MXPA99003563A - Metodos y composiciones para la distribucion y expresion de acidos nucleicos de interferon - Google Patents

Abstract

Se proveen métodos y composiciones para la expresión específica de tejido del interferon alfa para propósitos terapéuticos.

Description

MÉTODOS Y COMPOSICIONES PARA LA DISTRIBUCIÓN Y EXPRESIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS DE INTERFERON. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los interferon alfa humanos (IFN-a) son una familia de proteínas que comprenden al menos 24 sub-espeaes (Zoon, K C , Interferon 9 1 (1987) \ Greser, I , de Academic Press, NY) Los interferon alfas fueron descnptos originalmente como agentes capaces de inducir un estado antiviral en las células pero ahora son conocidos como linfocinas pe otropicas que afectan muchas funciones del sistema mmunoiogico (Openakker et al Experimentos 45 513 (1989)) Los I F-o han sido ampliamente usados para propósitos terapéuticos incluyendo a la leucemia de célula pilosa, sarcoma de kaposi carcinoma de célula renal hnfoma no Hodkm leucemia de célula T, leucemia mielogepa múltiple y crónica melanoma maligno carcinoma de célula de vejiga carcinoma de colon (con 5-FU) acumipata de condiloma pnovirus y vanas formas de hepatitis viral crónica que ocurre como resultado del virus de la hepatitis B (HBV) virus de hepatitis C (HCV) virus no A y no B (NANB), o infección por el virus de la hepatitis (HDV) (Pestka Investigación AÍDA y Retroviruses Humanos 8 (5) 776-786 (1992)) El INF-o también ha sido altamente efectivo contra la megacapocitopoiesis y par controlar la trombocitosis en pacientes con trastornos mieioprohferativos (Talpaz et al Med Int de los Anales 99 789-792 (1983) Gisslmger et al Lancet i 634-637 (1989) Ganser et al Sangre 70 1 173-1 19 (1987)) Las técnicas de terapia del gen tienen el potencial para limitar la exposición 199 903 pfc de un sujeto al producto del gen, como por ejemplo, interferon, apuntando la expresión del gen terapéutico a un tejido de interés Sin embargo en general, a capacidad de apuntar al tejido de interés es uno de los desafíos principales de la terapia del gen Como un ejemplo de apuntar a los genes de mterferon, la Publicación de la Aplicación de la Patente WIO Rn WO 93/15609 describe la v distribución de genes de interferon en el tejido vascular por medio de la administración de estos genes en las áreas de la pared del vaso sanguíneo usando un sistema de catéter En otro ejemplo, un vector adenoviral que codifica a una proteína capaz de convertir enzimáticamente una pro-droga un "gen suicida ", y un gen que codifica una atocina se administran directamente en un tumor sólido Otros métodos para apuntar genes terapéuticos a los tejidos de interés incluyen a las tres categorías generales de objetivos transductores, objetivos de posición, y objetivos transcppaonales (para una revisión, ver por ejemplo Miller et al FASEB J 9 190-199 (1995)) El objetivo transductor se refiere a la entrada selectiva en las células específicas logrado primariamente por la selección de un ligando receptor El objetivo de posición dentro del genoma se refiere a la integración en el sitio conveniente como por ejemplo, las regiones activas de la cromatma o a través de la recombinación homologa con una secuencia nucleotida endógena como por ejemplo un gen objetivo El objetivo transcppcional se refiere a la expresión selectiva lograda por la incorporación de promotores de transcripción con una regulación altamente específica de la expresión del gen recortada a las células de interés Los ejemplos de los promotores específicos de tejido incluyen al promotor para la cinasa de creatina que ha sido usada para dingir la expresión de la expresión de cADN de distrofina en los tejidos musculares y cardíacos (Cox et al Naturaleza, 364 725-729 (1993)), y la expresión de los genes suicidas en las células B (Maxwell et al Cáncer Res 51 4299-4304 (1991 )) Una región regulatopa específica de la célula endotelial ha sido también caracterizada \ (Jahroudí et al , Biología Celular Molecular 14 999-1008 (1994)) Los vectores retrovirales anfotróficos ha sido construidas portando una cmasa de timidina del virus de herpes simplex bajo el control de tanto los promotores de albúmina y alfa-fetoproteína (Huber et al Proc Nati Acad Sci U S A , 88 8039-8043 (1991 )) para las células objetivo de hígado y hepatoma, respectivamente Estos promotores específicos de tejido pueden usarse en los vectores retrovirales (Hartzoglou et al J Biol Chem 265 17285-17293 (1990)) y vectores de adenovirus (Friedman et al Biología Celular Molecular 6 3791-3797 (1986)) y todavía retienen su especificidad del tejido De esta manera existe la necesidad de la expresión del objetivo del alfa ipterferon para el tratamiento del cáncer, hepatitis y otras condiciones sujetas a la terapia con alfa interferon La presente invención resuelve esta necesidad, y más COMPENDIO DE LA INVENCIÓN Un aspecto de la invención es un método para proporcionar a un paciente un polipeptido de interferon alfa que comprende introducir en un tejido de interés del paciente un vector que comprende un segmento de ácido nucleico que codifica un polipeptido de interferon alfa el segmento de ácido nucleico está operativamente unido al promotor que tiene una especificidad para el tejido de ínteres, donde el poiipeptido se expresa en el tejido de interés Otro aspecto de la invención es un método para aumentar los niveles de mterferon alfa en un tejido de interés en un paciente, dicho método comprende introducir al tejido de interés un vector que comprende un segmento de ácido nucleico que codifica al polipéptido de interferon alfa, el segmento de ácido nucleico está operativamente ligado a un promotor que tiene una especificidad para el tejido de interés, donde el po péptido de interferon alfa está expresado en el tejido de interés en el paciente Otro aspecto de la invención es un método para el tratamiento del cáncer que responde al interferon alfa que comprende administrar a un tejido canceroso un vector que comprende un segmento de ácido nucleico que codifica a un pohpéptido de interferon alfa un segmento de ácido nucleico que codifica a un polipéptido de interferon alfa, el segmento de ácido nucleico está operativamente ligado a un promotor que tiene una especificidad para el tejido donde el polipeptido de interferon alfa esta expresado en el tejido Otro aspecto de la invención es un método para el tratamiento de la hepatitis que comprende administrar en el hígado de un paciente un vector que comprende un segmento de acido nucleico que codifica a un po péptido de interferon alfa el segmento de acido nucleico esta operativamente ligado a un promotor que tiene especificidad para las células del hígado donde el polipéptido de tnterferon alfa se expresa en el hígado del paciente Otro aspecto de la invención es una composición que comprende un vector que comprende un segmento de acido nucleico que codifica a un polipeptido de mterferon alfa el segmento de acido nucleico está operativamente ligado a un promotor que tiene especificidad para el tejido de interés BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 es un gráfico que ilustra los efectos anti-proliferativos del interferon alfa en las células de cáncer de próstata humano La Figura 2 es un gráfico que ilustra la actividad de luciferasa como una \ medida de la expresión de luciferasa conducida por medio de promotores de genes específicos de hígado. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA REALIZACIÓN PREFERIDA La presente invención provee método para la expresión específica de tejido de INF-o usando promotores específicos de tejido. El término IFN-a tal como se usa aquí pretende incluir a todas las sub-clases de interferon alfa, sus variantes de eliminación, inserción o sustitución, fragmentos biológicamente activos, y formas allélicas "Biológicamente activo" como se usa aquí se refiere a cualquier actividad anti-viral o anti-pro ferativa medida por medio de las técnicas bien conocidas en la técnica (ver. por ejemplo, Openakker et al., supra, Mossman Periódico de Métodos de Inmunol 65. 55 (1983)). Los interferon alfas recombmantes han sido clonados y expresados en E. coli por medio de vanos grupos (por ejemplo Weissmann et al Ciencia 209 1343-1 49 (1980), Sreuli et al Ciencia 209 1343-1347 (1980) Goeddel et al Naturaleza 290 20-26 (1981 ). Heneo et al Periódico de Biol Mol 185 227- 260 (1985)). Preferentemente, el interferon alfa es interferon alfa 2a o 2b (ver, por ejemplo, WO 91/ 18927), a pesar de que puede usarse cualquier mterferon alfa Los ácidos nucleicos que codifican al polipéptido IFN-o pueden ser ADN o ARN La frase "secuencia de ácido nucleico que codifica" se refiere a un ácido nucleico que dirige la expresión de una proteína o polipéptido específico Las secuencias de ácido nucleico incluyen tanto a la secuencia de filamento de ADN que está transcripta en la secuencia de ARN como a la secuencia de ARN que está traducida en proteína Las secuencias de ácido nucleico incluyen tanto a las secuencias de á ñci «do nucleico de longitud completa como a las secuencias de \ longitud no completa derivadas de la proteína de longitud completa Además se entiende que la secuencia incluye a los codones degenerados de la secuencia natural o secuencias que pueden ser introducidas para proporcionar la preferencia de codón en una célula huésped específica EL término "vectorj se refiere a los sistemas de expresión viral , ADN circular auto-rep cativo autónomo (plásmidos), e incluye tanto a los plásmidos de expresión como de no expresión Cuando un microorganismo recombinante o cultivo celular se describe como albergando un "vector de expresión", esto incluye tanto al ADN circular extra-cromosómico como al ADN que ha sido incorporado en el/ los cromosomays huésped Cuando un vector está siendo mantenido por una célula huésped, el vector puede ser tanto replicado de manera estable por las células durante la mitosis como una estructura autónoma, como incorporado dentro del genoma del huésped Un vector contiene múltiples elementos genéticos posiaonal y secuencialmente orientados, por ejemplo, operativamente unidos con otros elementos necesarios de manera tal que el ácido nucleico en el vector que codifica al IFN-a pueda ser transcripto, y cuando sea necesario, traducido en las células transfectadas El término "gen" como se usa aquí pretende referirse a una secuencia de ácido nucleico que codifica a un polipéptido Esta definición incluye a varios polimorfismos de secuencia, mutaciones y o vanantes de secuencia en las que estas alteraciones no afectan la función del producto del gen El término "gen" pretende incluir no sólo a las secuencias de codificación sino también a las regiones regulatopas como por ejemplo, promotores, fomentadores y regiones de terminación El término además incluye a todos los intrones y otras secuencias de \ ADN unidas de la transcripción de mARN, junto con las vanantes resultantes de los sitios de unión alternativos El término "plásmido" se refiere a una molécula de ADN circular autónoma capaz de replicarse en una célula e incluye tanto a los tipos de expresión como de no expresión Cuando un microorganismo recombmante o cultivo de tejido se describe como hospedando a un "plásmido de expresión", esto incluye tanto a las moléculas de ADN circular extra-cromosórnicas como al ADN que ha sido incorporado en el/ los cromosoma/s huésped Cuando un plásmido es mantenido por una célula huésped el plasmido o está siendo replicado de manera estable por las células durante la mitosis como una estructura autónoma o está incorporado dentro del genoma del huésped La frase "proteina recombinapte" o ' proteina producida de manera recomb?nanter se refiere a un peptido o proteina producidos usando células no naturales que no tienen una copia endógena de ADN capaz de expresar a la proteina Las células producen la proteina debido a que han sido genéticamente alteradas por la introducción de la secuencia de ácido nucleico adecuada La protema recombmante no se encontrará asociada a las proteínas y otros componentes sub-celulares normalmente asociados con las células que producen a la proteína Los términos "proteína" y 'polipéptido" se usan de manera intercambiable aquí En general, el IFN-s está provisto en un vector de expresión que comprende a los siguientes elementos enlazados secuencialmente a distancias adecuadas para la expresión funcional un promotor específico de tejido, un sitio de iniciación para la transcripción, una región no traducida 3', una secuencia líder mARN 5', una secuencia de ácido nucleico que codifica a un polipéptido de alfa mterferop y una señal de poliadenilación Las secuencias fomentadoras y otras secuencias que ayudan a la expresión y/o secreción también pueden incluirse en el vector de expresión Los genes adicionales, como por ejemplo, aquellos que codifican a la resistencia a la droga, pueden estar incluidos para permitir la selección o rastreo de la presencia del vector recombmante Estos genes adicionales pueden incluir, por ejemplo, a los genes que codifican la resistencia a la neomicina, la resistencia a la multi-droga la cinasa de timidina, beta-galactosidasa, reductasa de dihidrofolato (DHFR) y acetil transferasa de cloranfenicol. En la presente invención el objetivo del IFN-a hacia un tejido particular de interés se logra por medio del uso de un promotor y/o otros elementos de expresión preferentemente usados por el tejido de interés Los ejemplos de promotores de tejido conocidos específicos incluyen al promotor para la cinasa de creatina, que ha sido usada para dirigir la expresión de ia expresión de cADN de distrofma en el tejido muscular y cardíaco (Cox et al Naturaleza 364 725-729 (1993)) promotores de cadena liviana o pesada de inmunoglobulina para la expresión de los genes en las células B, promotores de albúmina o alfa-fetoproteina para apuntar a las células de la estirpe del hígado y células de hepatoma, respectivamente Los elementos de expresión especifica de tejido ejemplares para el hígado incluyen pero no están limitados al promotor de reductasa de HMG-CoA (Luskey Biol Cel Mol 7 (5) 1881-1893 (1987)), el elemento regulatopo 1 de esterol (SER-1 , Smith et al Periódico de Biol Chem 265(4) 2306-2310 (1990) el promotor de carboxi cmasa de fosfoenol piruvato (PEPCK) (Eisenberger et al Biol Cel Mol 12 (3) 1396-1403 (1992)), el promotor de proteína C-reactiva humana (CRP) (Li et al , P Biol Chem 265 (7) 4136-4142 (1998)), el promotor de glucocmasa humana (Tanizawa et al Endocrinología Molecular 6 (7) 1070-81 (1992) el promotor de 7-alfa hidroilasa de colesterol (CYP-7) (Lee et al Periódico de Biol Chem 269(20) 14681-9 (1994)), el promotor de beta-galactos?dasa-2,6-sialiltransferasa (Svensson et al Periódico de Biol Chem 265(34) 20863-8 (1990) el promotor de la proteina de enlace con el factor de crecimiento tipo insulina (IGFBP-1) (Babajko et al Biochem Biophvs Res Comm 196 (1) 480-6 (1993)) el promotor de aldolasa B (Bmgle et al Periódico de Bioquim 294 (Pt2) 473-9 (1993)) el promotor de transferpna humana (Mendelzon et al Nucí Acids Res 18 (19) 5717-21 (1990) el promotor del colágeno del tipo I (Houglum et al P de Clin Invest 94 (2) 808-14 (1994)) Los elementos de expresión específica de tejido ejemplares para la próstata incluyen pero no están limitados al promotor de fosfatasa de acido prostético (PAP) (Bañas et al Acta de Biofísica Bioquímica 1217 (2) 188-94 (1994)), la protema secretoria prostatica del promotor 94 (PSP 94) (Nolet et al Acta de Biofísica Bioquímica 1098(2) 247-9 (1991)), el promotor complejo de antígeno específico de próstata (Casper et al P de Biol Mol de Bioquímica Esteroide 47 (1-6): 127-35 (1993)); el promotor del gen de Kallikrein glandular humana (hgt-1 ) (Lilja et al, P. de Urología Mundial 11 (4); 188-91 (1993) Los elementos de expresión específica de tejido ejemplares para el tejido t t gástrico incluyen pero no están limitados al promotor de sub-unidad *I\ -ATPasa alfa (Tanura et al CarTas FEBS , 298: (2-3): 137-41 (1992)). Los elementos de expresión específicos de tejido ejemplares para el páncreas incluyen pero no están limitados al promotor asociado con el promotor de proteina (PAP) (Dusetti et al P de Quim Biol 268 (19): 14470-5 (1993)), el fomentador transcripcional de elastasa 1 (Druse et al. Genes y Desarrollo 7 (5) 774-86 (1993)), el promotor del fomentador de amilasa y elastasa específicos del páncreas (Wu et al Biol Cel Mol 1 1 (9) 4423-30 (1991 ), Keller et al, Genes y Desarrollo 4(8) 1316-21 (1990)) el promotor del gen de estearasa de colesterol pancreático (Fontame et al Bioquímica 30 (28) 70008-14 (1991 )) Los elementos de expresión específica de tejido ejemplares para el endometpo incluyen pero no están limitados al promotor de la uteroglobina (Helftenbein et al Anal Ciencia Acad NY 622 69-79 (1991 )) Los elementos de expresión específica de tejido ejemplares para las células suprarrenal incluyen pero no están limitadas al promotor de inserción de cadena lateral de colesterol (SCC) (Rice et al P de Quím Biol 265: 1 1713-20 (1990).

Los elementos de expresión específicos de tejido ejemplares para el sistema nervioso general incluyen pero no están limitados al promotor de enolasa gama-gama (enolasa específica de neurona, NSE) (Forss-Petter et al, Neurona 5 (2) 187-97 (1990)) Los elementos de expresión específicos de tejido para el cerebro incluyen pero no están limitados al promotor de cadena pesada de neurofilamepto (NF-H) (Schwartz et al f de Quim Biol 269 (18) • 13444-50 (1994)) Los elementos de expresión específicos de tejido ejemplares para los nfocitos incluyen pero no están limitados al promotor CGL- 1/ granzima B humano (Hanson et al P de Quím Biol 266 (36) 24433-8 (1991 )); la transferasa deoxi terminal (TdT), el promotor lambda 5, VpreB, y Ick (cinasa de proteína de tirosma específica de hnfocito p561 ck) (lo et al Biol Cel Mol 1 1(10) 5229-43 (1991 )), el promotor CD2 de humanos y su fomentador 3'transcr?pc?onal (Lake et al EMBO J 9 (10) 3129-36 (1990)), y el promotor de activación específico de NK humano y de célula T (Houchms et al Inmunoqenética 37 (2) 102-7 (1993)) Los elementos de expresión específicos de tejido ejemplares para el colon incluyen pero no están limitados al promotor de cmasa de tirosma pp60c-src (Talamonti et al Periódico de Invest Clin 91 (1 ) 53-60 (1993)), neoantígenos específicos de órgano (OSNs) el promotor mw 40kDa (p40) (llantzis et al Inmunol Microbiol 37 (2) 1 19-28 (1993)), el promotor de antígeno-P específico de colon (Sharkey et al Cáncer 73 (3 sup) 864-77 (1994)) Los elementos de expresión específicos de tejido ejemplares para las células de la mama incluyen pero no están limitados al promotor de alfa-lactalbúmtna humano (Thean et al Periódico Ingles del Cáncer 61 (5) 773-5 (1990)) Otros elementos que ayuda a la especificidad de la expresión en el tejido de ínteres pueden incluir a las secuencias líder de secreción, fomentadores, señales de localización nuclear, peptidos endosmolítico, etc Preferentemente, estos elementos derivan del tejido de interés para ayudar a la especificidad Las técnicas para la manipulación de ácido nucleico de las secuencias de ácido nucleico de la invención como por ejemplo, la sub-clonación de las secuencias dekác?do nucleico que codifican a los polipéptidos en vectores de expresión, sondas de rotulación, hibpdización de ADN, y similar se describen de manera general en Sambrook et al , Clonación Molecular - Un Manual de Laboratorio (2da edición) Vol 1-3 Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York, (1989) que se incorpora aquí para referencia Este manual se ahora en más se refiere como "Sambrook et al " Una vez que el ADN que codifica una secuencia de interés se aisla y se clona, se pueden expresar a las proteínas codificadas en una variedad de células preparadas de manera recombmante Se espera que las personas entrenadas en el arte conozcan los numerosos sistemas de expresión disponibles para la codificación del ADN Aqui no se intenta describir con detalles varios métodos conocidos para la expresión de las proteínas en procariotes o eucariotes Resumiendo brevemente la expresión de los ácidos nucleicos naturales o sintéticos que codifican una secuencia de interés típicamente se logrará enlazando de manera operativa al ADN o CADN a un promotor (que es tanto constitutivo o inducible) seguido de la incorporación en un vector de expresión Los vectores pueden ser adecuados para la replicación e integración en tanto los procariotes o eucariotes Los vectores de expresión típicos contienen a los termmadores de transcripción y traducción, secuencias de iniciación, y promotores útiles para la regulación de la expresión de la secuencia del polinucleótido de interés Para obtener la expresión de alto nivel de un gen clonado, es conveniente construir a los plásmidos de expresión que contienen, como mínimo, un promotor fuerte para dirigir la transcripción, un sitio de enlace de ribosoma para la iniciación translativa y un terminador de transcripción/ traducción. Los^ vectores de expresión también pueden comprender a los cassettes de expresión genérica que contienen al menos una secuencia del terminador independiente, a las secuencias que permiten la replicacióp del plásmido tanto en eucariotes como procariotes, por ejemplo, vectores Shuttle, y marcadores de selección tanto para los sistemas procarióticos y eucarióticos. Ver Sambrook et al. Las construcciones de la invención pueden introducirse en el tejido de interés in vivo o ex vivo por medio de una variedad de métodos. EN algunas realizaciones de la invención, el vector se introduce en las células por medio de métodos como por ejemplo la microipyección, precipitación de fosfato de calcio, fusión de liposoma, y biolistica En otras realizaciones, el ADN se toma directamente por medio del tejido de interés. En otras realizaciones, las construcción se envuelven en el sistema de vector viral para facilitar la introducción dentro de las células Los sistemas de vector viral útiles en la práctica de la presente invención incluyen al adenovirus, herpesvirus, virus adeno-asociado, virus diminuto del ratón (MVM), virus Smdbis, y retroviruses como por ejemplo, el virus del sarcoma Rous y MoMLV Típicamente las construcciones de la presente invención están insertadas en estos vectores para permitir el envasado de la construcción de la expresión de interferon , típicamente con ADN viral acompañante, la infección de una célula huésped sensible, y la expresión del gen de interferon-a. Un vector particularmente ventajoso es el vector de adenovirus descripto por Wills et al Terapia del Gen Humano 5 1079-1088 (1994) En incluso ptras realizaciones de la invención, las construcciones de IFN-a \ recombinantes de la invención están conjugadas con un ligando de receptor celular para la toma facilitada (por ejemplo, la invaginación de huecos revestidos y la interna zaci?n del endosoma) a través de una porción de enlace de ADN (Wu et al. Periódico de Química Biológica 263: 14621-14624 (1988), WO 92/06180). Por ejemplo, las construcciones de ADN de la invención pueden estar enlazadas a través de una porción de polilisina al asialo-oromucócido, que es un ligando para el receptor de asialog coproteina de los hepatocitos. De manera similar, las envolturas virales usadas para envolver a las construcciones de la invención pueden ser modificadas por el agregado de los ligandos del receptor o anticuerpos específicos para un receptor para permitir la endocitosis mediada con el receptor en las células específicas (por ejemplo, WO 93/20221. WO 93/14188. WO 94/06923) En algunas de las realizaciones de la invención, las construcciones de ADN de la invención están enlazadas a las proteínas virales, como por ejemplo las partículas de adenovirus, para facilitar la endocitosis (Cunel et al Proc Nati Acad Sci U S.A 88 - 8850-8854 (1991 )) En otras realizaciones, los conjugados moleculares de la presente invención pueden incluir a los inhibidores de microtúbulo (WO/94 6922), péptidos sintéticos que imitan a la hemaglutinma del virus de influenza (Plank et al. P de Biol Quim 269 12918-12924 (1994)), y las señales de localización nuclear como por ejemplo, el antígeno T SV40 (WO 93/19768) El término "tratamiento" como se usa aquí pretende referirse a la introducción del ácido nucleico que codifica al alfa interferon a un paciente con el propósito de exp.oner un tejido de interés, especialmente un tejido que tiene una o más células que demuestran alguna patología, al alfa interferon. De esta manera, por ejemplo, tejido "canceroso" pretende referirse a un tejido en el que una o más células son clasificadas como cancerosas, malignas, tumorales, pre-cancerosas, transformadas o como un adenoma o carcinoma, y cualquier otro sinónimo comúnmente usado en el arte para estas condiciones. Una célula "no cancerosa" tal como se usa aquí se entiende que en el arte está excluida de la definición de célula cancerosa o de cáncer, y puede incluir a las células normales y a las células que muestran alguna característica patológica como por ejemplo la infección por medio de un virus, bacteria, parásito, y otro organismo, las células afectadas por una condición que se puede heredar que les otorga contrapartes menos óptimas que las normales o del tipo natural, células afectadas por algún estado de enfermedad presumido no infeccioso como por ejemplo diabetes, etc., y células que han sobrevivido a cualquiera de estos trastornos etc El tratamiento o terapia de cualquier condición que podría beneficiarse de la administración de IFN-o puede comenzarse antes del diagnóstico de la condición o en cualquier momento antes del diagnóstico de la condición. De esta manera, por ejemplo, un paciente del que se sospecha tiene una lesión pre-cancerosas o una probabilidad aumentada de desarrollo de algún tipo de cáncer puede ser tratada con las composiciones de la invención De manera similar, una persona expuesta a un patógeno, como por ejemplo, el virus de la hepatitis B, puede ser tratada con las composiciones de la invención antes de haber diagnosticado la hepatitis Más aun, los portadores sospechados de HBV o los pacientes que se presumen pueden ser portadores pueden ser tratados luego de haber mejorado los síntomas principales de la enfermedad Las construcciones de la invención son útiles en la terapia de vanos cánceres, la hepatitis y otras condiciones en las que la administración de IFN-o para elevar los niveles de IFN-s en los tejidos es ventajosa, incluyendo pero no limitándose a la colitis ulcerante, infecciones de nnovirus, acummata de condiloma, papilomitis laríngea, infección por HIV, fibrosis, enfermedades alérgicas debido al exceso de producción de IL-4 e IgE, y trastornos granulomatosos, como por ejemplo, la enfermedad de Crohn A pesar de que se puede apuntar a cualquier tejido para el cual puede identificarse algún elemento de expresión específica de tejido como por ejemplo, un promotor, es de particular ínteres la administración específica de tejido de IFN-a para elevar los niveles de IFN-3 como por ejemplo los tejidos de carcinoma de próstata humana o tejidos de hepatoma Mas aun las construcciones de la invención pueden usarse para elevar los niveles de IFN-o en los tejidos en condiciones patológicas en las que las células no-cancerosas son deficientes en la producción de interferon, por ejemplo, producen menos mterferon que las células sanas, como por ejemplo, los portadores del virus de la hepatitis B crónica (Noup-Apa et al Hepatoloqia 14 (6) 1308-1311 (1991 )) En algunas realizaciones de la invención las construcciones tienen el objetivo de los tejidos o células vecinas para elevar la concentración local de interferon en una población celular de interés Las composiciones de la invención se formularán para la administración de las formas conocidas en el arte aceptables para la administración a un sujeto mamífero, preferentemente un humano. En algunas realizaciones de la invención, las composiciones de la invención pueden administrarse directamente dentro de un tejido por medio de una inyección o pueden administrarse en los vasos sanguíneos alimentan al tejido de interés. En otras realizaciones de la invención, las composiciones de la invención se administran "locoregionalmente", por ejemplo, intravenosamente, intralesión, y/o tópicamente. En otras realizaciones de la invención, las composiciones de la invención se administran sistémicamente por medio de una inyección, inhalación, supositorio, distribución transdérmica, etc En otras realizaciones de la invención, las composiciones se administran a través de catéteres y otros dispositivos para permitir el acceso a un tejido remoto de interés, como por ejemplo, un órgano interno Las composiciones de la invención también puede administrarse en los dispositivos del tipo depósito, implantes, o formulaciones encapsuladas para permitir la liberación lenta o sostenida de las composiciones La invención provee composiciones ara la administración que comprenden una solución de las composiciones de la invención disueltas o suspendidas en un portador aceptable, preferentemente un portador acuoso. Una variedad de portadores acuosos pueden usarse, por ejemplo, agua, agua regulada, 0.8 % de salmuera. 0.3 % de glicina, ácido hialurónico y similares, estas composiciones pueden esterilizarse por medio de las técnicas de esterilización muy conocidas convencionales, o pueden ser filtradas de manera estéril Las soluciones acuosas resultantes pueden envasarse para usar tal como están , o pueden ser liofilizadas, la preparación liofilizada está combinada con una solución estéril antes de la administración. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables tal como lo requieren para aproximarse a las condiciones fisiológicas, como por ejemplo, ajustando el pH y agentes reguladores, agentes de ajuste de tonicidad, agentes humectantes y similares, como por ejemplo, acetato de sodio, lactato de sodio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, monolaurato sorbitano, oleato de trietanolamma, etc La concentración de las composiciones de la invención en las formulaciones farmacéuticas puede variar ampliamente, por ejemplo, entre menos que alrededor del 0,1 %, usualmente al o menos que alrededor del 2 % hasta tanto como el 20% hasta el 50%. o más en peso, y será seleccionada primariamente por los volúmenes de fluido viscosidades etc., de acuerdo con el modo particular de administración elegido Las composiciones de la invención también pueden también administrarse por medio de liposomas Los liposomas incluyen a las emulsiones, espumas. micelas, monocapas msolubles cristales líquidos, dispersiones de fosfolípidos, capas laminares y similares En estas preparaciones la composición de la invención a ser distribuida se incorpora como una parte de un liposoma, solo o junto con una molécula que se enlaza al objetivo deseado, como por ejemplo, un anticuerpo, o con otras composiciones terapéuticas o inmunogénicas. De esta manera, los liposomas tanto llenos o decorados con la composición deseada de la invención pueden distribuirse sistémicamepte, o pueden estar dirigidos a un tejido de interés, donde los liposomas luego distribuyen a la composición de péptido terapéutica/ inmunogénica seleccionada Los liposomas para usar en la invención se forman de los lípidos formadores de vesícula estándares, que generalmente incluyen a los fosfolípidos neutros o cargados negativamente y un esterol como por ejemplo, colesterol La selección \ de lípidos generalmente está guiada por la consideración de por ejemplo, el tamaño del liposoma, la labilidad acida y estabilidad de los liposomas en el flujo sanguíneo Hay disponibles variedad de métodos para preparar los liposomas, tal como se describe en por ejemplo, Szoka et al Revisión Anual de Bioinqeniería Biofísica , 9 467 (1980), la Patente estadounidense Nr 4.235 871 , la Patente estadounidense Nr 4 501 728, la Patente estadounidense 4 837 028 y la Patente estadounidense 5 019 369 incorporadas aquí para referencia Una suspensión de hposoma que contiene una composición de la invención puede ser administrada intravenosamente, localmente, tópicamente, etc en una dosis que varía de acuerdo con ínter alia, la forma de administración, la composición de la invención a ser distribuida y la etapa de la enfermedad a ser tratada Para las composiciones sólidas, los portadores sólidos no tóxicos convencionales pueden usarse estos incluyen , por ejemplo, a los grados farmacéuticos de manitol lactosa almidón, estearato de magnesio, sacarina de sodio talco, celulosa, glucosa sacarosa, carbonato de magnesio y similares Para la administración oral una composición no tóxica farmacéuticamente aceptable está formada incorporando cualquiera de los excipientes normalmente utilizados, como por ejemplo, aquellos portadores previamente enumerados, y generalmente entre el 10 - 95 % del ingrediente activo, esto es, una o más composiciones de la invención , y más preferentemente en una concentración del 25%- 75%. Para la administración en aerosol, las composiciones de la invención preferentemente están provistas en una forma finamente dividida junto con un surfactante y un propulsor Los porcentajes típicos de las composiciones de la invención son entre el 0.01 % - 20% en peso, preferentemente 1% - 10% El surfactante debe , por supuesto, ser no tóxico, y preferentemente soluble en el propulsor. Los representantes de estos agentes son los esteres o esteres parciales de ácidos grasos que contienen entre 6 y 22 átomos de carbono, como por ejemplo, los ácidos caproico, octanoico, láunco, palmítico, esteárico, linoleico, linolénico, oiestépco y oleico con un alcohol polihídrico alifático o su anhídrido cíclico Los esteres mixtos como por ejemplo, los glicéridos mixtos o naturales pueden ser utilizados El surfactante puede constituir el 0,1 %-20% en peso de la composición, preferentemente 0.25%-5% El balance de la composición es ordinariamente propulsor Un portador también puede ser incluido, si se desea, asi como también por ejemplo lecitina para la distribución mtranasal. Las construcciones de la invención pueden adicionalmente ser distribuidas en un sistema del tipo deposito una forma encapsulada o un implante por medio de las técnicas bien conocidas en el arte De manera similar, las construcciones pueden distribuirse por medio de una bomba aun tejido de interés En algunas de las realizaciones de la invención, las composiciones de la invención se administran ex vivo a las células o tejidos explantados de un paciente, y luego se regresan al paciente Los ejemplos de la administración ex vivo de las construcciones de la terapia del gen incluyen a Arteaga et al.

Investigación del Cáncer 56(5) : 1098-1103 (1996); Nolta et al, Proc Nati. Acad Sci. USA 93 (6): 2414-9 (1996); Koc et al. Seminarios en Oncología 23 (1 ) 46-65 (1996); Raper et al. Anales de Cirugía 223(2) : 116-26 (1996); Dalesandro et al. Periódico de C Yirugía Cardíaca Torácica 11 (2) : 446-22 (1996); y Makarov et al, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 93 (1 ) : 402-6 (1996). Los siguientes ejemplos están incluidos para los propósitos ilustrativos y no deben considerarse como limitantes de la presente invención. EJEMPLOS I. Interferon-alfa Efectivo en la Proliferación de la Célula del Cáncer de Próstata Se estudiaron tres células de carcinoma de próstata diferentes, LNCaP (dependiente del apdrógeno , ATCC #CRL 1740), células PC-3 (independientes del andrógeno, ATCC #CRL 1435) y DU-145 (independiente del andrógeno, ATCC #HTB 81 ) Las células crecieron en 5 concentraciones diferentes (10, 102, 103. 104, 105 lU/ml) de ?nterferon-a2b (Schering-Plough) durante 72 horas en el siguiente medio las PC-3 se cultivaron en un medio F12 K Ham (GIBCO BRL) suplementado con suero bovino fetal al 7 % ; DU-145 fue cultivado en DMEM (GIBCO BRL) suplemeptado con suero de cabra fetal al 10 %; LnCaP fue cultivado en RPMI 1640 (GIBVO BRL) suplementado con suero bovino fetal al 5 % Los efectos anti-proliferativos del interferon se midieron por medio del ensayo MTT (Mossman. P. de los Métodos de Inmunología 65:55 (1983)). Las células PC-3 y DU-145 mostraron una sensibilidad consistente a las concentraciones en aumento del interferon estabilizado en 104 I U/ml. Las células LNCaP sensibles al andrógeno no respondieron al IFN. Entre las dos células refractarias de andr?geno , la PC-3 parecía más sensibles que las células DU-145 Estos datos fueron resumidos en la Figura 1 Las líneas enteras representan la línea celular PC-3 (independiente del andrógeno); las líneas entrecortadas representan la línea celular DU-145 (independiente del andrógeno), las líneas diagonales representan LNCaP (dependiente del andrógeno) II Construcción de un Cassette de Expresión Un vector de expresión fue construido con una secuencia de cADN completa de interferon alfa 2b (IFN-a2b) y una secuencia de señal completa para IFN-a2b (Sreu et al Ciencia 209 1343-1347 (1980), Goeddel et al Naturaleza 290 20-26 (1981 ), Heneo et al P de Biol Mol 185 227-260 (1985) bajo el control de un promotor basal de aproximadamente 600 bp para el gen de antígeno específico de próstata (PSA) para la expresión específica de tejido del IFN-a en células de carcinoma de próstata Básicamente, el cADN IFN-a2b de longitud completa que tiene su líder de señal putativa en el extremo 5' fue clonado en el sitio de poli-clonación en el flujo descendente de Hindll y Eco Rl del promotor de CMV en el vector PCDNA3 (Invitrogen) de expresión de mamíferos para crear el plásmido DIFN La secuencia de flanco 5' del gen PSA que contiene al promotor PSA (BBRC 161 1151 -1 159 (1989). Genbank #M27274) fue insertada en el vector, reemplazando al promotor CMV para crear al plásmido PSADIFN III Clonación de los Promotores Básales para los Genes Específicos de Hígado Las secuencias de flanco 5' , incluyendo a los promotores básales, de cuatro genes específicos de hígado humano, albúmina (HAL), s1-ant?tr?ps?na (HAT), alfa fetoproteína (AFP), y reductasa de hidroxi-metil-glutaril CoA (HMG), fueron sub-clonadas de ATCC 65731 , ATCC 61597, ATCC 65735, y ATCC 59567, respectivamente en el vector pCRScript para usar en la distribución del gen de interferon y su expresión específica de tejido en las células hepáticas (Luskey Biol. Cel. Mol. 7 (5) : 1881-1893 (1987); Minghetti et al, P. de Quim. Biol. 261 (15) : 6747-6757 (1986); Long et al, Bioquímica 23: 4828 - 4837 (1984); Gibbs Bioquímica 26 : 1332-1343 (1987)) Luego del mapeo de la enzima de restricción de los insertos en el vector pCRScnpt que contiene a las secuencias de flanco 5' de los genes anteriores para las enzimas específicas de hígado, los insertos se colocaron corriente arriba del gen de luciferasa en el plásmido informante, pGL3 (Promega) del vector pCRScnpt Las células de ovario de hámster Chino (CHO-KI, ATCC # CCL-61 ), hepatoma humano (HepG2. ATCC #NB 8065) y del hepatoma humano (Hep3B ATCC # HB 8064) fueron transfectadas por electroporación con estas cuatro construcciones asi como también por medio del plásmido de control pGLC (PROMEGA Corp ) El pGLC contiene al gen de luciferasa bajo el control del promotor SV40 y fomentador SV40 La expresión de luciferasa por medio de las cuatro secuencias de promotor específico de hígado en las células transfectadas fueron comparadas con el plásmido de control pGLC y el vector pGL3. Los datos se resumen en la Figura 2 (el resultado HAL no se ilustra) Los tres tipos de células fueron transfectadas por medio de construcciones de ADN que tienen las características salientes indicadas. Las lineas enteras representan las células HepG2 de hepatoma humano; las líneas de puntos cruzadas representan las células de ovario de hámster Chino (CHO), las barras diagonales representan a las células de Hep3B de hepatoma humano pGLB es un plásmido de control negativo, pGLC es un plásmido de control positivo, HAT denota al promotor de a1-ant?tr?ps?na, HMB denota al promotor de reductasa de hidroxi-metil-glutapl CoA humano, AFP denota al promotor de o-fetoprotema De los cuatro promotores específicos de tejido, el promotor a1 -ant?tr?pstna humano (HAT) pareció ser el mejor candidato para la expresión específica de hígado bajo estas condiciones La expresión conducida por el promotor HAT puede además optimizarse construyendo un vector de expresión con una secuencia fomentadora específica de hígado como por ejemplo, el fomentador de a-fetoproteína humana (Watanabe, et al P de Quim Biol 262 (10) 4812 - 4818 (1987) Gepebank # 02593) el fomentador de albúmina humana (Hayashi et al P de Quim Biol 267(21 ) 14580-14585 (1992) Genebank # M92816), el fomentador de o-1 microglobu na/ bikunma (Rouet et al P de Quím Biol 267(29) 20765-20773 (1992) Genebank # X67082) o el fomentador de la hepatitis B (Valenzuela et al etica Viral Animal De B Biels et al páginas 57-70, Academic Press N Y, (1981 ) Galibert et al Naturaleza 281 646-650 (1979)) A pesar de que la invención anterior ha sido descnpta con algunos detalles a manera de ilustración y ejemplo para obtener una mayor claridad de entendimiento sera obvio que ciertos cambios y modificaciones pueden ser practicados dentro del alcance de las Reivindicaciones en forma de apéndice Todas las referencias citadas aquí se incorporan como referencia en su totalidad para todos los propósitos

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES Un vector recombinante para expresión de un polipéptido interferón alfa, el vector comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para un polipéptido interferón alfa unido de manera operable a un promotor funcional en una célula. El vector de la reivindicación 1 , en donde el vector es un vector viral. El vector de la reivindicación 1, en donde el vector es un plásmido. El vector de la reivindicación 2 o 3, en donde el vector viral proviene del género adenoviridiae. El vector de la reivindicación 4, en donde el promotor es un promotor especifico del tejido. El vector de la reivindicación 5, en donde el vector especifico del tejido es un promotor especifico de hígado. El vector de la reivindicación 6, en donde el polipéptido interferón alfa es interferón alfa 2b. Una formulación farmacéutica que contiene como ingrediente activo un vector como se menciona en una de las reivindicaciones 1 a 1 , asociado con uno o más portadores, diluyentes o excipientes farmacéuticamente aceptables para el mismo. 9. Un método para incrementar el nivel intracelular de un polipéptido interferón alfa en un tejido de interés, consistiendo el método en: poner en contacto el tejido con un vector que consiste en una secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido interferón alfa unido de manera operable a una secuencia de control de expresión funcional en el tejido de interés. 10. El método de la reivindicación 9, en donde el tejido comprende una célula de higado. 11. El método de la reivindicación 10, en donde la célula de higado es una célula cancerosa, y el vector consiste en un promotor especifico de higado. 12. El método de la reivindicación 11, en donde el vector es un vector adenoviral. 13. El método de la reivindicación 12, en donde polipéptido interferón alfa es interferón alfa 2b. 14. El vector, o una formulación farmacéuticamente aceptable del mismo, como se menciona en cualquiera de las reivincicaciones 1 a 7, para uso en el tratamiento a un mamífero que sufra de una enfermedad manejable para el tratamiento con un polipéptido interferón alfa. 15. El método de la reivindicación 14, en donde el vector es un vector adenoviral y el polipéptido interferón alfa es un interferón alfa 2b. Un método para el tratamiento a un mamífero que sufra de carcinoma hepatocelular, el método comprende la administración a un mamífero de una formulación farmacéuticamente aceptable de un vector adenoviral, recombinante, en donde el vector dirige la expresión intracelular de un interferón alfa 2b.