bulkeiwitten en andere bulkverbindingen, zoals polyfenolen in het voedingsmiddel of farmaceutische preparaat zou worden gebracht. Bovendien kunnen bulkeiwitten een negatief effect hebben op de activiteit van een stress-eiwit, bijvoorbeeld doordat het stress-eiwit gebonden raakt 5 aan een bulkeiwit. Ook kunnen bulkeiwitten (zoals enzymen) de stabiliteit van een stress-eiwit product verlagen.

Het is een doel van de onderhavige uitvinding te voorzien in een economisch aantrekkelijke wijze voor het verhogen van het gehalte aan stress-eiwit (als percentage van het totale eiwitgehalte) in een eiwit-10 houdende vloeistof.

Er is nu gevonden dat het mogelijk is storende bulkverbindingen, zoals bulk-eiwitten, selectief af te scheiden uit een vloeistof die eiwitten bevat door middel van precipitatie die wordt gerealiseerd door een pH-verlaging. De onderhavige uitvinding heeft derhalve betrekking op een 15 werkwijze voor het verhogen van het stress-eiwit gehalte (als percentage van het totale eiwitgehalte) in een vloeistof die eiwitten bevat, waarbij - bulkverbinding uit de vloeistof geprecipiteerd wordt door het verlagen van de pH van de vloeistof, - het gevormde precipitaat wordt afgescheiden van het supernatant 20 dat het stress-eiwit bevat.

Er is gevonden dat een werkwijze volgens de uitvinding bijzonder geschikt is voor het op eenvoudige en industrieel aantrekkelijke wijze verwijderen van storende bulkverbindingen, en in het bijzonder van storende bulkeiwitten. Aldus is een werkwijze uitermate geschikt voor het 25 zuiveren van een stress-eiwitproduct, eventueel in combinatie met een of meer andere zuiveringsstappen. Ook is gevonden dat het middels een werkwijze volgens de uitvinding mogelijk is bulkverbindingen te verwijderen met het behoud van een hoge nativiteit en/of activiteit van een of meer stress-eiwitten.

.-' y ï » ia 4

In het bijzonder blijkt een werkwijze zeer geschikt voor het afscheiden van chlorofyl (in de vorm van een chlorofyl-eiwit complex en/of als vrij chlorofyl) en/of Rubisco als precipitaat, uit een vloeistof die plantaardige eiwitten bevat. Door het verwijderen van deze twee 5 componenten blijkt een daarop volgende concentratie of isolatie van het stress-eiwit sterk vergemakkelijkt te worden. Zo blijkt na precipitatie van chlorofyl-eiwit complexen en/of Rubisco, stress-eiwit op efficiënte wijze uit het supernatant geïsoleerd te kunnen worden of geconcentreerd te kunnen worden met gangbare technieken, zoals bijvoorbeeld (preperatieve) 10 kolomchromatografie, welke techniek ongeschikt was vanwege binding aan het kolommateriaal (chlorofyl) en het overladen vanwege de hoge concentratie eiwit (Rubisco).

Met de term stress-eiwit wordt hierin bedoeld een eiwit dat onder invloed van een blootstelling aan een belastende, niet intern door het 15 organisme bepaalde, omgevingsfactor (“stress”) tot expressie wordt gebracht door een door “stress” induceerbaar gen. Zeer geschikte voorbeelden van een dergelijke “stress” zijn blootstelling aan temperatuurverandering (blootstelling aan een warme of koude omgeving), aan straling, bijvoorbeeld UV-straling, aan een veranderde de atmosfeer, zoals hypoxie of anoxie, aan 20 een osmolariteitverandering of een combinatie daarvan. Het is ook mogelijk stress-eiwit productie te induceren door blootstelling aan een stress-eiwit inducerende stof, bijvoorbeeld een overgangsmetaalion (bijvoorbeeld zilver of koper) of organische xenobiotische stof (bijvoorbeeld paraquat).

Voorbeelden van stress-eiwitten die bijzonder geschikt zijn om 25 gewonnen te worden middels de uitvinding, zijn de zogenaamde “heat- shock” eiwitten (eiwitten geïnduceerd door een hittebehandeling), zoals HSP 20-30, HSP 40, HSP 60 (Chaperonine), HSP 70, HSP 90, HSP 130 en ubiquitine, welke zijn beschreven in S. Lewis et al, Ecotoxicology 8, 351-368 (1999). Andere voorbeelden van stress-eiwitten die volgens de uitvinding

101821H

5 gewonnen kunnen worden zijn Cytochroom p450 eiwitten, metallothioneines en heme oxygenases.

Met de term bulkverbinding, worden verbindingen bedoeld die in een grote hoeveelheid aanwezig zijn in de vloeistof waaruit het gewenste 5 stress-eiwit gewonnen kan worden, zoals eiwitten en andere peptidische verbindingen en andere verontreinigingen die geen stress-eiwitten zijn. Typische voorbeelden van bulkverbindingen zijn chlorofyl en eiwitten zoals, complexen van chlorofyl met “chlorofyl binding proteins”, Rubisco, enzymen (bijvoorbeeld proteasen en polyfenoloxidasen) en andere eiwitten die in 10 zodanige mate aanwezig zijn in de vloeistof dat ze een efficiënte winning van het stress-eiwit verstoren. Storende eiwitten, zoals Rubisco, “chlorofyl binding protein” en chlorofyl-eiwitcomplexen worden hierin bulkeiwitten genoemd.

In een voorkeursuitvoeringsvorm worden door een pH verlaging en 15 afscheiding van het gevormde precipitaat de bulkeiwitten Rubisco, “chlorofyl binding protein” , chlorofyl-eiwitcomplexen en eventueel nog andere storende bulkverbindingen zoals ongecomplexeerd chlorofyl tenminste gedeeltelijk uit de vloeistof verwijderd. Uit het resulterende supernatant kan het stress-eiwit eventueel middels een volgende 20 zuiveringstap gewonnen worden, waarbij een restant van de genoemde bulkeiwitten en/of andere componenten zoals polyfenolen, water en/of organische oplosmiddelen worden verwijderd uit de stress-eiwit fractie.

Zeer goede resultaten zijn bereikt bij het verhogen van het stress-eiwit gehalte in een vloeistof, waarbij het stress-eiwit afkomstig is uit een 25 organisme waarin een of meer stress-eiwitten zijn geïnduceerd door een hittebehandeling tussen de 20 en de 90 °C, bij voorkeur tussen de 30 en 60 °C en bij grotere voorkeur tussen de 35 en 45 °C. De tijdsduur van de behandeling kan binnen een breed bereik gekozen worden, bij voorkeur tussen de 1 min. en 24 uur, bij grotere voorkeur 30 min.-12 uur en bij nog 30 grotere voorkeur 1-4 uur.

1 0 1 821 H

6

De uitvinding wordt bij voorkeur toegepast op een vloeistof met stress-eiwitten die afkomstig zijn een plant, zoals bijvoorbeeld van luzerne (alfalfa), een graan (bijvoorbeeld gerst), soja, gras, biet, aardappel of een waterplant (bijvoorbeeld een alg). Deze techniek kan ook worden toegepast 5 op stress-eiwitten (zoals HSP’s) uit gisten, schimmels en bacteriën.

Bijzonder goede resultaten zijn behaald met stress-eiwitten uit luzerne en gerst.

Bij voorkeur wordt het blad van de plant gebruikt als bron voor een of meer stress-eiwitten. Bijzonder geschikt zijn bietenloof, luzernebladeren, 10 gerstebladeren en aardappelloof. Naast de bijzondere geschiktheid van dergelijk bladmateriaal als bron voor stress-eiwitten, biedt het gebruik ervan ook de mogelijkheid dergelijk bladmateriaal, dat gewoonlijk een afvalproduct is, op nuttige wijze te gebruiken.

De plant kan op conventionele wijze zijn gekweekt. Er zijn ook zeer 15 goede resultaten bereikt met een plant die gekweekt is in het donker of onder lichtarme condities. Door de plant, bijvoorbeeld gerst, in het donker of onder lichtarme condities te laten groeien blijkt het mogelijk niet alleen het chlorofylgehalte te verlagen maar ook het Rubiscogehalte, in sommige gevallen zelfs beneden de detectie grens. Er is gevonden dat een op 20 dergelijke wijze gekweekte plant een zeer goede bron is voor stress-eiwitten, die eenvoudig op zeer efficiënte wijze met een hoge mate van zuiverheid gewonnen kunnen worden door een pH verlaging volgens de uitvinding en/of door isolatie of concentratie op een andere wijze, bijvoorbeeld zoals hierin beschreven.

25 In principe kan elke vloeistof met plantaardige eiwitten gebruikt worden als bron waaruit een stress-eiwit volgens de uitvinding gewonnen kan worden. Bijzonder geschikt is bijvoorbeeld het sap van de plant dat verkregen is door persen van plantaardig materiaal en een extract van een plantaardig materiaal. Geschikte bereidingswijzen voor een dergelijke 30 vloeistof zijn bekend, bijvoorbeeld uit WO 00/70931 en S. Lewis et al, 101821n 7

Ecotoxicology 8, 351-368 (1999). Extractie kan bijvoorbeeld plaatsvinden met water, een buffer (bijvoorbeeld Tris, boraat, fosfaat, eventueel met additieven zoals polyvinylpyrolidon of EDTA), een zoutoplossing (bijvoorbeeld NaCl, KC1) of een ander oplosmiddel waarin stress-eiwitten 5 oplossen.

Voor de pH-verlaging in een werkwijze volgens de uitvinding heeft de vloeistof met plantaardige eiwitten bij voorkeur een pH in het bereik van pH 6-9, bij grotere voorkeur pH 6,5-8.

De pH wordt in een werkwijze volgens de uitvinding bij voorkeur 10 verlaagd naar een doelwaarde (“set-point”). Zeer goede resultaten zijn bereikt met een werkwijze waarbij de pH geleidelijk of stapsgewijs verlaagd wordt. De pH waarnaar verlaagd wordt en de snelheid waarmee de pH bij voorkeur verlaagd wordt is onder andere afhankelijk van de aanwezige bulk-verbindingen, het type stress-eiwit dat geïsoleerd wordt en kan door de 15 vakman routinematig worden vastgesteld. Bij voorkeur wordt de pH stapsgewijs of geleidelijk verlaagd wordt met een gemiddelde snelheid ongeveer 0,1-2 pH-eenheid per uur, bij grotere voorkeur met een gemiddelde snelheid ongeveer 0,2-1 pH-eenheid per uur, bij bijzondere voorkeur ongeveer 0,3-0,5 pH eenheid per uur, bijvoorbeeld stapsgewijs elk half uur 20 met een stapsgewijze verlaging van 0,2 pH-eenheid. Het zich vormende precipitaat kan naar keuze gedurende de pH-verlaging of aan het einde worden gescheiden van het supernatant.

In een voorkeursuitvoeringsvorm wordt de vloeistof tijdens het toevoegen van het zuur geroerd en wordt het roeren tussen twee 25 verlagingen tijdelijk gestaakt.

Afhankelijk van de eiwitsamenstelling van de vloeistof zal de vakman geschikte pH-condities weten te kiezen. Zeer goede resultaten zijn behaald met een werkwijze waarbij de pH verlaagd wordt naar een waarde in het bereik van ongeveer pH 4-6, bij voorkeur naar een waarde in het 30 bereik van ongeveer pH 4,5-5,5.

101821)- 8

Voor het winnen van HSP 20-30, HSP 40, HSP 60 (Chaperonin), HSP 70, HSP 90, HSP 130 Cytochroom p450, metallothioneine, heme oxygenase en/of ubiquitine uit een vloeistof die voorts chlorofyl en/of Rubisco eiwitten bevat is bijvoorbeeld een werkwijze zeer geschikt, waarbij chlorofyl 5 en/of Rubisco uit de vloeistof geprecipiteerd wordt door de pH van de vloeistof met de eiwitten stapsgewijs of geleidelijk te verlagen door toevoeging van een zuur van een pH van ongeveer 6,5 of hoger naar een pH van ongeveer 4,8-5,2, het gevormde precipitaat wordt afgescheiden van het supernatant dat het stress-eiwit bevat en optioneel het stress-eiwit in het 10 supernatant geïsoleerd of geconcentreerd wordt. Bijzonder goede resultaten zijn bereikt met een dergelijke werkwijze waarbij HSP70 gewonnen werd uit luzerne of gerst.

In principe kan voor de pH-verlaging middels een werkwijze volgens de uitvinding elk zuur gebruikt worden. Zeer geschikt zijn (relatief) 15 sterke anorganische of organische zuren zoals zoutzuur, salpeterzuur, fosforzuur, boorzuur, zwavelzuur, citroenzuur, azijnzuur, melkzuur en dergelijke. Van deze zuren hebben zoutzuur en azijnzuur een bijzondere voorkeur mede vanwege economische motieven. Naast zoutzuur en azijnzuur hebben in humane en dierlijke toepassingen ook melkzuur en 20 citroenzuur een voorkeur.

Naast de pH verlaging kunnen andere parameters veranderd worden, zoals de zoutconcentratie, de concentratie van organische oplosmiddelen, de eiwitconcentratie (door verdunning of concentratie) en de temperatuur, om op een gewenste wijze bulkverbindingen af te scheiden.

25 Een werkwijze volgens de uitvinding kan binnen een breed temperatuurbereik worden uitgevoerd, welke temperatuur desgewenst constant gehouden kan worden, of veranderd. Door de temperatuur te veranderen gedurende de pH-verlaging, kan het precipitatie-punt (pH waarbij precipitatie plaatsvindt) beïnvloed worden. Bij voorkeur ligt de 1018211 1 9 temperatuur tussen ongeveer 1 en 50 °C, bij grotere voorkeur tussen 5 en 30 °C bij nog grotere voorkeur tussen 5 en 20 °C.

Het precipitaat kan van het supernatant worden afgescheiden op elke geschikte manier, bijvoorbeeld door centrifugatie, filtratie of 5 decanteren. Vervolgens kan het stress-eiwit in het supernatant op iedere geschikte wijze worden geïsoleerd of geconcentreerd. Zeer geschikte technieken hiervoor zijn onder andere gelfiltratie, ultrafiltratie, ultracentrifugatie, cross-flow filtratie, precipitatie, (geheel of gedeeltelijk) drogen, membraanfiltratie, ionenwisseling, chromatografie (bijvoorbeeld 10 gelfiltratie-, gelpermeatie- of ionenwisselingschromatografie) en elektroforese.

De apparatuur en ander materiaal (bijv. kolommen, filters) blijken langer mee te kunnen gaan, dan in conventionele werkwijzen.

In een voorkeursuitvoeringsvorm wordt het stress-eiwit 15 geconcentreerd of geïsoleerd met chromatografie of een filtratietechniek. In een dergelijke uitvoeringsvorm is gevonden dat op grote schaal een stress-eiwit met een hoge nativiteit en/of activiteit verkregen wordt. Bijzonder goede resultaten voor de zuivering van HSP’s, zoals HSP 70, zijn bereikt met affiniteitschromatografie, bij voorkeur met ATP agarose als 20 kolommateriaal. Met affiniteitschromatografie kunnen na verwijdering van Rubisco en chlorofyl-eiwitcomplex andere verontreinigingen, zoals polyfenolen, erg snel en effectief verwijderd worden zonder veel kolomvervuiling, zodat op economisch aantrekkelijke wijze een eindproduct met een hoge zuiverheidsgraad verkregen kan worden. Er is gevonden dat 25 door het verwijderen van de bulkverbindingen de isolatie of concentratie met eenvoudigere apparatuur op efficiënte wijze bereikt kan worden en op industriële schaal toepasbaar is. Voor het bereiden van een product met een bepaalde zuiverheid volgens de uitvinding zijn minder scheidingsstappen nodig. Naast voordelen voor de benodigde apparatuur en de kortere mi .82-1.1;·· 10 bereidingstijd, kan zo ook het verlies aan stress-eiwit ten gevolge van de zuivering sterk worden verminderd.

Dankzij een werkwijze volgens de uitvinding, blijkt het ook mogelijk te zijn het stress-eiwit te isoleren middels gelfiltratie, na 5 afscheiding van bulkverbindingen zoals Rubisco. Hierdoor is het mogelijk gebleken een HSP als één goed gedefinieerde fractie te winnen, in tegenstelling tot scheidingsmethoden waarbij Rubisco niet eerst is afgescheiden.

Het is ook mogelijk een stress-eiwit te isoleren door precipitatie, 10 bijvoorbeeld door ammonium-sulfaatprecipitatie, precipitatie met een organisch oplosmiddel (aceton, ethanol e.d.) of zuur. Isoleren door precipitatie heeft als voordeel de eenvoud van het proces.

In een voorkeursuitvoeringsvorm wordt het stress-eiwit extra gezuiverd van polyfenolische verbindingen en/of andere verontreinigingen, 15 in het bijzonder als het stress-eiwit afkomstig is van bladmateriaal. Hierdoor blijft een hogere activiteit van het stress-eiwit behouden. Geschikte werkwijzen om polyfenolen te verwijderen zijn bekend. Een zeer geschikte werkwijze voor het verwijderen van polyfenolische verbinding uit een eiwitproduct staat beschreven in de Nederlandse aanvrage NL 101 72 41.

20 Hierin wordt een werkwijze beschreven waarbij eiwit wordt geprecipiteerd door menging van een oplossing van het eiwit in een waterig medium met een in water mengbaar organisch oplosmiddel bij een pH rond het iso-elektrisch punt (±1 pH eenheid) en het eiwit vervolgens gezuiverd wordt. Er is gevonden nu gevonden dat een dergelijke werkwijze ook geschikt is voor 25 het verwijderen van polyfenolen uit een stress-eiwit product, met behoud van stress-eiwit activiteit.

De uitvinding heeft voorts betrekking op een stress-eiwit product dat verkrijgbaar is middels een werkwijze volgens de uitvinding. Een dergelijk product kan bijvoorbeeld een oplossing, een dispersie, een emulsie 30 of een droog product zijn.

.-101821 u 11

Een product volgens de uitvinding kan verkregen worden zonder genetische modificatie en zonder de mogelijke gezondheidsrisico’s die aan stress-eiwitten, zoals HSP’s uit runderhersenen, kunnen kleven.

Een product volgens de uitvinding kenmerkt zich door een hoge 5 nativiteit van het stress-eiwit en/of een hoge activiteit van het stress-eiwit.

Een product volgens de uitvinding is zeer geschikt in tal van toepassingen. Derhalve heeft de uitvinding ook betrekking op een voedingsmiddel voor humane of dierlijke consumptie, een farmaceutisch of cosmetisch preparaat of een gewasbeschermingsmiddel, dat een stress-eiwit 10 omvat, welk stress-eiwit verkrijgbaar is volgens een werkwijze volgens de onderhavige uitvinding.

In een humaan voedingsmiddel volgens de uitvinding is een laag gehalte van chlorofyl zeer gewenst. Hoewel het Rubisco wel een interessant eiwit is voor humane voeding zal bij een hoge dosering stress-eiwit een 15 overmaat aan Rubisco ontstaan. Een humaan voedingsmiddel volgens de uitvinding blijkt een zeer hoog stress-eiwitgehalte te hebben ten opzichte van het Rubisco- en chlorofylgehalte.

In het bijzonder voor een farmaceutische- cosmetische en gewasbeschermingsmiddel volgens de uitvinding is gevonden dat er een zeer 20 lage mate van complexering van stress-eiwitten (zoals HSP’s) met Rubisco optreedt. Hierdoor blijft de activiteit van het stress-eiwit hoog. kan een gedeelte van de werking van het HSP teniet worden gedaan omdat de complexering zorgt voor een verlaagde dosering van het vrije HSP. Daarnaast kunnen de andere componenten (Rubisco en chlorofyl) een 25 negatief effect hebben.

In het bijzonder heeft de uitvinding tevens betrekking op het gebruik ervan in diervoeding of humane voeding, in een farmaceutisch preparaat, zoals een immuunsysteem stimulerend middel of een preparaat voor de behandeling van kanker, of cosmetisch preparaat of in een 30 gewasbeschermingsmiddel.

101821 hg 12

De uitvinding zal nu verder geïllustreerd worden aan de hand van enkele voorbeelden.

-·

Voorbeeld 1: HSP 70 uit luzerne 5

Inductie van het stress-eiwit vond plaats door Luzerne direct (binnen een half uur) na het maaien gedurende 2 uur te verwarmen bij 40 °C.

De hitte behandelde luzerne werd met vloeibare stikstof ingevroren en 10 vervolgens in een mortier verkleind. Aan 10 gram bladpoeder werd een 20 ml buffer (25 g/1 polyvinylpyrolidon; 50 mM Tris pH 8, 24 uur tevoren aangemaakt en bewaard bij 4 °C ) toegevoegd. Hieraan werd 2mM EDTA en 5 mM DTT (dithiothreitol), toegevoegd. Na 30 min bewaren bij 4 °C onder schudden, werd het extract gecentrifugeerd bij 10.000 g gedurende 15 15 min.). Het supernatant bevat zowel de HSP 70-, als ook het chlorofyl en Rubisco.

pH precipitatie:

De vloeistoffractie werd op pH 6.5 gebracht en bij een temperatuur van 5 °C 20 of 20 °C werd vervolgens stapsgewijs onder roeren 0.1 M zoutzuur toegevoegd (stapjes van ca. 0,2 pH, 30 min tussen twee verlagingen). Tussen twee pH verlagingen werd het roeren gedurende 30 min. gestaakt. In eerste instantie precipiteerde chlorofyl en daarna Rubisco tussen pH 6 en 5. Na centrifugatie van de vloeistof bij pH 5 bevatte de pellet het chlorofyl en het 25 Rubisco en het supernatant HSP 70 eiwit. (Bepaald middels western blotting en gel elektroforese)

Het experiment werd herhaald met als vloeistoffractie het sap van geperste luzerne.

1018211a 13

Voorbeeld 2: HSP 70 uit gerst

Gerst werd ontkiemd in het donker. Bladmateriaal van ontkiemde gerst werd tussen 1 en 10 dagen geoogst.

5 Bladmateriaal van gerst werd na het snijden verwarmd bij 40 °C

gedurende 2 uur.

Vervolgens werd het bladmateriaal werd met vloeibare stikstof ingevroren en vervolgens in een mortier verkleind. Hierna werd een 2 maal zo groot volume buffer toegevoegd, waarna het extract werd gecentrifugeerd.

10 De vloeistoffractie bevatte HSP 70 als ook wat andere eiwitten.

De vloeistoffractie kon eventueel verder worden behandeld zoals beschreven in Voorbeeld 1.

_ -ί 0 ï 821 1 j

Claims (19)

1. Werkwijze voor het verhogen van het stress-eiwitgehalte (als percentage van het totale eiwitgehalte) in een vloeistof die eiwitten bevat, waarbij - bulkverbinding uit de vloeistof geprecipiteerd wordt door het verlagen van de pH van de vloeistof, 5. het gevormde precipitaat wordt afgescheiden van het supernatant dat het stress-eiwit bevat.

2. Werkwijze volgens conclusie 1 , waarbij de pH geleidelijk of stapsgewijs verlaagd wordt.

3. Werkwijze volgens conclusie 1 of 2, waarbij de pH verlaagd wordt met een 10 snelheid van ongeveer 0,1 tot ongeveer 2 pH-eenheid per uur.

4. Werkwijze volgens een van de voorgaande conclusies, waarbij de pH verlaagd wordt naar een waarde in het bereik van ongeveer 4 tot 6.

5. Werkwijze volgens een van de voorgaande conclusies, waarbij het stress-eiwit is geïnduceerd door blootstelling aan een temperatuurverandering, 15 aan straling, bijvoorbeeld UV-straling, aan hypoxie of anoxie, aan een osmolariteitverandering of aan een stress-eiwit inducerende stof, bijvoorbeeld een overgangsmetaalion of organische xenobiotische stof.

6. Werkwijze volgens een van de voorgaande conclusies waarbij, chlorofyl, chlorofyl-eiwit complex en/of Rubisco als precipitaat wordt afgescheiden.

7. Werkwijze volgens een van de voorgaande conclusies waarbij de genoemde vloeistof een extract, een sap of een andere fractie omvat van een plantaardig materiaal.

8. Werkwijze volgens een van voorgaande conclusies waarbij de genoemde vloeistof voorafgaand aan het verlagen van de pH een waarde heeft in het 25 bereik van ongeveer 6 tot 9. ï ü » 821 1*

9. Werkwijze volgens een van de voorgaande conclusies, waarbij na het afscheiden van het precipitaat, het stress-eiwit in het supernatant wordt geconcentreerd of geïsoleerd.

10. Werkwijze volgens conclusie 9, waarbij het concentreren of isoleren van 5 het stress-eiwit in het supernatant plaatsvindt door middel van gelfïltratie, ultrafiltratie, ultracentrifugatie, cross-flow filtratie, precipitatie, drogen, membraanfiltratie, ionenwisseling, chromatografie, of elektroforese

11. Werkwijze volgens een van de voorgaande conclusies, waarbij het stress-10 eiwit afkomstig is van een plant die is gekweekt in het donker of onder lichtarme condities.

12. Werkwijze voor het verhogen van het stress-eiwitgehalte (als percentage van het totale eiwitgehalte) in een samenstelling die plantaardige eiwitten bevat, waarbij het stress-eiwit afkomstig is van een plant die is 15 gekweekt in het donker of onder lichtarme condities en waarbij het stress-eiwitgehalte wordt verhoogd door een pH-verlaging volgens een van de conclusies 1-10, door een isolatiestap, een concentratiestap of een combinatie daarvan.

13. Werkwijze volgens conclusie 12, waarbij de isolatiestap en/of 20 concentratiestap van het stress-eiwit plaatsvindt door middel van gelfïltratie, ultrafiltratie, ultracentrifugatie, cross-flow filtratie, precipitatie, drogen, membraanfiltratie, ionenwisseling, chromatografie of elektroforese.

14. Werkwijze volgens een van de voorgaande conclusies, waarbij het stress-25 eiwit een HSP 20-30, HSP 40, HSP 60 (Chaperonin), HSP 70, HSP 90, HSP 130 of ubiquitine, Cytochroom p450, metallothioneine, heme oxygenase is.

15. Werkwijze voor het winnen van HSP 20-30, HSP 40, HSP 60 (Chaperonin), HSP 70, HSP 90, HSP 130, Cytochroom p450, 30 metallothioneine, heme oxygenase en/of ubiquitine uit een vloeistof die 1018211ü plantaardige eiwitten bevat, waarbij - chlorofyl en/of Rubisco uit de vloeistof geprecipiteerd wordt door de pH van de vloeistof met de eiwitten stapsgewijs of geleidelijk te verlagen door toevoeging van een zuur van een pH van ongeveer 6,5 of 5 hoger naar een pH van ongeveer 4,8-5,2 - het gevormde precipitaat wordt afgescheiden van het supernatant dat het stress-eiwit bevat - optioneel het stress-eiwit in het supernatant geïsoleerd of geconcentreerd wordt.

16. Werkwijze volgens een van de voorgaande conclusies waarbij de eiwitten in de vloeistof afkomstig zijn van luzerne, een graan,, soja, gras, biet,, aardappel of een waterplant.

17. Een stress-eiwit product, dat verkrijgbaar is middels een werkwijze volgens een van de voorgaande conclusies.

18. Een voedingsmiddel voor humane of dierlijke consumptie, een farmaceutisch of cosmetisch preparaat of een gewasbeschermingsmiddel, dat een stress-eiwit volgens conclusie 17 omvat.

19. Het gebruik van een stress-eiwit volgens conclusie 17 in diervoeding of humane voeding, in een farmaceutisch of cosmetisch preparaat, in een 20 gewasbeschermingsmiddel. J 0 1 82 1 1 ,