NL1012859C2 - Werkwijze en systeem voor het bepalen van de hoeveelheid progesteron in rauwe melk. - Google Patents

Description

Titel: Werkwijze en systeem voor het bepalen van de hoeveelheid progesteron in rauwe melk

De uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het bepalen van de hoeveelheid progesteron in rauwe melk van koeien waarbij een biosensor in contact wordt gebracht met de rauwe melk en de hoeveelheid progesteron in de melk met behulp van de biosensor wordt bepaald waarbij 5 de biosensor is voorzien van een plaatje waarop progesteronlichamen of progesteronantilichamen zijn aangebracht.

De uitvinding heeft eveneens betrekking op een systeem voor het bepalen van de hoeveelheid progesteron in rauwe melk.

Een dergelijke werkwijze is bekend uit het artikel “Development of to a sensitive, selective electrochemical immunoassay for progesterone in cow’s milk based on a disposable screen-printed amperometric biosensor”ELECTROCHIMICA ACTA deel 43, nr. 23, 1998, bladzijden 3537-3574, XP004130864 Barking UK van R.M. PEMBERTON ET AL.

In de melkveehouderij is het van belang om de bronst/tocht cyclus 15 van een koe te weten. Aan de hand van deze cyclus kan de boer bepalen op welk moment de koe tochtig is en wat dan het moment van inseminatie moet zijn.

Het moment van inseminatie is moeilijk te bepalen. Het gebeurt dan ook regelmatig dat de kunstmatige inseminatie te vroeg of te laat 20 plaatsvindt waardoor geen bevruchting plaatsvindt. Dit komt mede doordat de cyclus van iedere individuele koe anders is. Daarom is het gewenst om een objectieve methode te gebruiken om het moment van kunstmatige inseminatie te bepalen.

Een belangrijke parameter om het tijdstip van inseminatie te 25 bepalen is de progesteron concentratie in de melk die de koe afgeeft.

Wanneer het moment nadert dat de koe geinsemineerd kan worden daalt de progesteron concentratie in de melk tot onder 4 ng/ml. Na de inseminatie stijgt de progesteron concentratie tot boven de 20 ng/ml en wanneer er een bevruchting heeft plaatsgevonden zal de progesteron concentratie in de 30 melk boven de 20 ng/ml blijven. Wanneer de progesteron concentratie weer daalt kan een nieuwe kunstmatige inseminatie plaatsvinden. Doordat iedere individuele koe een andere cyclus heeft is het gewenst om de cyclus van iedere koe apart te kunnen volgen. Om nauwkeuriger het moment van 1 01 28 59 2 inseminatie te bepalen is het niet voldoende om te weten wanneer de progesteron concentratie onder of boven de onder- of bovenlimiet ligt. Vooral betrouwbare informatie over het concentratiegebied tussen 0 en 7 ng/ml progesteron is van belang. Het liefst wil de boer gebruikmaken van een 5 methode voor progesteronbepaling die in hoge mate geautomatiseerd is, een hoge betrouwbaarheid heeft en die een lage kostprijs per monster kent.

Het is bekend dat de boer het moment van inseminatie bepaalt op basis van de gesteldheid van de koe of door gebruik te maken van veldanalysemethoden voor de bepaling van de progesteron concentratie in 10 rauwe melk.

De gesteldheid van de koe kan o.a. worden bepaald door middel van visuele waarneming van het diergedrag en/of een activiteitsmeting. De koe heeft hiervoor een stappenteller waarmee het aantal stappen kan worden geteld die het dier gedurende een gedefinieerde tijdsinterval doet.

15 Hiervoor moet de boer zijn koeien minimaal twee a drie maal per dag observeren gedurende een kwartier tot een half uur. Daarnaast kijkt de boer ook naar het gedrag van de koe. Wanneer de koe tochtig is bespringt de koe regelmatig andere koeien en wordt zelf besprongen.

Naast deze al eeuwen gebruikte methode wordt tegenwoordig ook 20 gebruik gemaakt van nieuw ontwikkelde veldanalysemethoden. Te denken valt aan bijvoorbeeld dipstick testen waarbij de boer een monster melk van de koe neemt (dit is een handmatige handeling en is niet geautomatiseerd) en een teststrip in de melk houdt. Na een minimale incubatieperiode, de progesteron in de melk reageert met de reagentia in de teststrip, is af te 25 lezen wat de concentratie progesteron in de geteste melk is. Meestal gebeurt deze aflezing visueel terwijl het aflezen soms ook geobjectiveerd kan worden door gebruik te maken van een fotometer. De nauwkeurigheid van de analytische bepaling is niet erg hoog waardoor alleen een uitspraak gedaan kan worden of de concentratie boven of onder een gestelde limiet is.

30 Aan de hand van de concentratie kan behalve een tochtigheidscontrole tevens een vroege drachtigheidsdiagnose worden uitgevoerd. Bovendien kan worden vastgesteld of het dier mogelijk een afwijking heeft aan het voortplantingsapparaat.

Voor de boer zou het ideaal zijn als de bepaling van de concentratie 35 progesteron in rauwe melk in hoge mate geautomatiseerd zou kunnen worden. Hierdoor heeft de boer zijn handen vrij om andere werkzaamheden 1 01 2859 3 te verrichten en daarbij komt dat de boer niet opgeleid is om een analytische bepaling uit te voeren.

Daarnaast zou het gewenst zijn om de progesteron concentratie over het gehele traject tussen 0 en 40 ng/ml met een hoge nauwkeurigheid 5 te kunnen bepalen. Hierdoor krijgt de boer meer informatie over de cyclus van de individuele koe en kan hij per koe beter het moment van inseminatie bepalen. Dit zal resulteren in een verlaging van het aantal mislukte inseminaties per koe waardoor de productiviteit per koe zal stijgen.

Bij de bekende werkwijze voor het meten van de hoeveelheid 10 progesteron in melk met behulp van een biosensor wordt gebruik gemaakt van een screen-printed carbon elektrode die in contact wordt gebracht met de melk waaraan ten behoeve van de meting een (enzym) gelabeld progesteron wordt toegevoegd. De sensor is voor een deel voorzien van een biologische coating. Er vindt, in gebruik, een immunochemische interactie 15 plaats tussen het progesteron (van de melk en het gelabeld progesteron) en deze coating. Bij de analyse vindt een competitie plaats tussen beide typen progesteron. Na incubatie van de melk met de sensor wordt het oppervlak gewassen en wordt een substraat aangeboden aan het enzym. Het substraat wordt enzymatisch omgezet in een elektrochemische actieve stof, waarna 20 het signaal wordt geïnduceerd. Dit gebeurt op een deel van een oppervlak van de sensor dat niet is voorzien van de coating. Het gaat dus om een elektrochemische meting.

Doordat de melk contact maak met zowel het gecoate als het ongecoate deel van de sensor, vinden a-specifieke interacties plaats, die een 25 nadelige invloed hebben op de reproduceerbaarheid van de sensor. Verder zijn drie biochemische interacties nodig voor het verkrijgen van een meetsignaal waarbij iedere interactie fouten met zich brengt zodat de nauwkeurigheid van de meting niet hoog is.

De uitvinding beoogt een oplossing te verschaffen voor de 30 genoemde nadelen alsmede aan de wensen van de boer tegemoet te komen. Daarnaast is de uitvinding ook goed bruikbaar voor het detecteren van status en/of afwijkingen in de vruchtbaarheid.

De werkwijze volgens de uitvinding heeft dienovereenkomstig als kenmerk dat een verzwaring van het plaatje wordt gemeten voor het 35 bepalen van de hoeveelheid progesteron.

· ? ? q r·^ 4

Het meten van de verzwaring kan op zich bekende wijze worden uitgevoerd. Doordat voorafgaand aan de meting van de verzwaring slechts een enkele interactie heeft plaats gevonden terwijl het meten van de verzwaring eveneens zeer nauwkeurig kan worden uitgevoerd kan de 5 uiteindelijke bepaling van de hoeveelheid progesteron zeer nauwkeurig worden uitgevoerd. Verder kan de biosensor worden schoongemaakt voor hergebruik.

In het bijzonder geldt dat de biosensor wordt verbonden met een computer voor het on-line bepalen van de hoeveelheid progesteron in melk.

10 Op deze wijze is het mogelijk om de concentratiebepaling van progesteron in rauwe melk in hoge mate te conditioneren.

Bij voorkeur geldt dat tevens de identiteit van het dier wordt bepaald, de hoeveelheid progesteron wordt bepaald van rauwe melk die in de tijd verspreid een veelvoud van keren door de koe is afgegeven waarbij de 15 identiteit van het dier tezamen met de bepaalde hoeveelheden progesteron en informatie over de tijdstippen waarop deze hoeveelheden zijn bepaald en/of de melk is afgegeven in een databank worden opgeslagen. Op deze wijze kan het verloop van de concentratie progesteron in rauwe melk, in de tijd verspreid per dier worden bepaald, opgeslagen en verder worden 20 verwerkt. Aan de hand van de tijdsafhankelijke concentratie curve kan nauwkeurig worden vastgesteld wanneer de koe tochtig is, of de koe drachtig is dan wel of de koe mogelijk een afwijking heeft aan zijn voortplantingsapparaat. In het bijzonder geldt dat de hoeveelheid progesteron in de melk tijdens het melken wordt bepaald. Indien de koe 25 wordt gemolken met behulp van een melkrobotinstallatie kan desgewenst in het traject waarlangs de rauwe melk door de melkrobotinstallatie stroomt de biosensor worden geplaatst.

De uitvinding heeft eveneens betrekking op een systeem voorzien van een computer en een hiermee verbonden biosensor welk systeem is 30 ingericht voor het uitvoeren van de werkwijze volgens de uitvinding.

De uitvinding zal thans nader worden toegelicht aan de hand van de tekening. Hierin toont fig. 1 schematisch een systeem volgens de uitvinding voor het uitvoeren van een werkwijze volgens de uitvinding; 35 fig. 2 het gebruik volgens de uitvinding van een eerste type biosensor; 1 01 28 59 5 fig. 3 het alternatief gebruik volgens de uitvinding van een tweede type; en fig. 4 toont het verloop in de tijd van de concentratie progesteron in rauwe melk van een koe.

5 In figuur 1 is met verwijzingscijfer 1 een systeem aangeduid voor het uitvoeren van een werkwijze volgens de uitvinding. Het systeem is voorzien van een biosensor 2, een computer 4 alsmede leiding 6 die de biosensor 2 met de computer 4 verbindt.

Voor het bepalen van de hoeveelheid progesteron in de rauwe melk 10 wordt de biosensor 2 in contact gebracht met de rauwe melk 8 waarvan in dit geval de concentratie progesteron moet worden bepaald. De rauwe melk 8 is in dit voorbeeld opgenomen in een houder 10 die vele uitvoeringsvormen heeft zoals hierna zal worden besproken.

De rauwe melk 8 kan bijvoorbeeld bestaan uit een monster van de 15 rauwe melk die bij het melken van de koe wordt afgegeven. Dit monster kan dan in de houder 10 worden gebracht.

De biosensor 2 is van een op zich bekend type en is ingericht om de concentratie progesteron in de rauwe melk 8 te bepalen. De biosensor 2 genereert op leiding 6 een signaal dat de gemeten concentratie progesteron 20 in de rauwe melk representeert. Deze concentratie wordt in dit voorbeeld opgeslagen in een databank van de computer 4. In dit voorbeeld wordt via een ingang 12 van de computer tevens de identiteit van het dier waar de rauwe melk van afkomstig is opgeslagen in de databank. De identiteit van het dier kan op, op zich bekende wijze worden bepaald. Hierbij kan worden 25 gedacht aan identiteitsbepaling aan de hand van een halsresponder, een oormerk, een implantaat en/of een bolus etc. Het systeem kan bijvoorbeeld zijn voorzien van een op zich bekende identifïcatieinrichting 14 die de identiteit van het dier vaststelt en deze aldus aan de ingang 12 van de computer 4 toevoert.

30 In het bijzonder geldt dat behalve de identiteit van het dier tevens de hoeveelheid progesteron wordt bepaald van rauwe melk die een veelvoud van keren in de tijd verspreid door het dier is afgegeven. De identiteit van het dier wordt dan tezamen met de bepaalde hoeveelheden progesteron alsmede informatie over de tijdstippen waarop de hoeveelheden zijn bepaald 35 en/of de melk is afgenomen in de databank opgeslagen.

4 ra 4 o q £· o 6

Op deze wijze wordt een inzicht verkregen in het verloop van de concentratie in de tijd, zie ook fïg. 4. Hierbij is op de horizontale as de tijd in dagen uitgezet, en op de verticale as de concentratie in nanogram per milliliter. Het tijdstip waarop het dier tochtig is is aangeduid met dag nul 5 en valt samen met een dip in het concentratie verloop in de tijd van de hoeveelheid progesteron in de rauwe melk. Eenentwintig dagen later blijkt het dier wederom tochtig te zijn. Door nu het moment te signaleren waarop de concentratie begint af te nemen van een waarde van bijvoorbeeld 40 ng/ml naar een waarde van rond de 4 ng/ ml kan nauwkeurig het moment 10 van tochtigheid worden bepaald. Wanneer de concentratie rondom de zesentwintigste dag niet daalt is het dier drachtig of is het mogelijk dat het dier een afwijking heeft aan zijn voortplantingsapparaat. Bij voorkeur geldt dat gedurende ongeveer twee weken (veertien dagen) nadat een verloop van de bepaalde hoeveelheid progesteron in de tijd een minimum heeft bereikt 15 het progesterongehalte van de melk van de koe niet wordt bepaald. Zoals uit fig. 4 blijkt zal in het algemeen pas na de veertiende dag wanneer het dier niet drachtig is en/of geen afwijking heeft aan zijn voortplantingsapparaat de concentratie weer gaan dalen. Het is derhalve pas na veertien dagen weer interessant om het verloop in de tijd van de hoeveelheid progesteron in 20 de melk weer te gaan volgen. Na de veertiende dag kan bijvoorbeeld om de twee a drie dagen de concentratie progesteron in de rauwe melk van het dier worden bepaald.

Bij voorkeur geldt dat de hoeveelheid progesteron tijdens het melken met behulp van een melkrobot wordt bepaald. De biosensor kan dan 25 op een geschikte positie in een traject, waarlangs de rauwe melk van de koe door de melkrobot stroomt, worden gepositioneerd. Hierbij kan bijvoorbeeld worden gedacht aan de melkleiding en/of de melkklauw. In dat geval vormt de melkklauw of de melkleiding derhalve de houder 10 in fig. 1. Het is echter eveneens mogelijk dat op automatische wijze in de melkrobot een 30 monster wordt genomen van de rauwe melk die langs het melkstroomtraject van de melkrobot stroomt. Dit monster wordt dan op genomen in een van het melkstroomtraject gescheiden houder 10. Dit is met name zinvol wanneer een biosensor wordt toegepast die bestaat uit een plaat waarop een coating van progesteronlichamen is aangebracht zoals hierna nader zal worden 35 toegelicht.

7

De biosensor 2 kan in dat geval zoals getoond in fig. 2 zijn voorzien van een plaat 16 waarop een coating is aangebracht die progesteronlichamen 18’ omvat. Tevens is in fig. 2 de rauwe melk 8 aangeduid die progesteron 20 omvat. Aan het monster rauwe melk dat in 5 fig. 2 is getoond is tevens een hoeveelheid progesteronantilichamen 22 toegevoegd. In fig. 2 is de lange staart 24 van de antilichamen 22 schematisch getoond.

Indien de concentratie antilichamen 22 in de rauwe melk 8 op op zich bekende wijze geleidelijk wordt verhoogd zullen de antilichamen 22 in 10 eerste instantie binden met de progesteronlichamen 20. Op het moment dat meer antilichamen 22 aan de rauwe melk zijn toegevoerd dan progesteronlichamen in de rauwe melk aanwezig zijn zullen de antilichamen 22 eveneens gaan binden met de progesteronlichamen 18 van het plaatje 16. Het gevolg is dat de massa die verbonden is met het plaatje 15 16 zal toenemen. Omdat de antilichamen 22 verzwaard zijn uitgevoerd zal de gewichtstoename van het plaatje 16 goed detecteerbaar zijn.

Indien in de rauwe melk 8 althans nagenoeg geen progesteronlichamen 20 aanwezig zijn zal bij toevoer van de antilichamen 22 aan de rauwe melk 8, deze antilichamen 22 direct gaan binden met het 20 plaatje 16. Het plaatje 16 zal dan ook direct worden verzwaard hetgeen op op zich bekende wijze kan worden gemeten.

Een verder voordeel van de werkwijze volgens fig. 2 is dat het regenereren van de biosensor snel en eenvoudig kan worden uitgevoerd. Doordat de antilichamen 22 zijn verzwaard laten deze ook weer gemakkelijk 25 los van de lichamen 18'. Wanneer het plaatje 16 derhalve met bijvoorbeeld reinigingsvloeistof wordt schoongespoeld zullen de antilichamen 22 gemakkelijk loslaten zodat de biosensor opnieuw kan worden gebruikt. Omdat bij de werkwijze volgens fig. 2 antilichamen aan de rauwe melk 8 worden toegevoegd zal de concentratie progesteron bij voorkeur aan de hand 30 van een gesepareerd monster van de rauwe melk worden bepaald.

Het is ook mogelijk dat het plaatje van de biosensor 2 is voorzien van een coating met progesteronantilichamen 18', zoals getoond in fig. 3. De progesteron 20 die in de melk 8 aanwezig is zal dan binden met de antilichamen 18'. Het gevolg is dat het plaatje 16 zal worden verzwaard.

35 Het verzwaren van het plaatje 16, wil zeggen de mate waarin de verzwaring van het plaatje 16 plaatsvindt is een maat voor de concentratie progesteron 1 01 2859 8 in de rauwe melk 8. Deze verzwaring kan op op zich bekende wijze worden gemeten. Nadat de concentratie progesteron is bepaald kan op op zich bekende wijze het plaatje 16 worden schoongespoeld met bijvoorbeeld reinigingsvloeistof voor regeneratie. De progesteronlichamen 20 laten 5 hierbij los en kunnen worden gebruikt voor nieuwe detectie van progesteron in rauwe melk 8.

Bij de werkwijze volgens fïg. 3 is het theoretisch mogelijk dat de biosensor 2 zoals hiervoor omschreven in het melkstroomtraject van een melkrobot worden opgenomen.

10 Om de verzwaring van het plaatje 16 te detecteren kan op op zich bekende wijze de resonantiefrequentie van het plaatje worden bepaald. Indien het plaatje is voorzien van een metaaloxydecoating blijkt dat de refractie index aan het oppervlak van het plaatje afhankelijk is van de hoeveelheid lichamen (fig. 3) of antilichamen (fig. 2) die zijn gebonden met 15 de coating. Dit resulteert in meetbare veranderingen in de reflectie intensiteit van een laserbundel waarmee het plaatje wordt belicht. Ook op deze wijze kan door detectie van de intensiteit van de gereflecteerde laserbundel de concentratie worden bepaald. Het is tevens mogelijk dat de hoeveelheid progesteron in de melk wordt bepaald maar dat de analyse van 20 de meetresultaten pas later plaatsvindt. De verkregen gegevens kunnen ook worden gekoppeld met andere data van de computer 4. Ook kan het belangrijk zijn het moment waarop de progesteron wordt gedetecteerd te beschouwen in relatie met andere parameters die van dit moment afhankelijk zijn. Zo kan een uitspraak over vruchtbaarheid worden gedaan 25 op grond van de bepaalde hoeveelheid progesteron in combinatie met andere parameters, zoals activiteit en temperatuur van het dier. Dergelijke varianten plus andere bekende methoden worden elk geacht binnen het kader van de uitvinding te vallen.

'4 ry < o q o

Claims (17)

1. Werkwijze voor het bepalen van de hoeveelheid progesteron in rauwe melk van koeien waarbij een biosensor in contact wordt gebracht met 5 de rauwe melk en de hoeveelheid progesteron in de melk met behulp van de biosensor wordt bepaald waarbij de biosensor is voorzien van een plaatje waarop progesteronlichamen of progesteronantilichamen zijn aangebracht, met het kenmerk, dat een verzwaring van het plaatje wordt gemeten voor het bepalen van de hoeveelheid progesteron. io

2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de identiteit van het dier wordt bepaald, de hoeveelheid progesteron wordt bepaald van rauwe melk die respectievelijk een veelvoud van keren in de tijd verspreid door de koe is afgegeven waarbij dat de identiteit van het dier tezamen met de bepaalde hoeveelheden progesteron en informatie over de tijdstippen 15 waarop deze hoeveelheden zijn bepaald en/of de melk is afgegeven in een databank worden op geslagen.

3. Werkwijze volgens een der voorgaande conclusies, met het kenmerk, dat de hoeveelheid progesteron in de melk tijdens het melken wordt bepaald. 20

4 . Werkwijze volgens conclusie 3, met het kenmerk, dat de koe wordt gemolken met behulp van een melkinstallatie/robot.

5. Werkwijze volgens conclusie 4, met het kenmerk, dat de biosensor in de melkinstallatie/robot wordt op genomen.

6. Werkwijze volgens een der voorgaande conclusies, met het 25 kenmerk, dat de hoeveelheid progesteron wordt bepaald van een monster van de rauwe melk van de koe.

7. Werkwijze volgens een der voorgaande conclusies, met het kenmerk, dat tenminste op basis van de bepaalde hoeveelheid c.q. hoeveelheden progesteron wordt bepaald of een koe tochtig of drachtig is 30 dan wel of de koe een afwijking heeft aan zijn voortplantingsapparaat.

8. Werkwijze volgens een der voorgaande conclusies, met het kenmerk, dat gedurende ongeveer twee weken nadat een verloop van de bepaalde hoeveelheid progesteron in de tijd een minimum heeft bereikt het progesterongehalte van de melk van de koe niet wordt bepaald. 1 01 2859 1 o

9. Werkwijze volgens een der voorgaande conclusies, met het kenmerk, dat gebruik wordt gemaakt van een biosensor die is voorzien van een oppervlak voorzien van een coating met antilichamen van progesteron.

10. Werkwijze volgens een der voorgaande conclusies 1-8, met het 5 kenmerk, dat aan de melk antilichamen van progesteron worden toegevoegd en dat gebruik wordt gemaakt van een biosensor die is voorzien van een oppervlak, voorzien van een coating met progesteronlichamen.

11. Werkwijze volgens conclusie 10, met het kenmerk, dat de antilichamen zwaarder zijn dan progesteron. io

12. Werkwijze volgens een der voorgaande conclusies, met het kenmerk, dat de bepaalde hoeveelheid, c.q. hoeveelheden, progesteron op een later tijdstip wordt geanalyseerd dan het tijdstip waarop het monster is genomen.

13. Werkwijze volgens een der voorgaande conclusies, met het 15 kenmerk, dat de bepaalde hoeveelheid, c.q. hoeveelheden, progesteron in combinatie met andere data uit een boerderijcomputer wordt verwerkt.

14. Werkwijze volgens conclusie 7, met het kenmerk, dat de bepaalde hoeveelheid, c.q. hoeveelheden, progesteron in combinatie met andere data, zoals het moment van bepalen van de hoeveelheid progesteron, de activiteit 20 en temperatuur van het dier etc., wordt verwerkt voor het doen van een uitspraak over de vruchtbaarheid van het dier.

15. Werkwijze volgens een der voorgaande conclusie, met het kenmerk, dat de biosensor wordt verbonden met een computer voor het on-line bepalen van de hoeveelheid progesteron in de melk.

16. Systeem voorzien van een computer en een hiermee verbonden biosensor ingericht voor het uitvoeren van de werkwijze volgens conclusie 15.

17. Gebruik van een biosensor voor het bepalen van de hoeveelheid progesteron in rauwe melk van koeien waarbij de biosensor in contact met de melk wordt gebracht voor het bepalen de hoeveelheid progesteron. 30 1 ij 1 5 8 8 8