MXPA99000963A - Polipeptidos utiles como agentes inmunoterapeuticos y metodos de preparacion de polipeptidos - Google Patents

Abstract

Se proporcionan polipéptidos de fusión y agregados de polipéptidos que comprenden antígenos derivados de papilomavirus, y composiciones de los mismos y su uso, por ejemplo, con adyuvantes para propósitos inmunogénicos y de vacuna, y para inducir, por ejemplo, respuestas inmunes específicas para HPV. Los polipéptidos se pueden purificar para que resulten en agregados los cuales, cuando están en solución a dispersión, pueden pasar a través de un filtro de esterilización, y en agregados amorfos. Un ejemplo de tal polipéptido es una proteína de fusión de las proteínas L2 y E7 de papiloma virus humano.

Description

POLIPÉPTIDOS ÚTILES COMO AGENTES INMUNOTERAPÉUTICOS Y MÉTODOS DE PREPARACIÓN DE POLIPÉPTIDOS La presente invención se relaciona con preparaciones polipeptídicas HPV y con su uso en el tratamiento profiláctico o terapéutico de infección crónica por HPV. Métodos para preparar estas combinaciones, que incluyen técnicas de purificación de proteínas y la ingeniería genética de secuencia de ácido nucleico por técnicas de ADN recombinante con el fin de mejorar y obtener altos niveles de expresión de una proteína particular en células heterólogas, en particular células bacterianas E. coli, lo cual generalmente es aplicable en el campo de producción de proteínas y constituyen un aspecto adicional de la invención.

Los papilomavirus humanos (HPV) son agentes responsables de diversas lesiones benignas y malignas o cancerosas las cuales proliferan en la piel y superficies mucosas de los humanos. Genéticamente son un grupo diverso de ADN virus los cuales infectan tejido epitelial y pueden provocar una gama de enfermedades humanas diferentes. Se han REF. 29388 distinguido más de 60 tipos diferentes de HPV, en base en la extensión de hibridización cruzada entre sus genomas, y de estos, los diferentes subgrupos se asocian principalmente con diferentes tipos de enfermedades. Por ejemplo, los HPV de tipos 1, 2, etc., se asocian con verrugas cutáneas en las manos y los pies. Los HPV 5 y 8 se asocian con un trastorno raro, y epidermodisplasia verruciformis . Aproximadamente 20 tipos de HPV infectan la mucosa genital y se pueden dividir en dos subgrupos en base en la gravedad de la enfermedad con la cual están asociadas. El primer grupo incluye virus tales como HPV-6 y HPV-11 los cuales se asocian con la mayor parte de los condilomas benignos (verrugas), que incluyen verrugas genitales. El segundo grupo incluye a los HPV 16, 18, 31, 33 y 45, asociados con verrugas planas de la cervix y están involucrados en conversiones malignas que llevan a carcinomas del cervix uterino (zur Hausen, Cáncer Res. 49 (1989) pp. 4677-4681). Las enfermedades asociadas con HPV generalmente se caracterizan por proliferaciones benignas de tejido epitelial (verrugas) causado directamente por infección por el virus, los virus infectan las células básales no quelatinizadas del epitelio pero no pueden completar su ciclo de replicación en estas células. En vez de esto, la expresión del gen viral se limita a un conjunto de proteínas tempranas las cuales pueden inducir a la célula infectada a que prolifere, lo que da lugar a la verruga característica. Sin embargo, en las capas superiores de la verruga, las células infectadas benignas experimentan diferenciación terminal hacia su estado quelatinizado final, y esta diferenciación es suficiente para permitir que el virus complete su ciclo de replicación con la producción de proteínas virales y finalmente nuevas partículas de virus. Estas lesiones, aunque son proliferativas, son de bajo riesgo de conversión maligno y en la mayor parte de los casos las verrugas permanecen como benignas. Sin embargo, en algunos casos, durante un período de años, las células que presentan secuencias de HPV se pueden volver tumorigénicas. En este caso parece que la mayor parte del genoma del virus probablemente se pierde, y una porción residual de genoma, que habitualmente incluye a los genes E6 y E7 del virus se integran al genoma. Sin embargo, esta progresión a cáncer maligno se asocia principalmente con un grupo limitado de tipos de HPV, específicamente los HPV 16, 18, 31, 33, 35, 45 y en particular a los tejidos tales como la cervix y el pene. Se sabe que el sistema inmune puede jugar un papel en el control de la infección por HPV. Se sabe bien que la incidencia de verrugas cutáneas inducidas por HPV y enfermedades asociadas con HPV se incrementa en aquellas personas quienes reciben tratamiento inmunosupresor, lo que sugiere que en muchos casos la infección por el virus se mantiene bajo control por mecanismo inmunológicos. Evidencia adicional para la capacidad del sistema inmune para controlar la infección proviene de estudios de la regresión espontánea de verrugas. Una observación común es que en algunos individuos con verrugas genitales las verrugas desaparecen súbitamente. Tales verrugas regresivas se han estudiado histológicamente, lo que revela un flujo de entrada sustancial de linfocitos T en las lesiones. Se considera que la lesión está mediada por el sistema inmune. Se piensa que las respuestas inmunes efectivas contra las infecciones por HPV son mediadas principalmente por células puesto que la enfermedad puede persistir en individuos con anticuerpos séricos contra HPV. Además, se sabe que la regresión espontánea de las verrugas con frecuencia es acompañada por infiltración linfocítica, comezón, enrojecimiento del área afectada y otros síndromes característicos de reacciones inmunes mediadas por células. Las infecciones por HPV también son comunes en pacientes con inmunidad celular dañada, en donde la persistencia de enfermedad viral sugiere una vigilancia inmune pobre. Los estudios respecto a la regresión de enfermedades asociadas con papilomavirus en modelos animales vacunados también apoyan el concepto de un efector inmune para combatir la enfermedad. Por ejemplo, ganado vacunado contra papilomavirus bovino (BPV) produce anticuerpos que se reporta no son neutralizantes, aunque la vacunación con una proteína de fusión comprende secuencias de BPV L2 y secuencias diferentes de HPV (betagalactosidasa) se ha demostrado que producen respuestas tanto profilácticas como terapéuticas en estos animales: (véase WO 93/00436, de Cáncer Research Campaign Technology Limited: Jarrett et al., y Jarrett et al., Virology, 184 (1991) pp. 33-42) . El uso de proteínas de HPV tales como Ll, L2 en la preparación de vacunas se conoce, por ejemplo, a partir de WO 93/02184 (Univ of Queensland & CLS Ltd: I Frazer et al.: Papilloma Virus vaccine) . Se han descrito otras proteínas de HPV para uso en inmunodiagnóstico, por ejemplo, en WO 91/18294 (Medscand AB: J Dillner et al.: Synthetic peptides of various human papillomaviruses, for diagnostic immunossay) ; y en EP 0 373 555 (Medgenix: G De Martynoff et al: Peptides, antibodies against them, and methods for detection and dosage of papilloma virus) . El documento EP 0 456 197 (1991) (Behringwerke: C Bleul et al) describe péptidos con uno o más epitopos serorreactivos de secuencia definida a partir de proteínas de HPV 18 El, E6 y E7. El documento EP 0 451 550 (1991) (Behringwerke: M Mueller et al) describe péptidos con uno o más epitopos serorreactivos de secuencia definida a partir de proteínas HPV 16 E4, E6, E7 o Ll. Las descripciones son con propósitos de prueba de selección y también mencionan el uso de vacunas. El documento 93/00436 (Cáncer Research Campaign Technology: WFH Jarrett et al) describe proteínas de papiloma virus y fragmentos relacionados con la proteína L2 para profilaxis y terapia de tumores de papilomavirus, y también menciona la preparación de la proteína E7. El documento WO 92/16636 (Immunology Ltd: MEG Boursnell et al) describe secuencias genéticas de HPV 16 y HPV 18 E6 y E7 como genes fusionados insertados en un vector de virus de vaccinia recombinante, lo que provoca expresión in vivo de antígenos después de la administración del vector de virus vivo. El documento WO 92/05248 (Bristol-Myers Squibb: EK Thomas et al) propone materiales para inhibir y tratar infección y transformación celular de papilomavirus humanos, mencionando células recombinantes (que incluye a vectores virales) que contienen un gen que codifica para un péptido que corresponde sustancialmente con una región del producto de gen E6 y/o E7 o un compuesto peptídico quimérico de una o más regiones de proteínas de HPV. CP Crum et al., Virology 178 (1990) pp. 238-246, describe la expresión de secuencias de partes fusionadas de HPV-16 Ll y E4, y el uso de proteínas con adyuvante completo de Freund para inmunizar conejos para elaborar antisueros para diagnóstico o para otros propósitos de prueba.

La presente invención proporciona polipéptidos de fusión y agregados de polipéptidos que tienen antígenos derivados de papilomavirus, como se describe de manera más particular en lo siguiente, y composiciones de los mismos y su uso para propósitos inmunogénicos y de vacunas para inducir respuestas inmunes específicas contra papilomavirus. También se proporcionan métodos para producir, tratar y purificar tales polipéptidos y composiciones, como se describe en lo siguiente. De acuerdo con la invención, se proporcionan polipéptidos y composiciones polipeptídicas que comprenden un determinante antigénico de una proteína de papilomavirus, en forma agregada la cual, cuando está en solución o dispersión, puede pasar a través de un filtro de esterilización, o en una forma agregada amorfa. La invención también proporciona polipéptidos de fusión que se combinan con antígenos derivados de virus de papiloma, por ejemplo, desde cada uno de por lo menos dos proteínas de papilomavirus diferentes, por ejemplo, que comprende: (a) por lo menos un determinante antigénico de una proteína L2 de papilomavirus, y (b) por lo menos un determinante antigénico que se selecciona de las proteínas de papilomavirus El, E2, E4, E5, E6 y E7 y proteinas de papilomavirus L2 de un tipo de papilomavirus diferente al del inciso (a) . Los polipéptidos de fusión adicionales proporcionados en la presente comprenden determinantes antigénicos de por lo menos dos proteínas de papilomavirus seleccionados de proteínas de papilomavirus El, E2, E4, E5, E6 y E7, por ejemplo, en donde las proteínas son de diferentes tipos de papilomavirus. Los polipéptidos y composiciones particularmente preferidos del mismo comprenden determinantes antigénicos de proteínas de papilomavirus humano, por ejemplo HPV tipo 6, 11, 16 y 18. Los determinantes antigénicos de proteínas de otros tipos y proteínas de HPV de papilomavirus animales no humanos también pueden ser elaborados y utilizados. Con mayor detalle, la invención proporciona, por ejemplo, polipéptidos que comprenden determinantes antigénicos de cada uno de por lo menos dos proteínas de HPV diferentes. Un determinante antigénico de una proteína de papilomavirus puede ser representada y proporcionada, por ejemplo, en relación con la invención ya sea por la secuencia completa de la proteína de papilomavirus relacionada, o por tales subsecuencias, según se desee, por ejemplo, un fragmento de secuencia que comprende por lo menos 25%, por lo menos 50% y 75% de la secuencia completa de la proteína relacionada, por ejemplo, el fragmento de secuencia en la parte N terminal o la parte C terminal. Las secuencias se pueden tomar de aislados clínicos de papilomavirus o de secuencias publicadas o proteínas de las mismas. Las proteínas de HPV, de las cuales los determinantes antigénicos pueden formar parte de tal polipéptido de fusión, se pueden seleccionar, por ejemplo, de las proteínas Ll, L2, El, E2, E4, E5, E6 y E7. Por ejemplo, se pueden utilizar proteínas de tipo de papilomavirus (humano) HPV 6, 11, 16 y 18, así como de otros tipos de papilomavirus humanos o animales.

Por lo tanto, los determinantes antigénicos de por lo menos dos proteínas de papilomavirus pueden ser L2 y otra, y/o E7 y otra. En ejemplos particulares, el polipéptido puede comprender por lo menos un determinante antigénico de cada uno de por lo menos dos proteínas diferentes de papilomavirus y del mismo tipo o de tipos diferentes de papilomavirus. Por ejemplo, por lo menos una de las proteínas se puede seleccionar de Ll o L2 y/o por lo menos una de las proteínas se puede seleccionar de El, E2, E4, E5, E6, y E7. En particular, los ejemplos de la invención proporcionan un polipéptido que comprende un determinante antigénico de proteína L2 de HPV y un determinante antigénico de proteína de E7 de HPV, que comprende adecuadamente, por ejemplo, una proteína L2 y/o E7 de longitud sustancialmente completa de HPV, o fragmentos antigénicos o proteínas de la misma. Una proteína de fusión que comprende a las proteínas L2 y E7 de HPV puede comprender un fragmento de secuencia de por lo menos 50% de la secuencia completa de cada una de las proteínas L2 y E7, por ejemplo, sustancialmente la secuencia completa de L2 y de E7 : opcionalmente puede incluir además una secuencia de la proteína Ll. El polipéptido puede incluir además determinantes antigénicos de otras proteínas de HPV o puede estar en mezcla o agregado con otras proteínas de HPV o con fragmentos de proteínas, tales como Ll y otro miembro o miembros de la serie L o E de las proteínas codificadas por papilomavirus. El polipéptido puede comprender una sola proteína que consiste de una fusión de L2 y E7 o una fusión de L2, E7 y Ll.

Alternativamente, el polipéptido puede comprender una proteina de fusión L2-E7 combinada con proteína Ll para aplicación profiláctica o terapéutica. El polipéptido puede comprender una molécula de fusión o se puede derivar de polipéptidos individuales acoplados o agregados juntos. Las formas solubles o solubilizadas del polipéptido se encuentran dentro del alcance de la invención. En ciertas modalidades el polipéptido se puede acoplar por reticulación química, de una manera conocida per se, por ejemplo, por técnicas estándar que involucran unión covalente, por ejemplo, a residuos tiroxina expuestos o a los grupos amino epsilon de residuos lisina o los grupos carboxilos de residuos aspartato y glutamato. Sin embargo, las modalidades preferidas son proteínas de fusión, cada una resulta de la expresión en una célula huésped recombinante de una secuencia de polinucleótidos en la cual una parte codifica una parte o la totalidad de la secuencia de aminoácidos de una primera proteína de papilomavirus, y otra parte codifica para parte o la totalidad de la secuencia de aminoácidos de una segunda proteína de papilomavirus. En particular, la invención proporciona, por ejemplo, un polipéptido que comprende un determinante antigénico desde cada uno de por lo menos dos proteínas de papilomavirus diferentes, en una forma agregada la cual, cuando está en solución o dispersión, puede pasar a través de un filtro de esterilización, por ejemplo, un filtro con tamaño de poro en el intervalo de 0.16-0.22 micrómetros, por ejemplo 0.2 micrómetros . Se puede ver que la invención proporciona, por ejemplo, un polipéptido que comprende un determinante antigénico de cada uno de por lo menos dos proteínas diferentes de papilomavirus, por ejemplo, L2 o Ll y por lo menos otra de Ll, L2, El, E2, E4, E5, E6 y E7, en una forma reagregada que, cuando está en solución o dispersión, puede pasar a través de un filtro de esterilización, por ejemplo un filtro con un tamaño de poro en el intervalo de 0.16-0.22 micrómetros, por ejemplo de 0.2 micrómetros. Las formas adecuadas de preparación pueden resultar, por ejemplo, por desnaturalización o desnaturalización con reducción, por ejemplo, con reagregación subsecuente de un polipéptido el cual puede ser una proteína de fusión u otra proteína de papilomavirus, por ejemplo, una proteína de papilomavirus única, expresada en forma de cuerpos de inclusión en una célula huésped recombinante. Tal forma puede ofrecer la ventaja de que puede ser purificada de manera relativamente fácil, por ejemplo, para uso como vacuna. Las preparaciones agregadas alternativas de los polipéptidos no necesitan ser filtrables para esterilizarlas y se pueden preparar y purificar por técnicas asépticas. Los polipéptidos agregados o reagregados como se describen en la presente pueden tener, por ejemplo, masas en el intervalo de aproximadamente 100,000, por ejemplo 160,000 a 10,000,000 de unidades dalton. El peso molecular de un dímero de L2E7 puede ser de aproximadamente 130,000. Los agregados pueden tener diámetros, por ejemplo, al microscopio electrónico en el intervalo de aproximadamente 4 a 50 nm, por ejemplo 10 a 15 nm. Un ejemplo de un polipéptido proporcionado por la invención como se describe con detalle en el ejemplo a continuación contiene un polipéptido de fusión L2E7 reagregado que contiene agregados de aproximadamente 500,000 unidades dalton, de aproximadamente 10-15 o 15-20 nm de diámetro al microscopio electrónico, con aproximadamente 7-10, por ejemplo, aproximadamente 8 cadenas de polipéptidos de fusión L2E7 por agregado. Más generalmente, el producto puede tener aproximadamente 2 a 200, por ejemplo 5-50 cadenas por partícula agregada, y las preparaciones de agregado pueden comprender partículas con un intervalo de tamaño de partícula dentro de la composición. La reagregación adecuada es obtenible, por ejemplo, como un resultado de remoción lenta o gradual de urea y agente reductor diol (con frecuencia por ejemplo ditiotreitol, u otro agente reductor tiol aceptable tal como glutation) a partir de una preparación desnaturalizada y reducida del polipéptido de fusión en urea (por ejemplo urea aproximadamente 8 M) y el agente reductor tiol, por ejemplo aproximadamente ditiotreitol 10 mM (preferiblemente disminuido a aproximadamente 0.1 mM o menos, por ejemplo, aproximadamente 0.04 mM o menos en el producto reagregado) . Tal remoción gradual puede resultar, por ejemplo, del procedimiento de cromatografía en columna descrito con detalle en lo siguiente. La preparación desnaturalizada y reducida del polipéptido de fusión se puede obtener, por ejemplo, por subilización en urea y agente reductor tiol, de los cuerpos de inclusión inicialmente insolubles como se producen por la expresión de los polipéptidos en un sistema E. coli T7. Tales productos agregados solubles o dispersos con frecuencia son amorfos y carecen de proteína Ll, y de otra manera son distintos de partículas similares a virus basadas en proteína Ll de papilomavirus (y algunas veces incluyen otras proteinas de papilomavirus) como se reporta que resultan de la expresión de genes de HPV (que incluyen Ll) en sistemas tales como, por ejemplo, baculovirus recombinante en células de insectos o en células de levadura. Por ejemplo, no se han descrito partículas similares a virus que hallan experimentado desnaturalización solubilizante y reducción con tiol, seguida por reagregación. Los polipéptidos mencionados en lo anterior adecuadamente se pueden preparar utilizando técnicas de ADN recombinante. Por lo tanto, la invención también proporciona ácidos nucleicos los cuales codifican para los polipéptidos mencionados antes, clonación y vectores de expresión lo que los incorporan y partes de los mismos, y células huésped transfectadas y traducidas que incorporan tales ácidos nucleicos y que son capaces de expresarlos como proteínas. En un ejemplo preferido, el ácido nucleico comprende un gen de fusión que comprende, por ejemplo, los genes L2 y E7 aislados, por ejemplo, de un aislado de HPV-6 obtenido de una muestra clínica de verruga genital.

Preferiblemente, los polipéptidos descritos en lo anterior se preparan por expresión del ácido nucleico en un huésped procariótico o eucariótico utilizando técnicas de ADN recombinante. Específicamente, un ácido nucleico el cual codifica para el polipéptido deseado se incorpora en un sistema de vector adecuado tal como un marco de lectura abierta adecuado con cualquier secuencia accesoria adecuada para su expresión en un sistema elegido. La célula huésped se transforma con el vector. Las células huésped transformadas después se cultivan y el polipéptido deseado se aisla del cultivo, ya sea del sobrenadante o de las células, como en los ejemplos proporcionados posteriormente. Los vectores mencionados antes, así como las células huésped transformadas forman un aspecto adicional de la invención. La expresión de polipéptidos proporcionada por la invención se ha examinado en sistemas de expresión de levadura y baculovirus, los cuales se ha reportado previamente que permiten la expresión de genes derivados de HPV. Se ha encontrado que en ambos casos es posible obtener expresión de una molécula de longitud completa, pero las concentraciones de expresión algunas veces son bajas. Actualmente se prefiere, con fines de optimización de las concentraciones de expresión, utilizar sistema de expresión de huéspedes procarióticos (particularmente un sistema de E. coli T7) en vez de los dos sistemas eucarióticos probados (levaduras o baculovirus) . Los polipéptidos inmunogénicos y las composiciones de vacuna proporcionadas en la presente son útiles para inducir respuestas inmunes específicas para HPV, por ejemplo, como vacunas para profilaxis o terapia de condiciones asociadas con papilomavirus. Los inmunógenos, por ejemplo, vacunas inmunoterapéuticas o profilácticas para uso en la profilaxis o tratamiento de enfermedades asociadas a HPV pueden ser utilizadas para generar respuestas inmunes, por ejemplo respuestas que involucran inmunidad celular capaz de mediar la regresión de infecciones crónicas de HPV que incluyen verrugas genitales (especialmente en donde los productos y las infecciones se basan en HPV de los tipos 6 y/u 11) o neoplasia intrapitelial cervical (especialmente en donde los productos y las infecciones se basan en HPV de los tipos 6 y/o 18) en pacientes infectados. Tales respuestas inmunes pueden ser dirigidas hacia células T, por ejemplo células CD4+, por ejemplo, mediante el uso de adyuvantes apropiados. Por lo tanto, la invención proporciona además un método para prevenir o tratar infección por HPV o lesiones asociadas con el mismo, método el cual comprende administrar a un paciente una cantidad efectiva de un polipéptido como se describe en la presente.

Las modalidades proporcionadas por la invención incluyen preparaciones de vacuna basadas en polipéptido como se menciona en la presente, las cuales, de acuerdo con la especificidad, están diseñadas para uso en la inducción de respuestas inmunes a papilomavirus, particularmente por ejemplo de papilomavirus de tipos HPV 6 y 11, y de los tipos HPV 16 y 18 para uso en profilaxis y terapia de verrugas genitales en humanos y de neoplasia intrapitelial cervical. Se ha observado reactividad cruzada entre los HPV de tipos diferentes y, de acuerdo con tal reactividad cruzada observable, los polipéptidos y vacunas producidas por la presente se pueden utilizar para inducir respuestas inmunes útiles contra tipos de papilomavirus diferentes a los tipos de los cuales se derivan. La invención proporciona composiciones inmunogénicas de los polipéptidos mencionados antes, adecuadas para administración por inyección, que comprende un portador tal como un adyuvante inmunológico. En ciertos ejemplos preferidos el adyuvante comprende hidróxido de aluminio y/o monofosforillípido A como se describe más particularmente en lo siguiente. Tales composiciones inmunogénicas, por ejemplo, para uso como una vacuna terapéutica o profiláctica en humanos o en animales no humanos, puede comprender un complejo de absorción que comprende "alúmina" (es decir, hidróxido de aluminio, habitualmente AlhydrogelMR o Rehydrogel M? como se utiliza convencionalmente en adyuvantes de vacuna) que tenga absorbido sobre el mismo un polipéptido obtenible como se mencionó en lo anterior. El complejo de absorción puede ser un complejo binario que consiste de la alúmina y el polipéptido o puede haber constituyentes adicionales, por ejemplo, MPL como se describe en lo siguiente, elaborando, por ejemplo, un complejo ternario de MPL, alúmina y polipéptido. El polipéptido, ya sea soluble o agregado, puede ser utilizado como una vacuna directamente o se puede administrar como una composición farmacéutica que también comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable, amortiguador, adyuvante u otro material aceptable. Por lo tanto, la invención proporciona además una vacuna o composición farmacéutica la cual comprende un polipéptido como se describe en lo anterior en combinación con un portador o excipiente adecuado. El polipéptido puede ser un monómero soluble, por ejemplo, L2E7, o un agregado polipeptídico. Preferiblemente el polipéptido, por ejemplo, una proteína de fusión L2E7 se formula al combinarse con un adyuvante u otra sustancia accesoria tal como una molécula inmunoestimuladora con el fin de mejorar su efecto como un antígeno terapéutico, y también para estimular un tipo preferido de respuesta inmune en el paciente receptor. Los adyuvantes útiles incluyen, pero no se limitan a: hidróxido de aluminio ("alúmina") por ejemplo en forma de AlhydrogelMR o Rehydrogel^; 3D-MPL (monofosforillípido A 3-desacilado) , por ejemplo, como se describe en el documento US 4,912,094 (Ribi I munochem Research: KR Myers and AT Truchot: que describe adyuvantes basados en lipopolisacáridos modificados de monofosforillípido A des-3-0-acilo) el cual se puede aplicar, por ejemplo, como se describe en el documento US 4,912,094 o en la especificación WO 94/21292 (Smithkline Beecham: P Houser et al: Vaccine compositions containing 3-0-deacylated monophosphoryl lipid A) . Cuando se utilizan tanto alúmina como MPL, la proteína preferiblemente se absorbe primero en alúmina y después se agrega MPL. También se pueden utilizar diésteres de trealosa tales como dimicolato de trealosa; saponinas y sus derivados tales como Quil A o QS-21, como por ejemplo, las descritas en las especificaciones WO 88/09336 (Cambridge Bioscience: CA Kensil et al: adyuvante de saponina) y WO 93/05789 (Cambridge Biotech: CA Kensil et al: conjugados de saponina-antígeno) ; ISCOMS o matrices de ISCOM, como por ejemplo las descritas en las especificaciones WO 90/03184 (B Morein et al: matriz Iscom con actividad inmunomoduladora, que comprende lípido y opcionalmente también adyuvantes) y WO 92/21331 (kabi Pharmacia AB: B Morein et al: portadores farmacéuticos que compren esterol y saponina) ; o dipéptido de muramilo, o toxina B de cólera. Las moléculas accesorias o inmunoestimuladoras adicionales útiles en esta invención incluyen citocinas tales como interleucinas que incluyen, pero no se limitan a GM-CSF, IL-3, IL-2, IL-12 y IL-7. Tales adyuvantes y/o sustancias accesorias adicionales pueden ser utilizadas por separado o en combinaciones según se desee. Las composiciones farmacéuticas tales como las vacunas proporcionadas en la presente puede ser, por ejemplo, emulsificadas en un mineral aceptable o un aceite de hidrocarburo, que incluye pero que no se limitan a escualeno o aceites minerales biodegradables como se describe en las especificaciones WO 91/00106 y WO 91/00107 (SEPPIC: B Bracq et al: que describe emulsiones de fase múltiple inyectables y vectores de emulsión con fase oleosa continua) ; o encapsulados, por ejemplo, por encapsulación en micropartículas biodegradables o liposomas o en vesículas tensoactivas no iónicas: para estas técnicas véanse respectivamente por ejemplo las especificaciones WO 94/27718 (DT O'Hagan et al: micropartículas que contienen antígenos atrapados y su uso en inmunización) y WO 93/19781 (PCT/GB93/00716) (Proteus Molecular Design: J Alexander et al: vacunas que contienen vesículas de tensoactivo no iónico, con antígeno atrapado) . Los polipéptidos se pueden suministrar para propósitos terapéuticos o profilácticos. Las rutas y procedimientos de administración incluyen, pero no se limitan a vías y procedimientos estándar intramuscular, subcutáneo, intradérmico, intravenoso, oral o rectal.

La cantidad de polipéptidos administrados se puede elegir de acuerdo con la formulación y la condición que se va a tratar. Generalmente se espera que la dosis se encuentren entre 1-2000 µg de la proteína, preferiblemente 10-300 µg, por ejemplo 10-250 µg. Las cantidades óptimas se pueden determinar fácilmente en los sujetos. Se pueden administrar a intervalos una o más dosis de la vacuna (véase por ejemplo, el ejemplo 13) . Este régimen puede ser optimizado fácilmente en los sujetos . Alternativamente, se puede incorporar un ácido nucleico que codifique para el polipéptido dentro de un vector de virus recombinante adecuado y se puede introducir en un organismo huésped, tal como un humano, con el fin de que la expresión del ácido nucleico pueda producir el polipéptido ¿D. situ. Los ejemplos de virus adecuados para uso como bases de vectores de virus recombinantes de esta manera son, por ejemplo, virus como se describe en WO 92/05263 (Immunology Ltd: SC Inglis et al) y WO 92/16636 (Immunology Ltd: MEG Boursnell et al) . Las vacunas que contienen polipéptidos relacionados con HPV como se describe en la presente pueden activar una gama amplia de respuestas inmunes específicas para HPV. Tales respuestas inmunes pueden incluir: anticuerpos específicos, que incluyen anticuerpos neutralizantes para HPV 6 y HPV 11, inmunidad celular mediada que incluye respuestas linfoproliferativas específicas para HPV 6 y HPV 11, respuesta de hipersensibilidad de tipo retardado, células T citotóxicas y producción de citocina. En el curso de preparar un vector adecuado para expresión del polipéptido de la invención, los solicitantes han preparado una técnica la cual mejora y obtiene un alto nivel de expresión de un polipéptido particular en células heterólogas, en particular células bacterianas E. coli. Por lo tanto, en un aspecto adicional, la invención proporciona un método para preparar un polipéptido recombinante, método el cual comprende expresar en una célula bacteriana una células de ácido nucleico la cual codifica para el polipéptido deseado pero el cual ha mutado de manera que los codones o grupos de codones los cuales causan terminación prematura de transcripción o traducción han sido sustituidos por codones degenerados. En particular, los solicitantes han encontrado que en el sistema de expresión T7 de E. coli, la incidencia de terminación prematura de transcripción o traducción se puede evitar efectivamente o se puede reducir por remoción de por lo menos una secuencia poli-T tal como [TTT]n en donde n es 2 o más, por ejemplo, al sustituir tal secuencia con una alternativa adecuada, por ejemplo, una secuencia [TTC]n la cual codifica para los mismos aminoácidos, lo que lleva a un mayor rendimiento del polipéptido deseado.

En los sistemas de expresión bacteriana tales como el sistema T7, los polipéptidos recombinantes se encuentran en agregados insolubles o "cuerpos de inclusión" (IB) dentro de la célula. Los solicitantes han establecido una técnica mejorada para recuperar los polipéptidos recombinantes. Por lo tanto, en un aspecto adicional de la invención se proporciona un método para recuperar un polipéptido recombinante a partir de un cuerpo de inclusión dentro de una célula huésped procariótica, tal método comprende someter una suspensión que comprende cuerpos de inclusión junto con material no deseado, por ejemplo residuos de células rotas, para filtración de flujo cruzado y recuperación del polipéptido recombinante a partir de cuerpos de inclusión separados del mismo. Esta técnica tiene el efecto combinado de separar los cuerpos de inclusión presentes en un homogeneizado celular de otros residuos celulares y al mismo tiempo lavarlos, por lo que se proporciona un grado útil de purificación. En una modalidad preferida de este proceso, los cuerpos de inclusión separados posteriormente se solubilizan in situ y el polipéptido se recupera de la solución. Los ejemplos de reactivos solubilizantes incluyen urea y mezclas de urea y ditiotreitol y otro agente reductor sulfidrilo, por ejemplo, a una concentración de aproximadamente 8M-10M. Puede ser particularmente conveniente llevar a cabo filtración de flujo cruzado de una suspensión sin tratar que resulte de la ruptura de células huésped que contenga el polipéptido expresado deseado en forma de cuerpos de inclusión, en dos etapas en el mismo aparato de filtración, una primera etapa en la cual los cuerpos de inclusión deseados se retienen y lavan en el retenido del filtro bajo condiciones no solubilizantes, y una segunda etapa en la cual los cuerpos de inclusión se ponen en contacto con un líquido solubilizante y se recolectan en un filtrado en tal líquido (por ejemplo en urea 8-10M opcionalmente con un reductor de sulfidrilo tal como ditiotreitol) . La remoción del solubilizante y la reagregación pueden seguirse de manera útil. Un ejemplo particular de una preparación de proteína de la invención puede comprender una proteína de fusión que comprende las proteínas L2E7 basadas en HPV-6. La proteína se expresa adecuadamente en células E. coli, se purifica a homogeneidad y después se formula con un adyuvante, por ejemplo alúmina. La preparación puede ser de uso en el tratamiento de verrugas genitales y puede formularse de manera que esté en una forma adecuada para administración por inyección parenteral al paciente receptor. La invención se describe adicionalmente a continuación a modo de ejemplo con referencia a los dibujos diagramáticos anexos, en los cuales: la figura 1 muestra una secuencia de nucleótidos para un vector que expresa una proteína de fusión L2E7 de HPV, de acuerdo con una modalidad de la invención; las figuras la y lb muestran secuencias del vector que precede al codón de inicio y que sigue al codón de retención en la secuencia de la figura 1; la figura 2 muestra una secuencia de aminoácidos correspondiente; y la figura 3 ilustra un procedimiento de purificación de proteína para uso de acuerdo con una modalidad de la invención en la purificación de la proteína de fusión L2E7 de las figuras 1 y 2. Los solicitantes han aislado ciertos genes de HPV, en particular los genes para Ll, L2 y E7 del virus HPV-6. Se han utilizado las secuencias de genes como se describe en la presente para construir fusiones de genes para expresión de proteína de HPV-6 a altos niveles en sistemas procarióticos y eucarióticos . Para este propósito se han construido vectores plasmídicos para la expresión de los polipéptidos descritos en lo anterior, tales como HPV-6, L2 y E7 como una sola proteína de fusión en E. coli. Los genes de virus HPV-6 fueron amplificados en reacción en cadena de polimerasa (PCR) a partir de una muestra de ADN viral preparada a partir de un solo aislado clínico de tejido de verruga infectado con HPV-6. Los genes aislados fueron utilizados para construir un cásete de fusión de genes para la expresión de proteína derivada de HPV-6 en sistema heterólogo. Se realizaron numerosas modificaciones del constructo del gen con el fin de mejorar el proceso de producción. Las modificaciones particularmente útiles fueron las siguientes: 1. Introducción de una secuencia líder ("líder pelB") en la parte N terminal de la secuencia de proteína codificada con el fin de mejorar la expresión de la proteína en células E. coli (pero no para dirigir la expresión al periplasma) . 2. La introducción de una secuencia ("His-Tag") en la parte C terminal de la secuencia de proteína codificada con el fin de permitir la purificación de la proteína por cromatografía de quelación de metales. 3. Mutación de tensiones o trayectos de residuos de timidina para erradicar secuencias implicadas en la terminación prematura de transcripción del gen de fusión. La mutación afecta únicamente a la secuencia de ADN del constructor genético, pero no afecta la secuencia de la proteína codificada, puesto que involucra la mutación de la tercera posición degenerada en el codón. Se ensayan constructos por transcripción y traducción de los marcos de lectura abierta de proteína, in vitro. En el caso de la proteína de fusión L2E7 de HPV-6, se examinaron tanto la proteína de longitud completa (80 kD) como el producto de proteína truncada (70 kD) cuando se utilizó un constructo de fusión genético de L2E7 de HPV-6 in vitro, y este patrón se repitió in vivo. La apariencia de una forma truncada de la proteína objetivo se correlacionó con la presencia en la secuencia de L2 de HPV-6 de una secuencia grande de residuos timidina (T) . También se identificó una segunda región rica en T que contiene 6 residuos timidina. Estas regiones se sometieron a mutagénesis in vitro utilizando oligonucleótidos los cuales alteraron la secuencia de ADN pero no la secuencia de aminoácidos de las proteína L2 de HPV-6. El gen de fusión L2E7 de HPV-6 mutado se subclonó en un vector de expresión plasmídico que impulsa la expresión de las secuencias clonadas a partir de un promotor T7 de bacteriófago (sistema de expresión pET Novagen) . El constructo plasmídico obtenido, designado pGW53, elegido para expresión de L2E7 de HPV-6, codifica una secuencia líder hacia el extremo 5', pelB, los ORF de L2E7 de HPV-6 y una secuencia hacia el extremo 3' que codifica 6 residuos histidina (His Tag) "en marco" con la parte C terminal de la proteína de fusión de HPV-6.

Figuras 1-2 : Los datos de secuencias en las figuras 1 y 2, indican sin limitación, un nucleótido y una secuencia de aminoácidos codificada de un ejemplo preferido de la proteína de fusión L2E7 producida por las técnicas descritas en la presente, que incluye un líder hacia el extremo 5' y una secuencia etiqueta hacia el extremo 3'. La secuencia líder, así como la secuencia etiqueta (aminoácidos 591-601) se puede omitir, si se desea. Las figuras la y lb muestran secuencias no codificantes en el vector de expresión T7 preferido, el cual precede al codón de inicio y sigue al codón de detención en la figura 1. La figura 2 muestra la secuencia de la proteína de fusión preferida de L2 y E7. En la secuencia de ADN de 1827 pares de bases, las posiciones 7 a 1812 (inclusive el codón de detención) codifica para una proteína de fusión L2E7 y las etiquetas. Las regiones de secuencia que corresponden a L2 y E7 en las figuras 1-2 se ha encontrado que incorporan algunas diferencias por comparación con las secuencias de aminoácidos separados publicadas de L2 y E7. Las diferencias son como sigue (con referencia primero a un residuo aminoácido en la numeración de secuencia de las figuras 1-2 en la presente, y después al aminoácido (diferente) en la posición correspondiente de la secuencia publicada) : 105 Gl y Gln en la secuencia publicada; 215 He fue Val; 230 He fue Val; 373 Glu fue Asp; 381 Lys fue Glu; 386 Asp fue Gly; 422 He fue Leu; 544 Tyr fue Phe. Además se encontraron algunas diferencias "silenciosas" en la secuencia de polinucleótidos, es decir, diferencias que no llevan a ninguna diferencia en la secuencia de aminoácidos traducida. Se considera que éstas no tienen significado para la presente invención. Dos mutaciones silenciosas, de TTTTTT a TTCTTC, producidas por razones como se discute en el presente texto, se localizan en las posiciones de aminoácidos 83-4 y 483-4. Una proteína de fusión expresada con la correspondencia precisa con las secuencias publicadas, e incorporada en composiciones como se describe en la presente tendría una elevada reactividad cruzada con la proteína de fusión L2E7 preferida mostrada en las figuras 1 y 2 e induciría respuestas inmunes similares equivalentes o de alta reactividad cruzada . También sería de funcionalidad similar las proteínas de fusión L2E7 derivadas de las secuencias de otros aislados clínicos de HPV: tales aislados adicionales del ambiente clínico posiblemente presenten discrepancias de secuencia en comparación con las secuencias proporcionadas en la presente, pero se espera que no sean significativas para el funcionamiento de la invención. Si se desea, cualquier discrepancia encontrada en un aislado clínico particular puede ser eliminada fácilmente, por ejemplo, mediante mutagénesis específica para el sitio de los vectores de clonación correspondientes preparados a partir de los mismos. El constructo de gen obtenido como se describe en la presente se inserta en un sistema de expresión optimizado para expresión a alto nivel de proteínas heterólogas en células E. coli. Este sistema de expresión se basa en el crecimiento de células E. coli hasta una densidad significativa, seguido por inducción de la polimerasa T7 dentro de las células, lo cual lleva altas concentraciones de transcripción del constructo del gen. El producto proteínico el cual después se expresa y acumula dentro de los cuerpos de inclusión en el interior de las células E. coli. Después de la recolección de las células, la proteína se purifica separándola de las proteínas bacterianas, y se prepara como un extracto de proteína solubilizado. Este extracto de proteína comprende un agregado de masa molecular elevada de moléculas de proteína, el cual es soluble en una solución acuosa. La proteína purificada obtenida de esta manera puede ser utilizada para formar la base de un producto antigénico terapéutico en particular para el tratamiento de verrugas genitales .

Los siguientes ejemplos y los datos de secuencias proporcionados en la siguiente ilustran la invención pero sin intentar limitar el alcance de la presente descripción.

EJEMPLO 1: Amplificación y Clonación de los Genes de HPV-6.

El ADN viral del tipo HPV en el tejido infectado se dedujo originalmente por PCR utilizando un método basado en una modificación del método de Snijders et al., 1990, Journal of General Virology, 71: pp. 173-191 con iniciadores o cebadores estándar para HPV-6. Se amplificaron los genes Ll, L2 y E7 de HPV-6 mediante reacción en cadena de polimerasa (PCR) a partir de una muestra de AFN viral preparada a partir de un aislado clínico único (H26) que se selecciona como la base para el desarrollo de la entidad terapéutica en base en la facilidad de aislamiento de genes. La identidad del aislado clínico no es importante y cualquier aislado clínico habitual de HPV-6 puede ser prácticamente equivalente, aunque no idéntico. La PCR inicial se realizó utilizando ADN polimerasa Taq. Los iniciadores de oligonucleótido utilizados en las reacciones de PCR codifican 24 nucleótidos de homología exacta de la secuencia del gen de interés así como nucleótidos adicionales y estos fueron codificados por sitios de enzimas de restricción o se agregaron para mantener el marco de lectura entre las fusiones del gen eventuales o para introducir codones de detención en los constructos de expresión finales. Un ejemplo del oligonucleótido utilizando es como sigue: JPC08 CAGTGTCGACGGTCTTCGGTGCCAGATGGGACA SEC. DE IDENT.: 1 La cadena no codificante del iniciador del oligonucleótido para amplificación del gen E7 de HPV-7 y del sitio Salí para clonación direccional. Los productos de PCR únicos para las reacciones de amplificación de los genes Ll, L2 y E7 se utilizaron como ADN plantilla en las reacciones de secuenciado para generar una secuencia de consenso para cada uno de los tres genes. Se estableció la suposición de que la secuencia de ADN de consenso es un reflejo preciso de las secuencias de ADN reales de los genes en los extractos de ADN viral debido a que es una secuencia generada de muchas moléculas de plantillas individuales . El gen L2 de HPV-6 se amplificó por PCR a partir de ADN viral de HPV-6, como un producto único de aproximadamente 1400 pb. El producto se purificó de agarosa y se utilizó como una plantilla para análisis de secuencia de ADN, y se generó una secuencia de consenso para el gen L2 amplificado utilizando iniciadores de oligonucleótido.

El producto L2 purificado se subclonó directamente en el vector pGEM-T para crear el plásmido pGW12. La secuencia de ADN completa del gen L2 subclonado se generó a partir de ADN de plantilla pGW12 utilizando los mismos iniciadores de oligonucleótido que para la secuencia de consenso. Se demostró que la secuencia de ADN del gen L2 clonado es idéntica a la del consenso. Se amplificó el gen E7 de HPV-6 por PCR a partir de ADN viral de HPV-6 como un producto único de aproximadamente 300 pb. Este se purificó a partir de agarosa y se utilizó como plantilla de análisis de secuencia de ADN, y se generó una secuencia de consenso para el gen amplificado utilizando iniciadores de oligonucleótido. El producto de PCR E7 purificado se subclonó directamente en el vector pGEM-T para crear el plásmido pGW04. La secuencia de ADN completa del gen E7 subclonado se generó a partir de la plantilla pGW04 utilizando los mismos iniciadores de oligonucleótido que para la secuencia de consenso. La secuencia del gen E7 clonado se demostró que es idéntica a la del consenso. El gen Ll del HPV-6 se amplificó por PCR a partir de ADN viral de HPV-6 como un solo producto de aproximadamente 1500 pb. Este se purificó a partir de agarosa y se utilizó como una plantilla para análisis de secuencia de ADN, y se generó una secuencia de consenso para el gen amplificado utilizando iniciadores de oligonucleótido. El producto de PCR de Ll purificado se subclonó directamente en el vector pGEM-T para crear el plásmido pGW-A. La secuencia completa de ADN del gen Ll subclonado se generó a partir de la plantilla pGW-A utilizando los mismos iniciadores de oligonucleótido que para la secuencia de consenso. Se demostró que la secuencia del gen E7 clonada es idéntica al del consenso. Los productos de PCR se purificaron a partir de geles de agarosa por unión a una matriz de sílice y se ligaron a ADN vector pGEM-T. Los productos de estas reacciones de ligación se utilizaron para transformar células E. coli DH5a. Se aislaron clonas recombinantes y se seleccionaron adicionalmente para los insertos de gen de HPV-6 correctos utilizando un método basado en PCR. Las secuencias de ADN de los genes L2 y E7 de HPV-6 clonados se obtuvieron y compararon con la secuencia de consenso generada directamente de los productos PCR originales. Se utilizaron clonas cuyas secuencias concuerdan con el consenso, para la construcción de los casetes de expresión de proteína recombinante.

Ejemplo 2: Comparación de las Secuencias de HPV-6 con una Base de Datos EMBL Se compararon las secuencias de consenso con las de los tipos HPV relacionadas estrechamente que incluyen a HPV-11, HPV-16 y HPV-18, así como la secuencia publicada de HPV-6b a partir de la base de datos de ADN del European Molecular Biology Laboratory (EMBL) para asegurar que los genes amplificados son de un virus de tipo HPV-6. Se hicieron comparaciones con la ayuda de un elemento de programación (software) Lasergene Navigator (DNAStarlnc. ) utilizando los programas EditSeq, SeqMan, Megalign y Protean. Se hicieron comparaciones a nivel de ADN y a partir de las secuencias predichas de aminoácidos de los tres genes. Este análisis indicó que los genes amplificados de L2, Ll y E7 se derivan de un virus tipo HPV-6. Los resultados demuestran que aunque la secuencia del gen está altamente conservada, se observan numerosos cambios con respecto a la secuencia predicha. En consecuencia, se considera que los constructos adecuados para uso en esta invención se pueden realizar en base al ADN de aislados de HPV clínicos de tipo silvestre.

EJEMPLO 3: Construcción de Cásete de Expresión.

Se ensamblaron los genes individuales para L2 y E7, para generar la molécula de fusión de la siguiente manera: ambos genes, L2 y E7 se clonaron por amplificación por PCR para introducir sitios de enzima de restricción novedosos en las partes N y C terminales, y al mismo tiempo se mantuvo la integridad de la secuencia proteínica. Estas secuencias de genes después se ligaron juntas en un vector de clonación, utilizando técnicas estándar de ADN recombinantes, para crear un gen de fusión L2E7, de manera que se mantuvieron los marcos de lectura abiertas de las dos secuencias. El gen de fusión L2E7 se construyó como sigue. El gen L2 de HPV-6 inicialmente se generó como un fragmento de PCR de 1.1 kb, flanqueado por sitios Ba Hl y Neo I. Este fragmento de PCR se subclonó en el vector de clonación pGEM-T. Las clonas que procesaron el inserto requerido se digirieron con las dos enzimas, con el fin de liberar al gen L2, el cual después se purificó por separación en un gel de agarosa, seguido por extracción en placas blancas. Similarmente, el gen E7 de HPV-6 se generó como un fragmento Neo I - Sal I de 300 pb, subclonado en pGEM-T. Estos dos fragmentos de genes fueron ligados juntos para producir un fragmento de ADN BamH I - Sal I de 1.4 kb, el cual codifica para una proteína de fusión L2E7.

El fragmento de ADN BamH I - Sal I resultante después se liga en un derivado de pET16b, un vector de clonación sin expresión que posee resistencia a canamicina. El constructo resultante se denominó pGW48. El gen de fusión L2E7 posteriormente se transfirió a un vector pET de expresión con el fin de analizar la expresión en la proteína en E. coli. Después del análisis de la expresión del gen de fusión en E. coli, la mutación del gen se realizó como se describe para eliminar tensiones de residuos T, los cuales se consideran que causan terminación prematura de la transcripción. El gen de fusión L2E7 después se modificó por PCR para generar partes terminales BamH I y Not I capaces de permitir la inserción del cásete genético dentro de un vector de expresión que contiene una secuencia líder pelB en marco en el extremo 5' y His Tag en marco, en el extremo 3'. El fragmento de PCR se clonó a través del vector pGEM-T, y finalmente se transfirió a un vector pET derivado de pET22b. Este constructo final se denominó pGW53. Después del ensamblado, el constructo de fusión se transfirió a una serie de vectores de expresión procarióticos conocidos como vectores pET. Estos vectores bien conocidos comprenden señales de transcripción y traducción del bacteriófago T7 fuertes. La expresión después puede ser inducida al proporcionar una fuente de ARN polimerasa T7 en la célula huésped, bajo el control del promotor lacUV5 inducible. La adición del inductor, IPTG, resulta después en la conversión de los recursos de la célula en la expresión del gen objetivo. Potencialmente, el producto deseado después puede comprender más de 50% de la proteína celular total. Además, debido a que el sistema es inducible, puede mantener la secuencia del gen objetivo en un estado transcripcionalmente silencioso antes de la inducción, lo que permite la expresión de las secuencias del gen las cuales son potencialmente tóxicas para la célula huésped. La adición de IPTG a un cultivo de células en crecimiento rápido transformado con este vector pET que contiene al gen objetivo por lo tanto lleva a inducción de la enzima polimerasa y la expresión concomitante del gen clonado. El producto proteínico puede ser secretado, o en el caso de estos productos genéticos de HPV, dirigido a cuerpos de inclusión. La etapa de clonación se realiza por la introducción de un sitio de enzima de restricción Bgl II en cada extremo del fragmento del gen mediante mutagénesis por PCR, utilizando el siguiente nucleótido: NRW170 GTCGACAGATCTGGCACATAGTAGGGCCCGA SEC. DE IDENT. NO: 2 (Oligonucleótido para clonación por PCR de L2E7 de HPV-6 en el vector pET. Introducción del sitio BglII en la parte N terminal de L2 de HPV-6. No se requiere codón de metionina para fusión en la secuencia líder pET (pelB) . Siguió el secuenciado por ADN. El gen de fusión L2E7 después se ligó en los siguientes vectores: pETllb, pET12b, pETl6b y pET22b, los cuales difieren en la naturaleza de sus secuencias N terminal y C terminal. Los plásmidos recombinantes después se utilizaron para transformar una célula huésped apropiada, HMS174, la cual contiene el gen para T7 polimerasa. Están disponibles otras células huésped que difieren en su capacidad de restricción de supresión de la expresión basal y se han utilizado exitosamente en este método.

EJEMPLO 4: Expresión del Constructo L2E7 en E. coli.

Se tomaron colonias bacterianas individuales de la placa de transformación y se utilizaron para inocular alícuotas de 2 mi de medio 2YT. Estas alícuotas se hicieron crecer durante 2 horas, y después se utilizaron para inocular 12 mi de cultivos de medio calentado, ajustando el volumen de inoculo para proporcionar una cantidad consistente de bacterias determinada por medición de densidad óptica a 600 nm. Estos cultivos crecieron hasta que la densidad óptica alcanzó 0.6, punto en el cual los cultivos se dividieron en alícuotas de 5.0 mi. Se agregó a un cultivo IPTG a la concentración recomendada de 1.0 mM, y ambos cultivos se incubaron bajo condiciones idénticas durante 3 horas. Al final de este período, las bacterias se transfirieron a hielo y se midió la densidad óptica. Los cultivos bacterianos se recolectaron por centrifugación en un tubo Falcon de 15 mi durante 10 minutos a 4000 rpm. Se removió el sobrenadante y se resuspendieron las bacterias en TE a un volumen final de 0.5 mi. El análisis por SDS-PAGE se llevó a cabo como sigue: Posteriormente la muestra se agregó a un volumen igual de amortiguador de muestra de electroforesis, reductor, y se calentó a 100°C durante 10 minutos. Después se cargaron 50 µl de la muestra en un gel de poliacrilamida al 5-15%, y se sometieron a electroforesis a 10 mA durante 12 horas. Las bandas de proteína se visualizaron por tinción con azul brillante de Coomassie en ácido acético al 10%, 10% de metanol durante 30 minutos, seguido de desteñido. Se puede detectar una banda de proteína principal de peso molecular 90 kD, que corresponde a la proteína L2E7 de longitud completa mediante la tinción del gen en Coomassie, además de por lo menos otra banda, de 80 kD, que corresponde a un producto ya sea de degradación proteolítica o la terminación prematura de la transcripción o traducción.

Después de la modificación de la secuencia del gen por mutagénesis dirigida al sitio, como se describe por ejemplo en el Ejemplo 6, la banda de 80 kD ya no fue detectable después de la tinción con azul de Coomassie, lo que sugiere que la hipótesis de terminación prematura de la transcripción o translocación era correcta. La comparación de la cantidad de proteína presente en el gel con un estándar conocido permite una estimación de la concentración de expresión dentro de la bacteria. Las concentraciones parecen estar consistentemente dentro del intervalo de 10-30 mg/l. Para una caracterización más detallada de los productos proteínicos expresados, el gel se sometió a transferencia Western, seguido por sondeo con antisuero contra L2 generado por inmunización de borregos con proteína de fusión L2 derivada de E. coli. La transferencia Western permite la visualización de una gran cantidad de bandas de peso molecular inferior al de las especies de longitud completa, probablemente la totalidad de las cuales nuevamente se generen por degradación proteolítica de la terminación prematura de transcripción o de traducción. El análisis inicial por SDS-PAGE demuestra la presencia de una banda de proteínas que se tiñe con Coomassie, con un tamaño que corresponde al esperado para el producto del gen L2E7 de longitud completa. Además, existen numerosas bandas adicionales visibles, las cuales pueden corresponder ya sea a fragmentos proteolíticos de L2E7 o a artefactos de terminación prematura. Esto se investigó mediante transferencia Western, utilizando suero contra L2 o contra E7. Los resultados confirmaron que el producto principal es L2E7, y sugieren que las bandas menores carecen de las regiones C terminal. Se realizó una caracterización adicional mediante secuenciado de proteína, el cual confirmó que las dos bandas principales contenían secuencias N terminales intactas, incluyendo una secuencia líder pelB no separada.

EJEMPLO 5: Transcripción y Traducción In Vitro Con el fin de caracterizar los productos adicionalmente, se analizaron los genes en una serie de experimentos de transcripción y traducción in vitro acoplados. Este sistema utiliza un enzima T7 polimerasa introducida para generar un transcripto de ARNm a partir del gen clonado en el vector de expresión, el cual después se traduce in vitro para generar un producto proteínico sintético. Mediante la incorporación de una etiqueta radioactiva dentro del producto proteínico, se puede monitorear su síntesis utilizando análisis de SDS-PAGE.

La transcripción y traducción in vitro mostraron un patrón similar de síntesis proteínica al encontrado en el sistema heterólogo de E. coli. La proteína de fusión L2E7 consistió de 2 bandas principales de 80 kD y 70 kD, mientras que el producto Ll contenía dos bandas principales a 30 y 32 kD, además del producto de longitud completa supuesto de 60 kD. El análisis de la secuencia de ADN reveló que en ambas secuencias para Ll y L2 había tensiones de poli-T que consisten de entre 7 y 9 residuos T, los cuales parecen coincidir con las posiciones de fragmentos terminados prematuramente en ambas moléculas, Ll y L2E7. Se sugirió que estas regiones causaron terminación prematura tanto de la transcripción como de la traducción, y más probablemente de la primera. Esta creencia es soportada por la observación de un tracto poli-T en la secuencia terminadora para la poli-T polimerasa.

EJEMPLO 6: Mutagénesis de Secuencia de ADN Con el fin de eliminar artefactos de terminación potenciales, se decidió mutar dos trayectos de regiones ricas en T. El codón TTT codifica para el aminoácido fenilalanina (Phe) , para el cual existe el codón alternativo (TTC) . Por lo tanto, se decidió sustituir el codón TTT por mutación para generar la secuencia TTC, y de esta manera mantener el marco de lectura y la secuencia natural de la proteína. Esto se eligió de manera que dejara sin afectar, en este ejemplo, las propiedades del producto, lo que lleva a una secuencia proteínica sin cambios del reactivo inmunoterapéutico. Sin embargo, la mutación puede incrementar el rendimiento del producto proteínico expresado al minimizar el nivel de artefactos debidos a terminación prematura de la transcripción traducción. La mutación se realizó mediante la técnica de PCR de extensión de superposición del gen utilizando los oligonucleótidos JCT61, JPC81 definidos posteriormente, en los cuales la secuencia de ADN natural es sustituida por la secuencia mutante en el área relevante. Se utilizaron los siguientes oligonucleótidos en la mutagénesis: JCT61 CCAACCCTCCGAAGAACACCCCCAAAC SEC. DE IDENT. NO: 3 (Iniciador oligonucleótido de cadena no codificante para mutagénesis de L2 de HPV-6 en las posiciones de secuencia de ADN 159 y 162 (TTTTTT a TTCTTC) ) .

JPC81 GATCA ???IAAAATGGGGAAGTTTGGGGGTGTTCTTCGGAGGG SEC. DE IDENT. NO . : 4 (Que codifica para el iniciador de oligonucleótido de cadena para HPV-6 L2 que incorpora una mutagénesis de la secuencia TTTTTT a TTCTTC en la posición 159 y 162. El oligonucleótido codifica para un sitio Sspl AATATT. También se mutó un segundo sitio mediante mutagénesis dirigida al sitio utilizando el siguiente oligonucleótido: JPC90 CGTATTCCCTTATTCTTCTCAGATGTGGCGGC SEC. DE IDENT. NO: 5 (Que codifica para un iniciador de oligonucleótido de cadena para L2 de HPV-6 que incorpora mutagénesis in vitro de la secuencia en la posición 1359 y 1362) . El producto de gen final se insertó con el fin de crear un vector de expresión final designado como pGW53 y se analizó por expresión in vitro e in vivo.

EJEMPLO 7 : Expresión de las Secuencias Mutadas Después de la mutagénesis del constructo L2E7, se monitoreó el efecto mediante expresión in vitro e in vivo seguido por análisis con SDS-PAGE y mediante análisis de transferencia Western, cuando fue apropiado.

Se realizaron experimentos iniciales para analizar los productos de transcripción y traducción in vitro de ambos genes mutados L2E7 y Ll . Se examinó como en lo anterior la expresión in vivo del gen L2E7 mutado y del gen Ll. Se seleccionaron colonias individuales y se hicieron crecer hasta una densidad óptica de 0.6. punto en el cual se utilizó IPTG para inducir la mitad del cultivo; tres horas posteriores a la inducción se recolectaron las células y se prepararon alícuotas para análisis por SDS-PAGE. Se encontró que el cásete de expresión se traduce satisfactoriamente . Los experimentos tanto in vitro como in vivo confirmaron que la mutagénesis de las regiones poli-T lleva a una disminución en el rendimiento de fragmentos terminados prematuramente tanto de L2E7 como de Ll, y una mejoría en el rendimiento del producto de longitud completa. El resultado neto es una disminución en el rendimiento del producto de 70 kD y la expresión de L2E7 y una pérdida de los fragmentos de 30-32 kD a partir de la expresión de Ll. Por lo tanto, es claro que la mutación de las regiones poli-T lleva a una expresión mejorada de las especies de longitud completa en este sistema de expresión. Este resultado no ha sido descrito previamente para un sistema de expresión basado en T7 polimerasa, y puede tener aplicaciones amplias en otras áreas de trabajo de expresión.

EJEMPLO 8 : Procesos de Producción y Purificación de Proteinas Los bancos de células maestras dedicadas y de trabajo de las células E. coli HMS174 que contienen el plásmido pGW53 y derivados como se describen en la presente se sedimentan y almacenan a -80°C. Para producción de un frasco a partir del banco de células de trabajo se recalientan y cultivan en medio 2YT hasta un volumen apropiado para inoculación en un fermentador. La escala de fermentación puede variar desde 1.3 1 a 50 1 y se pueden considerar escalas más grandes. Las células se cultivan hasta que la densidad celular alcanza un punto preestablecido (típicamente 0.3 g por 1). En este punto el cultivo se induce con IPTG después de lo cual las células se recolectan aproximadamente 2 horas después. Se ha obtenido en ocasiones rendimientos de 24-50 mg de L2E7 por g de peso seco de células utilizando condiciones de fermentación estándar. La ruptura de células y la purificación de proteínas después se lleva a cabo como se indica en lo siguiente y en la figura 3 de los dibujos anexos. La ruptura de células se realiza para liberar L2E7 insoluble almacenado como cuerpos de inclusión intracelulares (IB) . Esto se realiza utilizando una prensa hidráulica lo cual provoca la lisis celular al hacer pasar las células a través de una abertura estrecha bajo una presión de 351.5 kg/cm2 (5,000 psi). Se puede obtener un análisis con una eficiencia de aproximadamente 95% por métodos estándar y es virtualmente completa después de tres pasadas. El lisado de células de E. coli que contiene L2E7 insoluble en forma de cuerpos de inclusión se centrifuga. La pastilla sedimentada, que contiene cuerpos de inclusión y residuos celulares se resuspende en un amortiguador que contiene detergente Tritón X-100. En tal filtración de flujo cruzado tangencial, el cual es per se una técnica estándar llevada a cabo en un aparato obtenible comercialmente "Filtron"MR, un flujo de líquido o suspensión que va a ser ultrafiltrado o filtrado se hace pasar a través de una membrana de ultrafiltración o de filtración bajo una presión transmembranal suficiente para impulsar el filtrado a través de la membrana. En la presente modalidad, se utiliza una filtración de flujo cruzado tangencial para concentrar la suspensión de cuerpo de inclusión contra un filtro de 0.16 µm. Los cuerpos de inclusión se concentran en el retenido y se remueven los contaminantes en el filtrado. El concentrado después se diluye para reducir la concentración de Tritón X-100, y se concentra nuevamente. Después se agregan urea y DTT (ditiotreitol) hasta una concentración final de 8 M, y 10 mM, respectivamente, lo cual solubiliza a L2E7. La proteína L2E7 reducida, desnaturalizada después pasa a través del filtro de 0.16 µ a un filtrado adicional, en donde se recolecta.

La proteína L2E7 en forma desnaturalizada, reducida y filtrada, después se purifica utilizando cromatografía de intercambio iónico. La proteína L2E7 solubilizada en urea 8.0 M se purifica primero por cromatografía de intercambio aniónico utilizando condiciones indicadas en la figura 3. Típicamente se purifican 1-2 g del producto en una columna de 250-350 mi. La proteína L2E7 solubilizada con urea se carga sobre la resina de intercambio aniónico y se elimina los contaminantes unidos débilmente por elución con 4 volúmenes de columna de amortiguador urea DTT Tris (pH 8.0) que contiene NaCl 50 mM. Finalmente, la proteína L2E7 se eluye de la columna utilizando un máximo de 5 volúmenes de columna de amortiguador urea DTT Tris (pH 8.0) que contiene sal 350 mM. La velocidad de flujo a través de la etapa es de aproximadamente 5 mi crrf2/minuto. El producto pico de cromatografía de intercambio aniónico se carga sobre un intercalador catiónico. Típicamente se purifica 1-2 g de producto en aproximadamente 250 mi de material de columna. El producto se carga sobre la resina a 2.5 mi min cm"1, la cual después se lava con cuatro volúmenes de columna de urea 8.0 M DTT fosfato (pH 6.2) que contiene cloruro de sodio 210 mM seguido por elución pico de L2E7 con amortiguador de lavado que contiene cloruro de sodio 500 mM en aproximadamente 1.5 volúmenes de columna. El producto pico del intercambiador catiónico se carga sobre una matriz de exclusión de tamaño (como se indica en la figura 3) utilizando un amortiguador de corrida de Tris 25 mM, pH 8.0 que contiene cloruro de sodio 75 mM. Típicamente se cargan 100 mi que contienen 200-400 mg de L2E7 (a 0.2 mi cm" 2/min) sobre 6.5 1 de matriz, con una altura de lecho de 100 cm. El pico que corresponde al producto principal y los fragmentos menores con cortes en la parte N terminal se cortan del pico a un volumen de elución de aproximado de 0.46 volúmenes de columna. El pico de cromatografía por exclusión de tamaño en esta etapa del proceso es diluido, a una concentración aproximada de 0.25-0.5 mg mi"1. El producto (1-2 1) se concentra mediante cargado en un volumen pequeño de matriz de intercambio aniónico (~ 75 mi) a una velocidad de flujo de 0.5 mi cm"2/min. El producto se eluye utilizando amortiguador urea DTT fosfato, pH 8.0 que contiene cloruro de sodio 1.0 M. El volumen pico es 1-2 volúmenes de columna. El pico del cartucho de anión Q concentrado se somete a intercambio con amortiguador en un amortiguador de formulación final a Tris 48.9 mM, pH 8.0, que contiene DTT 5 mM. La matriz de la columna es medio G25 de Sepharose con un volumen de -2.5 litros. Se precarga un "tapón" de amortiguador que contiene urea 8 M igual al volumen de producto, sobre la columna. El producto después se carga a una carga -100-150 mi. El pico de producto intercambiado con amortiguador formulado típicamente eluye a 0.5 volúmenes de columna utilizando una velocidad de flujo de 0.06 mi cm"2/min. El volumen de producto final después se almacena a -80°C. Una solución o dispersión de la proteína L2E7 del producto obtenible de esta manera está en una forma agregada (reagregada) la cual no obstante puede pasar a través de un filtro esterilizante, por ejemplo, un filtro de calibre en el intervalo de 0.16-0.22 micrómetros, por ejemplo, 0.2 micrómetros .

EJEMPLO 9: Clonación y Expresión de genes de HPV-6 en Levadura- Saccharomyces cerevisiae Con el fin de examinar la capacidad de que otros sistemas heterólogos expresen concentraciones elevadas de los genes de HPV-6, los genes para el constructo de fusión L2E7 y para Ll se han clonado en varios vectores de expresión replicantes autónomamente disponibles de S. cerevisiae. Este vector, basado en los elementos de plásmido 2 µ, permite la expresión de genes heterólogos en marcos impulsados por el promotor GAL7. El vector también contiene al marcador Leu-2d, para selección de número de copias aumentado en células de levadura, y el gen de resistencia a canamicina que permite la selección en Escherichia coli. La cepa huésped de Saccharomyces utilizada para la expresión fue S150-2B (genotipo: a. leu2-3, 112, ?his3, trpl-289, ura3-52) .

La levadura se transformó con el constructo L2-E7 de HPV-6 y se hizo crecer en medio que contiene 2% de glucosa como la única fuente de carbono, con el fin de reprimir la transcripción del promotor GAL7. El gen de expresión se introdujo en presencia de galactosa al 2% del medio, como la única fuente de carbono. Los extractos celulares se produjeron por ruptura de las membranas celulares en presencia de esferas de vidrio. El amortiguador de extracción se basa en Tris y contiene inhibidores de proteasa de intervalo amplio: PMSF, peptatina, leupeptina, antipaina y quimostatina. Los extractos celulares se procesaron por SDS PAGE y después las proteínas separadas se sometieron a transferencia Western utilizando antisueros policlonales producidos en borrego contra L2 de HPV-6 y E7 de HPV-6. Los rendimientos de la proteína de fusión L2-E7 de HPV-6 producida de Saccharomyces cerevisiae de esta manera se ha estimado que es de 10 µg por litro de cultivo en ciertas modalidades.

EJEMPLO 10: Clonación y Expresión de Genes HPV-6 en Levadura- Pichia pastoris Se puede crear una molécula de fusión L2E7 (véase ejemplo 3 anterior) como un fragmento de ADN BamH I - Not I, y se puede clonar en un vector de expresión adecuado tal como el vector pPIC3K de Pichia (obtenido bajo licencia de Phillips Petroleum) . El gen se puede colocar bajo el control del promotor alcohol oxidasa, AOXI, con el fin de permitir altos niveles de expresión de la proteína de fusión. Después de la linearización del constructo de expresión, el ADN se puede transfectar en células de levadura por fusión de esferoplastos. Los transformantes se pueden seleccionar por su capacidad para crecer en medio mínimo, en ausencia de histidina, a diferencia de las células no transfectadas las cuales mantienen el requerimiento de histidina en el medio de crecimiento. Una segunda ronda de separación en base al crecimiento lento en un sustrato de metanol se puede realizar para seleccionar aquellas clonas que contienen al gen L2E7 integrado en el locus correcto.

EJEMPLO 11: Clonación y Expresión de Genes de HPV-6 en Baculovirus Con el fin de investigar la expresión del gen de fusión L2E7 en baculovirus, se generaron dos constructos, cada uno codifica para una proteína de fusión L2E7 de HPV-6, ya sea con o sin la cola HisTag. Ningún constructo contenía una secuencia líder, pues en esta ocasión se desea examinar el nivel de expresión intracelular.

Se clonaron dos constructos por amplificación por PCR, los cuales introducen sitios Bgl II terminales en el vector pGEM-T. Se aislaron los genes L2E7 como fragmentos Bgl II- Bgl II y se subclonaron en el sitio de clonación BamH I del vector de transferencia pBacPAKl (Clontech) . Después se determinó la orientación de los insertos por análisis por PCR, y se preparó ADN de clonas que contienen la orientación correcta. El ADN del vector de transferencia pBacPAKl que contiene cualquiera de los constructos L2E7 se transfecta, utilizando un procedimiento estándar mediada por lipofectina, en células de Spodoptera frugiperda (tipo Sf9) junto con un corte Bsu36 del ADN viral PBacPAKl (Clontech) . La recombinación homologa in vivo entre el ADN plasmídico y viral se produce después para rescatar el ADN viral, y en el proceso el gen objetivo se transfecta al genoma viral. Los virus progenie generados en el sobrenadante de cotransfección después se amplifican al infectar células frescas . Se recolecta una fracción de las células infectadas y se prepara el ADN genómico. La amplificación por PCR utilizando los iniciadores anteriores indica que el virus recombinante está presente en las células. El paso en el concentrado de virus después se utiliza para infectar adicionalmente células a alta multiplicidad de infección para caracterizar la expresión del gen al determinar el curso en el tiempo de la producción de proteínas: se infectaron células Sf9 confluentes en placas de 6 pozos a alta multiplicidad de infección, las células del sobrenadante se recolectaron a las 24 h, 48 h y 72 h posinfección. Los resultados del experimento se observaron por análisis SDS-PAGE y por transferencia Western con el fin de detectar la síntesis de la proteína. No se observó proteína recombinante en gel SDS-PAGE teñido con Coomassie, pero se detectó a bajas concentraciones mediante transferencia Western. Como se esperaba, la proteína no fue secretada debido a la ausencia de una secuencia líder. Los genes amplificados fueron secuencias completos y subclonados en vectores plasmídicos. Las secuencias del gen se han utilizado para construir fusiones de gen para expresión de proteínas de HPV-6 a altas concentraciones en sistemas procarióticos y eucarióticos .

EJEMPLO 12 : Inmunogenecidad de L2E7 en Ratones Se ha examinado en ratones la inmunogenecidad de un agregado de L2E7. Se encontró que cuando se absorbe un agregado de L2E7 sobre hidróxido de aluminio ("alúmina") y se inyecta en ratones B6CBA, se induce inmunidad específica para L2E7. Esta inmunidad específica para L2E7 incluye anticuerpos séricos, de la clase de inmunoglobulina G (IgG) y de la subclase de inmunoglobulina Gl (IgGl) . También se encontraron respuestas de hipersensibilidad de tipo retardado específicas para L2E7 y respuestas linfoproliferativas in vitro. Se examinó la inmunogenicidad de L2E7 absorbido sobre alúmina en ratones B6CBA. Se administró a los ratones inyecciones subcutáneas de 180 µg de L2E7/alúmina con diferencia de 14 días. Se recolectó suero a los 7, 14 y 56 días después de la segunda inyección de L2E7/alúmina. Se determinaron las concentraciones de anticuerpo sérico contra L2E7 en un ensayo inmunoabsorbente unido a enzima, específico para L2E7. Las respuestas de anticuerpos L2E7 séricos alcanzaron picos a los 14 días después de la inyección de L2E7 (título de punto medio, 4.572 log 10) y persistieron durante 56 días (título de tiempo medio, 4.127 log 10) . Las respuestas de hipersensibilidad de tipo tardío in vivo (DTH) a L2E7 se midieron en un segundo grupo de ratones inmunizados como en lo anterior. 7 días después de la segunda inyección con L2E7/alúmina, los ratones fueron expuestos a 1.8 µg de L2E7 en su oreja derecha y un volumen igual de amortiguador en su oreja izquierda. El incremento específico por L2E7 en el espesor de la oreja se midió con un micrómetro para ingenieros a las 24, 48 y 72 horas después de la exposición en la oreja. Los ratones inmunizados con L2E7/alúmina generaron respuestas DTH in vivo. Las respuestas linfoproliferativas in vitro se midieron al drenar células de nodulo linfático (células de nodulo linfático axilar) tomadas de un tercer grupo de ratones, 7 días después de su segunda inyección con el producto L2E7/alúmina (como en lo anterior) . Se elaboró una suspensión de células de nodulo linfático única y se sembraron en placas 2 x 106 linfocitos viables/ml en medio (medio de Iscove modificado por Dulbecco) suplementado con suero de ratón normal al 1%, glutamina, beta-mercaptoetano y antibióticos. Se título L2E7 en los cultivos (a partir del 91 micro-g/ml) y se determinó la proliferación celular por incorporación de timidina tritiada durante las 24 horas finales de las 72 horas de cultivo. Las células de nodulo linfático de los ratones se inmunizaron con L2E7/alúmina y proliferaron en respuestas in vitro de L2E7 (42,000 cpm, índice de estimulación 50).

EJEMPLO 13 : Respuestas Inmunes en Humanos : Se ha demostrado que una vacuna como se describe en lo anterior, un complejo de gel de hidróxido de aluminio de L2E7 preparado de la manera equivalente a la indicada antes, induce una respuesta inmune apropiada, relacionada con la dosis en voluntarios masculinos sanos. Las células de 36 voluntarios vacunados mostraron una respuestas linfoproliferativa específica in vitro contra L2E7 (células T CD4+) , indicativo de una respuesta inmune al producto. A los voluntarios se les ha administrado el producto por inyección intramuscular en dosis de 3, 30 o 300 µg, una dosis inicial en el día 0 y dosis repetidas en los días 7 y el día 28 (protocolo acelerado) . También se intentó un protocolo alternativo más lento, para vacunación los días 0, 28 y 56, y se encontró menos preferible) . Las respuestas linfoproliferativas se observaron desde el día 7 a concentraciones de dosis que incluyen la dosis más baja, 3 µg. También se encontró respuesta de anticuerpos específica para L2E7 en 29 de 32 muestras determinables en los voluntarios (las tres personas que no responden en la prueba de anticuerpos habían presentado la dosis más baja) . También se observó una producción aumentada in vitro de IL-5, consistente con la producción de anticuerpos. Las dos dosis más elevadas indujeron proliferación de células T más rápido que las dosis más bajas. La dosis más elevada, 300 µg, estimula más producción de IFN-gama que las dosis inferiores. Las observaciones realizadas en una proliferación rápida de células T y producción asociada de IFN-gama, son consistentes adecuadamente con el uso propuesto del producto como una vacuna terapéutica para verrugas genital. La regresión de verrugas en la planta humana establecidas durante mucho tiempo, consideradas debidas a papilomavirus humano, se han observado en un receptor del producto a una dosis de 3 micro-g, cuyas células están entre las que muestran respuesta proliferativa. La regresión fue observable en el día 7 y la desaparición de las verrugas se produjo en el día 14. La invención descrita y la descripción hecha en la presente son susceptibles de muchas modificaciones y variaciones, como será evidente y se realizará fácilmente por un lector familiarizado con la técnica, a la luz de esta descripción: y la descripción se extiende a adaptaciones, combinaciones y subcombinaciones de las características mencionadas y/o descritas en la presente. Los documentos mencionados en la presente se incorporan en la presente como referencia. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el convencional para la manufactura de los objetos a que la misma se refiere. Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes:

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Un polipéptido o composición polipeptídica, caracterizado porque comprende un determinante antigénico de una proteína de papilomavirus, en una forma agregada amorfa, la cual, cuando está en solución o dispersión, puede pasar a través de un filtro o de esterilización.

2. El polipéptido o la composición polipeptídica, de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende determinantes antigénicos de por lo menos dos proteínas de papilomavirus, por ejemplo, L2 y otra o E7 y otra.

3. El polipéptido o la composición polipeptidica, de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque comprende por lo menos un determinante antigénico de la proteína L2 de papilomavirus y por lo menos un determinante antigénico de la proteína El, E2, E4, E6 o E7 de papilomavirus.

4. El polipéptido o la composición polipeptídica, de conformidad con la reivindicación 1, 2 ó 3, caracterizado porque comprende determinantes antigénicos de las proteínas L2 y E7 de HPV, por ejemplo, que comprende un fragmento de secuencia de por lo menos 50% de la secuencia completa de cada una de la proteína L2 y la proteína E7, por ejemplo que comprende sustancialmente la secuencia completa de L2 y de E7; y que opcionalmente incluye además una secuencia de la proteína Ll.

5. El polipéptido o la composición polipeptídica, de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque el determinante, antigénico es de una proteína de papilomavirus de HPV tipo 6, 11, 16, 18 o de una papilomavirus animal no humano.

6. El polipéptido o la composición polipeptídica, de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque está en forma de preparación desnaturalizada, reducida y reagregada.

7. El polipéptido o la composición polipeptídica, de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque se puede obtener por desnaturalización, o desnaturalización con reducción, y reagregación subsecuente de un polipéptido expresado en forma de cuerpos de inclusión en una células huésped recombinante.

8. El polipéptido o la composición polipeptídica, de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque tiene una masa molecular por agregado en el intervalo de aproximadamente 10,000 a aproximadamente 10,000,000 de unidades dalton.

9. El polipéptido o la composición polipeptídica, de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque comprende partículas agregadas con diámetros, al microscopio electrónico, en el intervalo de aproximadamente 40 a 50 nm, por ejemplo, de aproximadamente 10-15 nm.

10. El polipéptido o la composición polipeptídica, de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque comprende partículas agregadas que tienen 2-200, por ejemplo 5-50 cadenas polipeptídicas por agregado.

11. El polipéptido o la composición polipeptídica, de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende un polipéptido de fusión que comprende: (a) por lo menos un determinante antigénico de una proteína L2 de papilomavirus, y (b) por lo menos un determinante antigénico que se selecciona de proteínas de papilomavirus El, E2, E4, E5, E6 y E7 y proteínas de papilomavirus L2 de diferente tipo de papilomavirus al del inciso (a) ; o que comprende determinantes antigénicos de por lo menos dos proteínas de papilomavirus que se seleccionan de proteínas de papilomavirus El, E2, E4, E5, E6 y E7, por ejemplo, cuando las proteínas son de tipos diferentes de papilomavirus.

12. El polipéptido o la composición polipeptídica, de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque un polipéptido de fusión comprende un determinante antigénico de la proteína L2 y un determinante antigénico de por lo menos una de las proteínas El, E2, E4, E6 y E7.

13. Una composición inmunogénica, adecuada para administración por inyección caracterizada porque comprende un polipéptido de conformidad con cualquier reivindicación precedente, junto con un adyuvante inmunológico.

14. La composición inmunológica, de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque el adyuvante comprende hidróxido de aluminio y/o monofosforil lípido A.

15. El uso de un polipéptido o una composición inmunogénica, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, como un inmunógeno, por ejemplo, como una vacuna para profilaxis o terapia de una condición asociada con papilomavirus.