MXPA99009550A - Formas de administracion farmaceuticas estables de peptidos, proteinas y acidos nucleicos - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a preparaciones farmacéuticas liofilizadas estables en almacenamiento de biomoléculas se seleccionan del grupo que comprende proteínas, péptidos,ácidos nucleicos y carbohidratos y además contienen uno o mas aminoácidos D o L, además de uno o masácidos aminodicarboxilicos oácidos dicarboxilicos y sus sales fisiológicamente compatibles de los mismos. Las sustancias auxiliares están disponibles en el cultivo liofilizado parcial o completamente en la forma amorfa.

Description

FORMA DE ADMINI STRACIÓN FARMACÉUTICAS ESTABLES PARA PÉPTIDOS, PROTEÍNAS Y ÁCIDOS NUCLEICOS La invención se refiere a composiciones liofilizadas estables para uso farmacéutico o de diagnóstico, que contienen una proteina, un péptido, un ácido nucleico o un polisacárido, en donde las sustancias auxiliares se seleccionan tal que los liofilizados están presentes en una forma amorfa o parcialmente amorfa.

Los avances en biotecnología en los pasados 20 años, han resultado en un enorme aumento en el número de biomoléculas que están disponibles en grandes cantidades. Un campo particularmente activo para estos productos es su uso en terapias farmacéuticas. Asi, por ejemplo, ciertas proteínas se usan para regular los tipos celulares individuales, los ácidos nucleicos se usan para regular la expresión del gen y los polisacáridos se usan para la vacunación. Es de ventaja práctica cuando las preparaciones pueden almacenarse a temperatura ambiente debido a que el espacio de almacenamiento refrigerado frecuentemente se limita.

REF. 31809 Además, las preparaciones sensibles a la temperatura requieren un monitoreo preciso del periodo de almacenamiento entre la remoción del refrigerador y la administración terapéutica (e.g. inyección), dado que los subproductos pueden formarse como resultado de las reacciones de degradación que pueden cambiar adversamente su espectro de acción. Es difícil asegurar una supervisión continua de las condiciones de almacenamiento de las preparaciones, especialmente en la rutina del hospital y cuando se administran preparaciones farmacéuticas, por ejemplo, para estudios clínicos en humanos.

Todas la biomoléculas pueden hidrolizarse fácilmente a un grado mayor o menor. La hidrólisis es parte del metabolismo natural y es por ejemplo, necesaria para evitar la acumulación de sustancias tóxicas moleculares superiores en el cuerpo.

Además, se describen en la literatura otras numerosas reacciones de degradación que pueden afectar las biomoléculas a diferentes grados. En el caso de los péptidos o proteínas, tales reacciones de degradación se presentan por medio de procesos de agregación, desnaturalización, isomeri zación o reducción. En el caso de los ácidos nucleicos, la desaminación o adición de un nucleófilo resulta, por ejemplo, en la degradación de los ácidos nucleicos .

Para el desarrollo de liofilizados estables e.g. de preparaciones farmacéuticas o de diagnóstico de péptidos o proteínas, aun no existen métodos establecidos que permitan que las sustancias auxiliares sean seleccionadas confiablemente de una pluralidad de sustancias y aditivos posiblemente auxiliares que asegurarían una forma de administración estable para la sustancia activa respectiva. La selección de las sustancias auxiliares apropiadas para hacer una forma de administración adecuadamente estable que, por ejemplo, aseguren una estabilidad de almacenamiento adecuadamente larga o que retrasen o eviten las reacciones de degradación anteriormente mencionadas se lleva a cabo usualmente empíricamente.

Se conoce que la estabilidad de almacenamiento de muchas preparaciones de proteínas se aumenta mediante la eliminación de agua. Los métodos apropiados para esto son secado por congelado y secado a vacio. Sin embargo, el uso de tales procesos técnicos también causa reacciones de degradación e.g. una fase de congelado es necesaria en el secado por congelado. Sin embargo, muchas proteínas no son suficientemente resistentes a los procesos de congelado. Cuando una solución acuosa de un biopolimero se enfria, la mayoría del agua cristaliza mientras que el biopolimero permanece en un estado amorfo. Esto puede conducir a un cambio en el ambiente molecular del biopolimero, que también puede resultar en un cambio en la estructura o conformación espacial del biopolimero. Esto en cambio favorece las reacciones de degradación, por ejemplo, disminuyendo la reactividad de los grupos funcionales individuales o agregando segmentos de cadena no plegada de moléculas de polímeros adyacentes. Además de la remoción del envolvente del hidrato que rodea la proteina en la fase de secado, puede llevar a las reacciones químicas tal como oxidación en la cadena de la proteina. La adición de aditivos apropiados, puede evitar o reducir el grado de estas reacciones de degradación .

En el caso del secado por congelado o secado a vacio, una función importante de las sustancias auxiliares es proporcionar un ambiente de estabilización amorfa para el biopolimero que solidifique en un estado vitreo con enfriamiento adicional. La transición se presenta de una manera similar dentro de un intervalo de temperatura muy estrecho y se caracteriza por la temperatura vitrea Tg' . La movilidad molecular y de esta manera .también la reactividad, se disminuyen ampliamente por debajo de esta temperatura. En una formulación que es muy apropiada para secarse por congelado, la Tg' es tan alta como sea posible y típicamente por encima de -40°C. La presencia de estructuras amorfas por ejemplo, puede demostrarse mediante calorimetría de exploración diferencial (CED), por examinaciones de difracción por rayos X o por examinaciones ópticas y electromicroscópicas .

Para producir las formas de administración farmacéuticas liofilizadas adecuadamente estables, es necesario seleccionar las sustancias auxiliares que no cristalicen o en la mayoría de los casos solo cristalicen parcialmente durante el congelado. Tales sustancias auxiliares que protegen la biomolécula durante el proceso de congelado se llaman "crioprotectores" . En la fase de secado principal, el cristal de hielo sublima mientras que en la fase de secado posterior parte del agua se enlaza en la fase amorfa y se remueve en el biopolimero que usualmente requiere condiciones más drásticas (mayor temperatura o un vacio más fuerte) . La Tg' aumenta conforme disminuye el contenido de agua en el material secado por congelado. Para acortar el tiempo del proceso de secado, la temperatura de las placas de la cámara de secado por congelado se aumenta sucesivamente, pero la temperatura en el material secado por congelado nunca debe exceder la Tg' .

Durante la fase de secado la sustancias auxiliares mantienen el estado vitreo en el que el polímero se incrusta. Además de la remoción de las moléculas de agua en la fase posterior al secado, resulta en la formación de valencias libres para los enlaces de hidrógeno en el biopolimero. La adición de sustancias auxiliares de estabilización apropiadas se destina para resultar en la adición de puentes de hidrógeno para crear un ambiente sustituido con agua para el biopolimero. El término " lioprotectores" es introdujo para esto.

El limite superior para el esfuerzo de temperatura durante el almacenamiento, se determina por la temperatura de transición vitrea Tg por encima de la cual existe un aumento pronunciado en la movilidad molecular. Frecuentemente esto resulta en los procesos de cristalización (descritos por la temperatura de cristalización Tk) o reacciones químicas. Visto macroscópicamente, esto resulta frecuentemente en el asi llamado colapso de la torta de liofilizado (descrita por la temperatura de colapso Te) debido a que las moléculas de la sustancia auxiliar se asocian una con otra, lo cual se realiza por una reducción de la superficie especifica de la matriz de la sustancia auxiliar .

El agua presente en el liofilizado disminuye la Tg; en una buena formulación el contenido de humedad residual después del secado por congelado es por debajo de 3%. Sin embargo, puede aumentar bastante durante el almacenamiento a largo periodo. La temperatura de almacenamiento del liofilizado en el estado vitreo, a lo más 20°C por debajo de Tg.

La WO 93/00807 describe un sistema de dos componentes compuesto de un crioprotector (tal como polietilen glicol, PVP o almidón) o un lioprotector (tal como azúcar, polihidroxi alcohol o aminoácido) para la estabilización durante la liofilización.

Es bien conocido que la tendencia para la formación vitrea aumenta con el peso molecular. De aqui que los polímeros tal como PVP, proteínas (en particular albúmina de suero) o polisacáridos (Dextran) se usen para formar matrices vitreas estables.

Sin embargo, es bien conocido que las proteínas protectoras como la albúmina de suero, pueden ser desventajosas después de la inyección debido a que inducen la formación de anticuerpos que disminuyen sus uso como preparaciones parenterales . Además de las diferencias en los grupos de materias primas de las proteínas protectoras, puede resultar en incert idumbres debido a que esto puede influenciar adversamente la capacidad para procesar y la calidad de los grupos de productos resultantes.

Además, los polisacáridos usados como sustancias auxiliares pueden tener un efecto pirogénico en la circulación de la sangre. Una desventaja adicional de los polisacáridos es que frecuentemente requieren hincharse, para que de este modo impidan frecuentemente la formación rápida de una solución clara cuando se reconstituye un liofilizado. Además, el material se compone usualmente de una fracción que comprende diferentes longitudes de cadena que lo hace más difícil para lograr una consistencia en grupo. Lo último también aplica para polímeros sintéticos tal como PVP (polivinilpirrolidona) .

Los compuestos de polihidroxi previos tal como sacáridos (sacarosa, trehalosa, glucosa) o alcoholes de azúcares (manitol), se han usado casi exclusivamente como sustancias moleculares inferiores para la formación .vitrea en liofilizados para biomoléculas. Sin embargo, la adición de manitol sólo resulta en el estado vitreo metaestable que después puede cristalizar durante el almacenamiento.

Los azúcares reducidos tal como glucosa o maltosa, pueden causar las reacciones de radical o de reducción y también pueden formar productos Amadori con grupos amino primarios (e.g. en proteínas) . Además de la reacción de Maillard, puede resultar en una decoloración café de la preparación. Los disacáridos o trisacáridos no reducidos, pueden hidroli zarse , lo que, de otra manera, puede llevar a la formación de azúcares reducidos, pero de otra manera puede impartir potencialmente las propiedades físicas de la matriz de sustancia auxiliar. Se conoce que los alcoholes de azúcares como el manitol pueden catalizar las reacciones de hidrólisis, por ejemplo, en presencia de acetato. Además, tienen una tendencia a cristalizarse. Sin embargo el man! tol/glicina / (opcionalmente fosfato, detergente) combinaciones, se usan frecuentemente como una matriz de sustancia auxiliar para liofilizar proteínas (cf . EP O 597 101, WO 89/09614) .

-Otras desventajas o problemas en la producción de preparaciones de azúcares de almacenamiento estable que están realmente suficientemente secas, son periodos de secado considerablemente aumentados dado a que solo es posible una pequeña entrada de calor debido a la estabilidad de los materiales biológicos que se usan. Los tiempos de procesos largos son económicamente desfavorables y además, existe un riesgo de proceso más alto e.g. se puede presentar derrame en la cámara de vacio, el sistema de enfriamiento puede romperse etc.

Se encontró sorprendentemente que ciertas combinaciones de sustancias auxiliares son apropiadas como formadores vitreos para la liofilización de biomoléculas. De aqui que la presente invención se refiere a las preparaciones liofilizadas que contienen a) biomoléculas seleccionadas del grupo que comprende proteínas, péptidos, ácidos nucleicos y carbohidratos y b) uno o varios D-aminoácidos básicos o L-aminoácidos y c) uno o varios ácidos aminodicarboxilicos , ácidos hidroxi-carboxilicos , ácidos hidroxidicarboxilicos o ácidos dicarboxilicos o las sales fisiológicamente toleradas de los mismos, en donde las sustancias auxiliares están presentes en el liofilizado al menos parcialmente en una forma amorfa. Uno o varios aminoácidos neutros también podria adicionarse opcionalmente para facilitar el secado y para mejorar la estructura morfológica de la torta de liofilizado.

La selección de las sustancias auxiliares tiene el efecto de que las sustancias auxiliares están presentes en los liofilizados ya sea completamente amorfas o al menos en una modificación parcialmente amorfa. En contraste con las composiciones cristalinas, tales liofilizados tienen una temperatura de transición vitrea (Tg) que está por encima de la temperatura de almacenamiento destinada. Las combinaciones apropiadas de las sustancias auxiliares son mezclas que contienen al menos una sustancia de cada uno de los grupos (A) y (B), en donde (A) es un D-aminoácido básico o L-aminoácido y (B) es un ácido aminodicarboxi 1 i co y en particular un D-aminoácido o L-aminoácido ácido, ácido aminocarboxilico , ácido monocarboxil ico , ácido dicarboxilico o ácido hidroxidicarboxilico o las sales fisiológicamente toleradas de los mismos. Tales mezclas son apropiadas como formadores vitreos para la liofilización de biomoléculas y como resultado tienen la ventaja de que los liofilizados preparados de esta manera, son estables para un periodo largo que depende de la sensibilidad de la biomolécula usada y es preferentemente de al menos un año, en particular uno a dos años a la temperatura refrigerada o temperatura ambiente. Esto permite una reducción o prevención completa del uso de los grupos de sustancias menos apropiadas mencionadas anteriormente, de modo que las desventajas en el uso de estos grupos de sustancias puede evitarse ampliamente cuando se produce formas de administración farmacéuticas. Una ventaja adicional de los liofilizados producidos de acuerdo a la invención, es una gran reducción en el tiempo de secado especialmente cuando se usa un aminoácido hidrofóbico de menos de 30 horas, preferentemente menos de 24 horas y en particular menos de 15 horas. Esto significa que los liofilizados pueden producirse mediante el secado durante toda la noche en lugar de un proceso de secado que frecuentemente requiere de varios dias.

Los liofilizados farmacéuticamente estables pueden obtenerse cuando el par que comprende el aminoácido básico y el contraión requerido para ajustar el pH se selecciona tal que se forma una matriz durante la liofilización que es al menos parcialmente amorfa y tiene una temperatura de transición vitrea mayor de 50°C, preferentemente mayor de 65°C y en particular mayor de 80°C. Es ventajoso para el proceso de producción que la solución congelada tenga una temperatura de transición vitrea mayor de -40°C.

Para ajustar el valor del pH es posible usar adicionalmente los ácidos o bases o sales de los mismos fisiológicamente tolerados. Los ácidos apropiados son ácidos inorgánicos u orgánicos tal como ácido fosfórico, ácido acético etc. Los ácidos o bases libres se usan preferentemente para lograr una concentración salina en el liofilizado que es tan baja como sea posible. En el caso de algunos péptidos y proteínas, la formación de los agregados de proteínas se observó en el fosfato de arginina cuando se preparó la solución a liofilizarse si el contenido de fosfato fue mayor de 5 mM . Un comportamiento similar se encontró cuando se usó citrato de arginina (c = 10 mM) . Sorprendentemente la formación de agregados puede reducirse o evitarse ampliamente cuando los ácidos monocarboxilicos o ácidos dicarboxilicos se usan como un contraión en lugar de la sal de fosfato del aminoácido arginina. Los liofilizados con un estado vitreo estable se obtuvieron en particular cuando se usan los ácidos aminodicarboxilicos (e.g. D-aminoácidos o L-aminoácidos ácidos) o ácidos dicarboxilicos. Opcionalmente, el ácido fosfórico a una concentración menor de 5 M puede usarse para el ajuste fino del pH en el intervalo de 5-7 cuando se usa un aminoácido básico.

Además, las formas de administración de acuerdo a la invención tienen la ventaja adicional de que la temperatura de transición vitrea asi como la apariencia de la torta de liofilizado, se mejoró adicionalmente, especialmente cuando un aminoácido neutro se adicionó aún si éste cristaliza parcialmente. La cantidad de este aminoácido puede variarse dentro de amplios limites (5-50% de la cantidad total de sustancia auxiliar) .

Las formas de administración de acuerdo a la invención, tienen la ventaja de que son estables cuando se almacenan a temperatura ambiente durante largos periodos. Es por esto que se garantiza un uso seguro como una preparación farmacéutica aún si se rompe la cadena fria .

Los aditivos o sustancias auxiliares apropiados en el sentido de la presente invención, son una combinación de un aminoácido básico, uno ácido y al menos uno neutro en la modalidad preferida. Estas combinaciones son fisiológicamente bien toleradas, tienen buenas propiedades de secado por congelado y mejoran la estabilidad térmica de biopolimeros liofilizados. Además de la disolución del liofilizado con agua, rápidamente se logra una solución clara.

Los aminoácidos básicos que son apropiados en el sentido de la presente invención, son todos los aminoácidos fisiológicamente tolerados con un grupo lateral básico tal como histidina, lisina, arginina, ornitina o citrulina. Los aminoácidos neutros correspondientemente apropiados son los aminoácidos fisiológicamente tolerados con grupos "laterales hidrofóbicos o hidrofilicos tal como fenilalanina , glicina, leucina o isoleucina. Los ácidos apropiados son los correspondientes ácidos aminodicarboxilicos , ácidos hidroxicarboxilicos , ácidos hidroxidicarboxilicos , ácidos dicarboxilicos o las sales fisiológicamente toleradas de los mismos, tal como ácido aspártico o glutámico. Si estos ácidos tienen un centro quiral, es posible usar racematos o aún los derivados ópticamente activos.

La cantidad de aditivos de acuerdo a la invención se selecciona preferentemente, de tal forma que la relación en peso de los ácidos mencionado en el grupo c) (ácidos aminodicarboxilicos, ácidos hidroxicarboxilicos o ácidos dicarboxilicos) a los D-aminoácidos o los L-aminoácidos básicos del grupo a) está en el intervalo de 0.01:1 a 2:1 en el liofilizado. Es particularmente ventajoso un intervalo de 0.1:1 a 1:1 y en particular aproximadamente 0.5:1.

Los numerosos péptido o proteínas entran en consideración dentro del sentido de la presente invención, como sustancias activas para la producción de las formas de administración farmacéuticas de acuerdo a la invención, tales como inmunomoduladores , linfocinas, monocinas, citocinas, enzimas, anticuerpos, factores de crecimiento, factores de inhibición del crecimiento, proteínas de la sangre, hormonas, vacunas, factores de coagulación de la sangre y las proteínas precursoras correspondientes, muteinas o fragmentos de las mismas. Los péptidos o proteínas tienen un peso molecular de 0.5-500 kD, preferentemente 2.0-200 kD. Los "siguientes péptido o proteínas se mencionan como ejemplos: factor natriurético atrial o FNA (cf. WO 85/33768), y urodilatina o ularitida (cf. WO 88/06596, WO 95/33768), cardiodi latina (cf. WO 85/02850), BNP (péptidos natriuréticos cerebrales), auriculina, int erferones , factores de estimulación de colonia, interleucinas (IL-1, IL-la, IL-lß, IL-2, IL-3, IL-4, etc.), factores de activación de macrofagos, factores de células B, urocinasa, activadores de plasminógeno , TNF, NGF; eritropoyetina, EGF, hGH, BMP (proteínas morfogénicas óseas), calcitonina, insulina o relaxina.

Los ácidos nucleicos tal como plásmidos, fragmentos de ADN o hebras de ARN, también son apropiados para la forma de administración de la invención.

Las formas de administración farmacéuticas liofilizadas de acuerdo a la invención, son particularmente apropiadas para la administración parenteral en una forma liquida.

La invención se ilustra por los siguientes ejemplos y ejemplos comparativos y se aclara en lo siguiente. Se ha encontrado que las formulaciones que, como formadores vitreos en la liofilización de biomoléculas aumentan considerablemente la temperatura de transición vitrea, previenen ampliamente la agregación de las biomoléculas, mejoran la apariencia de la torta de liofilizado y son apropiadas para la estabilización térmica de las biomoléculas liofilizadas. Las formulaciones listadas demuestran que solo las mezclas de acuerdo a la invención conducen al resultado deseado, es decir, permiten que las formulaciones de las proteínas estables se obtengan en un proceso de liofilización corto como estructuras completa o parcialmente amorfas.

Los estados de concentraciones en las formulaciones de los siguientes ejemplos, se refieren a la solución antes de la liofilización.

Ejemplo 1 El valor del pH de la solución se ajusta pH 7.4 con H3P04. 2 g de L-arginina y 1 g de L-aspartato, se disolvieron en 50 mi de agua. 35 mg de G-CSF (disuelto en 30 mi de amortiguador de fosfato 10 mM) se adicionó a esta solución mediante pipeteo y se agitó durante 5 min. Subsecuentemente, se adicionó 100 µl de Tween 80 (como una solución acuosa al 10%) mediante pipeteo y se agitó durante unos 20 minutos adicionales. El pH se ajustó a 7.4 mediante la adición de ácido fosfórico y el volumen se llevó hasta 100 mi. Esta solución se filtro" a través de una membrana (filtro PVDF de 0.22 µm) y se repartieron alícuotas de 1 mi en las ampolletas de vidrio. Estas se secaron por congelado después de colocarles un tapón apropiado y el secado se llevó a cabo durante un periodo total de 40 horas. Las ampolletas se sellaron y almacenaron subsecuentemente a diferentes temperaturas hasta el análisis. Se encontró por CED, que la temperatura de transición vitrea de la torta fue de 95°C. Después de 26 semanas, se registraron los espectros de difracción por rayos X de las muestras de este liofilizado que se almacenaron a diferentes condiciones. Estos espectros muestran que es amorfo aún después del almacenamiento a una temperatura de +60°C.

Ejemplo 2 (ejemplo comparativo) Concentración de la Formulación 2 solución inicial L-valina 20 mg/ mi Glicina 20 mg/ mi Tween 80 0.1 mg/ mi G-CSF 0.35 g/ mi El valor del pH de la solución se ajusta a pH 7.4 con NaOH. 2 g de L-valina y 2 g de glicina, se disolvieron en 50 mi de agua. 100 µl de Tween 80 (como una solución acuosa al 10%) se adicionó mediante pipeteo y se agitó durante unos 20 minutos adicionales. El pH se ajustó subsecuentemente a 7.4 mediante la adición de NaOH. Se adicionó 35 mg de G-CSF (disuelto en 30 mi de amortiguador de fosfato 10 mM) mediante pipeteo a esta solución y se agitó durante 5 min. El pH se verificó y el volumen se llevó hasta 100 mi. Después de llenar las ampolletas, se preparó un liofilizado de esta solución como en el ejemplo 1. No puede observarse la transición vitrea en el CED de este liofilizado inmediatamente después de su preparación. El espectro de difracción por rayos X y las imágenes en el microscopio electrónico de exploración, mostraron que la torta es completamente cristalina. No son detectables estructuras amorfas o parcialmente amorfas.

Ejemplo 3 (ejemplo comparativo) El valor del pH de la solución se ajusta a pH 7.4 con NaOH. 1 g de L-valina y 2 g de glicina, se disolvieron en 70 mi de agua, 100 µl de Tween 80 (como una solución acuosa al 10%) se adicionó y se agitó durante 20 minutos. Subsecuentemente el pH se ajustó a 7.0 mediante la adición de NaOH. Se adicionó 30 mg (15 kU) de LDH (músculo de porcino, disuelto en 20 mi de amortiguador de fosfato 20 mM) mediante pipeteo a esta solución y se agitó durante 5 min. El pH se verificó y el volumen se llevó hasta 100 mi. Después de llenar las ampolletas, se preparó un liofilizado de esta solución como en el ejemplo 1. Esta formulación también es completamente cristalina. No son detectables estructuras amorfas.

Ejemplo 4 El valor del pH de "la solución se ajusta a pH 7.4 con H3PO4. 2 g de L-arginina, 1 g de ácido aspártico y 1 g de L-fenilalanina , se disolvieron en 70 mi de agua, 100 µl de Tween 80 (como una solución acuosa al 10%) se adicionó mediante pipeteo y se agitó durante 20 minutos. Subsecuentemente el pH se ajustó a 7.4 mediante la adición de ácido fosfórico. Se adicionó 50 mg de (15 kU) de LDH (de músculo de porcino, disuelto en 30 mi de amortiguador de fosfato 100 mM) mediante pipeteo a esta solución y se agitó durante 5 min. El pH se verificó y el volumen se llevó hasta 100 mi. Después de llenar las ampolletas, se preparó un liofilizado de esta solución como en el ejemplo 1. El análisis mostró que algo de la fenilalanina estuvo presente en una forma cristalina i.e. la torta es parcialmente cristalina y parcialmente amorfa. La proporción cristalina permaneció constante durante el almacenamiento .

E emplo 5 El contenido de G-CSF sin cambio en las formulaciones 1 y 2, se determinó mediante RP-HPLC después de almacenar las ampolletas a temperatura ambiente (TA) : Proporción de la proteina que no cambió después de 4 semanas a TA Sustancia activa de volumen 96.5% sin adición de sustancias auxiliares, liofilizada L-arginina/fosfato/ácido 98.9 aspártico/Tween 80 (formulación 1) L-valina/glicina/Tween 80 92.0% (formulación 2) La actividad enzimática de las formulaciones 3 y 4, se determinó en una prueba óptica acoplada después de almacenar las ampolletas a TA (después de 5 o 13 semanas ) : Ejemplo 6 Los liofilizados se prepararon de una manera análoga a la formulación 4, pero la arginina se reemplazó por la misma cantidad molar de los otros ácidos aminocarboxilicos básicos. La actividad enzimática de LDH en el liofilizado, se determinó después de 5 semanas de almacenamiento a temperatura ambiente (TA) .

Ejemplo 7 El valor del pH de la solución se ajusta a pH 6.3 con ácido (ver abajo) . 2 g de L-arginina se disolvió en 50 mi de agua y se ajustó un pH de 6.3 adicionando un ácido. Se adicionaron 1 g de isoleucina y 1 mg de rhNGF y se llevó a un volumen de 100 mi con agua. Esta solución se filtro a través de una membrana (filtro PVDF de 0.22 µm) y se repartieron en ampolletas de vidrio alícuotas de 1 mi. Después de colocar un tapón apropiado, se llevó a cabo el secado por congelado después de un periodo de secado total de aproximadamente 40 horas. Los liofilizados se midieron subsecuentemente usando CED.

Resultado Ejemplo 8 (ejemplo comparativo) El valor de pH de la solución se ajusta a pH 6.0 con H3PO4. 2 g de L-arginina se disolvió en 50 mi de agua y se ajustó a un pH de 6.0 mediante la adición de ácido fosfórico. Se adicionó 100 mg de ularitida (disuelta en 30 mi de H20) mediante pipeteo a esta solución y se agitó durante 10 min. La solución llegó a ser turbia después de 60 minutos y la proteina floculó. Después de esto el experimento se terminó.

Ejemplo 9 (ejemplo comparativo) El valor de pH de la solución se ajusta a pH 6.0 con ácido cítrico. 2 g de L-arginina se disolvió en 50 mi de agua y se ajustó a un pH de 6.0 mediante la adición de ácido cítrico. Se adicionó 100 mg de ularitida (disuelta en 30 mi de H20) mediante pipeteo a esta solución y se agitó durante 10 min. La solución llegó a ser turbia después de 2 horas y la proteina floculó. Después de esto ei experimento se terminó.

E emplo 10 Los liofilizados que contienen la sustancia ularitida de sustancia activa, se prepararon mediante el proceso del ejemplo 7 con las siguientes composiciones por ampolleta: a) Formulación 19 (ejemplo comparativo) 1 mg de ularitida 10 mg de manitol se ajusta el pH a 6.3 con ácido acético El análisis del patrón de difracción por rayos X mostró que el liofilizado tiene una estructura completamente cristalina. No son detectables estructuras amorfas o parcialmente amorfas. b) Formulación 20 1 mg de ularitida 20 mg de L-arginina ~~ 10 mg de L-isoleucina se ajusta el pH a 6.3 con ácido aspártico Evaluación en CED: Formulación 19: no es detectable la transición vitrea, completamente cristalina Formulación 20: Tg = 85.1°C, estructura parcialmente amorfa Ambas formulaciones 19 y 20, se almacenaron durante 1 año a temperatura ambiente. Los resultados de la electrofores is en gel subsecuente fueron como sigue: Form. 19: dimeros > 1% y agregados solubles Form. 20: 100% monómero.

Ejemplo 11 Se prepararon los liofilizados con las siguientes composiciones de formulación por ampolleta usando el proceso del ejemplo 7: Form. 21 (ejemplo comparativo) 1 mg de ularitida 50 mg de sacarosa 10 mg de glicina 6 mg de polietilen glicol 6000 b) Form. 22 1 mg ularitida 20 mg de L-arginina 10 mi L-isoleucina se ajusta el pH a 6.3 con ácido aspártico b) Form. 23 4 mg ularitida 20 mg de L-arginina 10 mi L-isoleucina se ajusta el pH a 6.3 con ácido aspártico b) Form. 24 1 mg ularitida 20 mg de L-arginina 10 mi L-isoleucina se ajusta el pH a 6.3 con ácido aspártico b) Form. 25 (ejemplo comparativo 1 mg ularitida 25 mg de sacarosa 20 mg de glicina Todas las formulaciones 21-25 se almacenaron en una prueba de resistencia a diferentes temperaturas y subsecuentemente se determinó el contenido con RP-HPLC.

Los resultados de los ejemplos 10 y 11 muestran que las formulaciones de acuerdo a la invención, estabilizan el mejor péptido contra la resistencia a la temperatura que las formulaciones correspondientes basadas en sacarosa o sacarosa/PEG del arte previo. El manitol usado en muchas formulaciones, tampoco resulta en una formulación adecuadamente estable.

Los ejemplos 8 y 9 muestran que los ácidos que frecuentemente se usan en los sistemas amortiguadores, originan la floculación de ciertos péptidos. Esto no se observó con los ácidos (preferentemente el ácido aspártico y ácido glutámico) usados en las formulaciones de acuerdo a la invención.

Ejemplo 12 Los liofilizados que contienen la ularitida de sustancia activa, se prepararon mediante el proceso del ejemplo 7 con las siguientes composiciones por ampolleta : Form. 26 (ejemplo comparativo) __ 1 mg ularitida 15 mg de glicina 2 mg de L-isoleucina 10 mg de urea 0.5 mg de polisorbato se ajusta el pH a 6.8 con amortiguador de acetato de Na; completamente cristalino. b) Form. 27 1 mg ularitida 20 mg de D-arginina 10 mg de D-isoleucina se ajusta el pH a 6.8 con ácido D-aspártico Form. 28 1 mg ularitida 20 mg de L-arginina mg de L-isoleucina se ajusta el pH a 6.8 con ácido L-aspártico d) Form. 29 (ejemplo comparativo 1 mg ularitida 20 mg de L-treonina 10 mg de D-isoleucina e) Form. 30 (ejemplo comparativo) _ . 1 mg ularitida 15 mg de polietilen glicol 6000 5 mg de fenilalanina Todas las form laciones se almacenaron en una prueba de resistencia a diferentes _ temperaturas y subsecuentemente se determinó la cantidad del producto de degradación principal por RP-HPLC (pico XI) : Considerablemente, se forma menos producto de degradación del péptido en las formulaciones de acuerdo a la invención. Aunque la formulación 29 resulta en una torta de liofilizado amorfa, no es suficiente para estabilizar la proteina.

Ejemplo 13 Los liofilizados que contienen la ularitida de sustancia activa, se prepararon usando en proceso del ejemplo 7 con las siguientes composiciones por ampolleta : a ) Form . 31 1 mg de ularitida 70 mg de sacarosa 10 mg de L-fenilalanina b) Form. 32 1 mg de ularitida 85 mg de sacarosa c) Form. 33 1 mg de ularitida 46 mg de rafinosa 10 mg de L-fenilalanina Form. 34 1 mg de ularitida 20 mg de L-arginina 5 mg de L- fenilalanina se ajusta el pH a 6.3 con ácido L-aspártico Todas las formulaciones 31-34 se almacenaron en una prueba de resistencia a diferentes temperaturas, subsecuentemente los liofilizados se disolvieron en 1 mi de agua y se determinó la turbidez de la solución reconstituida después de 1 hora en un nefelómetro (tipo Hach) . Los valores de la turbidez por encima de 1.0 se encuentran en el intervalo no aceptable. Debido a que las sustancias auxiliares son fácilmente solubles, la turbidez observada en varias formulaciones es debido a una agregación del péptido.

Resultados TR = temperatura del ref igerador: -8 C TA = temperatura ambiente: 20-22°C Sólo las formulaciones de acuerdo a la invención no excedieron el valor del umbral de turbidez de 1.0 después de la resistencia térmica.

Ejemplo 14 La ularitida se reconstituyó en varias formulaciones después del almacenamiento, como en el ejemplo 11 y la solución se examinó para partículas usando un instrumento de medición de la dispersión de luz (PMS) .

Resultados : (en cada caso se establecieron los medios para el conteo de 5 ampolletas) Las formulaciones de acuerdo a la invención no mostraron aumento critico en el número de partículas después del almacenamiento a una temperatura elevada.

Ejemplo 15 Los liofilizados que contienen la proteina rhNGF se prepararon con las siguientes composiciones: a) Form. 35 0.025 mg de rhNGF 20 mg de L-arginina 10 mg de ácido L-aspártico se ajusta el pH a 6.3 con ácido acético b ) For . 36 0.025 mg de rhNGF 20 mg de L-arginina 10 mg de ácido L-aspártico 10 mg de L-isoleucina se ajusta el pH a 6.3 con ácido acético c) Fqrm. 37 (ejemplo comparativo) 0.025 mg de rhNGF 20 mg de L-arginina 30 mg de sacarosa se ajusta el pH a 6.3 con ácido acético Form. 38 (ejemplo comparativo) 0.025 mg de rhNGF 20 mg de L-arginina 30 mg de rafinosa se ajusta el pH a 6.3 con ácido acético El programa de liofilización se acortó considerablemente comparado con los programas usuales: un toral de 15 horas en lugar de usualmente 40-50 horas. Subsecuentemente, se determinó la humedad residual en el liofilizado en dos determinaciones independientes .

Resultado Formulación 35 4.7%/5.0% Formulación 36 1.0%/0.9% Formulación 37 5.9%/6.6% Formulación 38 5.6%/5.6% El ejemplo muestra que un acortamiento del periodo de liofilización es sólo posible con las formulaciones de acuerdo a la invención, especialmente cuando se usa un aminoácido hidrofóbico como el tercer componente.

Ejemplo 16 Los liofilizados que contienen la proteina rhNGF se prepararon con las siguientes formulaciones: a) Form. 39 0.025 mg de rhNGF 20 mg de L-arginina 10 mg de ß-alanina 10 mg de ácido L-aspártico se ajusta el pH a 6.3 con ácido acético b) Form. 40 0.025 mg de rhNGF 20 mg de L-arginina 8 mg de ácido L-aspártico 10 mg de L-isoleucina se ajusta el pH a 8.7 con ácido acético c ) Form . 41 0.025 mg de rhNGF 20 mg de L-arginina 12 mg de ácido L-aspártico 10 mg de L-isoleucina se ajusta el pH a 4.5 con ácido málico La liofilización se llevó a cabo con el mismo programa que se estableció en el ejemplo 15 y subsecuentemente, se determinó la humedad residual: Resultado Formulación 39 1.2%/1. ' Formulación 40 1.6%/l .9! Formulación 41 0.8%/0.9 ' Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes .

Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. Las preparaciones liofilizadas, caracterizadas porque contienen a) biomoléculas seleccionadas del grupo que comprende proteínas, péptidos, ácidos nucleicos y carbohidratos b) uno o varios D-aminoácidos o L-aminoácidos básicos y c) Uno o varios ácidos aminodicarboxilicos, ácidos hidroxi -carboxi 1 icos , ácidos hidroxidicarboxi li cos o ácidos dicarboxilicos o las sales fisiológicamente compatibles de los mismos en donde las sustancias auxiliares están présenles en el liofilizado en una forma completa o parcialmente amorfa.

2. Las preparaciones liofilizadas como se reivindica en la reivindicación 1, caracterizadas porque la relación en peso de los aditivos mencionados en c) a los aditivos mencionados en b) está en el intervalo de 0.01:1 a 2:1.

3. Las preparaciones liofilizadas como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1-2, caracterizadas porque contienen polímeros (compuestos con un peso molecular > 1000 Da) como sustancias auxiliares en una cantidad menor de 10% en peso de la masa total de las sustancias auxiliares.

4. Las preparaciones liofilizadas como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizadas porque contienen azúcares como sustancias auxiliares en una cantidad menor de 10% en peso de la masa total de las sustancias auxiliares

5. Las preparaciones liofilizadas como se reivindica en cualquiera de las rei indicaciones 1-4, caracterizadas porque tienen una temperatura de transición vitrea de > 50°C.

6. Las preparaciones liofilizadas como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizadas porque la solución congelada tiene una temperatura de transición vitrea por encima de -40°C antes de la liofilización.

7. Las preparaciones liofilizadas como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1-6, caracterizadas porque el ácido aminocarboxilico es el ácido aspártico o ácido glutámico.

8. Las preparaciones liofilizadas como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1-7, caracterizadas porque contienen adicionalmente uno o varios aminoácidos con un residuo hidrofóbico.

9. Las preparaciones liofilizadas como se reivindica en la reivindicación 8, caracterizadas porque contienen leucina, isoleucina, valina o fenilalanina , en particular isoleucina o fenilalanina .

10. Las preparaciones liofilizadas como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1-9, caracterizadas porque la solución reconstituida con agua tiene un pH entre aproximadamente 3 y 9.

11. Las preparaciones liofilizadas como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1-10, caracterizadas porque la relación másica de la biomolé'cula a la sustancia auxiliar es menor de 1:10.

12. Las preparaciones liofilizadas ~ como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1-11, caracterizadas porque la biomolécula es un péptido de la clase de los péptidos na t riurét icos atriales (ANP) .

13. El proceso para la producción de preparaciones liofilizadas como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1-12, caracterizado porque una solución o suspensión de la biomolécula se prepara en un disolvente fisiológicamente tolerado y a) uno o varios D-aminoácidos o L-aminoácidos básicos y b) al menos uno o varios ácidos aminodicarboxilicos o ácidos orgánicos o inorgánicos se adicionan y subsecuentemente la solución se liofiliza.

14. El proceso como se reivindica en el reivindicación 13, caracterizado porque la liofilización se lleva a cabo comenzando con una solución acuosa con un contenido de fosfato menor de 5 mM .