MXPA98009339A - Construccion genetica molecular de cepas de vacuna de pasteurellaceae - Google Patents

Abstract

Se proporcionan herramientas para tratar mediante ingeniería genéticamente Pasteurellaceae. Los plásmidos de replicación condicional que sonútiles para Pasteurellaceae han sido aislados y caracterizados. Los plásmidos pueden ser utilizados para entregar segmentos de ADN dentro de Pasteurellaceae, en situaciones en las cuales se desea el control de la replicación extracromosómica, tal como para lograr un intercambio alélico o mutagénesis directa al sitio. Se aislóuna endonucleasa de restricción, Hsol, a partir de un aislado de pulmón de bovino de Haemophilus somnus. Se encontróque la enzima era un verdadero isosquizómero de HinPl, una enzima disponible comercialmente aislada originalmente de Haemophilus influenzae Pl. Se encontróque la transferasa metílica de Hhal comercialmente disponible protege en contra de la división por ambas enzimas. Se encontróque la metilación del plásmido extanjero de ADN mejora las transformación de Haemophilus somnus en exceso de cuatro ordenes de magnitud.

Description

CONSTRUCCIÓN GENÉTICA MOLECULAR DE CEPAS DE VACUNA DE PASTEURELLACEAE ANTECEDENTE DE LA INVENCIÓN Pasteurella haemolytica, P. multocida y Haemophilus somnus son miembros de la Familia Pasteurellaceae. Cada uno está implicado en síndromes de enfermedades respiratorias en ganado doméstico. Estos organismos han probado dificultad para ia manipulación genética, y por lo tanto, ha sido obstaculizada la construcción de vacunas atenuadas vivas. Las cepas atenuadas vivas generalmente proveen protección superior comparado con las vacunas bacterianas muertas (bacterinas). En general, las vacunas vivas producen una respuesta mediada de células más fuertes en el huésped que las de las bacterinas. La inmunidad superior provista por los organismos vivos atenuados puede explicarse por su capacidad de inducir la expresión de proteínas de tensión y, posiblemente, de ciertas toxinas dentro del huésped. La respuesta inmune generada por organismos vivos puede dirigirse contra estas proteínas abundantes y por lo tanto proveer mejor protección. Existe una necesidad en la materia de vacunas atenuadas vivas contra el síndrome de enfermedad respiratoria en ganado doméstico ocasionadas por Pasteurellaceae. También existe una necesidad de técnicas y herramientas para facilitar la construcción de dichas vacunas. COMPENDIO DE LA INVENCIÓN Es un objetivo de la invención proveer un plásmido condicional de replicación . Es otro objetivo de la invención proveer una preparación libre de células de un plásmido que se purifica del AD N genómico y que es condicional a la replicación. Aún es otro objetivo de la invención proveer células huésped de Pasteurellaceae que comprende un plásmido el cual es condicional a la replicación . Es un objetivo de la invención proveer métodos para introducir ADN en H. somnus. Es un objetivo de la invención proveer métodos para mutagenizar H. somnus. Es un objetivo de la invención proveer cepas transformantes de H. somnus. Es un objetivo de la presente invención proveer cepas mutantes de H. somnus. Es otro objetivo de la invención proveer H. somnus genéticamente tratado. Es un objetivo de la invención proveer un método para introducir un segmento de ADN en un genoma de Pasteurellaceae. Es otro objetivo de la invención proveer Pasteurellaceae genéticamente modificada. Estos y otros objetivos de la invención se proveen por una o más modalidades descritas más adelante. En una modalidad, se provee un plásmido que es condicional para replicación en H. somnus, P. multocida y P. haemolytica. En otra modalidad de la invención , se provee una preparación libre de células de ADN de plásmido. El ADN de plásmido se purifica libre de ADN genómico. El plásmido es condicional a la temperatura para replicación en H. somnus, P. multocida y P. haemolytica. En otra modalidad de la invención, se provee una célula huésped de la familia Pasteurellaceae. La célula huésped comprende un plásmido que es condicional para replicación en H. somnus, P. multocida y P. haemolytica. En una modalidad de la invención, se provee un método para introducir ADN a H. somnus. El método comprende los pasos de: proveer una molécula de ADN ; metilar la molécula de ADN con una enzima metiltransferasa que tiene un sitio de reconocimiento 5'-GCGC-3' , para formar ADN metilado; y transformar células de H. somnus con el ADN metilado. En otra modalidad de la invención, se provee un método para producir una mutación en una región particular de ADN de un genoma de H. somnus. El método comprende los pasos de: aislar una región del genoma de H. somnus, introduciendo una mutación en la región para formar una región de ADN mutado; metilar la región de ADN mutado con una enzima de metilación que inhibe la separación de endonucleasa a una secuencia de reconocimiento 5'-GCGC-3' para formar ADN metilado; introducir el ADN metilado en una célula de H. somnus para formar transformantes y tamizar los transformantes para aquellos que la mutación en la región sobre ADN cromosomal de la célula H. somnus. En aún otra modalidad de la invención , se provee una preparación de una endonucleasa de restricción de Hsol aislada. En aún otras modalidades, se proveen mutantes y transformantes de H. somnus hechos por el proceso de la invención .

En otra modalidad de la invención se provee un método para introducir un segmento de ADN a un genoma de Pasteurellaceae que comprende: administrar a una célula de Pasteurellaceae una construcción recombinante que comprende el segmento de ADN y un plásmido que es condicional para temperatura para la replicación en la célula de Pasteurellaceae para formar transformantes; someter los transformantes a una temperatura no permisiva; tamizar los transformantes para la presencia del segmento de ADN; y tamizar los transformantes para la ausencia del plásmido. En aún otra modalidad, se provee Pasteurellaceae genéticamente modificada que está formada por el método de administrar una célula de Pasteurellaceae y una construcción recombinante que comprendió el segmento de ADN y un plásmido que es condicional a la temperatura para la replicación en la célula de Pasteurellaceae para formar transformantes; someter los transformantes a una temperatura no permisiva; tamizar los transformantes para la presencia del segmento de ADN; y tamizar los transformantes para la ausencia del plásmido .

Estas y otras modalidades de la invención proveen la técnica con los medios para construir mutantes y transformantes deseables de la familia de Pasteurellaceae económicamente importante y previamente intratable de patógenos. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS En la generación de mutaciones definidas en Pasteurellaceae, es conveniente introducir un segmento en el genoma que porta una mutación definida que ha sido formada in vitro o en otra bacteria. Normal mente, el segmento del genoma se introduce en un plásmido. Con el fin de "transferir" la mutación definida del ADN entrante al genoma, se requiere recombinación homologa. U n solo evento de recombinación dará como resultado la integración de todo el plásmido, lo cual da como resultado una copia de tipo silvestre y una mutante del gen. Un segundo evento de recombinación es conveniente, para suprimir la copia de tipo silvestre del gen y las secuencias del vector. Debido a que ia presentación de la recombinación doble deseada es un evento raro, presentándose en solamente una fracción de las células que reciben el ADN introducido, el incremento del número de células que contienen el ADN introducido , incrementará la recuperación de células que son recombinantes dobles. El uso de un plásmido que puede replicarse en Pasteurellaceae incrementa el número de células que tienen el ADN introducido. Sin embargo, la presencia de un plásmido en las células que finalmente pueden utilizarse para vacunas no es deseable, dado que dichos plásmidos con frecuencia contienen determinantes de resistencia a fármacos y toxinas, ecológica y médicamente indeseables . Los inventores han resuelto este problema creando un plásmido que no se replica bajo condiciones definidas, es decir, que es condicional para la replicación . Por lo tanto, el ADN genómico que porta una mutación definida introducida a las células vía el plásmido, puede estar presente en muchas células directamente transformadas y de progenie, desarrollando la célula a la temperatura permisiva. Esta característica aumenta el número absoluto de recombinantes dobles deseadas obtenidas incrementado la población de partida de células que portan el segmento de ADN . Además, cambiando a condiciones no permisivas (v. g r. , alta temperatura), se pueden eliminar plásmidos que son episomales . Es un descubrimiento de la presente invención que la colocación de dicha bacteria que contiene el plásmido a una temperatura superior que no permite la replicación eficiente del plásmido, da como resultado la perdida rápida del piásmido. El acondicionamiento de la replicación de los plásmidos de la presente invención puede estar basado sobre cualquier fenotipo seleccionable. Por ejemplo, los plásmidos pueden no ser capaces de replicarse en presencia de un agente particular, tal como un fármaco o toxina. Los plásmidos pueden no ser capaces de replicarse en presencia o ausencia de ciertos metabolitos o sales. La condición a la temperatura ha sido demostrada para una mutante de pD70 , pero se pueden utilizar otras condiciones, así como otros plásmidos que se repliquen en Pasteurellaceae. Particularmente se prefieren aquellos plásmidos del mismo grupo de incompatibilidad como pD70.

Los plásmidos de la presente invención pueden purificarse de acuerdo con cualquier método reconocido en la materia de ADN genómico. Las separaciones normales de plásmido de ADN genómico en una preparación libre de células son electroforética, cromatográfica, de sedimentación de gradiente de densidad, de lisis alcalina, etc. Los plásmidos se pueden introducir en células huésped bacterianas de Pasteurellaceae por cualquier medio convencional en la materia, incluyendo transformación , conjugación , transferencia de genes mediada por liposomas, bombardeo de partículas, etc. Cualquier huésped de Pasteurellaceae puede ser utilizado. Las mutaciones de plásmido se pueden inducir por cualquier medio conocido en la materia. Estos incluyen mutagénesis química in vitro o in vivo, pasaje a través de una cepa mutadora, etc. Aún las mutaciones espontáneas pueden utilizarse si alguien desea tamizar más extensamente. Particularmente, se prefieren las supresiones e inserciones que no son revestidas. Dichas mutaciones se generan fácilmente in vitro utilizando, por ejemplo, enzimas de restricción. Las mutaciones condicionales más probablemente son mutaciones en sentido contrario, pero las mutaciones sin sentido también se pueden utilizar en presencia de un ARNt supresor sensible a la temperatura.

Los plásmidos condicionales de temperatura de la presente invención pueden administrarse a una célula de Pasteurellaceae de acuerdo con los métodos normales conocidos en la materia, incluyendo , pero no limitado a electroporación , transformación ; transfección, transducción . Se puede tam izar por métodos genéticos o físicos para detectar aquellas células que han recibido el ADN del plásmido. Subsecuentemente, se puede tamizar entre los receptores de plásmido para aquellos que han perdido el plásmido y retenido el ADN de interés portado en el plásmido. Los métodos de tamizado pueden ser genéticos o físicos, tales como tamizado para un fenotipo o tamizado para la presencia de una secuencia particular de ADN en la célula por hibridización . Es un descubrimiento adicional de la presente invención que H. somnus contiene un sistema de modificación por restricción , llamado en la presente el sistema Hsol . La endonucleasa de restricción de Hso\ ha sido aislada y se ha determinado que su secuencia de separación es 5'-GCGC-3\ Se ha descubierto, por los presentes inventores, que una barrera para la transformación de H. somnus puede superarse tratando el ADN con una enzima de metilación , tal como metiltransferasa de Hsol (M. Hsol) . Dichas enzimas modifican los substratos de ADN de manera que las endonucleasas que reconocen las secuencias de 5'-GCGC-3' que inhiben en su capacidad de digerir dichos substratos modificados. Las metiltransferasas producen un sitio que ES 5'-GmCGC-3', es decir la 5' citosina es metiiada. Ejemplos de dichas metiltransferasas son metiltransferasa de Hsol metiltransferasa de HinP\ y metiltransferasa de Hnal que está comerciaimente disponible de New England Biolabs , Beverly, MA 0191 5. Las células que contienen dichas enzimas de metiltransferasa pueden ser utilizadas. Preferiblemente, estas son células recombinantes con enzimas de metiltransferasa introducidas de manera que carecen de enzima de restricción cognática. Alternativamente son variantes mutantes o naturales que carecen de la enzima de restricción cognática. En algunos casos puede ser posible pasar el ADN a través de células que tienen enzimas de restricción como de metiltransferasa, si la primera es menos activa (más lenta) o menos prevaleciente que la otra. La metilación de substratos de ADN para la transformación (electroporación u otros medios de introducción de ADN en células) se pueden lograr in vitro o in vivo. Para la metilación in vitro, se incuba el ADN con una preparación de metiltransferasa en presencia de un donador de metilo, tal como S-adenosilmetionina (SAM) . La metilación in vivo puede lograrse pasando del substrato de ADN a través de una bacteria que contienen una metiltransferasa apropiada, tal como metiltransferasa de Hsol, HinP\ o Hha\. Una variante mutante o natural de H. somnus que carece de endonucleasa de Hsol puede utilizarse también para preparar el ADN para la introducción subsecuente en H. somnus. Dicha mutante puede estar hecha entre otras cosas de acuerdo con el método para mutagénesis dirigida al sitio descrito en la presente. La mutagénesis dirigida a sitio de H. somnus puede lograrse de acuerdo con la presente invención , aislando primero una región de ADN de tipo silvestre de H. somnus. Se crea una mutación en la región de ADN de tipo silvestre aislada de acuerdo con cualquier método conocido en la materia. Por ejemplo , el ADN aislado puede ser qu ímicamente mutagenizado, ya sea en una bacteria o in vitro. Alternativamente, las endonucleasas de restricción se pueden utilizar para crear supresiones o inserciones precisas in vitro. Otros métodos dado que son conocidos en la materia se pueden utilizar según sea conveniente para una aplicación particular. Después de que el ADN de H. somnus ha sido aislado y mutagenizado, se metila como se describió antes. Se puede introducir en H. somnus de acuerdo con cualquier técnica conocida en la materia, incluyendo, pero no limitado a transfección , transformación, electroporación y conjugación . Alternativamente, en lugar de metilar el ADN mutagenizado e introducirlo en un H. somnus que expresa endonucleasa de restricción de Hsol , se puede omitir ia metilación del ADN mutagenizado e introducir el ADN mutagenizado en una célula de H. somnus, H. haemoliticus o H. influenza que no expresa eficientemente la endonucleasa de restricción de Hsol o un isosquizomero del mismo. Dichas células se pueden aislar en la naturaleza por tamizado extensivo, aislar siguiendo la mutagénesis química de una célula que expresa la endonucleasa de restricción de Hsol , o formarse por el método de mutagénesis dirigido a sitio descrito en la presente. De acuerdo con un aspecto de la invención, la región de ADN de H. somnus metilada se introduce en una célula de P. multocida sobre un plásmido que incluye una P. haemolytica de aproximadamente 4.2 kb de plásmido de determinación de resistencia a estreptomicina (pD70) . Este plásmido también ha sido depositado con American Type Culture Collection , 12301 Parklawn Drive, Rockvil le, MD, 20852, USA, el 2 de Diciembre de 1993, bajo los términos del tratado de Budapest como Número de Acceso ATCC 69499. Los derivados de este plásmido u otros plásmidos incompatibles pD70 pueden utilizarse de manera simi lar. El origen de replicación de pD70 puede aislarse sobre un fragmente de 1 .2 kb Sau3AI inmediatamente corriente abajo de la determinante de resistencia a estreptomicina. La conversión de genes puede monitorearse entre otras cosas por hibridización Southern que prueba a gen de interés, tamizando marcadores genéticos en la construcción de ADN introducida (tal como ampicilinaR o estreptomicinaR) y tamizando la presencia/ausencia del plásmido en la progenie de células transformadas. También la presente invención provee cepas mutantes y transformantes hechas de los métodos descritos de transformación y/o mutagénesis dirigida a sitio. Dichas mutantes pueden proveer las técnicas de veterinaria con cepas vivas atenuadas de Pasteurellaceae, que son adecuadas para vacunas para inducir inmunidad o protectora contra infección de Pasteurellaceae. Para la producción de vacunas, es conveniente que la mutación que atenúa la bacteria pueda ser una mutación esencialmente no revertida. Normalmente estas son mutaciones de supresión o inserción, la última no siendo ocasionada por un elemento transposable. Las cepas que contienen múltiples mutaciones de atenuación también puede utilizarse, de manera que el riesgo de reversión a una bacteria v /iirulenta de tipo silvestre es insignificantemente pequeño. Las m liutantes de atenuación adecuadas pueden ser, por ejemplo, auxotróficas. Las mutantes con factores de virulencia alterados también pueden utilizarse. Una cepa mutante que puede formarse por el método de mutagénesis dirigida a sitio descrito que es negativa endonucleasa de restricción de Hsol. Dicha cepa es útil para el tratamiento genético en H. somnus. Dicha cepa puede ser una receptora de ADN que no es metilada con metiltransferasa de Hsol, aún podría producir ADN que es metilado con metiltransferasa de Hsol . U na preparación de endonucleasa Hsol aislada se puede preparar, entre otras cosas, pasando un lisato libre de células de H. somnus sobre una columna de heparina-sefarosa. Otras técnicas conocidas para aislar las endonucleasas de restricción pueden utilizarse según sea apropiado. Normalmente la actividad específica de dicha preparación será enriquecida comparado con el lisato libre de células. La presente invención, por lo tanto, permite que aquellos con experiencia ordinaria en la materia introduzcan establemente ADN en H. somnus. El ADN puede ser de otras cepas o especies. El ADN puede modificarse artificialmente o puede estar en su estado nativo. Si se desea la recombinación en el genoma, se prefieren dos regiones de homolog ía de flanqueo. Dichas técnicas generalmente son conocidas para otras bacterias, pero no han sido exitosas en H. somnus debido a su sistema de restricción.

Las vacunas normalmente se formulan utilizando una solución salina con pH regulado estéril . Se pueden utilizar sacarosa y/o gelatina como estabilizantes, como se conoce en la materia. Es conveniente que las vacunas de Pasteurellaceae de la invención se administren por la ruta intranasal o intratecal, pero también se pueden utilizar inyecciones subcutáneas, intramusculares e intravenosas. Las formulaciones adecuadas y técnicas se enseñan por Kucera E. U.A. 4, 335, 106, Gilmour E. U .A. 4,346,074 y Berget E. U .A. 4,957,739. Normalmente, se administran entre 107 y 101 1 CFU por dosis, aunque se puede utilizar de 105 a 103 CFU . También se pueden agregar auxiliares. EJ EMPLOS Ejemplo 1 : Construcción y mutagénesis de plásmidos. El plásmido de 4.2 kb (pD70) que codifica resistencia a estreptomicina en serotipo 1 de Pasteurella haemolytica han sido secuenciados y descritos previamente (Chang, Tatum) . El plásmido se linearizó por digestión de Hind\ \ \ y se enromaron por el tratamiento con dNTPs y fragmento Klenow. Un rollo de canamicina (Genblock) digerido previamente con SamHI y hecho romo como antes, se ligó en pD70 para producir pD70kan. Este plásmido se amplificó en Pha\ de metiltransferasa que contiene DH 10B de E. coli sobre P?alrntasa de cósmido. El plásmido se introdujo en la cepa P. haemolytica de NADC-D 153. El ADN de plásmido (1 ug) recuperado de una transformante resistente a canamicina se mutagenizó con hidroxilamina durante 90 minutos a 70°C como se describió previamente. El ADN tratado se dializó contra TE, se precipitó con etano y se resuspendió con TE (10 mM Tris, 1 mm EDTA, pH 8.0). Ejemplo 2: Recuperación de plásmidos sensibles a la temperatura. Se desarrolló la cepa NADC D 153 de serotipo 1 de Pasteurella haemolytica hasta la fase tardía logarítmica en 100 mi de caldo columbia a 37°C con agitación suave. Las bacterias se formaron en pellas por centrifugación a 5000 x G y se lavaron en 100 mi de 272 mm de sacarosa a 0°C. La pella se resuspendió en un volumen igual de 272 mm de sacarosa a 0°C. Las células competentes (100 ug) se colocaron en seis cubetas de electroporación de 0.1 cm y se mezclaron con 100 ng del ADN tratado. Las células se electroporaron (pulsador de genes, Bio-Rad) a 18,000 V/cm y 800 ohms dando constantes de tiempo que varían de 1 1 -12 mseg. I nmediatamente después de cada electroporación las células se resuspendieron en 1 .0 ml de caldo columbia a 0°C. La recuperación fue durante 2 horas a 30°C. La suspensión se difundió (100 ul/placa) en placas de agar columbia (Difco) conteniendo 50 ug/ml de canamicina. Las placas se incubaron 28 horas a 30°C después se transfirieron a 42°C durante 6 horas. Las colonias fueron picadas, las cuales fueron más pequeñas que las colonias normales y puntearon en placas de canamicina. Después de la incubación a 30°C durante la noche, se duplicó el desarrollo de cada colonia seleccionada en placas de agar de columbia con y sin canamicina y después se incubaron durante la noche a 42°C. El crecimiento de placas no selectivas no se transfirió a placas de canamicina que se incubaron durante la noche a 30°C. Los clones que no se desarrollaron con la selección a 42°C pero que se desarrollaron bien en medio selectivo a 30°C después del paso sin selección a 42°C se supone que son sensibles a la temperatura para la expresión de canamicina. Los clones simi lares que exhibieron crecimiento reducido sobre placas selectivas a 30°C después del paso sin selección a 42°C se supone que son sensibles a la temperatura para mantenimiento de plásmidos. Cuatro de los últimos clones se seleccionaron para estudio adicional. Ejemplo 3: Prueba de plásm idos sensibles a la temperatura. El ADN de plásmido se recuperó por un procedimiento de lisis alcalino de cuatro clones de P. haemolytica que se supone que contiene origines de plásmidos sensibles a la temperatura de replicación. El ADN se electroporó en la cepa de NADC TT94 de P. multocida, un aislado de pulmón de bovino que es del tipo A: 3 de Carter-Heddleston. Después de la metilación específica con Hha\ (como se describió previamente) el ADN se electroporó en una cepa HS91 de H. somnus, un asilado de pulmón de bovino. Los transformantes se desarrollaron durante la noche en placas de agar columbia suplementado con 5% de sangre de bovino y 50 ug/ml de canamicina a 30°C en 10% de CO2. Los cultivos de caldo duplicados se inocularon con transformantes de cada organismo y plásmido. U n cultivo se desarrolló durante la noche a 40°C, y el otro a 30°C. El plásmido se recupero de cada caldo por un procedimiento de lisis alcalino y se resolvió en geles de agarosa al 1 %. Las placas selectivas y no selectivas se penetraron para la evaluación subjetiva del porcentaje de CFU resistente a canamicina después del pasaje. Ejemplo 4: Propiedades del plásmido condicional para repl icación. Se transformó Pasteurella haemolytica para resistencia a canamicina por el plásmido mutagenizado a una eficiencia de aproximadamente 6x104 CFU/ug de ADN . De los transformantes, se encontró que aproximadamente el 1 % (360) forman colonias atípicamente pequeñas después de la incubación a 42°C. El pasaje de estas colonias tanto a 30°C como a 42°C sobre placas con o sin canamicina reveló que aproximadamente el 90% de los transformantes fueron sensibles a la temperatura para la expresión de resistencia a la canamicina (aproximadamente el 10% no se desarrollaron en el primer pasaje y no se probaron más). Estos organismos formaron colonias sobre placas selectivas yno selectivas a 30°C pero no se desarrollaron sobre placas selectivas a 42°C. El pasaje de crecimiento de placas no selectivas a 42°C a placas selectivas a 30°C dio como resultado el crecimiento grueso, indicando que el plásmido aún está presente. Se detectó un plásmido de 5.5 kb en preparaciones de plásmido de las representativas de estos cultivos. Diez de las 360 colonias se compararon sobre el pasaje de manera simi lar a las colonias que contienen genes de canamicina sensibles a la temperatura excepto que se redujo el desarrollo sobre el medio selectivo a 30°C después del pasaje sin selección a 42°C. Pareció que estas colonias varían en porcentaje de resistencia a la canamicina después del paso sin selección a 42°C indicando diferencias posibles en su grado de estabilidad a una temperatura no permisiva (42°C). Cuatro se seleccionaron en base a su bajo rendimiento de colonias resistentes a la canamicina después del pasaje sin la selección a la temperatura no permisiva. Los cuatro plásmidos sensibles a la temperatura se introdujeron fácilmente en la cepa NADC-TT94 de P. multocida y en la cepa de NADC-HS91 de H. somnus (después de la metilación apropiada) . Los plásmidos se comportaron como lo hicieron en P. haemolytica. No se observó desarrollo sobre placas selectivas incubadas a 40°C y no se detectó el plásmido en cultivos de caldo desarrollados sin selección a 40°C. Los cultivos transformados con plásmido de tipo silvestre crecieron bien bajo selección a 40°C y produjeron ADN de plásmido de cultivos de caldo no selectivos a esa temperatura. Todos los cultivos se desarrollaron y produjeron plásmidos cuando crecieron con o sin selección a 30°C. Los resultados indican que la replicaciónl de plásmido es condicional a la temperatura en cada una de las tres especies de bacterias. Uno de los plásmidos condicionales a la temperatura llamados pBB 192 ha sido depositado en NADC D 153 de P. haemolytica en American Type Culture Collection, Rockville, M D, 20852 bajo No. de Acceso ATCC 55893 el 2 de Diciembre de 1996. Ejemplo 5: Aislam iento y caracterización de endonucleasa de restricción, Hsol, de Haemophilus somnus y protección de ADN heterólogo por meti ltransferasa de Hha?.

Las fracciones cromatográficas que exhiben actividad de endonucleasa se eluyeron de las columnas de heparina-sefarosa por 680 y 760 mm de NaCI (950 - 1060 µS). Un solo paso a través de estas columnas fue suficiente para identificar tanto la especificidad de reconocimiento como el sitio de separación. La digestión de ADN lambda con la preparación de Hsol concentrado dio como resultado un patrón de fragmento de restricción distintivo idéntico al producido por Hha\, una endonucleasa de restricción comercialmente disponible aislada de Haemophilus haemolytica. El sitio de separación (5' ...G4CGC...3') se encontró que difiere de Hftal , produciendo un coagente 5' idéntico al producido por HinP\ . Métodos Usados Bacteria, desarrollo y extracto crudo. Se desarrolló la cepa 2336 de Haemophilus somnus, (amablemente suministrado por Lynette Corbeil, San Diego, CA), durante 16 horas en placas de agar chocolate (base agar de sangre Columbia; Difco, Detroit, Mich , suplementado con 5% de sangre de bovino desfibrinada a 90°C, 200-ml de volumen total). Las células se recuperaron en TE (10 mm Tris, 1 mm EDTA, pH 8.0) , se formaron en pellas por centrifugación a 16, 000 x g durante 5 minutos a 4°C y se lavaron una vez en TE. La pella lavada se resuspendió en 12 mi de solución reguladora de pH que corre en cromatografía (20 mm de fosfato de sodio, 10 mm de 2-mercaptoetanol, pH 8.0, 0°C) y se colocó sobre hielo. Las células bacterianas se alteraron por tratamiento con sonido durante 2 min. en lapsos de 15 segundos. Los acechos y células no rotas se removieron por centrifugación a 16,000 x g durante 10 minutos y el sobrenadante se filtró a través de una membrana de tamaño de poro de 0.45 um (Millex-HA; Millipore Corp., Bedford, Mass.). No se llevó a cabo tratamiento adicional del extracto crudo antes de la cromatografía. Separación cromatográfica de proteínas. Todos los procedimientos cromatográficos se llevaron a cabo a temperatura ambiente. Las columnas pre-empacadas de heparina-Sefarosa (columnas de heparina en Econopac; Bio-Rad, Richmond, Calif.) se equilibraron como se recomienda por el fabricante. Un régimen de flujo de 1.0 ml/min. se utilizó para la separación, utilizando un sistema cromatográfico automático de baja presión de gradiente (Automated Econo-Systems; Bio-Rad, Richmond, Calif.). Cinco mi de extracto crudo se inyectaron y se utilizó un gradiente de 0 a 1.0 m de NaCI en 60 mi de solución reguladora de corrida para eluir proteínas. Las fracciones (1 mi) se almacenaron en hielo antes del análisis de actividad. Se llevó a cabo una segunda separación cromatográfica idéntica con una nueva columna a partir de la cual se recuperaron fracciones activas y se combinaron para su almacenamiento. Análisis para actividad de restricción de endonucleasa.

Alícuotas (5 ul) de las fracciones cromatográficas se incubaron con 1 ul de React 1 (BRL, Gaithersburg, MD) y 0.5 ul de ADN lambda de bacteriófago no metilado (0.5 ug/ul; New England Biolabs, Beverly, Mass) a 37°C durante 2 horas. Después de la adición del colorante de rastreo y electrofóresis sobre un gel de agarosa al 1% en solución reguladora de pH de Tris-borato-EDTA, se visualizaron los patrones de bandas con tinsión con bromuro de etidinio e iluminación por UV. Las fracciones que corresponden a la actividad de separación de ADN se combinaron de la segunda separación cromatográfica, se concentraron 20 veces sobre uitrafiltros de corte de peso molecular de 30,000 y se llevaron a concentraciones finales de 150 mm de NaCI, 10 mm de fosfato de calcio , 0.1 mm de EDTA, 5 mm de 2-mercaptoetanol, 0.25 ug de albúmina de suero de bovino por mi y glicerol al 50:50 (vol. /vol . ) , pH 8.0 , para almacenamiento a -20°C. La preparación concentrada se designó Hsol. Determinación de los sitios de reconocimiento y separación para Hsol. La secuencia de reconocimiento se identificó por digestión de pBluescript (Stratagene, La Jolla, Calif) y de ADN lam bda. El sitio de separación se identificó por digestión de una reacción de síntesis iniciada sobre pBluescript. Un iniciador de oligonucleótidos se sintetizó el cual es complementario con las secuencias 3' de un sitio de Hsol de pBluescript. Se utilizó ADN de un solo hilo para el patrón . Las reacciones de secuenciación de ADN de desoxi normales se llevaron a cabo y se extendió una reacción adicional que contiene un terminador desoxi a través del sitio de Hsol con el fragmento de Klenow de la polimerasa I de ADN utilizando el iniciador marcado con P32 final. La reacción de extensión se detuvo por extracción de fenol-cloroformo seguido por ia precipitación de etanol. Se agregó Hsol o Hha\ (New England Biolabs) a las reacciones adicionales y se dejó digerir el ADN durante 2 minutos. La reacción se detuvo por la adición de solución reguladora de pH de carga de gel y calentado a 80°C durante 3 minutos. Ejemplo 6: Transformación de H. somnus con ADN meti lado El ADN obtenido de H. somnus de E. coli y metilado in vitro con metiltransferasa de Hha\ fue resistente a la separación tanto para Hsol como para Hha\. La protección por metilación in vitro se encontró frecuentemente que es parcial, basado en la movilidad electroforética de ADN después de la digestión con y sin metilación in vitro previa, aún cuando el ADN del substrato ha sido fenol-cloroformo-alcohol de isoamilo extraído y después purificado por centrifugación de gradiente de CsCI. La introducción del ADN de plásmido en Haemophilus somnus se aumentó a aproximadamente 4 ordenes de magnitud por la metilación previa in vitro del plásmido. Cada uno de los plásmidos basados en pD70 transformó H. somnus, pero disminuyó eficientemente a medida que se aumentó el tamaño. Es posible que un segundo sistema de modificación para restricción sea responsable de la reducción marcada en eficiencia a medida que se incrementa el tamaño del plásmido. La posibilidad de los sistemas análogos a mcr o mrr en E. coli no fue investigada. La protección parcial en lugar de completa conferida por metilación in vitro y también podría tomarse en cuenta para la reducción. N o se recuperaron transformantes resistentes a ampicilina, indicando que el rollo resistente a ampicilina de pD80 no se expresa en H. somnus o que el origen de replicación no funcionó. U n replicón basado en pD70 que contiene el rollo de resistencia a ampicilina de pD80 en el sitio de H cflll transformó H. somnus para dar colonias resistentes a estreptomicina. Estas colonias no se replicaron sobre el medio que contiene ampicilina, indicando que el rollo de ampicilina no funciona en H. somnus. El origen de pD80 de replicación no se probó más . El rollo de resistencia a canamicina derivado de Tn903 se encontró que es excelente para la selección de transformantes. La estreptomicina solamente proveyó una selección justa. Los transformantes que contienen rollos resistentes a estreptomicina y canamicina fueron más fuertes sobre la selección de canamicina que sobre estreptomicina. A la inversa, las colonias no transformadas fueron comunes sobre la selección de estreptomicina pero no se encontraron sobre la selección de canamicina. U na segunda cepa de H. somnus, 649 (suministrada amablemente por el Dr. Lynette Corbeil) , no se transformó por derivados de pD70. Se encontró que esta cepa aloja un pequeño plásmido el cual se supone que es incompatible con pD70. Este plásmido, pD70, puede servir como un vector útil para la introducción de ADN en la bacteria. El sistema de modificación de restricción se l levó a cabo por Haemophilus somnus o es útil para manipular genéticamente este patógeno. La metilación específica contra la endonucleasa de restricción permite la introducción de ADN extraño. Dos replicones, ambos basados en orígenes similares de repiicación, se descubrieron los cuales de uso como vectores para la introducción de genes extraños. Métodos Utilizados Construcción y metilación de vector disparador. Un derivado de pD70, el plásmido de resistencia a estreptomicina de 4.2 kb de serotipo 1 de Pasteurella haemolytica, se construyó previamente durante experimentos implicando esa bacteria. En resumen, el fragmento puede ser Psíl de 2.2 kb de pD70 que contiene resistencia a estreptomicina se extirpó de un gel de agarosa al 1%, se electroeluyó y se ligó con un rollo de canamicina de Psíl derivado de Tn903. (Genblock, Pharmacia). El plásmido resultante confirió resistencia a canamicina en E. coli y P. haemolytica. El plásmido se metilo con metiltransferasa de Hha\ comercialmente disponible de acuerdo con la instrucción. Otros plásmidos basados en origen de pD70 de replicación fueron probados, incluyendo pD70 intacto, pD70kan (pD70 con el rollo de canamicina ligado romo en el único sitio de Hind\\\) y pD80 (el plásmido de P. haemolytica de 4.2 kb que codifica resistencia a ampicilina). Electroporación de ADN metilado en Hemophilus somnus. La cepa NADC Hs91 de Haemophilus somnus (aislado de pulmón de bovino neumónico) se desarrollo en 100 mi de caldo de Levinthol a 37°C en un 10% de C02 a la última fase logarítmica, aproximadamente durante cuatro horas. El desarrollo se formó en pellas por centrifugación a 5000 x G durante quince minutos y se lavó una vez con 100 mi de 272 mm de sacarosa 0°C. La pella se resuspendió en bacteria empacada a 272 mm de sacarosa sobre hielo al 1 :3. Las bacterias competentes (100 mi) se mezclaron con 10 ng de ADN de plásmido ya sea no metilado o metilado in vitro en cubetas de electroporación 0.1 cm (Bio-Rad) . Las células se electroporaron rápidamente después de la adición de ADN (pulsador de genes, Bio-Rad) a 18, 000 V/cm , 800 ohm , 25 m Fd con constantes de tiempo resultante que varían de 1 1 a 15 mseg . Inmediatamente se ag regó caldo de Levinthal (1 ml , 0°C) a las células electroporadas y la suspensión se incubó a 25°C durante aproximadamente 10 minutos. Las células entonces se recuperaron a 37°C con 10% de C02 durante 2 horas. Se sembraron en placas de dilusión diez veces en placas de agar chocolate (base agar de sangre columbia con 5% de sangre de bovino desfibrinada) conteniendo 50 mg/ml de canamicina, 100 mg/ml de estreptomicina, ó 20 mg/ml de ampicilina. Las colonias se enumeraron después de 36 de horas de incubación a 37°C con 10% de CO2. Las colonias representativas se examinaron para contenido de plásmido utilizando un procedimiento de lisis alcalina rápido. Ejemplo 7: Uso de repl icón cond icional de temperatura para generar una mutante de supresión aroA de Pasteurella multocida Los intentos previos para producir mutantes de remplazo de genes de P. multocida en nuestro laboratorio se ocultaron por las eficiencias de eletroporación y por la replicación de replicones basados de Coi E1 en P. multocida (resultados no publicados) .

Además, los productos de reemplazo de genes normalmente contienen genes de resistencia a antibióticos extraños que pueden impedir o retardar los usos partículas de mutantes de alguna manera convenientes. El plásmido de disparo construido aquí se utilizó para superar estos problemas. El origen de replicación del plásmido de pD70 de P. haemolytica se encontró que está dentro de un fragmento de 1 .2 kb de Sau3A 1 corriente a bajo de la región de codificación de estreptomicina. Junto con un rollo de canamicina derivado de Tn903, el vector (pBB 192) probó replicarse en miembros de la Familia Pasteurellaceae pero no particularmente bien en E. coli, requiriendo la clonación de secuencias apoyándose en el origen de pD70 para ser llevado a cabo en un huésped de Pasteurellaceae. Mientras que no es adecuada para usarse en P. multocida, se construyó un derivado del vector de disparo el cual contiene un origen de ColEl de replicación en el sitio de BamH l (pBB 192C) para la facilitar la construcción en E. coli de construcción condicionales de temperatura para usarse en organismos blancos de P. haemolytica o H. somnus (resultados no publicados) . El plásmido pBB192C se replicó eficientemente en E. coli. Aproximadamente 100 transformantes de P. multocida se recuperaron sobre canamicina a 30°C de electroporación con 25 ng de plásmido de reemplazo. El pasaje de cultivos de caldo de 6 colonias representativas a placas de canamicina a 40°C dio como resultado aproximadamente 20 colonias bien aisladas de cada 10 ul de inoculó , pero el número de colonias producidas varia entre los seis cultivos. El tamaño de colonia varió significativamente sobre cada placa, dando un número de colonias pequeñas y pocas colonias grandes. La proporción relativa de estos tamaños varia entre los 6 cultivos. El análisis de manchas Southern del ADN genómico de las colonias (probando con aroA) reveló que las colonias pequeñas fueron productos de eventos de cruce sencillos. Las colonias grandes contuvieron secuencias homologas aroA que no fueron similares en tamaño al plásmido de reemplazo además de un fragmento consistente con el aroA cromosomal de tipo silvestre. Las colonias grandes no se examinaron más. Nuestra interpretación de los datos es que el plásmido de reemplazo integrado desestabilice el cromosoma, dando como resultado una reducción substancial en el régimen de replicación y por lo tanto conteniendo tamaño de colonias pequeñas. El plásmido de reemplazo, sin embargo , se replica tan ineficientemente por si mismo a la temperatura no permisiva que las colonias no se forman totalmente bajo selección de canamicina. Esta situación crea una fuerte presión selectiva para redisponer el plásmido para replicación mejorado o para integrarlo en la secuencias de plásmido de cromosomas que contienen el gen de canamicina, dando como resultado algunos productos no probablemente potenciales. El paso del desarrollo de productos de eventos de un solo cruce sin selección de canamicina dio como resultado más del 99% de perdida de resistencia a la canamicina en un solo paso. Estos resultados indican la inestabilidad substancial del producto de un solo cruce. Entre 500 colonias aisladas de dicho pasaje, 5 no se desarrollaron sobre el medio definido y bajo la selección de canamicina. El análisis de manchas Southern confirmó la perdida de secuencias de ADN homologas al fragmento de C/al - EcoRV suprimidos, no mostraron homología con el vector de plásmido y mostraron una reducción de aproximadamente 300 pb en tamaño de aroA cromosomal. Los resultados de análisis de RCP indicaron una reducción de 300 bp en el tamaño del producto. La secuenciación del producto de RCP confirmó una supresión que se extiende desde el sitio de EcoRV a ligeramente más allá del sitio de C/al, 5'-ATTGATAT-GAACCAT-3', que no altera el marcado de lectura de las secuencias de ADN corriente abajo. El vector de disparo sensible a la temperatura separó la supresión de transformación bacteriana desde la selección de productos de cruce en reemplazo de genes. También se amplificó la generación de productos sin marcadores seleccionables extraños. La inestabilidad de los productos de un solo cruce pareció facilitar la resolución del plásmido del cromosoma para generar mutantes de supresión sin utilizar la selección negativa dada por dichos genes como SacB. Dado que el vector se replica condicionalmente a la temperatura en P. haemolytica y en H. somnus, probablemente debería ser igualmente útil en estas y otras Pasteurellaceae también.

La mutante de aroA de P. multocida construida aquí que se depositó el 2 de Diciembre de 1996, en ATCC y se le dio el número de acceso ATCC 55892, difiere del descrito por Homchampa y otros debido a que la cepa presente es de origen bovino, se introdujo una supresión en aroA y no están presentes secuencias de ADN en el producto. Esta mutante puede utilizarse como una vacuna viva atenuada. Métodos empleados Construcción de vector de disparo sensible a la temperatura. Un vector de disparos se construyó basado en el origen sensible a al temperatura descrito previamente de replicación de pD70, el plásmido de resistencia a estreptomicina aislado originalmente del serotipo 1 de P. haemolytica (Tatum y otros, Chang). Un producto de RCP de aproximadamente 1450 pb se produjo de pD70kan #192 sensible a la temperatura utilizando iniciador delantero 5'-GCCTGTTTTTCCTGCTC-3' y el iniciador inverso 5'-CCTGCGGTGTAAGTGTTATT-3'. El producto se digirió con Sau3A1 para completarse con el fin de producir un fragmento de aproximadamente 1.2 kb. Un rollo de resistencia a canamicina de Tn903 (GenBlock, Pharmacia) se digirió con EcoRI, ligado en el sitio de EcoRI de pBC SK (Stratagene), y se electroporó en la cepa 30-9G de E. coli para producir un ADN de plásmido metilado con Pha\ (Briggs y otros). El rollo de resistencia a la canamicina de aproximadamente 1.3 kb se extirpó del plásmido metilado con BamHl y se ligo durante la noche al Sau3A1 de 1.2 kb. La mezcla de ligación se electroporó en la cepa NADC-D153 de P. haemolytica y el plásmido se recuperó de colonias resistentes a canamicina. Se encontró que una porción del sitio de clonación múltiple pBC SK del sitio £coR1 al sitio de BamHl se transfirió junto con el rollo de canamicina, dando como resultado un plásmido de 2.5 kb con un único sitio de EcoR1 y un único sitio de BamHl efectivamente que se replica en P. haemolytica, H. somnus a 30°C pero muy pobremente en E. coli. El plásmido se nombra pBB192. Clonación y supresión de aroA de P. multocida. Se produjo un producto de RCP de 1.2 kb conteniendo el gen aroA usando un iniciador hacia adelante 5'-TTACTCTCAATCCCATCAGCTATA-3' y un iniciador inverso 5'-CTATCTGTAGGCTACTTGCCGTG-3'. El producto se clonó en un vector que contiene sitos de EcoR1 que flanquean el inserto del producto de RCP (vector TA, Invitrogen). El inserto se extirpo con EcoR1 y se ligó en el sitio de EcoR1 de puC9. El producto se digirió por duplicado con C/al y EcoRV para remover un fragmento de aproximadamente 300 pb. Los extremos del plásmido restante se enromaron utilizando el fragmento Klenow de polimerasa i de ADN y dNTPs se ligó entonces sobre ellos mismos para generar una supresión de aroA. El plásmido suprimido se amplificó en la cepa de £. coli 30-9G para metilar con Pha\ el ADN digerido después con EcoR1 y se electroporó sobre un gel de agarosa para confirmar la supresión. El fragmento de aroA de EcoR1 metilado con Pha\ que contiene la supresión se ligó en el sitio de £coR1 de pBB192 para crear pBB192Pm?aroA. La mezcla de ligación de electroporó en la cepa NADC-D153 de P. Haemolytica y el plásmido se recuperó de las colonias resistentes a la canamicina.

Producción de productos de un solo cruce de P. multocida. La cepa de Pasteurella multocida NADC-TT94, un aislado e pulmón de bovino de tipo A:3 de Carter-Heddleston, desarrolló 4 horas en 10 mi de caldo columbia conteniendo 2,500 U hialuronidasa. El crecimiento se centrifugó a 5000 x g durante 15 minutos y se lavó dos veces en 272 mm de sacarosa a 0°C y después se resuspendió en 1 mi de 272 mm de sacarosa. Las células (100 µl) se electroporaron (pulsador de genes, Bio-Rad) con 25 ng pBB192Pm?aroA en una cubeta de 0.1 cm a 1.8 kv, 800 O, y 25 µF con una constante de tiempo resultante de 14.7 ms. Las células se resupendieron inmediatamente en 1 mi de caldo columbia a 0°C y después se incubaron durante 2 horas a 30°C. La células recuperadas se esparcieron 100 ul/placas sobre placas de agar columbia conteniendo 50 µg/ml de canamicina y después se incubaron 24 horas a 30°C. Seis colonias se pasaron por separado a 5 mi de caldo columbia conteniendo 50 µg/ml de canamicina que se incubaron 18 horas a 30°C. El crecimiento se difundió (10 µl/paca) sobre placas de agar columbia con canamicina que se incubaron 24 horas a 40°C. Las colonias representativas se pasaron a caldo columbia (25 mi) con canamicina (para confirmar productos de un solo cruce por análisis de manchas Southern) y a caldo columbia (5 mi) sin canamicina (para tamizar mutantes de supresión) y se incubó durante la noche a 40°C. Tamizado para mutantes de supresión de P. multocida. El cultivo de caldo no selectivo anterior, placas de agar columbia se fijaron penetrando para colonias aisladas y se incubaron durante la noche. Se pasaron quinientas colonias aisladas en placas de microtitulación conteniendo 100 µl de caldo columbia/pozo y se incubaron 6 horas. El crecimiento (1 µl) se pasó en cada una de las dos placas de microtitulación conteniendo ya sea 100 µl/pozo de caldo de columbia con canamicina o 100 µl/pozo de triptofano que carece de medio definido químicamente basado en el de Wessman y otros y el de Watko y otros. Los pozos que se desarrollaron únicamente en la placa de microtitulación no selectiva orig inal pero no en canamicina o medio definido se supuso que eran mutantes de supresión. Estas se pasaron para análisis de machas Suorthern y para análisis de RCP usando iniciador hacia adelante 5'-CTACCCACCTATCGCCATTC-3' e iniciador inverso 5'-TCCGCCCCCACCTTA-3'. El producto de RCP de una de las mutantes de supresión se clonó para secuenciación de la supresión.

Claims (39)

1. REIVINDICACIONES 1. Un plásmido que es condicional para replicación en H. somnus, P. multocida y P. haemolytica. 2. El plásmido de la reivindicación 1, que comprende un origen de replicación de un grupo de incompatibilidad que comprende pD70
2. (ATCC 69499).
3. 3. El plásmido de la reivindicación 1, que comprende un origen de pD70 de replicación.
4. 4. El plásmido de la reivindicación 1, que se replica a 30°C pero que no se replica a 42°C.
5. 5. El plásmido de la reivindicación 4, que se ha depositado en American Type Culture Collection como No. De Acceso ATCC 55893.
6. 6. Una preparación libre de células del ADN de plásmido se purificó de ADN genómico que comprende un plásmido que es condicional de temperatura para replicación en H. somnus, P. multocida y P. haemolytica.
7. 7. Una célula huésped de la familia Pasteurellaceae que comprende el plásmido de la reivindicación 1.
8. 8. Una célula huésped de la familia Pasteurellaceae que comprende el plásmido de la reivindicación 2.
9. 9. Una célula huésped de la familia Pasteurellaceae que comprende el plásmido de la reivindicación 3.
10. 10. Una célula huésped de la familia Pasteurellaceae que comprende el plásmido de la reivindicación 4.
11. 11. Una célula huésped de la familia Pasteurellaceae que comprende el plásmido de la reivindicación 5.
12. 12. Un método para introducir ADN a H. somnus, que comprende los pasos de: proveer una molécula de ADN; metilar la molécula de ADN con una enzima metiltransferasa que tiene un sitio de reconocimiento de 5'-GCGC-3\ para formar ADN metilado; transformar células de H. somnus con el ADN metilado.
13. 13. El método de la reivindicación 12, en donde la enzima de metiltransferasa produce un sitio 5'-GmCGC-3\
14. 14. El método de la reivindicación 12, en donde la enzima de metiltransferasa se selecciona del grupo que consiste de: M Hsol, M.Hhal, M.H/nPl.
15. 15. Un método para producir un mutación en una región particular de ADN de un genoma de H. somnus: aislar una región del genoma de H. somnus; introducir una mutación en la región para formar una región de ADN mutado; metilar la región de ADN mutado con una enzima de metilación que inhibe la separación de endonucleasa a una secuencia de reconocimiento 5-GCGC-3' para formar ADN metilado; introducir el ADN metilado a una célula de H. somnus para formar transformantes; y tamizar dichos transformantes para aquellas que tienen la mutación en la región sobre ADN cromosomal de la célula de H. somnus.
16. 16. El método de la reivindicación 15, en donde el paso de metilación se lleva acabo por el pasaje de la región de ADN a través de una célula de metilación que contiene metiltransferasa de M.Hha o M.H/pPI.
17. 17. El método de la reivindicación 15, en donde el paso de metilación se lleva acabo in vitro.
18. 18. El método de la reivindicación 15, en donde la enzima de metilación es metiltransferasa de M.Hñal o M.H/pPI.
19. 19. El método de la reivindicación 15, en done el ADN metilado se introduce en H. somnus sobre un plásmido que comprende pD70, un plásmido de 4.2 kb StrR de P. haemolytica depositado en ATCC como No. de Acceso ATCC 69499.
20. 20. El método de la reivindicación 15, en donde el ADN metilado se introduce en H. somnus sobre un plásmido que comprende un origen de replicación de pD70, un plásmido de 4.2 kb StrR de P. haemolytica depositado en ATCC como No. de Acceso ATCC 69499.
21. 21. El método de la reivindicación 19, que comprende además: tamizar las transformantes para perdida del plásmido de 4.2 kb de StrR.
22. 22. Un método para producir una mutación en una región particular de ADN de un genoma de H. somnus: aislar una región del genoma de H. somnus; introducir una mutación en la región para formar una región de ADN mutado; introducir el ADN metilado a una célula de H. somnus que carece de una endonucleasa de restricción de Hsol para formar transformantes; y tamizar dichos transformantes para aquellas que tienen la mutación en la región sobre ADN cromosomal de la célula de H. somnus.
23. 23. Una preparación de una endonucleasa de Hsol.
24. 24. Una mutante de H. somnus hecha por el proceso de la reivindicación 15.
25. 25. Una transformante de H. somnus hecha por el proceso de la reivindicación 12.
26. 26. Una transformante aislada y purificada de H. somnus que ha sido modificada genéticamente por la introducción estable de ADN.
27. 27. La cepa de H. somnus de la reivindicación 26, en donde el ADN introducido se recombina con ADN genómico de H. somnus.
28. 28. Un método para introducir un segmento de ADN a un genoma de Pasteurellaceae que comprende: administrar a una célula de Pasteurellaceae una construcción recombinante que comprende el segmento de ADN y un plásmido que es condicional a la temperatura para la replicación en la célula de Pasteurellaceae para formar transformante; someter las transformantes a una temperatura no permisiva; tamizar las transformantes para presencia del segmento de ADN; y tamizar las transformantes para ausencia del plásmido.
29. 29. El método de la reivindicación 28, en donde el segmento de ADN es un elemento transposable.
30. 30. El método de la reivindicación 28, en donde el segmento de ADN es una forma mutante del ADN genómico de Pasteurellaceae.
31. 31. El método de la reivindicación 30, en donde la forma mutante es una supresión.
32. 32. El método de la reivindicación 30, en donde la forma mutante es una inserción.
33. 33. El método de la reivindicación 28, en donde el plásmido comprende un origen de repiicación de un grupo de incompatibilidad que comprende pD70.
34. 34. Una Pasteurellaceae modificada genéticamente formada por el método de la reivindicación 28.
35. 35. Una Pasteurellaceae modificada genéticamente formada por el método de la reivindicación 29.
36. 36. Una Pasteurellaceae modificada genéticamente formada por el método de la reivindicación 30.
37. 37. Una Pasteurellaceae modificada genéticamente formada por el método de la reivindicación 31.
38. 38. Una Pasteurellaceae modificada genéticamente formada por el método de la reivindicación 32.
39. 39. U na Pasteurellaceae modificada genéticamente formada por el método de la reivindicación 33. RES U M EN Se proporcionan herramientas para tratar mediante ingeniería genéticamente Pasteurellaceae. Los plásmidos de replicación condicional que son útiles para Pasteurellaceae han sido aislados y caracterizados. Los plásmidos pueden ser utilizados para entregar segmentos de ADN dentro de Pasteurellaceae, en situaciones en las cuales se desea el control de la replicación extracromosómica, tal como para lograr un intercambio alélico o mutagénesis directa al sitio. Se aisló una endonucleasa de restricción, Hsol, a partir de un aislado de pulmón de bovino de Haemophilus somnus. Se encontró que la enzima era un verdadero isosquizómero de HinP\, una enzima disponible comercial mente aislada originalmente de Haemophilus influenzae Pl . Se encontró que la transferasa metílica de Hha\ comercial mente disponible protege en contra de la división por ambas enzimas. Se encontró que la metilación del plásmido extranjero de ADN mejora la transformación de Haemophilus somnus en exceso de cuatro ordenes de magnitud.