MXPA98004418A - Nuevos almidones por via de la modificacion de laexpresion de genes de la enzima biosintetica delalmidon - Google Patents

Abstract

La presente invención expone la utilización de un clon de cADN para construir genes para inhibición de la actividad enzimática de la enzima ramificante de almidón en maíz. Más específicamente, esta invención se refiere a un método de controlar la estructura fina de almidón del almidón derivado del grano de maíz que comprende:(1) preparar un gen quimérico que contiene un fragmento deácido nucleico que codifica un gen estructural de la enzima ramificante de almidón o un fragmento del mismo, unido operablemente en orientación sentido o antisentido en el lado corriente arriba para un fragmento deácido nucleico que codifica un promotor que dirige la expresión del gen en tejido de endosperma de maíz, y unido operablemente del lado corriente abajo para un fragmento deácido nucleico que codifica una secuencia reguladora adecuada para la terminación transcripcional, y (2) transformación de maíz con dicho gen quimérico, en donde la expresión de dicho gen quimérico resulta en la alteración de la estructura fina de almidón derivado del grano de dicho maíz transformado comparado a la estructura fina del almidón derivado de maíz que no posee dicho gen quimérico.

Description

NUEVOS ALMIDONES POR VÍA DE LA MODIFICACIÓN DE LA EXPRESIÓN DE GENES DE LA ENZIMA BIOSINTETICA DEL ALMIDÓN Características v Utilidad Comercial del Almidón El almidón es una mezcla de dos polisacáridos, amilosa y amilopectina. La amilosa es una cadena no ramificada de hasta varios miles de unidades a-D-glucopiranosa unidas por enlaces glicosídicos a-1,4. La amilopectina es una molécula altamente ramificada hecha de hasta 50,000 residuos a-D-glucopiranosa unidos por enlaces glicosídicos a-1,4 y a-1,6. Aproximadamente 5% de los enlaces glicosídicos en la amilopectina son enlaces a-1,6, que orientan a la estructura ramificada del polímero.

Las moléculas de amilosa y amilopectina se organizan en gránulos que se almacenan en plástidos. Los gránulos de almidón producidos por la mayoría de las plantas son 15-30 % de amilosa y 70-85 % de amilopectina. La relación de amilosa a amilopectina y el grado de ramificación de la amilopectina afecta las propiedades físicas y funcionales del almidón. Propiedades funcionales, tai cono la viscosidad y estabilidad de un almidón gelatinizado determinan la utilidad y por le tanto el valor de los almidones en aplicaciones alimenticias REF: 27400 e industriales. Donde se necesita una propiedad funcional específica, los almidones obtenidos de varias cosechas tal como maíz, arroz o papa podrían satisfacer los requerimientos funcionales. Si un almidón no satisface una propiedad funcional requerida, si por ejemplo debe tener viscosidad estable bajo condiciones de alta temperatura y ácidas, la funcionalidad puede lograrse algunas veces modificando químicamente el almidón. Varios tipos y grados de modificación química se usan en la industria del almidón, y el etiquetado y uso de almidones modificados químicamente debe satisfacer las regulaciones gubernamentales.

Dentro de los órganos que contienen almidón de las plantas, la proporción de amilosa a amilopectina y el grado de ramificación de amilopectina están bajo control genético. Por ejemplo, las plantas homozigo recesivas para el gen waxy (wx) carecen de una enzima gránulo-almidón de enlace sintetasa y producen aproximadamente 100% de amilopectina. Las plantas homozigo recesivas para el gen extensor de amilosa (ae) pueden producir gránulos de almidón que tienen hasta 90% de amilosa (ver Pat. U.S. No. 5,300,145). El gen dull ha demostrado influenciar los niveles de actividad de una enzima almidón sintetasa y almidón ramificante.

La mayoría de las cosechas de cereal se manejan como productos, y muchos de los requerimientos de alimentos industriales y de animales para estas cosechas pueden satisfacerse por medio de variedades comunes que crecen y se producen ampliamente en volumen. Sin embargo, existe actualmente un mercado creciente para cosechas con propiedades especiales de uso final que no se encuentran en el grano de composición estándar. Mas comúnmente, el maíz de especialidad se diferencia del maíz "normal", también conocido como maíz de campo, por propiedades del endosperma alterado, tal como un cambio global en la relación de amilosa amilopectina como en el maíz waxy o de alta amilosa, un aumento en la acumulación de azúcares como en el maíz dulce, o una alteración en el grado de la dureza del endosperma como en el grado alimenticio del maíz o maíz palomero; Glover, D. V. and E.T. Mertz, (1987) en Corn: Nutricional Quality of Cereal Grains; Genetic and Agronomic Improvement, R. A. Olson and K. J. Frey, eds. American Society of Agronomy, Madison Wisconsin, pp. 183-336. Rooney, L. W. and S. 0. Serna-Saldivar, (1987) Food Uses of Whole Corn and Dry-milled Fractions, en Corn: Chemistry and Technology, S.A. Watson and P. E. Ramstead, eds. American Association of Cereal Chemists, Inc., St. Paul, Minnesota, pp. 339-429. La presente invención ofrece a los compradores de maíz de especialidad una fuente de almidón que tiene propiedades distintas de almidón waxy y ofrece a los granjeros la oportunidad para cultivar una cosecha de valor agregado mas alto que el maíz normal o waxy.

El almidón purificado se obtiene de las plantas por un proceso de molienda. El almidón de maíz se extrae a partir de granos mediante el uso de proceso de molienda húmeda. La molienda húmeda es un proceso multietapa que involucra el remojo y molienda de los granos y la separación de las fracciones de almidón, proteína, aceite y fibra. Una revisión del proceso de molienda húmeda de maíz se da en S. R. Eckhoff en the Proceedings of the Fourth Corn Utilization Conference, June 24-26, 1992, St. Louis, MO., impreso por la National Corn Growers Association, CIBA-GEIGY Seed División y el United States Department of Agriculture. El almidón se usa en numerosas aplicaciones alimenticias e industriales y es la principal fuente de carbohidratos en la dieta humana. Típicamente, el almidón se mezcla con agua y coce para formar un gel espeso. Tres propiedades importantes de un almidón son la temperatura a la que se coce, la viscosidad a la que llega el gel, y la estabilidad de la viscosidad del gel a lo largo del tiempo. Las propiedades físicas del almidón sin modificar durante el calentamiento y enfriamiento limitan su utilidad en muchas aplicaciones. Como resultado, esfuerzos y costos considerables se necesitan para modificar químicamente el almidón para superar estas limitaciones del almidón y para expandir la utilidad del almidón en aplicaciones industriales .

Algunas limitaciones de almidones no modificados y propiedades de almidones modificados se dan en Modified Starches: Properties and Uses, O.B. Wurzburg, ed., (1986) CRC Press Inc., Boca Ratón, FL. Los almidones no modificados tienen uso muy limitado en productos alimenticios porque los gránulos se hinchan y rompen fácilmente, formando asi geles indeseables de consistencia débil. Las modificaciones químicas se usan para estabilizar gránulos de almidón haciendo asi al almidón adecuado para miles de aplicaciones alimenticias e industriales incluyendo alimentos de bebé, crema en polvo para café, polvos para secado quirúrgico, clasificación de papel e hilado y adhesivos. Las modificaciones químicas comunes incluyen enlace cruzado en el que los enlaces químicos se introducen para actuar como puentes estabilizadores entre las moléculas de almidón, y sustitución en la que los grupos sustituyentes tal como grupos hidroxietilo, hidroxipropilo o acetilo se introducen en moléculas de almidón.

El uso de almidones modificados químicamente en los Estados Unidos está regulado por la Food and Drug Administration (FDA) . Almidones de "almidón modificado para alimento" podría usarse en alimento pero debe cumplir los límites de tratamiento específico, y los almidones de "almidón modificado para la industria" podrían usarse en artículos tal como recipientes que están en contacto con alimento y también deben cumplir los requerimientos de tratamiento especificados; Code of Federal Regulations, Título 21, Capítulo 1, Parte 172, Food Additives Permitted in Food for Human Consumptions, Sección 172, 892, Food Starch-Modified, U.S. Government Printing Office, Washington, D.C. 1981; (a) Parte 178, Indirect Food Additives, Sec. 178.3520, Industrial Starch Modified. Estas regulaciones limitan el grado de modificación química definiendo la cantidad máxima del reactivo químico que puede usarse en los pasos de modificación. También se regulan los niveles de subproductos en almidón que resultan del proceso de modificación. Por ejemplo residuos de propilén clorhidrina en almidón de hidroxipropilo son de especial interés; Tuschhoff, J.V., (1986) Hidroxipropilated Starches, In Modified Starches: Properties and Uses, O.B. Wurzburg, ed., CRC Press, Boca Ratón, FL, pp. 55-57.

Alteración de la Estructura Fina del Almidón a Través de Manipulación Genética Molecular de Plantas que Tienen Almidón Diferencias en el grado de ramificación o polimerización del almidón se conoce que resultan en un cambio en las propiedades fisicoquímicas del almidón. Se ha sugerido que los almidones, hechos a la medida para aplicaciones específicas, podrían generarse por medio de la alteración de la distribución de la cadena ramificada de la molécula de amilopectina, la proporción relativa de amilosa a amilopectina o el grado de polimerización de amilosa. Sin embargo, ha sido problemático lograr la alteración fenotipica de la composición de almidón; mientras que se han identificado las enzimas clave en la biosíntesis del almidón, sus roles exactos permanecen inciertos. Así, ha sido difícil la correlación de actividades de enzimas particulares con características moleculares particulares de la estructura del almidón y, a la vez, con la función del almidón en productos alimenticios e industriales. Aunque las propiedades funcionales deseables de un almidón ideal necesitarían poder ser previsualizadas, solo hay un entendimiento vago de que debería ser la estructura molecular del almidón para lograr esto y poco se entiende de como enzimas biosintéticas de almidón particulares afectan específicamente estos parámetros. Por ejemplo, el papel de las enzimas individuales en la determinación de los patrones de ramificación y longitud de las ramas es aún confuso y se combina con la carencia de falta de entendimiento de como interactuan las enzimas ramificadas y almidón sintetasas.

WO 94/09144 discute la generación de plantas con capacidad mejorada para sintetizar almidón a temperaturas elevadas. Esta publicación propone que el factor limitante en el llenado de granos a elevada temperatura es la inestabilidad de ciertas enzimas biosintéticas de almidón, particularmente almidón sintetasa (SS) y la enzima ramificante de almidón (SBE) . La introducción de genes que codifican enzimas que tienen una temperatura óptima de actividad mas alta o que tienen una tolerancia mas alta al calentamiento en plantas podrían proporcionar un aumento en la cantidad de almidón depositado en el grano de maíz. Además, se reivindica que esta estrategia podría usarse para generar almidón de estructura fina alterada como resultado de la introducción de genes donantes cuya expresión podría alterar el balance de las diferentes enzimas biosintéticas de almidón. Los genes donantes sugeridos incluyen aquellos que codifican enzimas que exhiben propiedades cinéticas o alostéricas mejoradas con relación a la enzima endógena o una copia extra del gen endógeno que compensaría de las pérdidas en que incurre la actividad de la enzima debido a la inestabilidad térmica. Como un medio para alterar la estructura del almidón WO 94/09144 también sugiere el uso de genes sentido y antisentido para alterar las relacionas naturales de diferentes almidón sintetasa y enzimas ramificantes en la planta receptora. Esta publicación expone el efecto de temperatura en la actividad catalitica y estabilidad enzimática para ciertas enzimas biosintéticas de almidón, sin embargo, no se presentan resultados para sostener las estrategias moleculares propuestas.

Los resultados de los intentos para inhibir la expresión de SBE en papa usando un enfoque antisentido se reportó recientemente por Virgin et al. en el 4th International Congress of Plant Molecular Biology (Junio, 1994) y por Christensen et al. and Kossman et al. en el Plant Polysaccharide Symposium (Julio, 1994). En todos los casos, aunque la actividad de SBE se suprimió casi completamente, la relación amilosa a amilopectina permaneció inalterada. Virgin et al. y Kossman et al. no reportaron cambio en la estructura de la amilopectina. Sin embargo, Christensen et al. reportaron un cambio en la distribución de cadenas ramificadas en la molécula de amilopectina con un aumento en el número de cadenas largas .

Los resultados en papa son inesperados, dado que solamente una enzima ramificante de almidón simple ha sido purificada y solamente un gen simple ha sido detectado en Southern blots de ADN genómico ie papa, aún bajo condiciones de baja astringencia (Koshnoodi, J. et al. (1993) FEBS Letters 332:132-138; Kossman, J. et al. (1991) Mol. Gen.

Genet. 230:39-44). Asi, la supresión antisentido del gen de la enzima ramificante de almidón simple en papa, que resulta en la reducción significante de niveles de enzima y una disminución concomitante en la actividad de la enzima ramificante de almidón, se esperó resultara en un cambio reproducible y medible en la composición de almidón y estructura fina del almidón. Los resultados contrarios e inconsistentes reportados en la literatura sugieren que otros genes de la enzima ramificante de almidón que comparte poca homología con el gen identificado podría también podría jugar un papel en la determinación de la estructura de amilopectina en papa. Alternativamente, la actividad de la enzima ramificante en papa podría codificarse por un solo gen, pero la proteína podría presentarse en tan grande exceso que las cantidades de amilopectina o la estructura no se afectan aún cuando se inhibe mas del 90% de la actividad enzimática.

La alteración de la estructura fina del almidón en maíz se complica por el hecho de que se han identificado tres isoformas de SBE. En el endosperma de maíz, las tres isoformas que presentan actividad de la enzima ramificante de almidón son SBEI, SBEIIa y SBEIIb. En la mutante extensor de amílosa (ae) , la actividad de SBEIIb se ha encontrado que es deficiente mientras que en la mutante dull (du) , se observa que disminuyen los niveles de SBEIIa (Boyer, C.D. and Preiss, J. (1981) Plant Physiol. 67:1141-1145). Los estudios de las propiedades catalíticas de las enzimas ramificantes del almidón de maiz indican que las isoformas difieren en la preferencia del sustrato y en la longitud de la cadena de glucano que se transfiere. La actividad de SBEI es mas alta cuando la amilosa sirve como el sustrato, y se transfieren preferencialmente las cadenas mas grandes. Las isoformas de SBEII exhiben actividad mas alta con sustratos mas altamente ramificados tal como amilopectina . Estas enzimas transfieren preferencialmente cadenas mas cortas de glucano (Guan et al. (199J, Plant Physiol. 102:1269-1273; Takeda et al. (1993) Carbohydrate Res. 240:253-263).

Un maíz SBEI cADN ha sido clonado y secuenciado (Baba et al. (1991) Biochem. Biophys. Res. Commun. 181:87-94; Fisher et al. (1995) Plant Physiol. 108:1313-1314). Además, se ha aislado un clon de SBEII cADN y se ha publicado la secuencia nucleótida (Fisher et al. (1993) Plant Physiol. 102:1045-1046) . Este clon de cADN mapea al locus ae, confirmando que este locus codifica el gen estructural del maíz SBEIIb (Stinard et al. (1993) Plant Cell 5:1553-1566).

El almidón aislado a partir de la' muíante ae se conoce que difiere en su estructura del aislado a partir de maíz mellado (Baba et al. (1984) Agrie. Biol. Chem. 48:1763-1775).

Se ha investigado el efecto del alelo ae en las propiedades del almidón (Yamada et al. (1987) StarJe 30:145-148). Dosis aumentandas de ae en un experimento de waxy (wx) produce un aumento en la temperatura de gelatinización de para que en la mutante homozigo, se observe la cocción incompleta del almidón, aún a 95°C. Estos autores indican el aumento en la viscosidad asociado con almidón ae wx es altamente deseable y sugiere un almidón "destino" con propiedades intermedias entre wx y a e wx . Mientras que se disponen las mutaciones que influencian los niveles del maíz SBEIIa y SBEIIb, las mutaciones en el gen estructural SBEI ya han sido identificadas. La carencia de mutantes SBEI podría indicar que la ausencia de esta isoforma de la enzima ramificante es letal para la planta. Alternativamente, una mutación de SBEI nula podría dar aumento al cambio no observable en el fenotipo de la semilla o uno que no se distingue fácilmente de las mutantes de almidón existentes.

Las soluciones genéticas moleculares para la generación de almidones a partir de maíz con estructuras finas alteradas tiene una ventaja decisiva sobre plantas mas tradicionales de especies cercanas. Los cambios de la estructura fina del almidón puede producirse inhibiendo específicamente la expresión de una o mas isoformas de SBE mediante inhibición antisentido o cosupresión. Un antisentido o cosupresión construido actuaría como un regulador dominante negativo de la actividad del gen. Mientras que mutaciones convencionales pueden producir regulación negativa de la actividad del gen siendo estos efectos mas del tipo recesivo. La regulación negativa dominante disponible con un enfoque transgénico podría ser ventajosa desde una perspectiva del grano. Adicionalmente la capacidad para restringir la expresión del fenotipo alterado de almidón hacia los tejidos reproductivos de las plantas por el uso de promotores específicos podría conferir ventajas agronómicas relacionadas a mutaciones convencionales que tendrán un efecto en todos los tejidos en los que el gen imitante se expresa ordinariamente. Finalmente, los niveles variables de inhibición antisentido o cosupresión que surgen a partir de las efectos de la posición cromosomal podrían producir un rango mas amplio de fenotipos de almidón que aquellos que resultan de los efectos de la dosificación de un alelo mutante en endosperma de maíz.

La organización compleja de las enzimas ramificantes de almidón en endosperma de maíz y los resultados reportados en papa hacen intentos para manipular la estructura fina del almidón mediante la inhibición de la expresión del gen de una de las impredecibles isoformas de maíz conocidas. La evidencia científica reportada indica que la inhibición de la expresión de un gen de la enzima ramificante de almidón simple y una reducción medible de la actividad de la enzima ramificante de almidón no predice un cambio correspondiente en la estructura fina del almidón. Además, la tecnología antisentido es inherentemente incierta en que no es obvio o predecible si el gen entero o si los fragmentos específicos y cuales fragmentos del un gen serán mas efectivos en intervenir en inhibición antisentido fuerte. Algunos resultados indican que se requiere la expresión fuerte del gen antisentido; sin embargo, la buena expresión del antisentido transcrito no correlaciona necesariamente con la observación de y la fuerza del fenotipo antisentido (Bourque, J. (1995) Plant Sci. 105:125-149). Aunque varias teorías se han desarrollado para explicar el fenómeno de cosupresión {Flavell, R. B. (1994) Proc. Nati. Acad: Sci. (USA) 91:3490-3496), ha llegado a ser evidente que ningún mecanismo simple parece suficiente para describir todos los resultados observados. A la fecha, efectos de cosupresión han sido reportados en tabaco, cañóla, soya, tomate y Arabidopsis, todas las cuales son plantas dicotiledóneas. No se ha reportado ningún resultado que indique que este fenómeno se opere en monocotiledóneas.

A pesar de la capacidad para inhibir la expresión de los genes SBE en maíz, un cambio resultante en el fenotipo de almidón permanece impredecible . Aunque los pasos enzimáticos se conocen, no se entienden bien los detalles moleculares de la biosíntesis de almidón. No es claro si las tres isoformas de SBE contribuyen igualmente en toda la biosíntesis de almidón o si cada isoforma juega un papel distinto en ensamblar la molécula de amilopectina en etapas discretas a lo largo de una ruta obligatoria. En atención al posible efecto entre las enzimas ramificantes de almidón y las múltiples almidón sintetasas que funcionan en la elongación de la cadena de glucano, es imposible hacer predicciones concernientes a la estructura del almidón basadas en las propiedades catalíticas de cada isoforma.

?? ? Tia^ ffl lli INVENCIÓN La presente invención expone la utilización de un clon de cADN para construir genes sentido y antisentido para la inhibición de la actividad enzimática de la enzima ramificante de almidón en grano o endosperma de maíz. Mas específicamente, esta invención se refiere a un método para controlar la distribución de la cadena ramificada de la amilopectina, la proporción relativa de amilosa a amilopectina y el grado de pe 1 ir-enzación de componentes i amilosa de almidón en maíz qu :r.p rende: (1) preparar un gen quimérico que contiene un íra:rer.-.o de ácido nucleico q e codifica un gen estructural ¿e 1 enzima ramificante almidón o un fragmento del mismo, unido operablemente en orientación sentido o antisentido del lado corriente arriba para un fragmento de ácido nucleico que codifica un promotor que dirige la expresión del gen en tejido de endosperma de maíz, y unido operablemente en el lado corriente abajo para un fragmento de ácido nucleico que codifica una secuencia reguladora adecuada para terminación transcripcional, y (2) transformar el maíz con dicho gen quimérico, en donde la expresión de dicho gen quimérico resulta en la alteración de la distribución de la cadena ramificada del componente molecular de amilopectina de derivado de almidón a partir del grano de dicho maíz transformado comparado a la distribución de la cadena ramificada del componente molecular de amilopectina de derivado de almidón a partir de maíz que no posee dicho gen quimérico. Esta invención también se refiere a las variedades de maíz preparadas por transformación usando dicho método, el aislamiento de almidón del grano de una variedad de maíz preparada usando dicho método, y un método para preparar un producto alimeticio espesado que comprende combinar un alimento, agua y una cantidad efectiva de un almidón aislado de una variedad de maíz preparada usando dicho método, y cociendo la composición resultante lo necesario para producir dicho producto alimenticio espesado.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Y DESCRIPCIONES DE IAS La invención puede comprenderse mas completamente a partir de la siguiente descripción detallada y los dibujos anexados y las descripciones de la secuencia que forman una parte de esta solicitud.

La Figura 1 presenta un mapa de restricción del plásmido pBE240 que contiene un cADN insertado que comprende ADN sin trasladar 5' de 78 pb, un marco abierto de lectura de 2397 pb que codifica la región codificante SBEIIb de maiz y ADN sin trasladar 3' de 190 pb.

La Figura 2 es un mapa de restricción del plásmido pBE44 que contiene un fragmento 3' de 414 pb de la inserción de pBE240 en orientación antisentido con respecto al promotor zein de 27 kd del maiz.

La Figura 3 es un mapa de restricción del plásmido pMLl03, usado como un vehículo de clonación intermedio en la construcción de genes quiméricos de la presente invención.

La Figura 4 es un mapa de restricción del plásmido p35/Ac que codifica, Inter alia, fosfinotricin acetil transferasa. La introducción de este plásmido en células y tejidos de plantas confiere resistencia a inhibidores herbicidas de glutamina sintetasa tal como fosfinotricin en las células y tejidos de plantas transformadas.

La Figura 5 compara los perfiles RVA de almidón de granos de maíz normales mellados, granos homozigo de extensor de amilosa (ae) y almidón de granos homozigo del pBE44 construido. La viscosidad, en unidades de número de agitación (SNU) , y temperatura (grados Celcius) se han medido y graficado como una función del tiempo (en minutos) .

La Figura 6 es un mapa de restricción del plásmido pBE43 que contiene un fragmento 5' de 507 pb de la inserción de pBE240 en orientación antisentido con respecto al promotor zein de 27 kd del maiz.

La Figura 7 es un mapa de restricción del plásmido pBE45 que contiene un fragmento de longitud casi completa de 2165 pb la inserción de pBE240 en orientación sentido con respecto al promotor zein de 27 kd del maiz.

La Figura 8 es un mapa de restricción del plásmido pBE96 que contiene un fragmento de longitud casi completa de 2087 pb la inserción de pBE240 en orientación sentido con respecto al promotor zein de 27 kd del maíz.

La Figura 9 es un mapa de restricción del plásmido pBE68 que contiene un fragmento de 373 pb que representa el extremo 3' de la inserción de cADN de SBEI de maiz en pBE65 (SEC ID NO: 13), acoplado en orientación antisentido al promotor zein de 27 kd del maíz.

La Figura 10 es un mapa de restricción del plásmido pBE69 que contiene un fragmento de 570 pb que representa el extremo 5' de la inserción de cADN de SBEI de maíz en pBE65 (SEC ID NO:16)/ acoplado en orientación antisentido al promotor zein de 27 kd del maíz.

La Figura 11 es un mapa de restricción del plásmido pBE72 que contiene un fragmento de longitud casi completa de 2487 pb la inserción de pBE65 en orientación sentido con respecto al promotor zein de 27 kd del maíz.

La Figura 12 es un mapa de restricción del plásmido pBE108 que contiene una variante higromicina resistente de pBE72.

La Figura 13 es un mapa de restricción del plásmido pBE97 que contiene un fragmento de longitud casi completa de 1865 pb la inserción del cADN de SBEI de pBE65 (SEC ID NO:20) acoplado en orientación sentido con respecto al promotor zein de 27 kd del maíz.

La Figura 14 es un mapa de restricción del plásmido BEHO que contiene un fragmento de cADN de 2565 pb que codifica una SBEI de longitud casi completa acoplado en orientación sentido con respecto al promotor zein de 27 kd del maíz.

La Figura 15 es un mapa de restricción del plásmido pBElll que contiene un fragmento de cADN de 1810 pb que codifica una SBEI truncada acoplado en orientación sentido con respecto al promotor zein de 27 kd del maíz.

La Figura 16 compara los perfiles RVA de almidón de granos axy, granos homozigo de extensor de amilosa (ae) y waxy y de granos que contienen el pBE44 construido mas el waxy. La viscosidad, en unidades de número de agitación (SNU), y temperatura (grados Celcius) se han medido y graficado como una función del tiempo (en minutos) .

SEC ID NO:l expone la secuencia nucleótida del cADN isertado en el plásmido pBE240 y la secuencia aminoácido que corresponde a la enzima completa de SEBIIb de maíz.

SEC ID NO: 2 expone la secuencia nucleótida de la inserción de 414 pb de pBE44.

SEC ID NO: 3 y 4 expone los cebadores BE41 y BE42 usados para la preparación de la inserción de 414 pb de pBE44.

SEC ID NO: 5 expone la secuencia nucleótida de la inserción de 507 pb de pBE43.

SEC ID NO: 6 y 7 expone los cebadores PCR BE39 y BE40 usados para la preparación de la inserción de 507 pb de pBE43.

SEC ID NO: 8 expone la secuencia nucleótida de la inserción de 2165 pb de pBE45.

SEC ID NO: 9 expone la secuencia nucleótida de la inserción de 2087 pb de pBE96.

SEC ID NO: 10 y 11 expone los cebadores PCR BE14 y BE15 usados para la preparación de la prueba usada para aislar la inserción de 2772 pb de pBE43. BE15 (SEC ID NO: 11) también se usó para la preparación de La inserción en el plásmido pBE79.

SEC ID NO: 12 expone la secuencia nucleótida de la inserción de 2772 pb de pBE65.

SEC ID NO: 13 expone la secuencia nucleótida de la inserción de 373 pb de pBE68.

SEC ID NO: 14 y 15 expone los cebadores PCR BE43 y BE52 usados para la preparación de la inserción de 373 pb de pBE68.

SEC ID NO: 16 expone la secuencia nucleótida de la inserción de 571 pb de pBE69.

SEC ID NO: 17 y 18 expone los cebadores PCR BE46 y BE50 usados para la preparación de la inserción de 571 pb de PBE69.

SEC ID NO: 19 expone la secuencia nucleótida de la inserción de 2487 pb de pBE72.

SEC ID NO: 13 expone la secuencia nucleótida de la inserción de 1865 pb de pBE9 .

SEC ID NO: 21 expone el cebador PCR BE67 usado para la preparación de la inserción de 805 pb de pBE83.

SEC ID NO: 22 y 23 expone los cebadores PCR BE101 y BB3 usados para la preparación de un pBEHO.

SEC ID NO: 24 expone la secuencia nucleótida de la inserción de 2565 pb de pBEHO.

SEC ID NO: 25 expone la secuencia nucleótida de la inserción de 1809 pb de pBElll.

Las Descripciones de las Secuencias contienen el código de letra para los caracteres de la secuencia nucleótida y los códigos de tres letras para los aminoácidos como se define de acuerdo con los estándares IUPAC-IYUB descritos en Nucleic Acids Research 13:3021-3030 (1985) y en el Biochemical Journal 219 ( 2 ): 345-373 (1984) que se incorpora aquí por referencia .

DESCRIPCIÓN DETALLADA En el contexto de esta exposición, se utilizará un número de términos. Como se usa aqui, el término "almidón se refiere a un polisacárido que consiste de glucano a-D-(l,4) que podría contener una proporción variable de ramificaciones a-D-(l,6). Como se usa aquí, el término "estructura fina de almidón" se refiere a la estructura molecular de un polímero de algodón, la presencia, abundancia y distribución de enlaces a-D-(l,6) y la presencia, abundancia y longitud de los glucanos ramificados y no ramificados o¡-D-(l,4) en el polímero. La estructura fina de almidón se describe por la distribución de la cadena ramificada de amilopectina, o por la proporción relativa de amilosa a amilopectina, o por el grado de polimerización de amilosa. La alteración de cualquiera de estos componentes moleculares estructurales resulta en una estructura fina alterada del almidón. Uno, dos o tres de estos parámetros podría alterarse independientemente de otro. El término "grado de polimerización" se refiere al número de unidades -D-glucopiranosa en una molécula o porción designada de una molécula tal como una cadena de amilopectina.

Como se usa aquí, el término "distribución de cadena ramificada" se refiere a la distribución de cadenas de glucano de enlace a-1,4- que se detectan después de la digestión con isoamilasa de amilopectina y el fraccionamiento subsecuente de las ramificaciones liberadas mediante la cromatografía de exclusión de tamaño. Las cadenas ramificadas podrían clasificarse de acuerdo a su tamaño y al número de regiones cristalinas (regiones donde muchos de los enlaces a-1,6- (p. ej . se presentan puntos ramificados) que se extienden en la molécula intacta. Las, cadenas A son no ramificadas y se extienden sobre una región cristalina simple. Las cadenas Bl también se extienden sobre una región cristalina simple pero son ramificadas. Las cadenas B2, B3 y B4+ son ramificadas y se extienden sobre 2, 3 y 4 o mas regiones cristalinas, respectivamente (Hizukuri (1986) Carbohidrate Res. 147:342-347). La longitud de las unidades cristalinas y amorfas repetidas en el gránulo de almidón es demasiado regular con una distancia repetida de 9 nm observado en almidón de una amplia variedad de especies de plantas (Jenkins (1993) Starch/Starke 45:417-420). Asi las cadenas A y Bl son de menos de 9 nm de longitud, las cadenas B2 y B3 están entre 18 y 27 nm de longitud y las cadenas B4+ son mayores de 36 nm.

Como se usa aquí, el término "ácido nucleico" se refiere a una molécula grande que pueden ser de hebra simple o hebra doble, compuestas de monómeros (nucleótidos) que contienen un azúcar, fosfato y purina o pirimidina. Un "fragmento de ácido nucleico" es una fracción de una molécula de ácido nucleico dada. En plantas superiores, el ácido desoxirribonucleico (ADN) es el material genético mientras que el ácido ribonucleico (ARN) se involucra en la transferencia de información de ADN en proteínas. Un "genoma" es el cuerpo entero de material genético contenido en cada célula de un organismo. El término "secuencia nucleótida" se refiere a un polímero de ADN o ARN que puede ser de hebra simple o doble, que contiene opcionalmente bases nucleótida sintéticas, no naturales o alteradas capaces de la incorporación en polímeros de ADN o ARN.

Como se usa aquí, "esencialmente similar" se refiere a secuencias de ADN que podrian incluir cambios de base que no causan un cambio en el aminoácido codificado, o que incluyen bases que podrían alterar uno o mas aminoácidos, pero no afectan las propiedades funcionales de la proteína codificada por xa secuencia de ADN. Se entiende por lo tanto que la invención abarca mas que las secuencias de ejemplo específicas. También se contemplan las modificaciones a la secuencia, tal como eliminaciones, inserciones, o sustituciones en la secuencia que produce cambios silentes que no afectan sustancialmente las propiedades funcionales de la molécula de proteína resultante. Por ejemplo, se contempla la alteración en la secuencia del gen que refleja la degeneración del código genético, o que resulta en la producción de un aminoácido equivalente químicamente en un sitio dado; así, un codón para el aminoácido alanina, un aminoácido hidrofóbico, podría sustituirse por un codón que codifica otro aminoácido hidrofóbico tal como glicina, valina, leucina, o isoleucina. Similarmente, los cambios que resultan en la sustitución de un residuo cargado negativamente por otro, tal como ácido aspártico por ácido glutámico, o un residuo cargado positivamente por otro, tal como lisina por arginina, también puede esperarse para producir un producto equivalente biológicamente. Los cambios de nucleótidos que resultan en la alteración de las porciones N-terminal y C-terminal de la molécula de proteina tampoco se esperaría que alteren la actividad de la proteína. En algunos casos, podría desearse de hecho hacer mutantes de la secuencia para estudiar el efecto de la alteración de la actividad biológica de la proteína. Cada una de las modificaciones propuestas es buena en la rutina del experto en el arte, como es la determinación de retención de la actividad biológica de los productos codificados. Además, el experto en el arte reconoce que las secuencias "esencialmente similares" por esta invención también puede definirse por su capacidad para hibridizar, bajo condiciones de astringencia (0.1X SSC, SDS al 0.1%, 65°C) , con las secuencias e emplificadas aquí.

"Gen" se refiere a un fragmento de ácido nucleico que codifica todo o una porción de una proteína específica, e incluye secuencias regulatorias precedentes (5' no-codificante) y posteriores (3* no-codificantes) a la región codificante. "Gen nativo" se refiere al gen como se encuentra en la naturaleza con sus propias secuencias regulatorias.

"Gen quimérico" se refiere a un gen que contiene secuencias regulatorias y codificantes heterogéneas. "Gen endógeno" se refiere al gen nativo encontrado normalmente en su lugar natural en el genoma. Un "gen externo" se refiere a un gen no encontrado normalmente en el organismo huésped pero que se introduce por transferencia del gen. "Gen externo" también puede referirse a un gen que se encuentra normalmente en el organismo huésped, pero que se reintroduce en un lugar en el genoma donde no se encuentra normalmente, resultando en una o mas copias adicionales de la secuencia que codifica un gen endógeno.

"Secuencia codificante" se refiere a una secuencia de ADN que codifica para una proteína específica y excluye las secuencias no codificantes.

"Codón de iniciación" y "codón de terminación" se refiere a una unidad de tres aminoácidos adyacentes en una secuencia codificante que especifica la iniciación y terminación de la cadena, respectivamente, de la síntesis de proteína (traslación de mARN) . "Marco abierto de lectura" se refiere a la secuencia aminoácido codificada entre la traslación de los codones de iniciación y terminación de la secuencia codificante.

"Transcripción de ARN" se refiere al producto que resulta de la transcripción catalizada por ARN polimerasa de una secuencia de ADN. Cuando la transcripción de ARN es una copia complementaria perfecta de la secuencia de ADN, se refiere como la "transcripción primaria" o podría ser una secuencia de ARN derivada del proceso postranscripcional de la transcripción primaria. "ARN mensajero" (mARN) se refiere a ARN que puede ser trasladado en proteína por la célula. "cADN" se refiere a una hebra doble de ADN, una hebra de la que es complementaria y un derivado de mARN por transcripción inversa. ARN "sentido" se refiere a una transcripción de ARN que incluye todo ó parte de un mARN. "ARN antisentido" se refiere a una transcripción de ARN que es complementaria toda o parte de una transcripción primaria destino o mARN y que bloquea la expresión de un gen destino interfiriendo con el procesamiento, transporte, y/o traslación de su transcripción primaria o mARN. La complementaridad de un ARN antisentido podría ser con cualquier parte del gen específico transcrito, p. ej . / en la secuencia 5' no codificante, secuencia 3' no codificante, intrones o secuencia codificante. Además, como se usa aquí, el ARN antisentido podría contener regiones de secuencias de ribosoma que podría aumentar la eficiencia del ARN antisentido para bloquear la expresión del gen. "Ribosoma" se refiere a un ARN catalítico e incluye endoribonucleasas de secuencia específica.

Como se usa aquí, "secuencias reguladoras" adecuadas se refiere a secuencias nucleótidas localizadas corriente arriba (5' ) r en, y/o corriente abajo (3') a una secuencia codificante, que controla la transcripción y/o expresión de las secuencias codificantes. Estas secuencias regulatorias incluyen promotores, secuencias directoras de traslación, secuencias de terminación de transcripción y secuencias de poliadenilación . En ADN artificial construido, las secuencias reguladoras también pueden controlar la transcripción y estabilidad de ARN antisentido.

"Promotor" se refiere a una secuencia de ADN en un gen, usualmente corriente arriba (5') a su secuencia codificante, que controla la expresión de la secuencia codificante proporcionando el reconocimiento de la ARN polimerasa y otros factores requeridos para la transcripción correcta. Un promotor también puede contener secuencias de ADN que se incluyen en el enlace de los factores de la proteína que controlan la efectividad de la iniciación de la transcripción en respuesta a condiciones fisiológicas o de desarrollo. También podría contener elementos aumentadores .

Un "aumentador" es una secuencia de ADN que puede estimular la actividad del promotor. Podría ser un elemento innato del promotor o un elemento heterólogo insertado para aumentar el nivel y/o la especificidad del tejido de un promotor. Promotores "constitutivos" se refiere a aquellos que dirigen la expresión del gen en sustancialmente todos los tejidos y demuestran poca regulación temporal o de desarrollo. Promotores de "órgano especifico" o "desarrollo especifico" como se refiere aquí son aquellos que dirigen la expresión del gen casi exclusivamente en órganos específicos, tal como hojas o semillas, o en etapas específicas de desarrollo en un órgano, tal como en embriogénesis temprana o tardía, respectivamente.

El término "unido operablemente" se refiere a secuencias de ácido nucleico en una molécula simple de ácido nucleico que se asocian para que la función de una se afecte por la otra. Por ejemplo, un promotor se une operablemente con un gen estructural (p. e . , un gen que codifica una enzima ramificante de almidón) cuando es capaz de afectar la expresión del gen estructural (p. ej . , que el gen estructural esté bajo el control transcripcional del promotor) .

El término "expresión", como se usa aquí, se dirige al medio de producción de un producto final codificado por un gen. Mas particularmente, "expresión" se refiere a la expresión de ARN sentido (mARN) o antisentido derivado del fragmento de ácido nucleico de la invención que, en conjunto con el aparato proteinico de la célula, resulta en niveles alterados del producto proteico. "Inhibición antisentido" se refiere a la producción transcripciones ARN antisentido capaces de evitar la expresión de la proteina destino. "Sobreexpresión" se refiere a la producción de un producto del gen en organismos transgénicos que excede los niveles de producción en organismos normales o no transformados. "Cosupresión se refiere a la expresión de un gen que es esencialmente similar a un gen endógeno y resulta en la supresión de la expresión del gen ectópico y el endógeno. "Niveles alterados" se refiere a la producción del producto del gen en organismos transgénicos en cantidades o proporciones que difieren de las de los organismos normales o no transformados. El experto en el arte reconocerá que los efectos fenotípicos contemplados por esta invención, es decir alteración de la distribución de la cadena ramificada en almidón de maíz, puede lograrse por la alteración del nivel del producto del gen producido en organismos transgénicos relativo a organismos normales o no transformados, incluyendo una reducción en la expresión del gen mediado por supresión antisentido o cosupresión, y aumento de la expresión del gen por sobreexpresión.

Las "secuencias 3* no codificantes" se refieren a la porción de la secuencia de ADN de un gen que contiene una señal de poliadenilación y cualquier otra señal reguladora capaz de afectar el procesamiento de mARN o expresión del gen. La señal de poliadenilación se caracteriza usualmente por afectar la adición de áreas de ácido poliadenilico en el extremo 3' del precursor de mARN.

"Transformación" se refiere a la transferencia de un fragmento de ácido nucleico en el genoma de un organismo huésped, resultando en herencia genéticamente estable. Los organismos huésped que contienen los fragmentos de ácido nucleico se refieren como organismos "transgénicos" .

El término "empastado" se refiere a un cambio físico irreversible en gránulos de almidón o una suspensión de gránulos de almidón caracterizada por el hinchamiento e hibridación de gránulos, un aumento rápido en la viscosidad de una suspensión, y la formación de un sol a partir de la suspensión. Este cambio también se conoce como cocción o gelatinización. La abreviación "SNU" se refiere a la unidad de número de agitación, aproximadamente igual a 10 centipoise, que es una medida de viscosidad. Para convertir a unidades SI (pascal segundos), multiplicar centipoise por 1000, p. ej., 1 PaSec = 1000 cp. Por lo tanto, 1 SNU = 0.01 PaSec. El término "sol" se refiere a un sistema de fluido coloidal. El término "viscosidad" es una medida de la fricción interna de un fluido que puede ser una idea de la consistencia o espesamiento de un fluido.

Esta invención se refiere a la construcción de plantas de maíz transgénico en donde la expresión de genes que codifican enzimas involucradas en la ramificación de almidón se modulan para efectuar un cambio en la distribución de la cadena ramificada de la amilopectina, la proporción relativa de amilosa a amilopectina, y el grado de polimerización del componente amilosa del almidón. Tal modificación de la estructura fina del almidón resulta en la alteración de las propiedades físicas del almidón aislado a partir de dichas plantas de maíz transgénico. Esta alteración en la estructura fina del almidón orientará en la generación de propiedades de nuevos almidones procesados que son benéficas en aplicaciones alimenticias e industriales.

Se han aislado y secuenciado un número de genes que codifican enzimas ramificantes de carbohidratos. Estas incluyen enzimas ramificantes de glicógeno de Saccharomyces cerevisiae (Thon et al. (1992) Ji Biol. Chem. 267:15224-15228), E. coli (Baecker et al. (1986) J. Biol. Chem. 261:8738-8743), Bacillus stearothermophilus (Kiel et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 230:136-144) Bacillus caldolyticus (Kiel at al. (1992) DAN Seq. 3:221-232), humano (Thon et al. (1993) J. Biol. Chem. 268:7509-7513), Aspergillus nidulans (Kiel et al. (1990) Gene 89:77-84), Streptomyces coelicolor (EMBL número de acceso X73903), Streptomyces aurofaciens (Homerova, D. and Kormanec, J. (1994) Biochem. Biophys. Acta 1200:334-336) y enzimas ramificantes de almidón de maíz (Baba et al. (1991) Biochem. Biophys. Res. Commun. 181:87-94; Fisher et al. (1993) Plant Physiol. 102:1045-1046; Fisher et al. (1995) Plant Physiol. 108:1313-1314; chícharo (Burton et al. (1995) Plant J. 7:3-15), papa (Poulsen, P. and Kreiberg, J.D. (1993) Plant Physiol. 102:1053-1054), yuca (Salehuzzaman et al. (1992) Plant Mol. Biol. 20:809-819), arroz (Kawasaki et al. (1993) Mol. Gen. Genet. 237:10-16; Mizuno et al. (.93) J. Biol. Chem. 268:19084-1 091) y Arabidopsis thaliana (EMBL número de acceso U18817 y U22428) . Preferidos entre estos son los genes de la enzima ramificante de almidón de maíz. Estos genes pueden aislarse por técnicas empleadas turinariamente por el experto en arte para aislamiento de genes cuando se conoce la secuencia nucleótida del gen deseado, o cuando se conoce la secuencia de un gen homólogo de otro organismo. La información de la secuencia sobre el gen deseado puede usarse para preparar pruebas de oligonucleótido para la identificación y aislamiento del gen de la enzima ramificante completa de una biblioteca genética apropiada. Esta biblioteca podría ser una biblioteca genómica, en donde la región codificante podría estar contenida en un fragmento de ADN simple o podría estar contenida en varios fragmentos de ADN distintos. Además, dos o mas exones que codifican la enzima ramificante podrían separarse por uno o mas intrones. Alternativamente, la biblioteca podría ser una biblioteca de cADN en donde es mayor la probabilidad de aislar un clon de cADN que contiene la región codificante completa como una secuencia contigua. En cada caso, el clon apropiado puede identificarse por hibridización de ADN-ADN con pruebas que corresponden a una o mas porciones de los genes deseados. Alternativamente, los cebadores de oligonuleótido pueden prepararse y emplearse como cebadores PCR para amplificar y aislar subsecuentemente toda o parte de la región codificante de la enzima ramificante de ADN genómico, o de las bibliotecas genómica o de cADN descritas anteriormente.

Varias pruebas diferentes pueden usarse para medir la actividad de la enzima ramificante. En la prueba de estimulación de fosforilasa (Boyer, C.D. and Preiss, J. (1978) Carbohydr. Res. 61:321-334), la actividad se mide indirectamente siguiendo la capacidad de las enzimas ramificantes para estimular la formación de a-D-glucano a partir de glucosa-l-fosfato por medio de fosforilasa a. La prueba de tinción de yodo se basa en la disminución en la absorbancia de un complejo glucan-poliyoduro que se presenta como resultado de la ramificación de la amilosa o amilopectina (ibid) . En la tercera prueba, la prueba de enlace ramificado la amilosa reducida se utilizó como el sustrato y la actividad de la enzima se siguió midiendo la generación de extremos reducidos después de la digestión del producto con isoamilasa (Takeda et al. (1993) Carbohidr. Res. 240:253-262). Guan and Preiss ((1993) Plant Physiol. 102:1269-1273) han usado la prueba de tinción de yodo y de enlace ramificado, para diferenciar las propiedades catalíticas de las tres enzimas ramificantes de almidón de maíz. Mientras que SBEI exhibe actividad mas alta en amilosa ramificada, SBEI la y SBEIIb muestran tasas mas altas de ramificación con un sustrato de amilopectina. Las isoformas podrían diferenciarse además en base de la longitud de la cadena de a-1, 4-glucano que se transfirió: SBEI transfiere preferencialmente cadenas de glucano mas grandes mientras que SBEIIa y SBEIIb muestran una preferencia en la transferencia de cadenas mas cortas. Por consiguiente, las pruebas que miden la actividad enzimática podrían usarse para asignar una actividad funcional a proteínas que, ,en base de la homología en el nivel de aminoácido o hibridización en el nivel de ADN, se han identificado como enzimas ramificantes de almidón o glicógeno. Podrían usarse adicionalmente para caracterizar enzimas ramificantes de almidón o glicógeno que se han sometido a esquemas de mutagénesis diseñados para identificar o alterar residuos aminoácidos que juegan un papel en la determinación de propiedades catalíticas. Además, usando los hallazgos de Guan and Preiss (Id.), las enzimas nativas mutagenizadas podrían clasificarse como tipo SBEI o SBEII en base de las preferencias de sustrato o producto.

Para alterar la estructura fina de almidón en maíz, se construyó un gen quimérico en donde la expresión del gen que codifica la enzima ramificante de almidón está bajo control de elementos reguladores adecuados para la expresión del gen 1) en tejidos de las plantas deseadas, 2) en etapas de desarrollo que proporcionan el máximo efecto deseado, y 3) en niveles de la expresión del gen que resulta en la alteración de la función de la enzima ramificante de almidón tal que la expresión afecta un cambio medible y significante en la estructura fina de almidón.

La expresión de genes externos en plantas está bien establecido (DeBlaere et al. (1987) Meth. Enzymol. 143:277-291) . El nivel apropiado de expresión de genes de enzimas ramificantes sentido o antisentido en maíz podrían requerir el uso de diferentes genes quiméricos utilizando diferentes elementos reguladores. Además, la modulación efectiva de la expresión del gen de la enzima ramificante endógeno por cosupresión o supresión antisentido podría requerir la construcción de genes quiméricos que tienen diferentes regiones de las secuencias sentido o antisentido de la enzima ramificante. La bien conocida impredicibilidad de la cosupresión y técnicas antisentido indican que aún mientras que usando diferentes construcciones genéticas, múltiples plantas podrían haber sido cribadas para identificar aquellas con el fenotipo deseado.

Los promotores utilizados para conducir la expresión del gen en plantas transgénicas pueden derivarse de muchas fuentes tanto como para que el promotor escogido tenga la suficiente actividad transcripcional para realizar la invención expresando el mARN trasladable o ARN antisentido en el tejido del huésped deseado. Por ejemplo, promotores para la expresión en un amplio arreglo de órgano incluyen aquellos que dirigen las transcripciones 19S y 35S en el virus del mosaico de la Coliflor (Odell et al. (1985) Nature 313:810-812; Hull et al. (1987) Virology 86:482-493), unidad pequeña de ribulosa 1, 5-bifosfato carboxilasa (Morelli et al. (1985) Nature 310:115-120; Coruzzi et al. (1984) EMBO J. 3:1671-1679; Faciotti et al. (1985) Bio/Tec nology 3:241 y proteína que enlaza clorofila a/b (Lamppa et al. (1986) Nature 316:750-752) .

Dependiendo de la aplicación, sería deseable seleccionar promotores que son específicos para la expresión en uno o mas órganos de la planta. Los ejemplos incluyen los promotores ligeramente inducibles de la subunidad pequeña de la ribulosa 1, 5-bifosfato, si la expresión es la deseada en órganos fotosintéticos, o promotores específicamente activos en semillas .

Los promotores preferidos son aquellos que permiten la expresión específicamente en semillas. Esto podría ser especialmente útil dado que las semillas son la localización principal de la acumulación de almidón a largo tiempo. Además, la expresión específica en semilla podría evitar cualquier efecto potencial deletéreo que la modulación de la enzima ramificante podría tener en órganos que no sean semilla. Ejemplos de promotores específicos en semilla incluyen, pero no se limitan a, los promotores de las proteínas de almacenamiento en semilla. Estas proteínas de almacenamiento en semilla se regulan estrictamente, siendo expresadas casi exclusivamente en semillas en una forma de órgano altamente específico y etapa específica (Higgins et al. (1984) Ann. Rev. Plant Physiol. 35: 191-221; Goldberg et al. (1989) Cell 56:149-160; Thompson et al. (1989) BioEssays 10:108-113). Además, diferentes proteínas de almacenamiento en semilla podrían expresarse en diferentes etapas del desarrollo de la semilla.

Hay numerosos ejemplos actualmente para la expresión especifica de genes de proteínas de almacenamiento en semilla. Estos incluyen genes de plantas monocotiledóneas tal como ß-hordeina de cebada (Marris et al. (1988) Plant Mol. Biol. 10:359-366) y glutenina de trigo (Colot et al. (1987) EMBO J. 6:3559-3564). Además, los promotores de genes específicos de semilla, enlazados operablemente a secuencias codificantes heterólogas en genes quiméricos construidos, también mantienen su patrón de expresión temporal y espacial en plantas transgénicas . Tales ejemplos incluyen enlace de los promotores de albúmina de Faseolina o Arabidopsis 2S a las secuencia codificante de albúmina 2S de la nuez de Brasil y que expresa tal combinación en tabaco, Arabidopsis, o Brasica napus (Altenbach et al. (1989) Plant Mol. Biol. 13:513-522; Altenbach et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18:235-245; DeClerq et al. (1990) Plant Physiol. 94:970-979), promotores de lecitina de frijol y ß-faseolina de frijol para expresar luciferasa (Riggs et al. (1989) Plant Sci. 63:47-57), y promotores de glutenina de trigo para expresar cloranfenicol acetil transferasa (Colot et al. (,87) EMBO J. 6:3559-3564) .

De uso particular en la expresión de los fragmentos de ácido nucleico de la invención serán promotores de varios genes de proteína de almacenamiento en semilla de maíz extensamente caracterizados tal como promotores específicos de endosperma del gen zein de 10 kD (Kirihara et al. (1988) Gene 71:359-370), el gen zein de 15 kD (Hoffman et al. (1987) EMBO J. 6:3213-3221; Schernthaner et al (1988) EMBO J. 7:1249-1253; illiamson et al. (1988) Plant Physiol 88:1002-1007), el gen zein de 27 kD (Prat et al. (1987) Gene 52:51-49; Gallardo et al. (1988) Plant Sci. 54:211-281), y el gen zein de 19 kD (Marks et al. (1985) J. Biol. Chem. 260:16451-16459) . Han sido reportadas las actividades transcripcionales relativas de estos promotores en maíz (Kodrzyck et al. (1989) Plant Cell 1:105-114) proporcionando una base para escoger un promotor para usar en genes quiméricos construidos para maíz. Además, los promotores que conducen la expresión de genes que codifican enzimas involucradas en la biosíntesis de almidón podrían usarse en la práctica de esta invención. Estos incluyen las secuencias reguladoras 5' de la sacarosa sintetasa (Yang, N.-S. and Rusell, D. (1990) Proc. Nati. Acad. Sci. 87:4144-4148) y los genes waxi o almidón sintetasa I enlazadora de gránulo (Unger et al. (1991) Plant Physiol. 96:124). Los elementos promotores podrían derivarse de otros genes de almidón sintetasa (isoformas enlazadoras de gránulo y solubles) cuando estos son disponibles, y de los genes sh2 (Bhave et al. (1990) Plant Cell 2:581-588) y genes bt2 (Bae et al. (1990) Maydica 35:317-322) cuyos productos constituyen la enzima ADP-glucosa pirofosforilasa . El aislamiento de clones genómicos que codifican los genes de la enzima ramificante de almidón podría realizarse usando los clones cADN correspondientes (Baba et al. (1991) Biochem. Biophys. Res. Commun. 181:87-94; Fisher et al (1993) Plant Physiol. 102:1045-1046) como pruebas de hibridización . Estos proporcionarían un punto de partida útil para el aislamiento de los fragmentos del promotor de estos genes. Para juntar el SBE construido, las secuencias corriente arriba podrían donarse por el gen cognado SBEII o, alternativamente, por el gen SBEI.

Se previsualiza que la introducción de aumentadores o elementos tipo aumentador en otro promotor construido también proporcionará niveles aumentados de transcripción primaria para realizar la invención. Esto incluiría aumentadores virales tal como el encontrado en el promotor 35S (Odell et al. (1988) Plant Mol. Biol. 10:263-272), aumentadores de los genes de opina (Fromm et al. (1989) Plant Cell 1:977-984), o aumentadores de cualquier otra fuente que resulta en transcripción aumentada cuando se coloca en un promotor enlazado operablemente al fragmento de ácido nucleico de la invención.

Los intrones aislados de los genes Ad -1 y Bz-1 de maíz (Callis et al. (1987) Genes Dev. 1:1183-1200), y el intrón 1 y exón 1 del gen del maíz Shrunken-1 (sh-1) (Maas et al. (1991) Plant Mol. Biol. 16:199-207) también podrían ser útiles para aumentar la expresión de los genes introducidos. Los Resultados con el primer intrón del gen de la alcohol deshidrogenes (Adh-1) del maíz indica que cuando este elemento de ADN se coloca en la unidad transcripcional de un gen heterólogo, los niveles de mARN pueden aumentar por 6.7 veces sobre los niveles normales. Niveles similares del intrón de aumento se han observado usando el intrón 3 de un gen de actina de maíz (Luehrsen, K. R. and Walbot, V. (1991) Mol. Gen. Genet. 225:81-93) . También se ha observado el aumento de la expresión del gen por medio del intrón 6 de Adh 1 (Oard et al. (1989) Plant Cell Rep 8:156-160). El exón 1 e intrón 1 del gen sh-1 del maíz ha demostrado aumentar individualmente la expresión de los genes reporteros en cultivos en suspensión de maíz por 10 y 100 veces, respectivamente. Cuando se usan en combinación, estos elementos han demostrado producir hasta 1000 veces la estimulación de la expresión del gen reportero (Maas et al. (1991) Plant Mol. Biol. 16:199-207).

Cualquier región no codificante 3' capaz de proporcionar una señal de poliadenilación y otras secuencias reguladoras que podrían requerirse para la expresión adecuada pueden usarse para realizar la invención. Esto incluiría el extremo 3' de cualquier proteina de almacenamiento tal como el extremo 3' de los genes de 10 kd, 15 kd, 27 kd y alfa zein, el extremo 3' del gen de faseolina del frijol, el extremo 3' del gen de b-conglicinina de la soya, el extremo 3' de los genes virales tal como el extremo 3' de las transcripciones de los virus del mosaico de la coliflor 35S y 19S, el extremo 3' de los genes de síntesis de opina, los extremos 3' de ribulosa 1, 5-bifosfato carboxilasa o la proteína de enlace de la clorofila a/b, o el extremo 3' de las secuencias de cualquier fuente tal que la secuencia empleada proporciona la información reguladora en su secuencia de ácido nucleico para resultar en la expresión correcta de la combinación promotor/ región codificante a la que se une operablemente. Hay numerosos ejemplos en el arte que indican la utilidad de diferentes regiones no codificantes 3' (por ejemplo, ver Ingelbrecht et al. (1989) Plant Cell 1:671-680).

Varios métodos para introducir una secuencia de ADN (p. ej . , de transformación) en células eucarióticas de plantas superiores están disponibles para los expertos en el arte (ver publicaciones EPO 0295 959 A2 y 0 138 341 Al). Tales métodos incluyen bombardeo balístico de alta velocidad con partículas de metal cubiertas con el ácido nucleico construido (ver Klein et al. (1987) Nature (London) 327:70-73, y ver Pat. U.S. No. 4,945,050), así como los basados en vectores de transformación basados en los plásmidos Ti y i de Agrcjbac erium spp., particularmente el tipo binario de estos vectores. Los vectores derivados de Ti transforman una amplia variedad de plantas superiores, incluyendo plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas, tal como soya, algodón y uva (Pacciotti et al. (1985) Bio/Technology 3:241; Byrne et al. (1987) Plant Cell, Tissue and Organ Culture 8:3; Sukhapinda et al. (1987) PJant Mol. Biol. 8:209-216; Lorz et al. (1985) Mol. Gen. Genet. 199:178-182; Potrykus et al. (1985) Mol. Gen. Genet. 199:183-188).

Otros métodos de transformación están disponibles para los expertos en el arte, tal como toma directa de ADN externo construido (ver publicación EPO 0 295 959 A2), y técnicas de electroporación (ver Fromm et al. (1986) Nature (London) 319:791-793). Una vez transformadas, las células pueden regenerarse por los expertos en el arte. También son relevantes varios métodos descritos recientemente de introducción de fragmentos de ácido nucleico en cosechas comercialmente importantes, tal como semilla de uva (ver De Block et al. (1989) Plant P ysiol. 91:694-701), girasol (Everett et al., (1987) Bio/Technology 5:1201-1204), soya (McCabe et al. (1988) Bio/Technology 6:923-926; Hinchee et al. (1988) Bio/Technology 6: 915-922; Chee et al. (1989) Plant Physiol. 91:1212-1218; Christou et al. (1989) Proc. Nati.

Acad. Sci USA 86:7500-7504; Publicación EPO 0 301 749 A2), y rnaiz (Gordon-Kamm et al. (1990) Plant Cell 2:603-618; Fromm et al. (1990) Bio/Technology 8 : 833-839) .

Un experto en el arte es familiar con aún otros medios para la producción de plantas transgénicas de maiz incluyendo la introducción de ADN en protoplastos y regeneración de plantas de dichos protoplastos (Omirulleh et al. (1993) Plant Mol. Biol. 21:415-423), electroporación de tejidos intactos (D'Hulluin et al. (1992) Plant Cell 4:1495-1505; Laursen et al. (1994) Plant Mol. Biol. 24:51-61), transformación de la fibra por medio de carburo de sílice de células de maíz (Kaeppler et al. (1992) Theor. Appl . Genet. 84:560-566; Frame et al. (1994) Plant J. 6:941-948). Además del método de bombardeo de partícula de las células de callo de maíz descrito anteriormente, un experto en el arte es familiar con el bombardeo de partícula de cultivos de maíz o cultivos en suspensión para producir plantas transgénicas fértiles (Koziel et al. (1993) Bio/Technology 11:194-200; Walters et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18:189-200).

Una vez que se obtienen plantas transgénicas por uno de los métodos descritos anteriormente, será necesario cribar las transgénicas individuales de aquellas que exhiben mas efectivamente el fenotipo deseado. Es bien conocido para los expertos en el arte que las plantas transgénicas individuales que portan la misma construcción podrían diferir en los niveles de expresión; este fenómeno se refiere comúnmente como "efecto de posición". Por ejemplo, cuando la construcción en cuestión se diseña para expresar niveles mas altos del gen de interés, las plantas individuales variarán en la cantidad de la proteína producida y por consiguiente en la actividad de la enzima; esto a su vez efectuará el fenotipo.

El experto en el arte sabrá que consideraciones especiales se asocian con el uso de tecnologías antisentido o cosupresión para reducir la expresión de genes particulares. Pat. U.S. Nos. 5,190,931, 5,107,065 y 5,283,323 han indicado la factibilidad de estas técnicas, pero es bien conocido que sus eficiencias son impredecibles . En cada caso, para ahorrar tiempo, el experto en el arte hará múltiples construcciones genéticas que contienen una o mas partes diferentes del gen a ser suprimido, dado que el arte no indica un método para predecir cuál será mas efectivo para un gen particular. Además, aún las construcciones mas efectivas darán un fenotipo de supresión efectivo solamente en una fracción de las líneas transgénicas individuales aisladas. Por ejemplo, W093/11245 y W094/11516 indican que cuando se intenta suprimir la expresión de los genes de ácido graso desaturasa en cañóla, la supresión verdadera se obtiene en menos de 1% de las lineas probadas. En otras especies el porcentaje es algo mayor, pero en ningún caso el porcentaje alcanza el 100.

Esto no deberia ser una limitación en la presente invención, pero en vez de asunto práctico que se aprecia y anticipa por el experto en este arte. Por lo tanto, el experto en el arte desarrollará métodos para cribar grandes números de transformantes. La naturaleza de estos cribados se escogerá en general en bases prácticas, y no es una parte inherente de la invención. En el caso actual, por ejemplo, puede cribarse buscarse cambios en el fenotipo de almidón usando cromatografía para determina proporciones relativas de amilosa a amilopectina, distribución de la cadena ramificada de amilopectina, análisis RVA (como se hace en los ejemplos), u otro medio. Podría usarse igualmente anticuerpos específicos para la proteína codificada por el gen que se suprime, o podrían establecerse pruebas que midan específicamente la actividad enzimática. Un método preferido será el que permita a un gran número de muestras ser procesadas rápidamente, dado que se esperará que la mayoría de las muestras serán negativas.

Las plantas que se identifican para tener la estructura fina del almidón alterado en el grano presenta material genético único que proporciona ventajas sobre líneas de maíz tradicionales y mutantes de algodón conocidas. El uso de líneas con la expresión inhibida de las isoformas de SBE en producción de maíz proporciona una característica que puede simplificar y acelerar el proceso de producción. Las mutantes de almidón conocidas pueden usarse pero a menudo son recesivas y presentas mas complicaciones. Además, el uso de antisentido o cosupresión para inhibir isoformas de SBE dirige a niveles variables de inhibición debido a efectos de la posición cromosomal. Los niveles variables resultantes de las actividades de SBE dirigirían a un rango amplio de fenotipos que no es posible usando mutantes tradicionales que pueden resultar en una serie de dosificación limitada de un alelo mutante en endosperma de maíz. Estructuras finas de almidón adicionales únicas y potencialmente valiosas resultarán de cruzar las líneas de maíz desarrolladas recientemente con SBE inhibido con otro y/o mutantes de almidón conocidas tal como wx o ae.

La presente invención se define además en los siguientes ejemplos. Se comprenderá que los ejemplos se dan para ilustración solamente y la presente invención no se limita a los usos descritos en los ejemplos. La presente invención puede usarse para generar plantas de maíz transgénico cuyos almidones alterados podrían usarse para cualquier propósito donde sus propiedades son útiles tal como en, pero sin limitarse a, alimentos, papel, plásticos, adhesivos o pintura. De la discusión anterior y los siguientes ejemplos, un experto en el arte puede averiguar, y sin desviarse del espíritu y alcance de la misma, puede hacer varios cambios y modificaciones de la invención para adaptarla a varios usos y condiciones. Todas las modificaciones se proyectan caigan dentro del alcance de las reivindicaciones propuestas.

Preparación de Maíz Transgénico que Expresa una Transcripción Antisentido de la Enzima Ramificante de Almidón de Maíz Ilb La inserción de cADN del clon del plásmido pBE240 se usó como el punto de partida en el ensamble de la construcción de ADN diseñado para lograr la supresión de la expresión de SEBIIb en plantas transgénicas de maíz. El clon pBE240 de cADN, que codifica la enzima ramificante de almidón de maíz Ilb (en lo sucesivo SBEIIb), se ha depositado bajo los términos del Tratado de Budapest en ATCC (American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852), y tiene el siguiente número de acceso: ATCC 97365. pBE240 (Figura 1) contiene un fragmento EcoRI-XhoI de 2.7 kpb aislado de una biblioteca de cADN de maíz, insertado en el vector plásmido pbluescript™SK+ (Stratagene) . La inserción (SEC ID NO: 1) consiste de 78 pb de ADN sin trasladar 5', un marco abierto de lectura que codifica la región codificante de SBEIIb de maíz y 190 pb de ADN sin trasladar 3'.

Preparación =|e_l V^tQr dg Ex resión gj¿e. godjfj.g¾ I¿ Construcción Antisentido 3' El gen quimérico insertado en el plásmido construido pBE44 (Figura 2) contiene un fragmento 3' del cADN de SBEIIb en orientación antisentido con respecto al promotor zein de 27 kD de maíz que se localiza 5' al fragmento SBEIIb, y el extremo 3' zein de 10 kD que se localiza 3' al fragmento SBEIIb. El fragmento SBEIIb de esta construcción se generó por medio de reacción en cadena con polimerasa (PCR) de pBE240 usando cebadores de oligonucleótido apropiados. Estos cebadores se sintetizaron en un Beckman Oligo 1000™ DAN Synthesizer. El fragmento de 414 pb de pBE44 (SEC ID NO: 2) se generó usando el par oligonucleótido BE41 (SEC ID NO: 3) y BE42 (SEC ID NO: 4) : BE41 5 ' -GAATTCCCGGGGTGTTCAACTTCCACTGC-31 (SEC ID NO: 3) BE42 5 ' -GAATTCCATGGGACACCTTGAAGGTCTT-3 ' (SEC ID NO: 4) Los sitios de clonación (Ncol o Smal) se incorporaron en los oligonucleótidos para proporcionar orientación antisentido de los fragmentos de ADN cuando se insertaron en el vector digerido pML103 como se describe posteriormente. La clonación se realizó en un volumen de 100 mi en un mezclado PCR estándar de 0.4 mM de cada oligonucleótido y 0.3 pM de pBE240 en Tris-CHl 10 mM, pH 8.3, C1 50 mM, MgCl2 1.5 mM, 0.001 % /v de gelatina, dGTP 200 mM, dATP 200 mM, dTTP 200 mM, dCTP 200 mM y 0.025 unidades de ADN polimerasa Amplitaq™. Las reacciones se llevaron a cabo en un Perkin-Elmer Cetus Thermocycler™ durante 30 ciclos comprendiendo 1 minuto a 95°C, 2 minutos a 55°C y 3 minutos a 72°C, con una extensión final de 7 minutos a 72°C después del último ciclo. El ADN amplificado se digirió con enzimas de restricción Ncol y Smal y se fraccionó en un gel de agarosa de bajo punto de fusión al 0.7% en Tris-acetato 40 mM, pH 8.5, EDTA lmM. La banda apropiada se cortó del gel, se fundió a 68°C y combinó con un fragmento con un fragmento Ncol-Smal de 4.9 kb del plásmido pML103 (Figura 3) . El plásmido pML103 se ha depositado de acuerdo a los términos del Tratado de Budapest en ATCC (American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852), y tiene el siguiente número de acceso: ATCC 97366. El fragmento de ADN de pML103 contiene un fragmento del promotor Sall-Ncol de 1.05 kb del gen zein de 27 kD del maíz y un fragmento Smal-Sall de 0.96 kb del extremo 3' del gen zein de 10 kD del rnaiz en el vector pGem9Zf(+) (Promega) . El ADN del vector e inserción se ligaron a 15°C durante la noche, esencialmente como se describe (Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York; en lo sucesivo "Maniatis") . El ADN ligado se usó para transformar E. coli XLl-Blue (Epicurian Coli XL-1 Blue™; Stratagene) . Las transformantes bacterianas se cribaron por medio de digestión con enzimas de restricción de ADN de plásmido y se limitó el análisis de la secuencia nucleótida usando el método de terminación de cadena didesoxi (Sequenase™ ADN Sequencing Kit; U.S. Biochemical) . El plásmido resultante construido, pBE44, contiene un gen quimérico que codifica, en la dirección 5' a 3', el promotor de zein de 27 kD del maiz, un fragmento 3' del cADN de SBEIIb del maíz, y la región 3' de zein de 10 kD.

Grandes cantidades de ADN de plásmido pBE44 se prepararon por el método de lisis alcalina, seguido de purificación por medio de centrifugación de gradiente de densidad con CsCl.

Transformación de Maiz con la Construcción Antisentido 3' Embriones de maíz inmaduros se disecaron realizando cariopsis derivados de cruzas de las lineas de maíz sin germinar H99 y LH132. Los embriones se aislaron 10 a 11 días después de la polinización cuando tenían de 1.0 a 1.5 mm de largo. Los embriones se colocaron con el eje lateral cara abajo y en contacto con medio N6 de agarosa solidificada (Chu et al. (1975), Sci. Sin. Peking 18:659-668). Los embriones se guardaron en la oscuridad a 27°C. Los callos embriogénicos congelados que consistían de masas indiferenciadas de células con nacimiento proembrionario y embrionario en estructuras suspensoras proliferados a partir de escutelo de estos embriones inmaduros. Los callos embriogénicos aislados a partir del primer explante se cultivaron en medio N6 y subcultivaron en este medio cada 2 o 3 semanas) .

El plásmido, p35S/Ac (Figura 4; obtenido de Dr. Peter Eckes, Hoechst Ag, Frankfurt, Germany) se usó en experimentos de transformación para proporcionar un marcador selectivo. Este plásmido contiene el gen Pat (ver Publicación de Patente Europea 0 242 236) que codifica fosfinotricin acetil transferasa (PAT). La enzima PAT confiere resistencia a inhibidores glutamina sintetasa de herbicidas tal como fosfinotricina . El gen pat en p35S/Ac está bajo el control del promotor del Virus del Mosaico de la Coliflor (Odell et al. (1985) Nature 313:810-812) y la región 3' del gen de la nopalina sintetasa a partir de T-ADN del plásmido Ti de Agrobacterium turnefaciens.

El método de bombardeo de partículas (Klein et al. (1987), Nature 327:70-73) se usó para transferir genes a las células del callo. Partículas de oro (1 m de diámetro) se cubrieron con ADN usando la siguiente técnica. ADNs de plásmido (10 µg de p35S/Ac y 10 µg de pBE44) se adicionaron a 50 µ? de una suspensión de partículas de oro (60 mg por mi). Cloruro de calcio (50 µ? de una solución 2.5 M) y espermidina libre de base (20 µ? de una solución 1.0 M) se adicionaron a las partículas. La suspensión se agitó con vórtex durante la adición de estas soluciones. Después de 10 minutos, los tubos se centrifugaron brevemente (5 seg a 15,000 rpm) y se removió el sobrenadante. Las partículas se resuspendieron en 200 µ? de etanol absoluto, se centrifugaron otra vez y el sobrenadante se removió. El enjuague de etanol se realizó otra vez y las partículas se resuspendieron en un volumen final de 30 µ? de etanol. Una alícuota (5µ1) de partículas de oro recubiertas de ADN se colocaron en el centro de un disco móvil Kapton™ (Bio-Rad Labs) . Las partículas se aceleraron en el tejido de maíz con un Biolistic™ PDS-1000/He (Bio-Rad Instruments, Hercules CA) , usando una presión de helio de 1000 psi, una distancia de espacio de 0.5 cm y una distancia de movimiento de 1.0 cm.

Para el bombardeo, el tejido embriogénico se colocó en papel filtro sobre medio N6 de agarosa solidificado. El tejido se acomodó como una tela delgada y se cubrió un área circular de aproximadamente 5 cm de diámetro. La caja de que contenia el tejido se colocó en la cámara de PDS-1000/He a aproximadamente 8 cm de la pantalla de paro. Entonces el aire en la cámara se evacuó hasta un vacio de 28 pulgadas de Hg. El macroportador se aceleró con una onda de choque de helio usando una membrana de ruptura que estalló cuando la presión del helio en el tubo de choque alcanzó 1000 psi.

Varios días después del bombardeo el tejido se transfirió a medio N6 que contenia glufosinato (2 mg por litro) y carecía de caseína o prolina. El tejido continuó creciendo lentamente en este medio. Después de 2 semanas adicionales el tejido se transfirió a medio N6 fresco que contenía glufosinato. Después de 6 semanas, áreas de aproximadamente 1 cm de diámetro de callos creciendo activamente se identificaron en algunas de las placas que contenían el medio suplementado con glufosinato. Estos callos continuaron creciendo cuando se subcultivaron en el medio selectivo.

Las plantas se regeneraron a partir del callo transgénico transfiriendo primero racimos de tejido a medio N6 suplementado con 0.2 mg por litro de 2,4-D. Después de dos semanas el tejido se transfirió al medio de regeneración (Fromm et al. (1990) Bio/Technology 8:833-839). Un total de 9 plantas de maíz se regeneraron de un experimento de transformación simple usando el pBE44 construido.

Análisis Molecular de Plantas Transaénicas de Maíz que Contienen la Construcción Antisentido 3' El ADN total se aisló de tejido de hojas de plantas regeneradas del experimento de transformación usando esencialmente pBE44 como se describe por Dellaporta et al. (Dellaporta et al. (1983) Plant Mol . Biol. Rep. 1 (4):9). El tejido liofilizado se congeló en nitrógeno líquido, sedimento en polvo fino y se suspendió en un amortiguador que consistía de Tris-HCl 100 mM, pH 8.0, EDTA 50 mM, b-mercaptoetanol 10 mM y NaCl 0.5 M. Las células se lizaron mediante la adición de SDS al 1% y el ADN precipitó con isopropanol. El ADN disuelto se trató con RNasa libre de DNasa y entonces reprecipitó con isopropanol. Los ADNs aislados se disolvieron en Tris-HCl 10 mM, pH 8.0, EDTA 1 mM y se almacenaron a -20°C hasta su uso.

Por análisis de Southern blot, 5 mg de ADN aislado se digirieron con enzima de restricción (10 unidades/mg ADN) en el amortiguador apropiado durante aproximadamente 6 hr a 37°C. El ADN restringido se cargó en un gel de agarosa al 0.8% en amortiguador Tris-borato-EDTA (Maniatis) y se corrió la electroforesis a 40V durante la noche. Después de la desnaturalización y neutralización, el ADN se transfirió a una membrana Immobilon™ ( illipore Corporation) usando 10X SSC. La membrana Immobilon™ se prehibridizó a 65°C en un sistema amortiguador acuoso que consistía de 6X SSPE, 5X reactivo de Denhardt, SDS 5% y 100 mg/mL de ADN de esperma de salmón desnaturalizado como se describió (Maniatis) . El fragmento SBE de pBE44 se marcó por traslación de nick (BRL Nick Translation Kit) y se adicionó al amortiguador anterior suplementado con 5% de sulfato de dextrán a un nivel de 1-2 x 106 cpm/ml. La hibridización se permitió continuar a 65°C durante 18 h. La membrana se lavó secuencialmente con 2X SSC, SDS 0.1% durante 15 minutos a temperatura ambiente, IX SSC, SDS 0.5% durante 15 minutos a 50'C. Las membranas lavadas se expusieron a película Dupont Reflec ion™ con una pantalla de intensificación a -80°C.

Para análisis Northern blot, el ARN total se aisló de granos cosechados 20-22 días después de la polinización (DAP) . Aproximadamente 10 granos por planta se almacenaron y congelaron en nitrógeno liquido. El tejido congelado se precipitó en un polvo fino. Una mezcla de fenol-cloroformo-alcohol isoamílico (24:24:1; 3 mi) se adicionó y la suspensión del tejido se homogeneizó brevemente a mano. 4.5 mL de amortiguador de extracción (1 M Tris-HCl, pH 9.0, SDS 1%, ß-mercaptoetanol 5%) se mezcló en y la suspensión se centrifugó (4°C, 7500 rpm, SS-34) para remover residuos. El sobrenadante se extrajo con fenol-cloroformo-alcohol isoamílico y los ácidos nucleicos se colectaron mediante precipitación con etanol. El ARN se aisló del paquete disuelto por precipitación selectiva con LiCl 0.2 M seguido por una segunda precipitación con etanol. El ARN se disolvió en agua estéril y se almacenó a -80°C antes de usar. La concentración de ADN se calculó midiendo la absorción de las soluciones a 260 nm (considerando que A260= 1 corresponde a 40 mg/mL) .

El ARN total se desnaturalizó por reacción con glioxal y se fraccionó en gel de agarosa al 1% en amortiguador de fosfato de sodio 10 mM, pH 7.0 (Maniatis) . El ARN se transfirió a una membrana de nylon Hybond™ usando 20X SSC como el medio de transferencia y entonces se fijó al soporte sólido por irradiación en un UV Stratalinker™ (Stratagene) . Las manchas se prehibridizaron a 42°C durante 18 h en un amortiguador que consistía de formamida 50%, 6X SSPE, 5X Denhardt, SDS 5%, 100 mg/mL de ADN de esperma de salmón desnaturalizado. La hibridización se llevó a cabo a 42°C durante 18-24 h en el mismo amortiguador suplementado con sulfato de dextrán 5% y que contenia 1-2 x 106 cpm/mL desnaturalizado, prueba de translado de nick. Las manchas se lavaron a temperatura ambiente durante 15 minutos en 2X SSC, SDS 1%, seguido de 15 minutos en IX SSC, SDS 0.1%. Esto fue seguido por un tercer lavado durante 15 minutos a 50°C en 0.1X SSC, SDS 0.5%. Las manchas lavadas se expusieron a -80°C mientras que aún estaban húmedos para la película Dupont Reflection™ con una pantalla de intensificación.

De las 9 líneas de plantas transgénicas que se regeneraron de los bombardeos de partícula realizados con el pBE44 construido, siete de estas se identificaron por análisis Southern blot por contener el gen tratado. Los Northern blots del ARN total aislado de estas líneas mostraron niveles variables de ARN de SBEIIb; en 6 de las líneas analizadas, también se observó una transcripción de 500 bases. El tamaño de este ARN hibridizado es consistente con que predice para la transcripción antisentido del gen quimérico de pBE44.

Análisis de Almidón de Plantas de Maíz Transformadas que Contienen la Construcción Antisentido 3' El almidón se extrajo de semillas simples obtenidas de plantas de maíz transformadas con la construcción antisentido 3'. Las semillas se remojaron en una solución que contenia ácido láctico 1.0% y metabisulfito de sodio 0.3%, pH 3.82, se mantuvieron a 52°C durante 22-24 h. Las semillas se drenaron, se enjuagaron y homogeneizaron individualmente en 8-9 mL de una solución de NaCl 100 mM. Cinco mL de tolueno se adicionaron a cada tubo y se agitaron vigorosamente dos veces durante 6 minutos usando un mezclador de pintura, y permitiendo sedimentar durante 30 minutos. Dos mL de NaCl 100 mM se pulverizaron sobre la solución, permitiendo sedimentar durante 30 minutos, y se aspiró la capa de proteina-tolueno. Se repitió el paso de lavado con tolueno. Doce mL de agua se adicionaron y se agitó en un agitador de pintura durante 45 segundos. Esta solución se centrifugó durante 10 minutos y el agua se retiró. El lavado con agua se repitió, seguido por un lavado final con 12 mL de acetona. Después de los pasos de agitación y centrifugación, la acetona se drenó y se dejó evaporar durante 1 h. Los extractos de almidón se incubaron a 40°C en estufa durante la noche.

Los almidones extraídos se desramificaron enzimáticamente como sigue. Los almidones extraídos (10 mg) de semillas individuales se gelatinizaron en 2 mL de agua por calentamiento a 115°C durante 0.5 h. Cuatro unidades de isoamilasa (Sigma) en amortiguador de NaOAc 50 mM, pH 4.5, se adicionaron a cada uno de los almidones gelatinizados y se colocaron en un baño de agua a 45°C durante 2.5 h. La enzima se inactivó calentando las muestras a 115°C durante 15 minutos. Cada muestra se filtró a través de un filtro de 0.45 mieras, y se colocó en viales individuales de automuestreador . Las muestras se mantuvieron a 45°C hasta la inyección . 50 mL de muestra de almidón desramificado se inyectaron y se corrió a través de cuatro columnas (3 x 250 A y 1 x 500 A ultrahydrogel™; Waters) arregladas en serie a 45°C y se eluyó con NaOAc 50 mM a una velocidad de flujo de 7 mL/min. El intervalo de muestreo fue de 65 minutos. Un detector de índice de refracción (Waters), integrador/graficador (Spectra-Physics) y computadora se usaron para la detección de la muestra, registrando los tiempos de retención y almacenando el cromatograma, respectivamente. Los tiempos de retención de las muestras colectadas se compararon a los tiempos de retención de los estándares abundantes (380K, 100 , 23. K, 5.8K, 728 y 180 mw) .

El programa de Spectra-Physics se usó para hacer cualquier corrección del nivel de referencia para el cromatograma. El programa Spectra-Physics GPC-PC se usó para pesos moleculares y tiempos de retención completos de estándares abundantes. Los resultados se importaron a Microsoft Excel identificando y extrayendo todos los resultados excepto peso molecular y por ciento de área del cromatograma. Los resultados restantes se usaron para determinar la distribución de la cadena ramificada de la amilopectina usando el programa Jandel Scientific Peakfit. Una serie de seis curvas Gausianas se ajustaron para la porción de amilopectina de los cromatogramas como se describe por Ong et al. ((1994) Carbohydrate Res. 260:99-117).

La amilopectina se describe típicamente por su distribución de cadenas ramificadas en la molécula. La molécula de amilopectina está comprendida de regiones cristalinas y amorfas alternadas. La región cristalina es donde se presentan muchos de los puntos ramificados (enlaces a-1,6), mientras que la región amorfa es un área de poca a no ramificada y pocas cadenas ramificadas. El tipo de cadena de designa A o B. Las cadenas A son no ramificadas y se extiende en una región cristalina simple. Las cadenas Bl también se extienden en una región cristalina simple pero son ramificadas. Las cadenas B2, B3 y B4+- son ramificadas y se extienden en 2, 3 y 4 o mas regiones cristalinas, respectivamente (Hizukuri (1986) Carbohydrate Res. 147:342-347). El ajuste del área relativa bajo las seis curvas Gausianas para la porción de amilopectina de los cromatogramas usando el paquete Peakfit se usó para determinar el por ciento de área de las cadenas A, Bl, B2, B3 y B4+. Las áreas del primero y segundo picos se sumaron para dar la cantidad relativa de las cadenas A y Bl, el tercer y cuarto picos representan las cadenas B2 y B3, respectivamente, y la suma del quinto y sexto picos representan el área relativa de las cadenas B4+ . La masa promedio DP de las cadenas A, Bl, B2, B3 y B4 fueron 14, 22, 43 y 69 respectivamente.

Los almidones de granos Rl individuales de plantas transformadas con pBE44 (la construcción antisentido 3' de SBEIIb de maíz) se analizaron usando el procedimiento descrito anteriormente. Como se conoce por los expertos en el arte, el fenómeno antisentido en general no se observa en cada linea transgénica individual. Por lo tanto, los granos individuales de lineas múltiples se examinaron y se esperó, algunos, pero no que todas las lineas poseyeran granos que demuestran un fenotipo de almidón alterado. Los granos individuales de una planta control negativa (Linea de Control Negativa de Transformación 03376; esta linea ha estado a través del proceso de transformación pero no porta el gen antisentido) se incluyó en cada grupo de prueba, y se realizaron pruebas duplicadas en almidones de granos individuales. La tabla 1 presenta ios resultados de granos individuales (Nos. de grano 1 y 7) de una linea de maíz transformada (0693) que mostró un fenotipo. Los resultados representan el porcentaje de diferencia de varias ramificaciones entre granos de la linea transformada y granos de un control negativo (linea 03376, que ha estado a través del proceso de trans ormación pero no contiene el gen antise'ntido) .

Tabla 1. Porcentaje de la Diferencia de la Distribución de Cadena Ramificada de Amilopectina de Almidón Aislado de Semilla Individual de la Linea de Maíz Transgénico SBEIIb Antisentido 3' (0693) Comparado al Almidón Aislado de la Linea de Control Negativa (03376) .

Fuente de Almidón A + Bl B B3_ B4 + 06931 80 95 104 226 06937 91 90 100 194 Los resultados experimental (06931 y 06937) y control (03376) son el promedio de pruebas duplicadas de almidones aislados de granos individuales. Como puede verse, hay un aumento de aproximadamente 2 veces (226% del control y 194% del control para 06931 y 06937, respectivamente) en las cadenas largas (B4+), que indica que las cadenas largas (B4+) se favorecieron a expensas de las cadenas mas cortas (A's, Bl's y B2's) en los almidones que poseen el gen antisentido relativo al almidón control. Las plantas transgénicas actuales demuestran asi un fenotipo de almidón ramificado único comparado a las plantas control no transgénicas. Estos resultados indican que la alteración de la actividad de la enzima ramificante de almidón de maíz suprimiendo la expresión de los genes correspondientes que codifican enzimas ramificantes de almidón resulta en un fenotipo de almidón alterado .

Los granos Rl de la linea pBE44, 0693, se plantaron y se produjo el grano R2. Los granos R2 individuales se analizaron usando el mismo procedimiento como se describió anteriormente para el análisis de los granos Rl . Los granos individuales de una linea de control negativo (04659, que ha estado a través del proceso de transformación pero no porta el gen antisentido) se incluyeron en este grupo de pruebas. La tabla 2 presenta los resultados de granos R2. Los resultados representan el porcentaje de diferencia de varias ramificaciones entre granos R2 y granos del control negativo.

Tabla 2. Porcentaje de la Diferencia de la Distribución de Cadena Ramificada de Amilopectina de Almidón Aislado de Semilla Individual de la Línea de Maíz Transgénico SBEIIb Antisentido 3' (05985) Comparado al Almidón Aislado de la Linea de Control Negativa (04659) .

Fuente de Almidón A + Bl B2 B3 B4+ 059852 69 91 132 476 0598510 71 92 129 455 Como puede verse, las cadenas largas (B3 y B4+ ) se favorecieron a expensas de las cadenas mas cortas (A's, Bl ' s y B2's) en la amilopectina derivada de granos R2 que poseen el gen antisentido relativo al almidón control (04659) . Las plantas transgénicas actuales demuestran así un fenotipo de almidón ramificado único comparado a las plantas control no transgénicas. Estos resultados indican que el fenotipo observado en la semilla R2 es mas fuerte que el de la semilla Rl (Tabla 1) que podría deberse a la segregación.

El grano R4 (línea XAY00681) se produjo, se cosechó y se extrajo el almidón. Para la distribución de la cadena ramificada de almidón y determinación del contenido de amilosa, la digestión de almidón se modificó ligeramente de los ejemplos anteriores como sigue. Siete mg de cada muestra de almidón se adicionó a un tubo de ensayo de tapón roscado con 1.1 mL de agua. Los tubos se calentaron a 120°C durante 30 minutos y se colocó entonces en un baño de agua a 45°C. La solución desramificada se hizo diluyendo 50 µL de isoamilasa (5xl06 unidades/mL, Sigma) por mL de amortiguador de acetato de sodio (50 mM, pH 4.5). 40 pL de solución desramificante se adicionó a cada muestra de almidón y se incubó durante 3 h a 45°C. Las reacciones se pararon calentando a 110°C durante 5 minutos. Las muestras de almidón desramificado se liofilizaron y disolvieron en DMSO para análisis por cromatografía de permeación en gel (GPC) . Cien pL de almidón desramificado se inyectó y corrió a través de dos columnas (Polymer Labs, Mixed Bed-C) ) en serie a 100°C y se eluyó con DMSO a una velocidad de flujo de 1.0 mL/min. El intervalo de muestreo fue de 25 minutos. Un detector de índice de refracción (Waters) se usó con una computadora de corrida Chemstation Software (versión A.02.05, Hewlett Packard) para detección y colección y almacenamiento de resultados, respectivamente. Los tiempos ie retención de estándares abundantes (380K, 100K, 23.7K, 5.6K, 728 y 180 mw) se usaron para definir los rangos de peso molecular para las muestras de almidón desramificado. La proporción del almidón total se determinó para 24 rangos del grado de polimerización (DP) extendiendo las porciones de amilosa y amilopectina del cromatograma . Para fines de comparación para los resultados reportados anteriormente, el porcentaje de área en rangos apropiados de DP se sumaron para dar valores de las cadenas A y Bl, B2, B3 y B4+ de la porción amilopectina del cromatograma. La porción del área total anterior DP 150 se usó para determinar el contenido de amilosa.

El almidón de la linea XAY00681 (R4) y el almidón de molienda (control) se desramificó y analizó. Los resultados se muestran en las Tablas 3 y 4 a continuación: Tabla 3. El porcentaje del área cromatográfica total en grados dados de polimerización (DP) rangos de almidón derivado de grano R4 que contiene la transcripción antisentido 3' de SBEIIb de maíz y almidón de molienda normal (control) . Se reportan promedios (n=12) y errores estándar de la media (SE) .

Almidón de Molienda XAY00681 Ranao de DP Promedio 2£ Promedio SE. >5k 5.45 0. 14 5.59 0.63 3-5k 2.62 0. 05 3.15 0.06 1.8-3k 3.03 0. 04 3.89 0.09 1.2-1.8k 2.49 0. 05 3.54 0.10 0.9-1.2k 1.92 0. 04 2.67 0.06 600-900 2.86 0. 03 3.91 0.09 400-600 2.78 0. 05 3.83 0.08 250-400 2.83 0. 05 3.83 SE 150-250 2.43 0. 04 3.50 0.09 90-150 2.38 0. 04 3.50 0.09 60-90 4.04 0. 08 6.10 0.07 48-60 4.08 0. 07 4.81 0.04 40-48 3.95 0. 09 3.96 0.05 32-40 4.52 0. 13 4.45 0.05 28-32 3.45 0. 12 2.89 0.04 24-28 3.69 0. 17 3.37 0.06 21-24 4.72 0.18 3.74 0.05 18-21 6.01 0.03 4.83 0.10 15-18 8.42 0.05 6.18 0.12 13-15 7.24 0.21 5.34 0.11 11-15 6.64 0.17 4.49 0.10 9-11 6.20 0.08 4.54 0.11 7-9 4.48 0.06 3.40 0.07 5-7 3.67 0.07 2.91 0.05 Tabla 4. Porcentaje de la Diferencia de la Distribución de Cadena Ramificada de Amilopectina (expresado como A+Bl, B2, B3 y B4+) y Contenido de Amilosa (% de Almidón Total) de Almidón Aislado de Grano R4 que Contiene la Transcripción Antisentido 3' de SBEIIb (XAY00681) de maíz Comparado con el Control (Molido) . Se indica rango de DP A+Bl (5- B2 (15-32 B3 (32-60) B4+ (60- Amilosa 151 15JH O150) 83.3 89.0 117.4 184.5 128.4 Como puede verse en las Tablas 3 y 4, la cantidad relativa de aumento de amilosa como la proporción de ramificaciones mas grandes de almidón que contenia la transcripción antisentido 3' de SBEIIb de maíz fue comparado con un control molido.

Análisis Funcional de Lineas Homoziao de la Construcción An gQntiflo 3 ' Los granos de plantas de una linea (XAT00025), homozigo para la construcción pBE44, se aisló de la progenie de la linea 05985 para obtener cantidades suficientes de almidón para la prueba de funcionalidad. El almidón se extrajo de granos maduros secos de la linea XAT00025, maíz molido y ae. Para cada linea 15 g de granos se pesaron en un matraz Erlenmeyer de 50 mL y se remojaron en 50 mL de solución de remojo (igual que arriba) durante 18 h a 52°C. Los granos se drenaron y enjuagaron con agua. Los granos se homogeneizaron después usando una prueba Polytron de 20 mm (Kinematica GmbH; Kriens Luzern, Switzerland) en 50 mL de NaCl 50 mM frío. El homogeneizado se filtró a través de una malla de 72 mieras. El filtrado se llevó a un volumen total de 400 mL con NaCl 50 mM y se adicionó un volumen total de tolueno. La mezcla se agitó con un agitador magnético durante 1 h a velocidad suficiente para emulsificar completamente las dos fases. La emulsión se dejó separar toda la noche en un vaso cubierto.

La capa superior de tolueno se aspiró del vaso y se desechó. La suspensión de almidón remanente en el fondo del vaso se resuspendió, se vertió en una botella de 250 mL de centrifuga y se centrifugó 15 minutos a 25,000 RCF. El sobrenadante se desechó y el almidón se lava secuencialmente con agua y acetona agitando y centrifugando como antes. Después del lavado de acetona y centrifugación la acetona se decantó y el almidón se dejó secar toda la noche en una campana de humos a temperatura ambiente.

Un Rapid Visco Analyzer (Newport Scientific; Sidney, Australia) con opción de alta sensibilidad y programa Thermocline se usó para el análisis de la curva de empastado. Para cada linea, se pesaron 1.50 g de almidón en el vaso de muestra y se adicionó 25 mi de amortiguador de fosfato/citrato (pH 6.50) conteniendo 1 % de NaCl. El análisis de la curva de empastado se realizó usando el siguiente perfil de temperatura: temperatura de reposo 50°C, manteniendo a 50°C durante 0.5 minutos, calentamiento lineal a 95°C durante 2.5 minutos, enfriamiento lineal a 50°C durante 4 minutos, manteniendo a 50°C durante cuatro minutos.

Los resultados del análisis de empastado del Rapid Visco Analyzer se muestran en la Figura 5. Puede verse que el almidón producido por la lir.ea XAT00025 difiere en sus propiedades de empastado del almidón molido normal y de una linea homozigo de la mutación ae. Este resultado demuestra que la alteración de la estructura fina de almidón producida suprimiendo la expresión de la enzima ramificante de almidón puede crear una almidón de funcionalidad nueva.

EJEMPLO 2 Preparación de Maíz Transaénico aue Expresa una Transcripción Antisentido 5' de Enzima Ramificante de Almidón de Maíz Ilb Preparación del Vector de Expresión aue Codifica la Construcción Antisentido 5' El gen quimérico insertado en el plásmido construido pBE43 (Figura 6) contiene un fragmento 5' del cADN de SEBIIb en orientación antisentido con respecto al promotor zein de 27 kD de maíz, localizado 5' al fragmento SBEIIb, y al extremo 3'de zein de 10 kD, localizado 3' al fragmento SBEIIb. El fragmento SBEIIb de esta construcción se generó por medio de reacción en cadena con polimerasa (PCR) de pBE240 usando cebadores apropiados de oligonucleótido . Estos cebadores se sintetizaron en un Beckman Oligo 1000™ DNA Synt esizer. El fragmento de 507 pb de pBE43 (SEC ID NO: 5) se sintetizó usando el par de oligonucleótido BE39 (SEC ID NO: 6) y BE40 (SEC ID NO: 7) : BE39 5 ' -GAATTCCCGGGACCCGGATTTCGCTCTT-3 ' (SEC ID NO: 6) BE40 5 ' -GAATTCCATGGTCTATAGAGGCTGTACCG-31 (SEC ID NO: 7) Los sitios de clonación (Ncol o Smal) se incorporaron en los oligonucleótidos para orientación antisentido de los fragmentos de ADN cuando se insertó en el vector digerido pML103 como se describe después. La amplificación se realizó en un volumen de 100 mi en una mezcla de reacción PCR estándar que consistía de 0.4 mM de cada oligonucleótido y 0.3 pM de pBE240 en Tris-HCl 10 mM, pH 8.3, KC1 50 mM, MgCl; 1.5 mM, 0.001% p/v de gelatina, dGTP 200 mM, dATP 200 mM, dTTP 200 mM, dCTP 200 mM y 0.025 unidades de ADN polimerasa Amplitaq™. Las reacciones se llevaron a cabo en un Perkin-Elmer Cetus Thermocycler™ para 30 ciclos que comprenden 1 minuto a 95°C, 2 minutos a 55:C y 3 minutos a 72°C, con una extensión final de 7 minutos a 72:C después del último ciclo. El ADN amplificado se digirió con enzimas de restricción Ncol y Smal y se fraccionó en un gel de agarosa 0.7% de bajo punto de fusión en Tris-acetato 40 mM, pH 8.5, EDTA lmM. La banda apropiada se cortó del gel, se fundió a 68°C y se combinó con un fragmento Ncol-Smal de 4.9 kb del plásmido pML103 (Figura 3) . El segmento de ADN de pML103 contiene un fragmento del promotor de Sall-Ncol de 1.05 kb del gen zein de 27 kD del maíz y un fragmento de Smal-Sall de 0.96 kb del extremo 3' del gen zein de 10 kD del maíz en el vector pGem9Zf( + ) (Promega) . El vector y el ADN insertado se ligaron a 15 °C durante la noche, esencialmente como se describió (Maniatis) . El ADN ligado se usó para transformar E. coli XLl-Blue (Epicurian Coli XL-1 Blue; Stratagene™) . Las transformantes bacterianas se cribaron por medio de digestión con enzima de restricción del ADN de plásmido y análisis de secuencia de nucleótido limitada usando el método de terminación de cadena didesoxi (Sequenase™ DNA Sequencing it; U.S. Biochemical) . La construcción del plásmido resultante, pBE43, comprende un gen quimérico que codifica en la dirección 5' a 3', el promotor zein de 27 kD de maíz, un fragmento 5' del gen SBEIIb de maíz en orientación antisentido, y la región 3' de zein de 10 kd.

Cantidades mas grandes de ADN del plásmido pBE43 se prepararon por el método de lisis alcalina, seguido de purificación con centrifugación de gradiente de CsCl.

Transformación de Maíz con la Construcción Antisentido 5' La construcción antisentido 5' (pBE43) se introdujo en tejido de maíz embriogénico por el método de bombardeo de partícula esencialmente como se describió en el Ejemplo 1. Siete días después del bombardeo el tejido se transfirió a medio N6 que contenía glufosinato (2 mg por litro) y carecía de caseína o prolina. El tejido continuó creciendo lentamente en este medio. Después de 2 semanas adicionales el tejido se transfirió a medio N6 fresco que contenía glufosinato. Después de 6 semanas, áreas de aproximadamente 1 cm de diámetro de callos creciendo activamente se identificaron en algunas de las placas que contenían el medio suplementado con glufosinato. Estos callos continuaron creciendo cuando se subcultivaron en el medio selectivo.

Las plantas se regeneraron a partir del callo transgénico transfiriendo primero racimos de tejido a medio N6 suplementado con 0.2 mg por litro de 2,4-D. Después de dos semanas el tejido se transfirió al medio de regeneración (Fromm et al. (1990) Bio/Technology 8:833-839). Noventa y nueve líneas de plantas transgénicas se regeneraron de 2 experimentos separados de bombardeo de partículas realizados con el ADN del pBE43 construido.

Análisis Molecular de Plantas Transgénicas de Maíz que Contienen la Construcción Antisentido 5' Los análisis Southern blot y Northern blot de ADN y ARN de plantas de maíz transformadas con la construcción antisentido 5' (pBE43) se realizó como se describe en el Ejemplo 1. Para Southerns, la prueba de ADN se preparó como se describe en el Ejemplo 1. De las noventa y nueve lineas de plantas transgenicas que se generaron de los experimentos de bombardeo de partículas, veintiocho se sometieron a análisis Southern blot usando un fragmento EcoRi-BamHI de 666 pb del cADN de SBEIIb como una prueba de hibridización. Se identificaron veinte lineas que portan el gen característico. El patrón de las bandas de hibridización estuvo en el rango de ligeramente simple a demasiado complejo, consistente con la duplicación y ordenamiento del ADN construido para la integración en el genoma de maíz.

El ARN total se aisló de 35 líneas de plantas transformadas pBE43. El ADN se desnaturalizó, se fraccionó por electroforesis en gel, se manchó en membranas de nylon y se hibridizó para una prueba que abarca el cADN de SBEIIb completo o una porción 5' de este. El nivel de ARN de SBEIIb se encontró que variaba considerablemente de línea a línea pero en ningún momento se encontró ausencia completa de ARN.

Este resultado no es inesperado dado que el ARN se preparó de una población segregada de semillas. Además del ARN de SBEIIb de 2.7 kb, se observó una especie de ARN mas pequeño en algunas de las líneas de plantas analizadas. La intensidad de esta banda se encontró que variaba con 8 líneas mostrando señales de moderadas a débiles y 4 líneas mostrando señales fuertes. El tamaño de esta banda de ARN, aproximadamente 600 bases, pares que se esperaron de la transcripción antisentido derivada del gen quimérico.

Esta identidad se confirmó hibridizando Northern blots a ribopruebas de hebra específica. Para la generación de pruebas de ARN de hebra simple, el fragmento de ADN de SBEIIb del pBE43 construido se subclonó en un vector pBLUESCRIPT SK+ modificado el cual contiene un sitio Ncolen el lugar del sitio Xbal en el polienlazador . Para la síntesis de la hebra sentido (ARN idéntico) , el plásmido se linearizó primero por digestión con Ncol y la transcripción se llevó a cabo por medio de T7 ARN polimerasa en presencia de ( -32P)rUTP usando un RNA Transcription Kit (Stratagene) . Para síntesis de la prueba ARN antisentido, el plásmido se linearizó por digestión con EcoRI, seguido por transcripción catalizada con T3 ARN polimerasa. La prehibridi zación de Northern blots se realizó a 60°C en formamida 50%, 6x SSPE, 1 x solución de Denhardt y 100 mg/ml de t-ARN de levadura. La hibridización se llevó a cabo en el mismo amortiguador suplementado con 5% de sulfato de dextrán y conteniendo 1 x 106 cpm/ml de prueba de ARN durante aproximadamente 18 h a 60°C. Las manchas se lavaron durante 15 minutos a temperatura ambiente en 2X SSPE, 30 minutos a 70°C en IX SSPE, SDS 0.1% seguido por 30 minutos a 70°C en IX SSPE, SDS 0.5%. Las manchas lavadas se expusieron a -80°C cuando estaban aún húmedas a la película Dupont Reflection con una pantalla de intensificación. La prueba que corresponde al ARN antisentido detectó solamente el ARN de SBEIIb endógeno mientras que la prueba sentido detectó solamente las especies de ARN de 600 bases. Este resultado es consistente con la identidad del ARN de 600 bases de la transcripción antisentido de pBE43.

Análisis de Almidón de Plantas de Maíz Transformadas que Contienen la Construcción Antisentido 5' Los almidones de granos Rl individuales de plantas transformadas con pBE43 (la construcción antisentido 5' de SBEIIb de maíz) se extrajeron y analizaron usando el procedimiento descrito en el Ejemplo 1. Como se conoce por los expertos en el arte, el fenómeno antisentido o cosupresión en general no se observa en cada línea transgénica individual. Por lo tanto, los granos individuales de líneas múltiples se examinaron. No se observaron alteraciones en la distribución de la cadena ramificada de almidón para las líneas Transgénicas que se cribaron. Se cree que el número de líneas probadas fue muy pequeño para asegurar hallar una planta donde se presentó un evento antisentido efectivo. Como se describió anteriormente, el número de plantas que debe cribarse puede ser impredecible y grande. Se asume que si un número suficientemente grande de individuos se examinaron tal evento debería detectarse. Podría ser que esta configuración particular es menos eficiente para suprimir la expresión de este gen; es por esta razón que se prepararon y probaron construcciones múltiples.

EJEMPLO 3 Preparación de Maíz Transaénico aue Expresa una Transcripción Antisentido de Longitud Casi Completa de la Enzima Ramificante de Almidón de Maíz Ilb Preparación del Vector de Expresión aue Codifica la Construcción Antisentido de Longitud Casi Completa La construcción de pBE45 es similar a pBE43 y pBE44 excepto que el fragmento es de 2.16 kb y contiene la región sin trasladar 5' completa así como de 2.08 kb de la región codificante (SEC ID NO: 8) . pBE240 se digirió primero con EcoRi y después se sometió a una reacción terminal completa con el fragmento de Klenow de ADN polimerasa I (Maniatis) . El extremo despuntado de ADN se fraccionó en un gel de agarosa de bajo punto de fusión y la banda cortada se combinó con un fragmento Ncol-Smal de 4.9 kb del plásmido pML103 (Figura 3).

El segmento de ADN del pML103 contiene un fragmento del promotor de Sall-Ncol de 1.05 kb del gen zein de 27 kD de maíz y un fragmento Smal-Sall del extremo 3' del gen zein de 10 kD de maíz en el vector pGem9Zf(+) (Promega). El vector y el ADN insertado se ligaron a 15 °C durante la noche, esencialmente como se describió (Maniatis) . El ADN ligado se usó para transformar E. coli XLl-Blue (Epicurian Coli XL-1 Blue™; Stratagene) . Las transformantes bacterianas se cribaron para la presencia de y la orientación del ADN adicionado por medio de digestión con enzima de restricción con Kpnl y análisis de secuencia de nucleótido limitada usando el método de terminación de cadena didesoxi (Sequenase™ DNA Sequencing Kit; U.S. Biochemical) . De acuerdo a este análisis, en pBE45, el fragmento SBEIIb está presente en orientación inversa relativa al promotor zein de 27 kD. La construcción del plásmido resultante, pBE45, contiene un gen quimérico que codifica, en la dirección 5' a 3', el promotor zein de 27 kD de maíz, el fragmento de longitud casi completa de SBEIIb de maiz en orientación antisentido, y la región 3' de zein de 10 kd (Fig. 7).

Cantidades mas grandes de ADN del plásmido pBE45 se prepararon por el método de lisis alcalina, seguido de purificación con centrifugación de gradiente de CsCl.

Transformación de Maíz con la Construcción Antisentido de Longitud Casi Completa La construcción antisentido de longitud casi completa (pBE43) se introdujo en tejido de maíz embriogénico por el método de bombardeo de partícula esencialmente como se describió en el Ejemplo 1. Siete días después del bombardeo el tejido se transfirió a medio N6 que contenía glufosinato (2 mg por litro) y carecía de caseína o prolina. El tejido continuó creciendo lentamente en este medio. Después de 2 semanas adicionales el tejido se transfirió a medio N6 fresco que contenía glufosinato. Después de 6 semanas, áreas de aproximadamente 1 cm de diámetro de callos creciendo activamente se identificaron en algunas de las placas que contenían el medio suplementado con glufosinato. Estos callos continuaron creciendo cuando se subcultivaron en el medio selectivo .

Las plantas se regeneraron a partir del callo transgénico transfiriendo primero racimos de tejido a medio N6 suplementado con 0.2 mg por litro de 2,4-D. Después de dos semanas el tejido se transfirió ai medio de regeneración (Fromm et al. (1990) Bio/Tecr.n l gy 3:833-839). Diez líneas de plantas transgénicas se regeneraron de un solo experimento de bombardeo de partículas realizado con el ADN del pBE43 construido .

Análisis Molecular de Plantas Transformadas de Maíz ana Contienen la Construcción Antisentido de Longitud Casi Completa Los análisis Southern blot y Northern blot de ADN y ARN de plantas de maíz transformadas con la construcción antisentido de longitud casi completa (pBE45) se realizó como se describe esencialmente en el Ejemplo 1. Para Southerns, la prueba de ADN, un fragmento 5' EcoRI-BamHI de pBE240, se preparó esencialmente como se describe en el Ejemplo 1. De las 10 lineas de plantas Transgénicas que se generaron, 5 pruebas fueron positivas para la presencia del gen característico introducido.

Los Northern blots del ARN total revelaron solamente una banda simple cuando se probó con el fragmento 5' EcoRI-BamHI del cADN de SBEIIb. Dado que el ARN de SBEIIb y la transcripción antisentido de pBE45 son de tamaño similar, 2.7 y 2.4 kb respectivamente, parece posible que las dos especies no podrían resolverse adecuadamente durante la electroforesis en gel de agarosa. Por esta razón, los Northern blots también se hibridizaron para pruebas de ARN de hebra específica, esencialmente como se describe en el Ejemplo 1. Sin embargo, mientras que la hebra antisentido detectó el mARN de SBEIIb endógeno, ninguna señal fue evidente cuando se empleó la prueba de hebra sentido.

Análisis de Almidón de Plantas de Maíz Transformadas que Contienen la Construcción Antisentido de Longitud Casi Completa Los almidones de granos Rl individuales de plantas transformadas con pBE45 (la construcción antisentido de longitud caso completa de SBEIIb de maíz) se analizaron usando el procedimiento descrito en el Ejemplo 1. Como se conoce por los expertos en el arte, el fenómeno antisentido en general no se observa en cada linea transgénica individual. Por lo tanto, los granos individuales de lineas múltiples se examinaron y se esperó, algunas, pero no todas las lineas poseyeran granos que demuestran un fenotipo de almidón alterado. La Tabla 5 presenta los resultados de una linea de maíz transformado que mostró un fenotipo. Los resultados representan el porcentaje de la diferencia de varias ramificaciones entre granos de la linea transformada y granos de un control negativo (linea 03376, que ha estado a través del proceso de transformación pero no contiene el gen antisentido) .

Tabla 5. Porcentaje de la Diferencia de la Distribución de Cadena Ramificada de Amilopectina de Almidón Aislado de Semilla Individual de la Linea de Maíz Transgénico SBEIIb Antisentido de Longitud Casi Completa (9228) Comparado al Almidón Aislado de la Linea de Control Negativa (03376) .

Fuente de Almidón A + Bl B2 g¿ 92283 92 97 81 Como puede verse, las cadenas largas (B4+) se favorecieron a expensas de las cadenas mas cortas (A's y Bl's, B2's y B3's) en el almidón derivado de plantas de maíz que poseen el gen antisentido relativo al almidón control (03376) . Las plantas transgénicas actuales demuestran asi un fenotipo de almidón ramificado único comparado a las plantas control no transgénicas. Estos resultados indican que la alteración de la enzima ramificante de almidón suprimiendo la expresión de los genes correspondientes que codifican las enzimas ramificantes de almidón resultan en un fenotipo de almidón alterado.

Preparación de Maíz Transaénico aue Expresa una Transcripción Sentido de Longitud Casi Completa de la Enzima Ramificante de Almidón de Maíz iib Preparación del Vector de Expresión aue Codifica la Construcción Sentido de Longitud Casi Completa El plásmido pBE96 contiene un fragmento de 2.09 kb del cADN de SBEIIb (SEC ID NO: 9) unido en orientación sentido al promotor zein de 27 kD y el extremo 3' zein de 10 kD (Figura 8) . El fragmento SBEIIb comienza en el codón de iniciación ATG de la región codificante y termina 312 pb 5' del codón de terminación de traslación. pBE240 se sometió a mutagénesis específica de sitio (Sculptor™ Mutagénesis Kit, Amersham) para generar un sitio Ncol en el sitio de inicio ATG. El plásmido mutagenizado se digirió primero con EcoRI y después se hizo el extremo despuntado por reacción con Klenow. El fragmento de ADN se liberó por digestión con Ncol, fraccionando por medio de electroforesis en un gel de agarosa de bajo punto de fusión, y se ligó al fragmento Ncol-Smal de pML103 como se describió anteriormente. Las transformantes en E. coli XLl-Blue se probaron para la presencia del fragmento SBEIIb por medio de digestión con enzima de restricción Ncol y HindIII seguido por la determinación de la secuencia nucleótida. De este análisis, se identificó pBE71. pBE71 se digirió con PvuII para el gen quimérico completo (promotor zein de 27 kD - SBEIIb truncado - extremo 3' zein de 10 kD) y este fragmento se clonó en el vector pKS17. pKS17 contiene el gen higromicina B fosfotransferasa que confiere resistencia al antibiótico higromicina. pKS17 se ensambló por la adición de un gen quimérico terminador de promotor T7-HPT-T7 a un vector multicopia del que se ha eliminado el gen b-lactamasa. El plásmido resultante que contiene la inserción zien de 27 kD - SBEIIb truncada - zein de 10 kD en pKS17 se denomina pBE96.

EJEMPLO 5 Preparación de Maiz Transaénico aue Expresa Transcripción Antisentido de la Enzima Ramificante de Almidón de Maíz I Un fragmento de ADN de SBEI se generó a partir de la secuencia publicada del cADN de SBEI (Baba et al. (1991) Biochem. Biophys . Res. Commun. 131:87-94} por reacción en cadena con polimerasa (PCR) usando cebadores BE14 (SEC ID NO: 10) y BE15 (SEC ID NO: 11) : BE14 5 ' -AAGCTTGAATTCTGCTCGGTGATGAGACAC-3 ' (SEC ID NO: 10) -AAGCTTGAATTCCTTGGAGGTGATGGCTAC- BE14 y BE15 se combinaron con ADN lambda de lizados de placa de una biblioteca de cADN de maíz DAP en lambda ZapII (Stratagene) en una mezcla de reacción PCR estándar que consistía de 0.4 mM de cada oligonucleótido y 0.8 mg de molde de ADN en Tris-HCl 10 mM, pH 8.3, KC1 50 mM, MgCl2 1.5 mM, 0.001% p/v de gelatina, dGTP 200 mM, dATP 200 mM, dTTP 200 mM, dCTP 200 mM y 0.025 unidades de ADN polimerasa Amplitaq™ en un volumen de 100 mi. El fragmento PCR de 875 pb se digirió con la enzima de restricción Accl para liberar un fragmento de 325 pb (que abarca los nucleótidos 2290-2610 de la secuencia publicada) que se usó después como una prueba de hibridización para cribar la biblioteca de 12 cADN de maíz DAP para los clones SBEI de longitud completa. Uno de los clones aislados, denominado pBE65, contenía una inserción EcoRI de 2772 pb (SEC ID NO: 12) . Los nucleótidos 165 a 2772 de este clon se encontró ser mas del 99% idéntico a la secuencia del clon cADN de SBEI publicado por Baba et al. ((1991) Biochem. Biophys. Res. Commun. 181:87-94). Sin embargo, el término 5' de 164 pb de la inserción no fue acorde con la secuencia publicada. Para resolver esta discrepancia, se intentó amplificar esta región del gen mediante PCR usando ADN total de maíz como molde. Un fragmento 5' de 571 pb se aisló, secuenció y encontró que es idéntica al cADN en todos los nucleótidos del 49 al 188. pBE65 se usó después como un punto de iniciación en la generación de construcciones de pBE65 sentido y antisentido incluyendo pBE68 y pBE97 descritas después. En el momento en que se hicieron estas construcciones y se introdujeron en el maíz, una segunda secuencia SBEI llegó a ser disponible (Fisher et al (1995) Plant Physiol. 108:1313-1314). El término 5' de 165 pb de pBE65 mostró poca concordancia con esta secuencia como se hizo con la secuencia anterior de SBEI. Como resultado de experimentos subsecuentes, se concluye ahora que pBE65 contiene un segmento terminal 5' de 165 pb que no está relacionado a SBEI pero que presumiblemente surgió como un artefacto durante la clonación de cADN de maíz. Esta región es seguida por 2607 pb de cADN SBEI que codifica 42 aminoácidos del péptido transitorio SBEI, los 760 aminoácidos de la proteína madura SBEI y contiene 194 pb del ADN sin trasladar 3'. El plásmido pBE65 ha sido depositado bajo los términos del Tratado de Budapest en ATCC (American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852), y tiene el siguiente número de acceso: .

Preparación de Vectores de Expresión aue Codifican Construcciones Antisentido de SBEI Dado que no se conocía que porciones de la secuencia de cADN serían mas efectivas para intervenir en la supresión de SBEI, se hicieron tres construcciones que tenían diferentes fragmentos de SBEI en orientación antisentido. El gen quimérico del plásmido pBE68 (Figura 9) contiene un fragmento 3' del cADN de SBEI en orientación antisentido con respecto al promotor zein de 27 kD de maíz que se localiza 5' al fragmento SBEI, y el extremo 3' zein de 10 kD que se localiza 3' al fragmento SBEI. El fragmento SBEI de 373 pb esta construcción (SEC ID NO: 13) se obtuvo por PCR del pBE65 usando el par de cebadores oligonucleótidos BE43 (SEC ID NO: 14) y BE52 (SEC ID NO: 15) : BE43 5 ' -GAATTCCCGGGCCGAACTCGTTCAAAG-3 ' (SEC ID NO: 14) BE52 5 ' -GAATTCCATGGCGGTGATGAGACACCAGTC-3 ' (SEC ID NO: 15) El gen quimérico de pBE69 (Figura 10) es análogo al de pBE68 excepto que el fragmento SBEI consiste de una porción 5' del cADN de SBEI. El fragmento de 571 pb de esta construcción (SEC ID NO: 16) se obtuvo por amplificación de pBE65 usando el par de cebadores BE46 (SEC ID NO: 17) y BE50 (SEC ID NO: 18) : BE46 5 ' -GAATTCCATGGCCATCTTATGGTTTGCACC-3 ' (SEC ID NO: 17) BE50 5 ' -GAATTCCCGGGCATAGCATAGATATGACGGC-3 ' (SEC ID NO: 18) Los sitios de clonación (Ncol y Smal) se incorporaron en los oligonucleótidos anteriores para proporcionar la orientación antisentido de los fragmentos de ADN cuando se insertaron en el vector pML103 descrito en el Ejemplo 1. La amplificación se realizó en un volumen de 100 mi en una mezcla de reacción PCR estándar como se definió en el Ejemplo 1. Las reacciones se llevaron a cabo en un Perkin-Elmer Cetus Thermocycler™ para 30 ciclos que comprenden 1 minuto a 95°C, 2 minutos a 55°C y 3 minutos a 72°C, con una extensión final de 7 minutos a 72°C después del último ciclo. Los ADNs amplificados se digirieron con enzimas de restricción Ncol y Smal y se fraccionaron en un gel de agarosa 0.7% de bajo punto de fusión en Tris-acetato 40 mM, pH 8.5, EDTA lmM. Las bandas apropiadas se cortaron del gel, se fundieron a 68°C y cada una se combinó con el fragmento Ncol-Smal de 4.9 kb del plásmido pML103 (Figura 3) descrito en el Ejemplo 1. El vector y los ADNs insertados se ligaron a 15°C durante la noche, esencialmente como describe Maniatis. El gen quimérico del pBE72 construido (Figura 11) consiste de un fragmento SBEI de 2.49 kb en orientación antisentido con respecto al extremo 3' del zein de 10 kD que se localiza 3' al fragmento SBEI. El fragmento SBEI de pBE72 (SEC ID NO: 19) se obtuvo por medio de digestión con enzima de restricción de pBE65 con EcoRI y HindIII seguido por reacción con el fragmento de Klenow de ADN polimerasa de E. coli. El fragmento de extremo despuntado se ligó al fragmento Ncol-Smal de 49 kb tratado con Klenow de pML103 esencialmente como se describe en Maniatis .

Los ADNs ligados se usaron para transformar E. coli XL1-Blue (Epicurian Coli XL-1 Blue™; Stratagene) . Las transformantes bacterianas se cribaron inicialmente por medio de digestión con enzima de restricción del ADN del plásmido. Para las Transformantes pBE68 y pBE69, la presencia de la inserción se detectó por digestión combinada con Ncol y Smal. Para las transformantes de pBE72, la digestión del ADN con Salí se usó para confirmar la presencia del ADN insertado y para determinar la orientación del fragmento de SBEI relativo al promotor zein de 27 kD. Las transformantes identificadas se caracterizaron además mediante análisis de la secuencia nucleótida limitada usando el método de terminación de cadena didesoxi (Sequenase™ DNA Sequencmg Kit; U.S. Biochemical ) .

El gen quimérico de pBE72 se introdujo subsecuentemente en el vector pKS17, descrito en el Ejemplo 4. El fragmento de ADN zein de 27 kD-SBEI-zein de 10 kD de pBE72 se liberó por digestión parcial con BamHI y se clonó en el sitio BamHI de pKSl7 para dar un equivalente resistente a higromicina de pBE72 denominado pBE108 (Figura 12).

Transformación de Maíz con las Construcciones Antisentido de 5BEI En experimentos separados, cada construcción antisentido se introdujo en tejido de maíz embriogénico por el método de bombardeo de partícula esencialmente como se describe en el Ejemplo 1. Siete días después del bombardeo el tejido se transfirió a medio N6 que contenía glufosinato (2 mg por litro) y carecía de caseína o prolina. El tejido continuó creciendo lentamente en este medio. Después de 2 semanas adicionales, el tejido se transfirió a medio N6 fresco que contenía glufosinato. Después de 6 semanas, áreas de aproximadamente 1 cm de diámetro de callos creciendo activamente se identificaron en algunas de las placas que contenían el medio suplementado con glufosinato. Estos callos continuaron creciendo cuando se subcultivaron en el medio selectivo .

Las plantas se regeneraron a partir del callo transgénico transfiriendo primero racimos de tejido a medio N6 suplementado con 0.2 mg por litro de 2,4-D. Después de dos semanas el tejido se transfirió al medio de regeneración (Fromm et al. (1990) Bio/Technology 8:833-839). Nueve lineas de plantas transgénicas se regeneraron de los experimentos de bombardeo de partículas realizado con el ADN del pBE68 construido, 20 líneas transgénicas se regeneraron de los experimentos de bombardeo de partículas realizado con el ADN del pBE69 construido y nueve líneas de plantas transgénicas se regeneraron de los experimentos de bombardeo de partículas realizado con el ADN del pBE72 construido.

Análisis Molecular de Plantas Transgénicas de Maíz que Contienen la Construcción Antisentido de SBEI El ADN total se aisló de tejido de hoja de plantas transgénicas esencialmente como se describe en el Ejemplo 1. Para análisis Southern blot de las transformantes de pBE68, pBE69 y pBE72, 10 mg de ADN aislado se digirió con la enzima de restricción Xbal a 37°C durante 6 hr en el amortiguador suplementado por el fabricante. Los ADNs restringidos se sometieron a electroforesis a 40 volts toda la noche en un gel de agarosa al 0.8% en amortiguador Tris-fosfato-EDTA (Maniatis) y se transfirieron a membranas Immobilon™. Las manchas se prehibridizaron, se hibridizaron con nick trasladando la inserción pBE65, y se lavaron como se describe en el Ejemplo 1.

El ARN total se aisló de los granos desarrollados (20-22 DAP) de plantas transgénicas y se prepararon Northern blots como se describe en el Ejemplo 1. Las manchas se prepararon con nick trasladando el ADN insertado de pBE65 y se lavaron subsecuentemente de acuerdo al régimen descrito en el Ejemplo 1.

De las 9 lineas de plantas transgénicas que se regeneraron de los bombardeos de partículas con el pBE68 construido, 5 se identificaron por análisis Southern blot por contener el gen característico. El análisis Northern blot demostró niveles variables de mARN de SBEI de 2.7 kb en 4 de las líneas positivas al Southern. Además, 2 de estas líneas contenían una transcripción de 400 bases que corresponde presumiblemente al ARN antisentido especificado por el gen quimérico de pBE68. De las 20 líneas de plantas transgénicas que se generaron de los bombardeos con pBE69, 8 se encontró que contenían ADN de pBE69. El ARN aislado de dos de las líneas de plantas transgénicas mostraron la presencia de la transcripción antisentido de 600 bases. De las 9 líneas de plantas transgénicas pBE72 disponibles, 6 se encontró por análisis Southern blot ser positivas para la presencia del gen tratado.

Análisis de Almidón de Plantas de Maíz Transformadas que Contienen las Construcciones Antisentido 3' y 5' Los almidones de granos individuales de plantas transformadas con pBE68 (la construcción antisentido 3* de SBE1 de maíz) y pBE69 (la construcción antisentido 5' de SBE1 de maiz) se extrajeron usando el procedimiento descrito en el Ejemplo 1. Como se conoce por los expertos en el arte, el fenómeno antisentido en general no se observa en cada linea transgénica individual. Por lo tanto, los granos individuales de lineas múltiples se examinaron y se esperó, algunas, pero no todas las lineas poseyeran granos que demuestran un fenotipo de almidón alterado. La digestión de almidón se modificó ligeramente de ejemplos previos como sigue. 7,0 mg de cada muestra de almidón se adicionó a un tubo de ensayo de tapón roscado con 1.1 mL de agua. Los tubos se calentaron a 120°C durante 30 minutos y se colocó entonces en un baño de agua a 45°C. La solución desramificada se hizo diluyendo 50 µL de isoamilasa (5xl06 unidades/mL, Sigma) por mL de amortiguador de acetato de sodio (50 mM, pH 4.5). Cuarenta pL de solución desramificante se adicionó a cada muestra de almidón y se incubó durante 3 h a 45°C. Las reacciones se pararon calentando a 110°C durante 5 minutos. Las muestras de almidón desramificado se liofilizaron y disolvieron en DMSO para análisis por cromatografía de permeación en gel (GPC) . Cien L de almidón desramificado se inyectó y corrió a través de 2 columnas (Polymer Labs, Mixed Bed-C) ) en serie a 100°C y se eluyó con DMSO a una velocidad de flujo de 1.0 mL/min. El intervalo de muestreo fue de 25 minutos. Un detector de índice de refracción (Waters) se usó con una computadora de corrida Chemstation Software (versión A.02.05, Hewlett Packard) para detección y colección y almacenamiento de resultados, respectivamente. Los tiempos de retención de estándares abundantes (380K, 100K, 23.7K, 5.8 , 728 y 180 mw) se usaron para definir los rangos de peso molecular para las muestras de almidón desramificado. La proporción del almidón total se determinó para 24 rangos del grado de polimerización (DP) extendiendo las porciones de amilosa y amilopectina del cromatograma. Para fines de comparación para los resultados reportados anteriormente el porcentaje de área en rangos apropiados de DP se sumaron para dar valores de las cadenas A y Bl, cadenas B2, B3 y B4+ de la porción amilopectina del cromatograma. La porción del área total anterior DP 150 se usó para determinar el contenido de amilosa.

El almidón se preparó de doce granos R4 individuales de una línea (XAY01414) positiva para la construcción pBE69, se desramificó y analizó como se describió anteriormente y se comparó a doce granos individuales de maíz sin transformar. Las Tablas 6 y 7 muestran el error promedio y estándar para la linea XAY01414 y el control sin transformar.

Tabla 6. El Porcentaje del Área Cromatográfica Total en Grados Dados de Polimerización (DP) Rangos de Almidón Derivado de Granos R4 que Contiene la Transcripción Antisentido 5' de SBEI de maíz (XAY01414) y Almidón de Molienda Normal (control) . Se proporcionan promedios de 12 semillas individuales y errores estándar de la media (SE) .

Almidón de Molienda XAY01414 Ranero de DP Promedio SE Promedio SE >5k 5.45 0.14 5.92 0.14 3-5k 2.62 0.05 2.58 0.04 1.8-3k 3.03 0.04 2.95 0.08 1.2-1.8k 2.49 0.05 2.66 0.03 0.9-1.2k 1.92 0.04 2.01 0.04 600-900 2.86 0.03 2.94 0.06 400-600 2.78 0.05 3.07 0.04 250-400 2.83 0.05 3.23 0.04 150-250 2.43 0.04 2.97 0.05 90-150 2.38 0.04 3.61 0.06 60-90 4.04 0.08 5.72 0.15 48-60 4.08 0.07 4.94 0.10 40-48 3.95 0.09 4.86 0.04 32-40 4.52 0.13 5.59 0.14 28-32 3.45 0.12 3.58 0.17 24-28 3.69 0.17 4.40 0.08 21-24 4.72 0.18 4.06 0.18 18-21 6.01 0.03 5.64 0.23 -18 8.42 0.05 6.17 0.16 13-15 7.24 0.21 5.92 0.28 11-15 6.64 0.17 5.33 0.15 9-11 6.20 0.08 4.71 0.13 7-9 4.48 0.06 3.58 0.09 -7 3.67 0.07 3.44 0.06 Tabla 7. Porcentaje de la Diferencia de la Distribución de Cadena Ramificada de Amilopectina (expresado como A+Bl, B2, B3 y B4+) y Contenido de Amilosa (% de Almidón Total) de Almidón Aislado de Granos R4 que Contienen la Transcripción Antisentido 5' de SBEI (XAY01414) de maíz Comparado con el Control (Molido) . Se indica rango de DP A+Bl (5- B2 (15-32) B3 (32-60) B4+ (60- Amilosa 15J. . (>15Q) 83.5 93.1 126.0 149.4 107.3 La transformante tiene alteraciones en las fracciones de amilosa y amilopectina del almidón. El contenido total de amilosa se incrementa algo en la línea XAY01414. La estructura de amilopectina también está alterada en que las cadenas mas grandes (B3 y B4 + ) se aumentan en relación al control molido y las cadenas mas cortas son menos abundantes que en el almidón molido.

El almidón se preparó de doce granos R4 individuales de una línea (XAY00013) positiva para la construcción pBE68 y se analizó como se describió anteriormente. Las Tablas 8 y 9 muestran los resultados de este análisis.

Tabla 8. El Porcentaje del Área Cromatográfica Total en Grados Dados de Polimerización (DP) Rangos de Almidón Derivado de Granos R4 que Contiene la Transcripción Antisentido 3* de SBEI de maíz (XAY00013) y Almidón de Molienda (control) . Se proporcionan promedios de 12 semillas individuales y errores estándar de la media (SE) .

Almidón de Molienda XAY00013 Ranao de DP Promedio =E Promedio SE >5k 5.45 0.14 6.13 0.39 3-5k 2.62 0.05 2.46 0.06 1.8-3k 3.03 0.04 2.92 0.05 1.2-1.8k 2.49 0.05 2.51 0.06 0.9-1.2k 1.92 0.04 2.02 0.04 600-900 2.86 0.03 2.93 0.05 400-600 2.78 0.05 3.02 0.06 250-400 2.83 0.05 3.19 0.05 150-250 2.43 0.04 2.83 0.06 90-150 2.38 0.04 3.15 0.07 60-90 4.04 0.08 5.33 0.10 48-60 4.08 0.07 4.77 0.13 40-48 3.95 0.09 4.73 0.16 32-40 4.52 0.13 5.62 0.18 28-32 3.45 0.12 3.99 0.16 24-28 3.69 0.17 3.97 0.19 21-24 4.72 0.18 4.67 0.18 18-21 6.01 0.03 5.40 0.12 -18 8.42 0.05 6.64 0.16 13-15 7.24 0.21 5.73 0.22 11-15 6.64 0.17 5.23 0.11 9-11 6.20 0.08 5.27 0.10 7-9 4.48 0.06 4.08 0.09 -7 3.67 0.07 3.31 0.10 Tabla 9. Porcentaje de la Diferencia de la Distribución de Cadena Ramificada de Amilopecti a (expresado como A+Bl, B2, B3 y B4+) y Contenido de Amilosa (% de Almidón Total) de Almidón Aislado de Granos R4 que Contienen la Transcripción Antisentido 3' de SBEI (XAY00013) de maíz Comparado con el Control (Molido) . Se indica rango de DP A+Bl (5- B2 (15-32) B3 (32-60) B4+ (60- Amilosa 15) 150) O150) 85.6 95.9 123.1 135.1 107.0 Como la linea XAY01414, la línea transformada con la construcción pBE68 tiene alteraciones en las fracciones de amilosa y amilopectina del almidón. El contenido de amilosa aumentó con respecto al control y las cadenas mas grandes (B4+ y B3) aumentaron en amilopectina. La mayoría del aumento en el contenido de amilosa se debió a un aumento de amilosa de DP mayor de 500.

Las plantas transgénicas actuales demuestran así un patrón único de ramificación ie almidón comparado a las plantas control. Estos resultados indican que la alteración de la actividad de la enzima ramificante de almidón de maíz suprimiendo la expresión de los genes correspondientes que codifican las enzimas ramificantes de almidón resulta en un fenotipo de almidón alterado.

EJEMPLO 6 Preparación de Maíz Transaénico aue Expresa Transcripciones Sentido de la Enzima Ramificante de Almidón de Maíz I Preparación del Vector de Expresión aue Codifica la Construcción Sentido de Longitud Casi Completa El plásmido pBE97 contiene un fragmento de 1.87 kb del cADN de SBEI (SEC ID NO: 20) unido en orientación sentido al promotor zein de 27 kD y el extremo 3' zein de 10 kD (Figura 13) . El fragmento SBEI abarca de los nucleótidos 55 hasta 1919 del clon de cADN de pBE65 y contiene así 117 pb de secuencia desconocida precedente a los restantes 1748 pb de la región codificante SBEI. Este fragmento de ADN se generó por medio de mutagénesis especifica de sitio por medio de PCR para introducir un sitio Ncol en el nucleótido de posición 53 de la secuencia pBE65. Los cebadores de nucleótido apropiados se combinaron con el molde pBE65 de ADN en una reacción PCR estándar definida en el Ejemplo 1. El fragmento PCR que se generó contiene un sitio Clal seguido por un sitio Ncol y termina en el nucleótido 612 de la secuencia pBE65. Este fragmento de ADN se digirió con Clal y PstI y se cambió con la región correspondiente en pBE65 para dar pBE79. pBE79 se digirió con BstEII y se hizo el extremo despuntado por reacción con el fragmento' Klenow de ADN polimerasa (Maniatis) . El fragmento de ADN se liberó por digestión con Ncol, fraccionando por medio de electroforesis en un gel de agarosa de bajo punto de fusión, y se ligó al fragmento Ncol-Smal de pML103 descrito en el Ejemplo 1. Las transformantes en E. coli XLl-Blue se cribaron para la presencia del fragmento SBEI por medio de digestión con enzima de restricción Ncol y BamHI. De este análisis, se identificó pBE88. pBE88 se sometió a digestión parcial con BamHI y el fragmento de 3.87 kb que contenia el gen quimérico zein de 27 kD - SBEI truncado - zein de 10 kD se aisló por electroforesis en un gel de agarosa de bajo punto de fusión de 0.7% (Maniatis). El fragmento de ADN se clonó en el vector pKS17 digerido con BamHI descrito en el Ejemplo 4. El plásmido resultante que contiene la inserción zein de 27 kD -SBEI truncado - zein de 10 kD en pKS17 se denomina pBE97.

Se hicieron dos construcciones sentido adicional de SBEI de maíz: pBEHO y pBElll. Los fragmentos sentido de longitud completa y truncado de estas construcciones se generaron por remoción de las secuencias 5' artificiales de pBE65 y se reemplazaron com las secuencias terminal 5' correctas de la región codificante de SBEI. Para generar una construcción sentido de longitud completa, el plásmido pBE79 descrito arriba se modificó para incorporar un sitio de restricción Smal después de nt 2674 de la secuencia insertada de pBE65. Para realizar esto, un fragmento 3' de 805 pb de cADN de SBEI se obtuvo por PCR usando el par de oligonucleótidos BE15 (SEC ID NO: 11) y BE67 (SEC ID NO: 21): BE15 5 ' -AAGCTTGAATTCCTTGGAGGTGATGGCTAC-3 ' (SEC ID NO: 11) BE67 51 -CGCGGATCCCGGGTTCCAAGGGCGCCAGCGG-3 ' (SEC ID NO: 21) y pBE65 como molde de ADN en una mezcla de reacción PCR estándar como se define en el Ejemplo 1. El producto PCR se digirió con las enzimas de restricción BstEII y Smal y el producto de digestión se clonó en pBE79 digerido con BstEII y Smal para dar pBE83. El fragmento de la región codificante SBEI se subclonó en el vector pCC6 en dos etapas: primero como un fragmento Ncol-Smal que representa el extremo 3' y después como un fragmento Ncol que representa el extremo 5' del fragmento de la región codificante. El vector pCC6 contiene un fragmento promotor EcoRI-NcoI de 924 pb del gen zein de 10 kD de maíz seguido por un fragmento Ncol-Smal de 453 pb que porta la región codificante zein de lOkD y un segmento 3' de 944 pb del gen zein de 10 kD en el vector de clonación pTZ18R (Pharmacia). El derivado pCC6 que contiene el fragmento SBEI de Ncol-Smal se denominó pBE85. pBE85 se sometió a digestión parcial con PvuII y el fragmento zein de 10 kD - SBEI - zein de 10 kD de 4.7 kb se insertó en pKS17 digerido con PvuII (Ejemplo 4). La construcción resultante designada pBE98, contiene 110 pb de secuencia no identificada en el extremo 5' del segmento de cADN de SBEI. La secuencia 5' correcta del cADN de SBEI se obtuvo por PCR usando los oligonucleótidos BE101 (SEC ID NO: 22) y BB3 (SEC ID NO: 23): BE101 5 ' -AACTGCAGAAGGATCCCATGGTGTGCCTCGTGTCGCCC-3 * (SEC ID NO: 22) bb3 5 ' -GGATGCTTAAATGTGTACC-3 * (SEC ID NO: 23) y ADN lambda preparado de lizados de placa de una biblioteca de cADN de endosperma de maíz 19 DAP (Stratagene) como molde. El producto PCR de 748 pb se digirió con Ncol y SstI para dar un fragmento de 673 pb. Este segmento de ADN se cambió con la región correspondiente en pBE98 para dar pBEHO. El pBEHO construido es de 7203 pb de longitud y consiste de un segmento de 2565 pb de cADN de SBEI (SEC ID NO: 24) que incluye los 823 aminoácidos completos de la región codificante de SBEI y 96 pb de ADN sin trasladar 3' (Figura 14) . El fragmento de ADN de SBEI está precedido por la región promotora del gen zein de 10 kD del maíz y está seguido por el extremo 3' del gen zein de 10 kD del maiz.

El pBElll construido de SBEI sentido truncado se generó ensamblando un fragmento de la región codificante de SBEI acortado en el vector pBC24. pBC24 es un derivado pSK+ en el que el sitio Xbal ha sido despuntado por reacción con el fragmento Klenow de ADN polimerasa y ligado a enlazadores Ncol. pBC24 carece asi del sitio Xbal y contiene un sitio único Ncol en la región polienlace. El fragmento SBEI 5' descrito anteriormente se digirió con las enzimas de restricción Ncol y BamHI y el fragmento de 694 pb se clonó en pBC24 digerido con NcoI-BamHI. Este intermedio se digirió entonces con BamHI y Smal y se ligó al fragmento BamHI-Smal de 1874 pb de pBE83 para obtener pBE112. pBE112 se digirió con BstEII, reaccionó con Klenow y se sometió después a digestión parcial con Ncol. El fragmento liberado de 1809 pb se clonó en pBT752 digerido con Ncol-parcial Smal. El vector, pBT752 es un derivado de pKS17 descrito en el Ejemplo 4 que contiene un gen quimérico zein ie 27 kD - zein de alto azufre del maiz - zein de 10 kD y carece jel sitio Ncol en el sitio de inicio translacional je i gen de higromicina fosfotransferasa . La digestión analítica de las transformantes resultantes en células NovaBlue (Novagen) reveló que el extremo 3' de zein de 10 kD se retiró como un fragmento Smal durante el procedimiento de clonación. Este segmento Smal de 963 pb se aisló asi de pBT752 y se insertó en un sitio HindIII despuntado que se localiza justo corriente abajo de la unión BstEII/Smal en el plásmido intermedio, pBE110.5. Las transformantes se cribaron por digestión con Dral para determinar la orientación del fragmento de extremo 3' relativo al gen quimérico de SBEI. De este análisis, se identificó pBElll. pBElll contiene un fragmento del cADN de SBEI (SEC ID NO: 25) que está precedido por el promotor de zein de 27 kD y está seguido por el extremo 3' de zein de 10 kD (Figura 15).

EJEMPLO 7 Uso de Maíz Transaénico aue Expresa Transcripciones Antisentido de la Enzima Ramificante de Almidón de Maíz Ilb en Combinación con la Mutante axy Una línea de maíz que porta la transcripción antisentido 3' de la enzima ramificante de almidón de maíz Ilb (pBE44) se cruzó con la mutante de almidón de maíz bien caracterizada waxy (wx). Los homozigos segregantes individuales para la mutación waxy se identificaron en la progenie de esta cruza. Se seleccionaron granos de la linea XAY00096 (homozigo wx) que porta la construcción antisentido 3'. El almidón se extrajo de estos granos y se sometió a análisis de empastado en Rapid Visco Analyzer como se describe en el Ejemplo 1. Waxy {wx) y el homozigo doble mutante, extensor de amilosa waxy [ae wx) , se muestran para fines comparativos. Una funcionalidad única se observó para la linea XAY00096 en la Figura 16. Como puede verse de la Figura 16, las propiedades de empastado del almidón XAY00096 aumentó la temperatura de empastado comparado a waxy, pero fue menor que el homozigo ae wx. La viscosidad fue mucho mayor que la de ae wx y se mantuvo aún después de enfriar, a diferencia de wx que perdió viscosidad durante el empastado. Este nuevo almidón dirigió asi a propiedades de empastado únicas que son distintas que las observadas en waxy sola, en la mutación nula de SBEIIb (ae) en la combinación de estas dos imitantes (ae wx) , o en la linea transgénica sola. La presente invención demuestra asi la capacidad para producir almidón con funcionalidad única combinando lineas transgénicas con mutantes de almidón conocidas .

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el convencional para la manufactura de los objetos a que la misma se refiere.

Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes.

LISTADO DE SECUENCIAS INFORMACIÓN GENERAL: (i) SOLICITANTE: (A) NOMBRE: E. I. DU PONT DE NEMOURS AND COMPANY (B) CALLE: 1007 MARKET STREET (C) CIUDAD: WILMINGTON (D) ESTADO: DELAWARE (E) PAÍS: UNITED STATES OF AMERICA (F) CÓDIGO POSTAL (ZIP): 19898 (G) TELÉFONO: 302-992-4927 (H) TELEFAX: 302-773-0164 (I) TELEX: 6717325 (ii) TÍTULO DE LA INVENCIÓN: NUEVOS ALMIDONES POR VÍA DE LA MODIFICACIÓN DE LA EXPRESIÓN DE GENES EN LA ENZIMA BIOSINTÉTICA DE ALMIDÓN (iii) NÚMERO DE SECUENCIAS: 25 (iv) FORMA DE LECTURA DE COMPUTADORA: (A) TIPO DE MEDIO: Disco flexible 3.5 INCH (B) COMPUTADORA: IBM PC compatible (C) SISTEMA DE OPERACIÓN: WINDOWS 3.1 (D) PAQUETERÍA: MICROSOFT WORD 6.0A (v) DATOS DE SOLICITUD ACTUAL: (A) NÚMERO DE SOLICITUD: (B) FECHA DE PUBLICACIÓN: (C) CLASIFICACIÓN: (vi) DATOS DE SOLICITUD ANTERIOR: (A) NUMERO DE SOLICITUD: 06/009,113 (B) FECHA DE PUBLICACIÓN: DICIEMBRE 20, 1995 (vii) INFORMACIÓN ABOGADO/MANDATARIO: (A) NOMBRE: BRUCE W. MORRISSEY (B) NÚMERO DE REGISTRO: 30,663 (C) NÚMERO DE REFERENCIA/LISTA: BB-1066 INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 2665 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: Sencilla (D) TOPOLOGÍA: Lineal TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (ix) CARACTERISTICA: (A) NOMBRE/CLAVE : CDS (B) LOCALIZACIÓN: 79..2476 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO ACCCGGATTT CGCTCTTGCG GTCGCTGGGG TTTTAGCATT GGCTGATCAG TTCGATCCGA TCCGGCTGCG AAGGCGAG ATG GCG TTC CGG GTT TCT GGG GCG GTG CTC GGT Met Ala Phe Arg Val Ser Gly Ala Val Leu Gly 1 5 10 GGG GCC GTA AGG GCT CCC CGA CTC ACC GGC GGC Gly Ala Val Arg Ala Pro Arg Leu Thr Gly Gly 15 20 GGG GAG GGT AGT CTA GTC TTC CGG CAC ACC GGC Gly Glu Gly Ser Leu Val Phe Arg His Thr Gly 30 CTC TTC TTA ACT CGG GGT GCT CGA GTT GGA TGT 210 Leu Phe Leu Thr Arg Gly Ala Arg Val Gly Cys 35 40 TCG GGG ACG CAC GGG GCC ATG CGC GCG GCG GCC 243 Ser Gly Thr His Gly Ala Met Arg Ala Ala Ala 45 50 55 GCG GCC AGG AAG GCG GTC ATG GTT CCT GAG GGC 276 Ala Ala Arg Lys Ala Val Met Val Pro Glu Gly 60 65 GAG AAT GAT GGC CTC GCA TCA AGG GCT GAC TCG 309 Glu Asn Asp Gly Leu Ala Ser Arg Ala Asp Ser 70 75 GCT CAA TTC CAG TCG GAT GAA CTG GAG GTA CCA Ala Gln Phe Gln Ser Asp Glu Leu Glu Val Pro 80 85 GAC ATT TCT GAA GAG ACA ACG TGC GGT GCT GGT 375 Asp lie Ser Glu Glu Thr Thr Cys Gly Ala Gly 90 95 GTC GCT GAT GCT CAA GCC TTG AAC AGA GTT CGA Val Ala Asp Ala Gln Ala Leu Asn Arg Val Arg 100 105 110 GTG GTC CCC CCA CCA AGC GAT GGA CAA AAA ATA 441 Val Val Pro Pro Pro Ser Asp Gly Gln Lys lie 115 120 TTC CAG ATT GAC CCC ATG TTG CAA GGC TAT AAG Phe Gln lie Asp Pro Met Leu Gln Gly Tyr Lys 125 130 TAC CAT CTT GAG TAT CGG TAC AGC CTC TAT AGA Tyr His Leu Glu Tyr Arg Tyr Ser Leu Tyr Arg 135 140 AGA ATC CGT TCA GAC ATT GAT GAA CAT GAA GGA Arg lie Arg Ser Asp lie Asp Glu His Glu Gly 145 150 GGC TTG GAA GCC TTC TCC CGT AGT TAT GAG AAG 573 Gly Leu Glu Ala Phe Ser Arg Ser Tyr Glu Lys 155 160 165 TTT GGA TTT AAT GGC AGC GCG GAA GGT ATC ACA 606 Phe Gly Phe Asn Ala Ser Ala Glu Gly lie Thr 170 175 TAT CGA GAA TGG GCT CCT GGA -3CA TTT TCT GCA 639 Tyr Arg Glu Trp Ala Pro Gly Ala Phe Ser Ala 180 185 GCA TTG GTG GGT GAC TTC AGG AGG TGG GAT CCA 672 Ala Leu Val Gly Asp Phe Asn Asn Trp Asp Pro 190 195 AAT GCA GAT CGT ATG AGC AAA AAT GAG TTT GGT Asn Ala Asp Arg Met Ser Lys Asn Glu Phe Gly 200 205 GTT TGG GAA ATT TTT CTG CCT AAC AAT GCA GAT 738 Val Trp Glu lie Phe Leu Pro Asn Asn Ala Asp 210 215 220 GGT ACA TCA CCT ATT CCT CAT GGA TCT CGT GTA Gly Trh Ser Pro lie Pro His Gly Ser Arg Val 225 230 AAG GTG AGA ATG GAT ACT CCA TCA GGG ATA AAG Lys Val Arg Met Asp Thr Pro Ser Gly lie Lys 235 240 GAT TCA ATT CCA GCC TGG ATC AAG TAC TCA GTG Asp Ser lie Pro Ala Trp lie Lys Tyr Ser Val 245 250 CAG GCC CCA GGA GAA ATA CCA TAT GAT GGG ATT 870 Gln Ala Pro Gly Glu lie Pro Tyr Asp Gly lie 255 260 TAT TAT GAT CCT CCT GAA GAG GTA AAG TAT GTG 903 Tyr Tyr Asp Pro Pro Glu Glu Val Lys Tyr Val 265 270 275 TTC AGG CAT GCG CAA CCT AAA CGA CCA AAA TCA 936 Phe Arg His Ala Gln Pro Lys Arg Pro Lys Ser 280 285 TTG CGG ATA TAT GAA ACA CAT GTC GGA ATG AGT 969 Leu Arg lie Tyr Glu Thr His Val Gly Met Ser 290 295 AGC CCG GAA CCG AAG ATA AAC ACA TAT GTA AAC 1002 Ser Pro Glu Pro Lys lie Asn Thr Tyr Val Asn 300 305 TTT AGG GAT GAA GTC CTC CCA AGA ATA AAA AAA 1035 Phe Arg Asp Glu Val Leu Pro Arg lie Lys Lys 310 315 CTT GGA TAC AAT GCA GTG CAA ATA ATG GCA ATC 1068 Leu Gly Tyr Asn Ala Val Gln lie Met Ala lie 320 325 330 CAA GAG CAC TCA TAT TAT GGA AGC TTT GGA TAC 1101 Gln Glu His Ser Tyr Tyr Gly Ser Phe Gly Tyr 335 340 CAT GTA ACT AAT TTT TTT GCG CCA AGT AGT CGT 1134 His Val Thr Asn Phe Phe Ala Pro Ser Ser Arg 345 350 TTT GGT ACC CCA GAA GAT TTG AAG TCT TTG ATT 1167 Phe Gly Thr Pro Glu Asp Leu Lys Ser Leu lie 355 360 GAT AGA GCA CAT GAG CTT GGT TTG CTA GTT CTC 1200 Asp Arg Ala His Glu Leu Gly Leu Leu Val Leu 365 370 ATG GAT GTG GTT GAT AGT CAT GCG TCA AGT AAT 1233 Met Asp Val Val His Ser His Ala Ser Ser Asn 375 380 385 ACT CTG GAT GGG TTG AAT GGT TTT GAT GGT ACA 1266 Thr Leu Asp Gly Leu Asn Gly Phe Asp Gly Thr 390 395 GAT ACA CAT TAC TTT CAC AGT GGT CCA CGT GGC 1299 Asp Thr His Tyr Phe His Ser Gly Pro Arg Gly 400 405 CAT CAC TGG ATG TGG GAT TCT CGC CTA TTT AAC 1332 His His Trp Met Trp Asp Ser Arg Leu Phe Asn 410 415 TAT GGG AAC TGG GAA GTT TTA AGA TTT CTT CTC 1365 Tyr Gly Asn Trp Glu Val Leu Arg Phe Leu Leu 420 425 TCC AAT GCT AGA TGG TGG CTC GAG GAA TAT AAG Ser Asn Ala Arg Trp Trp Leu Glu Glu Tyr Lys 430 435 440 TTT GAT GGT TTC CGT TTT GAT GGT GTG ACC TCC 1431 Phe Asp Gly Phe Arg Phe Asp Gly Val Thr Ser 445 450 ATG ATG TAC ACT CAC CAC GGA TTA CCA GTA ACA 1464 Met Met Tyr Thr His His Gly Leu Gln Val Thr 455 460 TTT ACG GGG AAC TTC AAT GAG TAT TTT GGG TTT 1497 Phe Thr Gly Asn Phe Asn Glu Tyr Phe Gly Phe 465 470 GCC ACC GAT GTA GAT GCA GTG GTT TAC TTG ATG 1530 Ala Thr Asp Val Asp Ala Val Val Tyr Leu Met 475 480 CTG GTA AAT GAT CTA ATT CAT GGA CTT TAT CCT 1563 Leu Val Asn Asp Leu lie His Gly Leu Tyr Pro 485 490 495 GAG GCT GTA ACC ATT GGT GAA GAT GTT AGT GGA 1596 Glu Ala Val Thr lie Gly Glu Asp Val Ser Gly 500 505 ATG CCT ACA TTT GCC CTT CCT GTT CAC GAT GGT 1629 Met Pro Thr Phe Ala Leu Pro Val His Asp Gly 510 515 GGG GTA GGT TTT GAC TAT CGG ATG CAT ATG GCT 1662 Gly Val Gly Phe Asp Tyr Arg Met His Met Ala 520 525 GTG GCT GAC AAA TGG ATT GAC CTT CTC AAG CAA Val Ala Asp Lys Trp lie Asp Leu Leu Lys Gln 530 535 AGT GAT GAA ACT TGG AAG ATG GGT GAT ATT GTG 1728 Ser Asp Glu Thr Trp Lys Met Gly Asp lie Val 540 545 550 CAC ACA CTG ACA AAT AGG AGG TGG TTA GAG AAG 1761 His Thr Leu Thr Asn Arg Arg Trp Leu Glu Lys 555 560 TGT GTA ACT TAT GCT GAA AGT "CAT GAT CAA GCA 1794 Cys Val Thr Tyr Ala Glu Ser His Asp Gln Ala 565 570 TTA GTC GGC GAC AAG ACT ATT GCG TTT TGG TTG 1827 Leu Val Gly Asp Lys Thr lie Ala Phe Trp Leu 575 580 ATG GAC AAG GAT ATG TAT GAT TTC ATG GCC CTC 1860 Met Asp Lys Asp Met Tyr Asp Phe Met Ala Leu 585 590 GAT AGA CCT TCA ACT CCT ACC ATT GAT CGT GGG 1893 Asp Arg Pro Ser Thr Pro Thr lie Asp Arg Gly 595 600 605 ATA GCA TTA CAT AAG ATG ATT AGA CTT ATC ACA 1926 lie Ala Leu His Lys Met lie Arg Leu lie Thr 610 615 ATG GGT TTA GGA GGA GAG GGC TAT CTT AAT TTC 1959 Met Gly Leu Gly Gly Glu Gly Tyr Leu Asn Phe 620 625 ATG GGA AAT GAG TTT GGA CAT CCT GAA TGG ATA 1992 Met Gly Asn Glu Phe Gly His Pro Glu Trp lie 630 635 GAT TTT CCA AGA GGT CCG CAA AGA CTT CCA AGT Asp Phe Pro Arg Gly Pro Gln Arg Leu Pro Ser 640 645 GGT AAG TTT ATT CCA GGG AAT AAC AAC AGT TAT 2058 Gly Lys Phe lie Pro Gly Asn Asn Asn Ser Tyr 650 655 660 GAC AAA TGT CGT CGA AGA TTT GAC CTG GGT GAT 2091 Asp Lys Cys Arg Arg Arg Phe Asp Leu Gly Asp 565 670 GCA GAC TAT CTT AGG TAT CAT GGT ATG CAA GAG Ala Asp Tyr Leu Arg Tyr His Gly Met Gln Glu 675 680 TTT GAT CGA GCA ATG CAA CAT CTT GAG CAA AAA Phe Asp Gln Ala Met Gln His Leu Glu Gln Lys 685 690 TAT GAA TTC A G ACA TCT GAT CAC CAG TAT ATT Tyr Glu Phe Met Thr Ser Asp His Gln Tyr lie 695 700 TCC CGG AAA CAT GAG GAG GAT AAG GTG ATT GTG Ser Arg Lys His Glu Glu Asp Lys Val lie Val 705 710 715 TTC GAA AAG GGA GAT TTG GTA TTT GTG TTC AAC Phe Glu Lys Gly Asp Leu Va i Phe Val Phe Asn 720 725 TTC CAC TGC AAC AAC AGC TAT TTT GAC TAC CGT 2289 Phe His Cys Asn Asn Ser Tyr Phe Asp Tyr Arg 730 735 ATT GGT TGT CGA AAG CCT GGG GTG TAT AAG GTG 2322 lie Gly Cys Arg Lys Pro Gly Val Tyr Lys Val 740 745 GTC TTG GAC TCC GAC GCT GGA CTA TTT GGT GGA 2355 Val Leu Asp Ser Asp Ala Gly Leu Phe Gly Gly 750 755 TTT AGC AGG ATC CAT CAC GCA GCC GAG CAC TTC Phe Ser Arg lie His His Ala Ala Glu His Phe 760 765 770 ACC GCC GAC TGT TCG CAT GAT AAT AGG CCA TAT 2421 Thr Ala Asp Cys Ser His Asp Asn Arg Pro Tyr 775 780 TCA TCC TCG GTT TAT ACA CCA AGC AGA ACA TGT 2454 Ser Ser Ser Val Tyr Thr Pro Ser Arg Thr Cys 785 790 GTC GTC TAT CGT CCA GTG GAG T GATAGCGGGG Val Val Tyr Ala Pro Val Glu 795 TACTCGTTGC TGCGCGGCAT GTGTGGGGCT GTCGATGTGA 2526 GGAAAAACCT TCTTCCAAAA CCGGCAGATG CATGCATGCA 2566 TGCTACAATA AGGTTCTGAT ACTTTAATCG ATGCTGGAAA 2606 GCCCATGCAT CTCGCTGCGT TGTCCTCTCT ATATATATAA 2646 GACCTTCAAG GTGTCAATT 2665 (2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 414 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: Sencilla (D) TOPOLOGÍA: Lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 2: GACACCTTGA AGGTCTTATA TATATAGAGA GGACAACGCA 40 GCGAGATGCA TGGGCTTTCC AGCATCGATT AAAGTATCAG 80 AACCTTATTC TAGCATGCAT GCATGCATCT GCCGGTTTTG 120 GAAGAAGGTT TTTCCTCACA TCGACAGCCC CACACATGCC 160 GCGCAGCAAC GAGTACCCCG CTATCACTCC ACTGGAGCAT 200 AGACGACACA TGTTCTGCTT GGTGTATAAA CCGAGGATGA 240 ATATGGCCTA TTATCATGCG AACAGTCGGC GGTGAAGTGC 280 TCGGCTGCGT GATGGATCCT GCTAAATCCA CCAAATAGTC 320 CAGCGTCGGA GTCCAAGACC ACCTTATACA CCCCAGGCTT 360 TCGACAACCA ATACGGTAGT CAAAATAGCT GTTGTTGCAG 400 TGGAAGTTGA ACAC 414 (2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 3: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 29 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: Sencilla (D) TOPOLOGÍA: Lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 3: GAATTCCCGG GGTGTTCAAC TTCCACTGC 29 (2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 4: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 28 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: Sencilla (D) TOPOLOGÍA: Lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 4: GAATTCCATG GGACACCTTG AAGGTCTT INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 5: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 502 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: Sencilla (D) TOPOLOGÍA: Lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO TCTATAGAGG CTGTACCGAT ACTCAAGATG GTACTTATAG CCTTGCAACA TGGGGTCAAT CTGGAATATT TTTTGTCCAT CGCTTGGTGG GGGGACCACT CGAACTCTGT TCAAGGCTTG AGCATCAGCC ACACCAGCAC CGCACGTTGT CTCTTCAGAA ATGTCTGGTA CCTCCAGTTC ATCCGACTGG AATTGAGCCG AGTCAGCCCT TGATGCGAGG CCATCATTCT CGCCCTCAGG 240 AACCATGACC GCCTTCCTGG CCGCGGCCGC CGCGCGCATG 280 GCCCCGTGCG TCCCCGAACA TCCAACTCGA GCACCCCGAG 320 TTAAGAAGAG GCCGGTGTGC CGGAAGACTA GACTACCCTC 360 CCCGCCGCCG GTGAGTCGGG GAGCCCTTAC GGCCCCACCG 400 AGCACCGCCC CAGAAACCCG GAACGCCATC TCGCCTTCGC 440 AGCCGGATCG GATCGAACTG ATCAGCCAAT GCTAAAACCC 480 CAGCGACCGC AAGAGCGAAA TCCGGGT 507 INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 6: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 28 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: Sencilla (D) TOPOLOGÍA: Lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 6: GAATTCCCGG GACCCGGATT TCGCTCTT 28 (2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 7: "i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 29 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: Sencilla (D) TOPOLOGÍA: Lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 7: GAATTCCATG GTCTATAGAG GCTGTACCG 29 (2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 8: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 2165 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: Sencilla (D) TOPOLOGÍA: Lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genóraico) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO AATTCATATT TTTGCTCAAG ATGTTGCATT GCCTGATCAA ACTCTTGCAT ACCATGATAC CTAAGATAGT CTGCATCACC CAGGTCAAAT CTTCGACGAC ATTTGTCATA ACTGTTGTTA TTCCCTGGAA TAAACTTACC ACTTGGAAGT CTTTGCGGAC CTCTTGGAAA ATCTATCCAT TCAGGATGTC CAAACTCATT TCCCATGAAA TTAAGATAGC CCTCTCCTCC TAAACCCATT GTGATAAGTC TAATCATCTT ATGTAATGCT ATCCCACGAT CAATGGTAGG AGTTGAAGGT CTATCGAGGG CCATGAAATC ATACATATCC TTGTCCATCA ACCAAAACGC AATAGTCTTG 360 TCGCCGACTA ATGCTTGATC ATGACTTTCA ACATAAGTTA 400 CACACTTCTC TAACCACCTC CTATTTGTCA GTGTGTGCAC 440 AATATCACCC ATCTTCCAAG TTTCATCACT TTGCTTGAGA 480 AGGTCAATCC ATTTGTCAGC CACAGCCATA TGCATCCGAT 520 AGTCAAAACC TACCCCACCA TGGTGAACAG GAAGGGCAAA 560 TGTAGGCATT CCACTAACAT CTTCACCAAT GGTTACAGCC 600 TCAGGATAAA CTCCATGAAT TAGATCATTT ACCAGCATCA 640 AGTAAACCAC TGCATCTACA TCGGTGGCAA AGCCAAAATA 680 CTTATTGAAG TTCCCCGTAA ATGTTACTTG TAATCCGTGG 720 TGAGTGTACA TCATGGAGGT CACACCATCA AAACGGAAAC 760 CATCAAACTT ATATTCCTCG AGCCACCATC TAGCATTGGA 800 GAGAAGAAAT CTTAAAACTT CCCAGTTCCC ATAGTTAAAT 840 AGGCGAGAAT CCCACATCCA 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TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: Sencilla (D) TOPOLOGÍA: Lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 14: GAATTCCCGG GCCGAATCG TTCAAAG 27 (2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 15: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 30 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: Sencilla (D) TOPOLOGÍA: Lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 15: GAATTCCATG GCGGTGATGA GACACCAGTC (2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 16: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 571 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: Sencilla (D) TOPOLOGÍA: Lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cADN (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 16: CCATCTTATG GTTTGCACCA TTCCAGTCAT TGAAGTCACC 40 AATAAGCTCT GCCTCCTGCG CAGCAGGTCT CCATTCACGA 80 TATACAGTTC CATCCTCATT TGTATTAATC CCAAATTTCA 120 AATAGCCTTT AGAAAAAGAT TCAAGACCTT CCCTCATTTT 160 CTTCAATTGA TCCTTTCTGC TCTAGGAATC TTTTCATCCG 200 GTACCTGAAA TGGTCCTTGA ATATCTCCAG 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PCR" (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 18: GAATTCCCGG GCATAGCATA GATATGACGG C 31 (2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 19 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 2487 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: Sencilla (D) TOPOLOGÍA: Lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cADN (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 19: AGCTTTGACG TCGATGCTCT CTGCTGGAGA CGTCTTTCCT 40 GTCTCTCGTT TCGCGTGAAG ACGTCGTCCA GCCCCTGCTT 80 CGTCTACACG GTAATAAGCC ACACAGGTGC GGGGCGGAGA 120 AAGGACTTTG AACGAGTTCG GCCGGTTGTT GAAGTTCGTT 160 TCGGGCACCC CTGGCACCCC TTCAGGCGAC GTGAAGTGAT 200 CCACGTCGTG GCCAACTCTT CCATGTCCAC CGAAGACCAG 240 AGCATCAGAG TCCAGGGCTA CTCTGTATTT CCCAGGCAAA 280 TCGCATCCCA CTTTGTAGCC CTCGTAAGTT TTCTTGGGAT 320 GGAAATTGAA AACAAAAACT AAATCTCCAC GTTCAAAGAC 360 AATAACCTTT TCCTCATCGT TCATGTCGCT GACGATCTGC 400 TTTGACGACG AAAGGAAGGA AAATCTCTCA TCGAGCGCAT 440 TCATCGCTTG GTCAAACGCA TTCATGTACT TGTACCGCAA 480 GTGATCAGTG TCCACAAGGC TCCACTGTCG TCTGCATTTA 520 TCATAGCTCC AGTTGTTCCC TTCTCTTGGA AAGTCAATCC 560 ATTCTGGGTG ACCAAACTCA TTTCCCATAA AATTCAAGTA 600 GCCATCACCT CCAAGGGCCA TTGTGATGAA GTGAATCATC 640 TTTTGGAGTG CAATCCCTCG ATCAATTGTA GGTGAAGCAG 680 GCTGCAAGTC TGACATGCCA GTGTACATTT CCTTGTCCAT 720 CAGGAGAAAT GCAATAGTTT TGTCGCCAAC AATAGACTGA 760 TCATGGCTCT CAGCATATGC GATGCATTTT TCAGTATATC 800 TCCTGTTAGT CAAAGTATGC GCTATTTCAC CCATCGACCA 840 CTCAGAGTCA TCTTTATTCT TCAGGTAGTC AATCCATCTA 880 TCAGGGATAG CCATTGCCAG GCGATAGTCA AACCCAACCC 920 CACCTTCATC AACTGGCCGG CAAAGGACCG GCATGCCTGA 960 AACATCTTCA GCAACAACGA TTGCTTCTGG CAAGAGTTTG 1000 TGCATTAAAT GGTTTGCAAG CATCATGTAA ACAACTGCAT 1040 CCACAGCTGT GTCCAAACTG AAATATTCCT GGTAGTTTCC 1080 AGTAAACCCC ACATTGATAC CATGGTGATG ATACAGCATT 1120 GATGTAACTC CATCAAATCG GAAGCCATCA AACATGAATT 1160 CATCCAACCA ATATCTCAGG TTAGAAAGAA GAAACCTTAA 1200 TACCTCCCAG TTAGCATAGT TGAACAGCCG ACTATCCCAA 1240 AGTTTATGAT AACCTCTATC TCCCGCATGA AAATAGGACT 1280 CTTGGGTGCT TTGTCCAACA TCATAGCCAT TTAAACCATC 1320 TGTGACATTA TTACTTGCAT GGCTATGGAC AACATCCATC 1360 AGAACTCGCA 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GACCCCAAGC TGGAGATATT CAAGGACCAT TTCAGGTACC 360 GGATGAAAAG ATTCCTAGAG CAGAAAGGAT CAATTGAAGA 400 AAATGAGGGA AGTCTTGAAT CTTTTTCTAA AGGCTATTTG 440 AAATTTGGGA TTAATACAAA TGAGGATGGA ACTGTATATC 480 GTGAATGGGC ACCTGCTGCG CAGGAGGCAG AGCTTATTGG 520 TGACTTCAAT GACTGGAATG GTGCAAACCA TAAGATGGAG 560 AAGGATAAAT TTGGTGTTTG GTCGATCAAA ATTGACCATG 600 TCAAAGGGAA ACCTGCCATC CCTCACAATT CCAAGGTTAA 640 ATTTCGCTTT CTACATGGTG GAGTATGGGT TGATCGTATT 680 CCAGCATTGA TTCGTTATGC GACTGTTGAT GCCTCTAAAT 720 TTGGAGCTCC CTATGATGGT GTTCATTGGG ATCCTCCTGC 760 TTCTGAAAGG TACACATTTA AGCATCCTCG GCCTTCAAAG 800 CCTGCTGCTC CACGTATCTA TGAAGCCCAT GTAGGTATGA 840 GTGGTGAAAA GCCAGCAGTA AGCACATATA GGGAATTTGC 880 AGACAATGTG TTGCCACGCA TACGAGCAAA TAACTACAAC 920 ACAGTTCAGT TGATGGCAGT TATGGAGCAT TCGTACTATG 960 CTTCTTTCGG GTACCATGTG ACAAATTTCT TTGCGGTTAG 1000 CAGCAGATCA GGCACACCAG AGGACCTCAA ATATCTTGTT 1040 GATAAGGCAC ACAGTTTGGG TTTGCGAGTT CGTATGGATG 1080 TTGTCCATAG CCATGCAAGT AATAATGTCA CAGATGGTTT 1120 AAATGGCTAT GATGTTGGAC AAAGCACCCA 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(C) HEBRA: Sencilla (D) TOPOLOGÍA: Lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = "cebador de PCR" (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 21 CGCGGATCCC GGGTTCCAAG GGCGCCAGCG G 31 (2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 22: CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 38 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: Sencilla (D) TOPOLOGÍA: Lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = "cebador de PCR" (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 22: AACTGCAGAA GGATCCCATG GTGTGCCTCG TGTCGCCC 38 (2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 23: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 19 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: Sencilla (D) TOPOLOGÍA: Lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = "cebador de PCR (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: GGATGCTTAA ATGTGTACC (2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 24: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 2565 pares de bases (B) TIPO: 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TTTAAGCATC CTCGGCCTTC AAAGCCTGCT GCTCCACGTA 760 TCTATGAAGC CCATGTAGGT ATGAGTGGTG AAAAGCCAGC 800 AGTAAGCACA TATAGGGAAT TTGCAGACAA TGTGTTGCCA 840 CGCATACGAG CAAATAACTA CAACACAGTT CAGTTGATGG 880 CAGTTATGGA GCATTCGTAC TATGCTTCTT TCGGGTACCA 920 TGTGACAAAT TTCTTTGCGG AAAGCAGCAG ATCAGGCACA 960 CCAGAGGACC TCAAATATCT TGTTGATAAG GCACACAGTT 1000 TGGGTTTGCG AGTTCTGATG GATGTTGTCC ATAGCCATGC 1040 AAGTAATAAT GTCACAGATG GTTTAAATGG CTATGATGTT 1080 GGACAAAGCA CCCAAGAGTG CTATTTTCAT GCGGGAGATA 1120 GAGGTTATCA TAAACTTTGG GATAGTCGGC TGTTCAACTA 11 60 TGCTAACTGG GAGGTATTAA GGTTTCTTCT TTCTAACCTG 1200 AGATATTGGT TGGATGAATT CATGTTTGAT GGCTTCCGAT 1240 TTGATGGAGT TACATCAATG CTGTATCATC ACCATGGTAT 1280 CAATGTGGGG TTTACTGGAA ACTACCAGGA ATATTTCAGT 1 320 TTQ3ACACAG CTGTGGATGC AGTTGTTTAC ATGATGCTTG 1360 CAAACCATTT AATGCACAAA CTCTTGCCAG AAGCAACTGT 1400 TGTTGCTGAA GATGTTTCAG GCATGCCGGT CCTTTGCCGG 1 4 0 CCAGTTGATG AAGGTGGGGT TGGGTTTGAC TATCGCCTGG 1 4 80 CAATGGCTAT CCCTGATAGA TGGATTGACT ACCTGAAGAA 1520 TAAAGATGAC TCTGAGTGGT CGATGGGTGA AATAGCGCAT 1560 ACTTTGACTA ACAGGAGATA TACTGAAAAA TGCATCGCAT 1600 ATGCTGAGAG CCATGATCAG TCTATTGTTG GCGACAAAAC 1 64 0 TATTGCATTT CTCCTGATGG ACAAGGAAAT GTACACTGGC 1680 ATGTCAGACT TGCAGCCTGC TTCACCTACA ATTGATCGAG 1720 GGATTGCACT CCAAAAGATG ATTCACTTCA TCACAATGGC 1760 CCTTGGAGGT GATGGCTACT TGAATTTTAT GGGAAATGAG 1800 TTTGGTCACC CAGAATGGAT TGACTTTCCA AGAGAAGGGA 1840 ACAACTGGAG CTATGATAAA TGCAGACGAC AGTGGAGCCT 1880 TGTGGACACT GATCACTTGC GGTACAAGTA CATGAATGCG 1920 TTTGACCAAG CGATGAATGC GCTCGATGAG AGATTTTCCT 1960 TCCTTTCGTC GTCAAAGCAG ATCGTCAGCG ACATGAACGA 2000 TGAGGAAAAG GTTATTGTCT TTGAACGTGG AGATTTAGTT 2040 TTTGTTTTCA ATTTCCATCC CAAGAAAACT TACGAGGGCT 2080 ACAAAGTGGG ATGCGATTTG CCTGGGAAAT ACAGAGTAGC 2120 CCTGGACTCT GATGCTCTGG TCTTCGGTGG ACATGGAAGA 2160 GTTGGCCACG ACGTGGATCA CTTCACGTCG CCTGAAGGGG 2200 TGCCAGGGGT GCCCGAAACG AACTTCAACA ACCGGCCGAA 2240 CTCGTTCAAA GTCCTTTCTC CGCCCCGCAC CTGTGTGGCT 2280 TATTACCGTG TAGACGAAGC AGGGGCTGGA CGACGTCTTC 2320 ACGCGAAACG AGAGACAGGA AAGACGTCTC 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CAAATGAGGA TGGAACTGTA TATCGTTAAT GGGCACCTGC 440 TGCGCAGGAG GCAGAGCTTA TTGGTGACTT CAATGACTGG 480 AATGGTGCAA ACCATAAGAT GGAGAAGGAT AAATTTGGTG 520 TTTGGTCGAT CAAAATTGAC CATGTCAAAG GGAAACCTGC 560 CATCCCTCAC AATTCCAAGG TTAAATTTCG CTTTCTACAT 600 GGTGGAGTAT GGGTTGATCG TATTCCAGCA TTGATTCGTT 64 0 ATGCGACTGT TGATGCCTCT AAATTTGGAG CTCCCTATGA 680 TGGTGTTCAT TGGGATCCTC CTGCTTCTGA AAGGTACACA 720 TTTAAGCATC CTCGGCCTTC AAAGCCTGCT GCTCCACGTA 760 TCTATGAAGC CCATGTAGGT ATGAGTGGTG AAAAGCCAGC 800 AGTAAGCACA TATAGGGAAT TTGCAGACAA TGTGTTGCCA 840 CGCATACGAG CAAATAACTA CAACACAGTT CAGTTGATGG 880 CAGTTATGGA GCATTCGTAC TATGCTTCTT TCGGGTACCA 920 TGTGACAAAT TTCTTTGCGG TTAGCAGCAG ATCAGGCACA 960 CCAGAGGACC TCAAATATCT TGTTGATAAG GCACACAGTT 1000 TCGGTTTGCG AGTTCTGATG GATGTTGTCC ATAGCCATGC 1040 AAGTAATAAT GTCACAGATG GTTTAAATGG CTATGATGTT 1080 GGACAAAGCA CCCAAGAGTC CTATTTTCAT GCGGGAGATA 1120 GAGGTTATCA TAAACTTTGG GATAGTCGGC TGTTCAACTA 1160 TGCTAACTGG GAGGTATTAA GGTTTCTTCT TTCTAACCTG 1200 AGATATTGGT TGGATGAATT CATGTTTGAT 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Claims (21)

1. Un método para controlar la estructura fina del almidón derivado del grano de maíz, caracterizado porque comprende : (a) preparar un gen quimérico que contiene un fragmento de ácido nucleico que codifica un gen estructural de la enzima ramificante de almidón o un fragmento del mismo, unido operablemente en orientación sentido o antisentido en el lado corriente arriba para un fragmento de ácido nucleico que codifica un promotor que dirige la expresión del gen en tejido de endosperma de maiz, y unido operablemente del lado corriente abajo para un fragmento de ácido nucleico que codifica una secuencia reguladora adecuada para la terminación transcripcional, (b) transformación de maiz con el gen quimérico del paso (a), en donde la expresión de dicho gen quimérico resulta en la alteración de la estructura fina de almidón derivado del grano de dicho maiz transformado comparado a la estructura fina del almidón derivado de maíz que no posee dicho gen quimérico.

2. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque dicha alteración de la estructura fina de almidón comprende la alteración de la distribución de la cadena ramificada del componente molecular amilopectina de dicho almidón.

3. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque dicha alteración de la estructura fina de almidón comprende la alteración de la relación del componente molecular amilosa al componente molecular amilopectina de dicho almidón.

4. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque dicha alteración de la estructura fina de almidón comprende la alteración del grado de polimerización del componente molecular amilosa de dicho almidón.

5. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque dicha alteración de la estructura fina de almidón comprende la alteración de ia distribución de la cadena ramificada del componente molecular amilopectina y la alteración de la relación del componente molecular amilosa al componente molecular amilopectina de dicho almidón.

6. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque dicha alteración de la estructura fina de almidón comprende la alteración de la distribución de la cadena ramificada del componente molecular amilopectina y la alteración del grado de polimerización del componente molecular amilosa de dicho almidón.

7. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque dicha alteración de la estructura fina de almidón comprende la alteración de la relación del componente molecular amilosa al componente molecular amilopectina y la alteración del grado de polimerización del componente molecular amilosa de dicho almidón.

8. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque dicha alteración de la estructura fina de almidón comprende la alteración de la distribución de la cadena ramificada del componente molecular amilopectina y la alteración del grado de polimerización del componente molecular amilosa, la alteración de la relación del componente molecular amilosa al componente molecular amilopectina, y la alteración del grado de polimerización del componente molecular amilosa de dicho almidón.

9. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque el fragmento de ácido nucleico que codifica el gen estructural de la enzima ramificante de almidón o fragmento del mismo es derivado del maíz.

10. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque el fragmento de ácido nucleico que codifica el gen estructural de la enzima ramificante de almidón o fragmento del mismo codifica toda o una porción de la enzima SBEIIb del maíz .

11. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque el fragmento de ácido nucleico que codifica el gen estructural de la enzima ramificante de almidón o fragmento del mismo codifica toda o una porción de la enzima SBEI del maíz .

12. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque el fragmento de ácido nucleico que codifica el gen estructural de la enzima ramificante de almidón o fragmento del mismo se une operablemente en orientación antisentido relativo a un fragmento de ácido nucleico que codifica un promotor que dirige la expresión del gen en tejido de endosperma de maíz del lado corriente arriba, y a un fragmento de ácido nucleico que codifica una secuencia reguladora adecuada para la terminación transcripcional del lado corriente abajo.

13. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque el fragmento de ácido nucleico que codifica el gen estructural de la enzima ramificante de almidón o fragmento del mismo se une operablemente en orientación sentido relativo a un fragmento de ácido nucleico que codifica un promotor que dirige la expresión del gen en tejido de endosperma de maíz del lado corriente arriba, y a un fragmento de ácido nucleico que codifica una secuencia reguladora adecuada para la terminación transcripcional del lado corriente abajo.

14. Una variedad de maíz preparada por el método de la reivindicación 1, o cualquier progenie de la misma.

15. La variedad de maíz de la reivindicación 14, caracterizada porque la relación del componente molecular amilosa al componente molecular amilopectina del almidón aislado del grano de dicha variedad de maíz se aumenta comparada a la relación del componente molecular amilosa al componente molecular amilopectina del almidón aislado del grano de maíz sin transformar.

16. La variedad de maíz de la reivindicación 14, caracterizada porque el componente molecular amilopectina del almidón aislado del grano de dicha variedad de maíz contiene una proporción mayor de cadenas de glucano de enlace a-1,4 mas grandes y una menor proporción de cadenas de glucano de enlace a-1,4 mas cortas comparada al componente molecular amilopectina del almidón aislado del grano de maíz sin transformar.

17. La variedad de maíz de la reivindicación 16, caracterizada porque el componente amilopectina del almidón aislado del grano de dicha variedad de maíz tiene una proporción mayor de cadenas B3 y B4+ comparada a la distribución de la cadena ramificada del componente molecular amilopectina del almidón aislado del grano de maíz sin transformar.

18. Almidón aislado del grano de una variedad de maíz preparada por el método de la reivindicación 1 o cualquier progenie de la misma.

19. Un método para preparar un producto alimenticio espesado, caracterizado porque comprende la combinación de un producto alimenticio, agua y una cantidad efectiva de un 189 almidón de la reivindicación 18 y cocer la composición resultante cuanto sea necesario para producir dicho producto alimenticio espesado.

20. Una variedad de maíz transformada con un gen quimérico, caracterizada porque comprende un fragmento de ácido nucleico que codifica el gen estructural de la enzima ramificante de almidón o fragmento del mismo, unido operablemente en orientación sentido o antisentido del lado corriente arriba a un fragmento de ácido nucleico que codifica un promotor que dirige la expresión del gen en tejido de endosperma de maíz, y unido operablemente del lado corriente abajo a un fragmento de ácido nucleico que codifica una secuencia reguladora adecuada para la terminación transcripcional, o cualquier progenie de la misma.

21. Un método para controlar la distribución de la cadena ramificada del componente molecular amilopectina del almidón de maíz, caracterizado porque comprende: preparar un gen quimérico que contiene un fragmento de ácido nucleico que codifica un gen estructural ie la enzima ramificante de almidón o un fragmento del mismo, unido operablemente en orientación sentido o antisentido en el lado corriente arriba para un fragmento de ácido nucleico que codifica un promotor que dirige la expresión del gen en tejido de endosperma de maíz, y unido operablemente del lado corriente abajo para un fragmento de ácido nucleico que codifica una secuencia reguladora adecuada para la terminación transcripcional, transformación de maiz con el gen quimérico del paso (a), en donde la expresión de dicho gen quimérico resulta en la alteración de la distribución de la cadena ramificada del componente molecular amilopectina de almidón derivado del grano de dicho maiz transformado comparado a la distribución de la cadena ramificada del componente molecular amilopectina del almidón derivado de maiz que no posee dicho gen quimérico. 191 DB IA INVENCIÓN La presente invención expone la utilización de un clon de cADN para construir genes para inhibición de la actividad enzimática de la enzima ramificante de almidón en maíz. Mas específicamente, esta invención se refiere a un método de controlar la estructura fina de almidón del almidón derivado del grano de maíz que comprende: (1) preparar un gen quimérico que contiene un fragmento de ácido nucleico que codifica un gen estructural de la enzima ramificante de almidón o un fragmento del mismo, unido operablemente en orientación sentido o antisentido en el lado corriente arriba para un fragmento de ácido nucleico que codifica un promotor que dirige la expresión del gen en tejido de endosperma de maíz, y unido operablemente del lado corriente abajo para un fragmento de ácido nucleico que codifica una secuencia reguladora adecuada para la terminación transcripcional, y (2) transformación de maíz con dicho gen quimérico, en donde la expresión de dicho gen quimérico resulta en la alteración de la estructura fina de almidón derivado del grano de dicho maíz transformado comparado a la estructura fina del almidón derivado de maíz que no posee dicho gen quimérico.