MXPA99004511A - Metodo y compuestos novedosos para utilizarse enel mismo - Google Patents

Abstract

La invención proporciona macromoléculas novedosas, métodos para su preparación, formulaciones farmacéuticas de las mismas y su uso como agentes contra influenza. La invención también proporciona un método de diagnóstico novedoso, el cual puede ser utilizado para la detección de todos los tipos de virus de influenza A y B. El compuesto macromolecular de la invención tiene unida al mismo una o más moléculas (aglutinantes de neuraminidasa), las cuales se unen al sitio activo de neuraminidasa de virus de influenza, pero las cuales no son desdobladas por la neuraminidasa.

Description

MÉTODO Y COMPUESTOS NOVEDOSOS PARA UTILIZARSE EN EL MISMO CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere a una nueva clase de compuestos químicos y su uso en medicina. En particular, la invención proporciona macromoléculas novedosas, métodos para su preparación, formulaciones farmacéuticas de las mismas y su uso como agentes contra influenza. La invención también proporciona un método de diagnóstico novedoso el cual puede ser utilizado para la detección de todos los tipos del virus de influenza A y B.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los virus de influenza A y B son la causa principal de enfermedades respiratorias agudas, dando como resultado en 30-50 millones de infecciones, estimado, anualmente en los Estados Unidos solamente. La influenza A ha sido responsable de epidemias principales, tales como "Spanish Flu" de 1919, que aniquiló a millones de personas. La influenza permanece como una enfermedad difícil de controlar, dando como resultado una morbidez significativa, y mortalidad enorme debido a la infección secundaria en pacientes mayores o débiles. Las vacunas están continuamente siendo obsoletas por cambio o desplazamiento antigénico, y consecuentemente la inmunización es sólo alrededor de un 70% efectiva para evitar la infección. Los únicos fármacos probados por autoridades reguladoras para el tratamiento de influenza son amantidina y rimantidina, los cuales no son efectivos contra influenza B, y se sabe que tienen serios efectos laterales. Muchas infecciones virales y bacterianas pueden presentarse con síntomas similares a aquellos de la influenza. La rápida identificación de virus respiratorios podría permitir a los médicos utilizar la terapia más apropiada desde el principio de la enfermedad. Por ejemplo, un diagnóstico temprano y exacto podría permitir decisiones con respecto al uso de la terapia antibacteriana y hospitalización para niños y personas mayores. Las pruebas de laboratorio para la identificación de virus en material clínico se utilizan ampliamente, y está disponible una variedad de diferentes metodologías de detección. El libro, "Laboratory Diagnosis of Viral Infectlons", Marcel Dekker 1992, Ed E.H. Lennette, generalmente describe métodos que son utilizados para una amplia variedad de virus, incluyendo virus de influenza. Un número de pruebas está disponible para el diagnóstico de influenza A y B. El método tradicional para identificar el virus de influenza ha sido utilizar el cultivo de célula, el cual es altamente sensible y específico. Desafortunadamente, el tiempo requerido para el cultivo, aislamiento e identificación del virus de influenza puede variar de entre 2 y 10 días, haciendo así virtualmente inútil la guía del médico hacia una terapia apropiada. Ya que la infección por virus de influenza es normalmente autolimitada, el diagnóstico debe ser rápido si la terapia va ha ser efectiva. Además de los métodos de cultivo de célula para detectar influenza, recientemente se han hecho disponibles algunas pruebas rápidas directas, las cuales son específicas para influenza A. De esta manera, se ha reportado un ensayo de inmunofluoresencia monoclonal (IFA) (Spada, B. et al, J. Virol. Method, 1991 33 305) y por lo menos un inmunoensayo de enzima rápido (ElA) está disponible (Ryan-Poirier, K.A. et al, J Clin. Microbiol., 1992 30 1072). Un número de comparaciones de estos rápidos métodos de detección para influenza A ha sido reportado; ver por ejemplo, Leonardi, G.P. et al, J. Clin. Microbiol., 1994 32 70, quien recomendó que el espécimen directo probado sea utilizado junto con el aislamiento del cultivo, con el fin de permitir tanto la identificación del virus en el momento de instituir la terapia y medidas de control de infección, como verificar la constitución antigénica de cepas de influenza prevalentes en la comunidad. El método IFA se reporta como muy laborioso, y requiere considerable experiencia técnica, y los resultados por lo regular son difíciles de interpretar. Por otro lado, el método de ElA (Directigen FLU-A; Becton Dickinson Microbiology System) tuvo un alto nivel de resultados positivos falsos, y se ha recomendado que este ensayo deba ser utilizado en laboratorios solamente como una adición o substitución para pruebas de ¡nmunofluoresencia directa (Warner, J.L. et al, J. Clin. Microbiol., 1991 29479).

Así como los problemas mencionados anteriormente con los rápidos ensayos actualmente disponibles para influenza, existen otras deficiencias fundamentales en algunos de estos métodos. En primer lugar, ninguno de los ensayos disponibles puede detectar influenza B, lo cual significa que aún un resultado de prueba negativo podría dejar al médico indeciso con respecto al tipo de terapia que debe ser utilizada. En segundo lugar, si un rápido ensayo de ¡nmunoensayo depende del uso de anticuerpos para una de las proteínas de influenza A, puede presentarse un serio problema para detectar nuevas cepas de los virus que han sufrido un cambio o desplazamiento en la estructura de las proteínas antigénicas. La influenza A es notoria por su propensión a sufrir tales cambios. Otro tipo de ensayo rápido para virus de influenza ha sido descrito en una serie de especificaciones de patente (ver, por ejemplo, Liav, A. et al, solicitud de patente PCT número 92/12256). El método implica el uso de un substrato cromogénico para la enzima de neuraminidasa de influenza. En otras palabras, el ensayo depende de una visualización con colorante, que se forma cuando la neuramindasa de influenza desdobla una molécula de conjugado de ácido siálico-colorante especial. Esta técnica parece ofrecer carácter específico limitado, ya que fácilmente no puede distinguir entre la presencia de neuraminidasa viral y otras formas de la enzima, particularmente neuraminidasa bacteriana. También pueden tener una baja sensibilidad debido a la actividad relativamente lenta de la neuraminidasa viral. La influenza A y B tiene dos glicoproteínas de superficie principales, la hemaglutinina (HA) y la enzima neuraminidasa (NA), ambas son esenciales para la infección. Se cree que HA es necesaria para que el virus se una a células, mientras que la NA es necesaria para la liberación del virus desde las superficies de las células. Típicamente, existen alrededor de 600 copias de HA trimérica y aproximadamente 50 copias de las unidades de tetrámero de NA sobre la superficie de cada partícula de virus. Tanto HA como NA por lo tanto, son objetivos potenciales atractivos en la búsqueda de fármacos contra influenza, pero actualmente no están disponibles fármacos contra la influenza que trabajen en cualquiera de estos sitios para uso clínico. La hemaglutinina de virus de la influenza se une al glicoproteínas y glicolípidos que contienen ácido siálico sobre receptores de superficie de célula, iniciando así el proceso de unión del virus a una célula y la subsecuente infección. La resistencia de la unión de una partícula de virus a la membrana de célula parece depender de la interacción copias múltiples de la HA de la influenza con múltiples grupos de ácido siálico sobre la superficie de la célula. Utilizando este concepto de interacción polivalente, varios trabajadores han reportado la síntesis de macromoléculas que contienen dos o más derivados de ácido siálico, los cuales actúan como inhibidores de hemaglutinina. Aunque algunos fuertes inhibidores de HA han sido descubiertos, ninguna de estas macromoléculas polivalentes ha mostrado evitar infección de influenza in vivo. Documentos recientes de Whitesides y colaboradores (J. Amer. Chem. Soc, 1996 118 3789-3800; J. Medicinal Chem., 1995 38 4179-4190) han resumido que los varios esfuerzos que han sido utilizados en este aspecto para el diseño de inhibidores de hemaglutinina de influenza. Existen varios inhibidores conocidos de NA, la mayoría de los cuales son análogos cercanos de ácido neuramínico, el substrato natural de la enzima, tal como ácido 2-deoxi-2,3-didehidro-N-acetilneuramínico (DANA) (Meindl et al, Virology, 1974 58 457-63). La solicitud de patente internacional número WO 91/16320 describe análogos de DANA, los cuales son muy activos, tanto in vivo como in vitro, contra neuramindasa de influenza A y B. Uno de estos compuestos (Compuesto I, designado GG167 o 4-guanidino-Neu5Ac2en) está en ensayo clínico, y muestra ser prometedor para el tratamiento de influenza (Hayden, F. G. et al, J. Amer. Med. Assoc., 1996 275295).

Compuesto (I) GG167 Más recientemente, se han descrito compuestos aromáticos con actividad inhibidora de neuraminidasa en la patente de E.U.A. número 5,453,533 de Luo y otros y la patente de E.U.A. número 5,512,596 de Gilead Sciences, Inc., y análogos del compuesto (I), en particular compuestos en donde la cadena lateral en el carbono 6 está enlazada con éter, que han sido descritos en la solicitud de patente internacional número WO 96/26933 de Gilead Sciences, Inc. y en C. Kim et al, J. Amer. Chem. Soc, 1997 119 681. Varios grupos de investigación han intentado encontrar análogos más simples o más potentes del compuesto I, pero los reportes hasta la actualidad (por ejemplo, Bamford M. J,. J. Chem. Soc. Perkin Trans. I, 1995, 1181) indican que cualquier cambio a la estructura del compuesto I, particularmente en la cadena lateral glicerol, probablemente puede reducir las propiedades de unión de neuraminidasa. Además, en contraste a la situación HA, no parece existir ninguna macromolécula conocida o inhibidores poliméricos de neuramindasa. Los polímeros que contienen ácido siálico han sido descritos en la patente de E.U.A. número 5,192,661 de Roy y otros y en la patente de E.U.A. número 5,571,836 de Bovin y otros, pero estos compuestos fueron polisialosidas sintéticas designadas para utilizarse como antígenos o como aglutinantes de hemaglutinina.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN En un primer aspecto, la invención proporciona compuestos macromoleculares, a los cuales se les ha unido una o más moléculas que se unen al sitio activo de neuraminidasa del virus de influenza; estas moléculas son denominadas en la presente como "aglutinantes de neuraminidasa". Preferiblemente, el aglutinante de neuraminidasa está unido a la molécula a través de un grupo separador o eslabonador, de manera que el aglutinante de neuraminidasa estéricamente no es impedido por la estructura de cadena de la macromolécula. Y el aglutinante de neuraminidasa puede ser cualquier agente que se una al sitio activo de la neuraminidasa del virus de influenza, siempre que no sea desdoblado por la enzima. La necesidad de unión no es irreversible, pero el grupo de unión debe tener una alta afinidad de unión, preferiblemente un IC50 de 10"6 M o menos. La invención particularmente se refiere a una nueva clase de compuestos químicos y su uso como agentes terapéuticos y de diagnóstico para el tratamiento y detección de influenza A y B. Más específicamente, la invención se refiere a macromoléculas a las cuales se les han unido derivados de ácido neuramínico (ácido siálico) que se une a neuraminidasa de la influenza A o B, y que opcionalmente también tiene una funcionalidad que permite que los compuestos se unan a una superficie, o que puedan ser utilizados como una marca detectable. Sorprendentemente, se ha encontrado que cuando el compuesto I es funcionalizado a través de la posición 7 de la estructura de ácido siálico, se puede unir a polímeros sintéticos o naturales grandes para dar complejos que inhiben neuraminidasa de influenza A o B, y los cuales pueden evitar o inhibir la infección de influenza. En lugar de destruir las propiedades de unión de neuraminidasa de influenza del compuesto I, se encontró que cuando se enlazan números múltiples de este y compuestos similares a través de su posición 7 mediante un separador adecuado a una variedad de moléculas, la unión promedio por grupo de ácido siálico no es substancialmente reducida. De esta manera, a través de la unión a la neuramindasa, las macromoléculas quedan herméticamente unidas al virus, y posiblemente debido al tamaño y efectos estéricos complejos, se reduce la infección de los viriones de influenza. Dichos compuestos macromoleculares también pueden ser utilizados para permitir la detección del virus de influenza A y B a través de su habilidad tanto para unir el virus de influenza selectivamente como al mismo tiempo unirse a una superficie o a un grupo de unión detectable. La actividad biológica de los compuestos macromoleculares de la invención y el método de diagnóstico de la invención ambos se basan en el uso de ligandos en las moléculas que son capaces de unirse específicamente al sitio activo de la neuraminidasa del virus de influenza, o derivados funcionalizados de dichos compuestos, como agentes de unión y/o detección para identificar el virus de influenza en especímenes clínicos. El término "aglutinantes de neuraminidasa" se utiliza de aquí en adelante para denominar estos compuestos y sus derivados funcionalizados. El método y compuestos de la invención pueden funcionar ya sea en presencia o en ausencia de compuestos que se unen no específicamente a la neuraminidasa de virus de influenza. En una modalidad preferida, la presente invención proporciona un compuesto de la fórmula II: (X - Y)n-M-(Z)m (II) en donde X es un derivado de ácido 2,3-dehidro-siálico (2) unido a neuraminidasa, el cual está enlazado a la posición 7 a través de un grupo separador Y a una molécula M, y Z es un substituyente extra opcional sobre la macromolécula. La porción de unión de neuraminidasa X es un derivado de ácido siálico de la fórmula (2): (2) en donde el separador Y conecta el grupo W, y en donde R representa un grupo azido, un grupo guanidino no substituido o substituido, o un grupo amino no substituido o substituido; R2 representa COCH3, COCF3, SO2CH3 o SO2CF3; W representa O(C = O)NH, O(C = S)NH, NH(C = O)NH o NH(C = S)NH y está unido a través de NH al grupo Y; m es un entero de entre 0 y 1,000; y n es un entero de entre 1 y 1,000. El grupo separador Y es una cadena opcionalmente substituida de hasta 1,000 átomos seleccionados de carbono, nitrógeno, oxígeno y azufre. La macromolécula M es un polímero sintético o natural, proteína, anticuerpo o enzima de peso molecular de 104 hasta 107. El grupo Y generalmente está enlazado en forma covalente a la macromolécula M, pero también puede unirse a través de una unión no covalente, por ejemplo, cuando M es avidina e Y tiene un grupo biotina terminal. El segundo substituyente y opcional Z puede ser un grupo que se une a hemaglutinina, tal como un derivado de ácido siálico 2-enlazado, o un grupo que pueda actuar como una marca detectable, tal como una molécula de biotina o fluorescente, puede ser un hapteno de unión a anticuerpo. El substituyente opcional Z también puede ser una enzima tal como peroxidasa de rábano (HRP) o fosfatasa alcalina (AP), los cuales pueden ser utilizados para permitir la detección de influenza. Alternativamente, el grupo Z puede ser un grupo con una funcionalidad terminal que es adecuada para unir a la macromolécula a una superficie, tal como NH2, SH, CO2H, CHO, o CH = CH2.

En otra modalidad preferida, la invención proporciona aglutinantes de neuraminidasa de la fórmula NA: (X' - Y)n-M- (Z)m (NA) en donde X' es un derivado de ciclohexenilo de unión de neuraminidasa de la fórmula (2a): (2a¡ que está enlazado a través del brazo lateral de éter, R, R2, Y, n y m son como se definieron anteriormente para la fórmula (2), y Ri y W' son grupos alquilo o alquileno de 1 a 12 átomos de carbono lipofílicos, los cuales están opcionalmente substituidos por uno o más átomos de halógeno o grupos alcoxi, haloalcoxi o arilo opcionalmente substituido. Los grupos separadores Y adecuados incluyen, pero no se limitan a, grupos aminoalquilo, ácidos poliamino, péptidos lineales, oligosacáridos y polisacáridos, unidades de glicol polietilénico y aminodialquilureas, cualquiera de los cuales puede ser utilizado sólo o en combinación. Típicamente, el grupo separador Y tiene un grupo amino terminal, el cual es utilizado para formar una amida o enlace de base Schiffs sobre la macromolécula M. Los substituyentes adecuados de los grupos guanidino o amino R incluyen metilo, etilo, alilo, amino, ciano o nitro. Las macromoléculas adecuadas M incluyen proteínas, enzimas, anticuerpos, polímeros sintéticos solubles en agua tales como ácidos poliacrílicos y poliacrilamidas, polisacáridos y poliaminoácidos. Las macromoléculas que son particularmente adecuadas para utilizarse en aplicaciones de diagnóstico incluyen albúmina de suero de bovino (BSA), peroxidasa de rábano (HRP), avidina y proteínas relacionadas tales como estreptavidina o neutravidina, e inmunoglobulinas. Las macromoléculas que son particularmente adecuadas para utilizarse en compuestos de la invención que serán utilizadas en el tratamiento de influenza incluyen polisacáridos, polímeros sintéticos tales como poliacrilamidas, glicoles polietilénicos, poliureas, poliácidos, poliésteres, poliamidas y varios copolímeros tales como N-(2-hidroxipropil)metacrilamida (HMPA), los cuales se sabe que son seguros para administrarse en seres humanos. Los expertos en la técnica estarán consientes de otros polímeros farmacéuticamente aceptables. Un grupo preferido de compuestos de la invención comprende los compuestos (II), en donde X es un derivado GG167 de la fórmula (2) en donde: R es guanidina, R es acetilo, W es el grupo O( = CO)NH y el separador Y es una cadena hecha de hasta 6 y 60 átomos de carbono, nitrógeno y oxígeno. Las macromoléculas de la fórmula (II) son inhibidores de neuraminidasa de influenza A y B y poseen actividad contra influenza. De esta manera, en un segundo aspecto de la invención, se proporciona una composición farmacéutica para el tratamiento de influenza A o influenza B que comprende un compuesto de la invención, preferiblemente un compuesto de la fórmula (II) o de la fórmula (NA), o un derivado farmacéuticamente aceptable del mismo, junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable. En un tercer aspecto, se proporciona un método para el tratamiento de infección de influenza en un mamífero, incluyendo el hombre, que comprende el paso de administrar una cantidad efectiva de un compuesto de la invención, preferiblemente un compuesto de la fórmula (II) o la fórmula (HA) o un derivado farmacéuticamente aceptable del mismo, a un mamífero con necesidad de dicho tratamiento. También se proporciona en un cuarto aspecto el uso de un compuesto de la invención, preferiblemente un compuesto de la fórmula (II) o la fórmula (HA) para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una infección viral de influenza. Los compuestos de la invención también pueden ser utilizados en combinación con otros agentes terapéuticos, por ejemplo, otros agentes contra infección, particularmente otros agentes antivirales.

La invención de esta manera proporciona en un aspecto adicional una composición farmacéutica que comprende un compuesto de la invención, preferiblemente un compuesto de la fórmula (II) o la fórmula (HA) o una sal o derivado farmacéuticamente aceptable del mismo, junto con uno o más agentes terapéuticamente activos, en particular un agente antiviral, junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable. La invención también proporciona en otro aspecto un método para detectar el virus de influenza, que comprende el paso de exponer una muestra con sospecha de incluir dicho virus a un compuesto de la invención que es capaz de unirse específicamente al sitio activo de neuraminidasa de virus de influenza. El método de la invención es aplicable a todos los tipos de influenza A e influenza B. Para la detección de influenza, los compuestos de la invención (II) pueden unirse a una superficie, ya sea a través de unión covalente o a través de unión no específica. El grupo separador Y debe ser suficientemente largo que las unidades de unión de neuraminidasa X quedan expuestas sobre la superficie de la macromolécula M y tienen acceso a una partícula de virus. Para la detección de influenza, el método de la invención puede utilizar captura selectiva con un compuesto de la fórmula (II) y de esta manera la concentración del virus, seguido por la detección del virus utilizando cualquier método conveniente; el método de detección no necesita tener selectividad inherente. Por ejemplo, el aglutinante (II) puede ser unido a un material de soporte, tal como una membrana o polímero, de manera que las partículas de virus se verán selectivamente capturadas y concentradas cuando una muestra se haga pasar sobre o a través del soporte. Por lo tanto, en una modalidad preferida de la invención, el grupo Z termina en una funcionalidad capaz de unirse a una superficie. Muchas funcionalidades adecuadas son conocidas en la técnica. Alternativamente, se puede utilizar un aspecto de detección selectiva; las partículas de virus en una muestra pueden ser, por ejemplo, no específicamente capturadas y después expuestas al aglutinante de neuraminidasa macromolecular (II), el cual incluye una marca detectable Z, bajo condiciones de manera que el aglutinante se une selectivamente a la neuraminidasa de influenza sobre la superficie de la partícula viral. La marca detectable después es detectada utilizando cualquier método conveniente. Para sistemas de detección, es conveniente enfocar la muestra en un área confinada, por ejemplo, una mancha o una línea sobre una superficie. Esto puede lograrse a través de una variedad de métodos; por ejemplo, la muestra puede ser suspendida o no selectivamente capturada en un filtro u otro material de soporte, y después exponerse al aglutinante marcado como se hizo anteriormente. En otro aspecto alternativo, la invención puede utilizar una combinación de captura selectiva y detección selectiva para proporcionar un método de dos etapas simple y sensible para detectar el virus de influenza. Esto hace uso del hecho de que las partículas del virus de influenza típicamente tienen alrededor de 100 moléculas de neuraminidasa extendida sobre su superficie esférica (White, D.O, Curr. Top. Microbiol. Immunol, 1974 63 1-48), y, por lo tanto, pueden unirse a más de un aglutinante al mismo tiempo. De esta manera, un compuesto aglutinante de neuraminidasa (II) puede ser unido a un soporte, por ejemplo, como una banda estrecha a través de la longitud de la membrana porosa. La muestra de prueba después es aplicada al otro extremo de la membrana y se deja fluir a través de la banda del compuesto unido. Cualquier partícula de virus de influenza en la muestra de prueba será atrapada por el compuesto (II) unido a la membrana y de esta manera retenida en la banda estrecha. En la segunda etapa de la prueba, una marca detectable unida a otro aglutinante de neuraminidasa (II) se deja fluir a través de la membrana a través de la banda de partículas de virus de influenza unidas. La presencia del virus de influenza después se muestra a través de un cambio observable en la membrana en el sitio del compuesto unido. Se contempla que el método y los compuestos de la invención son adecuados para utilizarse con la plataforma de Inmunoensayo Óptico Biostar (OAI), que se describe entre otros en la patente de E.U.A. número 5,418,135 de Miller y otros. Un gran número de sistemas de detección adecuados es conocido en la técnica, por ejemplo, los sistemas enzimáticos de biotina-estreptavidina tales como peroxidasa de rábano o fosfatasa alcalina, sistemas de fluorescencia, sistema de quimioluminiscencia, oro coloidal, marcas radioactivas y sistemas de aglutinación. Se contempla que el oro coloidal revestido con un compuesto de la invención (II) será una marca detectable particularmente conveniente. Similarmente, los compuestos de la invención, en donde la macromolécula M es peroxidasa de rábano, se espera que sean ideales para la fácil detección de influenza. El experto en la técnica fácilmente será capaz de seleccionar un sistema de detección adecuado y optimizar las condiciones para detección, utilizando experimentación de ensayo y error normal. Los compuestos de la invención de la fórmula (II) y sus sales farmacéuticamente aceptables y derivados pueden ser preparados a través de varios métodos que incluyen aquellos descritos más adelante. Los métodos de preparación subrayados más adelante forman otro aspecto de la invención.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La invención se describirá ahora con detalle haciendo referencia únicamente a los siguientes ejemplos no limitantes. Los ejemplos de los compuestos de la invención incluyen aquellos de la fórmula (3), en donde M es una proteína, como se lista en el cuadro a continuación. (3) CUADRO 1 Otros ejemplos de los compuestos de la invención incluyen aquellos de la fórmula (4), en donde M es la proteína avidina, la cual se une no covalentemente al grupo X-Y, y también tiene ligandos covalentemente unidos Z como se lista en el cuadro 2 más adelante.

Avidin Zr? (4) CUADRO 2 Comp. N 0. Separador Y n S ubstituyente Z m 4a (CH2) 6NH (COCH2NH) 2COCH2NH -Biotina- 4 - - 4b (CH2) ßNH (COCH2NH) 2COCH2NH -Biotina- 4 Biotinamidocaproilo 5 4c (CH2) 6NH (COCH2NH) 2COCH2NH Biotina- 4 Biotinamidocaproilo 10 4d (CH2) 6NH (CO (CH2) 5NH) 3CO (CH2) 5NH- 4 Biotinamidocaproilo 10 Biotina 4e (CH2) eNHCO (CH2) 5NHCOCH2 (0CH2CH2) 4 Biotinamidocaproilo 8 ißNH-Biotina Otros ejemplos adicionales de los compuestos de la invención en donde M es un polímero sintético incluyen aquellos de la fórmula (5) como se muestra más adelante en el cuadro 3, en donde los substituyentes en el grupo ácido siálico (2) son R2 = Ac, R = guanidina y W es OCONH. (51 CUADRO 3 Comp. No. Separador Y n P Substituyente Z m 5a (CH2)e 1 13 - - 5b (CH2)6 1 7 - - 5c (CH2) eNHCONH (CH2)ß 1 9 - - 5d (CH2) 6NH (CO (CH2) 5NH) 3CO(CH2)5 1 8 - - 5e CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2 1 8 - - 5f (CH2)ß 1 500 - - 5g (CH2) ßNH (CO (CH2) 5NH) 3CO (CH2)5 1 20 - - 5h (CH2) eNH (CO (CH2) 5NH) 3CO (CH2)5 1 50 - - 5i (CH2) ßNH (CO (CH2) 5NH) 3CO (CH2)6 1 45 bencilo 5 5j (CH2)6 1 50 - - 5k (CH2)6 1 45 bencilo 5 51 (CH2)6 2 40 h e x i I - b i 01 i n a 1 5m (CH2)6 2 40 hexil-f luoresceína 1 5n (CH2)6 1 20 CH2CH2SH 1 Otros ejemplos de los compuestos de la invención en donde M es una estructura de base de dextrano (peso molecular 500,000) incluyen aquellos representados por la fórmula (6) como se muestra más adelante en el cuadro 4, en donde los substituyentes en el grupo de unión de neuraminidasa (2) son R2 = Ac, R = guanadina y W es OCONH. Los enteros n, m y p en la fórmula (6) dan el porcentaje de las unidades de glucosa en la estructura de base de dextrano, las cuales están substituidas por los grupos particulares, es decir, cuando n, m y p no suman hasta 100, la estructura de base de dextrano restante se hace de unidades de glucosa no substituida. Se debe recordar también que existen tres puntos posibles de unión para los varios ligandos unidos a cada unidad de la estructura de base de dextrano. (6) CUADRO 4 Otros ejemplos de compuestos de la invención incluyen aquellos en donde la macromolécula M es una estructura de base de dextrano o ácido poliacrílico, y en donde los substituyentes en el grupo de ácido siálico (2) son R2 = Ac, R = guanadina y W es OCONH, y en donde el substituyente extra Z es, por ejemplo, un grupo bencilo, una molécula de biotina o un grupo que contiene fluoresceina. Se apreciará por aquellos expertos en la técnica que la referencia en la presente a tratamientos se extiende a la profilaxis así como al tratamiento de infecciones o síntomas establecidos. El tratamiento preferiblemente es iniciado antes o en el momento de la infección y se continúa hasta que el virus ya no está presente en el tracto respiratorio. En general, una dosis adecuada de un compuesto de la invención estará en la escala de 0.1 a 100 mg/kg/día, de preferencia en la escala de 0.2 a 20 mg/Kg/día. Convenientemente, el tratamiento se da 1-4 veces al día y se continúa durante 3-7 días después de la infección. La dosis deseada puede ser dada en una dosis individual, o como dosis divididas a intervalos apropiados. Aunque es posible que, para utilizarse como una terapia, un compuesto de la invención pueda ser dado como el producto químico de partida, generalmente se prefiere presentar el ingrediente activo como una formulación farmacéutica. La invención de esta manera proporciona una formulación farmacéutica que comprende compuestos de la fórmula (II) o una sal o derivado del mismo aceptable, junto con uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables para el mismo y, opcionalmente, otros agentes terapéuticos y/o profilácticos. Las formulaciones farmacéuticas incluyen aquellas para administración oral, nasal o tópica o en una forma adecuada para inhalación o insuflación al tracto respiratorio. Las formulaciones pueden ser, cuando sea apropiado, convenientemente presentadas en unidades de dosis discretas y pueden ser preparadas a través de cualquiera de los métodos bien conocidos en la técnica de la farmacia. En general, los compuestos de la invención pueden ser administrados en la forma de una solución o una suspensión o como un polvo seco. Para administración al tracto respiratorio, de acuerdo con el método de la invención, los inhibidores de neuraminidasa pueden ser administrados a través de cualquiera de los métodos y formulaciones empleados en la técnica para administrarse al tracto respiratorio. Las soluciones y suspenciones generalmente serán acuosas y, por ejemplo, preparadas a partir de agua sola o agua y un cosolvente fisiológicamente aceptable (por ejemplo, etanol, glicol propilénico, glicoles polietilénicos tales como peg 400). Dichas soluciones o suspensiones además pueden contener otros excipientes, por ejemplo, conservadores (tales como cloruro de benzalconio), agentes de solubilización/agentes tensioactivos tales como polisorbatos (por ejemplo Tween 80), agentes reguladores de pH, agentes isotónicamente de ajuste (por ejemplo, cloruro de sodio), mejoradores de absorción y mejoradores de viscosidad. Las suspenciones además pueden contener agentes de suspensión, (por ejemplo, celulosa microcristalina, carboximetil celulosa de sodio). Las soluciones o suspensiones son aplicadas a la cavidad nasal a través de medios convencionales, por ejemplo, con un gotero, pipeta o aspersión. Las soluciones pueden ser provistas en una forma de dosis individual o múltiple. Una aspersión puede ser obtenida, por ejemplo, a través de una bomba de aspersión de atomización de dosificación. La administración al tracto respiratorio también puede lograrse a través de una formulación en aerosol, en donde el compuesto es provisto en un paquete presurizado con un propulsor adecuado tal como un clorofluorocarbono (CFC) u otro gas adecuado. Alternativamente, los compuestos pueden ser provistos en la forma de un polvo seco, por ejemplo, una mezcla en polvo del compuesto en una base adecuada tal como lactosa, almidón, derivados de almidón y polivinilpirrolidona. Consecuentemente, el polvo formará un gel en la cavidad nasal. En formulaciones destinadas para administración al tracto respiratorio, incluyendo formulaciones intranasales, el compuesto generalmente tendrá un tamaño de partícula pequeño, por ejemplo, del orden de 5 mieras o menos. Dicho tamaño de partícula puede obtenerse a través de cualquier medio conocido en la técnica. Los compuestos de la invención se preparan en varias etapas, la primera parte generalmente siendo la síntesis de un derivado de ácido siálico unido a neuraminidasa de la fórmula X-Y, en donde X e Y son como se definieron anteriormente. Los métodos para la síntesis de derivados de ácido siálico (2) con funcionalidad adecuada en la posición 7 se describen en la solicitud de patente británica número 9516276.4, y en la solicitud d& patente internacional número PCT/AU97/00190. Ejemplos de derivados de ácido siálico adecuado X-Y se muestran a continuación en el cuadro 5, en donde los grupos R2, R y W son los substituyentes en la porción X como se definió anteriormente.

CUADRO 5 La segunda parte de la preparación de los compuestos de la invención implica la unión de las unidades de unión de neuraminidasa X-Y a la macromolécula M. Para la unión covalente de las unidades X-Y a las macromoléculas M de un tipo de proteína, la conjugación puede realizarse generalmente utilizando métodos de acoplamiento cruzado estándares, los cuales son bien conocidos (por ejemplo, S.S. Wong, "Chemistry of Protein Conjugation y Cross- Linking" CRC Press, 1991; G. T. Hermanson, "Bioconjugate Techniques" Academic Press, 1996). En el caso de polímeros sintéticos, las unidades X-Y pueden ser agregadas a una estructura de base de polímero preformado, la cual tiene substituyentes activados adecuados. Por ejemplo, si el grupo Y tiene una funcionalidad amino terminal, puede hacerse reaccionar con los substituyentes de éster activo en una estructura de base de poliacrilato. Alternativamente, las unidades X-Y con un substituyente polimerizable adecuado, tal como una olefina terminal pueden ser polimerizadas o preferiblemente copolimerizadas con otra olefina, para generar la estructura de base de macromolécula. Ver, por ejemplo, R. Roy, Trends in Glycoscience y Glycotechnology, 1996 8 79-99; N.V. Bovin y H.J. Gabius, Chem. Soc. Reviews., 1995413).

EJEMPLO 1 Preparación De Un Conjugado De GG167-Albúmina De Suero De Bovino-Biotina (3a) (a) Preparación de ácido 5-acetamido-7-(6'-6"-aminocaproil) aminohexiI)-carbamoiloxi-4-guanidino-2,3,4,5-tetradeoxi-D-glicero-D-galacto-non-2-enopiranosónico (2b) (7-(6-Aminocaproil) amino-hexilcarbamoiloxi-GG167). Se disolvió ácido 6-(t-butiloxicarbonilamino)caproico (34 mg, 147 µmoles) en una mezcla de acetona (2.5 ml), agua (100 µl), N- metil morfolina (4 µl, 36 µmoles) y trietil amina (21 µl, 147 µmoles)). La solución se enfrió a -12°C, y después se agregó cloroformiato de isobutilo (21 µl, 161 µmoles). La solución se agitó durante 12 minutos. Se disolvió la sal de ácido trifluoroacético de 5-acetamida-7- (6'-aminohexil)-carbamoiloxi-4-guanidino8,9-monocarbonildioxi-2,3,4,5-tetradeoxi-D-glicero-D-galacto-non-2-enopiranosonato de metilo (79 mg, 92 µmoles) en agua/acetona (1:1, 2 ml) conteniendo trietilamina (40 µl, 287 µmoles). Esta solución básica se enfrió a 0°C y se añadió como una porción individual a la mezcla de reacción previa. La mezcla se dejó calentar a temperatura ambiente y se agitó durante 4 horas. Los solventes se removieron bajo presión reducida. El producto crudo se tomó en metanol/agua (1:1, 4 ml) y después se agregó 1 ml de trietilamina. Esta solución se agitó durante la noche con argón. Los solventes se removieron sobre un evaporador giratorio y el residuo se disolvió en metanol y se absorbió sobre 1.5 g de gel de sílice. La cromatografía sobre gel de sílice (10 g), eluyendo con acetato de etilo/isopropanol/agua (100/75/25) dio el producto (53 mg, 77 µmoles, 84%). 1H n.m.r. (CD3OD, 200 Mhz) d 5.67 (d, J 2.6 Hz, 1H); 5.03 (m, 1H); 4.62 (m, 1H); 4.49 (m, 1H); 4.23 (m, 1H); 4.12 (m, 1H); 3.77 (m, 1H); 3.62 (m, 1H); 3.12 (m, 6H); 2.22 (t, J 8Hz, 2H); 2.0 (s, 3H); 1.5 (m, 23H). El azúcar t-Boc protegida se disolvió en acetato de etilo/tolueno y se evaporó a sequedad. El material se disolvió en 3 ml de ácido trifluoroacético y se agitó a temperatura ambiente bajo argón durante 1 hora. El solvente se removió bajo presión reducida, y el ácido trifluoroacético residual se removió a través de co-evaporación primero con diclorometano, después con 3 porciones de agua/metanol. La muestra después se disolvió en agua, se filtró y se I i of i liso para dar el producto (141 mg, 152 µmoles) como la sal de tris-TFA. Espectro de masa (FAB): 588 (M + 1) 1H n.m.r. (CD3OD, 300 Mhz) d 5.92 (d, J 2.6 Hz, 1H); 5.01 (m, 1H); 4.60 (dd, J 10, 3 Hz, 1H); 4.44 (dd, 9, 3 Hz, 1H); 4.23 (m, 1H); 4.05 (m, 1H); 3.67 (dd, 13, 4 Hz, 1H); 3.52 (dd, 13, 7 Hz, 1H); 3.16 (m, 5H); 2.96 (t, 8Hz, 2H); 2.25 (t, 8Hz, 2H); 2.00 (s, 3H); 1.7-1.3 (m, 14H). (b) Preparación del conjugado entre el derivado GG167 (2b) y albúmina de suero de bovino-(6-aminocaproil biotina)8. Regulador de pH de acoplamiento de proteína: 0.1N NaHCO3/0.2M NaCl. Regulador de pH de diálisis: 20mM KH2PO4/0.15M NaCI, pH 6.5. Se disolvió BSA-(caproil-biotina)8 (3 mg, 43 mmoles, Pierce) en 7.5 ml de regulador de pH de acoplamiento y se agitó moderadamente durante 30 minutos. Se disolvió suberato de bis-(N-hidroxi sulfosuccinimida) (12 mg, 21 µmoles, Pierce) en 1 ml de regulador de pH de acoplamiento y se agregó directamente a una solución básica del compuesto (2b) del ejemplo 1a (19.5 mg, 21 µmoles) en 1.5 ml de regulador de pH de acoplamiento. La reacción se dejó agitar durante 7.5 minutos. Después, se agregó gota a gota la solución de BSA-biotina a la solución de GG167 derivatizada y la mezcla se dejó agitar a temperatura ambiente durante 1.5 horas. La solución se I iof i I isó , se disolvió en 3.0 ml de agua y se dializó contra regulador de pH de diálisis (3 x 1.5 L, tubería de celulosa, corte 12,000 MW). La mezcla se liofilizó, se tomó en 2.5 ml de agua y se desaló sobre una columna PD-10 (Pharmacia), después se liofilizó para dar 2.5 mg del producto (3a). La estimación de la incorporación de azúcar (30 unidades de GG167 por molécula de proteína) se basó en un ensayo colorimétrico para el grupo de guanidina (Sakaguchi Reaction, ver Can. J. Chem., 1958 36 1541).

EJEMPLO 2 P reparad ón De Suero De Bovino De ? Glo ?bulin-(6-Aminocaproil B iotina)iR -ÍGG167-7-C arbamato-1 ,6- Diami nohexano-6- Amida de Ácido Aminocapro ico- Amida de Ácid o Subérico)?n (3b) Se disolvió ?-globulina de bovino (3 mg, 20 mmoles, Sigma) en 1 mi de regulador de pH de acoplamiento y se agitó durante 30 minutos.

Se agregó N-biotinil-6-aminocaproato de N-hidroxi sulfosuccinimidilo (1.8 mM, 280 µl, 0.5 µmoles) en regulador de pH de acoplamiento a la solución de proteína, y la reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. La mezcla de reacción se diluyó después a 7.5 ml con regulador de pH de acoplamiento y reaccionó con el suberato bis(N-hidroxi sulfosuccinimidilo) y amida de ácido GG167-7-carbamato-1 ,6-diaminohexan-6-am¡nocapro¡co del ejemplo 1a anterior bajo condiciones idénticas al ejemplo 1b. El rendimiento del conjugado de ?-globulina liofilizado (3b) fue de 2.5 mg.

EJEMPLO 3 Preparación Del Conjugado 3f Entre El Compuesto 2c Y Peroxidasa De Rábano (HRP) El compuesto 2c se acopló a HRP siguiendo la metodología de oxidación de periodato bien establecida (ver por ejemplo, G.T. Hermanson, "Bioconjugate Techniques" Academic Press, 1996 472) para dar el compuesto 3f. Se disolvió HRP (tipo IV-A, Sigma Aldrich P-6782, 5 mg, 114 mmoles) en regulador de pH de acetato de sodio/cloruro de sodio (5 mM/150 mM, pH 4.5, 500 µl). A esto se le agregó una solución de periodato de sodio recientemente preparada (88 mM en regulador de pH de acetato de sodio/cloruro de sodio, 50 µl, 4.4 mmoles) y la reacción se dejó reposar en la obscuridad a temperatura ambiente durante 20 minutos. La mezcla se cromatografió sobre una columna PD-10 (Pharmacia Biotech, Sephadex G-25) pre-equilibrada con regulador de pH de acetato de sodio (5 mM, pH 4.5), y el eluyente se secó por congelación. La HRP oxidada se disolvió en regulador de pH de carbonato de sodio (0.2M, pH 9.5, 1 ml) conteniendo el compuesto 2c (3.9 mg, 3.75 µmoles) a 4°C, y la reacción se dejó reposar durante la noche a 4°C. Se agregó una solución de cianoborohidruro de sodio (5M en 1N NaOH, 10 µl, 50 µmoles) y la reacción se dejó reposar durante la noche a 4°C. Se agregó una solución de etanolamina (1M, pH 9.5, 50 µl, 50 µmoles) y la reacción se dejó reposar a temperatura ambiente durante 30 minutos antes de la cromatografía sobre una columna PD-10, pre-equilibrada con agua destilada. El eluyente se secó por congelación para dar el conjugado de HRP-compuesto 2c como un polvo café pálido.

EJEMPLO 4 Preparación De Conjugados De Proteína-GG167 3c, 3d Y 3g-3i Se prepararon los compuestos 3c, 3d y 3g-3j mediante el acoplamiento de la proteína apropiada ya sea con el compuesto 2c o 2g utilizando suberato de bis(N-hidrox¡ sulfosuccinimida) y siguiendo un procedimiento similar a aquel descrito en el ejemplo 1, parte (b).

EJEMPLO 5 Preparación De Un Complejo Biotinilado (4d) Entre Avidina y Un Conjugado De Gg167-Biotina (a) Preparación de ácido 5-acetamido-7-(6'-(6"-(6'"-biotinil-aminocaproil)-triaminocaproil)aminohexil)-carbamoiloxi-4-guanidino-2,3,4,5-tetradeox¡-D-g/ycero-D-ga/acío-non-2-enopiranosónico (2e) se realizó utilizando ácido tetra(6-aminocaproico) Boc-protegido y siguiendo un método similar a aquel descrito en el Ejemplo 1. (b) Se disolvió avidina (3 mg, 0.0445 µmoles) en una solución del compuesto (2e) (0.5 mg, 0.434 µmoles) en 500 µl de agua a temperatura ambiente durante 2 horas. A esta solución resultante se le agregó sulfo-N-hidroxisuccinimido-caproilamino-Biotina (Pierce #21335) (1000 µg, 1.798 µmoles) y una solución de bicarbonato de sodio (1000 µg, 11.9 µmoles) en 240 µl de agua. Toda la mezcla se dejó reposar a temperatura ambiente durante 45 minutos, después se colocó un tubo de diálisis (corte de peso molecular 12,000). El tubo se dializó sucesivamente contra una solución de NaHCO3 50mM (4 x 250 ml) y agua (8 x 250 ml), con el tiempo de inmersión siendo de 45 minutos en cada caso. El tubo se dializó finalmente contra 500 ml de agua a temperatura ambiente durante la noche. La solución resultante del tubo de diálisis se ajustó a un pH de 6.5-7.0 con bicarbonato de sodio y después se secó por congelación para proporcionar el complejo del título (4c) (3 mg, 89%) como un sólido blanco. El complejo comprendió 4 moléculas de GG167-biotina unidas a través de los cuatro sitios de unión de avidina y después la estructura de base de avidina substituida con aproximadamente 8 a 10 ligandos de biotina covalentemente unida. Un diagrama del complejo se muestra en la Figura 1, en donde A representa avidina, B representa biotina y S representa la molécula de azúcar GG167.

EJEMPLO 6 Preparación De Poliacrilamidas (5a) - (5e) Substituidas Con Varios Ligandos De GG167 (a) Se preparó poli(N-(acriloiloxi)succinim¡da) (pNAS) a partir de N-(acriloiloxi) succinimida como se describió por Ferruti y otros. (Polymer, 1972, 13, pág. 462). El espectro 1H n.m.r. y el espectro infrarrojo de la pNAS fue consistente con aquel previamente reportado en la literatura. Una muestra del lote de pNAS se convirtió a poliacrilamida a través del tratamiento con amoniaco concentrado durante varias horas a temperatura ambiente y el peso molecular de la poliacrilamida dializada se encontró que fue de aproximadamente 50,000 utilizando viscosimetría. (b) Se prepararon poliacrilamidas (5a) - (5e) incorporando varios derivados de GG167 a partir del lote de pNAS siguiendo el método general subrayado más adelante para el compuesto (5c). Se agregó una solución de pNAS (10 mg, 59 µmoles de ÑAS) en dimetilformamida (DMF, 0.5 ml) a una solución del compuesto (2f) (3.8 mg, 6.2 µmoles) en 0.5 ml en DMF a temperatura ambiente con agitación. Se agregó trietilamina (10 µl, 70 µmoles) y la solución transparente se agitó durante la noche a temperatura ambiente, después se calentó a 65°C durante 5 horas y se agitó durante la noche de nuevo a temperatura ambiente. Se agregó amoniaco acuoso diluido (6 ml de solución al 3%) a la mezcla de reacción y la solución transparente se dejó reposar durante 24 horas a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se evaporó a sequedad bajo presión reducida, y el residuo de disolvió en 3 ml de agua y se colocó en tubo de diálisis (corte MW 12,000) y se dializó contra agua (500 ml, pH 6) durante 24 horas. La solución se secó por congelación para dar la poliacrilamida conteniendo GG167 (5c) como un sólido blanco (5 mg). El espectro de 1H nmr (300 MHz) mostró las siguientes señales de anchura: (D2O) d 5.7, 4.4-4.6, 4.1, 3.3-3.7, 3.0, 2.0-2.5, 1.9, 1.1-1.8. Comparando la integral para los protones de ácido siálico (d 5.7-3.2) con la integral para las cadenas de polímero y separador (d 1.0-3.2, menos el pico N-Acetilo a 1.9), el nivel de incorporación de unidades GG167 se estimó en aproximadamente 10%.

EJEMPLO 7 Preparación De Poliacrilamida 51, La Cual Tiene Tanto Ligandos De GG167 Como Ligandos De Biotina Una solución de pNAS (170 mg, 1 mmoles de ÑAS) (peso molecular aproximadamente 50,000) en 3 ml de DMF se agitó a temperatura ambiente, y se agregó una solución del compuesto 2a (sal TFA, 30 mg, 50 µmoles) y N-6-aminohexil-biotinamida (7 mg, 20 µmoles) en 2 ml de DMF. Se agregaron 50 µl de triatilamina y la mezcla de reacción se agitó a 20°C durante 24 horas. Se agregó amoniaco diluido (20 ml, 5%) a la mezcla de reacción y se continuó la agitación durante otras 24 horas. La mezcla de reacción se evaporó a sequedad y el residuo se disolvió en 10 ml de agua y se dializó en agua durante 2 días (1 x 4 litros, tubería de corte de peso molecular 12,000). Con la prueba de color de guanidina de Sakaguchi, se obtuvo un resultado positivo del fluido restante en la tubería, pero no de una muestra concentrada del agua de diálisis final. El líquido de la tubería de diálisis se secó por congelación para dar 5 litros como un sólido esponjoso cremoso (71 mg). El nivel de los ligandos sobre el polímero se estimó a través de integración de NMR, y fue consistente con la incorporación casi completa de las aminas de partida.

EJEMPLO 8 Preparación De Poliacrilamidas Que Contienen GG167 5i, 5k, 5m y 5n Los compuestos 5i, 5k, 5m y 5n cada uno fue preparado haciendo reaccionar pNAS con la mezcla apropiada del derivado GG167 (2a o 2c) y ya sea bencilamina, N-6-aminohexil-fluoresceína o aminoetantiol, siguiendo un procedimiento similar a aquel descrito en el Ejemplo 7. Para la preparación de los compuestos 5i y 5k (y también los compuestos 5h y 5j) se utilizó pNAS de peso molecular mayor (>200 Kd).

EJEMPLO 9 Preparación De Dextrano (PM 500 KDa) Con Substituyentes Múltiples De GG167 (7-Oxicarbamoilhexilamino-Carboniloxi-4- Guanidino-Neu5ac2en) (3.5 % Molar) y N-Bencilcarbamoiloxi (16.8 % Molar) A una solución de dextrano (peso molecular 500,000) [100mg, 0.617mmoles (con base en un peso molecular unitario de 162)] en 5 ml de DMSO se le agregaron cloroformiato de p-nitrofenilo (510mg, 2.53 mmoles) y 4-dimetilaminopiridina (309mg, 2.53mmoles). La mezcla se agitó bajo argón, primero a temperatura ambiente durante una hora y después a 35-40°C durante 3 horas. La solución resultante se combinó con una solución de bencilamina (12.5mg, 0.117 mmoles) y 4-dimetilaminopiridina (40 mg, 0.327 mmoles) en 5 ml de piridina. La mezcla de reacción se dejó agitar bajo argón a temperatura ambiente durante 16 horas, antes de evaporarse bajo alto vació a sequedad. El residuo se agitó en una solución de carbonato de potasio al 2% (25 ml) a 50°C durante 3 horas para producir una solución transparente, la cual después se ajustó a un pH de 7 con HCl 3M. La solución resultante se dializó contra agua a temperatura ambiente durante 3 días, se secó por congelación y para proveer dextrano bencilado (95 mg, 83.4%) como un sólido blanco teniendo 16.8% molar de oxicarbamoil-metilenbenceno indicado por 1H-nmr (D2O). A una solución del dextrano bencilado (5 mg, 0.027 mmoles) en 0.25 ml de DMSO se le agregaron cloroformiato de p-nitrofenilo (12.8mg, 0.063 mmoles) y 4-dimetil-aminopiridina (7.8 mg, 0.063 mmoles). La solución se agitó bajo argón a temperatura ambiente durante 1 hora, después a 35-40°C durante 3 horas. Después, se combinó con una solución del compuesto 2a (0.5 mg, 0.00105 mmoles) en una mezcla de 0.25 ml de piridina y 0.25 ml de DMSO. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 16 horas antes de la evaporación bajo alto vació a sequedad. El residuo se agitó vigorosamente en una solución de carbonato de potasio al 1 % (5 ml) durante 4.5 horas para producir una solución transparente. Después se ajustó a un pH de 7.5 con HCl 3M, se dializó contra agua a temperatura ambiente durante 24 horas y finalmente se I iof i liso para ofrecer el polímero del título (4.5 mg, 82%) como un sólido blanco. 1H-nmr (D2O) indicó que el polímero lleva 16.8 moléculas de bencilamina y 3.5 moléculas del compuesto 2a por 100 unidades de glucosa del portador. El peso molecular del polímero se estimó como 623 KDa, y el peso molecular promedio para una unidad de 7-aminohexilaminocarboniloxi-4-guanidino-Neu5Ac2en fue de 5770.

EJEMPLO 10 Preparación De GG167 (7-Oxiacetamidohexilam inocarboniloxi-4- Guanidino-Neu5ac2en) (3 % Molar), N-Bencilacetamido-2-Oxi (17 % Molar) v 2-Oxiacetato (20%) Multivalente Sobre Dextrano/500 KDa A una solución de dextrano (peso molecular 500,000) [50 mg, .308 mmoles (con base en un peso molecular de unidad de 162)] en 0.3 ml de agua en un baño de hielo se añadió hidróxido de potasio (138 mg, 2.46 mmoles) en 0.1 ml de agua. La mezcla se agitó a 0-5°C durante 20 minutos y después se agregó ácido cloroacético (102 mg, 1.07 mmoles). La mezcla resultante se agitó a 70-80°C durante 20 minutos y después a temperatura ambiente durante 2 horas. La mezcla de reacción se diluyó con 25 mi de metanol, el precipitado blanco se recogió a través de filtración, se lavó concienzudamente con 25 ml de metanol fresco y se secó. Todo el procedimiento se repitió una vez más para proveer el producto como un sólido blanco conteniendo aproximadamente 40% molar de la sal de potasio de oxiacetato según determinado a través de titulación (52 mg, 84%). A una solución del polímero de ácido acético (10 mg, 0.05 mmoles) en 0.4 ml de agua se le agregaron clorhidrato de 1 -eti I-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiim¡da (16 mg, 0.08 mmoles) y sulfo-N-hidroxisuccinimida (17.4 mg, 0.08 mmoles). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 20 minutos y después se combinó con una solución de bencilamina (12.8 mg, 0.118 mmoles) en 0.2 ml de metanol. La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas y se concentró bajo vació a sequedad. El residuo se agitó en 10 ml de agua conteniendo NaHCO3 (50 mg) a 50°C para producir una solución transparente, la cual se dializó contra agua durante 10 días, se liofilisó para proveer el producto (9 mg, 86%) como un sólido blanco conteniendo 17% molar de oxiacetamidometilenbenceno como se indicó mediante 1H-nmr. A una solución del polímero (5 mg, 0.0239 mmoles) en 0.2 ml de agua se le agregaron clorhidrato de 1 -etil-3-(3-dimetilamino-aminopropil)carbodiimida (8 mg, 0.04 mmoles) y sulfo-N-hidroxisuccinimida (8.7 mg, 0.04 mmoles). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 20 minutos, después se combinó con una solución del compuesto 2a (1 mg, 0.0021 mmoles) y 4-dimetilaminopiridina (3 mg, 0.024 mmoles) en 0.1 ml de piridina. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas y se evaporó a sequedad. El residuo se agitó en una solución de NaHCO3 al 1% (5 ml) para producir una solución transparente. Después de la diálisis en agua durante 24 horas, la solución se liofilisó para proveer el polímero del título como un sólido blanco (4.5 g, 84%). La titulación del ácido y 1H-nmr (D2O) indicaron que el polímero lleva el 17 % molar de bencilamina, 3 % molar de GG167 (7-aminohexilaminocarboniloxi-4-guanidino-Neu5Ac2en) y 20 % molar de acetato por 100 unidades de glucosa del portador. El peso molecular del polímero se estimó como 683 KDa y el peso molecular promedio para un 7-amino-hexilamino-carboniloxi-4-guanidino-Neu5Ac2en polimérico fue de 7420.

EJEMPLO 11 Preparación De 7--6'--6"--6"'-(6""--6 -Aminocaproil)- Aminocaproil)-Aminocaproil1-Aminoca roil.-Aminohexil}- Carbamoiloxi-4-Guanidino-Neu5ac2en Polimérico-Multivalente (14 % Molar) Sobre Dextrano Oxidado/500 KDa A una solución de dextrano (peso molecular 500,000) [20 mg, 0.123 mmoles (basado en un peso molecular unitario de 162)] en 0.4 ml de agua a una temperatura de baño de hielo se agregó gota a gota periodato de sodio (15.6 mg, 0.073 mmoles) en 0.4 ml de agua. La mezcla de reacción se agitó a 5°C durante 2 horas, después se dejó agitar a temperatura ambiente durante 2 horas. La mezcla resultante se diluyó con 1.2 ml de agua y se hizo pasar a través de una columna de Sephadex G-25 (10ml). La columna se eluyó con 3 ml de agua. El producto eluido se secó por congelación para proveer dextrano parcialmente oxidado (18 mg, 90%) como un sólido blanco.

A una solución del dextrano oxidado anterior (3 mg, 0.018 mmoles) en 0.6 ml de agua se agregaron bicarbonato de sodio (15 mg, 0.178 mmoles) y el compuesto 2c. sal TFA (6 mg, 0.0057 mmoles). Toda la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora, después se agitó a una temperatura en un baño de hielo. A esta mezcla fría se le agregó cianoborohidruro de sodio (100 mg, 1.59 mmoles) en porciones. La mezcla de reacción se agitó a temperatura de baño de hielo durante 1 hora, se dejó a 5°C durante 16 horas, después se trató más cianoborohidruro de sodio (100 mg, 1.59 mmoles) y agitó a 5°C durante 1 hora, después a temperatura ambiente durante 2 horas y finalmente se dializó contra agua durante 24 horas y se liofilisó para dar el polímero del título (3 mg) como un sólido blanco. 1H-nmr (D2O) indicó que el polímero llevó aproximadamente 430 moléculas de 7-{6'-{6"-[6'"-(6 -(6 -aminocaproil)-aminocaproil)-aminocaproil]-aminocaproil}-aminohexil}-carbamoil-oxi-4-guanidino-Neu5Ac2en (compuesto 2c) por molécula de dextrano parcialmente oxidado. Por lo tanto, el peso molecular del polímero se estimó para ser 860 KDa y el peso molecular promedio para cada unidad de 4-guanidino-Neu5Ac2en fue de 2,000.

EJEMPLO 12 Preparación De 7-Suberamoil-Hexil-Carbamoiloxi-4-Guanid¡no- Neu5ac2en (5 % Molar) Polimérico-Multivalente Sobre Polilisina/70-150 KDa Una solución de 7-aminohexil-carbamoiloxi-4-guanidino-Neu5Ac2en (compuesto 2a, 6.4 mg, 0.0135 mmoles) y suberato de disuccinimidilo (5 mg, 0.0135 mmoles) en una mezcla de 0.1 ml de piridina y 0.1 ml de DMF se agitó a 30°C durante 3 horas, después se evaporó a sequedad bajo alto vació. El residuo se recogió en éter (10 ml x 3) y se secó para proveer el éster activado. Esto después se combinó con una solución de sal de HBr de polilisina (peso molecular 70,000-150,000) (10 mg, 0.0485 mmoles) en una mezcla de 0.4 ml de agua, 0.25 ml de DMSO, 0.6 ml de DMF, y 0.4 ml de piridina. La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 10 horas, después se dializó contra agua durante 72 horas. El dializato se diluyó con 10 ml de agua, se calentó a 50°C, antes de la filtración. El filtrado después se liofilisó para proveer el polímero del título (5 mg) como un sólido blanco. 1H-nmr (D2O) indicó que el polímero lleva 5 moléculas de 7-suberamoil-hexilcarbamoiloxi-4-guanidino-Neu5Ac2en por 100 unidades de lisina del portador. Por lo tanto, el peso molecular promedio de un 4-guanidino-Neu5Ac2en polimérico fue de 5140.

EJEMPLO 13 Preparación De 7-_2 ' -\2' -i2" -Aminoetoxi)-Etoxi,-Etil.- Carbamoiloxi-4-Guanidino-Neu5ac2en (3.2 % Molar) Polimérico- Multivalente Sobre Ácido Poliglutámico/50-100 KDa A una solución de la sal de sodio de ácido poli-glutamico (peso molecular 50,000-100,000) (10 mg, 0.0657 mmoles) en 0.6 ml de agua se le agregaron clorohidrato de 1 -(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida (9.6 mg, 0.050 mmoles) y N-hidroxisulfosuccinimida (10.9 mg, 0.050 mmoles). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 25 minutos, después se combinó con una solución de 7-{2'-[2"-(2'"-aminoetox¡)-etoxi]-etil}-carbamoiloxi-4-guan¡dino-Neu5Ac2en.sal de TFA (compuesto 2d, 4.1 mg, 0.0081 mmoles) en 0.1 ml de agua y en 0.1 ml de piridina. La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas, después se dializó contra agua durante 3 días y finalmente se liofilisó para proveer el polímero del título (9.5 mg) como un sólido blanco. 1H-nmr (D2O) indica que el polímero lleva 3.2 moléculas de 7-{2'-[2"-(2'"-aminoetoxi)-etoxi]-etil}-carbamoiloxi-4-guanidino-Neu5Ac2en por unidades de ácido glutámico del portador. El peso molecular promedio para un 4-guanidino-Neu5Ac2en polimérico fue de 5250.

EJEMPLO 14 Preparación De N-Hidroxietilpoliacrilamida Conjugada Con El Compuesto 2c y Peroxidasa De Rábano La sal TFA del compuesto (2c) (6 mg, 0.0057 mmoles) se agregó a una solución de pNAS (ver Ejemplo 6, parte b) (20 mg, 0.118 mmoles de ÑAS) en 1 ml de DMF. Se agregaron 20 µl de trietilamina a la solución transparente, la cual se agitó a temperatura ambiente durante 3 días. La mitad de la mezcla de reacción anterior se agregó a una solución de peroxidasa de rábano (17 mg) en 4 ml de agua y la mezcla se dejó a 4°C durante varios días. Se agregó etanolamina (0.5 ml de una solución en agua al %) a la mezcla para extinguir el éster activado con poliacrilato.

Después de 2 horas, la mezcla de reacción se dializó contra agua durante 3 días y después el dializato se secó por congelación para dar el conjugado polimérico como un polvo esponjoso de color café pálido.

EJEMPLO 15 Determinación De La Unión De Los Compuestos De La Invención A Neuraminidasa Del Virus De Influenza Se utilizaron dos virus de influenza A y un virus de influenza B para probar la habilidad de los compuestos para unirse a toda la neuraminidasa del virus de influenza. Los resonantes de influenza A fueron ya sea de A/NWS/34-tern-Australia/G70C/75 (H1N9) o de A/NWS/Tokyo/3/67/H1N2 y la cepa de influenza B fue B/Victoria/02/87. El ensayo de neuraminidasa se realizó siguiendo un procedimiento de la literatura (Potier, M., et al, Anal. Biochem., 1979 94 287), y las constantes de inhibición medidas (IC50) se resumen en el cuadro 6. Las constantes de inhibición para las macromoléculas se calcularon con base en el peso molecular por unidad de derivado GG167 unido, por ejemplo, la poliacrilamida 5c que tiene una molécula derivada de GG167 unida a 10% de las unidades de acrilamida se le asignó un peso molecular de 1293.

CUADRO 6 Constantes de Unión Contra Neuraminidasa del Virus de Influenza Para Compuestos de la Invención EJEMPLO 16 Detección De Virus De Influenza En Placas De ELISA Utilizando El Compuesto Número 4d Una solución de virus (50 µl) de aproximadamente 2 x 10~8 pfu/ml del virus de influenza A NWS/G70C en salina regulada en su pH con fosfato (PBS) se agregó directamente a las cavidades de una placa de ELISA de 96 cavidades (Dynatech), y el virus de dejó unir a través de reposo durante la noche a 4°C. Después de lavar, las placas fueron bloqueadas con PBS-Tween 20 de acuerdo con procedimientos estándares, y después se agregaron dilusiones en serie del compuesto número 4d a una de las filas de la placa de ELISA, empezando a una concentración de 1 µM de unidades GG167 y yendo hacia 10"10 M. Como un control, se agregaron dilusiones en serie de un anticuerpo NC10 anti-neuraminidasa monoclonal biotinilado (L. C. Gruen, J. Immunological Methods, 1994 168 91) a otra fila de la placa de ELISA. Después de la incubación durante 1 hora, las placas fueron lavadas para remover el compuesto no unido y después el virus fue detectado con estraptavidina-HRPO (Boehringer-Mannheim), utilizando ABTS (Sigma) como el substrato cromogénico y aproximadamente 30 minutos de incubación. Se observaron concentraciones del compuesto 4d por arriba de 10~9 M que permitió la detección del virus, y además una señal y muy fuerte, en paralelo con la concentración incrementante del compuesto. De esta manera, las partículas de virus de aproximadamente 5 x 106 por cavidad fácilmente pudieron ser detectadas con el compuesto número 4d. El control de anticuerpo biotinilado dio un nivel similar de señal.

EJEMPLO 17 Captura y Detección De Un Complejo Entre Virus De Influenza y El Compuesto Número 3a Para permitir el revestimiento de las partículas del virus con el derivado GG167-biotina, se pre-incubaron 10 µl de una solución del virus de influenza A NWS/G70C (1 x 10 pfu/ml) durante 1 hora con varias concentraciones del compuesto 3a en las cavidades de filas separadas de una placa de ELISA. Se utilizaron la mitad de la dilusiones log10 del compuesto 3a, empezando de una concentración de 1 µM de unidades GG167 y yendo hacia abajo hacia O.OOOOlµM. Después, los complejos de virus-compuesto fueron transferidos a una placa de ELISA, la cual había sido pre-revestida con avidina e incubada durante 1 hora para permitir la captura. Las placas fueron lavadas en PBS-Tween 20, y el virus capturado se detectó con un anticuerpo de conejo policlonal dirigido a la hemaglutinina del virus de acuerdo con procedimientos estándares. El mejor resultado se encontró con una concentración de 0.1 µM del compuesto número 3a, el cual permitió claramente la detección del virus A 106 pfu. A concentraciones más altas del compuesto, la señal fue más débil, posiblemente debido al bloqueo de algunos sitios de avidina por el compuesto número 3a libre, mientras que a concentraciones más bajas (< 0.001µM), la señal de detección también fue más débil, probablemente debido a que existe un compuesto insuficiente para unirse completamente a todas las partículas del virus.

EJEMPLO 18 Detección Directa Del Conjugado De Virus De I nf luenza-GG 167- Proteína-Biotina Con Estreptavidina-Peroxidasa De Rábano Siguiendo el mismo procedimiento descrito en el Ejemplo 17 anterior, y utilizando el compuesto 4d, la detección directa del virus unido con estreptavidina-peroxidasa de rábano, en lugar del anticuerpo anti-hemaglutinina, también se observó.

EJEMPLO 19 Inhibición de Hemaglutinación de Influenza a través de Macromoléculas de La Invención Los compuestos de la invención fueron probados para la habilidad de inhibir hemaglutinación (HAI) de cepas de influenza X- 31 (H3N2), G70C y Tokyo A, siguiendo el tipo estándar del método que se describió en la literatura (ver, por ejemplo, J. Amer. Chem.

Soc, 1997 119 4103 y referencias citadas en la misma). El ensayo HAI se realizó utilizando soluciones de los conjugados GG167 poliméricos en PBS, los cuales fueron 2 veces serialmente diluidos a través de 12 cavidades de placa de microtitulación. La suspensión del virus, diluida a 4 unidades de HA en PBS, fue agregada a las cavidades. Después de 2 horas a 4°C, 0.5 % de la suspensión de eritrocitos de pollo se agregaron a cada cavidad. Después de 1 hora a 4°C, se determinó la concentración más baja de inhibidor que evitó la aglutinación de los eritrocitos. Los resultados se resumen en el cuadro 7.

CUADRO 7 EJEMPLO 20 Inhibición de la Replicación del Virus de Influenza a través de las Macromoléculas de la Invención Los compuestos de la invención fueron probados para la habilidad para inhibir la replicación del virus de influenza A siguiendo el método estándar que fue descrito en la literatura (ver, por ejemplo, Watanabe et al, J. Virological Methods, 1994, 48, 257). El ensayo se realizó utilizando células MDCK, y los resultados se muestran en el cuadro 8 a continuación. Los resultados se mostraron como la concentración de compuesto mínima que inhibe el efecto citopático a un 50% [ID50(µg/ml)], calculado utilizando un programa de análisis de regresión para fijación de curva semi- registro. Los resultados muestran que todas las macromoléculas que tienen derivados GG167 unidos a las mismas son más activas contra el virus de influenza que las estructuras de base no substituidas por sí mismas. Los resultados también muestran que muchos de los compuestos poliméricos son más activos que el ligando monomérico simple (compuesto 2c), particularmente cuando se calcula en base a la concentración molar de unidades GG167. El índice terapéutico para cada compuesto se calculó dividiendo la concentración de fármacos citotóxico mínima (MTC) entre el ID50.

CUADRO 8 Será evidente para aquellos expertos en la técnica que aunque la invención ha sido descrita con cierto detalle con el propósito de claridad y entendimiento, varias modificaciones y alteraciones a las modalidades y métodos aquí descritos pueden hacerse sin apartarse del alcance del concepto inventivo descrito en esta especificación.

Las referencias citadas en la presente se listan en las siguientes páginas, y se incorporan aquí por referencia.

Claims (29)

REIVINDICACIONES

1. Un compuesto macromolecular que tiene unido a dicho compuesto una o más moléculas (aglutinantes de neuraminidasa), que se unen al sitio activo de neuraminidasa del virus de influenza pero los cuales no son desdoblados por la neuraminidasa.

2. Un compuesto macromolecular de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el aglutinante de neuraminidasa se une a la molécula a través de un grupo separador o eslabonador, de manera que el aglutinante de neuraminidasa no está estéricamente impedido por la estructura de base de la macromolécula.

3. Un compuesto macromolecular de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde el aglutinante de neuraminidasa tiene un IC50 de 10"6 M o menos.

4. Un compuesto macromolecular de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el aglutinante de neuraminidasa es un derivado de ácido siálico.

5. Un compuesto macromolecular de acuerdo con la reivindicación 4, en donde el compuesto de ácido siálico es el compuesto (I): Compuesto (I) GG167 funcionalizado a través de la posición 7 de la estructura de ácido siálico.

6. Un compuesto macromolecular de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 de la fórmula (II): (X-Y)n-M-(Z)r (II) en donde X es un derivado de ácido 2,3-dehidro-siálico (2) unido a neuraminidasa: (2) que está unido en la posición 7 a través de un grupo separado Y a una macromolécula M, y Z es un substituyente extra opcional sobre la molécula, en donde el separador Y se conecta al grupo W, y en donde R representa un grupo azido, un grupo guanidino no substituido o substituido, o un grupo amino no substituido o substituido; R2 representa COCH3, COCF3, SO2CH3 o SO2CF3; W representa O(C = O)NH, O(C = S)NH, NH(C = O)NH o NH(C = S)NH y está unido a través de NH al grupo Y; m es un entero de entre 0 y 1,000; y n es un entero de entre 1 y 1,000, el grupo separador Y es una cadena opcionalmente substituida de hasta 1,000 átomos seleccionados de carbono, nitrógeno, oxígeno y azufre; y la macromolécula M es un polímero, proteína, anticuerpo o enzima sintética o natural de peso molecular de 104 hasta 107, enlazado covalente o no covalente frente al grupo separador Y.

7. Un compuesto macromolecular de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, de la fórmula (HA): (X' - Y)n-M- (Z)m (HA) en donde X' es un derivado de ciclohexenilo de unión a neuraminidasa de la fórmula (2a): (2a) que está enlazado a través del brazo lateral de éter, R, R2, Y, n y m son como se definieron en la reivindicación 6, y RT y W' son grupos alquilo o alquileno de 1 a 12 átomos de carbono lipofílicos, los cuales están opcionalmente substituidos por uno o más átomos de halógeno o grupos alcoxi, haloalcoxi o arilo opcionalmente substituido.

8. Un compuesto macromolecular de acuerdo con la reivindicación 6 o reivindicación 7, en donde Z es un grupo que une hemaglutinina.

9. Un compuesto macromolecular de acuerdo con la reivindicación 6 o reivindicación 7, en donde Z es un grupo que puede actuar como una marca detectable.

10. Un compuesto macromolecular de acuerdo con la reivindicación 7, en donde Z es biotina o una molécula fluorescente.

11. Un compuesto macromolecular de acuerdo con la reivindicación 6 o reivindicación 7, en donde Z es una enzima adecuada para utilizarse en un ensayo de detección.

12. Un compuesto macromolecular de acuerdo con la reivindicación 6 o reivindicación 7, en donde Z es un grupo con funcionalidad terminal que es adecuado para unir la macromolécula a una superficie.

13. Un compuesto macromolecular de acuerdo con la reivindicación 12, en donde Z es NH2, SH, CO2H, CHO o CH = CH2.

14. Un compuesto macromolecular de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 13, en donde el grupo separador Y se selecciona del grupo que consiste de grupos aminoalquilo, poliaminoácidos, péptidos lineales, oligosacáridos y polisacáridos, unidades de glicol polietilénico, y aminodialquilureas, cualquiera de los cuales puede ser utilizado sólo o en combinación.

15. Un compuesto macromolecular de acuerdo con la reivindicación 14, en donde Y tiene un grupo amino terminal.

16. Un compuesto macromolecular de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 15, en donde la macromolécula M se selecciona del grupo que consiste de proteínas, enzimas, anticuerpos, antibióticos, polímeros sintéticos solubles en agua, polisacáridos y poliaminoácidos.

17. Un compuesto macromolecular de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 15, en donde la macromolécula M se selecciona del grupo que consiste de albúmina de suero (BSA), peroxidasa de rábano (HRP), avidina, estreptavidina o neutravidina, e inmunoglobulinas.

18. Un compuesto macromolecular de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 15, en donde la macromolécula M se selecciona del grupo que consiste de polisacáridos, poliacrilamidas, glicoles polietilénicos, poliureas, poliácidos, poliésteres, poliamidas y N-(2-hidroxi-propil)metacrilamida (HMPA), dicha macromolécula siendo farmacéuticamente aceptable.

19. Un compuesto macromolecular de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 18, en donde R es un grupo guanidino o amino substituido con un grupo metil, etil, alil, amino, ciano o nitro.

20. Un compuesto macromolecular de acuerdo con la reivindicación 6, en donde X es un compuesto de la fórmula (2), en donde R es guanidina, R2 es acetilo, W es un grupo O( = CO)NH y el separador Y es una cadena hecha de hasta 6 y 60 átomos de carbono, nitrógeno y oxígeno.

21. Un método para detectar un virus de influenza, que comprende el paso de exponer una muestra con sospecha de incluir el virus a un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, el cual sea capaz de unirse específicamente al sitio activo de la neuraminidasa del virus de influenza.

22. Un método de acuerdo con la reivindicación 21, en donde el compuesto se une a una superficie a través de unión covalente o unión no específica, y en donde el grupo separador Y es suficientemente largo que las unidades de unión de neuraminidasa X quedan expuestas sobre la superficie de la macromolécula M y accesibles a una partícula de virus.

23. Un método de acuerdo con la reivindicación 21 o 22, caracterizado porque es un ensayo de captura selectiva, un ensayo de detección selectiva, o una combinación de ensayo de captura selectiva-detección selectiva.

24. Una composición farmacéutica para el tratamiento de influenza A o influenza B que comprende un compuesto de la invención, preferiblemente un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, 13, 14 y 18 a 20, o un derivado farmacéuticamente aceptable del mismo, junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable, en donde el compuesto tiene un ID50 para neuraminidasa menor que 5 µg/ml.

25. Una composición de acuerdo con la reivindicación 24, en donde el compuesto es un compuesto de acuerdo con la reivindicación 6 o reivindicación 7.

26. Una composición de acuerdo con la reivindicación 24 o 25, que comprende además uno o más agentes terapéuticamente activos.

27. Una composición de acuerdo con la reivindicación 26, en donde el agente terapéuticamente activo adicional es un agente antiviral.

28. Un método para el tratamiento de infección de influenza en un mamífero, incluyendo el hombre, que comprende el paso de administrar una cantidad efectiva de un compuesto de la invención, preferiblemente un compuesto de acuerdo con cualquiera de ias reivindicaciones 1 a 7, 13, 14 y 18 a 20, o un derivado farmacéuticamente aceptable del mismo, a un mamífero con la necesidad de dicho tratamiento, en donde ei compuesto tiene un ID50 para neuraminidasa menor que 5 µg/ml.

29. El uso de un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, 13, 14 y 18 a 20 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una infección viral de influenza, en donde el compuesto tiene un ID50 para neuraminidasa menor que 5 µg/ml.