MXPA99003336A - Composicion liposomal fusogenica y metodo - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a una composición liposomal fusogénica para suministrar un compuesto atrapado en liposoma al citoplasma de una célula blanco. Los liposomas tienen un recubrimiento de superficie externa de cadenas poliméricas hidrofílicas químicamente liberables que cubren o protegen a los polímeros hidrofóbicos sobre la superficie externa liposomal. La liberación de las cadenas poliméricas hidrofílicas expone los polímeros hidrofóbicos a la interacción con las membranas de célula externa de las células blanco, para promover la fusión de liposoma con las células blanco. También se expone un método para utilizar la composición para suministrar un compuesto a las células blanco y un método para seleccionar los polímeros hidrofóbicos adecuados que se utilizarán en la composición.

Description

COMPOSICIÓN LIPOSOMAL FUSOGENICA Y MÉTODO CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con composiciones liposomales fusogénicas para suministrar un agente al compartimiento citoplásmico de una célula y con los métodos relacionados con las mismas.

Referencias Alien, T.M., et al., Biochemicia et Biophysica Acta 1237:99-108 (1995). Beauchamp, C.O., et al . , Annalyt. Biotech. - 131:25 (1983) . DeFrees, S.A., et al., J. Am. Chem. Soc., 118: 6101-6104 (1996). Heath, T.D., Biochem. et Biophys. Acta, 640:66 (1981) . Kirpotin, D., et al., FEBS Letters, 388 : 115- 118 (1996) . Lee, R.J., et al. , J. Bio'l . Chem., 269 (5) :3198-3204 (1994). Martin, F. J., Biochemistry, 20:4229 (1981). Martin, F. J., J. Biol Chem., 257:286 (1982). Martin, F.J., in SPECIALIZED DRUG DELIVERY SYSTEMS-MANUFACTURING AND PRODUCTION TECHNOLOGY, (P. Tyle, Ed.) Marcel Dekker, New York, pp . 267-316 (1990). Moore, J.S.; Stupp, S.I., Macromolecules , P1219/99 X 23: 65-70 (1985) . Rothberg, K.G., et al, J. Cell Biol., 110 (3) : 637-649 (1990) . Salhany J.M., et al., The Journal of Biological Chemistry, 268 (11) :7643-7645 (1993). Still, W.C., et al., J. Org. Chem., 43:2923-2925 (1978) . Szoka, -F., Jr . , et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9: 467 (1980) . Torchilin and Klibanov, "Phospholipid Handbook", Ed: Cevic, G., Marcel Dekker, NY 293-321 (1993) . Uster, P.S., et al., FEBS Letters , 386: 243: 246 (1996) . Veronese, F.M., et al., Appl. Biochem.

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ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El beneficio terapéutico de muchos compuestos es limitado debido a la baja absorción del compuesto por parte de las células blanco o debido a la descomposición intracelular del compuesto después de la absorción. En general, para el máximo beneficio terapéutico, se desea suministrar el compuesto al compartimiento citoplásmico de la célula, en donde se efectúa la traducción del mARN y la síntesis de proteína y en donde existe un enlace o vínculo directo P1219/99MX al núcleo. Para muchos compuestos pequeños y no cargados, la permeación a través de la membrana celular puede permitir una absorción relativamente eficiente por parte de la célula. Sin embargo, para una variedad de compuestos más grandes y/o cargados, tales como las proteínas, los ácidos nucleicos y los compuestos orgánicos cargados muy solubles en agua, la absorción pasiva por medio de la permeación a través de la membrana celular es más limitada. Se han propuesto varios métodos para mejorar la absorción de estos compuestos en las células. Por ejemplo, puede administrarse un fármaco en forma modificada o en forma de profármaco para el transporte en las células y sufrir entonces la conversión enzimática en una forma activa dentro de las células. Alternativamente, pueden utilizarse los procesos celulares de la fagocitosis o la endocitosis, en donde las partículas que contienen a los fármacos están rodeadas por las células. Sin embargo, este enfoque está limitado a cierfos tipos de células, por ejemplo, la fagocitosis está limitada a las células de linaje monocítico y a ciertas células mieloides diferentes, " tales como los neutrófilos, y la endocitosis está limitada a las células mesenquimales , tales como las células del endotelio vascular y los fibroblastos. Otra limitante de este enfoque es que en el transcurso normal del procesamiento intracelular, P1219/99MX las partículas se exponen a los compartimientos endosómico/lisosómico ácidos y a un hospedador de enzimas degradantes, que incluyen proteasas, lipasas y nucleasas, lo que resulta en la degradación del compuesto terapéutico, a menos que en el sistema se manipule genéticamente un escape de dicho procesamiento . Otro enfoque para mejorar la absorción del fármaco por parte de las células, incluye el uso de partículas fusogénicas diseñadas para fusionarse con la membrana superficial de una célula blanco, que libera el contenido de la partícula en el compartimiento citoplásmico de la célula. Con este fin, se han propuesto partículas virales inactivadas y reconstituidas , particularmente en la terapia génica, en donde en las células se introducen largas hebras de ácido nucleico. Las partículas de tipo viral compuestas de proteínas virales promotoras de la fusión embebidas en membranas de bicapa lípida artificial son otro ejemplo. Sin embargo, las cuestiones sobre seguridad y el gasto asociado al crecimiento, aislamiento y desactivación de los componentes virales limita estos enfoques.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN La invención incluye, en un aspecto, una composición liposomal para la fusión con una membrana P1219/99MX blanco de una célula, liposoma o lo similar. La composición incluye una suspensión de liposomas diseñada para dirigirse hacia la membrana blanco. Cada liposoma contiene un agente terapéutico atrapado en los liposomas, una superficie liposomal externa que tiene un recubrimiento de cadenas poliméricas hidrofílicas químicamente liberables y polímeros hidrofóbicos sobre la superficie externa liposomal. Los polímeros, protegidos inicialmente por el recubrimiento de polímero hidrofílico, se exponen entonces a la fusión con la membrana blanco cuando el recubrimiento de polímero hidrofílico se libera químicamente. El polímero hidrofílico y el polímero hidrofóbico forman de preferencia un copolímero dibloque, en el que los dos componentes poliméricos están unidos mediante un enlace químicamente liberable, tal como un enlace de disulfuro, un enlace sensible al pH, un enlace enzimáticamente escindible o un enlace fotoquímicamente escindible. En donde los liposomas están diseñados para tener un tiempo de circulación sanguínea prolongado, el recubrimiento polimérico hidrofílico de preferencia está compuesto de cadenas poliméricas de polietilenglicol, polivinilpirrolidona, polivinilmetiléter , polimetiloxazolina, polietiloxazolina, polihidroxipropiloxazolina, po1ihidroxipropilmetacrilamida, po1imetacrilamida, P1219/99MX polidimetilacrilamida, polihidroxipropilmetacriíato, polihidroxietilacrilato, hidroximetilcelulosa, hidroxietilcelulosa, polietilenglicol o poliaspartamida . Las cadenas poliméricas tienen un peso molecular preferido de entre aproximadamente 500-10,000 daltones. El polímero hidrofóbico de preferencia es una cadena de óxido de polipropileno, polietileno, polipropileno, policarbonato, poliestireno, polisulfona, óxido . de polifenileno o éter de politetrametileno . Las cadenas poliméricas tienen un peso molecular preferido de entre 500-3,000 daltones. Én forma más general, el polímero hidrofóbico de preferencia es un polímero lineal eficaz para provocar la hemolisis de eritrocitos, cuando se incuba con las células un copolímero tribloque soluble en agua que contiene cadenas de polímero hidrofóbico y de polímero hidrofílico unidas a los extremos opuestos de cadenas poliméricas hidrofóbicas, mediante enlaces de disulfuro, y el incubado se trata con un agente reductor . La composición adicionalmente puede incluir un ligando no protegido unido al recubrimiento de polímero hidrofílico, efectivo para la unión específica de ligando a una molécula receptora en una superficie celular blanco antes de la liberación química del recubrimiento de polímero hidrofílico. Como ejemplos, P1219/99MX el ligando no-protegido puede ser: (i) un folato, en donde la composición tiene la intención de tratar células tumorales que tienen receptores de folato en la superficie " celular, (ii) un piridoxilo, en donde la composición tiene la intención de tratar linfocitos CD4+ infectados con virus o (iii)' sialilo-Lewisx, en donde la composición tiene la intención de tratar una región inflamada. Alternativamente, o adícionalmente, la composición puede incluir, además, un ligando protegido unido al liposoma, efectivo para unirse a las moléculas del receptor superficial de la célula blanco, solamente después de la liberación química del recubrimiento polimérico hidrofílico. En una modalidad relacionada, los liposomas contienen un lípido catiónico protegido, efectivo para impartir una carga superficial liposomal positiva, para mejorar la unión de los liposomas a las células blanco, sólo después de la liberación química del recubrimiento polimérico hidrofílico. El agente que será suministrado puede ser un polinucleótido capaz de expresar una proteína seleccionada, cuando es absorbido por una célula blanco, un oligonucleótido o un análogo de oligonucleótido diseñado para unirse a un ácido nucleico de secuencia específica en las células blanco o cualquier otro polímero terapéutico o agente P1219/99MX t * terapéutico o diagnóstico de molécula pequeña. En otro aspecto, la invención incluye un método para suministrar un compuesto a las células blanco en un sujeto, mediante la administración parenteral de la anterior composición liposomal a un sujeto, entonces se ponen en contacto los liposomas en las células blanco con un agente de escisión efectivo para liberar las cadenas poliméricas hidrofílicas que forman el recubrimiento superficial, para exponer los polímeros hidrofóbicos en la superficie externa liposomal para la interacción con las membranas celulares externas de las células blanco y promover, de esta manera, la fusión de los liposomas con las células blanco . En una modalidad general, las cadenas poliméricas hidrofílicas están unidas en forma liberable al liposoma mediante un enlace químico reducible y el paso de la puesta en contacto, incluye administrar al sujeto un agente reductor, tal como una cisteína, glutatión o ascorbato. En otra modalidad general, las cadenas poliméricas hidrofílicas están unidas en forma liberable a los liposomas mediante un enlace químico sensible al pH y el paso de la puesta en contacto incluye dirigir los liposomas hacia un sitio, tal como un sitio de tumor sólido, que tiene un pH efectivo para liberar las cadenas. Para el direccionamiento hacia P1219/99MX los tumores, los liposomas tienen de preferencia tamaños de 0.03 a 0.40 µm para la extravasación hacia una región tumoral sólida. También se revela un método para el tamizado de un polímero hidrofóbico con la actividad fusogénica con una membrana blanco, es decir, de un polímero hidrofóbico adecuado para utilizarse en la composición de la invención. El método incluye adicionar a una suspensión de células blanco, un copolímero tribloque compuesto de un segmento del polímero hidrofóbico que se va a probar y que, unido en cada extremo del segmento polimérico por medio de un enlace químicamente liberable, tiene un segmento polimérico hidrofílico efectivo para solubilizar al segmento polimérico hidrofóbico en la suspensión. La suspensión se trata entonces para liberar los polímeros hidrofílicos y exponer los segmentos hidrofóbicos a las células blanco. La suspensión de células, por ejemplo, eritrocitos, se analiza entonces para determinar la lisis, por ejemplo, la hemolisis. Estos y otros objetos y particularidades de la invención se apreciarán en forma más completa cuando la siguiente descripción detallada de la invención se lea junto con los dibujos acompañantes.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 es una ilustración esquemática de P1219/99MX un liposoma preparado de conformidad con una modalidad de la invención; las Figuras 2A-2B son ilustraciones esquemáticas de conjugados de copolímero dibloque-lípido útiles en la presente invención; la Figura 3 es una ilustración esquemática de un lípido formador de vesículas con un ligando unido; la Figura 4 muestra un esquema de reacción para la preparación de un copolímero tribloque PEG-PPO-PEG; la Figura 5 es una gráfica que muestra la absorbancia a 480 nm de eritrocitos expuestas a: (a) el copolímero tribloque mPEG-PPO-mPEG con enlaces de disulfuro liberables y al agente reductor ditiotreitol (DTT) , (b) el copolímero tribloque mPEG-PPO-mPEG solo, y (c) DTT solo; las Figuras 6A-6C son fotomicrografías de las preparaciones (a), (b) y (c) de la Figura 5 observadas bajo una óptica de contraste de fase a un aumento de 630X, en donde la Figura 6A corresponde al copolímero tribloque mPEG-PPO-mPEG y a la preparación DTT del (a) , la Figura 6B corresponde a la preparación de copolímero tribloque mPEG-PPO-mPEG solo del (b) y la Figura 6C corresponde a la preparación del (c) de DTT solo; la Figura 7 ilustra varios enlaces -S-S- y su susceptibilidad relativa a la escisión por parte de un nucleófilo; P1219/99MX la Figura 8 ilustra un " esquema de reacción para la preparación de un conjugado de copolímero dibloque-lípido de metoxi PEG y PPO ligados covalentemente por medio de un enlace de disulfuro y unidos a un ancla de lípido diestearoilo; la Figura 9 ilustra un esquema de reacción para la preparación de un conjugado de copolímero dibloque-lípido de metoxipolietilenglicol (mPEG) y óxido de polipropileno (PPO) unidos covalentemente por medio de un enlace de disulfuro y unidos al lípido formador de vesículas de diestearilo fosfatidiletanolamina; las Figuras 10A-10B muestran otro esquema de reacción para la preparación de un polímero dibloque de mPEG y PPO unidos covalentemente por medio de un enlace de disulfuro y unidos a un lípido diacilo; la Figura 11 muestra un enlace de disulfuro lábil ej emplificativo que une a los segmentos poliméricos mPEG y PPO; las Figuras 12A-12B muestran esquemas de reacción para unir ácido fólico (Figura 12A) y piridoxal (Figura 12B) a polietilenglicol con un grupo funcional en el extremo, unido a diestearil fosfatidiletanolamina; la Figura 13 es una fotomicrografía que muestra la actividad fusogénica de los liposomas preparados de conformidad con la invención y que P1219/99MX contienen fluoresceina con células de eritrocito; y las Figuras 14A-14B son gráficos de unidades de luciferasa relativa (RLU) por mg de proteína en el pulmón (Figura 14A) y en el hígado (Figura 14B) después de la administración in vivo a ratones de los complejos liposoma/plásmido, en donde los liposomas tenían un recubrimiento superficial externo de polietilenglicol al incluir en el lipósoma 2.5 por ciento molar de PEG unido covalentemente a DSPE (PEG), 1 por ciento molar de PEG unido covalentemente a DSPE y 1 por ciento molar de PEG unido a DSPE mediante un enlace liberable (PEG+R-PEG) ó 2.5 por ciento molar de PEG unido a DSPE mediante un enlace liberable (R-PEG) .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN I . Composición Liposomal La presente invención incluye una composición liposomal fusogénica para la fusión con una membrana blanco. La membrana blanco, según se utiliza en la presente, se refiere a una membrana de bicapa lípida, por ejemplo, una membrana bicapa de una célula biológica, un liposoma o una membrana plana artificial. En una modalidad preferida, la composición liposomal fusogénica de la invención es para utilizarse en el suministro de un compuesto atrapado en liposoma al compartimiento citoplásmico de una célula biológica blanco .

P1219/99MX La composición incluye liposomas, normalmente en forma de suspensión, del tipo descrito a continuación con respecto a la Figura 1, que muestra un liposoma representativo 10. El liposoma está compuesto de lípidos formadores de vesículas, tales como los lípidos 12, cada uno de los cuales incluye grupos de cabeza, tales como los grupos 12a y, normalmente dos cadenas lípidas hidrofóbicas de diacilo, tal como se indica en 12b. A continuación se proporcionan lípidos formadores de liposoma ej emplificativos . El liposoma tiene un recubrimiento superficial externo 14 de cadenas poliméricas hidrofílicas, tales como las cadenas 16 y 18, las cuales de preferencia están densamente empacadas para formar un recubrimiento de tipo cepillo, efectivo para proteger a los componentes de la superficie liposomal, según se describe más adelante. De conformidad con una importante particularidad de la invención, las cadenas poliméricas hidrofílicas están conectadas a los lípidos del liposoma o a las cadenas hidrofóbicas conectadas a los lípidos del liposoma, mediante enlaces químicamente liberables - es decir, enlaces químicos covalentes que pueden ser liberados mediante un agente escindidor adecuado, tal como puede ser un agente reductor, un pH bajo o alto, una enzima hidrolítica o un estímulo fotolítico, según se describe adicionalmente más adelante .

P1219/99MX Según se muestra en la Figura 1 y, con detalle en la Figura 2A, la cadena polimérica hidrofílica 16 forma el extremo distante de un conjugado de copolímero dibloque-lípido 20 que tiene una parte 20a de lípido formador de vesículas y una parte 20b de copolímero dibloque. La parte 20b de copolímero dibloque consiste a su vez de una cadena hidrofóbica 22 que está unida covalentemente en su extremo proximal al grupo de cabeza polar de la parte lípida 20a. La cadena hidrofóbica 22 está unida en su extremo distante a la cadena polimérica hidrofílica 16 por medio de un enlace químicamente liberable 24. La cadena hidrofílica 18, por contraste, está unida directamente al grupo de cabeza polar del lípido 26 formador de vesículas por medio de un enlace 28 químicamente liberable. Según se indicó anteriormente, las cadenas poliméricas hidrofílicas, tales como el segmento 16 en él conjugado 20, están incluidas en el liposoma 10 como parte de la porción polimérica dibloque de los lípidos formadores de vesículas en la superficie externa de los liposomas. Se apreciará que el segmento polimérico hidrofílico en un conjugado dibloque funciona para mejorar la solubilidad en agua de la cadena hidrofóbica asociada, para evitar la desestabilización de la membrana liposomal mediante el reparto o distribución de las cadenas hidrofóbicas en la región bicapa P1219/99MX liposomal. Según se analizará más adelante, esta desestabilización es ventajosa para promover la fusión liposoma/membrana celular pero, es indeseable antes de que ocurra la fusión, es decir, durante el almacenamiento, administración y biodistribución del liposoma hacia el sitio blanco. Los tipos y pesos moleculares de los segmentos hidrofílicos e hidrofóbicos adecuados para lograr estos efectos se mencionan a continuación. Además de su papel en la "solubilización" de las cadenas hidrofóbicas y de protegerlas de las interacciones con otras membranas bicapa, las cadenas hidrofílicas también tienen de preferencia una densidad superficial suficiente para crear una barrera molecular efectiva para evitar en forma importante la interacción de las proteínas de suero con la superficie liposomal. De este modo, el recubrimiento de cadena hidrofílica es efectivo para prolongar el tiempo de circulación de los liposomas en el torrente sanguíneo durante períodos de varias horas hasta varios días. En la última modalidad, las cadenas hidrofílicas de preferencia están presentes en la capa lípida externa de los liposomas en una cantidad correspondiente a entre aproximadamente 1-20 por ciento molar de los lípidos superficiales del liposoma con polímeros de menor peso molecular, por ejemplo, 500 daltones, se encuentran presentes a una mayor densidad, por ejemplo, 20 por P1219/99MX ciento molar y cadenas poliméricas de mayor peso molecular, por ejemplo, cadenas de 10,000 daltones, están presentes a una menor densidad, por ejemplo, 1-5 por ciento molar. El porcentaje de cadenas hidrofóbicas, es decir, el porcentaje de conjugados dibloque-lípido en los liposomas, varía normalmente entre aproximadamente 5-100% de los lípidos superficiales totales que contienen a los polímeros hidrofílicos conjugados. De este modo, por ejemplo, en una formulación liposomal que contiene 5 por ciento molar de lípidos superficiales de liposoma de polímero hidrofílico y 50% de conjugados dibloque-lípido, el polímero hidrofóbico constituiría 50% x 5%, ó 2.5 por ciento molar de los lípidos superficiales. El liposoma 10 puede incluir adicionalmente ligando superficiales no protegidos, tales como el ligando 30, para dirigir los liposomas a una - membrana blanco específica - por ejemplo, a una región de tejido específica o tipo de célula o a un liposoma o membrana plana portadora de las moléculas receptoras superficiales apropiadas. Según se observa mejor en la Figura 2B, la molécula de ligando 30 es portada en el extremo distante de una cadena polimérica hidrofílica 32, tal como la cadena en un conjugado de copolímero dibloque-lípido 34 del tipo descrito en la Figura 1. Los medios para conjugar el ligando al extremo distante P1219/99MX de una cadena polimérica hidrofílica son bien conocidos. . La colocación del ligando en o cerca de los extremos distantes de las cadenas poliméricas, es decir, no protegido por el recubrimiento polimérico hidrofílico, permite que el ligando interactúe con una célula blanco que contiene un receptor superficial específico del ligando, antes de la remoción de las cadenas hidrofílicas de los liposomas. Adicionalmente a los componentes liposomales recién descritos, los liposomas pueden incluir, además, uno o más componentes de superficie liposomal, los cuales están protegidos de la interacción con células blanco hasta después de la remoción de los polímeros hidrofílicos. En una modalidad general y, con referencia a las Figuras 1 y 3, el componente protegido es un ligando, tal como el ligando 36, acoplado al grupo de cabeza polar 38 de un lípido 40 formador de vesículas. El propósito del ligando es unirse específicamente a un receptor celular después de la remoción del recubrimiento polimérico hidrofílico, para forzar al liposoma hacia una proximidad o cercanía con la membrana celular, para mejorar la interacción de las cadenas poliméricas hidrofóbicas sobre los liposomas con la bicapa lípida de la célula blanco. En forma alternativa o adicional, el componente de superficie protegido puede incluir lípidos formadores de vesículas con grupos polares P1219/99MX cargados en forma positiva, tal como se indica en 42 de la Figura 1. La carga superficial positiva en la superficie de los liposomas está protegida por el recubrimiento hidrofílico, durante la biodistribución del liposoma en el sitio blanco. Después de la remoción del recubrimiento hidrofílico, la interacción electrostática entre la carga superficial liposomal positiva y la célula blanco cargada en forma negativa actúa para empujar al liposoma hacia un contacto más íntimo con la célula, para promover la fusión mediata mediante las cadenas poliméricas hidrofóbicas. Finalmente, se prepara al liposoma para que contenga uno o más agentes terapéuticos o diagnósticos, los cuales serán suministrados al sitio de la célula blanco. Según se utiliza en la presente, agente terapéutico o de diagnóstico, compuesto o fármaco se utilizan intercambiablemente. El agente puede estar atrapado en el compartimiento acuoso interno del liposoma o en la bicapa lípida, dependiendo de la naturaleza del agente. Agentes terapéuticos ej emplificativos se describen a continuación.

A. Componente Lípido formador de vesículas La composición liposomal de la presente invención está compuesta principalmente de lípidos formadores de vesículas. Este lípido formador de vesículas es uno que (a) en agua puede transformarse o P1219/99MX convertirse espontáneamente en vesículas bicapa, según se ejemplifica mediante los fosfolípidos o (b) se incorpora en forma estable en bicapas lípidas, en donde su porción hidrofóbica está en contacto con la región interior hidrofóbica de la membrana bicapa y su porción de cabeza de grupo está orientada hacia la superficie polar exterior de la membrana. Los lípidos formadores de vesículas de este tipo de preferencia son aquellos que tienen dos cadenas de hidrocarburo, normalmente cadenas acilo y un grupo de cabeza, ya sea polar o no polar. Existe una variedad de lípidos sintéticos formadores de vesículas y de lípidos naturales formadores de vesículas, que incluyen a los fosfolípidos, tales como la fosfatidilcolina, la fosfatidiletanolamina, el ácido fosfatídico, el fosfatidilinositol y la esfingomielina, en donde las dos cadenas de hidrocarburo normalmente tienen una longitud de entre aproximadamente 14-22 átomos de carbono y tienen grados de insaturación variables. Los lípidos y fosfolípidos antes descritos cuyas cadenas de acilo tienen grados de saturación variables, pueden ser obtenidos en forma comercial o preparados de conformidad con los métodos publicados. Otros lípidos adecuados incluyen a los glicolípidos y a los esteróles tales como el colesterol. Los lípidos con cadena diacilo preferidos para utilizarse en la presente invención, incluyen P1219/99MX diacilglicerol, fosfatidiletanolamina (PE), diacilaminopropanodioles, tales como el diesteroilaminopropanodiol (DS) y el fosfatidilglicerol (PG) . Estos lípidos son los preferidos para utilizarlos como el lípido formador de vesículas, el principal componente liposomal y, para utilizarlos en los conjugados de polímero dibloque-lípido y lípidos directamente enlazados a las cadenas poliméricas hidrofílicas, que en forma conjunta están incluidos de preferencia en la capa externa liposomal a una proporción en mol de entre aproximadamente 1-20 por ciento molar. Adicionalmente, el lípido formador de vesículas se selecciona para obtener un grado de fluidez o de rigidez especificado, para controlar la estabilidad del liposoma en el suero y para' controlar la velocidad o tasa de liberación del agente atrapado en el liposoma. La rigidez del liposoma, según se determina mediante el lípido formador de vesículas, también puede desempeñar una función en la fusión del liposoma con una célula blanco, conforme será descrito. Los liposomas que tienen una bicapa lípida más rígida o una bicapa cristalina líquida, se obtienen mediante la incorporación de un lípido relativamente rígido, por ejemplo, un lípido que tiene una temperatura de transición de fase relativamente elevada, por ejemplo, hasta de 60°C. Los lípidos P1219/99MX rígidos, es decir, los saturados, contribuyen a una mayor rigidez de membrana en la bicapa lípida. Se sabe que otros componentes lípidos, tales como el colesterol, contribuyen también a la rigidez de la membrana en las estructuras de bicapa lípida. Por otra parte, la fluidez del lípido se obtiene mediante la incorporación de un lípido relativamente fluido, normalmente uno que tiene una fase lípida con una temperatura de transición de fase cristalina de líquido a líquido, relativamente baja, por ejemplo, a temperatura ambiente o por debajo de ésta . En una modalidad de la invención, los liposomas se preparan con un lípido relativamente rígido para impartirle rigidez a la bicapa lípida. En esta modalidad, los lípidos que forman los liposomas tienen una temperatura de transición de fase de entre aproximadamente 37-70 °C. En una modalidad preferida, el lípido formador de vesículas es diestearilfosfatidilcolina (DSPC), que tiene una temperatura de transición de fase de 62°C. En otra modalidad de la invención, los lípidos que forman a la vesícula bicapa, es decir, el liposoma, son efectivos para impartir una carga superficial de liposoma positiva. Estos lípidos incluyen a aquellos normalmente referidos como lípidos catiónicos, los cuales tienen una porción lipofílica, tal como un P1219/99MX esterol, una cadena acilo o diacilo y, en donde el lípido tiene una carga positiva neta total. Preferentemente, el grupo de cabeza del lípido porta la carga positiva. Los lípidos catiónicos ej emplificativos incluyen 1, 2-dioleiloxi-3-(trimetilamino) propano (DOTAP); bromuro de N-[l-(2,3,-ditetradeciloxi) propil] -N, N-dimetil-N-hidroxietilamonio (DMRIE) ; bromuro de N- [ 1- (2 , 3-dioleiloxi) propil ] -N, N-dimetil-N-hidroxietilamonio (DORIE); cloruro de N-[l-(2, 3-dioleiloxi)propil] -N, , -trimetilamonio (DOTMA); 3ß [N- ( ' , ' -dimetilaminoetano) carbamoil] colesterol (DC-Chol) ; y dimetildioctadecilamonio (DDAB) . El lípido catiónico formador de vesículas también puede ser un lípido neutro, tal como el dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE) o un lípido amfipático, tal como un fosfolípido, derivado con un lípido catiónico, tal como la polilisina u otros lípidos poliamina. Por ejemplo, el lípido neutro (DOPE) puede ser derivado con polilisina para formar un lípido catiónico.

B. Recubrimiento de Polímero Liberable Según se describió anteriormente, el recubrimiento polimérico hidrofílico se forma al incluir, al menos en la capa lípida externa de los liposomas, conjugados lípidos formadores de vesículas que contienen un conjugado copolimérico dibloque del P1219/99MX tipo mostrado en la Figura 2A y, opcionalmente, polímeros hidrofílicos enlazados directamente al grupo de cabeza del lípido formador de vesículas, según se muestra en la Figura 3. Los polímeros hidrofílicos adecuados para utilizarse en los conjugados, en donde se pretende que los polímeros también prolonguen el tiempo en circulación del liposoma, incluyen polivinilpirrolidona, polivinilmetiléter, polimetiloxazolina, polietiloxazolina, polihidroxipropiloxazolina, polihidroxipropilmetacrilamida, polimetacrilamida, polidimetilacrilamida, polihidroxipropilmetacriíato, polihidroxietilacrilato, hidroximetilcelulosa, hidroxietilcelulosa, polietilenglicol y poliaspartamida . En una modalidad preferida, el polímero hidrofílico es polietilenglicol, de preferencia, como una cadena PEG que tiene un peso molecular entre 500-10,000 daltones, normalmente entre 1,000-5,000 daltones . El recubrimiento superficial sobre el liposoma proporcionado por las cadenas poliméricas hidrofílicas proporciona estabilidad coloidal y, a una densidad superficial polimérica suficiente, sirve para proteger a los liposomas de la absorción por parte del sistema retículo-endotelial, que proporciona una vida P1219/99MX prolongada de circulación en la sangre a los liposomas para que lleguen a las células blanco. La magnitud del aumento en el tiempo de circulación sanguínea de preferencia es de varias veces el que se alcanzó en ausencia del recubrimiento polimérico, según se describe en la Patente de los Estados Unidos No. 5,013,556 de titularidad mancomunada. Los métodos para preparar conjugados dibloque y de polímero hidrofílico directamente enlazado al lípido se analizan más adelante .

C . Polímero Hidrofóbico Según se describió anteriormente, los liposomas fusogénicos incluyen un polímero hidrofóbico para promover- la fusión entre el liposoma y la membrana celular blanco. El polímero hidrofóbico está incluido en los liposomas como parte del conjugado de copolímero dibloque-lípido y está directamente unido al grupo de cabeza de un lípido formador de vesículas, tal como un lípido con cadena diacilo, según será descrito más adelante con respecto a las Figuras 8-10 (Ejemplos 2-4) . Los polímeros hidrofóbicos ej emplificativos adecuados para utilizarse en el bloque copolimérico del conjugado de copolímero dibloque-lípido incluyen óxido de polipropileno, polietileno, polipropileno, policarbonato, poliestireno, polisulfona, óxido de P1219/99MX polifenileno y politetrametilenéter . De preferencia, el polímero hidrofóbico tiene un peso molecular de entre 100-5,000 daltones, más de preferencia de entre 500-3,000 daltones. En una modalidad preferida, el polímero hidrofóbico es óxido de polipropileno (PPO) que tiene un peso molecular de entre 500-3,000 daltones. Un método para determinar polímeros hidrofóbicos y pesos moleculares adecuados para utilizarse en los liposomas fusogénicos descritos en la presente se incluye en otro aspecto de la invención. En este método, la actividad fusogénica de un polímero hidrofóbico seleccionado con una membrana blanco se determina al unir un segmento de polímero hidrofílico a al menos un extremo y, de preferencia, a cada extremo del polímero hidrofóbico. Los segmentos de polímero hidrofílico se unen a los extremos del segmento hidrofóbico mediante un enlace liberable, según se describe más adelante. El copolímero tribloque se añade a una suspensión de células blanco, por ejemplo, una suspensión de eritrocitos. Los segmentos poliméricos hidrofílicos se liberan del segmento hidrofóbico mediante escisión del enlace liberable, exponiendo los segmentos hidrofóbicos a la membrana externa de las células blanco. Las células blanco se analizan entonces para determinar la lisis, por ejemplo, la hemolisis de las eritrocitos.

P1219/99MX El Ejemplo 1 describe la preparación de un copolímero tribloque para determinar la actividad fusogénica de un polímero hidrofóbico. Según se describe en el Ejemplo 1 y se muestra en la Figura 4, se preparó un copolímero tribloque compuesto de PPO y PEG al formar primero un compuesto intermedio mPEG-DTP-OSu (compuesto III) al hacer reaccionar metoxipoli (etilenglicol) amina (compuesto I) con un exceso de ditiobis ( succinimidil propionato) (DTSP, compuesto II) disuelto en dimetilformamida (DMF) . La PPO-diamina (compuesto IV) se hizo reaccionar con un ligero exceso de mPEG-DTP-OSu (compuesto III) para formar un producto de PPO di-PEGilado (compuesto V), por ejemplo, mPEG-PPO-mPEG, en donde los bloques poliméricos están unidos por enlaces disulfuro escindibles . Se probó la actividad promotora de la fusión de este copolímero tribloque, según se describe en el Ejemplo 1C, al solubilizar el copolímero tribloque en solución salina y al añadirlo a una suspensión de eritrocitos. En una parte de las preparaciones, se añadió ditiotreitol (DTT) para reducir los enlaces de disulfuro, liberando a los segmentos de polímero hidrofílico y para exponer el polímero hidrofóbico a las eritrocitos. Como controles o muestras de control, no se añadió DTT a algunas de las preparaciones y en otra preparación no se añadió el copolímero tribloque a P1219/99MX las células, sin embargo, las células se expusieron al DTT. Todas las muestras se incubaron y se determinó la actividad hemolítica del PPO al analizar la absorbancia del sobrenadante a 480 nm y al examinar las células al microscopio en una óptica de contraste de fase. Los valores de absorbancia a 480 nm para las preparaciones que contienen un copolímero tribloque de 0.78 mg/mL y para la preparación de control, se midieron y se muestran en la Figura 5, en donde la barra (a) muestra la absorbancia de las muestras que contienen al copolímero tribloque más DTT, la" barra (b) muestra la absorbancia de las muestras que contienen al copolímero tribloque solo y la barra (c) muestra la absorbancia de la preparación de control (células más DTT) . Las fotomicrografías de las tres preparaciones se muestran en las Figuras 6A-6C, en donde la Figura 6A corresponde a la barra (a) de la Figura 5 y las Figuras 6B y 6C corresponden a las barras (b) y (c) . Los datos de absorbancia y las fotomicrografías indican que la lisis celular es evidente solamente en la preparación que contiene al copolímero tribloque expuesto al DTT, en donde se Usaron más del 80% de las células, según lo evidencian los cuerpos negros, transparentes en la fotomicrografía (las células intactas se ven como cuerpos brillantes en las fotomicrografías, ver al control de la Figura 6C) . La Figura 6B corresponde a la preparación que contiene P1219/99 X las eritrocitos incubados con el copolímero tribloque solo sin DTT y no muestra evidencia de lisis celular. La Figura 6C, la preparación de eritrocitos en presencia de DTT solo, no muestra lisis celular, según lo evidencia ninguna absorbancia efectiva y visualmente, mediante las células intactas. Estos resultados indican que la adición de DTT al copolímero tribloque escindió los enlaces disulfuro entre el PEG y el PPO, liberando PPO libre. El PPO libre atacó a las membranas de glóbulos rojos cercanas, conduciéndolos a la hemolisis. El DTT solo no tuvo efecto sobre las células y no indujo la lisis celular. Estos resultados indican, además, que el PP020oo es efectivo como un polímero hidrofóbico para promover la fusión entre los liposomas y una célula y, que es adecuado para utilizarse en el conjugado de copolímero dibloque-lípido de la presente invención. Se apreciará que las células blanco pueden ser células biológicas, tales como eritrocitos, liposomas o membranas artificiales planas. Los liposomas pueden tener un fluoróforo encapsulado u otro material adecuado para el análisis que sigue a la lisis del liposoma . El enlace liberable en el método de tamizaje puede ser un enlace químicamente liberable, un enlace sensible al pH, un enlace sensible a la luz o un enlace sensible al calor. El enlace se escinde mediante la P1219/99MX exposición al estímulo apropiado, tal como puede ser un agente químico reductor, calor, un cambio en el pH o en la luz . Se apreciará que cualquier polímero hidrofóbico, tal como los antes listados, pueden unirse en forma liberable a un polímero hidrofílico mediante la adecuada química de grupo de extremo. En las modalidades preferidas, el polímero hidrofóbico es un segmento polimérico lineal del óxido de polipropileno y el polímero hidrofílico es polietilenglicol que tiene un peso molecular de entre 1,000-5,000 daltones. La actividad de los polímeros hidrofóbicos y el efecto del peso molecular son tamizados fácilmente mediante este método. Los polímeros hidrofóbicos que tienen una elevada actividad hemolítica promueven la fusión y son adecuados para utilizarse en la conjugación del copolímero dibloque-lípido de la invención .

D. Enlace Químico Liberable Según se describió anteriormente, los liposomas de la presente invención incluyen un recubrimiento superficial externo de cadenas poliméricas hidrofílicas liberables. Es decir, las cadenas poliméricas hidrofílicas están unidas en forma liberable al liposoma mediante un enlace químico escindible .

P1219/99MX Estos enlaces químicos incluyen aquellos que pueden escindirse en condiciones fisiológicas selectivas, tal como en presencia de enzimas o agentes reductores. Por ejemplo, los enlaces éster o péptido se escinden mediante enzimas hidrolíticas, tales como esterasas o peptidasas y los enlaces de disulfuro se escinden mediante agentes reductores, tales como glutatión, cisteína o ascorbato, presentes normalmente en el plasma e intracelularmente o, estos mismos agentes introducidos en el plasma, por ejemplo, mediante inyección. Otros enlaces liberables incluyen enlaces sensibles al pH y enlaces que se escinden con la exposición a la luz o al calor. En una modalidad preferida, las cadenas poliméricas hidrofílicas están unidas al liposoma mediante un enlace sensible al pH y los liposomas se dirigen a un sitio que tiene un pH efectivo para escindir al enlace y liberar las cadenas hidrofílicas, tal como puede ser una región tumoral. En otra modalidad preferida, el enlace escindible es un enlace de disulfuro, que en la presente en forma general se pretenden referir como enlaces que contienen azufre, tales como los que se muestran en la Figura 7. Los enlaces que contienen azufre se sintetizan para alcanzar el grado de labilidad seleccionado, según se indica en la figura e incluye un enlace de disulfuro, un enlace mezclado P1219/99MX sulfuro-sulfona y un enlace sulfuro-sulfóxido . De los tres enlaces, el enlace de disulfuro es menos susceptible a la tiólisis y el enlace de sulfuro-sulfona (enlace tiosulfonato) es el más susceptible. Estos enlaces son útiles para adaptar la tasa o velocidad de liberación del segmento polimérico hidrofílico de la superficie liposómica. Por ejemplo, un enlace de disulfuro muy lábil es el preferido para dirigir liposomas a células sanguíneas o a células endoteliales, ya que estas células son muy fácilmente accesibles y se necesita una vida más corta en la circulación sanguínea del liposoma. En el otro extremo, se prefiere un enlace de disulfuro de mayor duración cuando el blanco liposomal es tejido tumoral, sitios inflamados o infectados, piel u otros órganos y tejidos linfáticos periféricos. En estos casos, generalmente es necesaria una vida más larga en la circulación sanguínea del liposoma para que los liposomas alcancen el blanco deseado. El enlace escindible que une las cadenas poliméricas hidrofílicas al liposoma se escinde in vivo, normalmente como resultado de un cambio en el entorno, tal como por ejemplo, cuando los liposomas alcanzan un sitio específico el cual tiene un pH ligeramente menor, tal como puede ser _ una región de tejido tumoral o un sitio con condiciones reductoras, tal como un tumor hipóxico. Las condiciones reductoras P1219/99MX in vivo también pueden efectuarse mediante la administración de un agente reductor, tal como ascorbato, cisteína o glutatión. El enlace escindible también puede romperse en respuesta a un estímulo externo, tal como la luz o el calor. En los estudios efectuados para soportar la presente invención, descritos más adelante, se prepararon liposomas que tienen un recubrimiento superficial liberable de polietilenglicol, en donde las cadenas de polietilenglicol se unieron al liposoma mediante un enlace lábil de disulfuro. Los liposomas se administraron a ratones junto con un agente reductor para efectuar la liberación de las cadenas poliméricas. El análisis tisular del pulmón e hígado de los ratones, indica que el recubrimiento polimérico hidrofílico fue liberado para lograr la retención de los liposomas en estos órganos.

E . Moléculas de Ligando Según se indicó anteriormente, los liposomas de la invención pueden incluir un ligando no protegido '(de superficie expuesta) efectivo para unirse a receptores específicos en la superficie celular en la membrana celular blanco. Las moléculas ligando se transportan en las cadenas poliméricas hidrofílicas que están ancladas al liposoma mediante unión covalente a un lípido diacilo. Las cadenas poliméricas P1219/99MX hidrofílicas pueden estar covalentemente unidas a un lípido unido al liposoma por medio de un enlace convencional, por ejemplo, irreversiblemente unido o, por medio de un enlace químicamente liberable, tal como los antes descritos. Los ejemplos de ligandos adecuados para utilizarlos para dirigir los liposomas de la presente invención a los tipos de células específicos, se listan en el Cuadro 1.

CUADRO 1 Pares Ligando-Receptor y Célula Blanco Asociada P1219/99MX P1219/99 X Anticuerpos del receptores de eritrocitos , receptor de superficie superficie plaquetas anticelular (o celular fragmentos de los mismos ) Anticuerpos del receptores de células de la médula receptor de superficie superficie ósea anticelular (o celular, fragmentos de los tales como mismos) CD-34 En una modalidad de la invención, un ligando folato está unido al extremo distante de un lípido formador de vesículas derivado de PEG, por ejemplo, DSPE. El ligando folato es efectivo para unirse a los receptores de folato en células epiteliales para la administración de^ un agente terapéutico atrapado a la célula blanco, por ejemplo, la administración de un agente neoplástico para el tratamiento de carcinomas epiteliales . En otra modalidad, sialilo-Lewisx está unido a PEG-DSPE e incluido en la composición liposomal para dirigir los liposo as a los sitios de inflamación, más específicamente, a células que expresan ELAM-1. Se ha descrito la preparación del conjugado sialilo-Lewisx-PEG-DSPE (DeFrees, 1996) . En otra modalidad de la invención, un ligando piridoxilo, que incluye piridoxal, piridoxina, P1219/99MX piridoxamina, piridoxal '5 '-fosfato y N-(4'-piridoxil) aminas , está unido a un conjugado PEG-DSPE para dirigir los liposomas a los receptores CD4. Los esquemas de reacción sintética para preparar estos conjugados de ligando se describen más adelante. En otra modalidad, la membrana blanco es un liposoma y pueden incorporarse varios receptores en el liposoma blanco para la fusión con los liposomas de la invención presente.

II . Preparación del Liposoma A. Preparación del Recubrimiento Polimérico Liberable . Según se describió anteriormente, los liposomas en la composición de la presente invención incluyen un recubrimiento químicamente liberable de cadenas poliméricas hidrofílicas, en donde las cadenas poliméricas que constituyen al recubrimiento están unidas mediante un enlace liberable en un conjugado de copolímero dibloque y, opcionalmente, mediante un enlace liberable formado en el extremo polar de un lípido formador de vesículas. En los estudios efectuados para soportar la invención, se prepararon conjugados de copolímero dibloque-lípido, en donde el polímero dibloque estaba constituido por óxido de polipropileno (PPO) y P1219/99MX metoxi (polietilenglicol) (mPEG) , enlazados por un enlace de disulfuro alifático y unido a través del bloque PPO al diestearoilo o al diestearilo fosfatidiletanolamina (DSPE) . La preparación de estos conjugados se describe respectivamente en los Ejemplos 2 y 3. Como se expone en el Ejemplo 2 y se ilustra en la Figura 8, el diclorhidrato de cistamina (Compuesto VII) disuelto en tetraborato de potasio tetrahidratado, se mezcló con a- (imidazol-1-il) carbonil-w-metoxi-poli (óxido de etileno) (Compuesto VI, preparado según se describe en Beauchamp, et a l . , 1983) y la solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante cuatro horas. En este momento, se ajustó en 1 el pH de la solución con HCl 6N y se añadió a continuación cloruro de sodio hasta el límite de saturación. La solución acuosa se extrajo con cloroformo, el extracto orgánico se combinó, secó sobre sulfato de magnesio y se filtró. El solvente se evaporó in va cuo y el gel incoloro resultante se disolvió en acetato de etilo.

La lenta adición de dietiléter produjo un precipitado blanco, clorhidrato de a- [2-aminoetilditio-N-etilcarbamoil-w-metoxi-poli (óxido de etileno) (Compuesto VIII) . Continuando con la referencia a la Figura 8, se preparó el a, w-bis ( 4-nitrofenoil carbonato) -poli (óxido de propileno) (Compuesto IX), según se P1219/99MX describe en el Ejemplo 2C y se hizo reaccionar con el Compuesto VIII en presencia de TEA, según se describe en el Ejemplo 2D. Después de 60 minutos de reacción, el análisis TLC indicó el total consumo del Compuesto VIII y, por lo tanto, la formación de mPEG-S-S-PPO-nitrofenilcarbonato (Compuesto X) como producto principal y mPEG-S-S-PPO-S-S-mPEG como un producto menor. La mezcla se trató con aminopropanodiol . Después de un tiempo de reacción adicional en nitrógeno, el solvente se evaporó y el residuo amarillo se sometió a cromatografía en columna para eluir al mPEG-S-S-PPO-aminopropano diol (Compuesto XI) . Una solución del compuesto XI se hizo reaccionar con ácido esteárico y 4- (dimetilamino) piridinio tosilato en diclorometano en presencia de 1, 3-diciclohexicarbodiimida (DCC) . Después de la reacción, de la filtración y de la cromatografía en columna, se obtuvo un sólido blanco floculento, identificado como -mPEG-S-S-PPO-DS (Compuesto XII) . Este conjugado es adecuado para utilizarse en la preparación de liposomas, según se describe más adelante, de conformidad con la invención. El Ejemplo 3 describe la preparación de un conjugado de copolímero dibloque-lípido similar, con la excepción de que el lípido era un lípido formador de vesículas, diestearilfosfatidiletanolamina (DSPE) . Según se ilustra en la Figura 9, el DSPE (Compuesto P1219/99 X XIII) se hizo reaccionar con bis-nitrofenilcarbonato poli-óxido de propileno (Compuesto IX, preparado según se describe en el Ejemplo 2C) en CHC13. A la mezcla de reacción se añadió imida de ácido N-hidroxi-s-norbornene-2 , 3-dicarboxílico (HONB) y trietilamina (TEA) y después de la reacción y tratamiento adicionales (detallado en el Ejemplo 3A) , se obtuvo el Compuesto XIV (DSPE-PPO-p-nitrofenilcarbamato) . El Compuesto VIII (preparado según se describe en el Ejemplo 2B) se hizo_ reaccionar con el Compuesto XIV en CHC13 para formar al conjugado mPEG-S-S-PPO-DSPE deseado, compuesto XV (Ejemplo 3B) . Otro esquema de reacción para la preparación de un conjugado mPEG-S-S-PPO-DSPE, se describe en el Ejemplo 4 y se ilustra en las Figuras 10A-10B. Aquí, el diestearil fosfatidilglicerol (DSPG, compuesto XVI) se oxida con periodato de sodio (NaI04) y, se amina en forma reductiva con poli-óxido de polipropilendiamina (compuesto XVIII) para formar amino-PPO-DSPE (compuesto XIX). El mPEG-DTP-OSu (compuesto III), preparado según se describe en el Ejemplo ÍA, está acoplado al amino-PPO-DSPE. (compuesto XIX) para formar un conjugado de copolímero dibloque-lípido, PEG-DTP-amido-PPO-DSPE (compuesto XX) . El compuesto XX tiene un polímero de bloque terminal hidrofílic.o de PEG y un enlace de disulfuro escindible interno con un bloque de polióxido de propileno hidrofóbico unido a un lípido terminal, P1219/99MX DSPE. En los ejemplos proporcionados anteriormente (Ejemplos 2-4), el enlace escindible es un enlace de disulfuro; sin embargo, son adecuados otros enlaces, tales como el péptido o éster, los cuales pueden escindirse bajo condiciones fisiológicas selectivas, tales como eñ presencia de enzimas de peptidasa o de esterasa. Según se analizó anteriormente, los "enlaces de disulfuro pueden sintetizarse para que varíen en la susceptibilidad a la reducción, con motivo de adaptar la velocidad de liberación del recubrimiento polimérico hidrofílico. Un esquema de reacción para la síntesis de una molécula tensoactiva de lípido polimérico en donde los segmentos del polímero dibloque (PEG y PPO) están unidos por un enlace de disulfurb que tiene un aumento en la labilidad, se muestra en la Figura 11.

El mPEG-SH (compuesto XXI) y el Reactivo de Ellman (compuesto XXII) se hicieron reaccionar, según se describe en el Ejemplo 5, para formar disulfuro de mPEG-3-carboxi-4-nitrofenol (compuesto XXIII) . Este compuesto se hizo reaccionar con amino-PPO-DSPE (compuesto XIX), preparado según se describe en el Ejemplo 4A, y con diciclohexilcarbodiimida (compuesto XXIV) . El conjugado de copolímero dibloque-lípido (compuesto XXV) tiene un segmento mPEG terminal enlazado a un segmento PPO mediante un enlace P1219/99MX escindible que contiene azufre, el cual tiene un aumento en la susceptibilidad a la tiólisis. Este conjugado (Compuesto XXV) se utilizó para la preparación y los ensayos in vivo de liposomas, según se describe en el Ejemplo 9.

B. Unión de un Ligando al Polímero Hidrofilico Como se describió anteriormente, en una modalidad de la invención, los liposomas en la composición fusogénica incluyen un ligando para dirigir los liposomas a un tipo de célula seleccionado o a otro liposoma que contiene al receptor apropiado. El ligando está unido al liposoma mediante unión covalente con el extremo distante libre de una cadena de polímero hidrofílico anclado con lípido. En una modalidad de la invención, la cadena de polímero hidrofílico es PEG y se han descrito varios métodos para la unión de ligandos a los extremos distantes de cadenas PEG (Alien, Zalipsky (1993), Zalipsky (1994), Zalipsky (1995a), Zalipsky (1995b)). En estos métodos, el grupo metoxi terminal inerte del mPEG es reemplazado con un reactivo de funcionalidad adecuada para las reacciones de conjugación, tal como un grupo amino o hidrazida. El PEG de extremo funcionalizado se une a un lípido, normalmente DSPE. Los derivados PEG funcionalizado-DSPE se utilizan en la formación de liposomas y el ligando deseado está unido P1219/99MX al extremo reactivo de la cadena PEG antes o después de la formación de liposoma. El Cuadro 1 (mencionado anteriormente) lista los ligandos ej emplificativos para utilizarse en la composición liposómica. A manera de ejemplo, los esquemas de jreacción para la unión de ácido fólico y piridoxil con el extremo distante del DSPE derivado de PEG se muestran en las Figuras 12A-12B, respectivamente . El ácido fólico (compuesto XXVI) es una vitamina hematopoiética con un peso molecular de 441 daltones . El ácido fólico se une al receptor de folato, también conocido como proteína de unión con el folato de la membrana, que es una proteína de membrana que tiene algunas particularidades de un receptor involucrado en una endocitosis mediada por receptor. El receptor está expresado al máximo en la superficie de las células de cultivo de tejido agotadas de folato y es responsable de la acumulación de alta afinidad del ácido 5-metiltetrahidrofólico en el citoplasma de - estas células (Rothberg) . También se ha reportado que los receptores de alta afinidad de ácido fólico están muy enriquecidos en ciertas células cancerosas (Lee) . Un ligando de ácido fólico incorporado en un liposoma mediante la unión con el extremo distante de cadenas poliméricas hidrofílicas ancladas con lípido, dirigirían los liposomas a estas células cancerosas.

P1219/99MX La unión del ácido fólico al conjugado DSPE-PEG se describe en el Ejemplo 6 y se ilustra en la Figura 12A. El ácido fólico se mezcla con amino-PEG-DSPE (compuesto XXVII, preparado según lo describe Zalipsky (1994)) y se hizo reaccionar en presencia de imida de ácido N-hidroxi-s-norbornene-2 , 3-dicarboxílico (HONB) y diciclohexil-carbodiimida (DCC) para formar un conjugado de ácido fólico-PEG-DSPE (compuesto XXVIII) . Este conjugado se incluye en la mezcla lípida durante la preparación del liposoma para formar liposomas que incluyen un ligando que se dirige al ácido fólico. La Figura 12B ilustra la unión de piridoxal a PEG activado con hidrazida-DSPE . El piridoxal y los análogos' relacionados han sido estudiados para utilizarse en el transporte facilitado de compuestos biológicamente activos (Zhang) y para utilizarse en la terapia del SIDA (Salhany) . En la terapia del SIDA, el piridoxal 5 '-fosfato se une a la proteína CD4, el receptor del HIV-1 en las células T-auxiliares . El piridoxal 5 '-fosfato se une fuertemente a la proteína CD4 soluble con una estequiometría de aproximadamente 1 mol de piridoxal 5 ' -fosfato/mol de proteína. Esta afinidad y dirigido a la proteína CD4 es útil para dirigir liposomas hacia las células T para la terapia del SIDA. La unión del piridoxal (compuesto XXIX) al PEG activado con hidrazida-DSPE (compuesto XXX) se describe en el Ejemplo 7 y se muestra en la Figura 12B.

P1219/99MX Como otro ejemplo, el ligando sialilo-Lewisx está unido al PEG-DSPE e incluido en la composición liposomal fusogénica. La inflamación provoca la expresión de un polipéptido, molécula-1 de adhesión de leucocito endotelial (ELAM-1 o E-selectina) en la superficie de células endoteliales de vasos sanguíneos, adyacentes a los sitios de inflamación. La ELAM-1, reconoce a su vez y se une a la porción de polisacárido del sialilo-Lewisx en las superficies de neutrófilos y recluta neutrófilos hacia los lugares de inflamación. Puede utilizarse al sialilo-Lewisx para dirigir liposomas a células que expresan ELAM-1 para el suministro de un agente terapéutico. Se ha descrito la preparación de un sialilo-Lewisx-PEG-DSPE derivado (DeFrees) . Según se describió anteriormente con respecto a la Figura 1 y a la Figura 3, los liposomas contienen opcionalmente un ligando unido a la superficie del lípido mediante la unión a los componentes de lípido superficial. Este ligando está inicialmente protegido de la interacción con células blanco por el recubrimiento superficial hidrofílico hasta después de la remoción de los polímeros hidrofílicos. En general, este ligando está acoplado al grupo de cabeza polar de un lípido formador de vesículas y se han descrito varios métodos para la unión de ligandos a los lípidos. En un método preferido, la porción de afinidad P1219/99 X se acopla al lípido, mediante una reacción de acoplamiento descrita más adelante, para formar uh conjugado de porción de afinidad-lípido . Este conjugado se "añade a una solución de lípidos para la formación de liposomas, según se describirá. En otro método, un lípido formador de vesículas activado para la unión covalente con una porción de afinidad se incorpora en los liposomas. Los liposomas formados se exponen a la porción de afinidad para lograr la unión de la porción de afinidad con los lípidos activados. Se tienen disponibles una variedad de métodos para preparar un conjugado compuesto de una porción de afinidad y de un lípido formador de vesículas. Por ejemplo, las porciones de afinidad solubles en agua que contienen amina pueden unirse covalentemente a los lípidos, tales como fosfatidiletanolamina, al hacer reaccionar la porción que contiene amina con un lípido que se ha derivado para que contenga un éster de N-hidroxisuccinimida activado. Como otro ejemplo, las biomoléculas , y en particular las biomoléculas grandes tales como las proteínas, pueden acoplarse a los lípidos de conformidad con los métodos reportados. Un método incluye la formación de base Schiff entre un grupo aldehido en un lípido, normalmente un fosfolípido y un aminoácido primario en la porción de afinidad. El grupo aldehido se forma de preferencia mediante P1219/99 X oxidación del lípido con peryodato. La reacción de acoplamiento, después de la remoción del oxidante, se efectúa en presencia de un agente reductor, tal como el ditiotreitol, según se describe en Heath, (1981) . Los típicos precursores de aldehído-lípido adecuados en el método incluyen lactosilceramida, trihexosilceramina, galacto cerebrosido, fosfatidilglicerol, fosfatidilinositol y gangliósidos . Un segundo método de acoplamiento general es aplicable a las porciones de afinidad que contienen tiol e incluye la formación de un enlace de disulfuro o de tioéter entre un lípido y la porción de afinidad. En la reacción' de disulfuro, una amina lípida, tal como fosfatidil-etanolamina, se modifica para contener un piridildito derivado que puede reaccionar con un grupo tiol expuesto en la porción de afinidad. Las condiciones de reacción para este método pueden encontrarse en Martin (1981). El método de acoplamiento por tioéter, descrito por Martin (1982), se realiza al formar un fosfolípido reactivo con sulfhidrilo, tal como N- ( 4 ) P-maleimido-fenil (butiril) fosfatidiletanolamina y hacer reaccionar al lípido con la porción de afinidad que contiene tiol. Otro método para hacer reaccionar la porción de afinidad con un lípido incluye el hacer reaccionar a la porción de afinidad con un lípido que se ha derivado para que contenga un éster de N-hidroxisuccinimida P1219/99MX activado. La reacción se efectúa normalmente en presencia de un detergente moderado, tal como desoxicolato . Al igual que las reacciones antes descritas, esta reacción de acoplamiento se efectúa de preferencia antes de incorporar el lípido al liposoma. Las técnicas de acoplamiento antes descritas son ej emplificativas y se apreciará que en la técnica se conocen y se han descrito otros métodos adecuados, por ejemplo, en las Patentes de los Estados Unidos de América No. 6,605,630, 4,731,324, 4,429,008, 4,622,294 y 4, 483, 929.

C . Preparación del Liposoma Los liposomas pueden prepararse mediante una variedad de técnicas, tales como las que se detallan en Szoka, et a l . , 1980. Pueden formarse vesículas multilaminares (MLVs) mediante sencillas técnicas de hidratación de película de lípido. En este procedimiento, una mezcla de lípidos formadores de liposoma del tipo antes detallado disueltos en un solvente orgánico adecuado que se evapora en un recipiente para formar una película delgada, la cual es cubierta entonces por un medio acuoso. La película lípida se hidrata para formar las MLVs, normalmente con dimensiones entre aproximadamente 0.1 a 10 mieras. Los componentes lípidos utilizados en la formación de los liposomas fusogénicos de la presente P1219/99MX invención de preferencia se encuentran presentes en una proporción molar de aproximadamente 70-90 por ciento de lípidos formadores de vesículas, 1-20 por ciento del conjugado de copolímero dibloque-lípido y 0.1-5 por ciento de un lípido que tiene una molécula ligando unida. Según se indicó anteriormente, el polímero hidrofílico añadido puede consistir completamente del conjugado de copolímero dibloque-lípido o una combinación del conjugado de copolímero dibloque-lípido y polímero directamente enlazado a un lípido. Idealmente, el porcentaje de conjugado dibloque-lípido en esta mezcla es el máximo porcentaje que sea consistente con la estabilidad del liposoma. De este modo, para optimizar la formulación de una composición dibloque-lípido particular, uno seleccionaría varias proporciones de los dos tipos de lípidos poliméricos hidrofílicos y utilizaría la proporción más elevada que proporcione una buena estabilidad de liposoma, según se evidencia, por ejemplo, mediante un bajo régimen de fuga de un reportero fluorescente desde los liposomas. De preferencia, la cantidad del conjugado de copolímero dibloque-lípido está entre 5-100% del total del lípido polimérico hidrofílico incluido en la preparación lípida . Una formulación ej emplificativa incluye 80-90 por ciento molar de fosfatidilcolina, 1-20 por ciento molar de conjugados de polímero-lípido y 0.1-5 por P1219/99MX ciento molar del ligando-PEG-DSPE, en donde el conjugado de polímero dibloque-lípido constituye 20-100 por ciento del total de conjugados de polímero hidrofílico-lípido . El colesterol puede estar incluido en la formulación entre aproximadamente 1-50 por ciento molar. La preparación de una formulación liposomal ej emplificativa se describe en el Ejemplo 10. Otro procedimiento adecuado para la preparación de los liposomas fusogénicos de la presente invención incluye la difusión de conjugados de polímero-lípido en liposomas preforinados . En este método, los liposomas que tienen un agente terapéutico atrapado se preparan a partir de lípidos formadores de vesículas." Los liposomas preformados se añaden a una solución que contiene una dispersión concentrada de micelas de conjugados polímero dibloque-lípido y, opcionalmente, ligando-PEG-DSPE y la mezcla se incuba en condiciones efectivas para lograr la inserción de los lípidos micelares en los liposomas preformados. Una ventaja de este método es que la porción de polímero hidrofóbico en el lípido dibloque está confinada a la -capa lípida externa de los liposomas y, por lo tanto, es potencialmente menos desestabilizante que cuando el componente dibloque se incorpora en todas las capas de lípido que forman los liposomas. Alternativamente, los liposomas pueden estar preformados con el lípido polimérico hidrofílico P1219/99MX directamente ligado e incubados en condiciones de intercambio de lípido con el conjugado de polímero dibloque, para intercambiar al lípido dibloque en la capa liposomal externa. El agente terapéutico o diagnóstico que será administrado a las células, mediante la fusión celular, de conformidad con la invención, puede incorporarse en los liposomas mediante métodos estándar, que incluyen (i) atrapamiento pasivo del compuesto soluble en agua al hidratar una película lípida con una solución acuosa del agente, (ii) atrapamiento pasivo de un compuesto lipofílico al hidratar una película lípida que contiene i al agente y (iii) cargar un fármaco ionizable contra un gradiente de pH del liposoma interno/externo. Otros métodos, tales como la preparación del liposoma en fase de evaporación inversa, también se encuentran disponibles . Los liposomas fusogénicos de la invención de preferencia se preparan para que tengan dimensiones o tamaños prácticamente homogéneos en un intervalo de tamaño seleccionado, normalmente entre aproximadamente 0.01 a 0.5 mieras, más de preferencia, entre 0.03-0.40 mieras. Un método de dimensionamiento efectivo para REVs y MLVs incluye extruir una suspensión acuosa de los liposomas a través de una serie de membranas de policarbonato que tiene un tamaño de poro uniforme seleccionado en el intervalo de 0.03 a 0.2 mieras, P1219/99MX normalmente de 0.05, 0.08, 0.1 ó 0.2 mieras. El tamaño o diámetro de poro de la membrana corresponde en general a los tamaños más grandes de liposomas producidos por extrusión a través de esa membrana, particularmente cuando la preparación se extruye dos o más veces a través de la misma membrana. Los métodos de homogeneización también son útiles para reducir el tamaño de los liposomas a tamaños de 100 nm o menor (Martin) . 1. Preparación j Fusión ?n vi ro de Liposomas E?empli icativos para Eritrocitos . Se realizó un estudio en apoyo de la invención para demostrar que los liposomas preparados de conformidad con la invención exhiben actividad fusogénica después de la liberación de la porción hidrofílica del conjugado de copolímero-lípido y de la exposición del bloque polimérico hidrofóbico. Según se describe en el Ejemplo 8, los liposomas que contienen carboxifluoresceína atrapada se prepararon a partir de lípidos formadores de vesículas 1, 2-dioleiloxi-3- (trimetilamino) propano (DOTAP) , liso-fosfatidilcolina y fosfatidilcolina de soya parcialmente hidrogenada. Los liposomas también incluyeron colesterol y 5 por ciento molar del conjugado de polímero dibloque-lípido mPEG-S-S-PPO-DS, preparado según se describe en el Ejemplo 2 (Compuesto XII, Figura 8) .

P1219/99MX Los liposomas que contienen fluoresceína se incubaron con fantasmas de eritrocitos humanos liberados, preparados según se describe en el Ejemplo 8A. Los liposomas y las células fantasmas se centrifugaron para asegurar el contacto y entonces el agente de liberado ditiotreitol (DTT) se añadió para escindir al bloque mPEG del conjugado mPEG-S-S-PPO-DS incluido en los liposomas (Ejemplo 8C) . Después de la incubación, las células volvieron a suspenderse y se examinaron utilizando óptica por fluorescencia y una fotomicrografía se muestra en la Figura 13. Los fantasmas de eritrocitos observados en la micrografía exhiben fluorescencia interna, que indica que los liposomas que contienen fluoresceína se fusionaron con las células . Las células fantasmas de eritrocito que no se fusionaron con un liposoma también se observan en la fotomicrografía como células " transparentes más obscuras. También son evidentes los pequeños liposomas que contienen fluoresceína. Una preparación de control que contiene fantasmas de eritrocito _y la misma preparación liposomal pero que no estuvo expuesta al agente liberador DTT, no mostró evidencia de fusión liposoma-célula, según se evidencia mediante ningún fantasma celular en el campo óptico en óptica de fluorescencia que exhibe la fluorescencia interna. En la fotomicrografía de la Figura 13, aproximadamente más del 30% de las células fantasmas de eritrocito tienen P1219/99MX fluorescencia interna, que indica fusión con los liposomas fusógénicos . 2. Preparación ^ Ensayo In vivo de Liposomas Eiemplificativos . Se efectuaron estudios en apoyo de la invención utilizando liposomas que tienen un recubrimiento liberable de cadenas PEG mediante la inclusión del compuesto XXV (Figura 11) en los liposomas. Estos liposomas se probaron o ensayaron in vivo para la liberación de las cadenas PEG. Según se describe en el Ejemplo 9, se prepararon complejos que contienen liposomas catiónicos con el recubrimiento liberable de cadenas PEG y un plásmido portador de luciferasa. Los complejos se prepararon al formar un complejo de liposoma catiónico-plásmido condensado y al incubar el complejo con micelas de PEG-DTP-DSPE (compuesto XXV, Figura 11) o con miceles de PEG-DSPE (por ejemplo, PEG unido a DSPE mediante un enlace convencional no escindible (Zalipsky 1992a)) . Las miceles de PEG-DSPE y PEG-DTP-DSPE se insertan en los liposomas catiónicos con la incubación a temperatura ambiente y agitando vorticialmente en forma moderada durante 5 minutos. Se prepararon tres formulaciones de liposoma, según se describe en el Ejemplo 9. En la primera formulación, el recubrimiento de PEG no era liberable, P1219/99MX es decir, el PEG estaba incluido en, los liposomas como PEG unido irreversiblemente al DSPE. En la segunda formulación, los liposomas tenían un recubrimiento superficial de PEG, en donde la mitad de las cadenas de PEG estaban unidas en forma liberable a la superficie liposomal y la otra mitad no estaban unidas en forma liberable. En la tercera formulación, el recubrimiento superficial PEG en los liposomas era liberable. Estas formulaciones están indicadas en las Figuras 14A-14B como "PEG", "PEG + R-PEG" y "R-PEG", respectivamente. Los complejos de liposoma se administraron en forma intravenosa a ratones. Cinco minutos después de la administración, se añadió agente reductor de cisteína para reducir los enlaces de disulfuro, liberando de esta manera al PEG liberable de los liposomas. 24 horas después de la inyección, se analizó la actividad de la luciferasa en el pulmón y el hígado. Los resultados, mostrados en las Figuras 14A-14B, muestran que la actividad de la luciferasa es elevada, por ejemplo, en el tejido se retuvieron más liposomas, para liposomas que tienen cadenas PEG liberables. En forma importante, los datos demuestran liberación in vivo de cadenas PEG mediante la reducción de un enlace liberable. La liberación de las cadenas PEG expone las cargas positivas de la superficie liposomal de los liposomas catiónicos, aumentando la unión a las membranas celulares negativas y mejorando P1219/99MX la retención de los liposomas en los tejidos, según se evidencia mediante la superior actividad de la luciferasa para las formulaciones liposomales de PEG liberable .

III. Utilidad de la Composición Liposomal Fusoqénica . La composición liposomal fusogénica descrita es útil para suministrar agentes de diagnóstico o terapéuticos biológicamente activos, tales como fármacos, proteínas, material genético u otros agentes o moléculas receptoras, ya sea en una membrana celular, un liposoma receptor y en el citoplasma de una célula in vivo o in vi tro . De conformidad con la invención, el agente atrapado en el liposoma se suministra directamente al citosol de la célula blanco mediante la fusión de liposoma con las células, en vez de mediante mecanismos endocitóticos o fagocíticos. Los liposomas son de este modo particularmente ventajosas para suministrar agentes terapéuticos, tales como construcciones génicas, oligonucleótidos o análogos de oligonucleótido, péptidos, proteínas y otras macromoléculas biológicas que no penetran fácilmente una membrana celular mediante transporte pasivo o activo . La composición liposomal fusogénica puede P1219/99MX administrarse in vivo mediante una variedad de rutas que incluyen la subcutánea, intramuscular, - interlesional (a tumores), intertraqueal por inhalación, tópica, internasal, infraocular, mediante la inyección directa a los órganos e intravenosa.

A. Administración de la Composición Liposomal La composición liposomal fusogénica está diseñada para utilizarse en el suministro de un agente o compuesto hacia una célula blanco, ya sea en un sitio in vivo o en cultivos de células' in vi tro . El suministro del agente se logra mediante la fusión de las vesículas con la membrana de plasma _de las células blanco, liberando al agente en el compartimiento citoplásmico de la célula. A continuación se mencionan varias aplicaciones. 1. Suministro de un Agente Terapéutico. Una variedad de compuestos terapéuticos, que incluyen agentes farmacológicos generales, péptidos y ácidos nucleicos pueden tener aplicaciones terapéuticas limitadas debido al problema de la baja absorción en las células blanco. Al utilizar la composición liposomal de la presente invención, el compuesto terapéutico atrapado puede suministrarse a las células blanco con una elevada absorción mediante la fusión vesícula-célula . En esta aplicación general, los liposomas P1219/99MX fusogénicos que contienen farmacoencapsulado se administran, por ejemplo, en forma intravenosa. Los liposomas fusogénicos, según se describió anteriormente, pueden incluir un ligando específico para dirigirse a células que tienen la necesidad del fármaco atrapado. Por ejemplo, los liposomas que portan un fármaco antitumor, tal como doxorrubicina, pueden dirigirse a las células del endotelio vascular de tumores al incluir un ligando VEGF en el liposoma, para la unión selectiva a los receptores Flk-1,2 expresados en las células endoteliales tumorals en proliferación. El recubrimiento hidrofílico en los liposomas protege a los liposomas de la absorción por parte del sistema retículo endotelial, proporcionando una larga vida de circulación en la sangre para una llegada o alcance más efectivo. Al mismo tiempo, el ligando, unido a los extremos distantes de las cadenas poliméricas hidrofílicas ancladas al lípido, se exponen para los propósitos de unión y direccionamiento del receptor. Alternativamente, el dirigir a las células o tejido blanco seleccionado puede ser pasivo, es decir, por medio de la biodistribución normal de liposomas después de la administración, sin el requerimiento de ligandos no protegidos. Por ejemplo, los liposomas de circulación larga que tienen tamaños de preferencia menores de aproximadamente 0.2 µm, pueden acumularse, P1219/99 X después de administración IV, en los sitios de la región del tumor sólido o de los sitios de inflamación, mediante la extravasación por vasculatura comprometida. Cuando los liposomas han llegado a un sitio blanco seleccionado, por ejemplo, mediante la unión de ligando específico de los liposomas a las células blanco o la acumulación de liposomas en la vecindad de células blanco mediante la biodistribución de los liposomas inyectados, los liposomas se ponen en contacto en las células blanco con un agente químico efectivo para liberar las cadenas que forman al recubrimiento superficial. Esta liberación expone los polímeros hidrofóbicos en la superficie de liposoma a las células blanco, promoviendo la fusión de los liposomas con la superficie celular blanco, según se describe más adelante. En una modalidad general, las cadenas poliméricas hidrofílicas están enlazadas a las cadenas hidrofóbicas (o directamente a los lípidos del liposoma) mediante enlaces de disulfuro. En esta modalidad, el sujeto se trata, por ejemplo, mediante administración IV de un agente reductor, tal como ascorbato, cisteína o glutatión. En otra modalidad, el enlace químicamente liberable puede ser un enlace sensible al pH, en donde los liposomas están dirigidos a una región, tal como una región de tumor sólido, en donde un pH normalmente P1219/99MX bajo puede promover el desprendimiento del polímero hidrofílico . La remoción de las cadenas poliméricas hidrofílicas, total o parcialmente, expone al polímero hidrofóbico en la superficie del liposoma a la superficie de la membrana celular blanco. El segmento hidrofóbico, ahora en un entorno acuoso, buscará un entorno más favorable, por ejemplo, uno hidrofóbico, tanto en la bicapa de liposoma como en la membrana celular blanco adyacente. El reparto o la distribución de las cadenas hidrofóbicas en las células blanco actuará tanto para aumentar lá proximidad del liposoma a la membrana celular blanco como para desestabilizar la bicapa celular blanco, haciéndola más susceptible a la fusión con la bicapa del liposoma. Pueden utilizarse varias estrategias para optimizar o mejorar la eficiencia de la fusión. En primer lugar, es deseable aumentar la tendencia de la cadena hidrofóbica expuesta al reparto o distribución en la bicapa celular blanco en vez de en la bicapa de liposoma. Esto puede realizarse, parcialmente, al aumentar la concentración de lípidos de alta transición de fase en los liposomas. En segundo lugar, es deseable poner en una estrecha proximidad a los liposomas con la membrana blanco, esto puede realizarse, según se mencionó anteriormente, al proporcionar un ligando protegido o P1219/99MX un componente lípido cargado positivamente, capaz de interaccionar con la membrana blanco, después de la liberación de los polímeros hidrofóbicos, forzando de este modo a que se acerquen las dos bicapas . Finalmente, el tipo y tamaño de las cadenas poliméricas hidrofóbicas pueden optimizarse para aumentar la eficiencia de la fusión. El método antes analizado para examinar la habilidad de las cadenas poliméricas hidrofóbicas para lisar eritrocitos puede utilizarse para identificar el tamaño y el tamaño de polímero óptimos. 2. Terapia Génica . Los liposomas fusogénicos que contienen un gen atrapado en (plásmido de cADN) son liberados hacia las células blanco, para la terapia génica ex vivo o in vivo . En el último caso, un gen se introduce directamente (en forma intravenosa, intraperitoneal o en aerosol, etc.) en un sujeto. En la transferencia génica ex vivo ( o in vi tro ) , el gen se introduce en las células después de la remoción de las células del tejido específico de un sujeto. Las células transfectadas se re-introducen entonces en el sujeto. Se ha descrito una variedad de genes para el tratamiento de diversas condiciones y las secuencias de codificación para los genes específicos de interés pueden ser recuperadas de los bancos de datos de secuencias de ADN, tales como el GenBank o el EMBL .

P1219/99MX las secuencias de codificación seleccionadas pueden codificar a cualquiera de una variedad de diferentes tipos de proteínas o polipéptidos, dependiendo de la aplicación particular. Por ejemplo, el liposoma fusogénico puede ser utilizado para introducir enzimas codificadoras de secuencias, por ejemplo, en células de soporte o linfocitos de sujetos que padecen una deficiencia enzimática. Por ejemplo, en el caso de sujetos con deficiencia de adenosina desaminasa (ADA), pueden transfectarse secuencias que codifican ADA en las células de soporte o linfocitos de estos sujetos. En aplicaciones relacionadas,- los liposomas pueden contener genes que codifican a cualquiera de una varie"dad de proteínas circulantes, tales como a -antitripsina, factores de coagulación (por ejemplo, Factor VIII, Factor IX) y globinas (por ejemplo ß-globina, hemoglobina) , para el tratamiento de hemofilia, anemia falciforme y otras enfermedades relacionadas con la sangre. Otros ejemplos de genes que codifican secuencias adecuados para utilizarse con la presente invención incluyen secuencias que codifican proteínas estructurales; receptores, tales como receptor de lipoproteína de baja densidad (LDL-R) para la transfección de hepatocitos para tratar pacientes con deficiencia de LDL, de CD4 humano y formas solubles del mismo y lo similar; proteínas transmembrana, tales como regulador de conductancia transmembrana de P1219/99MX fibrósis quística (CFTR) para el tratamiento de pacientes con fibrosis quística; moléculas de señalización; citocinas, tales como diversos factores de crecimiento (por ejemplo, TGF-a, TGF-ß, interleucinas, interferones, eritropoietina y lo similar, así como receptores de dichas citocinas; anticuerpos, que incluyen anticuerpos quiméricos; genes útiles para dirigirse a tumores malignos (por ejemplo, melanoma maligno mediante la transformación de, por ejemplo, linfocitos que se infiltran en el tumor, TIL), genes supresores de tumor, tales como los genes p53 o RB, que regulan la apoptosis, tales como el gen Bcl-2 para timidina quinasa seguida por el gen ganciclovir de la citosina desaminasa seguida del gen 5-fluorocitosina por encima de la expresión del gen producto MDR-1 para proteger células normales de la quimioterapia citotóxica, con genes perjudiciales para los tumores, tal como el factor de necrosis tumoral, factor inhibitorio de leucemia o varios otros genes tóxicos; hormonas, tal como la insulina y la hormona del crecimiento; elementos regulatorios transcripcionales y translacionales ; y lo similar. Los liposomas también pueden codificar enzimas para convertir un profármaco no citotóxico en un fármaco citotóxico en células tumórals o en células endoteliales adyacentes al -tumor. En una modalidad de la invención, los liposomas contienen un polinucleótido diseñado para P1219/99MX incorporarse en el genoma de la célula blanco o diseñado para la replicación autóloga dentro de la célula. En otra modalidad, el compuesto atrapado en las vesículas de lípido es un segmento de oligonucleótido diseñado para la unión específica de secuencia en ARN o ADN celular. En el liposoma pueden atraparse polinucleótidos, oligonucleótidos, otros ácidos nucleicos, tales como plásmido de ADN, al condensar el ácido nucleico en forma de molécula sencilla. El ácido nucleico está suspendido en un medio acuoso que contiene espermina, espermidina, histona, lisina, mezclas de las mismas u otros agentes de condensación policatiónicos adecuados, en condiciones efectivas para condensar al ácido nucleico en pequeñas partículas, según se describe en el Ejemplo 11. La solución de las moléculas de ácido nucleico condensado se utiliza para rehidratar una película lípida seca para formar liposomas con el ácido nucleico condensado en forma atrapada.

B. Uso en Ensayos In Vi tro La composición liposomal fusogénica puede dirigirse a una célula o a un liposoma blanco in vi tro para utilizarse en un formato de inmunoensaye homogéneo . En esta aplicación, el suceso de la fusión P1219/99MX introduce una molécula efector portada en el liposoma fusogénico hacia la célula blanco, por ejemplo, en una célula biológica o en otro liposoma. La molécula efector interactúa con un compuesto contenido en la célula blanco para producir una señal medible.

IV. EJEMPLOS Los siguientes ejemplos ilustran métodos para preparar, caracterizar y utilizar los liposomas fusogénicos de la presente invención. Los ejemplos no pretenden de ninguna manera limitar el alcance de la invención .

Ejemplo 1 Preparación de Copolímero Di-PEG-PPO para Tamizane de la Actividad de Fusión A. Preparación del intemediario N-succinimidil- (2- ( -metoxipoli- (oxietileno) -a-amino-carbonil) etil- ditiopropionato, (mPEG-DTP-OSu) . Este esquema sintético se ilustra en la Figura 4. El N-succinimidil- (2- (w-metoxi-poli (oxietileno) -a-aminocarbonil) etil-ditiopropionato (compuesto III), se preparó de conformidad con el método de Kirpotin, 1996. Una solución de ditiobis (succinimidilpropionato) (873 mg, 2mmol) (DTSP, compuesto II), preparada a partir de ácido ditiodipropiónico (Aldrich, Milwaukee, Wl), se disuelve P1219/99MX en dimetilformamida ,(10 mi) y se trata con metoxipoli (etilenglicol) amina (2g, lmmol), mPEG-NH2 (compuesto I), preparado de conformidad con el método de Zalipsky (Zalipsky, 1983) y trietilamina (140 mi) . El resultante N-succinimidil éster polímero • intermedio, N-succinimidil- (2- (w-metoxipoli (oxietileno) -a-aminocarbonil) etil-ditiopropionato (mPEG-DTP-OSu, compuesto III) se purifica entonces por doble recristalización desde isopropanol, seguido por secado al vacío en pentóxido de fósforo, para eliminar el agua residual. El intermedio se caracterizó mediante H NMR, utilizando metanol deuterado como solvente. H-NMR (CD3OD) : d 2.6 (m, SCH2CH2CON) , 2,85 (s, Su, 4H) , 3.0 (m de traslape, SCH2CH2C02-Su y SCH2CH2, CON) , 3.38 (s, CH3, #h) , 3.64 (s, PEG, * 180H). La composición de la mezcla producto, es decir, la cantidad relativa de mono-PEG-ilado (mPEG-DTP-OSu) a producto di-PEG-ilado ditiodipropionato (mPEG)2DTP, se determina al comparar las integraciones relativas de los picos a 2.6 ppm y 2.85 ppm del campo inferior de TMS, asignado al succinato deseado, contra una resonancia a 3.0 ppm, asignada a (mPEG)2DTP.

B. PREPARACIÓN DEL COPOLÍMERO TRIBLQQUE Se agitó PPO-diamina, que contiene dos grupos amino primario terminales (compuesto IV) , en cloruro de metileno hasta la disolución. A esta solución se P1219/99 X añadió un leve exceso (1.2 equivalentes) de mPEG-DTP-OSu (compuesto III) . La mezcla de reacción se agitó entonces durante varias horas a temperatura ambiente. El progreso de la reacción se monitorea mediante TLC; la terminación se indica mediante la desaparición de una mancha que corresponde a PPO-diamina. El producto di-PEGilado PPO, di (mPEG-amido-DTP-a ido) PPO (compuesto V) , se purifica mediante cromatografía en columna en gel de sílice, seguido por la caracterización mediante espectroscopia H NMR (CDC13) para confirmar la ausencia de cualquier producto mono-PEGilado PPO restante.

C. Método para Rastrear la Actividad Promotora de la Fusión de Polímeros Hidrofóbicos . Se preparó un copolímero tribloque de PEG20oo Y PPO2000 (Compuesto V) mediante un procedimiento de conformidad con el antes descrito. Se disolvieron 50 mg del copolímero tribloque en 1.2 mL de solución salina amortiguada con fosfato (PBS) . Se colocaron 0.5 L en los primeros dos tubos de dos filas de 10 tubos cada uno conteniendo 0.5mL de PBS. Se realizaron diez diluciones al doble en serie del copolímero en ambas hileras de tubos. A cada uno de los 20 tubos se añadió 0.5mL de una suspensión al 10% en volumen/volumen de eritrocitos del grupo O humano frescos (que habían sido extraídos en heparina y lavados tres veces con PBS) . También se preparó un control de célula al combinar P1219/99MX 0.5mL PBS y 0.5 mL de la suspensión de eritrocitos en un solo tubo. Todos los tubos se colocaron en un refrigerador durante 10 minutos, después de este tiempo, se añadió 0. lmL de 0.5M ditiotreitol (DTT) a un conjunto de diluciones mientras que al otro conjunto de diluciones se añadió 0.1 mL de PBS. Al tubo que contiene el control de célula se añadió 0.1 mL de DTT. Los tubos se colocaron en el refrigerador durante 2 horas. Después de la incubación, los tubos se colocaron en una centrífuga y se hicieron girar a 2000 x G durante 10 minutos para peletizar o globulizar los pelets . Los sobrenadantes se retiraron cuidadosamente y se colocaron en tubos separados. Se midieron los valores de absorbancia a 480 nm de los sobrenadantes de la 5a dilución (es decir, los tubos que contienen una concentración del copolímero tribloque de 0.78 mg/mL) y de la preparación de control, estos se muestran en la Figura 5, en donde la barra (a) muestra la absorbancia de las muestras que contienen al copolímero tribloque más DTT, la barra (b) muestra la absorbancia de las muestras que contienen 'al copolímero tribloque solo y la barra (c) muestra la absorbancia de la preparación de control (células más DTT) . Las células también se examinaron microscópicamente en óptica de contraste de fase a un aumento de x630 y las fotomicrografías se muestran en P1219/99MX las Figuras 6A-6C. La Figura 6A muestra la preparación de célula expuesta al copolímero tribloque y al DTT, la Figura 6B corresponde a las células expuestas solamente al copolímero tribloque y la Figura 6C muestra las células expuestas solamente al DTTA Según se observa, la lisis celular solamente es evidente en la preparación que contiene al copolímero tribloque expuesto al DTT, en donde se usaron más del 80% de las células,' según se evidencia mediante los cuerpos transparentes obscuros en la fotomicrografía (las células intactas se observan como cuerpos brillantes en las fotomicrografías) .

Ejemplo 2 Preparación de un Conjugado Copolímero Diblogue-Lípido : mPEG-S-S-PPO-DS (Compuesto XII) A. Materiales ^ Métodos Materiales: A menos que se indique otra cosa, los materiales se obtuvieron a partir de proveedores comerciales y se utilizaron tal como se suministraron. El a- (imidazol-1-il) carbonil-w-metoxi-poli (óxido de etileno) se sintetizó mediante métodos conocidos (Beauchamp, et al . , 1983) . Métodos: La frase "evaporado al va ci o" se refiere al uso de un evaporador giratorio con una temperatura de baño que no excede de 40 °C, utilizando un aspirador de agua. La cromatografía de capa fina P1219/99MX (TLC) se realizó en placas de gel de sílice Analtech 60F-254 y la detección de los componentes en la TLC se efectuó mediante tinción con vapor de yodo, tinción con reactivo de Dragendorf (para la detección de poliéter) o mediante tratamiento con solución de sulfato cúprico/ácido sulfúrico seguida de calentamiento. Los sistemas solventes están expresados como un porcentaje de componente más polar con respecto al volumen total (v/v%) . Se utilizó gel de sílice Merck grado 9385 de 230-400 mallas (60 A) para la cromatografía (Merck Sharpe & Dohme, Philadelphia, PA) , la cual se realizó utilizando las directrices descritas por Still, et a l . (1978) . Se adquirió el espectro de 1H NMR en 360 Mhz GE instrument en Acorn NMR Inc. (Fremont, CA) y los valores de desplazamiento químico se expresaron en valores ? (partes por millón) con respecto a tetrametilsilano como norma interna. La ionización por desorción con láser ayudado por matriz-espectroscopia de masa en tiempo de vuelo (MALDI-TOFMS ) se obtuvo con espectrómetro de masa en tiempo de vuelo-analizador electrostático triple PH-EVANS MALDI en Charles Evans & Associates (Redwood City, CA) .

B . Preparación de a- [2-Aminoetilditio-N- etilcarbamoil- -metoxi-poli (óxido de etileno) Clorhidrato (Compuesto VIII) . La siguiente reacción se muestra en la Figura P1219/99 X 8. Un matraz de bola de 250 mL se cargó con cistamina diclorhidrato (Compuesto VII, 4.5 g, 20 mmol) disuelto en 50mL de tetraborato de potasio tetrahidratado 0.01 M. A esta solución en agitación se añadió, en una porción, a- imidazol-1-il) carbonil-w-metoxi-poli (óxido de etileno) (Compuesto VI, n=45) preparado según se describe en Beauchamp, et al . , 1983 y la solución transparente resultante se agitó a temperatura ambiente durante cuatro horas. En este momento, se ajustó el pH de la solución a 1 con HCl 6N y se añ dió cloruro de sodio hasta el límite de saturación. La solución acuosa se extrajo con cloroformo (2 x 75 mL) , los extractos orgánicos se combinaron, secaron sobre sulfato de magnesio y filtraron. El solvente se evaporó in va cuo y el gel incoloro resultante se disolvió en aproximadamente 70 mL de acetato de etilo. A esta solución clara o transparente se añadieron lentamente 120 mL de dietiléter para proporcionar 1.97 g (88%) de un precipitado blanco, a- [2-Aminoetilditio-N-etil-carbamoil-w-metoxi-poli (óxido de etileno) clorhidrato (Compuesto VIII), que fue suficientemente puro para la siguiente reacción. Rf = 0.49 (2:18:90 agua/metanol/cloroformo) . ^"H NMR (360 Mhz, DMSO-d6)? 7.74 (bs, 3), 7.38 (t, 1, J = 5.1 Hz), 4.05 (pt, 2, J = 4.5 Hz), 3.69 (pt, 1, J = 4.7 Hz), 3.50 (b , ~ 180), 3.41 ( , 2), 3.23 (s, 3), 3.08 (pt, 2, J = 46.7 Hz, 7.1 Hz), 2.90 (pt, 2 J = 6.9 Hz, 6.6 P1219/99MX Hz) C. Preparación de bis p-Nitro enil Carbonato Polipropileno (Compues o IX) . El óxido de polipropileno- (PPO, 1 g, 0.5 mmol) se secó azeótrbpicamente con benceno. p-nitrofenil cloroformato (604 mg, 3 mmol, 6 eq) y trietanolamina (TEA," 418 mi, 3 mmol, 6 eq) se añadieron al PPO en CH2C12 (3 mi) . Después de 30 minutos, la TLC mostró que la reacción estaba completa. La solución se filtró y evaporó a sequedad. El producto en bruto se disolvió en DHC13 : CH3COCH3 (90:10), se cargó en la columna de sílice (la pulpa se preparó con el mismo solvente) y se eluyó con los siguientes solventes, CHC13 : CH3COCH3 = 90:10 (grupo p-nitrofenilo eluido), CHC13 : CH3COCH3 = 50:50 (producto eluido) . Los factores apropiados se combinaron, evaporaron y secaron in va cuo sobre P205 para proporcionar un producto puro tal como aceite transparente. Rendimiento: 1 g (86%) . 1H NMR (d6-DMSO) : d 1.05 (d, CH3CHCH2, 105H) ; 1.15(5, CH3CHCH2, y 6H) ; 3.30 (m, CHdCHCH2, 35H) ; 3.45 (m, CH3CHCH2, 70H); 4.90 (m, terminal CH3CHCH2, 2H) ; 7.50 (d, N02C6H4 PPO, 4H) , 8.30 (d, N02C6H4 PPO, 4H) .

D. Preparación de mPEG-S-S-PPO-DS (Compuesto XII) Un matraz de bola de 25 mL secado en la estufa se cargó con, en atmósfera de nitrógeno, a,w-bis(4- P1219/99MX nitrofenoil carbonato) -poli (óxido de propileno) (Compuesto IX, m=35, 611 mg, 236 µmol) (preparado según se describe en el Ejemplo 2C anterior, de conformidad con los métodos de Veronese, et al . , 1985) y Compuesto VIII (512 mg, 230 µmol) en 4.0 mL de dimetilformamida seca. Entonces se añadió trietilamina (98 µl, 700 µmol) a esta solución amarilla clara para proporcionar una mezcla amarilla brillante nebulosa que se agitó a temperatura ambiente en hidrógeno durante 60 minutos. En este momento, el análisis de TLC indicó la consumación completa del Compuesto VIII (y la formación de mPEG-S-S-PPO-nitrofenilcarbonato [Compuesto X, producto principal] y mPEG-S-S-PPO-S-S-mPEG [producto menor]) . La reacción se dejó en agitación a temperatura ambiente en nitrógeno durante 21 horas. El solvente - se evaporó entonces y el residuo amarillo se sometió a cromatografía en columna (SiO , 25 x 150 mm, (1) 10% de acetona/cloroformo para eluir al p-nitrofenol entonces, (2) 5% de metanol/cloroformo para eluir a la primera mezcla, (3) 8% de metanol/cloroformo) para eluir la segunda mezcla que contiene mPEG-S-S-PPO-aminopropanodiol (Compuesto XI). La evaporación del solvente de las fracciones apropiadas proporcionó 260 mg de un aceite el cual, mediante análisis de TLC, contenía dos materiales de Rf = 0.58 y Rf = 0.57 (10% de metanol/cloroformo ) que eran positivos a la tinción con yodo y a la tinción con P1219/99MX Dragendorf específica de poliéter. Este material se utilizó sin ninguna purificación adicional. Un matraz de 5 mL secado en estufa se cargó con, en atmósfera de nitrógeno, ácido esteárico (52 mg, 182 µmol), 4-(dimetilamino) piridinio tosilato (Moore y Stupp, 1990) (9 mg, 30 µmol) y una solución del Compuesto XI (260 mg de mezcla) en 2.0 mL de diclorometano seco. A esta solución transparente se añadió 1,3-diciclohexicarbodiimida (5 mg, 25 " µmol) y la reacción se dejó en agitación a temperatura ambiente en atmósfera de nitrógeno. Después de 30 minutos, comenzó a formarse un precipitado ( 1 , 3-diciclohexilurea) y el análisis de TLC mostró la formación de una nueva zona de producto en Rf = 0.57 (9% de metanol/cloroformo, material de inicio Rf = 0.49) . La reacción se agitó durante toda la noche a temperatura ambiente y en atmósfera de nitrógeno. La mezcla se filtró a través de Celite con lavados de diclorometano, el solvente se evaporó y el residuo se sometió a cromatografía en columna (Si02, 25 x 100 mm, [a] 10-50% de gradiente de 2-propanol/cloroformo, [b] 2:48:50 metanol/2-propanol/cloroformo, [c] 5:45:50 metanol/2-propanol/cloroformo, [d] 5% de metanol/cloroformo, [e]7.5% de metanol/cloroformo; 100 mL de solvente total) para proporcionar, después de la evaporación del solvente y la liofilización del 2-metil-2-propanol/agua, 58 mg (10%) de un sólido blanco P1219/99MX floculento, identificado como mPEG-S-S-PPO-DS (Compuesto XII). 1H NMR (360 Mhz, CDC13) d 5.32 (bs, 1), 6.20 (bs, 1), 5.09 (m, 1), 4.91 (bm, 3), 4.28 (dd, 1, J = 4.0 Hz, 12.2 Hz) , 4.22 (pt, 2, J = 4.7 Hz), 4.12 (dd, 1, J = 5.6 Hz, 11.8 Hz), 3.83 (m, 1), 3.64 (m, ~ 180), 3.58-3.51 (bm, ~ 70), 3.39 (bm, ~ 35), 3.37 (s, 3), 2.80 (pt, 4, J = 6.8 Hz, 5.9 Hz), 2.30 (pt, 4, J = 7.4 Hz, 7.5 Hz), 1.61 (bm, 4), 1.32-1.22 (bm, -62), 1.13 (d, -99, J = 6.9 Hz), 0.88 (t, 6, J = 6.6 Hz). El espectro de masas MALDI-TOF (DHB, 2 , 5-dihidroxbenzoato utilizado como material de matriz) mostró al ion molecular " del " conjugado representado por una distribución de líneas centradas en los 4800. El espectro también mostró dos distribuciones que representan los fragmentos del conjugado generado por escisión del enlace de disulfuro, 2100 y 2700 m/z. El primero está compuesto de líneas espectrales igualmente separadas a 44 m/z unidades (unidad de repetición oxietileno) y la segunda distribución contiene líneas igualmente separadas a 58 unidades dé separación (unidad de repetición oxipropileno) .

P1219/99MX Ejemplo 3 Preparación de un Conjugado de Copolímero Diblogue- Lípido mPEG-S-S-PPO-DSPE (Compuesto XV) A. Preparación de DSPE-PPO-p-nitro nil carbamato (Compuesto XIV) . La siguiente reacción se ilustra en la Figura 9. Se añadió DSPE (Compuesto XIII, 220 mg, 0.294 mmol) al bis-nitrofenil carbonato polióxido de propileno (Compuesto IX, 1 *g, 0.482 mmol, 3 eq) en CHC13 (5 mi) . La imida de ácido N-hidroxi-s-norbornene-2 , 3-dicarboxílico (HONB, 79 mg, 0.441 mmol, 1.5 eq) y el TEA (304 mi, 2.19 mmol, 7.44 eq) se añadieron a la mezcla de reacción. La mezcla de reacción se convirtió en una solución amarilla nebulosa. Después de 4 horas a 42°C, la mezcla de reacción se volvió transparente (amarilla) . La TLC (CHCl3:MeOH: H20 = 90: 18: 2) mostró que la reacción se había completado. La mezcla de producto se agitó vorticialmente con resina de intercambio iónico Amberlist 15 (acida, 1.5 g, 4.6 meq/g) y resina de intercambio iónico Amberlist 21 (básica, 1.5 g, 4.8 meq/g) . Entonces la mezcla de producto se disolvió en MeOH (3 mi), se añadió sílice (3 g, Aldrich Chemical Co . , Milwaukee, Wl, Sílice de 60 Á, 230-400 mallas) y se evaporó. El producto se eluyó mediante los siguientes solventes, CHC13 : CH3COCH3 = 90:10 (100 mi), CHCl3:iPrOH = 98:2 (100 mi), CHCl3:iPrOH 96:4 (100 mi), CHCl3:iPrOH = 94:6 (100 mi), P1219/99MX CHCl3:iPrOH = 92.8 (100 mi), CHCl3:iPrOH = 92.8 (100 mi), CHCl3:iPrOH = 90:10 (200 mi). Las fracciones que contienen producto puro se combinaron y evaporaron. Al producto se. añadió t-BuOH (5 mi) . El producto (Compuesto XIV) se secó in va cuo sobre P205 y se obtuvo como sólido blanco ( 350 mg, 41%) . XH NMR (CDC13) : d 0.88 (m, 6H) , 1.15 (s, PPO (CH3CHCH2), - 105 H) , 1.26 (s, CH2, 56 H) , 1.58 (br m, CH2CH2C=0, 4H) 2.31 (2 t, CH2C=0, 4H) , 3.38 (m, PPO (CH3CHCH2), - 35H) , 3.54 (m, PPO (CH3CHCH2) , - 70H) , 5.20 (m, P04CH2CH, 1H) , 7.38 (d, N02C6H4 PPO, 4H) , 8.38 (d, N02C6H4 PPO, 4H)V B. Preparación de mPEG-S-S-PPO-DSPE (compuesto XV) " Continuando con referencia a la Figura 9, el compuesto VIII (Ejemplo 2B: mPEG-0 (C=0 ) NHCH2CH2S-SCH2CH2-NH2; 56 mg, 0.027 mmol, 1.4 eq) , hidroxibenzotriazol (HOBt, 15.2 mg, 0.113 mmol, 6 eq) , malla molecular (50 mg) y TEA (20 mi, 0.143 mmol, 7.7 eq) se añadieron al compuesto XIV (carbamato de DSPE-PPO-p-nitrofenil) (55 mg, 0.019 mmol, 1 eq) , en CHC13, (600 mi) . Después de 3 horas el TLC (CHC13: MeOH: IPA = 50: 1: 49) mostró la formación del producto, pero el punto de producto fue muy claro. Después, se añadió DMF (0.2 mi) a la mezcla de reacción y se agitó a temperatura ambiente. Después de 24 horas el punto o mancha del producto se obscureció en relación al dia P1219/99MX previo. La mezcla del producto se filtró, se liofilizó y después se purificó por cromatografía de columna en gel de sílice. La mezcla del producto se disolvió en CH3C0CH3:CHC13 (90:10) y se cargó sobre la columna. La columna se eluyó con los siguientes solventes: CHC13:CH3C0CH3 = 90:10 (50 mi), CHCl3:iPrOH = 80:20 (20 mi), CHCl3:iPrOH = 60:40 (20 mi), CHC13 : iPrOH: MeOH =. 50:49:1 (20 mi), CHC13 : iPrOH- : MeOH = 50:48:2 (20 mi), CHCl3:iPrOH = 92:8 (100 mi, CHCl3:iPrOH = 92:8 (100 mi), CHCl3:iPrOH = 90:10 (200 mi). Las fracciones que contenían productos puros se combinaron y evaporaron. Se añadió t-BuOH (5 mi) al producto. El producto, compuesto XV, se secó al vacío sobre P205 y se obtuvo como un sólido blanco (350 mg, 41%) . 1H NMR (CDC13) : d 0.88 ( , 6H) , 1.15 (s, CiT3CHCH2, -105 H) 1.26 (s, CH2, 56 H) , 1.58 br m, Cf_CH2) , -35 H) , 3.54 (m, PPO CH3CHC_?2, -70 H) , 3.64 (s, PEG, 180 H) ; 5.20 ( , P04CH2Cff, 1 H) . , El espectro de masas MALDI-TOF (matriz DHB) mostró al ion molecular del conjugado representado por una distribución de líneas centradas en 5000 m/z. El espectro también mostró dos distribuciones que representaban los fragmentos del conjugado generadas por la escisión del enlace disulfuro, 2100 y 3000 m/z. La primera de las líneas que componían al espectro estuvo separada igualmente en 44 m/z unidades (unidad de repetición PEG) y las líneas que contenían la segunda distribución estaban igualmente separadas a 58 P1219/99 X unidades (unidades de repetición PPO) .

Ejemplo 4 Preparación de un conjugado de Copolímero Diblogue-Lípido mPEG-DTP-amido-PPO-DSPE (compuesto XX) A. Preparación del Intermediario del Polímero Hidrofóbico Lipidizado, amino-PPO-DSPE (compuesto XIX) Se trató diestearilfosfatidilglicerol (DSPG, compuesto XVI Figura 10A) con peryodato de sodio (NaI04) como se describe por Torchilin. El producto oxidado resultante, DSPE-oxidado (compuesto XVII), se aminó de manera reductiva con un exceso de diamina de óxido de polipropileno (diamino-PPO, compuesto XVIII, n=10-20) (por ejemplo, Jeffamina®, Texaco, Houston, TX) en la presencia de NaCNBH3, para formar el polímero hidrofóbico con función lipídica unido a amino, amino-PPO-DSPE (compuesto XIX, Figura 10A) .

B. Preparación de un Conjugado de Copolímero Diblogue-Lípido mPEG-DTP-amido-PPO-DSPE (compuesto XX) El conjugado deseado, mPEG-DTP-amido-PPO-DSPE (compuesto XX) , tiene un polímero de bloque terminal hidrofílico, PEG, un enlace disulfuro interno escindible y un bloque de óxido de polipropileno hidrofóbico unido a un lípido terminal, y se prepara P1219/99MX mediante el acoplamiento de los intermediarios preparados como se describe en los Ejemplos ÍA y 4A anteriores, PEG-DTP-OSu (compuesto III) y amino-PPO-DSPE (compuesto XIX), para formar el producto conjugado de copolímero-lípido deseado, mPEG-DTP-amido-PPO-DSPE (compuesto XX) . Se preparó mPEG-DTP-OSu (compuesto III) como se describe en el Ejemplo ÍA y se disolvió en CHC13. Una cantidad equimolar del amino-PPO-DSPE (compuesto XIX) se añadió a la solución CHC13 de mPEG-DTP-OSu y incubó, en presencia de trietilamina, en 45°C hasta que se clarificó. El producto (compuesto XX) se purificó como se describe por Zalipsky, 1993 y el producto purificado se caracterizó por H NMR. La ausencia de protones asignables al grupo de succionato activo indicó la copulación de las dos porciones de polímero para formar el producto deseado. El esquema de reacción se resumen en" las Figuras 10A-10B.

Ejemplo 5 Preparación del Conjugado de Copolímero-lípido unido a un Enlace de Disulfuro que Tiene una Labilidad Incrementada La preparación de un conjugado mPEG-PPO-DSPE interenlazado con disulfuro que _ contiene un enlace disulfuro modificado que tiene una mayor susceptibilidad a ser "escindido (por ejemplo, tiolisis P1219/99MX y/o hidrólisis) se llevó a cabo como se describe a continuación y se ilustra en la Figura 11. Se preparó metoxipoli (etilen glicol) tiol, mPEG-SH (compuesto XXI), de acuerdo al método de Zalipsky (1987) . A una solución de mPEG-SH (compuesto XXI) en agua o dimetilformamida se añadió un exceso de 5 ' 5 ' -ditiobis (ácido 2-nitrobenzoico) , "reactivo de Ellman" (compuesto XXII) y la mezcla de reacción resultante se dejó en agitación a temperatura ambiente (20-25°C) . La reacción se monitoreó mediante TLC hasta la desaparición del material de partida mPEG-tiol, o alternativamente puede seguirse por un análisis IR (alargamiento S-H) de alícuotas de la mezcla de reacción. El producto disulfuro mixto resultante, mPEG-3-carboxi-4-nitrofenil disulfuro (compuesto XXIII) , se recuperó por cromatografía en columna de gel de sílice y se purificó. El disulfuro resultante se caracterizó por espectroscopia H NMR y las integraciones relativas (áreas pico) de las resonancias de campo ascendente asignables a la porción PEG de la molécula, y aquéllas de los picos correspondientes a los protones aromáticos en el anillo de fenilo substituido, se compararon para determinar el grado en que se formó el producto colateral de disulfuro de d-PEGilado, di (mPEG) disulfuro . El disulfuro mixto, disulfuro de mPEG-3-carboxi-4-nitrofenilo (compuesto XXIII), se disolvió P1219/99 X completamente en el cloruro de metileno. A esta solución resultante se añadió amino-PPO-DSPE (compuesto XIX), preparado como se describe en el Ejemplo 4A anterior, y el agente de copulación diciclo-hexilcarbodiimida (DCC, compuesto XXIV) . La mezcla de reacción resultante se agitó por toda la noche a temperatura ambiente hasta que se observo la desaparición completa de H2H-PPO-DSPE, como se determina por TLC. El producto resultante de surfactante copolímero-lípido, disulfuro de mPEG- ( 3-amido-PPO-DSPE) - (4-nitrofenil) (compuesto XXV) se purificó por cromatografía en coJLumna de gel de sílice y se caracterizó por NMR. El producto de disulfuro modificado presentó Una susceptibilidad mejorada a la escisión del enlace disulfuro, por ejemplo, al ataque con un tiol entrante, por ejemplo, cisteína o glutatión .

Ejemplo 6 Preparación de Ácido Fólico-PEG-DSPE Como el ácido fólico es sensible a la luz, este procedimiento se efectúo bajo condiciones de protección contra la luz. Como se ilustra en la Figura 12A, el ácido fólico (compuesto XXVI, 25 mg 5.6 10" , 1.6 equiv.), el amino-PEG-DSPE (compuesto XXVII, 97 mg, 3.4 10" , 1 equiv., preparado como se describe en Zalipsky (1994)) y la imida del ácido N-hidroxi-s- P1219/99MX norborneno-2 , 3-dicarboxílico (HONB, 10 mg, 5.5 x 10 , 1.6 equiv.) se disolvieron en DMSO (1.0 mi) y piridina (0.5 mi) . La mezcla se agitó hasta que se disolvió completamente. Se añadió diciclohexil-carbodiimida (DCC, 32 mg, 1.5 x 10"4, 4.4 equiv.) para iniciar la reacción. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante cuatro horas y la reacción se completó para formar ácido fólico-PEG-DSPE (compuesto XXVIII) confirmándolo por TLC (debe estar ausente amino-PEG-DSPE) . La piridina después se evaporó a partir de la mezcla reaccionada. Para el TLC, las muestras se disolvieron en 50µl DMSO y diluyeron con cloroformo 1.0 mi. Las mezclas de reacción se diluyeron con cloroformo con objeto de disolver el ácido fólico. La matriz que se acopla con el DMSO mantiene el valor de RF entre las muestras. Los solventes que se utilizaron para la corrida del TLC fueron: (1) alcohol isopropilíco/amoniaco/agua 10:1:2 (requiere 40 minutos), y (2) cloroformo/metanol/agua 75:30:5 (requiere 14 minutos ) . Las técnicas de visualización son U.V. y rocío Dragendorff . " Los valores RF y las técnicas de visualización en los solventes TLC fueron: P1219/99MX Ejemplo 7 Preparación de Piridoxal-PEG-DSPE Se mezcló Piridoxal (compuesto XXIX) y PEG derivatizado con hidrazida unido a DSPE (compuesto XXX, en Zalipski (1993)) a temperatura ambiente (20-25°C) en DMF para formar el conjugado piridoxal-PEG-DSPE (compuesto XXI) mostrado en Figura 12B.

Ejemplo 8 Fusión del Liposoma In v±tro con Fantasmas de eritrocito liberados A. Preparación de fantasmas eritrocito humano liberados Se introdujo sangre humana del grupo 0 en un tubo que contenía heparina y las células se lavaron tres veces con 5 volúmenes de solución salina amortiguada con fosfato, fría (PBS) . Después de tercer lavado, las células se resuspendieron en una suspensión 50% volumen/volumen en PBS frío. Las células se P1219/99MX Usaron introduciendo lentamente un mL de suspensión de células al 50% en 100 mL de agua destilada enfriada con hielo que contenía 5 mM de Mg S04 con agitación constante. Después de 10 minutos, se añadieron 848 mg de NaCl sólido a la suspensión para restablecer la isotonicidad. Los fantasmas se liberaron incubando la suspensión a 37°C por una hora. La suspensión se transfirió hacia tubos de centrífuga y se centrifugó a 10,000 rpm por 30 minutos a 4°C. Los fantasmas de eritrocito "rosado" peletizados se resuspendieron (5% volumen/volumen) en glucosa al 5%.

B . Preparación de Liposomas Un toral de 20 mg de lípidos indicados en el cuadro se disolvieron en 1 mL de dietil éter en un tubo de cultivo con tapa de rosca, de 10 mL .

P1219/99MX La mezcla se calentó ligeramente para disolver los lípidos y se añadieron 0.3 L de una solución de 100 mM de 6-carboxifluoresceina (6-CF) en agua destilada (300mOsm) . Las dos fases se emulsificaron por sonicación en un aparato de ultrasonido tipo baño por 10 minutos a temperatura ambiente. El tubo se colocó en una manga de evaporación y se fijó al evaporador rotatorio. Se aplicó suficiente vacío para hacer más lenta la evaporación del éter en un periodo de aproximadamente 10 minutos. La manga se sumergió en un baño de agua a 37°C y el vació se incrementó lentamente. A medida que el éter se evaporó se formó un gel que eventualmente se colapso. Otros 0.05 mL de la solución 6-CF se añadieron y la suspensión se sometió a formación de torbellino. El éter residual restante se retiró colocando el tubo al alto vacío por 10 minutos. La suspensión de liposomas formada en esta forma se hizo pasar sobre una columna de Sephadex G-75 (10 mm x 25 cm) pre-equilibrada con solución de glucosa al 5%. Los liposomas que se eluyeron con el volumen hueco de la columna se recolectaron y se utilizaron sin mayor dilución.

C. Experimento de fusión de liposoma- antasma de eritrocitos . 0.5 mL de la suspensión enfriada con hielo de los fantasmas de eritrocito liberados se colocaron en P1219/99MX dos tubos de centrífuga y se añadieron a cada 10 microlitros de la suspensión de liposomas. Los liposomas se unieron rápidamente a los fantasmas como lo prueba la aglutinación inmediata por extensión de los fantasmas. Los dos tubos se dejaron incubar en un baño de hielo por 1 hora para permitir que los liposomas se unieran más completamente a los fantasmas. Para asegurar un contacto estrecho entre las membranas de los fantasmas y los liposomas, las mezcla se centrifugó a 10,000 x G por 10 minutos a 4°C. Después del paso de centrifugación, 10 microlitros de la solución 0.1M de ditiotreitol (DTT) en glucosa al 5% se añadieron a un tubo y 10 microlitros de glucosa al 5% al otro tubo, como un control. Los tubos se dejaron incubar por 2 horas en el refrigerador. Los tubos se sometieron a agitación vorticial para resuspender las células fantasma y una muestra de 10 microlitros de cada uno se retiró y se colocó sobre un porta-objetos de vidrio para microscopio. Un cubre-objetos se colocó sobre la suspensión y los porta-objetos se examinaron tanto por óptica fluorescente como por óptica de contraste de fase a un aumento de x630. Una microfotografía de la muestra se expuso a DTT y observó bajo óptica de fluorescencia como se muestra en la Figura 13. El control que contenía fantasmas se ligó a los liposomas que no se habían expuesto a DTT, sin mostrar evidencias de fusión liposoma-célula, es decir P1219/99MX ninguno de los fantasmas del campo óptico en la óptica de fluorescencia exhibió fluorescencia interna. En contraste, más de aproximadamente el 30% de las células totales de fantasma que se habían unido a liposomas y que sé expusieron a DTT exhibieron fluorescencia interna intensa, indicando que los liposomas que contenían 6-C7F se habían fusionado con las membranas fantasma .

Ejemplo 9 Administración in vivo de Liposomas PEG Liberables A. Formulaciones de Liposomas Los liposomas catiónicos que tienen un recubrimiento superficial de PEG y que están acomplejados en un plásmido portador de luciferasa, se prepararon en la siguiente forma.

B. Preparación del Complejo Liposoma/Plásmido Los liposomas catiónicos compuestos de los lípidos dimetildioctadecilamonio y colesterol (DDAB: CHOL) se prepararon de acuerdo a procedimientos estándar, disolviendo 10 µmol DDAB y 10 µmol CHOL en un solvente orgánico que contenía CHC13 principalmente. La solución de lípidos se secó en una película delgada por rotación bajo presión reducida. La película de lípidos se hidrató por la adición de la fase acuosa deseada, es decir, agua, solución salina o solución reguladora, P1219/99MX para formar liposomas (a una concentración total de lípido de 20 µmol/mi) que después se dimensionaron por sonicación o por extrucción secuencial a través de membranas de policarbonato nucleopore con tamaños de poro de 0.4 µm, 0.2 µm, 0.1 µm y 0.05 µm para obtener liposomas de un tamaño de 100-150 mn. Se utilizó un plásmido de luciferasa como un gen reportero. El plásmido se condensó para acomplejarse con los liposomas catiónicos añadiendo 100 µl de una solución que contenía 1 mg/ml de histona total en un medio acuoso de 400 µl de plásmido solubilizado (1 mg plásmido/ml) . El plásmido condensado tuvo un diámetro promedio de aproximadamente 150 nm, medido por dispersión dinámica de luz. Los complejos de liposoma catiónico/plásmido condensado se prepararon añadiendo 280 µl de la suspensión catiónica de liposoma (20 µmol/mi) a 500 µl de las partículas de plásmido condensadas con histona. Los complejos liposoma-plásmido tuvieron un diámetro promedio de aproximadamente 200 nm, medido por dispersión dinámica de luz.

C . Inserción de PEG La diestearil fosfatidiletanolamina (DSPE) se derivatizó con PEG, como lo describe Zalipski, 1992a. Las micelas PEG-DSPE se prepararon a partir de PEG-DSPE disolviendo 1 mM en agua y sometiendo a sonicación.

P1219/99MX Las micelas de PEG-DTP-DSPE, es decir 'PEG unido a DSPE por un enlace disulfuro escindible (compuesto XXV, preparado como se describe en el Ejemplo 5), se prepararon disolviendo 1 mM de PEG-DTP-DSPE en agua y sometiendo a sonicación. Los liposomas que contenían 2.5 por ciento molar de PEG-DSPE se prepararon añadiendo 140 µl de la suspensión micelar PEG-DSPE (1 µmol de lípido/ml) a 5.6 µmoles de lipido de los complejos lípido catiónico-plásmido. La suspención del complejo micelar se incubó por 5 minutos a temperatura ambiente con formación de torbellino suave para lograr la inserción de PEG-DSPE dentro de los liposomas catiónicos (Uster) . Esta formación de liposoma se indica en las Figuras 14A-14B como "PEG". Los liposomas que contenían 1 por ciento molar de PEG-DSPE y 1 por ciento molar de PEG-DTP-DSPE se prepararon como se describe antes para la composición liposomal de PEG-DSPE al 2.5%, excepto por el complejo liposoma catiónico-plásmido que se incubó con micelas de PEG-DSPE y PEG-DTP-DSPE para formar liposomas que tenían un recubrimiento superficial de cadenas de PEG, donde la mitad de las cadenas de PEG se unieron liberablemente a la superficie liposomal. La formación de liposomas está indicada en las Figuras 14A-14B como "PEG + R-PEG". Los liposomas que contenían 2.5 por ciento P1219/99MX molar de PEG-DTP-DSPE se prepararon como se describe antes, excepto por que el número total de PEG incluido fue PEG-DTP-DSPE. Esta formulación de liposomas se indica en las Figuras 14A-14B como "R-PEG".

D. Administración ±n vivo Los complejos de liposoma catiónico recubierto con PEG-plásmido se administraron a ratones BALB/c obtenidos de Simonsen Laboratories (Gilroi, CA) por inyección de aproximadamente 100 nmoles de lípido en 0.2-0.25 mi (aproximadamente 100 µg de plásmido) en la vena de la cola de 3 ratones. 5 minutos después de administración de los liposomas, se inyectaron 250 µl de cisteína 100 mM por la vena de la cola a cada uno de los ratones. 24 horas después de la inyección , los ratones se sacrificaron y los tejidos (pulmón, hígado) se recolectaron después de la perfusión con PBS heparinizado (4°C) bajo anestesia. Se añadió a una temperatura de 0.4°C, 0.75 mi de reactivo de lisis celular (Promega, Madison, Wl) a cada uno de los tejidos, y el tejido se homogeneizó por un 1 minuto a 20,000 rpm. El sobrenadante se retiró a un tubo de microcentrífuga y se centrifugó a 10,000 g por 5 minutos. El sobrenadante se recolectó para los ensayos de proteína y de luciferasa. 20 µl de cada muestra se midieron inmediatamente por un luminómetro (100 µl de luciferina y ATP que contenía regulador del P1219/99MX ensayo, medición de 10 segundos) . La unidad de luz relativa se normalizó por la cantidad de proteína en los extractos. Los resultados se muestran en las Figuras 14A-14B.

Ejemplo 10 Preparación de Liposoma Los liposomas fusogénicos se prepararon de acuerdo a los procedimientos estándar disolviendo en cloroformo los siguientes lípidos: 85 por ciento molar de diestearil fosfatidilglicerol (DSPG) , 10 por ciento molar de conjugado de copolímero-lípido preparado como se describe en los Ejemplos 2, 3 ó 4, 1 por ciento molar del ligando-PEG-DSPE, preparado como se describe en los Ejemplos 6 ó 7, y 4 por ciento molar de colesterol. Los lípidos se secaron como una película delgada por rotación bajo presión reducida. La película de lípido se hidrató por la adición de una fase acuosa para formar liposomas que se dimensionaron por sonicación o por extrucción secuencial a través de las membranas de policarbonato Nucleopore, con tamaños de poro de 0.4 µm, 0.2 µm, 0.1 µm y 0.5 µm para obtener liposomas de 100-150 nm de tamaño.

Ejemplo 11 Liposomas con Plásmido de ADN Atrapado Se condensó pGL3 plásmido de ADN (Promega P1219/99MX Corporation, Madison, Wl) con espermidina (base libre, Sigma Chemical Co (St Louis, MO) ) y después se atrapó en liposomas fusogénicos en la siguiente forma. Una solución reguladora Tris 10 mM, pH 7.5, que contenía espermidina 0.1 mM se preparó. Para 1 mi de la solución reguladora (14.52 µg espermidina), se añadieron 30 µg del plásmido a partir de una solución acuosa que contenía 0.6 µg de pGL3/µl. La solución plásmido-espermidina que contenía aproximadamente 2 µg de plásmido/µg de espermidina, se mezcló para formar moléculas simples condensadas de pGL3. La película lipídica seca se preparó como se describe en el Ejemplo 10, y después se rehidrató con la solución de plásmido-espermidina para formar liposomas fusogénicos que tienen atrapadas las moléculas de plásmido pGL3 condensadas. Aunque la invención se ha descrito con relación a las modalidades particulares, será evidente para aquéllos con pericia en este campo que pueden hacerse varios cambios y modificaciones sin apartarse del espíritu de la invención.

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Claims (38)

1. NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito el presente invento, se considera como una novedad y, por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes REIVINDICACIONES : 1. Una composición de liposoma para fusionarse con una membrana blanco, que comprende una suspensión de liposomas designadas para tener como blanco la membrana blanco, en donde cada liposoma (i) contiene un agente terapéutico atrapado en los liposomas, y (ii) está compuesto de lípidos formadores de vesículas, una porción de los lípidos está derivatizada por un copolímero dibloque compuesto de una cadena polimérica hidrofóbica unida covalentemente al lípido y una cadena polimérica hidrofílica, las cadenas hidrofóbica e hidrofílica están unidas por un enlace químicamente liberable para liberar las cadenas poliméricas hidrofílicas y exponer las cadenas poliméricas hidrofóbicas.
2. 2. La composición según la reivindicación 1, en donde los liposomas están compuestos además de lípidos formadores de vesículas que tienen una cadena polimérica hidrofílica unida a un lípido formador de vesículas mediante un enlace químicamente liberable.
3. 3. La composición según la reivindicación 1, en donde el enlace liberable es un enlace disulfuro o un enlace químico sensible al pH. P1219/99MX
4. 4. La composición según la reivindicación 1, en donde las cadenas poliméricas hidrofílicas están compuestas de un polímero hidrofílico seleccionado del grupo que consiste de: polivinilpirrolidona, polivinilmetiléter, polimetiloxazolina, polietiloxazolina, polihidro'xipropiloxazolina, polihidroxipropilmetacrilamida, po1imetacrilamida, polidimetilacrilamida, polihidroxipropilmetacriíato, polihidroxietilacrilato, hidroximetilcelulosa, hidroxietilcelulosa, polietilenglicol y poliaspartamida .
5. 5. La composición según la reivindicación 4, en donde las cadenas poliméricas hidrofílicas están compuestas de cadenas de polietilenglicol que tienen un peso molecular de entre 500-10,000 daltones.
6. 6. La composición según la reivindicación 1, en donde el polímero hidrofóbico se selecciona del grupo que consiste de: óxido de polipropileno, polietileno, polipropileno, policarbonato, poliestireno, polisulfona, óxido de polifenileno y politetrametilenéter .
7. 7. La composición según la reivindicación 6, en donde el polímero hidrofóbico es óxido de polipropileno que tiene un peso molecular de ente 500-3,000 daltones.
8. 8. La composición según la reivindicación 1, en donde el polímero hidrofóbico es un polímero lineal P1219/99MX efectivo para provocar ía hemolisis de las eritrocitos cuando un copolímero de tribloque _ soluble en agua que contiene al polímero hidrofóbico y a las cadenas poliméricas hidrofílicas unidas a los extremos opuestos de las cadenas poliméricas hidrofóbicas por enlaces disulfuro, se incuban con estas células y el incubado se trata con un agente reductor.
9. 9. La composición según la reivindicación 1, en donde los liposomas contienen, además, un ligando unido a un extremo distante de las cadenas poliméricas hidrofílicas, el ligando es efectivo para la unión específica al ligando con una molécula receptora en una superficie celular blanco, antes de la liberación química de las cadenas del polímero hidrofílico.
10. 10. La composición según la reivindicación 9, en donde el ligando se selecciona del grupo que consiste de: (i) folato, en donde la composición está destinada a tratar células tumorales que tienen receptores de folato de superficie celular, (ii) piridoxil, en donde la composición está destinada a tratar linfocitos CD4+ infectados con virus y (iii) sialil-Lewisx, en donde la composición está destinada para tratar una región de inflamación.
11. 11. La composición según la reivindicación 1, en donde los liposomas incluyen, además, un ligando unido a la superficie liposomal, el ligando es efectivo para unirse a una molécula receptora de la superficie P1219/99MX celular blanco después, y no antes, de la liberación química de las cadenas poliméricas hidrofílicas.
12. 12. La composición según la reivindicación 1, en donde los liposomas contienen, además, un lípido catiónico efectivo para impartir una carga positiva en la superficie liposomal y para mejorar el enlace de los liposomas con las células blanco después, y no antes, de la liberación química de las cadenas poliméricas hidrofílicas .
13. 13. La composición según la reivindicación 1, en donde el agente atrapado en las vesículas de lípido es un polinucleótido capaz de expresar una proteína seleccionada, cuando es absorbida por una célula blanco .
14. 14. La composición según la reivindicación 1, en donde el agente atrapado en los liposomas es un oligonucleótido o un análogo de oligonucleótido efectivo para la unión específica de secuencia con el ARN o ADN celular.
15. 15. Un método para suministrar un compuesto hacia células blanco en un sujeto, que comprende administrar en forma parenteral al sujeto, liposomas diseñados para llegar a las células blanco por el torrente sanguíneo, cada liposoma contiene al compuesto en forma atrapada y tiene un recubrimiento superficial externo de cadenas . poliméricas hidrofílicas químicamente liberables y poner en contacto los P1219/99MX liposomas en la célula blanco con un agente químico eficaz para liberar las cadenas que forman el recubrimiento superficial, exponiendo así a los polímeros hidrofóbicos sobre la superficie externa de liposoma para la interacción con las membranas celulares externas de las células blanco y promover la fusión de los liposomas con las células blanco.
16. 16. El método según la reivindicación 15, en donde las cadenas poliméricas hidrofílicas están unidas liberablemente a los liposomas mediante un enlace químico reducible, y el contacto incluye administrar al sujeto un agente reductor efectivo para liberar las cadenas .
17. 17. El método según la reivindicación 16, en donde el enlace químico es un enlace de disulfuro y el agente reductor se selecciona del grupo que consiste de cisteína, glutatión y ascorbato.
18. 18. El método según la reivindicación 15, en donde cada una de las cadenas poliméricas hidrofílicas está unida liberablemente al liposoma mediante un enlace químico sensible al pH, y el contacto incluye dirigir a los liposomas hacia un sitio que tiene un pH efectivo para liberar a las cadenas.
19. 19. El método según la reivindicación 18, en donde los liposomas tienen tamaños entre 0.03-0.40 µm de extravasación en un tumor sólido.
20. 20. El método según la reivindicación 15, en donde P1219/99MX los liposomas contienen, además, un ligando unido a un extremo distante de las cadenas poliméricas hidrofílicas, el ligando es efectivo para la unión específica del ligando con una molécula receptora sobre una superficie celular blanco, antes de la liberación química del recubrimiento polimérico hidrofílico.
21. 21. El método según la reivindicación 20, en donde el ligando se selecciona del grupo que consiste de: , (i) folato, en donde la composición está destinada a tratar células tumorales que tienen receptores de folato en superficie celular, (ii) piridoxil, en donde la composición está destinada a tratar linfocitos CD4+ infectados con virus y (iii) sialil-Lewisx, en donde la composición está destinada para tratar una región de inflamación.
22. 22. El método según la reivindicación 15, en donde los liposomas incluyen, además, un ligando unido a la superficie liposomal, el ligando es efectivo para unirse a una molécula receptora de la superficie celular blanco después, pero no antes, de la liberación química del recubrimiento de polímero hidrofílico.
23. 23. El método según la reivindicación 15, en donde los liposomas contienen, además, un lípido catiónico eficaz para impartir una carga positiva en la superficie liposomal, para mejorar la unión de los liposomas a las células blanco después, pero no antes, de la liberación química del recubrimiento de polímero P1219/99MX hidrofílico .
24. 24. Un método .para el tamizaje de un polímero hidrofóbico para la actividad fusogénica con una membrana blanco, que comprende: adicionar a una suspensión de células blanco, un copolímero tribloque compuesto de un segmento del polímero hidrofóbico que va a probarse y unido a cada uno de los extremos del segmento polimérico, a través de un enlace químicamente liberable, un segmento de polímero hidrofílico eficaz para solubilizar el segmento de polímero hidrofóbico en la suspensión, liberar los polímeros hidrofílicos para exponer los segmentos hidrofóbicos a las células blanco; y analizar la suspensión para determinar lisis de las células blanco.
25. 25. El método según la reivindicación 24, en donde las células blanco son eritrocitos .
26. 26. El método según la reivindicación 24, en donde el enlace liberable es un enlace de disulfuro y la liberación incluye añadir un agente reductor a la suspensión.
27. 27. El método según la reivindicación 24, en donde el polímero hidrofílico es polietilenglicol que tiene un peso molecular de entre 1,000 a 5,000 daltones.
28. 28. Un conjugado polímero-lípido que se utiliza en promover la fusión entre membranas blanco, P1219/99MX que comprende: un primer segmento compuesto de un polímero hidrofílico; un segundo segmento compuesto de un polímero hidrofóbico, el segundo segmento está unido al primer segmento por un enlace químicamente liberable; y unido al segundo segmento por un miembro de lípido formador de vesículas.
29. 29. El conjugado según la reivindicación 28, en donde una de las membranas blanco es una membrana bicapa de lípido liposomal.
30. 30. El conjugado según la reivindicación 29, en donde el conjugado se incorpora dentro de la membrana de lípido liposomal con el primero y el segundo segmentos orientados para extenderse desde la superficie de liposoma.
31. 31. El conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 28 a 30, en donde el segundo segmento es un homopolímero hidrofóbico.
32. 32. El conjugado según la reivindicación 31, en donde el homopolímero se selecciona del grupo que consiste de óxido de polipropileno, polietileno, polipropileno, policarbonato, poliestireno, polisulfona, óxido de polifenileno y politetrametilenéter .
33. 33. El conjugado según la reivindicación 31, en donde el polímero hidrofóbico es óxido de polipropileno que tiene un peso molecular de entre 500- P1219/99MX 3,000 daltones.
34. 34. El conjugado según la reivindicación 31, en donde el enlace es un enlace que contiene azufre.
35. 35. El conjugado según la reivindicación 31, en donde el enlace es sensible al pH o es susceptible a la tiólisis o hidrólisis.
36. 36. El conjugado según la reivindicación 31, en donde las cadenas poliméricas hidrofílicas están compuestas de un polímero hidrofílico seleccionado del grupo que consiste de: polivinilpirrolidona, polivinilmetiléter , polimetiloxasolina, polietiloxasolina, polihidroxipropiloxasolina, polihidroxipropilmetacrilamida, polimetacrilamida, polidimetilacrilamida, polihidroxipropilmetacriíato, polihidroxietilacrilato, hidroximetilcelulosa, hidroxietilcelulosa, polietilenglicol y poliaspartamida .
37. 37. El conjugado según la reivindicación 31, en donde las cadenas poliméricas hidrofílicas están compuestas de cadenas de polietilenglicol que tienen un peso molecular de entre 500-10,000 daltones.
38. 38. El conjugado según la reivindicación 31, que incluye, además, un ligando unido a un extremo distante de las cadenas poliméricas hidrofílicas, el ligando es efectivo para la unión específica de ligando con una molécula receptora sobre una superficie celular blanco . P1219/99MX