MXPA98003314A

MXPA98003314A - Factor de liberacion de colecistoquinina luminal

Info

Publication number: MXPA98003314A
Application number: MXPA/A/1998/003314A
Authority: MX
Inventors: Gary M Green; Rodger A Liddle; Joseph R Reeve Jr; Ellen B Kraig
Original assignee: Board Of Regents The University Of Texas System; Duke University
Priority date: 1995-10-26
Filing date: 1998-04-27
Publication date: 2000-12-06

Abstract

El factor de liberación de colecistoquinina luminal (FLCL) es una proteína liberadora de colecistoquinina (CCK) aislada de la secreción intestinal de rata. El factor de liberación de colecistoquinina luminal purificado se caracterizópor el peso molecular, la secuencia de aminoácidos parcial, y la actividad liberadora de colecistoquinina, como se muestra en estudios en vivo de anticuerpos anti-factor de liberación de colecistoquinina luminal, en el bloqueo del efecto liberador de colecistoquinina del factor de liberación de colecistoquinina luminal. Los estudios de fijación demostraron la localización en el duodeno, en el páncreas, y en las fibras nerviosas a través de todo el páncreas, en las fibras sensoriales y en los cuerpos celulares de los ganglios nudosos, asícomo en las fibras nerviosas simpáticas de la médula adrenal. El factor de liberación de colecistiquinina luminal parece ser un neuropéptido presente en los sistemas nerviosos entérico, parasimpático, y simpático, pero no en el cerebro. La inmunorreactividad del factor de liberación de colecistiquinina luminal también estápresente en los enterocitos de las puntas de las vellosidades del intestino delgado. Tomados juntos, los estudios indican que el factor de liberación de colecistoquinina luminal es un neuropéptido que puede tener varias funciones en los sistemas gastrointestinales y en otros sistemas. Los estudios de inmunoafinidad que utilizan anticuerpos criados para el factor de liberación de colecistoquinina luminal 1-6 sintético, y los estudios de infusión del lumen del intestino delgado, indicando que el factor de liberación de colecistoquinina luminal puede ser el péptido liberador de colecistoquinina presente en la secreción intestinal que media la regulación de retroalimentación negativa de la secreción de enzima pancreática y de liberación de colecistoquinina. El factor de liberación de colecistoquinina luminal y las especies funcionalmente relacionadas, tienen potencial de desarrollo para el tratamiento de la secreción de insulina, el vaciado gástrico y de la vesícula biliar, y de regímenes que requieran de control o supresión de apetito.

Description

FACTOR DE LIBERACIÓN DE COLECISTOQUININA LUMINAL 1.0 ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN 1.1 Campo de la Invención La invención se refiere en general al campo de biología molecular, y más particularmente a polipéptidos novedosos y composiciones que comprenden péptidos de liberación de colecistoquinina (FLCL) novedosos, y los genes que codifican los péptidos. En ciertas modalidades, la invención se refiere al uso de factor de liberación de colecistoquinina luminal y a secuencias de ácido nucleico que codifican los péptidos para producir el estímulo de una respuesta inmune, para la supresión del apetito, la inhibición del vaciado gástrico, y para estimular la secreción de insulina. 1.2 Descripción de la Técnica Relacionada La colecistoquinina (CCK) es una hormona de péptido localizada en células separadas del intestino delgado superior, y secretada hacia la sangre en respuesta a la alimentación. La colecistoquinina tiene un papel central en la regulación fisiológica de la contracción de la vesícula biliar y de la secreción pancreática, y modula el vaciado gástrico, la movilidad intestinal, y el apetito (Liddle, 1989) . Debido al papel central de la colecistoquinina en la digestión, los mecanismos que regulan la liberación de colecistoquinina desde células endocrinas discretas en el intestino delgado proximal, ha sido objeto de una investigación considerable, revisada por Liddle (1995) . Un gran cuerpo de evidencia indica que la colecistoquinina es un agente de saciedad natural en animales y seres humanos. Parte de la sensación agradable de "lleno" después de un alimento, denominada "saciedad", está claramente relacionada con un incremento en la liberación de colecistoquinina, y se ha demostrado que se presenta en muchos experimentos con seres humanos y animales. Desafortunadamente, la colecistoquinina actúa adentro de los órganos internos y de los nervios para ocasionar estos efectos, y por consiguiente, la colecistoquinina se debe administrar de una manera intravenosa o intramuscular, o posiblemente mediante administración intranasal. Más aún, la colecistoquinina no es efectiva oralmente, ya que está sujeta a los procesos digestivos, y en segundo lugar, todavía tendría que ser absorbida intacta desde el tracto intestinal, un asunto complicado, inclusive cuando sobreviviera a los procesos 120 digestivos. Las proteínas dietéticas o las digestiones de proteína fracasan para estimular la liberación de colecistoquinina desde las células mucosas intestinales aisladas, y se ha sugerido que se necesitan otros factores para la regulación de la secreción de colecistoquinina * (Sharara y colaboradores, 1993) . En ratas conscientes y en el hombre, la liberación de colecistoquinina y la secreción exócrina pancreática, son inhibidas por tripsina, quimiotripsina, o elastasa en el intestino delgado proximal. Esto ha conducido a la noción de que la liberación de colecistoquinina puede ser mediada por un mecanismo sensible a la proteasa (Folsh y colaboradores, 1987; Slaff y # colaboradores, 1984; Owyang y colaboradores, 1986). Basándose en el potente estímulo de la liberación de colecistoquinina mediante la desviación del jugo pancreático y de la bilis desde el intestino delgado, Miyasa a y Green (1983) propusieron que un factor intestinal sensible a la tripsina, intraluminal ente secretado, mediante esta respuesta. Esta sustancia podría actuar como un importante regulador de 1J5 retroalimentación de la secreción de la enzima pancreática mediante el estímulo de la liberación de colecistoquinina cuando la actividad de la proteasa libre intestinal (no complejada o no inhibida) sea baja, pero se haria inactiva a medida que se elevara la actividad de proteasa libre intestinal (Green y colaboradores, 1972). Subsecuentemente, los investigadores obtuvieron una evidencia para un factor activo en los lavados intestinales que estimulaban la liberación de colecistoquinina y la secreción de la enzima pancreática en ratas conscientes (Miyasaka y colaboradores, 1989) y en ratas anestesiadas (Lu y colaboradores) .

La colecistoquinina se produce en las células endocrinas discretas del intestino delgado proximal, y se libera hacia la corriente sanguínea en seguida de un alimento. Las grasas, proteínas, y hasta un menor grado los carbohidratos ingeridos, estimulan la liberación de colecistoquinina (Marx y colaboradores; Fried y colaboradores) , pero se desconocen los mecanismos subyacentes a la actividad liberadora de colecistoquinina de estos compuestos . 0 Los estudios en ratas han demostrado que la 1 desviación de las secreciones biliares-pancreáticas alejándose del intestino delgado, o la infusión de inhibidores de tripsina o de proteína intacta en el intestino delgado, estimula fuertemente la secreción de enzima pancreática, y 5 este fenómeno se denomina "regulación de retroalimentación de secreción de enzima pancreática" (Green y colaboradores, 1972; Green y colaboradores, 1973) . Estos y los estudios posteriores muestran que la secreción de enzima pancreática y la 1 liberación de colecistoquinina en ratas y en seres humanos, es 0 inhibida por tripsina, quimiotripsina, y elastasa en el i intestino delgado proximal (Schneeman y colaboradores; Green y colaboradores, 1985; Louie y colaboradores; Folsch y t colaboradores; Slaff y colaboradores; Owyang y colaboradores, 1986) . 5 La hipótesis de que la regulación de #. retroalimentación dependiente de proteasa de la secreción de enzima pancreática es mediada por un péptido endógeno intestinal intraluminal ente secretado, fue estropeada por los reportes anteriores de que aparecían péptidos gastrointestinales en el lumen del intestino en cantidades significativas (Uvnas-Wallensten; Lake-Bakaar y colaboradores; Chang y colaboradores) . El origen de los péptidos luminales % era controversial. Algunos investigadores reportaron que el intestino liberaba los péptidos circulantes mediante su secreción hacia el lumen (Jordán y colaboradores; Ayalon y colaboradores) . Por otra parte, Uvnas-Wallensten argumentaba que la fuente inmediata de péptidos gastrointestinales luminales era la célula endocrina del intestino correspondiente (Uvnas-Wallensten) , que se describió que se secretaba de una manera bidireccional, es decir, hacia el lumen y hacia la circulación por medio de difusión desde el fluido intersticial adyacente a las partes básales y laterales de la superficie celular endocrina. Se propuso que la regulación de retroalimentación de ' 20 la liberación de colecistoquinina manifestada por los inhibidores de proteasa dietéticos o por la proteína intacta (pero no por la desviación del jugo pancreático) era mediada por un péptido liberador de colecistoquinina , un péptido monitor (I ai y colaboradores; Fushiki y colaboradores) que se ha purificado a partir del jugo pancreático. El péptido # monitor, también conocido como inhibidor de tripsina secretora pancreática-61 (PSTI-61) aparentemente no está presente en la secreción intestinal (Guan y colaboradores) . Sin embargo, se han aislado dos péptidos con similitud o identidad de secuencia con el péptido monitor a partir de intestino de cerdo, aunque no se sabe si estos péptidos estimulan la liberación de colecistoquinina, o son secretados # intraluminalmente (Agerbeth y colaboradores 1991; Agerbeth y colaboradores, 1989). 10 Adicionalmente, Owyang y colaboradores (Owyang y '• colaboradores, 1990; Herzing y colaboradores, 1995) han i descrito la purificación de un péptido liberador de colecistoquinina a partir de mucosa intestinal porcina que estimula la liberación de colecistoquinina cuando se introduce en el intestino de la rata. Este péptido se ha identificado como idéntico al péptido previamente reportado inhibidor de la fijación de diazepam (IFD) . 2.0 Sumario de la Invención ; La presente invención busca resolver estos y otros inconvenientes inherentes en la técnica anterior, al proporcionar composiciones de polipéptido liberador de colecistoquinina purificada, y métodos para el tratamiento de diferentes condiciones relacionadas con la falta de, o la regulación insuficiente de, la liberación de colecistoquinina.

La invención se refiere en particular al compuesto de tipo de # hormona de polipéptido novedoso, el factor de liberación de colecistoquinina luminal (FLCL) , que se purificó a partir de secreciones intestinales de rata. Los estudios de inmunoafinidad que utilizan anticuerpos criados para el factor de liberación de colecistoquinina luminal sintético, indican que el producto de polipéptido aislado y caracterizado es un péptido liberador de colecistoquinina presente en la secreción % intestinal. Las propiedades del péptido indican que media la "regulación de retroalimentación negativa" de la secreción de enzima pancreática y la liberación de colecistoquinina. El factor de liberación de colecistoquinina luminal representa uno de una nueva clase de péptidos reguladores que son secretados intraluminalmente en el intestino, y sirven para una importante función fisiológica en la regulación de las funciones metabólicas que dependen del estímulo de colecistoquinina . » 2.1 Polipéptidos Liberadores de Colecistoquinina Novedosos En un aspecto importante, por consiguiente, la ¡ presente invención se refiere al descubrimiento de un polipéptido liberador de colecistoquinina novedoso aislado a partir de las secreciones intestinales luminales. El nuevo péptido difiere de otros factores de liberación de colecistoquinina conocidos. La secuencia del péptido parcial (SEQ ID NO:l) tiene poca homología con el inhibidor de fijación de diazepam (IFD) u otras secuencias de proteínas depositadas en la base de datos disponibles en el momento de la invención. 2.2 Composiciones Farmacéuticas de Factor de Liberación de Colecistoquinina Luminal Otro aspecto de la presente invención incluye composiciones novedosas que comprenden proteína de factor de liberación de colecistoquinina luminal aislada y purificada, # o ácidos nucleicos que codifican la proteína del factor de liberación de colecistoquinina luminal. Por supuesto, se entenderá que se puede utilizar uno o más de un factor genético de liberación de colecistoquinina en los métodos y composiciones de la invención. Los métodos de entrega de ácido nucleico, por consiguiente, implican la administración de 1, 2, 3, ó más genes homólogos. El máximo número de genes que se pueden aplicar están limitados solamente por consideraciones prácticas, tales corao el esfuerzo involucrado en la preparación simultánea de un gran número de construcciones genéticas, o inclusive la posibilidad de provocar un efecto citotóxico adverso. 20 Las composiciones contendrán una cantidad biológicamente efectiva del péptido o los péptidos novedosos. Como se utiliza en la presente, una "cantidad biológicamente efectiva" de un péptido o composición, se refiere a una cantidad efectiva para estimular la liberación de colecistoquinina. Como se da a conocer en la presente, son efectivas diferentes cantidades de péptido, como se muestra in vitro e in vivo, tales como entre aproximadamente 6 y aproximadamente 11 miligramos/kilogramo. Por supuesto, las dosis clínicas serán determinadas por el estado nutricional, la edad, el peso, y la salud del paciente. La cantidad y el volumen de la composición de péptido administrada, dependerán del sujeto y de la vía de administración. Las cantidades precisas de péptido activo requeridas dependerán del juicio del experto, y pueden ser f 10 peculiares para cada individuo. Sin embargo, a la luz de los datos presentados en la presente, la determinación de un rango de dosificación adecuado para utilizarse en seres humanos será directa. Las composiciones para utilizarse en el estímulo de la liberación de colecistoquinina de conformidad con la presente invención, serán composiciones que contengan el péptido de longitud completa que tiene de aproximadamente 70 a 75 residuos de aminoácidos, y un peso molecular de aproximadamente 8,136 daltones, o fragmentos funcionales y variantes de los mismos, tales como las secuencias representadas por las SEQ ID N0:1, SEQ ID NO: 3, posiciones de aminoácidos 1-6, 7-23, ó 22-37 de la SEQ ID N0:1. El término "un péptido" o "un polipéptido" en este sentido, significa cuando menos un péptido o polipéptido que incluye una secuencia de cualquiera de las estructuras anteriormente mencionadas o sus variantes. Los términos péptido y polipéptido se utilizan de una manera intercambiable. En adición a incluir una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID N0:1, los péptidos pueden incluir otros diferentes fragmentos más cortos o más largos, u otras secuencias de peptidilo cortas de diferentes aminoácidos. En ciertas modalidades, los péptidos pueden incluir una repetición de secuencias más cortas, por ejemplo, la SEQ ID NO: 3, o secuencias adicionales, tales como secuencias de dirección cortas, rótulos, residuos etiquetados, aminoácidos contemplados para incrementar la vida media o la estabilidad del péptido, o cualquier residuo adicional para un propósito designado, siempre que el péptido todavía funcione como un agente liberador de colecistoquinina. Esta funcionalidad se puede determinar fácilmente mediante ensayos, tales como aquellos descritos en la presente. En los péptidos se pueden incorporar cualquiera de los aminoácidos que se presentan comúnmente, incluyendo alanina, arginina, ácido aspártico, asparagina, cisteína, ácido glutámico, glutamina, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptófano, tirosina, y valina. De la misma manera, también se puede incorporar cualquiera de los denominados aminoácidos raros o modificados en un péptido de la invención, incluyendo: ácido 2-aminoadípico, ácido 3-aminoadípico, beta- alanina (ácido beta-aminopropiónico) , ácido 2-aminobutírico, ácido 4-aminobutírico (ácido piperidínico) , ácido 6- aminocaproico, ácido 2-aminoheptanoico, ácido 2- aminoisobutírico, ácido 3-aminoisobutírico, ácido 2- aminopimélico, ácido 2 , 4-diaminobutírico, desmosina, ácido 2 , 2 ' -diaminopimélico, ácido 2 , 3-diaminopropiónico, N- etilglicina, N-etilasparagina, hidroxilisina, halo- # hidroxilisina , 3-hidroxiprolina , 4-hidroxiprol ina , isoesmosina, halo-isoleucina, N-metilglicina (sarcosina), N- 10 metilisoleucina , N-metilvalina, norvalina, norleucina, y ornitina. Las composiciones inhibidoras de la invención pueden incluir un péptido modificado para hacerlo biológicamente protegido. Los péptidos biológicamente protegidos tienen ciertas ventajas sobre los péptidos no protegidos cuando se administran a sujetos humanos, y como se da a conocer en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,028,592, incorporada a la presente como referencia, los péptidos protegidos con frecuencia exhiben una mayor actividad farmacológica . Las composiciones para utilizarse en la presente invención también pueden comprender péptidos que incluyen todos los L-aminoácidos, todos los D-aminoácidos, o una mezcla de los mismos. El uso de los D-aminoácidos puede conferir resistencia adicional a las proteasas que se encuentran naturalmente adentro del cuerpo humano, y son menos inmunogénicos, y por consiguiente, se puede esperar que tengan vidas medias biológicas más largas. De la misma manera, también se contemplan composiciones que hacen uso de los genes codificadores del factor de liberación de colecistoquinina. La combinación particular de genes puede ser de dos o más variantes de genes de factor de liberación de colecistoquinina luminal; o puede ser tal que se combine un gen de factor de liberación de 0 colecistoquinina luminal con otro gen y/u otra proteína, tal como una proteína citoesquelética, un cofactor, u otra biomolécula; una hormona o un factor genético de crecimiento se puede inclusive combinar con un gen que codifique un receptor de superficie celular capaz de interactuar con el '5 producto de polipéptido del primer gen. En la utilización de múltiples genes, éstos se pueden combinar en una sola construcción genética bajo el control de uno o más promotores, o se pueden preparar como construcciones separadas del mismo o de diferentes tipos. Por 0 consiguiente, se puede emplear una combinación casi interminable de diferentes genes y construcciones genéticas. Ciertas combinaciones genéticas se pueden diseñar para, o su uso puede dar como resultado de otra manera, el logro de efectos sinergísticos sobre el crecimiento celular y/o el 5 estímulo de una respuesta inmune. Se pretende que cualquiera • 13 y todas estas combinaciones caigan dentro del alcance de la presente invención. Realmente, se han descrito muchos efectos sinergísticos en la literatura científica, de tal manera que un experto ordinario en este campo podría identificar fácilmente las combinaciones genéticas sinergísticas posibles, o inclusive combinaciones de gen-proteína. •"•5 También se entenderá que, si se desea, se podría administrar el segmento de ácido nucleico o el gen que codifique un polipéptido de factor de liberación de colecistoquinina luminal en combinación con otros agentes, tales como, por ejemplo, proteínas o polipéptidos o diferentes agentes farmacéuticamente activos. Siempre que la composición comprenda un factor genético de liberación de colecistoquinina luminal, virtualmente no hay límite para otros componentes que también se puedan incluir, dado que los agentes adicionales no provocan un efecto adverso significativo al hacer contacto con las células objetivo o los tejidos anfitriones. De esta manera, los ácidos nucleicos se pueden entregar junto con otros diferentes agentes, según se requieran en el caso particular. Las composiciones farmacéuticas preparadas de conformidad con la presente invención, encuentran uso en diferentes aplicaciones, incluyendo supresión del apetito, estímulo de liberación de insulina, y supresión del vaciado gástrico o de la vesícula biliar. Estos métodos involucran en general la administración a un mamífero, de una composición farmacéutica que comprende una cantidad inmunológicamente efectiva de una composición de factor de liberación de colecistoquinina luminal. Esta composición puede incluir una cantidad inmunológicamente efectiva de un péptido de factor de liberación de colecistoquinina luminal o de una composición de ácido nucleico que codifique el factor de liberación de colecistoquinina luminal. Tales composiciones también se pueden utilizar para generar una respuesta inmune en un mamífero. Los estuches terapéuticos que comprenden péptidos de factor de liberación de colecistoquinina luminal o segmentos de ácido nucleico que codifiquen el factor de liberación de colecistoquinina luminal, comprenden otro aspecto de la presente invención. Estos estuches generalmente contendrán, en recipientes adecuados, una formulación farmacéuticamente aceptable de péptido de factor de liberación de colecistoquinina luminal o de una composición de ácido nucleico que codifique el factor de liberación de colecistoquinina luminal. El estuche puede tener un solo recipiente que contenga la composición de factor de liberación de colecistoquinina luminal, o puede tener diferentes recipientes para la composición de factor de liberación de colecistoquinina luminal y otros reactivos que se puedan incluir adentro de estos estuches.

Los componentes del estuche se pueden proporcionar como soluciones líquidas, o como polvos secos. Cuando se proporcionan los componentes en una solución líquida, la solución líquida es una solución acuosa, prefiriéndose particularmente una solución acuosa estéril. Cuando los reactivos o los componentes se proporcionan como un polvo seco, el polvo se puede reconstituir mediante la adición de un solvente adecuado. Se prevé que el solvente también se pueda proporcionar en otro elemento del recipiente. En las modalidades relacionadas, la presente invención contempla la preparación de estuches de diagnóstico que se pueden emplear para detectar la presencia de proteínas o péptidos de factor de liberación de colecistoquinina luminal, y/o anticuerpos, en una muestra. Hablando en términos generales, los estuches de conformidad con la presente invención incluirán una proteína o péptido de factor de liberación de colecistoquinina luminal adecuado, o un anticuerpo dirigido contra esta proteína o este péptido, junto con un reactivo de inmunodetección, y un elemento para contener al anticuerpo o al antígeno y al reactivo. Los componentes de los estuches de diagnóstico se pueden empacar en un medio acuoso o en una forma liofilizada. El reactivo de inmunodetección típicamente comprenderá una eficacia asociada con el anticuerpo o el antígeno, o asociada con un ligando de fijación secundaria.

Los ligandos de ejemplo podrían incluir un anticuerpo secundario dirigido contra el primer anticuerpo o antígeno, o un ligando de biotina o avidina (o estreptavidina) que tenga una etiqueta asociada. Por supuesto, como se observó anteriormente, se conocen en la técnica un número de etiquetas de ejemplo, y se pueden emplear todas estas etiquetas en relación con la presente invención. Los estuches pueden contener conjugados de anticuerpo-etiqueta ya sea en una forma completamente conjugada, en la forma de intermediarios, o como fracciones separadas para ser conjugadas por el usuario del estuche. El elemento de recipiente generalmente incluirá cuando menos un vial, un tubo de ensayo, un matraz, una botella, una jeringa, u otro elemento de recipiente, en donde se pueda colocar el antígeno o el anticuerpo, y que de preferencia se pueda hacer una alícuota adecuadamente. Donde se proporcione un segundo ligando de fijación, el estuche también contendrá en general un segundo vial u otro recipiente en donde se pueda colocar este ligando o anticuerpo. Los estuches de la presente invención también incluirán típicamente un elemento para contener a los recipientes de anticuerpo, antígeno, y reactivo en estrecha confinación para su venta comercial. Estos recipientes pueden incluir recipientes de plástico moldeados por inyección o por soplado en donde se retengan los viales deseados. 2.3 Anticuerpos de Factor de Liberación de Colecistoquinina Luminal En otro aspecto, la presente invención contempla un anticuerpo que es inmunorreactivo con un polipéptido de la invención. Un anticuerpo puede ser un anticuerpo policlonal o monoclonal. En una modalidad preferida, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. Los medios para la preparación y caracterización de los anticuerpos son bien conocidos en este campo (ver, por ejemplo, Howell y Lañe, 1988) . Dicho de una manera breve, se prepara un anticuerpo policlonal mediante la inmunización de un animal con un inmunógeno que comprenda un polipéptido de la presente invención, y se recolectan los antisueros de este animal inmunizado. Se puede utilizar un amplio rango de especies animales para la producción de antisueros. Típicamente, un animal utilizado para la producción de anti-antisueros es un conejo, un ratón, una rata, un hámster, o un conejillo de Indias. Debido al volumen de sangre relativamente grande de los conejos, el conejo es una elección preferida para la producción de anticuerpos policlonales. Los anticuerpos, tanto policlonales como monoclonales, específicos para el factor de liberación de colecistoquinina luminal, se pueden preparar empleando técnicas de inmunización convencionales, como serán generalmente conocidas por los expertos en la materia. Se puede utilizar una composición que contenga epítopos antigénicos de factor de liberación de colecistoquinina luminal, para inmunizar a uno o más animales experimentales, tales como un conejo o un ratón, que luego procederá para producir anticuerpos específicos contra el factor de liberación de colecistoquinina luminal. Los antisueros policlonales se pueden obtener, después de dar tiempo para la generación de anticuerpos, simplemente sangrando al animal y preparando muestras de suero a partir de la sangre entera. Para obtener anticuerpos monoclonales, también se inmunizaría inicialmente a un animal experimental, con frecuencia preferiblemente un ratón, con una composición de factor de liberación de colecistoquinina luminal. Luego, después de un período de tiempo suficiente para permitir la generación de anticuerpos, se obtendría una población de células de bazo o de linfa del animal. Las células de bazo o de linfa se pueden fundir entonces con las líneas celulares, tales como las cepas de mieloma humanas o de ratón, para producir los hibridomas secretores de anticuerpo. Estos hibridomas se pueden aislar para obtener clones individuales que luego se pueden rastrear por la producción del anticuerpo para el péptido de factor de liberación de colecistoquinina luminal deseado. En seguida de la inmunización, se remueven las células del bazo y se funden, empleando un protocolo de fusión convencional, con células de plasmacitoma, con el fin de producir hibridomas que secreten los anticuerpos monoclonales contra el factor de liberación de colecistoquinina luminal. Los hibridomas que producen anticuerpos monoclonales para los antígenos seleccionados, se identifican empleando técnicas convencionales, tales como los métodos de ELISA y de mancha Western. Luego se pueden cultivar los clones de hibridoma en un medio líquido, y los sobrenadantes del cultivo se purifican para proporcionar los anticuerpos monoclonales específicos del factor de liberación de colecistoquinina luminal. Se propone que los anticuerpos monoclonales de la presente invención encontrarán una aplicación útil en los procedimientos inmunoquímicos convencionales, tales como los métodos ELISA y de mancha Western, así como en otros procedimientos que pueden utilizar anticuerpos específicos para los epítopos de factor de liberación de colecistoquinina luminal. Adicionalmente, se propone que los anticuerpos monoclonales específicos para la quimiocina particular se pueden utilizar en otras aplicaciones útiles. Por ejemplo, su uso en protocolos inmunoabsorbentes puede ser útil en la purificación de especies de factor de liberación de colecistoquinina luminal nativas o recombinantes, o variantes de las mismas. En general, se pueden utilizar tanto anticuerpos policlonales como monoclonales contra el factor de liberación de colecistoquinina luminal en una variedad de modalidades. Por ejemplo, se pueden emplear en los protocolos de clonación de anticuerpos para obtener ADNcs o genes que codifiquen factor de liberación de colecistoquinina luminal o proteínas relacionadas. También se pueden utilizar en los estudios de inhibición para analizar los efectos del factor de liberación de colecistoquinina luminal en células o animales. Los anticuerpos anti-factor de liberación de colecistoquinina luminal también serán útiles en los estudios de inmunolocalización, para analizar la distribución del factor de liberación de colecistoquinina luminal durante diferentes eventos celulares, por ejemplo, con el fin de determinar la distribución celular o específica del tejido del péptido de factor de liberación de colecistoquinina luminal bajo diferentes condiciones fisiológicas. Una aplicación particularmente útil de estos anticuerpos es en la purificación del factor de liberación de colecistoquinina luminal nativo o recombinante, por ejemplo, utilizando una columna de afinidad de anticuerpo. La operación de todas estas técnicas inmunológicas será conocida por los expertos en este campo a la luz de la presente divulgación. 2.4 Composiciones de Factor de Liberación de Colecistoquinina Luminal, y Supresión del Apetito El factor de liberación de colecistoquinina luminal tiene ventajas distintivas como un supresor del apetito, y por consiguiente, como una herramienta potencial en el arsenal del manejo del peso. A diferencia de la colecistoquinina, el factor de liberación de colecistoquinina luminal se puede administrar oralmente, proporcionando de esta manera un método simple para el tratamiento de pacientes con una mínima inconveniencia o incomodidad. Los efectos sobre el vaciado gástrico también pueden ser un contribuyente importante para la saciedad, y parte del efecto del factor de liberación de colecistoquinina luminal sobre la saciedad, puede ser a través de sus efectos para demorar el vaciado gástrico. Una vez que el agente de péptido llega al duodeno, está sujeto a la digestión por las enzimas digestivas pancreáticas. El factor de liberación de colecistoquinina luminal normalmente se secreta hacia el lumen del duodeno, y sobrevive intacto, si hay inhibidores de proteína del alimento o de proteasa dietética para proteger al péptido de las enzimas digestivas pancreáticas. Las formulaciones oralmente efectivas del factor de liberación de colecistoquinina luminal se podrían tomar mejor con los alimentos, y la proteína del alimento protegería adicionalmente al agente de péptido en el intestino. De una manera similar, se puede agregar una formulación que contenga un inhibidor de proteasa, tal como, por ejemplo, inhibidor de proteasa de papa II (POT II) o inhibidor de proteasa de frijol de soya, junto con el agente de péptido, para incrementar la sobrevivencia del agente de péptido, y por consiguiente, la efectividad en el intestino. Por ejemplo, la administración oral de la hormona de péptido, vasopresina, acompañada con un inhibidor de proteasa Trasylol, dio como resultado suficiente hormona que sobrevivió a la digestión intestinal para ser absorbida en cantidades efectivas (Franco-Saenz y colaboradores, 1979) . Ya que el factor de liberación de colecistoquinina luminal es activo desde el lado luminal del intestino, se cree necesario solamente para entregarlo con seguridad al lumen duodenal; no es necesario facilitar su absorción. Por consiguiente, en la mayoría de los casos serán preferibles las preparaciones orales. El factor de liberación de colecistoquinina luminal oralmente administrado se puede utilizar para estimular la secreción de colecistoquinina . Si el factor de liberación de colecistoquinina luminal fuera sensible a la pepsina, se puede administrar en formulaciones entéricamente protegidas, de tal manera que se libere en el intestino delgado. De una manera alternativa, se puede administrar con inhibidores de pepsina, inhibidores de secreción de ácido estomacal, o antiácidos de los tipos tradicionales. El factor de liberación de colecistoquinina luminal se puede hacer más resistente a la digestión mediante la modificación de sus aminoácidos, por ejemplo, utilizando homoarginina para sustituir la arginina, o reemplazando una o ambas lisinas. Debido a que el factor de liberación de colecistoquinina luminal es sensible a la tripsina, los fragmentos del factor de liberación de colecistoquinina luminal en la vecindad de una de las lisinas o de la arginina, debe retener la liberación de colecistoquinina biológica u otras actividades. Se espera que las modificaciones o sustituciones de aminoácidos con el factor de liberación de colecistoquinina luminal entero o fragmento, proporcionen sustancias más fácilmente preparadas y/o resistentes a la digestión. 2.5 Composiciones de Factor de Liberación de Colecistoquinina Luminal, y Secreción de Insulina Se contempla que las composiciones de factor de liberación de colecistoquinina luminal son útiles para estimular la secreción de insulina. Se ha demostrado que la colecistoquinina potencia la secreción de insulina inducida por aminoácidos. Por consiguiente, en condiciones en donde sea deficiente la secreción de insulina, tal como en diabetes melitus tipo I ó II, la colecistoquinina puede ser útil, y por consiguiente, será valioso un péptido liberador de colecistoquinina que sea oralmente activo, tal como el factor de liberación de colecistoquinina luminal. En adición, la colecistoquinina puede reducir los niveles de azúcar elevados en sangre después de comer un alimento, demorando el vaciado gástrico, y puede incrementar la movilidad del intestino delgado y grueso. Cuando se describen los usos anteriores para el factor de liberación de colecistoquinina luminal, se entiende que esto puede involucrar fragmentos, derivados, o análogos de factor de liberación de colecistoquinina luminal, que retengan las actividades biológicas deseadas. El factor de liberación de colecistoquinina luminal también es útil para regular el vaciado estomacal, una condición que ha demostrado estar asociada con algunos tipos de diabetes. La colecistoquinina está bien establecida como un regulador fisiológico del vaciado estomacal; específicamente, la colecistoquinina inhibe el vaciado estomacal. Los problemas clínicos con el vaciado estomacal involucran tanto un vaciado estomacal demorado como acelerado. La diabetes de la primera etapa, tanto de tipo I (dependiente de insulina) como del tipo II (no dependiente de insulina o "de establecimiento en adultos"), involucra un vaciado estomacal acelerado, que posteriormente puede cambiar a un vaciado estomacal demorado cuando se daña el sistema nervioso por la enfermedad. Se ha implicado la liberación deficiente de colecistoquinina en el vaciado estomacal acelerado en la diabetes tipo II (Rushakoff y colaboradores, 1993). El factor de liberación de colecistoquinina luminal, como un agente oral que libera colecistoquinina, será útil para superar este defecto en la diabetes de la primera etapa, para hacer más lento el progreso de la enfermedad. Existe una necesidad significativa de esta aplicación, debido al gran número de personas con diabetes tipo II, especialmente a medida que se incrementan las poblaciones hispanas y asiáticas de los Estados Unidos de Norteamérica, ya que son particularmente susceptibles a la diabetes tipo II, particularmente cuando adoptan una dieta de tipo occidental más densa en calorías. 2.6 Composiciones de Factor de Liberación de Colecistoquinina Luminal, y Vaciado de la Vesícula Biliar El factor de liberación de colecistoquinina luminal también se puede utilizar como parte de un tratamiento para la enfermedad de la vesícula biliar, particularmente cálculos biliares. La necesidad de este medicamento es muy grande, especialmente entre las mujeres, los hispano-americanos , los americanos nativos, y la gente que sufra de programas de pérdida de peso muy bajos en calorías. Los cálculos biliares se presentan con diferentes grados de frecuencia en las poblaciones norteamericanas, dependiendo del género, la edad, la dieta, el estado socioeconómico, y la etnicidad. El riesgo es varias veces más alto en las mujeres que en los hombres (del 15 al 40 por ciento después de los 50 años de edad en las mujeres caucásicas) , y se incrementa con la obesidad. Los cálculos biliares se presentan con una frecuencia dramática durante una pérdida de peso rápida, así como en pacientes con nutrición parenteral total (NPT) . En las mujeres hispano-americanas de más de 60 años de edad, la incidencia es tan alta como del 44 por ciento. El índice más alto reportado en una población definida es el 70 por ciento en mujeres adultas Indias Pima del Suroeste Americano. Aunque la causa de la formación de cálculos biliares es compleja, se cree que un punto común es la movilidad reducida de la vesícula biliar, que da como resultado un vaciado menos frecuente y menos completo. Inclusive cuando se formen cálculos biliares pequeños, el vaciado regular y completo los descargaría sin daños hacia el duodeno antes de que se hicieran suficientemente grandes para ser clínicamente relevantes. Ya que la colecistoquinina es el factor principal en el vaciado de la vesícula biliar, cuando menos algo del vaciado de la vesícula biliar perjudicado se debe a una liberación insuficiente de colecistoquinina para vaciar completamente la vesícula biliar. La mejor liberación de colecistoquinina, como mediante el factor de liberación de colecistoquinina luminal oralmente administrado, mejorará el vaciado de la vesícula biliar en las personas propensas a cálculos biliares, reducirá la incidencia de enfermedades de la vesícula biliar, y por consiguiente, la necesidad de una costosa intervención clínica. 2.7 Polipéptidos Recombinantes de Factor de Liberación de Colecistoquinina Luminal Las versiones recombinantes de una proteína o polipéptido se consideran parte de la presente invención. Por lo tanto, empleando técnicas familiares para los expertos en este campo, se puede expresar una versión recombinante del polipéptido en una célula recombinante para obtener el polipéptido a partir de estas células. Las técnicas se basan en la clonación de una molécula de ADN que codifique al polipéptido a partir de una biblioteca de ADN, es decir, sobre la obtención de una molécula de ADN específica distinta de otros ADNs. Por ejemplo, se puede clonar una molécula de ADNc, o se puede clonar un ADN genómico. Estas técnicas también serían apropiadas para la producción de los polipéptidos de mutacina de conformidad con la presente invención. 2.8 Genes de Factor de Liberación de Colecistoquinina Luminal Como es conocido por los expertos en la materia, la fuente original de un gen recombinante o de un segmento de ADN que se va a utilizar en un régimen terapéutico, no necesita ser de la misma especie que el animal que se va a tratar. En este aspecto, se contempla que se puede emplear cualquier gen recombinante de factor de liberación de colecistoquinina luminal en los métodos dados a conocer en la presente, tales como la identificación de células que contengan ADN que codifique factor de liberación de colecistoquinina luminal, o variantes de factor de liberación de colecistoquinina luminal. Los genes particularmente preferidos son aquellos aislados de seres humanos. Sin embargo, ya que se espera que se conserve la homología de secuencia para los genes que codifiquen polipéptidos de factor de liberación de colecistoquinina luminal a través de las líneas de las especies, también se pueden contemplar las especies equina, murina, y bovina como las fuentes, ya que estos genes y segmentos de ADN están fácilmente disponibles, prefiriéndose más las formas humanas o murinas del gen para utilizarse en regímenes de tratamiento en seres humanos. Las proteínas y polipéptidos recombinantes codificados mediante segmentos de ADN aislados y genes, con frecuencia son referidos con el prefijo "r" para recombinante, y "rh" para recombinante humano. Como tales, los segmentos de ADN que codifican los factores de liberación de colecistoquinina luminal recombinantes, o los genes relacionados con factor de liberación de colecistoquinina luminal recombinante, etcétera, se contemplan como particularmente útiles en relación con esta invención. De la misma manera, cualquier gen recombinante de factor de liberación de colecistoquinina luminal sería útil con los métodos de la invención. 20 El aislamiento del ADN que codifica polipéptidos de factor de liberación de colecistoquinina luminal, permite utilizar métodos bien conocidos por los expertos en esta técnica, y como se describen en la presente para hacer cambios en los codones para aminoácidos específicos, de tal manera que los codones sean los codones de "uso preferido" para una especie dada. Por consiguiente, por ejemplo, los codones preferidos variarán de una manera significativa para las especies bacterianas, comparándose con las especies de mamíferos; sin embargo, existen preferencias inclusive entre las especies relacionadas. Más adelante se muestran las tablas de uso de codón preferidas para rata y humano. El aislamiento de ADN de rata que codifica factor de liberación de colecistoquinina luminal, permitirá hacer sustituciones para los codones humanos preferidos, aunque se espera que el producto de polipéptido expresado a partir de ADN humano sea altamente homólogo al factor de liberación de colecistoquinina luminal de mamífero, y se esperaría que fuera estructural y funcionalmente equivalente al factor de liberación de colecistoquinina luminal aislado de rata. ^otal: 118,048 codones 'u = Frecuencia por 1,000 *• omo sapiens lTotal: 4,489,120 b? V? = = Frecuencia por 1,000 La definición del "gen de factor de liberación de colecistoquinina luminal" , como se utiliza en la presente, es un gen que se hibriza, bajo condiciones de hibridación relativamente rigurosas (ver, por ejemplo, Maniatis y colaboradores, 1982) , a las secuencias de ADN actualmente conocidas que incluyen secuencias genéticas de citoquina. La definición de un "gen de factor de liberación de colecistoquinina", como se utiliza en la presente, es un gen que se hibriza, bajo condiciones de hibridación relativamente rigurosas, a las secuencias de ADN actualmente conocidas que incluyen secuencias genéticas de factor de liberación de colecistoquinina . Para preparar un segmento de gen de factor de liberación de colecistoquinina luminal, o un ADNc, se pueden seguir las enseñanzas dadas a conocer en la presente, y también las enseñanzas de cualquiera de las patentes o documentos científicos específicamente referenciados en la presente. Se puede obtener un segmento de ADN que codifique factor de liberación de colecistoquinina luminal recombinante u otro factor de liberación de colecistoquinina, empleando técnicas biológicas moleculares, tales como reacción de cadena de polimerasa (PCRMR) , o rastreo de una biblioteca de ADNc o genómica, utilizando cebadores o sondas con secuencias basadas en la secuencia de nucleótidos anterior. Estos fragmentos se pueden preparar fácilmente mediante, por ejemplo, sintetizar directamente el fragmento mediante medios químicos, mediante la aplicación de tecnología de reproducción de ácido nucleico, tal como la tecnología de PCRMR de las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 4,683,195 y 4,683,202 (incorporadas a la presente como referencia) . La práctica de estas técnicas es un asunto de rutina para los expertos en la materia, como se enseña en diferentes textos científicos (ver, por ejemplo, Sambrook y colaboradores, 1989) , incorporados a la presente como referencia. Ciertos documentos definen además particularmente vectores de expresión de mamífero adecuados, por ejemplo la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,168,050, incorporada a la presente como referencia. Los genes de factor de liberación de colecistoquinina luminal y los segmentos de ADN que se prefieren particularmente para utilizarse en ciertos aspectos de los presentes métodos, son aquellos que codifican factor de liberación de colecistoquinina luminal y polipéptidos relacionados con factor de liberación de colecistoquinina luminal. También se contempla que se pueden clonar otros genes o ADNcs que codifiquen un péptido, proteína, o polipéptido de factor de liberación de colecistoquinina. Las técnicas para clonar moléculas de ADN, es decir, obtener una secuencia de codificación específica a partir de una biblioteca de ADN que sea distinta de otras porciones de ADN, son bien conocidas en este campo. Esto se puede lograr mediante, por ejemplo, el rastreo de una biblioteca de ADN apropiada que se relacione con la clonación de un gen de quimiocina, tal como factor de liberación de colecistoquinina luminal . El procedimiento de rastreo se puede basar en la hibridación de sondas de oligonucleótidos, diseñadas a partir de una consideración de porciones de la secuencia de aminoácidos de las secuencias de ADN conocidas que codifiquen proteínas de citoquina relacionadas. La operación de estos protocolos de rastreo es bien conocida por los expertos en este campo, y se describe con detalle en la literatura científica, por ejemplo ver Sambrook y colaboradores, 1989. Las técnicas para introducir cambios en secuencias de nucleótidos, que están diseñados para alterar las propiedades funcionales de las proteínas o polipéptidos codificados, son bien conocidas en este campo, por ejemplo, Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,518,584, incorporada a la presente como referencia, cuyas técnicas también se describen con mayor detalle en la presente. Estas modificaciones incluyen la supresión, inserción, o sustitución de bases, y por lo tanto, cambios en la secuencia de aminoácidos. Los cambios se pueden hacer para incrementar la actividad de citoquina de una proteína, para incrementar su estabilidad biológica o vida media, para cambiar su patrón de glicosilación, y similares. Todas estas modificaciones a las secuencias de nucleótidos son abarcadas por esta invención. 2.8.1 Segmentos de ADN que Codifican Factor de Liberación de Colecistoquinina Luminal La presente invención, en un sentido general y global, también se refiere al aislamiento y la caracterización de un gen novedoso, Icr, que codifica el polipéptido liberador de colecistoquinina novedoso, factor de liberación de colecistoquinina luminal. Una modalidad preferida de la presente invención es un segmento de ácido nucleico purificado que codifica una proteína que tiene cuando menos una secuencia de aminoácidos parcial de acuerdo con la SEQ ID N0:1. Otra modalidad de la presente invención es un segmento de ácido nucleico purificado, adicionalmente definido por incluir una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 2. En una modalidad más preferida, el segmento de ácido nucleico purificado consiste esencialmente en la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2, su complemento, y las variantes degeneradas de la misma. Como se utiliza en la presente, el término "segmento de ácido nucleico" y "segmento de ADN" se utilizan de una manera intercambiable, y se refieren a una molécula de ADN que se ha aislado libre del ADN genómico total de una especie particular. Por consiguiente, un segmento de ADN o de ácido nucleico "purificado", como se utiliza en la presente, se refiere a un segmento de ADN que contiene una secuencia de codificación de factor de liberación de colecistoquinina luminal, que no obstante se aisla lejos de, o se purifica libre de, el ADN genómico total, por ejemplo, el ADNc total o el ADN genómico humano. En el término "segmento de ADN" , se incluyen segmentos de ADN y fragmentos más pequeños de estos segmentos, y también vectores recombinantes, incluyendo, por ejemplo, plásmidos, cósmidos, fagos, virus, y similares . De una manera similar, un segmento de ADN que comprende un gen lcr aislado o purificado, se refiere a un segmento de ADN que incluye secuencias de codificación de factor de liberación de colecistoquinina luminal aisladas sustancialmente lejos de otros genes que se presentan naturalmente o secuencias que codifiquen la proteína. En este aspecto, el término "gen" se utiliza para mayor simplicidad, para referirse a una proteína funcional, polipéptido, o unidad codificadora de péptido. Como será entendido por los expertos en este campo, el término funcional incluye tanto las secuencias genómicas como las secuencias de ADNc, o combinaciones de las mismas. "Sustancialmente aislado lejos de otras secuencias de codificación" significa que el gen de interés, en ese caso lcr, forma la parte significativa de la región de codificación del segmento de ADN, y que el segmento de ADN no contiene porciones grandes de ADN de codificación que se presente naturalmente, tales como los fragmentos cromosomales grandes u otros genes funcionales o regiones de codificación de ADNc. Por supuesto, esto se refiere al segmento de ADN como aislado originalmente, y no excluye a los genes o a las regiones de codificación agregadas posteriormente al segmento por la mano del hombre. En las modalidades particulares, la invención se refiere a segmentos de ADN aislados, y a vectores recombinantes que incorporan secuencias de ADN que codifican un gen lcr, que incluye, adentro de su secuencia de aminoácidos, una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO:l. Más aún, en otras modalidades particulares, la invención se refiere a segmentos de ADN aislados, y a vectores recombinantes que incorporan secuencias de ADN que codifican un gen que incluye, adentro de su secuencia de aminoácidos, la secuencia de aminoácidos de un gen lcr que corresponde a lcr de murino. Otra modalidad preferida de la invención es un segmento de ácido nucleico purificado que codifica una proteína de acuerdo con la SEQ ID NO:l, además definida como un vector recombinante. Como se utiliza en la presente, el término "vector recombinante" se refiere a un vector que se ha modificado para contener un segmento de ácido nucleico que codifica una proteína de factor de liberación de colecistoquinina luminal, o un fragmento de la misma. El vector recombinante se puede definir adicionalmente como un vector de expresión que comprende un promotor operablemente enlazado con dicho segmento de ácido nucleico que codifica el factor de liberación de colecistoquinina luminal. Una modalidad preferida adicional de la presente invención, es una célula anfitriona, que se hace recombinante con un vector recombinante que comprende un gen lcr. La célula anfitriona recombinante puede ser una célula procariótica. En una modalidad más preferida, la célula anfitriona recombinante es una célula eucariótica. Como se utiliza en la presente, el término célula "diseñada" o "recombinante" pretende referirse a una célula en donde se ha introducido un gen recombinante, tal como un gen que codifique el factor de liberación de colecistoquinina luminal. Por consiguiente, las células diseñadas se pueden distinguir de las células que se presentan naturalmente, las cuales no contienen un gen recombinantemente introducido. Por lo tanto, las células diseñadas son células que tienen un gen o genes introducidos por la mano del hombre. Los genes recombinantemente introducidos estarán en la forma de un gen de ADNc (es decir, no contendrán intrones) , una copia de un gen genómico, o incluirán genes colocados adyacentes a un promotor no naturalmente asociado con el gen introducido particular. Hablando en términos generales, puede ser más conveniente emplear, como el gen recombinante, una versión de ADNc del gen. Se cree que el uso de una versión de ADNc proporcionará ventajas, en que el tamaño del gen será en general mucho más pequeño y se empleará más fácilmente para transfectar la célula objetivo, que un gen genómico, que típicamente será hasta un orden de magnitud mayor que el gen de ADNc. Sin embargo, los inventores no excluyen la posibilidad de emplear una versión genómica de un gen particular en donde se desee. En ciertas modalidades, la invención se refiere a segmentos de ADN aislados, y a vectores recombinantes que codifican una proteína o péptido que incluye, adentro de su secuencia de aminoácidos, una secuencia de aminoácidos esencialmente como se describe en la SEQ ID NO:l. Naturalmente, en donde el segmento de ADN o el vector codifique una proteína de factor de liberación de colecistoquinina luminal de longitud completa, o se pretenda para utilizarse en la expresión de la proteína del factor de liberación de colecistoquinina luminal, las secuencias más preferidas son aquellas que se describen esencialmente en la SEQ ID N0:1. Se reconoce que la SEQ ID NO: 1 representa 41 de los 63-70 aminoácidos de la proteína de longitud completa codificada por el gen Icr, y que las modalidades contempladas incluyen hasta la secuencia de longitud completa, y también las variantes f ncionales . El término "una secuencia esencialmente como se describe en la SEQ ID NO:l", significa que la secuencia corresponde sustancialmente a una porción de la SEQ ID NO:l, y tiene relativamente pocos aminoácidos que no son idénticos a, o un equivalente biológicamente funcional de, los aminoácidos de la SEQ ID N0:1. El término "equivalente biológicamente funcional" es bien entendido en la técnica, y se define además con detalle en la presente, como un gen que tiene una secuencia esencialmente como se describe en la SEQ ID NO:l, y que está asociado con un factor liberador de colecistoquinina constitutivamente producido, en la familia del factor de liberación de colecistoquinina luminal. De conformidad con lo anterior, las secuencias que tienen entre aproximadamente el 70 por ciento y aproximadamente el 80 por ciento; o más preferiblemente entre aproximadamente el 81 por ciento y aproximadamente el 90 por ciento; o todavía de una manera más preferible, entre aproximadamente el 91 por ciento y aproximadamente el 99 por ciento de aminoácidos que son idénticos o funcionalmente equivalentes a los aminoácidos de la SEQ ID NO:l, serán secuencias que son "esencialmente como se describen en la SEQ ID NO:l". En otras modalidades, la invención se refiere a segmentos de ADN aislados y a vectores recombinantes que incluyen, adentro de su secuencia, una secuencia de ácido nucleico esencialmente como se describe en la SEQ ID NO:2. El término "esencialmente como se describe en la SEQ ID NO:2", se utiliza en el mismo sentido que se describió anteriormente, y significa que la secuencia de ácido nucleico corresponde sustancialmente a una porción de la SEQ ID NO: 2, y tiene relativamente pocos codones que no son idénticos, o funcionalmente equivalentes, a los codones de la SEQ ID NO: 2. El término "codón funcionalmente equivalente", se utiliza en la presente para referirse a codones que codifican el mismo aminoácido, tales como los seis codones para arginina o serina, como se describen en la Tabla 1, y también se refiere a codones que codifican aminoácidos biológicamente equivalentes . También se entenderá que las secuencias de aminoácidos y ácido nucleico pueden incluir residuos adicionales, tales como aminoácidos N- ó C-terminales adicionales, o secuencias 5' ó 3', y todavía ser esencialmente como se describen en una de las secuencias dadas a conocer en la presente, siempre que la secuencia satisfaga los criterios descritos anteriormente, incluyendo el mantenimiento de la actividad biológica de la proteína, en donde se refiera a la expresión de la proteína. La adición de secuencias terminales se aplica particularmente a las secuencias de ácido nucleico que, por ejemplo, pueden incluir diferentes secuencias no codificadoras flanqueando a las porciones 5' ó 3' de la región de codificación, o pueden incluir diferentes secuencias internas, es decir, intrones, que se sepa que se presentan adentro de los genes . Exceptuando las regiones intrónicas o de flanqueo, y permitiendo la degeneración del código genético, las secuencias que tienen entre aproximadamente el 70 por ciento y aproximadamente el 80 por ciento; o más preferiblemente entre aproximadamente el 80 por ciento y aproximadamente 90 por ciento; o todavía de una manera más preferible entre aproximadamente el 90 por ciento y aproximadamente el 99 por ciento de nucleótidos que son idénticos a los nucleótidos de la SEQ ID NO: 2, serán secuencias que son "esencialmente como se describen en la SEQ ID NO: 2". Las secuencias que son esencialmente iguales a aquellas descritas en la SEQ ID NO: 2, también se pueden definir funcionalmente como secuencias que son capaces de hibridarse a un segmento de ácido nucleico que contenga al complemento de la SEQ ID NO: 2 bajo condiciones relativamente rigurosas. Las condiciones de hibridación relativamente estringentes adecuadas serán conocidas por los expertos en la materia, y se describen claramente en la presente, por ejemplo, las condiciones para utilizarse con el análisis de mancha Southern y Northern, y como se describen en el ejemplo dado en la presente. Naturalmente, la presente invención también abarca segmentos de ADN que son complementarios, o esencialmente complementarios, para la secuencia descrita en la SEQ ID NO: 2. Las secuencias de ácido nucleico que son "complementarias", son aquellas que son capaces de formar pares de bases de acuerdo con las reglas de complementariedad convencionales de Watson-Crick. Como se utiliza en la presente, el término "secuencias complementarias", significa secuencias de ácido nucleico que son sustancialmente complementarias, como pueda ser evaluado por la misma comparación de nucleótidos descrita anteriormente, o como se defina como capaces de hibridarse al segmento de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 2 bajo condiciones relativamente rigurosas. Los segmentos de ácido nucleico de la presente invención, independientemente de la longitud de la secuencia de codificación misma, se pueden combinar con otras secuencias de ADN, tales como promotores, señales de poliadenilación, sitios de enzima de restricción adicionales, múltiples sitios de clonación, otros segmentos de codificación, y similares, de tal manera que su longitud global puede variar considerablemente. Por consiguiente, se contempla que se puede emplear un fragmento de ácido nucleico de casi cualquier longitud, limitándose de preferencia la longitud total por la facilidad de preparación y uso en el protocolo de ADN recombinante pretendido. Por ejemplo, se pueden preparar fragmentos de ácido nucleico que incluyan una complementariedad de estiramiento corto con la SEQ ID NO: 2, tal como de aproximadamente 10 a 15, ó 20, 30, ó 40 nucleótidos, y que sean hasta de aproximadamente 200 pares de bases de longitud. También se contempla que son útiles los segmentos de ADN con longitudes totales de aproximadamente 500, 200, 100, y aproximadamente 50 pares de bases de longitud. Una modalidad preferida de la presente invención es un segmento de ácido nucleico que comprende cuando menos un estiramiento de 14 nucleótidos de largo que corresponde a, o es complementario para, la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 2. En una modalidad más preferida, el ácido nucleico se define adicionalmente por comprender cuando menos un estiramiento de 20 nucleótidos de largo, un estiramiento de 30 nucleótidos de largo, un estiramiento de 50 nucleótidos de largo, un estiramiento de 100 nucleótidos de largo, o un estiramiento de cuando menos 200 nucleótidos de largo que corresponda a, o sea complementaria para, la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 2. El segmento de ácido nucleico se puede definir adicionalmente por tener la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 2. Una modalidad relacionada de la presente invención, es un segmento de ácido nucleico que comprende cuando menos un estiramiento de 14 nucleótidos de largo que corresponde a, o es complementario para, la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 2, definida además por comprender un fragmento de ácido nucleico de hasta 10,000 pares de bases de longitud. Una modalidad más preferida es un fragmento de ácido nucleico que comprende 14 nucleótidos de la SEQ ID NO: 2, de hasta 5,000 pares de bases de longitud, 3,000 pares de bases de longitud, 1,000 pares de bases de longitud, 500 pares de bases de longitud, o 100 pares de bases de longitud. Naturalmente, también se entenderá que esta invención no se limita a las secuencias de ácido nucleico y de aminoácidos particulares de las SEQ ID NOS : 2 y 1. Por consiguiente, los vectores recombinantes y los vectores de ADN aislados pueden incluir variadamente las regiones de codificación del factor de liberación de colecistoquinina luminal mismas, llevando las regiones de codificaciones alteraciones o modificaciones seleccionadas en la región de codificación básica, o pueden codificar polipéptidos más grandes que no obstante incluyan regiones de codificación del factor de liberación de colecistoquinina luminal, o pueden codificar proteínas o péptidos equivalentes biológicamente funcionales que tengan secuencias de aminoácidos variantes. Los segmentos de ADN de la presente invención abarcan proteínas y péptidos de factor de liberación de colecistoquinina luminal equivalentes biológicamente funcionales . Estas secuencias pueden presentarse como una consecuencia de la redundancia de codones y la equivalencia funcional que se sabe que se presentan naturalmente adentro de las secuencias de ácido nucleico y de las proteínas así codificadas. De una manera alternativa, las proteínas o péptidos funcionalmente equivalentes se pueden crear mediante la aplicación de tecnología de ADN recombinante, en donde se pueden diseñar cambios en la estructura de la proteína, basándose en consideraciones de las propiedades de los aminoácidos que se estén intercambiando. Los cambios diseñados por el hombre se pueden introducir a través de la aplicación de técnicas de mutagénesis dirigida al sitio, por ejemplo, para introducir mejoras a la antigenicidad de la proteína de factor de liberación de colecistoquinina luminal, o para probar los mutantes de factor de liberación de colecistoquinina luminal, con el objeto de examinar la actividad o de determinar la frecuencia del péptido de factor de liberación de colecistoquinina luminal en diferentes células y tejidos al nivel molecular. Una modalidad preferida de la presente invención es una composición purificada que comprende un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO:l. El término "purificada", como se utiliza en la presente, pretende referirse a una composición de proteína de factor de liberación de colecistoquinina luminal, en donde la proteína de factor de liberación de colecistoquinina luminal se purifica hasta cualquier grado en relación con su estado que se puede obtener naturalmente, es decir, en este caso, en relación con su pureza adentro de un extracto de células eucarióticas. Una célula preferida para el aislamiento de la proteína de factor de liberación de colecistoquinina luminal es una célula de páncreas o de vellosidad intestinal; sin embargo, la proteína de factor de liberación de colecistoquinina luminal también se puede aislar a partir de muestras de pacientes, células recombinantes, tejidos, subpoblaciones aisladas de tejidos, y similares, como será sabido por los expertos en la materia, a la luz de la presente divulgación. Por consiguiente, una composición de proteína de factor de liberación de colecistoquinina luminal purificada, también se refiere a un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:l, libre del medio ambiente en donde se pueda presentar naturalmente. Si se desea, también se pueden preparar proteínas de fusión y péptidos, por ejemplo, en donde las regiones de codificación del factor de liberación de colecistoquinina luminal queden alineadas adentro de la misma unidad de expresión con otras proteínas o péptidos que tengan funciones deseadas, tales como para propósitos de purificación o inmunodetección (por ejemplo, proteínas que se pueden purificar mediante cromatografía por afinidad, y las regiones de codificación de etiqueta enzimática, respectivamente) . Pasando a la expresión del gen lcr, bien sea a partir del ADN basado en ADNc o genómico, se puede proceder a preparar un sistema de expresión para la preparación recombinante de proteína de factor de liberación de colecistoquinina luminal . El diseño de los segmentos de ADN para la expresión en un sistema procariótico o eucariótico, se puede realizar mediante técnicas .generalmente conocidas por los expertos en la expresión recombinante. Por ejemplo, se puede preparar una proteína de fusión de FLCL-GST (glutationa-S-transferasa) , que es un medio conveniente de expresión bacteriana. Sin embargo, se cree que se puede emplear virtualmente cualquier sistema de expresión en la expresión del factor de liberación de colecistoquinina luminal. El factor de liberación de colecistoquinina luminal se puede expresar con éxito en sistemas de expresión eucarióticos; sin embargo, los inventores contemplan que se pueden utilizar sistemas de expresión bacteriana para la preparación de factor de liberación de colecistoquinina luminal para todos los propósitos. El ADNc que contiene al gen lcr, se puede expresar por separado en sistemas bacterianos, expresándose las proteínas codificadas como fusiones con ß-galactosidasa, avidina, ubiquitina, Schistosoma japonicum, glutationa S-transferasa, múltiples histidinas, rótulos de epítopos, y similares. Se cree que la expresión bacteriana finalmente tendrá ventajas sobre la expresión eucariótica en términos de facilidad de uso y cantidad de materiales obtenidos mediante lo mismo. Se propone que la transformación de las células anfitrionas con segmentos de ADN que codifiquen factor de liberación de colecistoquinina luminal, proporcionará un medio conveniente para obtener una proteína de factor de liberación fei de colecistoquinina luminal. También se propone que el .ADNc, las secuencias genómicas, y las combinaciones de los mismos, son adecuados para la expresión eucariótica, ya que la célula anfitriona, por supuesto, procesará las transcripciones 5 genómicas para producir ARNm funcional para trasladarse a la proteína. Otra modalidad es un método para la preparación de una composición de proteína que comprende cultivar una célula anfitriona recombinante que comprenda un vector que codifique una proteína que incluya una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID N0:1, bajo condiciones que permitan la expresión del ácido nucleico y la producción de la proteína, seguida por la recuperación de la proteína así producida. La célula anfitriona, las condiciones que permiten la expresión del ácido nucleico, la producción y recuperación de la proteína, serán conocidas por los expertos en esta técnica, a la luz de la presente divulgación del gen lcr. 2.8.2. Construcciones Genéticas y Segmentos de ADN Como se utilizan en la presente, los términos "gen" y "segmento de ADN", se utilizan ambos para referirse a una molécula de ADN que se ha aislado libre de ADN genómico total de una especie particular. Por consiguiente, un gen o un segmento de ADN que codifique un polipéptido de factor de liberación de colecistoquinina luminal, se refiere a un segmento de ADN que contiene secuencias que codifican una proteína de factor de liberación de colecistoquinina luminal, pero que está aislado lejos de, o purificado libre de, el ADN genómico total de la especie a partir de la cual se obtiene el ADN. Dentro del término "segmento de ADN", se incluyen los segmentos de ADN y los fragmentos más pequeños de estos segmentos, y también vectores recombinantes, incluyendo, por ejemplo, plásmidos, cósmidos, fagos, retrovirus, adenovirus, y similares. El término "gen", se utiliza para mayor simplicidad, para referirse a una proteína funcional o a una unidad codificadora del péptido. Como será entendido por los expertos, este término funcional incluye tanto secuencias genómicas como secuencias de ADNc. "Sustancialmente aislado lejos de otras secuencias de codificación", significa que el gen de interés, en este caso, un gen de factor de liberación de colecistoquinina, forma la parte significativa de la región de codificación del segmento de ADN, y que el segmento de ADN no contiene porciones grandes de ADN de codificación que se presente naturalmente, tales como los fragmentos cromosomales grandes u otros genes funcionales o regiones de codificación de ADNc. Por supuesto, esto se refiere al segmento de ADN como se aisló originalmente, y no excluye los genes o las regiones de codificación, tales como las secuencias que codifican péptidos líder o secuencias de dirección, posteriormente agregadas al segmento por la mano de hombre . 2.8.3 Vectores Recombinantes que Expresan el Factor de Liberación de Colecistoquinina Luminal Un aspecto particular de esta invención proporciona maneras novedosas en las cuales se utilizan los segmentos de 5 ADN que codifican el factor de liberación de colecistoquinina luminal, y vectores recombinantes que comprenden segmentos de ADN de lcr. Como es bien sabido por los expertos en este campo, muchos de estos vectores ya están fácilmente disponibles, siendo un ejemplo detallado particular de un vector adecuado para la expresión en células de mamíferos el descrito en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,168,050, incorporada a la presente como referencia. Sin embargo, no hay requerimiento de que se utilice un vector altamente purificado, siempre que el segmento de codificación empleado codifique una proteína de factor de liberación de colecistoquinina luminal, y no incluya cualesquiera secuencias de codificación o reguladoras que tengan un efecto adverso sobre las células. Por consiguiente, también se entenderá que las secuencias de ácido nucleico útiles incluyen residuos adicionales, tales como secuencias no codificadoras adicionales que flanqueen a las porciones 5' ó 3' de la región de codificación, o pueden incluir diferentes secuencias internas, es decir, intrones, que se sabe que se presentan adentro de los genes. 25 Después de identificar un gen de codificación de * 52 factor de liberación de colecistoquinina luminal apropiado o una molécula de ADN, se puede insertar en cualquiera de los muchos vectores actualmente conocidos en la técnica, de tal manera que dirija la expresión y la producción de la proteína de factor de liberación de colecistoquinina luminal cuando se incorpore en una célula anfitriona. En un vector de expresión recombinante, la porción codificadora del segmento de ADN se coloca bajo el control de un promotor. El promotor puede estar en la forma del promotor que esté naturalmente asociado con un gen que codifique el factor de liberación de colecistoquinina luminal, o se puede obtener mediante el aislamiento de las secuencias no codificadoras 5' localizadas corriente arriba del segmento codificador o exón, por ejemplo, utilizando tecnología de clonación recombinante y/o PCRMR, en relación con las composiciones dadas a conocer en la presente. En ciertas modalidades, se contempla que se obtendrán ventajas particulares mediante la colocación del segmento de ADN que codifica el factor de liberación de colecistoquinina luminal bajo el control de un promotor recombinante o heterólogo. Como se utiliza en la presente, un promotor recombinante o heterólogo se refiere a un promotor que normalmente no está asociado con un gen Icr en su medio ambiente natural . Estos promotores pueden incluir aquellos normalmente asociados con otros genes de polipéptidos liberadores de colecistoquinina, y/o promotores aislados a partir de cualquier otra célula bacteriana, viral, eucariótica, o de mamífero. Naturalmente, será importante emplear un promotor que dirija efectivamente la expresión del segmento de i\DN en la célula particular que contenga al vector que comprenda al gen del factor de liberación de colecistoquinina luminal. El uso de promotores recombinantes para lograr la expresión de la proteína es generalmente conocido por los expertos en la técnica de biología molecular, por ejemplo, ver Sambrook y colaboradores (1989) . Los promotores empleados pueden ser constitutivos, o inducibles, y se pueden utilizar bajo las condiciones apropiadas para dirigir un alto nivel o una expresión regulada del segmento de ADN introducido. Los promotores actualmente preferidos son aquellos tales como CMV, RSV LTR, el promotor SV40 solo, y el promotor SV40 en combinación con el mejorador de SV40. 2.9 Métodos de Transfección de ADN La tecnología para la introducción de ADN en células es bien conocida por los expertos en este campo. Se han descrito cuatro métodos generales para entregar un gen a las células: (1) métodos químicos (Graham y VanDerEb, 1973); (2) métodos físicos tales como microinyección (Capecchi, 1980) , electroincorporación (Wong y Neumann, 1982; Fromm y colaboradores, 1985) , y la pistola genética (Yang y colaboradores, 1990); (3) vectores virales (Clapp, 1993; Danos y Heard, 1992; Eglitis y Anderson, 1988); y (4) mecanismos mediados por el receptor (Wu y colaboradores, 1991; Curiel y colaboradores, 1991; Wagner y colaboradores, 1992) . 2.9.1 Liposomas y Nanocápsulas La formación y uso de liposomas son en general conocidos por los expertos en la técnica (ver, pro ejemplo, Couvreur y colaboradores, 1991, que' describe el uso de liposomas y nanocápsulas en la terapia dirigida con antibióticos de infecciones y enfermedades bacterianas intracelulares) . Recientemente, se desarrollaron liposomas con mejor estabilidad en suero y mejores tiempos medios de circulación (Gabizon y Papahadjopoulos, 1988; Alien y Choun, 1987) . La siguiente es una breve descripción de estos modos de entrega de ADN. Las nanocápsulas generalmente pueden atrapar a los compuestos en una forma estable y reproducible (Henry-Michelland y colaboradores, 1987) . Para evitar los efectos secundarios debidos a la sobrecarga polimérica intracelular, estas partículas ultrafinas (de un tamaño de alrededor de 0.1 milímetros) se deben diseñar utilizando polímeros que se puedan degradar en vivo. Las nanopartículas de polialquilcianoacrilato biodegradables que cumplen estos requerimientos, se contemplan para utilizarse en la presente invención, y estas partículas se pueden hacer fácilmente, como se describe (Couvreur y colaboradores, 1984; 1988) .

Los liposomas se forman a partir de fosfolípidos, que se dispersan en un medio acuoso, y forman espontáneamente vesículas de dos capas concéntricas multilamelares (también denominadas vesículas multilamelares (VML) ) . Las vesículas multilamelares tienen en general diámetros de 25 nanómetros a 4 milímetros. La sonicación de las vesículas multilamelares da como resultado la formación de vesículas unilamelares pequeñas (VUP) con diámetros en la escala de 200 a 500 angstroms, que contienen una solución acuosa en el núcleo. En adición a las enseñanzas de Couvreur y colaboradores (1991) , se puede utilizar la siguiente información en la generación de formulaciones liposomales. Los fosfollpidos pueden formar una variedad de estructuras diferentes de los liposomas cuando se dispersan en agua, dependiendo de la proporción molar del lípido al agua. En bajas proporciones, el liposoma es la estructura preferida. Las características físicas de los liposomas dependen del pH, de la fuerza iónica, y de la presencia de cationes divalentes. Los liposomas pueden mostrar una baja permeabilidad a las sustancias iónicas y polares, pero a temperaturas elevadas sufren una transición de fases que alteran notablemente su permeabilidad. La transición de fases involucra un cambio desde una estructura ordenada estrechamente empacada, conocida como el estado de gel, hasta una estructura menos ordenada flojamente empacada, conocida como el estado fluido. Esto ocurre a una temperatura de transición de fases característica, y da como resultado un incremento en la permeabilidad a los iones, a los azúcares, y a los fármacos. Los liposomas interactúan con las células por medio de cuatro mecanismos diferentes: endocitosis por las células fagocíticas del sistema reticuloendotelial, tales como macrófagos y neutrófilos; adsorción a la superficie celular, bien sea mediante fuerzas hidrofóbicas o electrostáticas débiles no específicas, o mediante interacciones específicas con los componentes de la superficie celular; fusión con la membrana celular del plasma mediante inserción de la bicapa de lípido del liposoma en la membrana del plasma, con la liberación simultánea del contenido liposomal hacia el citoplasma; y mediante transferencia de los lípidos liposomales hacia las membranas celulares o subcelulares, o vice versa, sin asociación alguna del contenido del liposoma. Con frecuencia es difícil determinar cual mecanismo es operativo, y puede operar más de uno al mismo tiempo. 2.10 Expresión del Factor de Liberación de Colecisto?fuinina Luminal Para la expresión del factor de liberación de colecistoquinina luminal, una vez que se ha obtenido un clon o clones adecuados (de longitud completa si se desea) , ya sea que se basen en el ADNc, o genómicos, se puede proceder a preparar un sistema de expresión para la preparación £7 recombinante del factor de liberación de colecistoquinina luminal. El diseño de segmentos de ADN para la expresión en un sistema procariótico o eucariótico se puede realizar mediante técnicas generalmente conocidas por los expertos en la expresión recombinante . Se cree que se puede emplear virtualmente cualquier sistema de expresión en la expresión del factor de liberación de colecistoquinina luminal. El factor de liberación de colecistoquinina luminal se puede expresar con éxito en sistemas de expresión eucarióticos; sin embargo, también se prevé que se pueden preferir sistemas de expresión bacterianos para la preparación del factor de liberación de colecistoquinina luminal para todos los propósitos. El ADNc para el factor de liberación de colecistoquinina luminal se puede expresar por separado en sistemas bacterianos, expresándose las proteínas codificadas como fusiones con ß-galactosidasa, ubiquitina, Schistosoma japonicum, glutationa S-transferasa, proteína fluorescente verde, y similares. Se cree que la expresión bacteriana finalmente tendrá ventajas sobre la expresión eucariótica en términos de facilidad de uso y cantidad de los materiales obtenidos mediante la misma. Se propone que la transformación de las células anfitrionas con segmentos de ADN que codifiquen el factor de liberación de colecistoquinina luminal, proporcionará un medio conveniente para obtener el péptido del factor de liberación de colecistoquinina luminal. Tanto el ADNc como las secuencias genómicas son adecuados para la expresión eucariótica, ya que la célula anfitriona, por supuesto, procesar la transcripción genómica para producir ARNm funcional para trasladarse hacia la proteína. De una manera similar, se cree que se puede utilizar casi cualquier sistema de expresión eucariótico para la expresión del factor de liberación de colecistoquinina luminal, por ejemplo, sistemas basados en vaculovirus, basados en sintasa de glutamina, o basados en reductasa de dihidrofolatos. Sin embargo, en las modalidades preferidas, se contempla que serán más útiles los vectores de plásmido que incorporen un origen de réplica y un promotor eucariótico eficiente, como se ejemplifica por los vectores eucarióticos de la serie pCMV, tal como pCMV5. Para la expresión de esta manera, se podrían colocar las secuencias de codificación adyacentes a, y bajo el control de, el promotor. Se entiende en la técnica que, para poner una secuencia de codificación bajo el control de este promotor, se coloca el extremo 5' del sitio de iniciación de transcripción del marco de lectura de transcripción de la proteína entre aproximadamente 1 y aproximadamente 50 nucleótidos "corriente abajo" de (es decir, 31 de) el promotor seleccionado. En donde se contemple la expresión eucariótica, también típicamente se deseará incorporar en la unidad de transcripción que incluya al factor de liberación de colecistoquinina luminal, un sitio de poliadenilación apropiado (por ejemplo, 5 ' -AATAAA-3 ' ) , si no había uno contenido adentro del segmento clonado original. Típicamente, el sitio de adición poli A se coloca a de aproximadamente 30 a 2,000 nucleótidos "corriente abajo" del sitio de terminación de la proteína, en una posición anterior a la terminación de la transcripción. También se pueden incorporar mej oradores de traslación como parte del ADN del vector. Por consiguiente, las construcciones de ADN de la presente invención también deben contener de preferencia una o más secuencias líder no trasladadas 51, que pueden servir para mejorar la expresión de los productos genéticos a partir de las transcripciones de ARNm resultantes. Estas secuencias se pueden derivar del promotor seleccionado para expresar el gen, o se pueden modificar específicamente para incrementar la traslación del ARN. Estas regiones también se pueden obtener a partir de ARNs virales, a partir de genes eucarióticos adecuados, o a partir de una secuencia genética sintética (Griffiths y colaboradores, 1993) . Estas secuencias "mej oradoras" pueden ser deseables para incrementar o alterar la eficiencia de la traslación del ARNm resultante. La presente invención no se limita a construcciones en donde el mejorador se derive de la secuencia promotora no trasladada 51 nativa, sino que también pueden incluir secuencias líder no trasladadas derivadas a partir de otros promotores no relacionados, tales como otros activadores de transcripción mej oradores o genes. Se contempla que se puede utilizar virtualmente cualquiera de las células anfitrionas comúnmente empleadas en relación con la expresión del factor de liberación de colecistoquinina luminal de conformidad con la presente. Los ejemplos incluyen las líneas celulares típicamente empleadas para la expresión eucariótica, tales como las líneas celulares 239, AtT-20, HepG2, VERO, HeLa, CHO, Wl 38, BHK, C0S-7 , RIN y MDCK. Se contempla que el factor de liberación de colecistoquinina luminal se puede "sobre-expresar", es decir, se puede expresar en mayores niveles en relación con su expresión natural en células humanas, o inclusive en relación con la expresión de otras proteínas en una célula anfitriona recombinante que contenga segmentos de ADN que codifiquen el factor de liberación de colecistoquinina luminal. Esta sobre-expresión se puede evaluar mediante una variedad de métodos, incluyendo radioetiquetación y/o purificación de proteína. Sin embargo, se prefieren los métodos simples y directos, por ejemplo, aquellos que involucran SDS-PAGE, y teñido de proteína o mancha Western, seguida por análisis cuantitativos, tales como exploración densitométrica del gel resultante o de la mancha. Un incremento específico en el nivel de la proteína recombinante o del péptido en comparación con el nivel en las células animales productoras de factor de liberación de colecistoquinina luminal naturales, indica una sobre-expresión, así como una abundancia relativa de la proteína específica en relación con las otras proteínas producidas por la célula anfitriona, y, por ejemplo, visibles sobre un gel. Como se utiliza en la presente, el término célula "diseñada" o "recombinante" pretende referirse a una célula en donde se ha introducido un gen recombinante, tal como un gen que codifique un péptido de factor de liberación de colecistoquinina luminal. Por consiguiente, las células diseñadas se pueden distinguir de las células que se presentan naturalmente, que no contienen un gen recombinantemente introducido. Por lo tanto, las células diseñadas son células que tienen un gen o genes introducidos por la mano del hombre. Los genes recombinantemente introducidos estarán en la forma de un gen de ADNc (es decir, no contendrán intrones) , de una copia de un gen genómico, o incluirán genes colocados adyacentes a un promotor no asociado naturalmente con el gen introducido particular. Se entenderá que el factor de liberación de colecistoquinina luminal recombinante puede diferir del factor de liberación de colecistoquinina luminal naturalmente producido de ciertas maneras. En particular, el grado de modificaciones después de la traslación, tales como, por ejemplo, glicosilación y fosforilación, puede ser diferente entre el factor de liberación de colecistoquinina luminal recombinante y el polipéptido de factor de liberación de colecistoquinina luminal purificado a partir de una fuente natural, tal como de las secreciones intestinales. Hablando en términos generales, puede ser más conveniente emplear, como el gen recombinante, una versión de ADNc del gen. Se cree que el uso de una versión de ADNc proporcionará ventajas, porque el tamaño del gen generalmente será mucho más pequeño y se empleará más fácilmente para transfectar la célula objetivo, que un gen genómico, que típicamente será hasta de un orden de magnitud mayor que el gen de ADNc. Sin embargo, los inventores no excluyen la posibilidad de emplear una versión genómica de un gen particular en donde se desee. Después de identificar una molécula de ADN apropiada mediante cualquiera o una combinación de medios descritos anteriormente, el ADN se puede insertar entonces en cualquiera de los muchos vectores actualmente conocidos en este campo, y se puede transferir a una célula anfitriona procariótica o eucariótica, en donde dirigirá la expresión y la producción de la denominada versión "recombinante" de la proteína. La célula anfitriona recombinante se puede seleccionar a partir del grupo que consiste en S. mutans , E. coli. S. cerevisiae.

Bacillus sp. , Lactococci sp. , Enterococci sp. , ó Salmonella sp. En ciertas modalidades preferidas, la célula anfitriona recombinante tendrá un fenotipo recA. En donde se requiera la introducción de una versión recombinante de uno o más de los genes anteriores, será importante introducir el gen de tal manera que quede bajo el control de un promotor que dirija efectivamente la expresión del gen en el tipo de célula seleccionado para el diseño. En general, se deseará emplear un promotor que permita la expresión constitutiva (constante) del gen de interés. Los promotores constitutivos comúnmente utilizados son en general de origen viral, e incluyen el promotor de citomegalovirus (CMV) , la secuencia de repetición de término largo (RTL) de sarcoma de Rous, y el promotor del gen temprano SV40. El uso de estos promotores constitutivos asegurará un nivel de expresión alto y constante de los genes introducidos. El nivel de expresión a partir de los genes introducidos de interés puede variar en diferentes clones, probablemente como una función del sitio de inserción del gen recombinante en el ADN cromosomal. Por consiguiente, el nivel de expresión de un gen recombinante particular se puede seleccionar mediante la evaluación de diferentes clones derivados a partir de cada experimento de transfección; una vez que se selecciona la línea, el promotor constitutivo asegura que se mantenga permanentemente el nivel de expresión deseado. También puede ser posible utilizar promotores que sean específicos para el tipo de célula utilizada para el diseño, tales como el promotor de insulina en las líneas celulares de insulinoma, o los promotores de prolactina u hormona de crecimiento en las líneas de las células de la pituitaria anterior. 2.10.1 Producción Mejorada de Factor de Liberación de Colecistoquinina Luminal Uno de los problemas con el factor de liberación de colecistoquinina luminal aislado a partir de fuentes naturales, es el de los bajos rendimientos y extensos procesos de purificación. Un aspecto de la presente invención es la producción mejorada de factor de liberación de colecistoquinina luminal mediante metodologías recombinantes en un anfitrión bacteriano, empleando construcciones de ADN para transformar las células bacterianas gram-positivas o gram-negativas . Por ejemplo, el uso de sistemas de expresión de Escherichia coli es bien conocido por los expertos en este campo, así como el uso de otras especies bacterianas, tales como Bacillus subtilis ó Streptococcus sanguis . Otros aspectos de la invención incluyen vectores de alta expresión que incorporan ADN que codifica el factor de liberación de colecistoquinina luminal novedoso y sus variantes . Se contempla que también se puedan obtener vectores que proporcionen una mejora expresión del factor de liberación de colecistoquinina luminal en otros sistemas, tales como S. mutans . En donde sea deseable, se pueden buscar modificaciones de las propiedades físicas del factor de liberación de colecistoquinina luminal para incrementar su solubilidad o su expresión en un cultivo líquido. El lugar de lcr se puede poner bajo el control de un promotor de alta expresión, o se pueden alterar los componentes del sistema de expresión para mejorar la expresión. En otras modalidades, el ADN que codifica el ADN del factor de liberación de colecistoquinina luminal de la presente invención permite la producción a gran escala y el aislamiento del polipéptido del factor de liberación de colecistoquinina luminal. Esto se puede realizar mediante la dirección de la expresión del polipéptido de mutacina mediante la clonación del ADN que codifique el polipéptido del factor de liberación de colecistoquinina luminal en un vector de expresión adecuado. Este vector de expresión se puede transformar entonces en una célula anfitriona que pueda producir la proteína de factor de liberación de colecistoquinina luminal. La proteína de factor de liberación de colecistoquinina luminal se puede purificar luego, por ejemplo, mediante elementos proporcionados en esta descripción, y se puede utilizar en una forma biológicamente activa. El factor de liberación de colecistoquinina luminal recombinante no biológicamente activo también puede tener utilidad, por ejemplo, como un inmunógeno para preparar anticuerpos anti-factor de liberación de colecistoquinina luminal. 2.10.3 Clonación del Gen de Factor de Liberación de Colecistoquinina Luminal En todavía otra modalidad, la presente proporciona descripción de métodos para clonar el ADN que codifica el polipéptido de factor de liberación de colecistoquinina luminal. Empleando métodos bien conocidos por los expertos en este campo, se puede aislar y purificar el ADN que codifique el factor de liberación de colecistoquinina luminal purificado de la presente invención. Por ejemplo, mediante el diseño de un oligonucleótido degenerado que comprenda nucleótidos complementarios para el ADN que codifique la secuencia de la SEQ ID N0:1, se puede clonar el ADN que codifique el factor de liberación de colecistoquinina luminal a partir de una biblioteca de células de páncreas. Las secuencias de ADN dadas a conocer por la invención, permiten la preparación de secuencias de ADN (o de ARN) relativamente cortas, que tienen la capacidad para hibridarse específicamente a un gen que codifique el polipéptido de liberación del factor de liberación de colecistoquinina luminal. Este gen se denomina en la presente como el lcr, y se entiende que significa el lugar del gen que codifica el gen estructural del factor de liberación de colecistoquinina luminal. En estos aspectos, se preparan sondas de ácido nucleico de una longitud apropiada. Estas sondas típicamente se preparan basándose en la consideración de la secuencia de aminoácidos definida del factor de liberación de colecistoquinina luminal purificado. La capacidad de estas sondas de ácido nucleico para hibridarse a las secuencias del gen lcr. les da una utilidad particular en una variedad de modalidades. Por ejemplo, las sondas se pueden utilizar en una variedad de ensayos de diagnóstico para detectar la presencia de genes lcr en muestras de mucosa intestinal; sin embargo, se preveen otros usos, incluyendo la identificación de secuencias del gen lcr que codifiquen polipéptidos similares o imitantes relacionados con la mutacina. Otros usos incluyen el uso de cebadores de especies mutantes, o cebadores para preparar otras construcciones genéticas. Un primer paso de estos procedimientos de clonación es el rastreo de una biblioteca de ADN apropiada, tal como, en el presente caso, genómica o de ADNc preparado a partir de una biblioteca celular apropiada; por ejemplo, de células de páncreas. El procedimiento de rastreo puede ser un protocolo de rastreo de expresión que emplee anticuerpos dirigidos contra la proteína, o ensayos de actividad. De una manera alternativa, el rastreo se puede basar en la hibridación de sondas de oligonucleótido, diseñadas a partir de una consideración de porciones de la secuencia de aminoácidos de la proteína, o a partir de las secuencias de ADN de genes que codifiquen proteínas relacionadas. Otro planteamiento de clonación contemplado como particularmente adecuado, es el uso de una sonda o un cebador dirigido a un gen que se sepa que está generalmente asociado con, por ejemplo, adentro del mismo operón que, el gen estructural que se desee clonar. Por ejemplo, en el caso del factor de liberación de colecistoquinina luminal, se puede desear utilizar un cebador dirigido a cualesquiera regiones conservadas que se sepa que están asociadas con los genes de liberación de colecistoquinina . Otro planteamiento hacia la identificación de los genes responsables de la producción del factor de liberación de colecistoquinina luminal es localizar genes que se sepa que están adyacentes a los genes de factor de liberación de colecistoquinina luminal. Desde los lugares secuenciados en los genes que codifiquen otros péptidos de liberación de colecistoquinina, será posible determinar si varias enzimas de procesamiento y de exportación están altamente conservadas entre los productores de lantibióticos y comparten áreas de secuencias comunes. Se podría utilizar una serie de cebadores de oligonucleótidos complementarios para las secuencias conservadas en reacciones PCRR, con el fin de amplificar la secuencia que intervenga, y este amplicón podría utilizarse como una sonda para identificar genes transportadores putativos. La tecnología de PCRMR se describe en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,603,102, incorporada a la presente como referencia. En donde se encuentre que este gen transportador es parte de todo gen de péptido liberador de colecistoquinina conocido, el gen estructural para el factor de liberación de colecistoquinina luminal debe estar cerca y se debe identificar fácilmente mediante una técnica conocida como "cromosomas que caminan". 3.0 Breve Descripción de los Dibujos Figura 1. Efecto de la infusión intraduodenal de factor de liberación de colecistoquinina luminal intestinal parcialmente purificado sobre la proteína pancreática y la secreción de fluido, y sobre los niveles de colecistoquinina en plasma (inserto) . La bioactividad del factor de liberación de colecistoquinina luminal es bloqueado por el antagonista del receptor de colecistoquinina, MK329. *Significativamente diferente de los grupos de NaCl ó MK329 (n = 6, prueba t no emparejada). **Significativamente diferente del grupo de NaCl (inserto, n = 6, prueba t no emparejada) . Figura 2. Purificación de factor de liberación de colecistoquinina luminal mediante cromatografía de líquido de alta presión (CLAP) de fase inversa. Figura 3. Electroforesis capilar de alto rendimiento (ECAR) de factor de liberación de colecistoquinina luminal purificado mediante cromatografía de líquido de alta presión. Figura 4. Efecto de una infusión intraduodenal de factor de liberación de colecistoquinina luminal intestinal puro sobre la proteína pancreática y la secreción de fluido. *Significativamente diferente de los grupos de NaCl y de 1 miligramo. +Significativamente diferente del grupo de NaCl (prueba t no emparejada) . Figura 5. Efecto de la cromatografía de inmunoafinidad utilizando un antisuero de factor de liberación de colecistoquinina luminal^g sobre la bioactividad del factor de liberación de colecistoquinina luminal de factor de liberación de colecistoquinina luminal parcialmente purificado. Figura 6. Cambios en la proteína pancreática y en la secreción de fluido después de una inyección intraduodenal de factor de liberación de colecistoquinina luminal purificado o Péptido Monitor (PM) . *denota que es significativamente diferente de la dosis 9 para el factor de liberación de colecistoquinina luminal. -fdenota que es significativamente diferente de la dosis 9 para el péptido monitor. Figura 7. Relación de dosis-respuesta entre el factor de liberación de colecistoquinina luminal1_35 intraduodenal y la secreción pancreática. Cada punto representa de 6 a 8 experimentos con la dosis indicada, utilizando el modelo de rata de bioensayo (ver el texto) . *denota que es significativamente diferente de la dosis 0 para factor de liberación de colecistoquinina luminal. Figura 8. Comparación entre infusión intraduodenal (i.d.) contra intravenosa (i.v.) de factor de liberación de colecistoquinina luminal1_35. Los resultados para el panel superior son del mismo experimento ilustrado en la Figura 2. *denota una diferencia significativa desde la dosis cero. Figura 9. Cambios en la proteína pancreática y en la secreción de fluido después de una inyección intraduodenal de diferentes subfragmentos de factor de liberación de colecistoquinina luminal1_35. *Denota que es significativamente diferente de la dosis cero. El único subfragmento con una actividad biológica significativa fue el factor de liberación de colecistoquinina luminal1:_25 • Figura 10. Cambios en la proteína pancreática y en la secreción de fluido después de una inyección intraduodenal de Inhibidor de Fijación de Diazepam IFD^.gg de rata, o del ISD 33-50 del péptido ODN. *Denota que es significativamente diferente de la dosis cero. Figura 11. Efecto del bloqueo del receptor de colecistoquinina con MK329, sobre la proteína pancreática (panel superior) y la secreción de fluido (panel inferior) estimuladas por el factor de liberación de colecistoquinina luminal1_35~ , durante el retorno del jugo pancreático al intestino ("modelo fisiológico") . En la flecha, se infundió el factor de liberación de colecistoquinina luminal 1-35 intraduodenalmente a 25 microgramos/hora durante 2 horas, durante el retorno del 10 por ciento del jugo pancreático secretado hacia el duodeno. Se infundió MK329 a 0.5 miligramos/hora intravenosamente, empezando 1 hora antes de la primera recolección basal. *Denota que es significativamente diferente de la basal . Figura 12. Producción creciente de proteína y fluido en los experimentos descritos en la leyenda de la Figura 6. Los resultados demuestran que el estímulo de la proteína pancreática y de la secreción de fluido por el factor de liberación de colecistoquinina luminal721-35 es abolido por antagonista del receptor de colecistoquinina MK325. *Denota que es significativamente diferente, comparándose con NaCl y factor de liberación de colecistoquinina lumina^.-^ + MK329. Figura 13. Concentraciones de colecistoquinina luminal en plasma, en muestras de sangre tomadas 60 minutos después del inicio de la infusión de los compuestos de prueba en el experimento descrito en la leyenda de la Figura 9, con la adición de estudios con factor de liberación de colecistoquinina luminal1_6. Figura 14. Efecto de la digestión con tripsina de factor de liberación de colecistoquinina luminal1_35 sobre su actividad liberadora de colecistoquinina. El factor de liberación de colecistoquinina luminal-^-jg se incubó con # 73 tripsina bovina purificada (1 miligramo/mililitro) a 37°C durante 24 horas. Se incubó un factor de liberación de colecistoquinina luminal de control bajo las mismas condiciones pero sin tripsina. El control de tripsina fue de 5 1 miligramo/mililitro de tripsina incubada bajo las mismas condiciones pero sin factor de liberación de colecistoquinina luminal1_35. *Denota que es significativamente diferente del # control . Figura 15. Estímulo de factor de liberación de colecistoquinina luminal1_35 de la liberación de colecistoquinina a partir de células intestinales de rata dispersadas. *Denota que es significativamente diferente de la concentración cero de factor de liberación de colecistoquinina luminal1_35. 15 Figura 16. Efecto de la IgG anti-factor de liberación de colecistoquinina luminal, sobre la respuesta secretora pancreática a la peptona al 5 por ciento infundida intraduodenalmente en ausencia de jugo pancreático en el intestino. La peptona se mezcló con IgG anti-factor de liberación de colecistoquinina luminal, y se infundieron juntas en el duodeno. *Denota que es significativamente diferente de la peptona mezclada con IgG de conejo normal. Los resultados muestran que la IgG anti-factor de liberación de colecistoquinina luminal, abolió la respuesta secretora pancreática a la peptona.

Figura 17. Efecto de antisuero de factor de liberación de colecistoquinina luminal sobre la respuesta secretora pancreática, a la desviación del jugo pancreático- biliar desde el duodeno. Se introdujeron antisuero de factor 5 de liberación de colecistoquinina luminal, o suero de conejo normal (SCN) intravenosamente como un bolo (0.1 mililitros) 1 hora antes de desviar el jugo pancreático-biliar . En el inserto se muestra el incremento de la producción de proteína pancreática y fluido. *Denota que es significativamente diferente del grupo introducido con suero de conejo normal. Figura 18. Efecto del antisuero de factor de liberación de colecistoquinina luminal sobre la respuesta de la colecistoquinina en plasma a la desviación del jugo pancreático-biliar desde el duodeno. *Denota que es significativamente diferente del grupo de suero de conejo normal y del grupo que no recibió suero. Figura 19. Falta de efecto del factor de liberación de colecistoquinina luminal.,.^ sobre la liberación de amilasa a partir de ácinos pancreáticos aislados. La colecistoquinina- 20 8 estimuló la amilasa en una forma relacionada con la dosis. En concentraciones similares, el factor de liberación de colecistoquinina luminal.,.^ no tuvo efecto alguno. Los resultados indican que el factor de liberación de colecistoquinina luminal1.35 no estimula al páncreas directamente, sino que más bien lo hace indirectamente mediante el estímulo de la liberación de colecistoquinina. Figura 20. Inmunorreactividad de factor de liberación de colecistoquinina luminal (IR-FLCL) en vellosidad del intestino delgado. La Figura 15A muestra la vellosidad intestinal teñida utilizando antisuero 2243232 de factor de liberación de colecistoquinina luminal, que muestra la inmunorreactividad del factor de liberación de colecistoquinina luminal (estructuras y áreas oscuras) en la punta, y las estructuras en el cuerpo de las vellosidades. Figura 15B: vellosidades intestinales en seguida del teñido, en donde el antisuero fue preabsorbido con antígeno específico (control de antígeno específico) . Figura 21. Inmunorreactividad de factor de liberación de colecistoquinina luminal en los nervios entéricos del intestino delgado. 21A: inmunorreactividad del factor de liberación de colecistoquinina luminal (antisuero 22322 en las fibras nerviosas y en los cuerpos de las células nerviosas en el plexo mientérico y en las neuronas submucosales del duodeno. 16B: Control de antígeno específico. Figura 22. Inmunorreactividad de factor de liberación de colecistoquinina luminal en los ganglios nudosos. 22A: Fibras nerviosas (rayas oscuras) y cuerpos de células nerviosas (parches oscuros) en los ganglios nudosos teñidos utilizando antisuero 22322. 17B: control de antígeno específico.

Figura 23. Inmunorreactividad de factor de liberación de colecistoquinina luminal en la glándula adrenal. 23A: fibras nerviosas (rayas oscuras) en la médula adrenal teñidas utilizando antisuero 22322. 23B: control de antígeno específico. Figura 24. Mancha Western de reactividad de antisueros de conejo contra el páncreas, el músculo del estómago, y el tejido de mucosa del estómago. Figura 24A: es un control con suero de conejo normal. Figura 24B: es con suero policlonal de conejo #QPDG. Figura 25. Mancha Western de reactividad de antisueros de conejo contra páncreas, mucosa estromal, músculo estromal , músculo duodenal, mucosa duodenal, músculo abdominal, mucosa del ileo, músculo del íleo. La Figura 20A es un control con suero de conejo normal. La Figura 20B es con suero policlonal de conejo #1728. 4.0 Descripción Detallada de las Modalidades Preferidas Se ha aislado y purificado un factor de liberación de colecistoquinina novedoso, el factor de liberación de colecistoquinina luminal (FLCL) a partir de secreciones intestinales. El factor de liberación de colecistoquinina luminal es activo en el estímulo de la liberación de colecistoquinina, y se encuentra en los enterocitos, en las puntas de las vellosidades del intestino delgado. Se ha identificado como un neuropéptido putativo que se encuentra en los sistemas nerviosos entérico, parasimpático, y simpático, pero no en el cerebro. Los estudios de inmunoafinidad utilizando anticuerpos criados contra factor de liberación de colecistoquinina luminal-^g sintético, y los estudios de infusión del lumen del intestino delgado, sugieren que el factor de liberación de colecistoquinina luminal media la regulación de retroalimentación negativa de la secreción de enzima pancreática, así como la liberación de colecistoquinina . Para un uso práctico, se pueden utilizar el péptido de factor de liberación de colecistoquinina luminal y los fragmentos activos o análogos del mismo, para estimular la liberación de colecistoquinina de una manera típica de las grasas y proteínas ingeridas. A diferencia de estos alimentos, el factor de liberación de colecistoquinina luminal efectúa la liberación de colecistoquinina con virtualmente cero entrada calórica, ya que el péptido es muchos órdenes de magnitud más potente para liberar la colecistoquinina. El factor de liberación de colecistoquinina luminal actúa fisiológicamente desde adentro del lumen del intestino (es decir, no sistémicamente, ni desde la sangre) ; por consiguiente, se puede aplicar a su sitio de acción oralmente. Esto contrasta con otros péptidos bioactivos utilizados en tratamiento médico, por ejemplo, insulina y hormona de crecimiento, que deben administrarse parenteralmente, ya que actúan sobre las células adentro de los órganos internos o de los músculos . La aplicación oral del péptido de factor de liberación de colecistoquinina luminal puede encontrar una destrucción prematura potencial por el ácido del estómago y/o la pepsina, y/o sufrir una rápida destrucción en el intestino por la tripsina y otras enzimas proteolíticas pancreáticas. Por consiguiente, se deseará considerar las modalidades del agente que incluyan agentes auxiliares que inhiban estos procesos digestivos. Estos agentes están disponibles y son bien conocidos por los expertos en este campo. Los agentes potencialmente útiles incluyen medicamentos que suprimen la secreción o la acción del ácido del estómago (antiácidos y supresores de ácido tales como los antagonistas del receptor de histamina tipo II (Tagamet, Zantac, Pepcid) , ó inhibidores de H+, K+, ATPasa (por ejemplo, Prolesec) , así como agentes que supriman la actividad de la tripsina (por ejemplo, inhibidor de tripsina de frijol de soya, o inhibidor de tripsina/quimiotripsina de papa (POT-II) ) . Estos compuestos ya se han utilizado en seres humanos. Adicionalmente, se pueden emplear análogos resistentes a la pepsina del factor de liberación de colecistoquinina luminal, o fragmentos de péptido más pequeños que posean actividad de factor de liberación de colecistoquinina luminal. El resultado práctico de estas modalidades sería tener una formulación que imite la liberación de colecistoquinina que ocasiona el alimento (particularmente la grasa y la proteína) , pero que carezca de las calorías . Una preparación de ejemplo podría ser factor de liberación de colecistoquinina luminal sintético combinado con agentes para inhibir su destrucción digestiva, o análogos químicos (o fragmentos pequeños) de factor de liberación de colecistoquinina luminal que resistan la digestión. 4.1 ELISAS Se pueden utilizar ELISAS en conjunto con la invención. En un ensayo ELISA, las proteínas o los péptidos que incorporan secuencias antigénicas de factor de liberación de colecistoquinina luminal, se inmovilizan sobre una superficie seleccionada, de preferencia una superficie que exhiba una afinidad con proteína, tal como las cavidades de una placa de microtitulación de poliestireno. Después de lavar para remover el material incompletamente adsorbido, es deseable fijar o recubrir las cavidades de la placa de ensayo con una proteína no específica que se sepa que es antigénica neutra con respecto a los antisueros de prueba, tales como albúmina de suero bovino (ASB) , caseína, o soluciones de leche en polvo. Esto permite bloquear los sitios de adsorción no específicos sobre la superficie inmovilizadora, y por consiguiente, reduce el fondo ocasionado por la fijación no específica de los antisueros sobre la superficie. Después de la fijación del material antigénico a la cavidad, el recubrimiento con un material no reactivo para reducir el fondo, y el lavado para remover el material no fijado, la superficie inmovilizadora se pone en contacto con los antisueros o con el extracto clínico o biológico que se vaya a probar, de una manera que conduzca a la formación del complejo inmune (antígeno/anticuerpo) . Estas condiciones incluyen de preferencia la dilución de los antisueros con diluyentes, tales como albúmina de suero bovino, gamma-globulina bovina (GGB) , y suero regulado con fosfato (SRF)/TweenR. Estos agentes agregados también tienden a asistir en la reducción del fondo no específico. Luego se permite que los antisueros en capas se incuben durante de aproximadamente 2 a aproximadamente 4 horas, a temperaturas de preferencia del orden de aproximadamente 25 °C a aproximadamente 27 "C. En seguida de la incubación, se lava la superficie en contacto con el antisuero para remover el material no inmunocomplejado. Un procedimiento de lavado preferido incluye lavar con una solución tal como suero regulado con fosfato/Tween , o regulador de borato. En seguida de la formación de inmunocomplejos específicos entre la muestra de prueba y el antígeno fijado, y del lavado subsecuente, se puede determinar la presentación e inclusive la cantidad de formación de inmunocomplejo, sometiéndolo a un segundo anticuerpo que tenga especificidad para el primero. Para proporcionar un elemento de detección, el segundo anticuerpo de preferencia tendrá un enzima asociada que generará un desarrollo de color al incubarse con sustrato cromogénico apropiado. Por consiguiente, por ejempl se deseará poner en contacto e incubar la superficie fijada antisuero, con una ureasa o con una IgG anti-humana conjuga con peroxidasa, durante un período de tiempo y ba condiciones que favorezcan el desarrollo de la formación d inmunocomplejo (por ejemplo, incubación durante 2 horas a temperatura ambiente en una solución que contenga sue regulado con fosfato, tal como suero regulado c fosfato/T eenR) . Después de la incubación con el segundo anticuer rotulado con enzima, y subsecuentemente al lavado para remov el material no fijado, se cuantifica la cantidad de etique mediante la incubación con un sustrato cromogénico, tal co urea y púrpura de bromocresol o ácido 2 , 2' -azino-di- (3-eti benzotiazolin) -6-sulfónico (ABTS) y H202 , en el caso de peroxidasa como la etiqueta enzimática. Luego se logra cuantificación midiendo el grado de generación de color, p ejemplo, utilizando un espectrofotómetro de espectro visibl 4.2 Secuencias de Núcleo Epitópicas La presente invención también se refiere composiciones de proteína o de péptido, exentas de célu totales y de otros péptidos, las cuales comprenden proteína o péptido purificado que incorpora un epítopo reacciona cruzadamente de una manera inmunológica con uno más anticuerpos anti-factor de liberación de colecistoquinin luminal . Como se utiliza en la presente, el término "qu incorpora un epítopo (s) que reacciona cruzadamente de un manera inmunológica con uno o más anticuerpos anti-factor d liberación de colecistoquinina luminal", pretende referirse un antígeno de péptido o de proteína que incluye un estructura primaria, secundaria, o terciaria similar a u epítopo localizado adentro de un polipéptido de factor d liberación de colecistoquinina luminal. El nivel de similitu generalmente estará a tal grado que los anticuerpo monoclonales o policlonales dirigidos contra el polipéptido d factor de liberación de colecistoquinina luminal también s fijarán a, reaccionarán con, o reconocerán de otra manera e antígeno de péptido o de proteína de reacción cruzada. S pueden emplear diferentes métodos de inmunoensayo en conjunt con estos anticuerpos, tales como, por ejemplo, manch Western, ELISA, RÍA, y similares, todos los cuales so conocidos por los expertos en este campo. La identificación de los epítopos de factor d liberación de colecistoquinina luminal, y/o sus equivalente funcionales, adecuados para utilizarse en vacunas, es u asunto relativamente directo. Por ejemplo, se pueden emplea los métodos de Hopp, como se enseña en la Patente de lo Estados Unidos de Norteamérica Número 4,554,101, incorporad a la presente como referencia, la cual enseña la identificación y la preparación de epítopos a partir de secuencias de aminoácidos con base en la hidrofilicidad. Los métodos descritos en otros diferentes documentos, y los programas de software basados en los mismos, también se pueden utilizar para identificar secuencias de núcleo epitópicas (ver, por ejemplo, Jameson y Wolf , 1988; Wolf y colaboradores, 1988; Patente de los Estados Unidos dé Norteamérica Número 4,554,101). La secuencia de aminoácidos de estas "secuencias de núcleo epitópicas" se puede incorporar entonces fácilmente en lofe péptidos, bien sea a través de la aplicación de síntesis de péptidos o tecnología recombinante. Los péptidos preferidos para utilizarse de conformidad con la presente invención, en general serán del orden de aproximadamente 5 a aproximadamente 25 aminoácidos de longitud, y más preferiblemente de aproximadamente 8 a aproximadamente 20 aminoácidos de longitud. Se propone que las secuencias de péptido derivadas de factor de liberación de colecistoquinina luminal antigénicas más cortas proporcionará ventajas en ciertas circunstancias, por ejemplo en l preparación de vacunas o en ensayos de detección inmunológica. Las ventajas de ejemplo incluyen la facilidad de preparació y purificación, el costo relativamente bajo, y la mejo reproducibilidad de producción, y una biodistribució conveniente.

"T* 84 Se propone que se pueden hacer realidad ventajas particulares de la presente invención a través de la preparación de péptidos sintéticos que incluyan secuencias de núcleo epitópicas/inmunogénicas modificadas y/o extendidas, 5 que den como resultado un péptido epitópico "universal" dirigido al factor de liberación de colecistoquinina luminal o a las secuencias relacionadas con factor de liberación de colecistoquinina luminal. Se propone que estas regiones representan aquellas que tienen más posibilidades de promover el estímulo de las células T o de las células B en un animal, y por consiguiente, provocar la producción de anticuerpos específica en ese animal. Una secuencia de núcleo epitópica, como se utiliza en la presente, es un estiramiento relativamente corto de aminoácidos que es "complementario" para, y por consiguiente se fijará a, los sitios de fijación de antígeno sobre los anticuerpos de proteína de transferencia-fijación. De una manera adicional o alternativa, una secuencia de núcleo epitópica es una que provocará a los anticuerpos que tienen reacción cruzada, con los anticuerpos dirigidos contra las composiciones de péptido de la presente invención. Se entenderá que, en el contexto de la presente divulgación, el término "complementario" se refiere a los aminoácidos o a los péptidos que exhiben una fuerza de atracción unos hacia otros.

Por consiguiente, ciertas secuencias de núcleo de epítopo de la presente invención se pueden definir operativamente en términos de su capacidad para competir con, o tal vez desplazar, la fijación del antígeno de proteína deseado, con el antisuero dirigido a la proteína correspondiente. En general, se cree que el tamaño del antígeno de polipéptido no es particularmente crucial, siempre que sea cuando menos suficientemente grande para llevar la secuencia o las secuencias de núcleo identificadas. La secuencia de núcleo útil más pequeña anticipada por la presente divulgación, será en general del orden de aproximadamente 5 aminoácidos de longitud, prefiriéndose más las secuencias del orden de 8 o de 25 aminoácidos de longitud. Por consiguiente, este tamaño corresponderá en general con los antígenos de péptido más pequeños de conformidad con la invención. Sin embargo, el tamaño del antígeno puede ser más grande en donde se desee, siempre que contenga una secuencia de núcleo epitópica básica. La identificación de las secuencias de núcleo epitópicas es conocida por los expertos en este campo, por ejemplo, como se describe en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,554,101, incorporada a la presente como referencia, la cual enseña la identificación y la preparación de epítopos a partir de secuencias de aminoácidos, con base en la hidrofilicidad. Más aún, numerosos programas de computación están disponibles para utilizarse en la predicción de porciones antigénicas de proteínas (ver, por ejemplo, Jameson y Wolf, 1988 ,Wolf y colaboradores, 1988) . Los programas de análisis de secuencias de péptidos computarizados (v.gr., software DNAStarR, DNAStar, Inc., Madison Wisc.) también pueden ser útiles en el diseño de péptidos de factor de liberación de colecistoquinina luminal sintéticos, y análogos de péptido de conformidad con la presente descripción. Las síntesis de secuencias epitópicas, o de péptidos que incluyen un epítopo antigénico adentro de su secuencia, se logran fácilmente utilizando técnicas sintéticas convencionales, tales como el método en fase sólida (v.gr., a través del uso del sintetizador de péptidos comercialmente disponible, tal como un Sintetizador de Péptidos Applied Biosystems Modelo 430A) . Los antígenos de péptido sintetizados de esta manera se pueden poner en alícuotas entonces en cantidades predeterminadas, y se pueden almacenar de maneras convencionales, tales como en soluciones acuosas, o inclusive más preferiblemente, en un estado en polvo o liofilizado, mientras está pendiente su uso. En general, debido a la estabilidad relativa de los péptidos, se pueden almacenar fácilmente en soluciones acuosas durante períodos de tiempo bastantes largos si se desea, por ejemplo, hasta 6 meses o más, virtualmente en cualquier solución acuosa, sin una degradación apreciable o pérdida de actividad antigénica. Sin embargo, en donde se contemple un almacenamiento acuoso prolongado, en general será deseable incluir agentes, incluyendo reguladores del pH, tales como Tris o reguladores de fosfato, para mantener un pH de aproximadamente 7.0 a aproximadamente 7.5. Más aún, puede ser deseable incluir agentes que inhiban el crecimiento microbiano, tal como azida de sodio o Merthiolate . Para un almacenamiento prologando en un estado acuoso, será deseable almacenar las soluciones a 4°C, o más preferiblemente congeladas. Por supuesto, en donde los péptidos se almacenen en un estado liofilizado o en polvo, se pueden almacenar virtualmente de una manera indefinida, por ejemplo, en alícuotas medidas, las cuales se pueden rehidratar con una cantidad predeterminada de agua (de preferencia destilada) , o con regulador del pH, antes de usarse. 4.3 Inmunoprecipitación Los anticuerpos de la presente invención son particularmente útiles para el aislamiento de antígenos mediante inmunoprecipitación. La inmunoprecipitación involucra la separación del componente de antígeno objetivo de una mezcla compleja, y se utiliza para discriminar o aislar cantidades diminutas de proteína. Para el aislamiento de proteínas de membrana, las células deben solubilizarse en micelios de detergente. Se prefieren las sales no iónicas, ya que otros agentes, tales como las sales biliares, se precipitan en un pH de ácido, o en la presencia de cationes bivalentes . En una modalidad alternativa, los anticuerpos de la presente invención son útiles para la yuxtaposición cercana de dos antígenos. Esto es particularmente útil para incrementar la concentración localizada de antígenos, por ejemplo, los pares de enzima-sustrato. 4.4 Manchas Western Las composiciones de la presente invención encontrarán un gran uso en los análisis de inmunomancha o de mancha Western. Los anticuerpos anti-factor de liberación de colecistoquinina luminal, se pueden utilizar como reactivos primarios de alta afinidad para la identificación de proteínas inmovilizadas sobre una matriz de soporte sólida, tal como nitrocelulosa, nylon, o combinaciones de, los mismos. En conjunto con la inmunoprecipitación, seguida por electroforesis en gel, se pueden utilizar como un reactivo de un solo paso para utilizarse en la detección de antígenos contra los cuales los reactivos secundarios utilizados en la detección del antígeno ocasionen un fondo adverso. Esto es especialmente útil cuando los antígenos estudiados sean inmunoglobulinas (precluyendo el uso de los componentes de pared celular bacteriana de fijación de inmunoglobulinas) , cuando los antígenos estudiados reaccionan cruzadamente con el agente detector, o emigran al mismo peso molecular relativo como una señal de reacción cruzada.

Los métodos de detección basados inmunológicamente para utilizarse en conjunto con mancha Western, incluyen anticuerpos secundarios rotulados enzimáticamente, con radioetiqueta, o fluorescentemente, contra la fracción de toxina, y se consideran de un uso particular en este aspecto. 4.5 Vacunas La presente invención contempla vacunas para utilizarse tanto en las modalidades de inmunización activa como pasiva. Las composiciones inmunogénicas, propuestas como adecuadas para utilizarse como una vacuna, se pueden preparar más fácil directamente a partir de péptidos de factor de liberación de colecistoquinina luminal inmunogénicos preparados de una manera dada a conocer en la presente. De preferencia, el material antigénico se dializa extensamente para remover las moléculas de peso molecular pequeño indeseadas, y/o se liofiliza para una formulación más fácil hasta un vehículo deseado. La preparación de vacunas que contienen secuencias de péptido de factor de liberación de colecistoquinina luminal como ingredientes activos, se entiende en general en la técnica, como se ejemplifica en las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 4,608,251; 4,601,903; 4,599,231; 4,599,230; 4,596,792, y 4,578,770, todas incorporadas a la presente como referencia. Típicamente, estas vacunas se preparan como inyectables. También se pueden preparar como soluciones líquidas o suspensiones; formas sólidas adecuadas para solución en, o suspensión en, un líquido, antes de la inyección. Las preparaciones también pueden emulsionarse. El ingrediente inmunogénico activo con frecuencia se mezcla con excipientes, que sean farmacéuticamente aceptables y compatibles con el ingrediente activo. Los excipientes adecuados son, por ejemplo, agua, suero, dextrosa, glicerol, etanol, o similares, y combinaciones de los mismos. En adición, si se desea, la vacuna puede contener cantidades menores de sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsificantes, agentes reguladores del pH, o auxiliares que mejoren la efectividad de las vacunas . Las vacunas se pueden administrar convencionalmente de una manera parenteral, mediante inyección, por ejemplo subcutánea o intramuscular. Las formulaciones adicionales que son adecuadas para otros modos de administración incluyen supositorios, y en algunos casos, formulaciones orales. Para los supositorios, los aglutinantes y vehículos tradicionales pueden incluir, por ejemplo, polialcanglicoles o triglicéridos; estos supositorios se pueden formar a partir de mezclas que contengan el ingrediente activo en la escala de aproximadamente el 0.5 a aproximadamente el 10 por ciento, de preferencia de aproximadamente el 1 a aproximadamente el 2 por ciento. Las formulaciones orales incluyen los excipientes normalmente empleados tales como, por ejemplo, los grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina de sodio, celulosa, carbonato de magnesio, y similares. Estas composiciones, en la forma de soluciones, 5 suspensiones, tabletas, pildoras, cápsulas, formulaciones de liberación sostenida, o polvos, y contienen de aproximadamente el 10 a aproximadamente el 95 por ciento de ingrediente activo, de preferencia de aproximadamente el 25 a aproximadamente el 70 por ciento. 10 Los péptidos derivados de factor de liberación de colecistoquinina luminal de la presente invención, se pueden formular en la vacuna como formas neutras o de sal . Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales de adición de ácido (formadas con los grupos amino libres del péptido) , y aquellas que se forman con ácidos inorgánicos, tales como, por ejemplo, los ácidos clorhídrico o fosfórico, o ácidos orgánicos tales como acético, oxálico, tartárico, mandélico, y similares. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres también se pueden derivar a partir de bases inorgánicas, tales como, por ejemplo, hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio, o férrico, y las bases orgánicas tales como isopropilamina, trimetilamina, 2-etilaminoetanol, histidina, procaína, y similares. Las vacunas se administran de una manera compatible con la formulación de dosificación, y en una cantidad que sea # 92 terapéuticamente efectiva e inmunogénica. La cantidad que se va a administrar depende del sujeto que se vaya a tratar, incluyendo, por ejemplo, la capacidad del sistema inmune del individuo para sintetizar anticuerpos, y el grado de 5 protección deseado. Las cantidades precisas del ingrediente activo requeridas para administrarse dependen del juicio del experto. Sin embargo, las escalas de dosificación adecuadas son del orden de varios cientos de microgramos de ingrediente activo por vacuna. Los regímenes adecuados para la administración inicial y las vacunas de refuerzo también son variables, pero están tipificados por una administración inicial seguida por inoculaciones subsecuentes u otras administraciones . La manera de aplicación puede variar ampliamente. Es aplicable cualquiera de los métodos convencionales para la administración de una vacuna. Se cree que estos incluyen aplicación oral sobre una base sólida fisiológicamente aceptable, o en una dispersión fisiológicamente aceptable, parenteralmente, mediante inyección, o similares. La dosificación de la vacuna dependerá de la vía de administración, y variará de acuerdo con el tamaño del huésped. Diferentes métodos para lograr el efecto auxiliar para la vacuna incluyen el uso de agentes tales como hidróxido o fosfato de aluminio (alum) , comúnmente utilizado como una solución de aproximadamente el 0.05 a aproximadamente el 0.1 por ciento en suero regulado con fosfato, mezclada con polímeros sintéticos de azúcares (CarbopolR) utilizados como una solución a aproximadamente el 0.25 por ciento, la acumulación de la proteína en la vacuna mediante tratamiento por calor con temperaturas entre aproximadamente 70°C y aproximadamente 101 °C durante un período de 30 segundos a 2 minutos, respectivamente. La acumulación mediante la reactivación con anticuerpos tratados con pepsina (Fab) para albúmina, mezcla con células bacterianas tales como C. parvum, o endotoxinas o componentes de lipopolisacárido de bacterias gram-negativas, emulsión en vehículos de aceite fisiológicamente aceptables tales como monooleato de manida (Aracel A) , o emulsión con una solución al 20 por ciento de un perfluorocarbono (Fluosol-DAR) utilizado como un sustituto de bloque, que también se pueden emplear. En muchos casos, será deseable tener administraciones múltiples de la vacuna, que no excedan normalmente de seis vacunas, más usualmente que no excedan de cuatro vacunas, y de preferencia una o más, normalmente cuando menos aproximadamente tres vacunas. Las vacunas normalmente serán a intervalos de 2 a 12 semanas, más usualmente a intervalos de 3 a 5 semanas. Serán deseables refuerzos periódicos a intervalos de 1 a 5 años, normalmente de 3 años, para mantener los niveles protectores de los anticuerpos. El curso de la inmunización puede ser seguido por ensayos por anticuerpos para los antígenos sobrenadantes. Los ensayos se pueden realizar mediante etiquetación con etiquetas convencionales, tales como radionúclidos, enzimas, fluorescentes, y similares. Estas técnicas son bien conocidas, y se pueden encontrar en una amplia variedad de patentes, tales como las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 3,791,932; 4,174,384, y 3,949,064, como ilustrativas de estos tipos de ensayos . 4.6 Segmentos de ADN En otras modalidades, se contempla que se obtendrán ciertas ventajas mediante la colocación del segmento de ADN de codificación bajo el control de un promotor recombinante o heterólogo. Como se utiliza en la presente, un promotor recombinante o heterólogo pretende referirse a un promotor que normalmente no está asociado con un segmento de ADN que codifique un péptido de factor de liberación de colecistoquinina luminal en su medio ambiente natural . Estos promotores pueden incluir promotores normalmente asociados con otros genes, y/o promotores aislados a partir de cualquier célula viral, procariótica (por ejemplo, bacteriana), eucariótica (por ejemplo, fungal, de levadura, de planta, o de animal), y particularmente aquellos de células de mamífero. Naturalmente, será importante emplear un promotor que dirija efectivamente la expresión del segmento de ADN en el tipo de ^4 95 célula, en el organismo, o inclusive en el animal seleccionado para la expresión. El uso de combinaciones de promotor y tipo de célula para la expresión de la proteína, es en general conocido por los expertos en la técnica de biología molecular, 5 por ejemplo ver Sambrook y colaboradores, 1989. Los promotores empleados pueden ser constitutivos o inducibles, y se pueden utilizar bajo las condiciones apropiadas para dirigir una expresión de alto nivel para el segmento de ADN introducido, tal como es conveniente en la producción a gran escala de proteínas o péptidos recombinantes. Los sistemas de promotor/expresión apropiados contemplados para utilizarse en la expresión de alto nivel incluyen, pero no se limitan a, el sistema de vector de expresión Pichia (Pharmacia LKB Biotechnology) , un sistema de baculovirus para la expresión en células de insecto, o cualquier sistema de expresión en levadura o bacteriano adecuado. En relación con las modalidades de expresión para preparar proteínas y péptidos recombinantes, se contempla que con más frecuencia se utilizarán segmentos de ADN más largos, codificando los segmentos de ADN toda la secuencia de péptido que se prefiera más. Sin embargo, se apreciará que el uso de segmentos de ADN más cortos para dirigir la expresión de péptidos de factor de liberación de colecistoquinina luminal o regiones de núcleo epitópicas, tales como se pueden utilizar para generar anticuerpos anti-factor de liberación de colecistoquinina luminal, también cae dentro del alcance de la invención. Se contemplan como particularmente útiles los segmentos de ADN que codifican antígenos de péptido de factor de liberación de colecistoquinina luminal de aproximadamente 5 10 a aproximadamente 100 aminoácidos de longitud, o más preferiblemente de aproximadamente 20 a aproximadamente 80 aminoácidos de longitud, o todavía de una manera más preferible de aproximadamente 30 a aproximadamente 70 aminoácidos de longitud. 10 En adición a su uso para dirigir la expresión de péptidos de factor de liberación de colecistoquinina luminal de la presente invención, las secuencias de ácido nucleico contempladas en la presente también tienen una variedad de otros usos. Por ejemplo, también tienen utilidad como sondas o cebadores en las modalidades de hibridación de ácido nucleico. Como tales, se contempla que los segmentos de ácido nucleico que comprenden una región de secuencia que consista en cuando menos una secuencia contigua de aproximadamente 14 nucleótidos de largo que tenga la misma secuencia que, o sea complementaria para, un segmento de ADN contiguo de aproximadamente 14 nucleótidos de largo de la SEQ ID N0:2, encontrará una utilidad particular. Las secuencias idénticas o complementarias contiguas más largas, por ejemplo aquellas de aproximadamente 20, 30, 40, 50, 100, 200 (incluyendo todas las longitudes intermedias) , e inclusive aquellas de hasta e incluyendo aproximadamente 220 pares de bases (de longitud completa), también serán útiles en ciertas modalidades. La capacidad de estas sondas de ácido nucleico para hibridarse específicamente en secuencias que codifiquen factor de liberación de colecistoquinina luminal, les hará posible ser útiles en la detección de la presencia de secuencias complementarias en una muestra dada. Sin embargo, se prevén otros usos, incluyendo el uso de la información de secuencia para la preparación de cebadores de especies mutantes, o cebadores para utilizarse en la preparación de otras construcciones genéticas. Las moléculas de ácido nucleico que tienen regiones de secuencia que consisten en estiramientos de nucleótidos contiguos de aproximadamente 14, 15-20, 30, 40, 50, o inclusive de aproximadamente 100 a aproximadamente 200 nucleótidos, idénticos o complementarios para la secuencia de ADN de la SEQ ID NO : 2 , se contemplan como sondas de hibridación para utilizarse, por ejemplo, en mancha Southern y Northern. Los fragmentos más pequeños generalmente encontrarán uso en las modalidades de hibridación, en donde se puede variar la longitud de la región complementaria contigua, tal como entre aproximadamente 10 y 14, y hasta aproximadamente 100 nucleótidos, pero se pueden utilizar estiramientos de complementariedad contiguos más grandes, de acuerdo con la longitud de las secuencias complementarias que uno desee detectar. El uso de una sonda de hibridación de aproximadamente 14 nucleótidos de longitud, permite la formación de una molécula dúplex que es tanto estable como 5 selectiva. Aunque en general se prefieren las moléculas que tienen secuencias complementarias contiguas sobre estiramientos mayores de 14 bases de longitud, con el objeto de incrementar la estabilidad y la selectividad del híbrido, y de esta manera mejorar la calidad y el grado de moléculas híbridas específicas obtenidas. En general se preferirá diseñar moléculas de ácido nucleico que tengan estiramientos complementarios del gen de aproximadamente 15 a aproximadamente 20 nucleótidos contiguos, o todavía más largos en donde se desee. 15 Por supuesto, también se pueden obtener fragmentos mediante otras técnicas, tales como, por ejemplo, mediante desgarre mecánico o mediante disección con enzima de restricción. Los segmentos o fragmentos de ácido nucleico pequeños se pueden preparar fácilmente mediante, por ejemplo, síntesis directa del fragmento mediante elementos químicos, como se practica comúnmente utilizando un sintetizador de oligonucleótidos automatizado. También, se pueden obtener fragmentos mediante la aplicación de tecnología de reproducción de ácido nucleico, tal como PCRMR, mediante la introducción de secuencias seleccionadas en vectores recombinantes para la producción recombinante, y mediante otras técnicas de ADN recombinante generalmente conocidas por los expertos en el campo de la biología molecular. De conformidad con lo anterior, las secuencias de 5 nucleótidos de la invención se pueden utilizar por su capacidad para formar selectivamente moléculas dúplex con estiramientos complementarios de fragmentos de ADN. Dependiendo de la aplicación prevista, se deseará emplear condiciones variables de hibridación para alcanzar diferentes grados de selectividad de la sonda hacia la secuencia objetivo. Para las aplicaciones que requieran de una alta selectividad, típicamente se deseará emplear condiciones relativamente estringentes para formar los híbridos, por ejemplo, se seleccionarán condiciones de sal relativamente baja y/o alta temperatura, tales como se proporcionan por NaCl de aproximadamente 0.02 M a aproximadamente 0.15 M a temperaturas de aproximadamente 50°C a aproximadamente 70°C. Estas condiciones selectivas toleran poco, en su caso, mal acoplamiento entre la sonda y la plantilla o la cadena objetivo, y serían particularmente adecuadas para aislar segmentos de ADN que codifiquen factor de liberación de colecistoquinina luminal . La detección de segmentos de ADN por medio de hibridación es bien conocida por los expertos en este campo, y los ejemplos de los métodos de análisis de hibridación son las enseñanzas de las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 4,965,188 y 5,176,995 (cada una incorporada a la presente como referencia) . Son particularmente pertinentes las enseñanzas que se encuentran en los textos de Malov y colaboradores, 1994; Segal, 1976; Prokop, 1991; y Kuby, 1994. Por supuesto, para algunas aplicaciones, por ejemplo, en donde se desee preparar mutantes empleando una cadena de cebador mutante hibridada a una plantilla subyacente, en donde se busque aislar secuencias que codifiquen factor de liberación de colecistoquinina luminal a partir de especies relacionadas, equivalentes funcionales, o similares, típicamente se necesitarán condiciones de hibridación menos rigurosas, con el objeto de permitir la formación del heteroduplex. En estas circunstancias, se puede desear emplear condiciones tales como sal de aproximadamente 0.15 M a aproximadamente 0.9 M, a temperaturas de aproximadamente 20 °C a aproximadamente 55 °C. De esta manera se pueden identificar fácilmente las especies de hibridación cruzadas como señales de hibridación positiva con respecto a las hibridaciones de control. En cualquier caso, se aprecia en general que las condiciones se pueden hacer más estringentes mediante la adición de cantidades crecientes de formamida, que sirve para desestabilizar el dúplex híbrido de la misma manera que la mayor temperatura. Por consiguiente, las condiciones de hibridación se pueden manipular fácilmente, y por lo tanto, serán en general un método de elección, dependiendo de los resultados deseados . En ciertas modalidades, serán conveniente emplear secuencias de ácido nucleico de la presente invención en combinación con un elemento apropiado, tal como una etiqueta, para determinar la hibridación. En la técnica se conocen una amplia variedad de elementos indicadores apropiados, incluyendo ligandos fluorescentes, radioactivos, enzimáticos, u otros ligandos, tales como avidina/biotina, que son capaces de dar una señal detectable. En las modalidades preferidas, posiblemente se deseará emplear una etiqueta fluorescente o un rótulo enzimático, tal como ureasa, fosfatasa alcalina, o peroxidasa, en lugar de reactivos radioactivos u otros reactivos indeseables para el medio ambiente. En el caso de los rótulos enzimáticos, se conocen los sustratos indicadores colorimétricos, que se pueden emplear para proporcionar un medio visible para el ojo humano, o espectrofotométricamente, para identificar la hibridación específica con muestras que contengan ácido nucleico complementario. En general, se prevee que las sondas de hibridación descritas en la presente serán útiles tanto como reactivos en la hibridación en solución, así como en las modalidades que empleen una fase sólida. En las modalidades que empleen una fase sólida, el ADN (o el ARN) de prueba se absorbe o se fija de otra manera a una matriz o superficie seleccionada. Este ácido nucleico de una sola cadena fijado se somete entonces a hibridación específica con sondas seleccionadas bajo las condiciones deseadas. Las condiciones seleccionadas dependerán de las circunstancias particulares, basándose en los criterios particulares requeridos (dependiendo, por ejemplo, del contenido de G+C, del tipo de ácido nucleico objetivo, de la fuente de ácido nucleico, del tamaño de la sonda de hibridación, etcétera) . En seguida del lavado de la superficie hibridada, para remover las moléculas de sonda no específicamente fijadas, se detecta la hibridación específica, o inclusive se cuantifica, por medio de la etiqueta. 4.7 Equivalentes Funcionales Biológicos Se pueden hacer modificaciones y cambios en la estructura de los péptidos de la presente invención y segmentos de ADN que los codifican, y todavía se puede obtener una molécula funcional que codifique una proteína o péptido con características deseables. La siguiente es una discusión basada en el cambio de los aminoácidos de una proteína para crear una molécula de segunda generación equivalente, o inclusive mejorada. Los cambios de aminoácidos se pueden lograr mediante el cambio de los codones de la secuencia de ADN, de acuerdo con la siguiente tabla de codones: TABLA 3 Aminoácidos Codones Alanina Ala A GCA GCC GCG GCU Cisteína Cys C UGC UGU Acido aspártico Asp D GAC GAU Acido glutámico Glu E GAA GAG Fenilalanina Phe F UUC UUU Glicina Gly G GGA GGC GGG GGU Histidina His H CAC CAU Isoleucina He I AUA AUC AUU Lisina Lys K AAA AAG Leucina Leu L UUA UUG CUA CUC CUG CUU Metionina Met M AUG Asparagina Asn N AAC AAU Prolina Pro P CCA CCC CCG CCU Glutamina Gln Q CAÁ CAG Arginina Arg R AGA AGG CGA CGC CGG CGU Serina Ser S AGC AGU UCA UCC UCG UCU Treonina Thr T ACA ACC ACG ACU Valina Val V GUA GUC GUG GUU Triptófano Trp W UGG Tirosina Tyr Y UAC UAU Por ejemplo, ciertos aminoácidos pueden ser sustituidos por otros aminoácidos en la estructura de la proteína sin una pérdida apreciable de la capacidad de fijación interactiva, con estructuras como, por ejemplo, 5 regiones de fijación de antígeno de anticuerpos, o sitios de fijación sobre moléculas de sustrato. Ya que es la capacidad interactiva y la naturaleza de una proteína lo que define la actividad funcional biológica de esa proteína, se pueden hacer ciertas sustituciones de la secuencia de aminoácidos en una secuencia de proteína, y por supuesto, en su secuencia de codificación de ADN subyacente, y no obstante, obtener una proteína con propiedades iguales. Por consiguiente, los inventores contemplan que se pueden hacer diferentes cambios en las secuencias de péptido de las composiciones dadas a conocer, o en las secuencias de ADN correspondientes que codifiquen a estos péptidos, sin una pérdida apreciable de su T|P.. utilidad o actividad biológica. Al hacer estos cambios, se puede considerar el índice hidropático de los aminoácidos. La importancia del índice de aminoácidos hidropático para conferir la función biológica interactiva a una proteína, se entiende en general en la técnica (Kyte y Doolittle, 1982, incorporado a la presente como referencia) . Se acepta que el carácter hidropático relativo del aminoácido contribuye a la estructura secundaria de la proteína resultante, lo cual a su vez define la interacción de la proteína con otras moléculas, por ejemplo, enzimas, sustratos, receptores, ADN, anticuerpos, antígenos, y similares. A cada aminoácido se le ha asignado un índice hidropático con base en su hidrofobicidad y en sus características de carga (Kyte y Doolittle, 1982) ; éstos son: isoleucina (+4.5); valina (+4.2); leucina (+3.8); fenilalanina (+2.8); cisteína/cistina (+2.5); metionina (+1.9); alanina (+1.8); glicina (-0.4); treonina (-0.7); serina (-0.8); triptófano (-0.9); tirosina (-1.3); prolina (-1.6); histidina (-3.2); glutamato (-3.5); glutamina (-3.5); aspartato (-3.5); asparagina (-3.5); lisina (-3.9); y arginina (-4.5). En la técnica se sabe que ciertos aminoácidos pueden ser sustituidos por otros aminoácidos que tengan un índice o puntaje hidropático similar, y todavía darán como resultado una proteína con una actividad biológica similar, es decir, todavía obtendrán una proteína biológicamente funcionalmente equivalente. Al hacer estos cambios, se prefiere la sustitución de aminoácidos cuyos índices hidropáticos estén dentro de +2, se prefieren particularmente aquellos dentro de +1, y se prefieren todavía más particularmente aquellos dentro de +0.5. También se entiende en este campo, que la sustitución de aminoácidos similares se puede hacer efectivamente con base en la hidrofilicidad. La Patente de los ro 4,554,101, incorporada a la presente como referencia, informa que la mayor hidrofilicidad promedio local de una proteína, como es regulada por la hidrofilicidad de sus aminoácidos adyacentes, 5 se correlaciona con una propiedad biológica de la proteína. Como se detalla en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,554,101, se han asignado los siguientes valores de hidrofilicidad a los residuos de * aminoácidos: arginina (+3.0); lisina (+3.0); aspartato (+3.0 + 1); glutamato (+3.0 + 1); serina (+0.3); asparagina (+0.2); glutamina (+0.2); glicina (0); treonina -0.4); prolina (-0.5 + 1); alanina (-0.5); histidina (-0.5); cisteína (-1.0); metionina (-1.3); valina (-1.5); leucina (-1.8); isoleucina (-1.8); tirosina (-2.3); fenilalanina (-2.5); triptófano (-3.4) . Se entiende que un aminoácido puede ser sustituido por otro que tenga un valor de hidrofilicidad similar, y todavía se obtendrá una proteína biológicamente equivalente, y en particular, una proteína inmunológicamente equivalente.

Estos cambios, se prefiere la sustitución de aminoácidos cuyos valores de hidrofilicidad están dentro de ± 2, se prefieren i particularmente aquellos que están dentro de + 1, y se prefieren todavía más particularmente aquellos dentro de + 0.5. 25 Como se ilustró anteriormente, las sustituciones de aminoácidos se basan en general, por consiguiente, en la similitud relativa de los sustituyentes de cadena lateral de aminoácidos, por ejemplo, en su hidrofobicidad, hidrofilicidad, carga, tamaño, y similares. Las sustituciones de ejemplo que toman varias de las características anteriores en consideración son bien conocidas por los expertos en la técnica, e incluyen: arginina y lisina; glutamato y aspartato; serina y treonina; glutamina y asparagina; y valina, leucina, e isoleucina. 4.8 Mutagénesis Específica del Sitio La mutagénesis específica del sitio es una técnica útil en la preparación de péptidos individuales, o de proteínas o péptidos equivalentes biológicamente funcionales, a través de mutagénesis específica del ADN subyacente. La técnica proporciona además una capacidad para preparar y probar variantes de secuencia, por ejemplo, incorporando una o más de las consideraciones anteriores, mediante la introducción de uno o más cambios en la secuencia de nucleótidos, adentro del ADN. La mutagénesis específica del sitio permite la producción de mutantes a través del uso de secuencias de oligonucleótidos específicas que codifiquen la secuencia de ADN de la mutación deseada, así como un número suficiente de nucleótidos adyacentes, para proporcionar una secuencia de cebador de un tamaño y complejidad de secuencia suficientes para formar un dúplex estable sobre ambos lados de la unión de supresión que se esté tratando. Típicamente, se prefiere un cebador de aproximadamente 17 a 25 nucleótidos de i longitud, alterándose de aproximadamente 5 a 10 residuos sobre ambos lados de la unión de la secuencia. 5 En general, la técnica de mutagénesis específica del sitio es bien conocida en este campo, como se ejemplifica por diferentes publicaciones. Como se apreciará, la técnica típicamente emplea un vector fago que existe tanto en la forma de una sola cadena como de doble cadena. Los vectores típicos útiles en la mutagénesis dirigida al sitio incluyen vectores tales como el fago M13. Estos fagos están fácilmente disponibles comercialmente, y su uso es en general bien conocido por los expertos en la materia. También se emplean como rutina plásmidos de doble cadena en la mutagénesis dirigida al sitio, que elimina el paso de transferir el gen de interés desde un plásmido hasta un fago. En general, la mutagénesis dirigida al sitio de conformidad con la presente, se realiza obteniendo primero un . vector de una sola cadena, o fundiendo aparte dos cadenas de ¡20 un vector de doble cadena que incluya adentro de su secuencia, j una secuencia de ADN que codifique el péptido deseado. Un i cebador de oligonucleótido que lleve la secuencia mutada deseada se prepara en general sintéticamente. Luego este ¡ cebador se templa con el vector de una sola cadena, y se somete a enzimas de polimerización de ADN, tales como fragmentos Klenow de polimerasa I de E. coli , con el objeto de completar la síntesis de la cadena que lleva mutación. Por consiguiente, se forma un heteroduplex, en donde una cadena codifica la secuencia no mutada original, y la segunda cadena lleva la mutación deseada. Este vector heteroduplex se utiliza entonces para transformar las células apropiadas, tales como células de E. coli, y se seleccionan los clones que incluyan vectores recombinantes que lleven la configuración de la secuencia mutada. La preparación de las variantes de secuencia de los segmentos de ADN que codifican el péptido seleccionado, utilizando mutagénesis dirigida al sitio, se proporciona como un medio para producir especies potencialmente útiles, y no es limitante, ya que hay otras maneras en que se pueden obtener variantes de secuencia de péptidos, y las secuencias de ADN que los codifican. Por ejemplo, los vectores recombinantes que codifiquen la secuencia de péptido deseada, se pueden tratar con agentes mutagénicos, tales como hidroxilamina, para obtener variantes de secuencia. 4.9 Anticuerpos Monoclonales Los medios para la preparación y caracterización de los anticuerpos son bien conocidos en este campo (ver, por ejemplo, Harlow y Lañe, 1988; incorporado a la presente como referencia) . Los métodos para la generación de anticuerpos monoclonales (mAbs) generalmente empiezan a lo largo de las mismas líneas que aquellos para la preparación de anticuerpos policlonales. Dicho de una manera breve, un anticuerpo policlonal se prepara mediante la inmunización de un animal 5 con una composición inmunogénica de conformidad con la presente invención, y recolectando el antisuero de ese animal inmunizado. Se pueden utilizar un amplio rango de especies I i animales para la producción de antisueros. Típicamente, el animal utilizado para la producción del anti-antisuero es un I 10 conejo, un ratón, una rata, un hámster, un conejillo de ! Indias, o una cabra. Debido al volumen de sangre relativamente grande de los conejos, una elección preferida para la producción de anticuerpos policlonales es un conejo. Como es bien conocido en este campo, una composición dada puede variar en su inmunogenicidad. Con frecuencia es necesario, por consiguiente, reforzar el sistema inmune del huésped, como se puede lograr mediante el acoplamiento de un ' inmunógeno de péptido o polipéptido con un portador. Los 1 portadores de ejemplo y preferidos son hemocianina limpete de 20 orificio (HLO) y albúmina de suero bovino (ASB) . También se pueden utilizar como portadores otras albúminas, tales como ovalbúmina, albúmina de suero de ratón, o albúmina de suero de conejo. Los medios para conjugar un polipéptido con una proteína portadora, son bien conocidos en la materia, e 25 incluyen glutaraldehído, éster de m-maleimidobenzoil-N- hidroxisuccinimida, carbodiimida, y benzidina-bis-biazotizada. Como también es bien conocido en esta materia, se puede mejorar la inmunogenicidad de una composición de inmunógeno particular mediante la utilización de estimulantes 5 no específicos de la respuesta inmune, conocidos como auxiliares. Los auxiliares de ejemplo y preferidos incluyen auxiliar de Freund completo (un estimulante no específico de ! la respuesta inmune, que contiene Mycobacterium tuberculosis muertas) , auxiliares de Freund incompletos, y auxiliar de 0 hidróxido de aluminio. La cantidad de composición de inmunógeno utilizada en la producción de anticuerpos policlonales varía con la 1 naturaleza del inmunógeno, así como con el animal utilizado para la inmunización. Se pueden emplear una variedad de vías 5 para administrar el inmunógeno (subcutánea, intramuscular, intradérmica, intravenosa, e intraperitoneal) . La producción de anticuerpos policlonales se puede monitorear mediante el muestreo de la sangre del animal inmunizado en diferentes I I puntos en seguida de la inmunización. También se puede dar una 0 segunda inyección de refuerzo. El proceso de refuerzo y titulación se repite hasta que se alcance una titulación adecuada. Cuando se obtiene un nivel deseado de inmunogenicidad, el animal inmunizado se puede sangrar, y el I suero se puede aislar y almacenar, y/o se puede utilizar el 5 animal para generar anticuerpos monoclonales.

Los anticuerpos monoclonales se pueden preparar fácilmente a través del uso de técnicas bien conocidas, tales como aquellas ejemplificadas en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,196,265, incorporada a la presente como referencia. Típicamente, esta técnica involucra inmunizar un animal adecuado con una composición de inmunógeno seleccionada, por ejemplo, una proteína, polipéptido, o péptido de factor de liberación de colecistoquinina luminal - purificado o parcialmente purificado. La composición inmunizadora se administra de una manera efectiva para estimular las células productoras de anticuerpos. Los roedores, tales como los ratones y las ratas, son los animales preferidos; sin embargo, también es posible el uso de células de conejo, de oveja y de rana. El uso de ratas puede proporcionar ciertas ventajas (Goding, 1986) , pero se prefieren los ratones, prefiriéndose más el ratón BALB/c, ya que éste se utiliza más rutinariamente, y en general da un porcentaje más alto de fusiones estables. i En seguida de la inmunización, se seleccionan las células somáticas con el potencial para producir anticuerpos, especialmente linfocitos B (células B) para utilizarse en el protocolo de generación de anticuerpos monoclonales. Estas células se pueden obtener a partir de bazos, amígdalas, o nodos linfáticos biopsiados, o a partir de una muestra de sangre periférica. Se prefieren las células de bazo y las células de sangre periférica, las primeras debido a que son una fuente rica en células productoras de anticuerpos que están en la etapa de plasmablasto en división, y las últimas debido a que la sangre periférica es fácilmente accesible. Con frecuencia, se habrá inmunizado un panel de animales, y se removerá el bazo del animal con la titulación de anticuerpos más alta, y se obtendrán los linfocitos del bazo mediante la homogenización del bazo con una jeringa. Típicamente, un bazo ?^- de un ratón inmunizado contiene de aproximadamente 5 x 107 a 2 x 108 linfocitos. Los linfocitos de productores de anticuerpos a partir del animal inmunizado, se funden entonces con las células de una célula de mieloma inmortal, generalmente una de la misma especie que el animal que se inmunizó. Las lineas celulares de mieloma adecuadas para utilizarse en los procedimientos de fusión productores de hibridoma, de preferencia no son productoras de anticuerpos, tienen una alta eficiencia de fusión, y deficiencias enzimáticas que las hacen entonces incapaces de crecer en ciertos medios selectivos que apoyen el crecimiento de solamente las células fundidas deseadas (hibridomas) . Se puede utilizar cualquiera de un número de células de mieloma, como es conocido por los expertos en este campo (Goding, 1986; Campbell, 1984). Por ejemplo, en donde el animal inmunizado sea un ratón, se puede utilizar P3-X63/Ag8, X63-Ag8.653, NSl/l.Ag 4 1, Sp210-Agl4, FO, NSO/U, MPC-11, MPC11-X45-GTG 1.7 y S194/5XX0 Bul; para ratas, se puede utilizar R210.RCY3, Y3-Ag 1.2.3, IR983F, y 4B210; y U-266, GM1500-GRG2, LICR-LON-HMy2 , y UC729-6 son todos útiles en 5 relación con las fusiones de células humanas. Una célula de mieloma de murino preferida es la línea celular de mieloma NS-1 (también denominada P3-NS-l-Ag4- 1) , que está fácilmente disponible en NIGMS Human Genetic Mutant Cell Repository, mediante la solicitud del número de 0 reposición de la línea celular GM3573. Otra línea celular de t mieloma de ratón que se puede utilizar, es la línea celular no productora de mieloma de murino de ratón resistente a 8- azaguanina SP2/0. Los métodos para la generación de híbridos de bazo 5 productor de anticuerpos o células de nodos linfáticos y células de mieloma, normalmente comprenden mezclas las células somáticas con las células de mieloma en una proporción de 2:1, aunque la proporción puede variar de 20:1 a aproximadamente 1:1, respectivamente, en la presencia de un agente o agentes 0 (químicos o eléctricos) que promuevan la fusión de las ' membranas celulares. Se han descrito los métodos de fusión utilizando virus Sendai (Kohier y Milstein, 1975; 1976) , y aquellos que utilizan polietilenglicol (PEG) , tal como polietilenglicol al 37 por ciento (volumen/volumen) , por 5 Gefter y colaboradores (1977) . También es apropiado el uso de método de fusión eléctricamente inducidos (Goding, 1986) . Los procedimientos de fusión normalmente producen híbridos viables a bajas frecuencias, de aproximadamente 1 x 10~6 a 1 x 10 "8. Sin embargo, esto no presenta un problema, ya que los híbridos fundidos viables se diferencian de las células no fundidas parentales (particularmente las células de mieloma no fundidas que normalmente continuarían dividiéndose indefinidamente) , mediante el cultivo en un medio selectivo. El medio selectivo es en general uno que contenga un agente que bloquee la síntesis de novo de los nucleótidos en el medio de cultivo de tejido. Los agentes de ejemplo y preferidos son aminopterina, metotrexato, y azaserina. La aminopterina y el metotrexato bloquean la síntesis de novo tanto de purinas como de pirimidinas, mientras que la azaserina bloquea solamente la síntesis de purina. En donde se utilice aminopterina o metotrexato, el medio se complementa con hipoxantina y timidina como una fuente de nucleótidos (medio HAT) . En donde utilice azaserina, el medio se complementa con hipoxantina. El medio de selección preferido es HAT. Solamente las células capaces de operar las trayectorias de salvamento de nucleótidos, pueden sobrevivir en el medio HAT. Las células de mieloma son defectuosas en enzimas clave de la trayectoria de salvamento, por ejemplo, la transferasa de fosforribosilo de hipoxantina (HPRT) , y no pueden sobrevivir. Las células B pueden operar esta trayectoria, pero tienen un lapso de vida limitado en cultivo, y en general mueren dentro de aproximadamente 2 semanas. Por consiguiente, las únicas células que pueden sobrevivir en el medio selectivo, son , aquellas híbridas formadas a partir de células de mieloma y células B. Este cultivo proporciona una población de hibridomas a partir de la cual se seleccionan los hibridomas específicos. Típicamente, la selección de los hibridomas se realiza ^^F* mediante el cultivo de las células por dilución de un solo 10 clon en placas de microtitulación, seguida por la prueba de los sobrenadantes clónales individuales (después de aproximadamente 2 a 3 semanas) por la reactividad deseada. El ensayo debe ser sensible, simple, y rápido, tal como radioinmunoensayos, inmunoensayos enzimáticos, ensayos de 15 citotoxicidad, ensayos de placa, ensayos de inmunofij ación de punto, y similares. Los hibridomas seleccionados entonces se diluirían en serie, y se clonarían en las líneas celulares productoras ¡ de anticuerpos individuales, cuyos clones se pueden propagar entonces indefinidamente para proporcionar anticuerpos monoclonales. Las líneas celulares se pueden explotar para la producción de anticuerpos monoclonales de dos maneras básicas. Se puede inyectar una muestra del hibridoma (con frecuencia en la cavidad peritoneal) en un animal histocompatible del tipo que se utilizó para proporcionar las células somáticas y de mieloma para la fusión original. El animal inyectado desarrolla tumores que secretan el anticuerpo monoclonal específico producido por el híbrido celular fundido. Los fluidos del cuerpo del animal, tales como el fluido de suero o ascitas, se pueden sacar entonces para proporcionar anticuerpos monoclonales en una alta concentración. Las líneas celulares individuales también se podrían cultivar in vi tro, en donde los anticuerpos monoclonales se secretan naturalmente hacia el medio de cultivo, desde donde se pueden obtener fácilmente en altas concentraciones. Los anticuerpos monoclonales producidos por cualquier medio, se pueden purificar adicionalmente, si se desea, empleando filtración, centrifugación, y diferentes métodos cromatográficos, tales como cromatografía de líquido de alta presión, o cromatografía por afinidad. 4.10 Composiciones Farmacéuticas Las composiciones farmacéuticas dadas a conocer en la presente se pueden administrar oralmente, por ejemplo, con un diluyente inerte o con un vehículo comestible asimilable, o se pueden encerrar en una cápsula de gelatina de cubierta dura o blanda, o se pueden comprimir en tabletas, o se pueden incorporar directamente con el alimento de la dieta. Para la administración terapéutica oral, los compuestos activos se pueden incorporar con excipientes, y se pueden utilizar en la forma de tabletas ingeribles, tabletas bucales, trociscos, cápsulas, elíxires, suspensiones, jarabes, obleas, y similares. Estas composiciones y preparaciones deben contener cuando menos el 0.1 por ciento de compuesto activo. El porcentaje de las composiciones y preparaciones, por supuesto, se puede variar, y convenientemente puede ser entre aproximadamente el 2 y aproximadamente el 60 por ciento del peso de la unidad. La cantidad de compuestos activos en estas composiciones terapéuticamente útiles es tal que se obtendrá una dosificación adecuada. Las tabletas, trociscos, pildoras, cápsulas, y similares, también pueden contener lo siguiente: un aglutinante, como goma de tragacanto, acacia, almidón de maíz, o gelatina; excipientes, tales como difosfato de calcio; un agente desintegrante, tal como almidón de maíz, almidón de papa, ácido algínico y similares; un lubricante, tal como estearato de magnesio; y se puede agregar un agente edulcorante, tal como sacarosa, lactosa, o sacarina, o un agente saborizante, tal como menta, aceite de gaulteria, o saborizante de cereza. Cuando la forma de dosificación unitaria es una cápsula, puede contener, en adición a los materiales del tipo anterior, un vehículo líquido. Puede haber otros diferentes materiales presentes como recubrimientos, o para modificar de otra manera la forma física de la unidad de dosificación. Por ejemplo, las tabletas, pildoras, o cápsulas pueden estar recubiertas con shellac, azúcar, o ambos. Un jarabe de elíxir puede contener a los compuestos activos de sacarosa como un agente edulcorante, metil- y propil-parabenos como conservadores, un colorante y un saborizante, tal como saborizante de cereza o de naranja. Por supuesto, cualquier '5 material utilizado en la preparación de cualquier forma de unidad de dosificación debe ser farmacéuticamente puro y sustancialmente no tóxico en las cantidades empleadas. En adición, los compuestos activos se pueden incorporar en preparaciones y formulaciones de liberación sostenida. 0 Los compuestos activos también se pueden administrar parenteralmente o intraperitonealmente . Se pueden preparar soluciones de los compuestos activos como la base libre o como sales farmacológicamente aceptables en agua adecuadamente mezclada con un tensoactivo, tal como hidroxipropilcelulosa. 5 También se pueden preparar dispersiones en glicerol, polietilenglicoles líquidos, y mezclas de los mismos, y en aceites. Bajo condiciones ordinarias de almacenamiento y uso, estas preparaciones contienen un conservador para impedir el crecimiento de microorganismos. 0 Las formas farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles, y polvos estériles para la preparación extemporánea ! de soluciones o dispersiones inyectables estériles. En todos los casos, la forma debe ser estéril, y debe ser fluida hasta 5 el grado en que exista un fácil paso por jeringa. Debe ser estable bajo las condiciones de fabricación y almacenamiento, y debe conservarse contra la acción contaminante de los microorganismos, tales como bacterias y hongos. El vehículo puede ser un solvente o un medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, y polietilenglicol líquido, y similares) , mezclas adecuadas de los mismos, y aceites vegetales. La fluidez apropiada se puede mantener, por ejemplo, mediante la utilización de un recubrimiento, tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partículas requerido en el caso de la dispersión, y mediante la utilización de tensoactivos. La prevención de la acción de los microorganismos se puede provocar mediante diferentes agentes antibacterianos y antifungales, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal, y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo azúcares o cloruro de sodio. La absorción prolongada de las composiciones inyectables se puede provocar mediante la utilización, en las composiciones, de agentes que demoren la absorción, por ejemplo monoestearato de aluminio y gelatina. Las soluciones inyectables estériles se preparan mediante la incorporación de los compuestos activos en la cantidad requerida en el solvente apropiado, con otros diferentes ingredientes enumerados anteriormente, según se requiera, seguido por esterilización filtrada. En general, las te la incorporación de los diferentes ingredientes activos esterilizados en un vehículo estéril que contenga el medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente . En el 5 caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos de preparación preferidos son técnicas de secado al vacío y secado por congelación, que produzcan un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente adicional deseado, a partir de una solución previamente filtrada estéril del mismo. Como se utiliza en la presente, "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye cualquiera y todos los solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifungales, agentes isotónicos y demoradores de la absorción, y similares. El uso de estos medios y agentes para sustancias activas farmacéuticas, es bien conocido en este campo. Excepto hasta donde cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el ingrediente activo, se contempla su uso en las composiciones terapéuticas. También se pueden incorporar ingredientes activos complementarios en las composiciones. La frase "farmacéuticamente aceptable" se refiere a entidades moleculares y composiciones que no produzcan una reacción alérgica o adversa similar cuando se administren a un ser humano. La preparación de una composición acuosa que ^^^*- contenga una proteína como un ingrediente activo, es bien entendida en este campo. Típicamente, estas composiciones se preparan como inyectables, bien sea como soluciones o suspensiones líquidas; también se pueden preparar formas sólidas adecuadas para solución en, o suspensión en, un líquido antes de la inyección. La preparación también se puede emulsionar. La composición se puede formular en una forma neutra o de sal. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales de adición de ácido (formadas con los grupos amino libres de la proteína) , y que se formen con ácidos inorgánicos, tales como, por ejemplo, ácidos clorhídrico o fosfórico, o ácidos orgánicos, tales como acético, oxálico, tartárico, mandélico, y similares. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres también se pueden derivar a partir de bases inorgánicas, tales como, por ejemplo, hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio, o férrico, y bases orgánicas tales como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaína, y similares. 20 Sobre la formulación, las soluciones se administrarán de una manera compatible con la formulación de la dosificación, y en una cantidad tal que sea terapéuticamente efectiva. Las formulaciones se administran fácilmente en una variedad de formas de dosificación, tales como soluciones inyectables, cápsulas de liberación del fármaco, y similares. Para la administración parenteral en una solución acuosa, por ejemplo, la solución debe regularse adecuadamente si es necesario, y el diluyente líquido se hace primero isotónico con suficiente suero o glucosa. Estas soluciones acuosas particulares son especialmente adecuadas para administración intravenosa, intramuscular, ' subcutánea, e intraperitoneal. En relación con esto, el medio acuoso estéril que se puede emplear será conocido por los expertos en la materia, a la luz de la presente descripción. Por ejemplo, una dosificación se podría disolver en 1 mililitro de una solución de NaCl isotónica, y se agrega a 1,000 mililitros de fluido de hipodermóclisis, o se inyecta en el sitio de infusión propuesto (ver, por ejemplo, "Remington's Pharmaceutical Sciences", 15a Edición, páginas 1035-1038 y 1570-1580). Necesariamente se presentará alguna variación en la dosificación, dependiendo de la condición del sujeto que se esté tratando. La persona responsable de la administración, en cualquier caso, determinará la dosis apropiada para el sujeto individual. Más aún, para la administración a seres humanos, la preparación debe cumplir con las normas de esterilidad, pirogenicidad, seguridad y pureza generales, requeridas por los estándares de la Oficina de Biología de la FDA. La secreción de colecistoquinina en ratas y seres humanos es inhibida por los proteasas pancreáticas y los ^B***' ácidos biliares del intestino. Se ha hipotetizado que la inhibición ocasionada por las proteasas pancreáticas se debe a la inactivación proteolítica de un péptido liberador de colecistoquinina presente en la secreción intestinal. Para 5 purificar este péptido secretor putativo, se recolectaron secreciones intestinales mediante la perfusión de una fístula Thiry-Vella modificada de yeyuno en ratas despiertas, y se utilizaron estas secreciones como material de partida. Se concentró un péptido a partir de las secreciones intestinales mediante ultrafiltracisn y mediante cromatografía de fase inversa de baja presión, y se purificaron mediante cromatografía de líquido de alta presión de fase inversa. La pureza se confirmó mediante electroforesis capilar de alta presión. Las fracciones se ensayaron por la actividad liberadora de colecistoquinina, por su capacidad para estimular la secreción de la proteína pancreática al introducirse en el intestino delgado proximal de ratas conscientes. | Las fracciones parcialmente purificadas estimularon I 20 fuertemente la secreción pancreática y la liberación de colecistoquinina, y el bloqueo del receptor de colecistoquinina abolió la respuesta pancreática. El análisis de aminoácidos y el análisis espectral de masas mostraron que el péptido purificado tiene aproximadamente 70 residuos de aminoácidos, y una masa de aproximadamente 8,136 daltones. La composición de aminoácidos del factor de liberación de colecistoquinina luminal es como sigue (aminoácido/número de residuos): Ala/4; Arg/1; Asp/9 ; Cys/N.D.; Glu/11; Gly/6; His/1; Ile/2; Leu/5; Lys/2 ; Met/0; Phe/2, Pro/7 ; Ser/7; Thr/7 ; Trp/N.D.; Tyr/2; Val/3 (N.D. = no determinado en el análisis). El análisis de microsecuencia del factor de liberación de colecistoquinina luminal produjo una secuencia de aminoácidos para 41 aminoácidos, como sigue: 0 STFWAYQPDGDNDPTDYQKYEHTSSPSQLLAPGDYPCVIEV.

Cuando se introdujo intraduodenalmente, el péptido purificado estimuló la proteína pancreática y la secreción de fluido de una manera relacionada con la dosis en ratas 5 despiertas, y elevó de una manera significativa los niveles de colecistoquinina en plasma. La cromatografía por inmunoafinidad utilizando antisueros criados para factor de I ' liberación de colecistoquinina luminal.,.6 sintético, indicó que la actividad liberadora de colecistoquinina de la secreción 0 intestinal se debía a un péptido con la secuencia de aminoácidos anterior. Estos estudios demuestran la primera caracterización química de un péptido entérico secretado luminalmente que funciona como un regulador intraluminal de la liberación de hormona intestinal. = El mediador intraluminal de la regulación de ^*9^n> retroalimentación sensible a la proteasa de la secreción de colecistoquinina se purificó a partir de secreciones intestinales recolectadas mediante la perfusión de una vuelta aislada de yeyuno en ratas despiertas. La secreción intestinal 5 pareció ser una mejor fuente de este factor que los extractos intestinales. Esto puede ser debido a que los extractos intestinales podrían contener otros liberadores de colecistoquinina que pueden no ser liberados hacia el lumen intestinal. 10 Para purificar el factor de liberación de colecistoquinina luminal, se recolectaron secreciones intestinales mediante la perfusión de una fístula Thiry-Vella modificada de yeyuno en ratas despiertas, y estas secreciones se utilizaron como el material de partida. El péptido se concentró a partir de secreciones intestinales mediante ultrafiltración y mediante cromatografía de fase inversa de baja presión. Se purificó mediante cromatografía de líquido de alta presión de fase inversa. La pureza se confirmó mediante electroforesis capilar de alta presión. Las fracciones se t 20 ensayaron por la actividad liberadora de colecistoquinina, por su capacidad para estimular la secreción de proteína pancreática al introducirse en el intestino delgado proximal de ratas conscientes. Las fracciones parcialmente purificadas estimularon fuertemente la secreción pancreática y la liberación de colecistoquinina, y el bloqueo del receptor de cslecistoquinina anuló la respuesta pancreática. El análisis de aminoácidos y el análisis espectral de masas mostraron que el péptido purificado tiene aproximadamente 70 aminoácidos, y una masa de 8136 + 1 por ciento daltones. El análisis de microsecuencia del factor de liberación de colecistoquinina luminal produjo una secuencia de aminoácido N-terminal para 41 de los aminoácidos, como sigue: STFWAYQPDGDNDPTDYQKYEHTSSPSQLLAPGDYPCVIEV.

Cuando se introdujo intraduodenalmente, el péptido purificado estimuló la proteína pancreática y la secreción de fluido de una manera relacionada con la dosis en ratas despiertas, y elevó de una manera significativa los niveles de colecistoquinina en plasma. La cromatografía por inmunoafinidad, utilizando antisueros criados para factor de liberación de colecistoquinina luminal1.6 sintético, confirmó que la secuencia de aminoácidos descrita en la presente era aquella de un péptido liberador de colecistoquinina presente en la secreción intestinal. La presente invención demuestra la primera caracterización química de un péptido entérico luminalmente secretado que funciona como un regulador intraluminal de la liberación de hormona intestinal. Los estudios de respuesta a la dosis con factor de liberación de colecistoquinina luminal intestinal purificado, mostraron una curva bifásica, produciendo la dosis más alta una proteína pancreática submáxima y respuesta de fluido. Una curva de respuesta a la dosis bifásica similar para la liberación de colecistoquinina estimulada por el péptido monitor, fue reportada por Cuber y colaboradores (1990) en estudios que utilizaron intestino de rata aislado, vascularmente perfundido. Estos investigadores sugirieron que la curva bifásica puede reflejar la desensibilización de los receptores sobre las células enteroendócrinas que secretan colecistoquinina en concentraciones más altas del péptido liberador. Los cambios paralelos en la producción de fluido y en la producción de proteína en el jugo pancreático, sugirieron que el factor de liberación de colecistoquinina luminal tiene actividad liberadora de secretina, así como actividad liberadora de colecistoquinina. Sin embargo, la secreción de fluido pancreático en la rata durante la desviación del jugo biliar-pancreático depende mucho de la colecistoquinina, como es demostrado por Taguchi y colaboradores (1992) , quienes demostraron que la producción de fluido muy elevada en las ratas de jugo biliar-pancreático desviado, casi se anuló por el bloqueo de receptor de colecistoquinina , en paralelo con una disminución en la producción de proteína. Debido a que la desviación del jugo pancreático en la rata estimula la liberación de secretina, el estímulo de la producción de fluido por el factor de liberación de colecistoquinina luminal intestinal se puede interpretar como un reflejo de los mayores niveles de 5 secreción de fluido que aumenta la colecistoquinina estimulada por un fondo de elevada secreción de secretina (Sun y colaboradores, 1982) . Esto también es consistente con la eliminación virtual de la respuesta del fluido pancreático al ?9- factor de liberación de colecistoquinina luminal parcialmente purificado, por el antagonista del receptor de colecistoquinina, MK-329, en los estudios presentados en la presente . El factor de liberación de colecistoquinina luminal es efectivo para liberar colecistoquinina en la rata en una dosis de 3 microgramos (3 µg) aplicados intraduodenalmente . Esto se traduce a aproximadamente 10 µg/kg/rata. De una manera conservadora, esto sugiere que una dosis efectiva para la liberación de colecistoquinina en un hombre de 70 kilogramos, sería de aproximadamente 1 miligramo. Para un tratamiento efectivo, se cree que ésta es la cantidad que tendría que estar disponible en el intestino (duodeno o yeyuno) . Por consiguiente, debe estar presente aproximadamente 1 miligramo de factor de liberación de colecistoquinina luminal activo en el duodeno para provocar máximamente la liberación de colecistoquinina en un ser humano de 70 kilogramos. Sin las medidas protectoras que no sean un alimento, se esperaría que sólo aproximadamente del 1 al 2 por ciento sobrevivirían a los procesos digestivos (DiMagno y colaboradores, 1986) , significando que se podrían requerir de 50 a 100 miligramos como una dosis oral efectiva. Si está acompañado por supresores de la secreción de ácido, la mayor parte (del 70 al 80 por ciento) del péptido debe sobrevivir al paso por estómago, y se debe aplicar al duodeno, es decir, debe ser efectiva una dosis de 2 a 3 miligramos de factor de liberación de colecistoquinina luminal con Pepcid o Tagamet, especialmente si se toma con un alimento. Si el agente de péptido se formula con un inhibidor de la proteasa pancreática, y se toma con un medicamento supresor de ácido, : posiblemente se podría esperar una liberación del 100 por ciento (siendo entonces efectiva una dosis de 1 miligramo o menos de factor de liberación de colecistoquinina luminal) . De la misma manera, si se hace una forma químicamente modificada de factor de liberación de colecistoquinina luminal, resistente a la digestión en el estómago y el intestino, sería efectiva en dosis de 1 miligramo o menos. Como se describió, para un péptido dado oralmente en una forma no protegida, la digestión del péptido en el estómago y en el intestino podría ocasionar grandes pérdidas de actividad. Esto es análogo al complemento con enzimas digestivas oralmente administradas en la enfermedad pancreática, en donde la mayor parte de las enzim administradas son destruidas en el estómago por ácido/pepsina. La neutralización del contenido gástrico c supresores de la secreción de ácido gástrico (por ejempl Tagamet, Zantac, o Pepcid) previene la inactivación gástri de los complementos de enzimas digestivas orales (DiMagno colaboradores) , y un protocolo similar protegerá a l formulaciones de factor de liberación de colecistoquini luminal oralmente administradas también. El Pepcid y Tagamet están ahora disponibles sin receta, y se espera que Zantac lo esté en el futuro cercano. Las formulacion protectoras adicionales podrían incluir un recubrimien entérico de microesferas que encapsulen al agente, de t manera que las microesferas no liberen su contenido sino has que lleguen al duodeno. Con estas medidas, se esperaría que 2 a 3 miligramos de factor de liberación de colecistoquini luminal tomado oralmente, darían como resultado que llega aproximadamente 1 miligramo al duodeno. La forma dosificación oral del factor de liberación de colecistoquini luminal, sus fragmentos activos, sus derivados o análogo pueden estar en cualquier forma administrable conveniente, t como una solución, suspensión, tableta, cápsula, u otr conocidas por los expertos en este campo. 5.0 Ejemplos Los siguientes ejemplos se incluyen para demostr las modalidades preferidas de la invención. Debe ser apreciado por los expertos en este campo, que las técnicas dadas a conocer en los siguientes ejemplos representan las técnicas descubiertas por los inventores, que funcionan bien en la práctica de la invención, y por consiguiente, se puede considerar que constituyen los modos preferidos para su práctica. Sin embargo, los expertos en la técnica, a la luz de la presente descripción, deben apreciar que se pueden hacer muchos cambios en las modalidades específicas que se dan a conocer, y todavía obtendrán un resultado igual o similar, sin apartarse del espíritu y alcance de la invención. 5.0.1 Materiales Se criaron antisueros #94113 y #22322 en conejos, en la instalación de núcleo de anticuerpo CURE, y por Quality Controlled Biochemicals, Inc. (Hopkinton, MA) , para factor de liberación de colecistoquinina luminal-^g y factor de liberación de colecistoquinina luminal7_23. El inhibidor de fijación de diazepam recombinante (IFD-^g ) , fue proporcionado por Jens Knudsen (Universidad de Odense, Odense, Dinamarca) . El IFD33_50 (ODN) y el péptido liberador de gastrina (PLG) se obtuvieron en Península Laboratories, Inc. (Belmont, CA) . El péptido monitor (PM) recombinante se preparó como se describe en Liddle (Liddle y colaboradores, 1984) . 5.0.2 Métodos 5.0.2.1 Preparación del Tejido Las ratas macho Wistar, con un peso entre 300 y 350 gramos, se pusieron en ayuno durante la noche. Las ratas se anestesiaron con pentobarbital (Nembutal, Abbott, Chicago, IL) . Se removieron el cerebro y el tallo cerebral de las ratas perfundidas con paraformaldehído al 4 por ciento. Se removieron los ganglios nudosos con secciones del nervio vago, esófago, estómago, duodeno, páncreas, y glándulas adrenales, de ratas no perfundidas, y se fijaron durante 1 a 2 días en una solución de Zamboni/Es. Todo el tejido se crioprotegió subsecuentemente en dos cambios de sacarosa al 30 por ciento durante 2 días. Algo de cada muestra de tejido, con la excepción del cerebro y el tallo cerebral, se embebió en gel de yema de huevo, y se seccionó en rebanadas de 30 mieras, en un micrótomo deslizante, para la inmunohistoquímica de sección flotante. El cerebro y el tallo cerebral se seccionaron en secciones de 30 mieras mediante el microtomo deslizante, sin embeberse en gel de yema de huevo. Se congelaron muestras de tejido adicionales en un Compuesto Tej ido-Tek OCT (Miles, Inc. , Elkhart, IN) , se seccionaron sobre un crióstato, y se montaron para descongelación sobre placas Superfrost (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) para los estudios del antígeno, utilizando las secciones adyacentes. 5.0.2.2 Empotramiento en Gel de Huevo En seguida de la fijación y de la crioprotección, todos los tejidos, con la excepción del cerebro y el tallo cerebral, se empotraron en "gel de huevo" antes de la inmunohistoquímica de sección flotante. La gelatina se preparó al 6 por ciento y al 12 por ciento, 2 horas antes de empotrarse, y se almacenó a 37 °C, para permitir que se disiparan las burbujas. Se vertió una capa de gelatina al 12 por ciento en el molde que se iba a utilizar para el empotramiento, y se almacenó plana hasta endurecerse. El tejido se remojó en gelatina al 6 por ciento a 37 °C durante 15 minutos, luego se transfirió y se remojó en gelatina al 12 por ciento justo antes del empotramiento. Los huevos de pollo se llevaron hasta la temperatura ambiente antes del empotramiento. Un huevo se rompió y se decantó la clara. Toda la clara se removió dando vueltas a la yema sobre un papel filtro, y la yema se mezcló con gelatina al 12 por ciento en una proporción de 1:1. El tejido se removió de la gelatina al 12 por ciento, y se puso en el molde sobre la base de gelatina. La mezcla de gelatina de yema se vertió sobre el tejido, teniendo cuidado de no introducir burbujas, y se enfrió en el refrigerador durante 15 minutos. Los moldes se sumergieron en paraformaldehído al 4 por ciento frío, y se refrigeraron durante la noche, y luego se incubaron a la temperatura ambiente durante 24 horas. El bloque de tejido se removió del molde, y flotó en paraformaldehído al 4 por ciento durante varios días, y luego flotó en paraformaldehído al 4 por ciento con sacarosa al 20 por ciento durante 2 días . 5.0.2.3. Inmunohistoquímica Las secciones de tejido de flotación libre sufrieron 5 seis lavados de 10 minutos en suero regulado con fosfato 0.05 M, una incubación de 20 minutos en f nilhidrazina al 0.10 por ciento (volumen/volumen) (Fisher, Pittsburgh, PA) , seguido por cuatro lavados adicionales de 10 minutos en suero regulado con potasio y fosfato 0.05 M. Luego se incubaron las secciones de 0 tejido en anticuerpo primario diluido a 1:160,000 en suero ! regulado con potasio y fosfato 0.05 M, con Triton-X 100 al 0.4 por ciento (volumen/volumen) durante 60 minutos a 22°C, y luego durante 2 días a 4°C. En seguida de la incubación, los tejidos sufrieron seis lavados de 10 minutos en suero regulado 5 con potasio y fosfato 0.05 M. Los tejidos se incubaron en una solución de IgG de cabra biotinilada anti-conejo (Vector #BA1000) diluida a 1:600 en suero regulado con potasio y fosfato 0.05 M con Triton-X 100 al 0.4 por ciento a la temperatura ambiente durante 1 hora, luego se enjuagaron cinco 0 veces durante 10 minutos con suero regulado con potasio y fosfato 0.05 M. Se mezclaron avidina y biotina con peroxidasa de rábano (HRP, Vector, ABC Élite) en una proporción de 45 mililitros con 45 mililitros de biotina en 10 mililitros de suero regulado con potasio y fosfato 0.05 M con Triton-X 100 5 al 0.4 por ciento, y luego se incubaron durante 30 minutos a la temperatura amb ente. El tejido se incubó con el complejo de avidina-biotina durante 1 hora a la temperatura ambiente. En seguida de la incubación, el tejido se enjuagó tres veces durante 5 minutos con suero regulado con potasio y fosfato 5 0.05 M, y luego tres veces durante 5 minutos con acetato de sodio 0.175 M. El cromógeno utilizado fue de 2 miligramos de diaminobenzadina (Fluka, Suiza) , 250 miligramos de sulfato de níquel (II), 8.3 mililitros de peróxido de hidrógeno al 3 por # ciento, y 10 mililitros de acetato de sodio 0.175 M. Las secciones de tejido se incubaron en cromógeno durante 8 a 10 minutos bajo una observación directa. Cuando se obtuvo un teñido óptimo, las reacciones se detuvieron con tres enjuagues de 5 minutos en acetato de sodio 0.175 M, seguidos por tres enjuagues de 5 minutos en suero regulado con potasio y fosfato 0.05 M. Las secciones flotantes se montaron sobre placas Superfrost plus, se contra-tiñeron con rojo neutro, y se deshidrataron a través de una serie de enjuagues con alcohol desde el 50 por ciento hasta el 100 por ciento. Los tejidos se aclararon con xileno, y los cubreobjetos se montaron con Histomount (Kimberly Research, Atlanta, GA) . 5.0.2.4 Caracterización del Antisuero Se determinó la concentración óptima del antisuero para los estudios inmunohistoquímicos a través de una escala de concentración de -log 2. La especificidad del teñido se determinó mediante la preabsorción de la solución de antisuero con factor de liberación de colecistoquinina luminal1.35 terminal interno a 150 mM, o solución de control durante 1 hora, antes de que se agregara el antisuero a las secciones de tejido. La dilución de antisuero óptima para los estudios inmunohistoquímicos se determinó mediante titulación del anticuerpo primario a través de una serie de diluciones desde 1:1000 hasta 1:320,000. 5.0.2.4.5. Ensayos 5.0.2.4.5.1 Ensayo de Proteína Se midió la producción de proteína en el jugo pancreático mediante la determinación de la densidad óptica a 280 nanómetros de muestras diluidas en regulador Tris 0.01 M (pH de 7.8), y se expresó como miligramos/30 minutos, utilizando tripsinógeno bovino como el estándar. La producción de fluido se midió mediante jeringa Hamilton, y se estimó hasta el más cercano 0.001 mililitro. 5.0.2.4.5.2 Bioensayo de Colecistoquinina Se determinó la colecistoquinina en plasma mediante un bioensayo validado basado en la liberación de amilasa a partir de acinos pancreáticos aislados. Se utilizó la misma preparación para probar los efectos directos del factor de liberación de colecistoquinina luminal.,_35 sobre los acinos pancreáticos . 5.1 Ejemplo 1 Aislamiento y Caracterización del Factor de Liberación de Colecistoquinina Luminal 5.1.1 Aislamiento Las ratas macho Wistar, con un peso entre 325 y 375 gramos, se pusieron en ayuno durante la noche. Bajo anestesia con metoxifurano (Metofano, Pitman-Moore) , las ratas se prepararon con una fístula Thiry-Vella modificada de yeyuno. El yeyuno se transectó en dos puntos, a 5 centímetros y a 30 centímetros del ligamento de Treitz . Se cerró el extremo proximal de la fístula yeyunal, y se insertó una cánula de infusión Silastic. El extremo cortado distal se llevó hasta el exterior, y se aseguró al peritoneo y a la fascia subcutánea.

Se restableció la continuidad del intestino mediante una anastomosis de extremo con extremo (duodeno con el yeyuno restante) . Las ratas se dejaron 3 días para recuperarse de la cirugía antes de que se iniciara la recolección de las secreciones intestinales. Durante la recuperación y entre las recolecciones, se perfundió continuamente la vuelta Thiry-Vella a 2 mililitros/hora durante aproximadamente 14 horas/hora, con una dieta de tipo elemental (Vital, 0.05 kilocalorías/mililitro, Ross Laboratories, Columbus, OH). El propósito de la introducción de la dieta fue prevenir la atrofia mucosal de la vuelta aislada. A los animales se les dejó alimento para roedores normal y agua al gusto después de la cirugía. Los procedimientos quirúrgicos son técnicas convencionales, y se describen en Guan y colaboradores, 1990.

Se introdujo suero (NaCl 0.15 M) a 0.5 mililitros/minuto durante 1 hora, para deslavar cualquier dieta restante en el lumen de la fístula, seguido por suero a 1.0 mililitros/minuto durante 5 horas para enjuagar las 5 secreciones intestinales que contenían el péptido liberador de colecistoquinina intestinal (300 mililitros de secreción intestinal diluida por rata al día) . Las secreciones intestinales diluidas (lavado intestinal) se recolectaron sobre hielo, y al final del período de recolección (5 horas) , el lavado se hirvió durante 10 minutos, se enfrió, y luego se filtró a través de un papel filtro Whatman número 4. El lavado se almacenó a 5°C antes de que se emprendiera el aislamiento de la proteína. 5.1.2 Purificación 15 En un cuarto frío (a 5°C), el lavado intestinal se filtró a través de una membrana de disco Amicon YM-30 (corte de peso molecular de 30,000), utilizando una celda agitada Amicon de alta producción, y luego se concentró 100 veces utilizando una membrana de disco Amicon YM-1 (corte de peso '20 molecular de 1,000). Los concentrados se almacenaron a -70°C.

El lavado concentrado se concentró adicionalmente y se purificó mediante la utilización de una cadena de Sep-Paks C18 (Millipore, Milford, MA) . Se enlazaron cinco Sep-Paks C18 (modelo clásico) entre sí, utilizando tubería Silastic (volumen de elución de aproximadamente 5 mililitros) . La cadena Sep-Pak se acondicionó con etanol al 100 por ciento, seguido por ácido acético al 0.1 por ciento. Los concentrados (100 mililitros) se cargaron sobre la cadena Sep-Pak. Subsecuentemente, la cadena se lavó con ácido acético al 0.1 por ciento. El péptido liberador de colecistoquinina intestinal se eluyó a partir de la cadena Sep-Pak, lavando la cadena con concentraciones crecientes de etanol en ácido acético al 0.1 por ciento. Los extractos en etanol se almacenaron a 5°C antes de otra purificación mediante cromatografía de líquido de alta presión. Las muestras concentradas se diluyeron cinco veces con trifluoroacetato al 0.1 por ciento, y se cargaron mediante inyecciones repetidas de 4 mililitros sobre una columna de cromatografía de líquido de alta presión, de fase inversa Vydac C-18 equilibrada en trifluoroacetato al 0.1 por ciento. Después de la carga, la columna se enjuagó con trifluoroacetato al 0.1 por ciento, hasta que la absorbencia regresó al valor que estaba antes de la inyección. La muestra se eluyó entonces con un gradiente hasta el 50 por ciento de acetonitrilo, conteniendo trifluoroacetato al 0.1 por ciento. Se supervisaron las absorbencias a 220 y a 280 nanómetros, y se recolectaron los picos. 5.1.3 Análisis Las muestras que contenían proteína de la cromatografía de líquido de alta presión, se analizaron mediante electroforesis capilar de alto rendimiento (ECAR) , para evaluar la pureza de la muestra. Una muestra de 5 mililitros se diluyó tres veces con fosfato de sodio 0.1 M, pH de 2 , y se colocó sobre un Aparato de Electroforesis Capilar de Alto Rendimiento Beckman 9600. La muestra se pasó de acuerdo con las condiciones recomendadas por los fabricantes, y los datos se analizaron mediante el software System Gold. La electroforesis capilar de alto rendimiento reveló la elución de un solo componente mayor (Figura 3) . Un contaminante que se eluyó a los 20.7 minutos, fue menor del 1 por ciento del área del pico mayor. Este contaminante estaba presente en los controles con regulador, y por consiguiente, no representó un componente aislado de los lavados intestinales. El material eluido representó una sola proteína pura . Una alícuota (50 mililitros) de la muestra de la electroforesis capilar de alto rendimiento, se secó al vacío.

La muestra se hidrolizó con HCl gaseoso durante 24 horas, y luego se secó al vacío. La muestra hidrolizada se cargó sobre un analizador de aminoácidos automatizado Applied Biosystems, y se analizó de acuerdo con los procedimientos recomendados por los fabricantes . El análisis mostró la composición de aminoácidos del factor de liberación de colecistoquinina luminal como se muestra en la Tabla 4.

* TABLA 4 Aminoácido Mo. de resi dúos Aminoácido No. de : residuos Ala 4 Lys 2 Arg 1 Met 0 Asp 9 Phe 2 Cys N . D . Pro 7 Glu 11 Ser 7 He 2 Tyr 2 Leu 5 Val 3 Aproximadamente el 7 por ciento del factor de liberación de colecistoquinina luminal purificado (100 mililitros) se cargó sobre un Secuenciador de Péptidos Applied Biosystems, con análisis PTH automático. Se realizaron tres análisis sobre dos muestras purificadas por separado. Un análisis de secuencia dio asignaciones de residuos conclusivas hasta la posición 41. Los otros dos análisis de secuencia dieron resultados similares, con la excepción de que la asignación de residuos no fue conclusiva después de la posición 30. La última designación de una sola letra para la secuencia de aminoácidos determinada, es como sigue: STFWAYQPDGDNDPTDYQKYEHTSSPSQLLAPGDYPCVIEV (SEQ ID NO:l) ícuotas pequeñas de factor de liberación de colecistoquinina luminal (de 5 a 10 mililitros) mediante electroaspersión, sobre un espectrómetro de masas cuadrapolo Sciex operado en el modo positivo. El análisis del factor de liberación de colecistoquinina luminal detectó un ion de masa arriba de los valores establecidos. La masa del factor de liberación de colecistoquinina luminal se midió a 8136.5 daltones, indicando que se determinó aproximadamente 2/3 de la secuencia del factor de liberación de ; 10 colecistoquinina luminal. El factor de liberación de colecistoquinina luminal tiene un tamaño molecular de 8136 daltones + 1 por ciento, determinado mediante análisis espectral de masas. Asumiendo un peso molecular promedio basado en los análisis de la composición, el número estimado de residuos de aminoácidos está en alguna parte alrededor de 69-73 residuos de aminoácidos. La composición de aminoácidos del factor de liberación de colecistoquinina luminal indica que contiene tres residuos básicos que pueden representar sitios de disociación de tripsina potenciales. Estos sitios son consistentes con la observación de que el factor de liberación es inactivado por la tripsina (Miyasaka y colaboradores, 1989) . La secuencia de aminoácidos determinada para las primeras 2/3 de la molécula del factor de liberación de * colecistoquinina luminal, se comparó con las secuencias de un programa de investigación que incluye las bases de datos SWISS-PROT, PIR, GenPept, y GenPept . Las homologías más cercanas para las secuencias de aproximadamente 30 5 aminoácidos, no fueron mayores de aproximadamente el 35 por ciento, mientras que la homología más cercana para las secuencias menores de 5 aminoácidos o más, fue de aproximadamente el 60 por ciento. * 5.2 Ej emplo 2 10 Actividad Biológica del Factor de Liberación de Colecistoquinina Luminal 5.2.1 Bioensayos Un bioensayo en vivo para la actividad de liberación de colecistoquinina, fue una modificación de los métodos descritos por Miyasaka y colaboradores (1992) . Se prepararon ratas macho Wistar con cánulas pancreática, biliar, duodenal, y de la vena yugular. En estos animales, el jugo pancreático se desvió del intestino para prevenir la inactivación proteolítica de los péptidos infundidos, y se infundió taurocolato intradérmicamente para suprimir la alta liberación basal de colecistoquinina ocasionada por la desviación del jugo pancreático. Se insertaron dos cánulas en el duodeno para el retorno del jugo biliar-pancreático, y para infusión de los péptidos bioactivos. Se insertó una cánula de la vena yugular para las muestras de sangre para el bioensayo de colecistoquinina. Durante la recuperación y entre los experimentos, se recolectaron el jugo pancreático y la bilis, y se regresaron continuamente al intestino mediante un servomecanismo consistente en un tubo de recolección en un 5 detector del nivel de líquido acoplado con una bomba peristáltica. Durante los experimentos, se recolectó el jugo pancreático, y el 10 por ciento de la secreción recolectada se regresó al duodeno. Este modelo de regreso parcial del jugo pancreático tiene la ventaja de mantener la supresión de la 10 secreción pancreática basal, pero reduce el umbral para el estímulo por los inhibidores de tripsina y la proteína dietética. La racionalización para utilizar esto en el estudio del factor de liberación de colecistoquinina luminal.,_35 fue bajar el umbral para el estímulo de la secreción pancreática por el péptido, de una manera análoga a la infusión del inhibidor de tripsina bajo las mismas condiciones. A las 0:800 horas de los días post-operativos 4-7, las ratas se pusieron en ayuno, y su jugo pancreático se desvió del duodeno. Tres horas más tarde, la bilis también se desvió, y se introdujo taurocolato de sodio 40 mM conteniendo bicarbonato de sodio 100 mM intraduodenalmente a 1 mililitro/hora durante 3 horas, para establecer una velocidad secretora pancreática estable. Luego se inyectaron las muestras intraduodenalmente, y se calculó la proteína pancreática y la respuesta de fluido, sustrayendo la salida en < el último período de recolección basal de 15 minutos, por la salida en la primera recolección de 15 minutos en seguida de la inyección de la solución de prueba. Se establecieron bioensayos in vi tro basados en la 5 capacidad del factor de liberación de colecistoquinina luminal para estimular la secreción de colecistoquinina desde las células de la mucosa intestinal aislada (Bouras y colaboradores, Liddle 1995) , o desde las células de colecistoquinina purificadas por FACS. Las preparaciones in vitro respondieron a los factores de liberación de colecistoquinina, tal como el péptido monitor, KCl, y factor de liberación de colecistoquinina luminal. Se utilizaron uno o el otro de estos ensayos in vi tro, junto con el bioensayo de rata en vivo descrito, para seguir la purificación del factor de liberación de colecistoquinina luminal desde los lavados intestinales concentrados. Se utilizaron los ensayos in vi tro para confirmar los ensayos in vivo . Para verificar que la colecistoquinina era la hormona que estimulaba el páncreas en el bioensayo, se determinó el efecto del bloqueo del receptor de colecistoquinina (MK-329) sobre las respuestas secretoras pancreáticas a la infusión intraduodenal de factor de liberación de colecistoquinina luminal parcialmente purificado. El factor de liberación de colecistoquinina luminal parcialmente purificado se infundió intraduodenalmente como se describió anteriormente, y se determinaron la proteína pancreática y la secreción de fluido en seguida de la inyección intravenosa de MK-329 o de vehículo. También se midieron los niveles de colecistoquinina en plasma durante los 5 experimentos de inyección de vehículo, para asegurar que el bioensayo estuviera realmente midiendo la actividad liberadora de colecistoquinina de las preparaciones. 5.2.2 Bioactividad de Factor de Liberación de Colecistoquinina Luminal 10 Las fracciones (de 100 a 200 mililitros) recolectadas a partir de la cromatografía de líquido de alta presión de los lavados intestinales, como se describieron en el Ejemplo 5.1, se sometieron a evaporación en Speed-Vac durante aproximadamente 30 minutos para remover el acetonitrilo. Se agregó 1 mililitro de ácido acético al 0.1 por ciento, y las muestras se cargaron entonces sobre un solo Sep-Pak C18. Los Sep-Paks se lavaron con etanol al 100 por ciento, seguido por ácido acético al 0.1 por ciento. Después de la carga, se utilizaron 1.5 mililitros de etanol al 70 por ciento en ácido acético al 0.1 por ciento para la elución. El volumen de la muestra se redujo mediante el Speed-Vac hasta aproximadamente 100 mililitros; se agregó 1 mililitro de suero, y el pH se ajustó a de aproximadamente 6 a 7 con NaOH 0.1 N. 25 Se encontró bioactividad en los eluentes de la * cadena Sep-Pak C18, tanto en la fracción de etanol al 40 por ciento como al 60 por ciento. La cromatografía de líquido de alta presión de fase inversa de la fracción de etanol al 60 por ciento, produjo un pico con una bioactividad débil, pero 5 este pico también contenía algunas impurezas . La cromatografía de líquido de alta presión de fase inversa de la fracción de etanol al 40 por ciento produjo un solo pico con absorbencia en 220 y 280 nanómetros, que estuvo asociado con la * bioactividad del factor de liberación de colecistoquinina luminal (Figura 2) . Los tubos de control antes y después de este pico no tuvieron bioactividad. Una vez que se determinaron la preparación y las condiciones de cromatografía, cada preparación de factor de liberación de colecistoquinina luminal pasado por cromatografía (n=6) tuvo bioactividad en la misma posición que se muestra en la Figura 2. Las diferencias en las preparaciones incluyeron la cantidad de factor de liberación de colecistoquinina luminal purificado, y el nivel de contaminantes observados en otras regiones del cromatograma. 20 El factor de liberación de colecistoquinina luminal intestinal purificado se inyectó intraduodenalmente en diferentes dosis, y se supervisó la proteína pancreática y la respuesta secretora de fluido. Se inyectaron lentamente 1 miligramo (n = 5) , 2 miligramos (n = 5) , 3 miligramos (n = 2) , Y miligramos (n = 2) de factor de liberación de colecistoquinina luminal puro, o NaCl 0.15 M (n = 5) en el duodeno de las ratas de bioensayo, y se supervisaron los cambios en la proteína pancreática y en la secreción de fluido. Las respuestas que se ven con 3 miligramos y 7 miligramos no fueron evaluadas estadísticamente, debido al pequeño número de inyecciones. La inyección de 2 miligramos del polipéptido incrementó de una manera significativa la proteína pancreática y la secreción de fluido por 3.5 veces y 3.1 veces, respectivamente, comparándose con el suero. Los resultados, ilustrados en la Figura 4, muestran que la respuesta secretora pancreática al factor de liberación de colecistoquinina luminal intestinal purificado está relacionada con la dosis y es bifásica, ocasionando la dosis más alta (7 miligramos) una respuesta sustancialmente más baja que la dosis máximamente efectiva (3 miligramos) . De una manera alternativa, las muestras concentradas que contenían factor de liberación de colecistoquinina luminal parcialmente purificado, se sometieron a cromatografía de filtración en gel Sephadex. La filtración en gel incrementó la bioactividad específica 100 veces, comparándose con las muestras obtenidas después de la separación de cadena Sep-Pak. Los bioensayos in vivo e in vi tro de esta preparación parcialmente purificada, se condujeron como se describió anteriormente . Se retiró 1 mililitro de sangre 15 minutos después de las inyecciones de factor de liberación de colecistoquinina luminal para las determinaciones de colecistoquinina en plasma. La colecistoquinina en plasma se midió mediante el bioensayo descrito en Liddle y colaboradores (1984) . Se repitieron las inyecciones de factor de liberación de colecistoquinina luminal en la presencia de MK-329 (bolo intravenoso de 0.5 miligramos/kilogramo), un antagonista del receptor de colecistoquinina-A específico (proporcionado por el Dr. Víctor J. Lotti, Merck Sharp & Dohme, West Point, PA) . El MK-329 se disolvió en sulfóxido de dimetilo: Tween 80: suero (1:1:3), y se inyectó intravenosamente 1 hora antes de la inyección del factor de liberación de colecistoquinina luminal parcialmente purificado. Se determinó el efecto de una infusión intraduodenal de factor de liberación de colecistoquinina luminal parcialmente purificado sobre los niveles de colecistoquinina en plasma y sobre la secreción de proteína pancreática. Se inyectaron lentamente 200 miligramos de factor de liberación de colecistoquinina luminal en 1 mililitro de NaCl 0.15 M, o el NaCl solo (durante aproximadamente 1 minuto) en el duodeno de las ratas del bioensayo. Se retiró 1 mililitro de sangre 15 minutos después de las inyecciones . Las inyecciones de factor de liberación de colecistoquinina luminal se repitieron al día siguiente durante el bloqueo del receptor de colecistoquinina-A con MK-329. Como se muestra en la Figura 1, el factor de liberación de colecistoquinina luminal tuvo un efecto que •4» incrementó de una manera significativa los niveles de colecistoquinina en plasma 4.8 veces, comparándose con el suero (NaCl 0.15 M). La proteína pancreática y las respuestas de fluido crecientes al factor de liberación de colecistoquinina luminal fueron 4.2 veces y 2.6 veces más altas, respectivamente, que las que se ven con la infusión de suero. El MK-329 abolió completamente la respuesta secretora pancreática al factor de liberación de colecistoquinina luminal parcialmente purificado. Estos resultados proporcionaron una fuerte evidencia de que el factor que se está purificando ee un péptido liberador de colecistoquinina, y que las respuestas secretoras pancreáticas observadas con el bioensayo se deben a la liberación de colecistoquinina. 5.3 Ej emplo 3 15 Experimentos de Inmunoafinidad Para confirmar que la secuencia de aminoácidos reportada era de hecho aquella de un péptido liberador de colecistoquinina, se hicieron estudios de cromatografía por inmunoafinidad para remover selectivamente la bioactividad del factor de liberación de colecistoquinina luminal de los lavados intestinales. Estos estudios determinaron que la secuencia atribuida al factor de liberación de colecistoquinina luminal no era aquella del contaminante de proteína. Se descubrió que los anticuerpos policlonales criados contra varios fragmentos de factor de liberación de colecistoquinina luminal sintético se fijan específicamente al factor de liberación de colecistoquinina luminal, y bloquean la actividad del factor de liberación de colecistoquinina luminal, confirmando de esta manera que la secuencia determinada era aquella de un péptido liberador de colecistoquinina . Se produjeron antisueros mediante métodos convencionales en conejos para el factor de liberación de colecistoquinina luminal sintético (hexapéptido N-terminal en las posiciones 1-6 de la SEQ ID N0:1) conjugado con hemocianina limpete de orificio. Este antisuero (anticuerpo de factor de liberación de colecistoquinina luminal) o el suero de conejo normal (SCN, control) se acopló con el gel Bio-Rad Affi-Gel 10. Una muestra de factor de liberación de colecistoquinina luminal obtenida de la ultrafiltración de los lavados intestinales de rata, se aplicó al gel acoplado con suero de conejo normal, y al gel acoplado con anticuerpo de factor de liberación de colecistoquinina luminal, y se incubaron durante la noche a 4°C. Después de 16 horas, cada gel se transfirió a un soporte de columna, y el material no fijado se eluyó de la columna con NaCl ÍM (Paso de Elución 1) . Subsecuentemente se aplicó HCl 20 mM a cada columna, con el objetivo de eluir el material fijado al anticuerpo, mediante la interrupción de la interacción del anticuerpo-antígeno (Paso de Elución 2) . Los eluentes del paso 1 y del paso 2 se concentraron utilizando Sep-Paks C18 y Speed-Vac. Los eluentes se ensayaron por la actividad liberadora de colecistoquinina, mediante el estímulo de la secreción de proteína pancreática en ratas conscientes. También se descubrió que los antisueros se fijan selectivamente a algunas células y tejidos, tales como el intestino delgado, el estómago, el páncreas, los ganglios nudosos, y el cerebro. La incubación del factor de liberación de colecistoquinina luminal parcialmente purificado con el gel acoplado con antisuero (efluente desde la columna de anticuerpo de factor de liberación de colecistoquinina luminal) , disminuyó de una manera significativa la bioactividad del material recuperado desde el gel . El factor de liberación de colecistoquinina luminal se incubó durante la noche con un gel de inmunoafinidad (Bio-Rad Affi-gel 10) , al cual se le acopló antisuero de factor de liberación de colecistoquinina luminal 1-6 (Ac-FLCL) , o suero de conejo normal (SCN) . Al día siguiente, el material no fijado se eluyó a partir de los soportes de la columna, y se ensayó por la bioactividad del factor de liberación de colecistoquinina luminal (secreción de proteína pancreática) . El gel acoplado al anticuerpo de factor de liberación de colecistoquinina luminal1_g aparentemente fijó el factor de liberación de colecistoquinina luminal, como se indica por la bioactividad significativamente reducida que se eluye desde la columna, # comparándose con el gel acoplado con suero de conejo normal. El control fue una cantidad equivalente de preparación de factor de liberación de colecistoquinina luminal parcialmente purificado que no se aplicó a los geles de afinidad. En contraste, la activación con el gel acoplado con suero de conejo normal (eluente de la columna de suero de conejo normal) no afectó de una manera significativa la bioactividad del material recuperado de ese gel. Los resultados se ilustran # en la Figura 5. Cuando se interrumpieron las interacciones de anticuerpo-antígeno sobre los geles, y se eluyeron los geles, se eluyeron cantidades significativas de bioactividad del factor de liberación de colecistoquinina luminal a partir del gel acoplado con antisuero, pero no se eluyó bioactividad de factor de liberación de colecistoquinina luminal a partir del gel acoplado con suero de conejo normal (no se muestran los resultados) . Se produjeron antisueros para dos porciones diferentes de la molécula de factor de liberación de colecistoquinina luminal en conejos. Se demostró que estos anticuerpos neutralizan el efecto liberador de colecistoquinina del factor de liberación de colecistoquinina luminal en vivo. Se prepararon cerebro de rata, ganglios nudosos, estómago, páncreas, duodeno, y adrenal, y se rebanaron para la inmunohistoquímica. Se determinó la concentración de antisuero óptima para los estudios inmunohistoquímicos, a través de una escala de concentración de -log 2. Se determinó la especificidad del teñido mediante preabsorbencia de la solución de antisuero con el antígeno de factor de liberación de colecistoquinina luminal específico, o nada, durante 1 hora antes de que se agregara el antisuero a las secciones de tejido. La fijación se localizó utilizando un sistema de anticuerpo secundario de complejo de avidina-biotina/peroxidasa de rábano con cromógeno de níquel-diaminobenzadina . Las secciones se contra-tiñeron y se analizaron mediante microscopio de luz. Se identificó el teñido dependiente de la concentración y específico del antígeno tanto en el duodeno como en el páncreas. El teñido se observó en el plexo mientérico y submucoso del duodeno y el estómago. El teñido también se identificó en las fibras nerviosas a través de todo el páncreas, las fibras sensoriales y los cuerpos celulares de los ganglios nudosos, y las fibras nudosas simpáticas en la médula adrenal. La evidencia inmunohistoquímica sugirió que el factor de liberación de colecistoquinina luminal es un neuropéptido que puede tener varias funciones en el sistema gastrointestinal y en otros sistemas. La especificidad de la fijación se demostró mediante la pérdida progresiva de fijación con dilución en serie, por la ausencia de teñido con anticuerpo primario de conejo no específico, y por el bloqueo de la fijación con el antígeno específico utilizado para inmunizar los conejos (Figuras 20B, 21B, 22B, y 23B) . El teñido inmunohistoquímico de la sección adyacente con antisuero para factor de liberación de colecistoquinina luminal1_6 y para factor de liberación de colecistoquinina luminal7_23 en cada uno de los tipos de tejido, demostró patrones de teñido idénticos, aunque el antisuero para el factor de liberación de colecistoquinina luminal7_23 fue superior al antisuero amino-terminal para la inmunohistoquímica. Estos datos sugirieron que el teñido inmunohistoquímico utilizado para la localización, refleja precisamente la distribución del factor de liberación de colecistoquinina luminal en vivo. 5.3.1. Localización del Factor de Liberación de Colecistoquinina Luminal en el Intestino Superior y en el Páncreas Se identificó la inmunorreactividad del factor de liberación de colecistoquinina luminal en las fibras nerviosas adentro de las dos terceras partes proximales de las vellosidades del intestino delgado y en los enterocitos de las puntas de las vellosidades (Figura 20A y Figura 20B) . Las vistas longitudinales y de sección transversal de los enterocitos demuestran la inmunorreactividad del factor de liberación de colecistoquinina luminal (IR-FLCL) adentro de estructuras circulares separadas en el citoplasma y en las fibras. Las cadenas mucosas luminales contienen iberación de colecistoquinina luminal, pero estaban incompletamente bloqueadas con el antisuero preabsorbido . Aunque las hebras de moco de inmunorreactividad de factor de liberación de colecistoquinina 5 luminal parecieron extenderse desde las vellosidades distales, las células de copa fueron negativas para la inmunorreactivídad de factor de liberación de colecistoquinina luminal. Las células enteroendócrinas también fueron negativas -# para la inmunorreactividad de factor de liberación de colecistoquinina luminal. Las fibras nerviosas y los cuerpos celulares nerviosos en el plexo mientérico y en las neuronas submucosales del duodeno, contienen inmunorreactividad del factor de liberación de colecistoquinina luminal (Figura 21A y Figura 21B) . Las fibras nerviosas que se extienden hasta las vellosidades se rastrearon hasta las neuronas submucosales en ^s^^ algunos casos, aunque no se pudo determinar el origen de la mayoría de las fibras . La inmunorreactividad del factor de liberación de colecistoquinina luminal en el estómago se identificó en las fibras nerviosas y en los cuerpos celulares nerviosos, en el plexo mientérico y submucosal . Los enterocitos adentro de la unión gastroesofágica también exhibieron factor de liberación de colecistoquinina luminal. En adición, un número de nervios grandes de inmunorreactividad de factor de liberación de colecistoquinina luminal cursaron a lo largo de la superficie serosa del antro del estómago. Las fibras nerviosas grandes de inmunorreactividad de factor de liberación de colecistoquinina luminal parecen correr a través del páncreas, y son especialmente prominentes en el tejido conectivo interlobular. Los nervios inmunorreactivos pequeños se vieron ocasionalmente alrededor de la periferia de los islotes de Langerhans, pero no siempre se observaron. 5.3.2 Inmunorreactividad de Factor de Liberación de Colecistoquinina Luminal en el Sistema Nervioso Autónomo y en el Cerebro. Se investigó el sistema nervioso parasimpático a través de la evaluación de los ganglios nudosos con las secciones de vago y tallo cerebral adyacentes que contienen el núcleo motor dorsal del vago y el núcleo ambiguo. Los cuerpos celulares nerviosos de los ganglios nudosos y de las fibras vagales son positivos para la inmunorreactividad del factor de liberación de colecistoquinina luminal (Figura 22A y Figura 22B) , mientras que las neuronas motoras del tallo cerebral son negativas para la inmunorreactividad del factor de liberación de colecistoquinina luminal. Por consiguiente, solamente el brazo sensorial del vago contiene inmunorreactividad del factor de liberación de colecistoquinina luminal . Se utilizó la glándula adrenal para rastrear los nervios del sistema nervioso simpático. Las células de la médula adrenal mostraron un teñido débil de inmunorreactividad del factor de liberación de colecistoquinina luminal, así como un teñido distintivo de las fibras nerviosas simpáticas (Figura 23A y Figura 23B) . Sin embargo, no se observaron fibras simpáticas perivasculares con inmunorreactividad de factor de liberación de colecistoquinina luminal en la glándula adrenal, en el intestino, o en otros tejidos. Se evaluó el sistema nervioso central utilizando secciones sagitales regularmente separadas que cubrían todo el cerebro. No se identificó inmunorreactividad del factor de liberación de colecistoquinina luminal en el sistema nervioso central. Por consiguiente, la inmunorreactividad del factor de liberación de colecistoquinina luminal se localiza en los nervios del sistema nervioso entérico, el brazo sensorial del vago, y las fibras simpáticas de la glándula adrenal. 5.4 E emplo 4 Clonación Molecular del Factor de Liberación de Colecistoquinina Luminal La determinación de la mayor parte de la secuencia de aminoácidos del factor de liberación de colecistoquinina luminal permite la clonación relativamente directa del ADN codificador, utilizando cebadores degenerados para sondear una biblioteca de ADN apropiada. La longitud del cebador es generalmente un asunto de elección, pero convenientemente será del orden de 15 a 25 pares de bases, y podría ser hasta la longitud completa de la secuencia de 41 aminoácidos determinada. Los cebadores degenerados sintetizados a partir de los aminoácidos N-terminales secuenciados del péptido se utilizarán para producir, mediante PCRMR a la temperatura ambiente, un ADNc que codifica este segmento del factor de liberación de colecistoquinina luminal. Una vez que se secuencia el ADNc, se utilizarán los cebadores generados desde el extremo 3' de la secuencia de ADNc como el cebador 5' , junto con el oligo (dT) 16 como el cebador 3', para hacer una amplificación rápida del extremo de ADNc (RACE) de ambos extremos de la transcripción, con el objeto de producir un ADNc de longitud completa intacto de factor de liberación de colecistoquinina luminal . Amplificación Rápida del Extremo de ADNc (RACE) El extremo 3' del ADNc del factor de liberación de colecistoquinina luminal se amplificará en una mezcla de reacción de 100 mililitros conteniendo Tris-HCl 10 mM (pH de 8.4; a 23°C), MgCl2 1.5 mM, KCl 40 mM, 200 mM de cada uno de dNTP, 1 mM de cada uno de un cebador desde la parte media del péptido ya secuenciado, 2 mililitros de oligo (dT)16, y 2 unidades de polimerasa de ADN Taq. Se realizarán 30 ciclos de amplificación con desnaturalización a 94°C durante 1 minuto, templado a 40°C/minuto, y extensión a 72°C durante 1 minuto, seguida por una extensión adicional a 72°C durante 20 minutos. Para asegurar que se secuencie completamente el del factor de liberación de colecistoquinina luminal, este último se transcribirá inversamente utilizando el cebador P3. Al cebador extendido se le pondrá una cola con poli A en una mezcla de reacción de 20 5 mililitros conteniendo cacodilato de potasio 50 mM, CoCl2 2 mM, DTT 200 mM, dATP 200 mM, y 10 unidades de transferasa de desoxinucleotidotidilo terminal. El cebador extendido se utilizará como plantilla, y se amplificará como para el «4 extremo 3' descrito anteriormente, con la excepción de que los cebadores y el primer ADNc serán sustituidos por el cebador oligo (dT) 16 0.2 mM, 0.5 mM de un cebador específico obtenido del ADNc de 123 pares de bases secuenciado, y 2 mililitros de la primera cadena con cola del ADNc. Finalmente, los productos de RACE traslapados de los extremos 3 ' y 4 ' se combinarán para producir un ADNc de longitud completa intacto del factor de liberación de colecistoquinina luminal. Clonación y Secuensiamiento El producto de PCRMR se purificará y se clonará en el ,, vector del plásmido pVZI por medio del método de clonación TA de Invitrogen. Las secuencias de nucleótidos se determinarán mediante el método de terminación de cadena de didesoxinucleótido, utilizando [a-35S]dATP y el estuche de secuenasa. Una alternativa a la clonación de PCRMR, sería una hibridación de placa tradicional utilizando una sonda, basándose en la secuencia de aminoácidos conocida del factor de liberación de colecistoquinina luminal, y una biblioteca de ADNc, tal como la obtenida de células de páncreas o de cerebro. Una vez teniendo el ADNc de longitud completa que codifica el factor de liberación de colecistoquinina luminal, se utilizará el ADNc del factor de liberación de colecistoquinina luminal para obtener la versión humana de este péptido. Una versión humana de factor de liberación de colecistoquinina luminal que se espera que sea homologa al factor de liberación de colecistoquinina luminal de rata, también se obtendría mediante procedimientos análogos. Las secuencias de ADN dadas a conocer en la invención, permiten la preparación de secuencias de ADN (o de ARN) relativamente cortas, que tienen la capacidad para hibridarse específicamente en secuencias del gen lcr, mediante la preparación de sondas de ácido nucleico de una longitud apropiada. Estas sondas típicamente se preparan basándose en la consideración de la secuencia del gen definida, del gen del factor de liberación de colecistoquinina luminal, o derivada a partir de las regiones de flanqueo de este gen. Con el objeto de clonar el gen que codifique el factor de liberación de colecistoquinina luminal, se contemplan dos estrategias complementarias . Un planteamiento ha sido utilizar la secuencia de péptido de la SEQ ID NO:l, para diseñar cebadores de oligonucleótido para utilizarse en la clonación directa mediante PCR MR (reacción de cadena de lanteamiento, se utilizarán reactivos serológicos para rastrear una biblioteca de ADNc, con el fin de identificar la secuencia con inmunorreactividad. Estos dos planteamientos son complementarios, pero se espera que identifiquen la misma secuencia de ADN o de ARN. Planteamiento de Oligonucleótido A partir de la secuencia de 41 aminoácidos determinada para el término amino del factor de liberación de colecistoquinina luminal, se predijo la secuencia de ARNm, y se seleccionaron las regiones menos degeneradas . Se generaron seis cebadores de oligonucleótido diferentes (desde 4 regiones) ; sus secuencias y posiciones son como se muestran.

STFWAYQPDGD?DPTDYQKYEHTSSPSQLLAPGDYPCVIEV (SEQ ID ?O:l) 15 lcrf-5 lcrf-p lcrf-p2 lcrf-3¡ Las secuencias de los oligonucleótidos lcrf son: 20 lcrf-5 (inosina) 5'-TT(T/C) TGG GCI TA(T/C) CA(A/G) CCI GA(T/C) GG (SEQ ID ?0:4) lcrf-5 (degenerado) 5'-TT(T/C) TGG GC(A/C/T) CA(A/G) CC (A/C/T) GA(T/C) GG (SEQ ID ?O:5) lcrf-p 5'-GA(T/C) AA(C/T) GA(T/C) CCI ACI GA(C/T) TA(T/C) CA (SEQ ID NO: 6) lcrf-p2 5'-GT(A/G) TG(T/C) TC (A/G) TA(C/T) TT(T/C) TG (SEQ ID NO: 7) lcrf-3' (inosina) 5'-TCI ATI AC (A/G) CAÍ GG(A/G) TA(A/G) TCI CC (SEQ ID NO: 8) lcrf-3' (degenerado) 5'-TC(T/G/A) AT(C/G) AC (A/G) CA(T/A/G) GG(A/G) GG (A/G) TA(A/G) TCN CC (SEQ ID NO: 9) .

Por cada uno de los oligonucleótidos más externos, se generaron dos versiones diferentes, una en donde las posiciones degeneradas estaban rellenas con inosina, y la otra en donde contenían la mezcla apropiada de nucleótidos. En general, los oligonucleótidos de factor de liberación de colecistoquinina luminal-5' y de factor de liberación de colecistoquinina luminal-3' se diseñaron para servir como cebadores en la PCRMR, mientras que se iban a utilizar los oligonucleótidos internos primordialmente como sondas, o si era necesario, como cebadores anidados. Con el objeto de clonar la secuencia del factor de liberación de colecistoquinina luminal, se preparó ARN a partir de varios tejidos de rata, incluyendo intestino, cerebro, páncreas, estómago, y ganglios nudosos. Estos ARNs se convirtieron en AD?c para utilizarse en la reacción de cadena de polimerasa acoplada con transcriptasa inversa (PCRMR-TI) ; se demostró que todos estaban intactos utilizando una PCRMR de control de HPRT (transferasa de fosforribosilo de hipoxantina) . Se emplea la PCRMR estándar. En adición, ya que los cebadores están altamente degenerados, también se utiliza PCRMR escalonada hacia abajo. En adición, se aisló AD? genómico de alto peso molecular a partir de hígado de rata, para utilizarse en las amplificaciones de PCRM estándares. Se han obtenido y clonado varios productos de la PCRMR en un pUC para su análisis. En seguida, se utilizará PCRMR escalonado hacia abajo para incrementar la especificidad con las reacciones de PCRMR de .AD?. Planteamiento Serológico Antes de la generación de una biblioteca de expresión, fue necesario identificar una buena fuente de AR? que tuviera posibilidades de contener la secuencia de ARNm del factor de liberación de colecistoquinina luminal. En adición, se requirieron uno o más anticuerpos anti-factor de liberación de colecistoquinina luminal, que pudieran reconocer el péptido desnaturalizado. Por consiguiente, para resolver ambos asuntos, se prepararon manchas Western utilizando extractos de proteína de diferentes fuentes. Las manchas de proteína se incubaron entonces individualmente con cuatro antisueros diferentes. En el extracto de páncreas, todos los cuatro antisueros detectaron una banda del mismo tamaño de 5 aproximadamente 20 kD. Por consiguiente, se construirá una biblioteca de expresión de ADNc a partir de ARNm de páncreas, y se rastreará directamente con los reactivos anti-factor de liberación de colecistoquinina luminal policlonales. Los ADNcs detectados se secuenciarán para asegurar que contengan la ,10 información de codificación apropiada. Se utilizará el ADNc del factor de liberación de colecistoquinina luminal identificado para clonar el ADNc de longitud completa a partir de bibliotecas de ADNc tanto de rata como humanas . Los ADNcs se clonarán en vectores de expresión, con el objeto de producir grandes cantidades de factor de liberación de colecistoquinina luminal para el análisis fisiológico. En adición, se clonará el gen de factor de liberación de colecistoquinina luminal a partir de bibliotecas genómicas humana y de ratón, para definir adicionalmente sus acciones reguladoras. Los inventores contemplan además la utilización del gen de murino para generar un ratón inconsciente deficiente en factor de liberación de colecistoquinina luminal, para utilizarse en la evaluación del papel biológico de este péptido. 25 5.5 Ej emplo 5 Métodos para Utilizar el Efecto del Factor de Liberación de Colecistoquinina Luminal sobre la Liberación de Colecistoquinina La administración de factor de liberación de colecistoquinina luminal es superior a la colecistoquinina o a los agonistas de colecistoquinina. Esto se debe a que el factor de liberación de colecistoquinina luminal libera colecistoquinina endógena, que es predominantemente colecistoquinina-58 en la sangre de seres humanos y de perros. La colecistoquinina-58 es una molécula demasiado grande para sintetizarse económicamente para propósitos farmacéuticos. Sin embargo, la colecistoquinina-58 liberada por el factor de liberación de colecistoquinina luminal sería preferible a la forma de colecistoquinina aprobada para uso médico, es decir, colecistoquinina-8 inyectada, debido a que la primera tiene una vida media más larga, y características de fijación de receptor preferibles, comparándose con la colecistoquinina-8. De la misma manera, los agonistas de colecistoquinina potenciales, de péptido así como no de péptido, serían menos fisiológicos que la colecistoquinina endógena. La actividad del factor de liberación de colecistoquinina luminal indica su utilidad para controlar la liberación de colecistoquinina, y por consiguiente, para proporcionar métodos de tratamiento para varias condiciones en * donde esté involucrada la colecistoquinina en una capacidad reguladora. El factor de liberación de colecistoquinina luminal y las formas truncadas y las variantes activas, se pueden sintetizar mediante técnicas convencionales, y se puede 5 determinar su capacidad para liberar colecistoquinina in vi tro e in vivo. Los métodos in vi tro se basan en la capacidad de los péptidos activos de factor de liberación de colecistoquinina luminal para liberar colecistoquinina a # partir de las células de la mucosa intestinal dispersas, o a ,10 partir de células STC-1, una línea celular de tumor que secreta colecistoquinina en respuesta a los péptidos liberadores de colecistoquinina, tal como un péptido monitor, bombesina, así como el factor de liberación de colecistoquinina luminal . Los métodos en vivo incluyen infusión intraduodenal o intragástrica o intravenosa de factores de liberación de colecistoquinina luminal. 5.5.1 Composiciones Farmacéuticas Orales Formas en las que se puede Administrar Oralmente el Factor de Liberación de Colecistoquinina Luminal 20 El factor de liberación de colecistoquinina luminal es un polipéptido, como la insulina, de modo que está sujeto a la digestión en el estómago, por el ácido/la pepsina, y en el intestino delgado por las proteasas pancreáticas. Pero, a diferencia de la insulina (y de la colecistoquinina misma) , el factor de liberación de colecistoquinina luminal « presumiblemente actúa sobre los receptores en el lado luminal de las células de la mucosa (las células liberadoras de colecistoquinina) , de tal manera que no se tiene que absorber. La insulina tendría que absorberse intacta para llegar a los 5 receptores celulares, y esto es improbable. Esto hace que el factor de liberación de colecistoquinina luminal sea único como un péptido regulador, y hace práctica la aplicación oral, mientras que para otros péptidos reguladores (hormona de crecimiento, insulina, etcétera) , la administración oral es # 10 impráctica. La administración de factor de liberación de colecistoquinina luminal sería práctica en una multitud de formas. El compuesto es estable al calor (sobrevive a la ebullición durante 10 minutos, y sobrevive a la incubación a 37°C durante 24 horas, con una pérdida de aproximadamente el 20 por ciento de actividad) . Es soluble en agua, y es efectivo en concentraciones muy bajas, tales como 0.08 miligramos/kilogramo de peso del cuerpo en la rata adulta, dado intraduodenalmente para estimular la liberación de colecistoquinina, o 0.15 miligramos/kilogramo para suprimir la ingestión de alimento en ratas neonatales, administrado intragástricamente . Por consiguiente, tan poco como 10 miligramos pueden ser efectivos oralmente en un ser humano de 70 kilogramos. 25 110 Formas en las que se Puede Administrar Oralmente el Factor de Liberación de Colecistoquinina Luminal: Polvo: como el péptido puro, mezclado en un vehículo en polvo, tal como leche en polvo, cocoa en polvo, azúcar, 5 cuya mezcla entonces se podría disolver en agua o en otro vehículo líquido adecuado. En esta forma, el péptido se desprotegería de la digestión gástrica o intestinal, como en las ratas neonatales, y por consiguiente, se esperaría que la dosis estuviera en la escala de 10 miligramos/kilogramo. 10 Aunque la administración de factor de liberación de colecistoquinina luminal oralmente sin esfuerzos adicionales para impedir las pérdidas debidas a la inactivación en el estómago y en el intestino pueda parecer ineficiente, no es barrera importante para un tratamiento de éxito, ya que puede ser superado simplemente incrementando la dosis. Esto no es peligroso, debido a que el exceso de péptido (desperdiciado) simplemente se digiere como cualquier otra proteína de la dieta. 1 Estas formas en polvo se deben tomar antes de un alimento, para sacar ventaja del fenómeno de "pre-carga", en donde al ingerir un pequeño alimento 10 ó 20 minutos antes de un alimento regular, puede reducir notablemente la cantidad del alimento consumido. Cápsula: el factor de liberación de colecistoquinina 25 luminal se puede administrar en una cápsula, de tal manera que se puede tomar con un alimento o antes de un alimento. Esto sería conveniente, bien sea que la cápsula esté recubierta o no para resistir la digestión en el estómago y el intestino. Preparaciones recubiertas entéricas: para reducir la dosis de factor de liberación de colecistoquinina luminal necesaria, las preparaciones de factor de liberación de colecistoquinina luminal pueden estar en cápsulas recubiertas entéricas, o recubrimiento entérico. Esta tecnología ha estado en un uso ampliamente extendido en la administración oral de complementos enzimáticos pancreáticos. Las preparaciones permiten que la preparación encapsulada sobreviva a los procesos digestivos gástricos, liberando su contenido en el medio ambiente de pH no ácido del intestino. Preparaciones inhibidoras de proteasa: los inhibidores de proteasa orales estimulan la liberación de colecistoquinina al proteger al factor de liberación de colecistoquinina luminal endógeno, o a otros péptidos liberadores de colecistoquinina luminales endógenos, de acuerdo con la hipótesis de Miyasaka y colaboradores (1992) . Por consiguiente, es lógico considerar la mezcla de inhibidores de proteasa, tales como POT II, es decir, inhibidor de proteasa de papa II, con el factor de liberación de colecistoquinina luminal, para hacer una preparación que mejore la eficacia del factor de liberación de colecistoquinina luminal, protegiéndolo de la digestión en el j . intestino delgado. El POT II (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,468,727, cuya descripción se incorpora como referencia) , estimula la liberación de colecistoquinina, e inhibe el vaciado gástrico en seres humanos. 5 En los seres humanos, estos efectos presumiblemente ocurren mediante la protección de una versión humana endógena de factor de liberación de colecistoquinina luminal. Por consiguiente, el POT II se podría hacer en una formulación que incluyera factor de liberación de colecistoquinina luminal 10 sintético, y se podría incorporar en una cápsula de microencapsulación para protegerse del ácido gástrico/pepsina gástricos, y se esperaría que esta formulación sobreviviera a las barreras digestivas tanto gástrica como de proteasa intestinal, y entregaría casi el 100 por ciento de la dosis ingerida de factor de liberación de colecistoquinina luminal a los receptores apropiados sobre la mucosa intestinal. Con esta preparación, predecimos que tan poco como 1 miligramo/70 kilogramos de factor de liberación de colecistoquinina ' luminal, sería altamente efectivo para estimular la liberación de colecistoquinina en seres humanos, para efectuar valores de saciedad crecientes para los alimentos tomados antes de, o con, la preparación de factor de liberación de colecistoquinina luminal, para hacer más lento el vaciado gástrico y de esta manera hacer más lenta la absorción y recuperación de glucosa, para aminorar la hiper- e hiper-glicemia post-prandial y la hiperinsulinemia, para vaciar más completamente la vesícula biliar con el fin de reducir la posibilidad de cálculos, para mejorar el funcionamiento del reflejo gastro-cólico que promueve el movimiento reflejo del intestino y la defecación después de un alimento. 5.5.1.1 Composiciones Farmacéuticas Intravenosas El factor de liberación de colecistoquinina luminal.,. 35 infundido intravenosamente, fue tan efectivo y potente como cuando se dio intraduodenalmente (Figura 8B) . Esto indica que el factor de liberación de colecistoquinina luminal intravenoso estimula la liberación de colecistoquinina, debido a que el factor de liberación de colecistoquinina luminal no estimula al páncreas directamente, como se indica por su falta de efecto sobre la liberación de amilasa a partir de los ácinos pancreáticos aislados. Debido a que el factor de liberación de colecistoquinina luminal administrado intravenosamente puede estimular la liberación de colecistoquinina, la vía de administración intravenosa puede ser útil en algunas situaciones, y puede ser superior a la infusión intravenosa de la colecistoquinina misma, por las razones descritas anteriormente, debido a que el factor de liberación de colecistoquinina luminal estimula la liberación de colecistoquinina natural endógena. Las situaciones en donde se podría garantizar la administración intravenosa en lugar de la oral, son en sea impráctica o difícil, tal como en pacientes (adultos y niños) que reciban alimentación intravenosa, debido a cirugía del intestino o a disfunción del intestino. Con frecuencia desarrollan cálculos de vesícula, 5 debido a la falta de estímulo de la vesícula biliar, y esto puede ser impedido mediante la administración intravenosa de colecistoquinina-8. Para la administración intravenosa, el factor de liberación de colecistoquinina luminal se podría suministrar en viales estériles para inyección, o para infusión por goteo. Basándose en los estudios animales, la concentración de dosis para la infusión intravenosa humana, se esperaría que estuviera en la escala de 0.1 a 1.0 microgramos/kilogramo de peso del cuerpo/hora. Esto es menos que para la vía oral, debido a que no hay inactivación enzimática digestiva del péptido infundido intravenosamente. 5.5.2 Control de la Secreción de Insulina Se contempla que las composiciones de factor de liberación de colecistoquinina luminal son útiles para el estímulo de la secreción de insulina. Se ha demostrado que la colecistoquinina potencia la secreción de insulina inducida por aminoácidos en seres humanos. Por consiguiente, en condiciones en donde la secreción de insulina sea deficiente, tal como en diabetes melitus tipo I ó II, la colecistoquinina puede ser útil, y por consiguiente será valioso un péptido liberador de colecistoquinina que sea oralmente activo, tal como el factor de liberación de colecistoquinina luminal. En este caso, el factor de liberación de colecistoquinina luminal se puede administrar oralmente en composiciones como se describieron anteriormente. En las primeras etapas de la diabetes tipo II, la secreción de insulina es excesiva debido a la insensibilidad de la insulina. Se considera deseable reducir la hiperinsulinemia en la diabetes tipo II, y se ha demostrado que la colecistoquinina endógena y exógena en seres humanos puede reducir la hiperinsulinemia, al hacer más lento el vaciado de los carbohidratos desde el estómago. 5.5.3 Regulación del Vaciado Gástrico El vaciado gástrico en seres humanos es regulado por la colecistoquinina, y porque tanto la colecistoquinina como los inhibidores de tripsina hacen más lento el vaciado gástrico en los pacientes diabéticos que tienen un vaciado gástrico anormalmente rápido. Esto es importante, debido a que el vaciado gástrico rápido es ahora reconocido como un síntoma , de diabetes temprana, y exacerba la hiperglicemia post- prandial y la hiperinsulinemia. Los sujetos diabéticos, tanto del tipo I (dependientes de insulina) como del tipo II (establecimiento en adultos, no dependientes de insulina) , se beneficiarían del factor de liberación de colecistoquinina luminal, al tomarlo antes de, y con, alimentos altos en carbohidratos, ya que este tipo de alimento se vacía lo más rápido en estos sujetos. Por ejemplo, un sujeto diabético puede tomar factor de liberación de colecistoquinina luminal como una pre-carga en un vehículo líquido de 10 a 20 minutos antes de un alimento, para hacer más lento el vaciado gástrico del siguiente alimento. También se esperaría que esto reduzca la ingestión de alimento, ya que la distención gástrica es un factor importante en la saciedad. Si se eetá consumiendo una bebida alta en carbohidratos y alta en calorías, se recomendaría que se mezclara factor de liberación de colecistoquinina luminal, como un polvo, con la bebida, para hacer más lento su vaciado desde el estómago, y mejorar su valor de saciedad. 5.5.4 Reducción en la Estasis de la Vesícula Biliar (vaciado incrementado de la vesícula biliar) La estasis de la vesícula biliar es la terminación del alimento disminuido, especialmente la grasa, en el intestino, como en las personas con dietas de reducción de peso, y la ausencia de alimento en el intestino, como en los pacientes con una nutrición parenteral total. En muchos casos, esto conduce a cálculos de la vesícula. En el primer caso, se les avisaría a los sujetos con regímenes de reducción de peso bajos en grasa y bajos en calorías, que tomarán factor de liberación de colecistoquinina luminal antes de cada alimento, para mejorar la capacidad de este alimento para liberar ra contraer más completamente la vesícula biliar. Se sabe que la contracción más frecuente de la vesícula biliar mediante la colecistoquinina exógena previene los cálculos biliares en los sujetos susceptibles, y 5 por consiguiente, se esperaría que el factor de liberación de colecistoquinina luminal tomado oralmente lo haría de la misma manera . 5.5.5 Supresión del Apetito y Control de la Ingestión de Alimento 10 Para probar la capacidad del factor de liberación de colecistoquinina luminal para inducir la saciedad y reducir el consumo de alimento, se empleó un diseño experimental reconocido para probar el efecto de la colecistoquinina endógena sobre la ingestión de alimento. En este procedimiento, se removieron las ratas jóvenes de aproximadamente 12 días de edad de su nido, y se pesaron. Luego se infundieron rápidamente intragástricamente con 1 mililitro de suero isotónico (control) o factor de liberación de colecistoquinina luminal.,_35 en suero. Luego se volvieron a pesar y se alojaron en grupos a 33 °C. Diez minutos después, se transfirieron a recipientes individuales a la temperatura ambiente, y se les dio acceso a 4 mililitros de dieta de leche (mitad y mitad comercial) durante 30 minutos. Después de la prueba, las ratas se secaron y se pesaron, y la ingestión de leche se expresó como el porcentaje de peso del cuerpo ganado # durante la prueba (% PPG) . Se realizaron dos estudios separados con grupos separados de ratas, pero utilizando la misma preparación de factor de liberación de colecistoquinina luminal1.35. TABLA 5 Se utilizó análisis de regresión lineal utilizando el sistema de análisis estadístico SAS, para evaluar el efecto de la dosis del factor de liberación de colecistoquinina luminal.,_35 sobre la ingestión de alimento. Los datos mostraron: (1) falta de ajuste: la falta de ajuste desde la tendencia lineal no fue significativa (p=>0.30); (2) la velocidad disminución por cada microgramo de la dosis fue el 0.11 por ciento de porcentaje de peso del cuerpo ganado, y el 0.14 por ciento del porcentaje de peso del cuerpo ganado. Se encuentra que la tendencia lineal para disminuir la ingestión de alimento es altamente importante, en ambos experimentos, con p<0.001. Estos experimentos establecen, en un modelo de mamífero, que el factor de liberación de colecistoquinina luminal actúa como un agente de saciedad en dosis muy bajas, para reducir la ingestión de alimento. Uso de factor de liberación de colecistoquinina luminal para la reducción de la ingestión de alimento en seres humanos. Se espera que el factor de liberación de colecistoquinina luminal reduzca la ingestión de alimento en el experimento anterior, debido a que los estudios anteriores en seres humanos demostraron que el inhibidor de tripsina de frijol de soya suprimía la ingestión de alimento. Se ha propuesto que el factor de liberación de colecistoquinina luminal media el estímulo de la liberación de colecistoquinina por el inhibidor de tripsina. Debido a que los inhibidores de tripsina orales también incrementan la liberación de colecistoquinina en seres humanos, y reducen la ingestión de alimento en seres humanos, se espera que el factor de liberación de colecistoquinina luminal estimule la liberación de colecistoquinina, y reduzca la ingestión de alimento en seres humanos. El factor de liberación de colecistoquinina luminal, incorporado en las composiciones descritas anteriormente para aplicación oral, se tomaría antes de un alimento, para inducir ^ - y aumentar el fenómeno de "pre-carga" que ayuda a reducir la ingestión de alimento normalmente. Se esperaría que la preparación de factor de liberación de colecistoquinina luminal se tomaría antes de cada alimento grande, y antes de, o con, bebidas líquidas altamente ricas en calorías, por ejemplo bebidas de cola. Se lograría la máxima inducción de las acciones de saciedad del factor de liberación de colecistoquinina luminal tomando factor de liberación de colecistoquinina luminal de 10 a 20 minutos antes de un alimento, y una vez más justo antes de, o con, el alimento. La dosificación del factor de liberación de colecistoquinina luminal dependería de la forma tomada, por ejemplo, recubrimiento entérico, o como un polvo. El factor de liberación de colecistoquinina luminal no se tomaría entre comidas, ya que actúa para aumentar el valor de saciedad de los alimentos, pero puede no tener acciones de menos saciedad si se da solo. 5.6 Ejemplo 6 Las variantes y los fragmentos de factor de liberación de colecistoquinina luminal se han descrito anteriormente. Se han evaluado varias de las variantes y especies truncadas, y se ha descubierto que tienen actividad biológica. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, FLCL.,. 6, FLCL.,.35 , FLCL7.23, FLCL1.37, y FLCL.,_35, Lys?ala en la posición 19. fe 5.6.1 Bioactividad del Factor de Liberación d Colecistoquinina Lum±nal.,_35 Se sintetizó la secuencia de término N del factor d liberación de colecistoquinina luminal, que incluye lo 5 aminoácidos 1-35. El péptido estimuló de una maner significativa la proteína pancreática y la secreción de fluid en ratas conscientes, cuando se introdujeron bien se intravenosamente o intraduodenalmente. La infusió intraduodenal estimuló de una manera significativa la mayo concentración de colecistoquinina en plasma, pero no tuv efecto alguno sobre la liberación de amilasa de los ácino pancreáticos. El antagonista del receptor de colecistoquinina A, MK-329, anuló la actividad estimulante pancreática. Baj condiciones similares, el IFD 1-86 y el IFD 33-50, n estimularon de una manera significativa la secreció pancreática. La digestión de tripsina anuló la activida liberadora de colecistoquinina del factor de liberación d colecistoquinina luminal.,.35. 5.6.1.2 Respuesta Secretora Pancreática a la Aplicació Intraduodenal del Péptido Monitor y del Factor de Liberació de Colecistoquinina Luminal Purificado Nativo En las Figuras 6A y 6B se ilustran las relaciones d dosis/respuesta entre la producción creciente de proteína fluido en ratas infundidas con péptido monitor recombinante vector de factor de liberación de colecistoquinina lumina nativo. El péptido monitor y el factor de liberación de colecistoquinina luminal estimularon de una manera significativa la proteína pancreática y la secreción de fluido en dosis de 1 a 2 microgramos, respectivamente, siendo la producción de fluido estrechamente paralela a la producción de proteína. Ambos péptidos exhibieron una inhibición supramáxima en dosis más altas en este modo. 5.6.1.3 Respuesta Secretora Pancreática a la Aplicación Intraduodenal de Factor de Liberación de Colecistoquinina Luminal^35 En las Figuras 7A y 7B se ilustran las relaciones de la dosis/respuesta entre la producción creciente de proteína pancreática y fluido con factor de liberación de colecistoquinina luminal1.35 y factor de liberación de colecistoquinina luminal.,.6 (como un control) . El factor de liberación de colecistoquinina luminal.,.35 estimuló de una manera significativa la secreción de proteína en dosis de 0.1 a 0.5 microgramos/rata, con una respuesta pico en 0.1 microgramos. La producción de fluido siguió una curva de respuesta a la dosis similar. El factor de liberación de colecistoquinina luminal1.6 no estimuló la proteína pancreática o la secreción de fluido. .6.1.4 Comparación entre las Vías Intravenosa contra Intraduodenal para el Estímulo de la Secreción Pancreática por el Factor de Liberación de Colecistoquinina Luminal1.35 Las Figuras 8A y 8B ilustran la comparación entre las vías de administración intravenosa contra intraduodenal de factor de liberación de colecistoquinina luminal.,_35. La curva 5 de respuesta a la dosis fue muy similar por ambas vías, presentándose la respuesta pico en la misma dosis, 0.1 microgramos, por cualquier vía. Estos resultados indican que el factor de liberación de colecistoquinina luminal.,_35 aplicado intravenosamente, puede tener acceso a las células secretoras 0 de colecistoquinina del intestino delgado, ya que otros resultados, descritos más adelante, muestran que el factor de liberación de colecistoquinina luminal1.35 no estimula la secreción pancreática directamente. 5.6.1.5 Respuesta Secretora Pancreática a Diferentes 5 Subfragmentos de Factor de Liberación de Colecistoquinina Luminal 35 Para determinar el fragmento mínimo de factor de liberación de colecistoquinina luminal que posee actividad de ' liberación de colecistoquinina, se sintetizaron y se probaron 0 varios fragmentos adentro de la secuencia del factor de liberación de colecistoquinina luminal,,_35, utilizando el modelo de "bioensayo". Como se ilustra en la Figura 9, solamente el fragmento de factor de liberación de colecistoquinina luminal.,.,.^ estimuló de una manera 5 significativa la secreción de proteína pancreática, con una mayor potencia pero menor eficacia, comparándose con el factor de liberación de colecistoquinina luminal1.35. 5.6.1.6 Respuesta Secretora Pancreática a la Aplicación Intraduodenal de Inhibidor de Fijación de Diazepam (IFD) y Fragmento de Inhibidor de Fijación de Diazepam y Péptido Liberador de Gastrina Estos estudios se realizaron en el "modelo de bioensayo" descrito en el Ejemplo 2. A través de un amplio rango de dosis (Figuras 10A y 10B) , ninguno de los péptidos 0 estimuló de una manera significativa la secreción de proteína pancreática o de fluido, bajo condiciones en donde el factor de liberación de colecistoquinina luminal1.35 y el factor de liberación de colecistoquinina luminal nativo estimularon fuertemente la secreción pancreática. Este resultado indica 5 que el péptido, el inhibidor de fijación de diazepam, reportado como un péptido liberador de colecistoquinina en la .rata por Herzig y colaboradores (1995), no estimula la liberación de colecistoquinina en ratas conscientes i completamente recuperadas de ci.rugía. Estos resultados i.ndi.can 0 que el inhibidor de fijación de diazepam no media la regulación de retroalimentación de la liberación de i colecistoquinina en la rata, contrariamente a las proclamaciones por Herzig y colaboradores. 5.6.1.7 Efecto del Bloqueo del Receptor de Colecistoquinina 5 sobre la Respuesta Secretora Pancreática al Factor de # Liberación de Colecistoquinina Luminal,,_35 Intraduodenal, y Efecto del Factor de Liberación de Colecistoquinina Luminal1-35 Intraduodenal sobre la Concentración de Colecistoquinina en Plasma Estos estudios se realizaron en un modelo fisiológico, es decir, con bilis y jugo pancreático regresados al intestino. Las Figuras HA y 11B muestran el transcurso del tiempo de la secreción de proteína pancreática y fluido durante la administraión intraduodenal continua de 25 microgramos de factor de liberación de colecistoquinina luminal.,.35 y control de suero durante 2 horas, y el efecto del antagonista del receptor de colecistoquinina MK-329 sobre la respuesta al factor de liberación de colecistoquinina luminal.,. 35. El factor de liberación de colecistoquinina luminal.,_35 estimuló de una manera significativa la secreción de fluido pancreático y proteína, comparándose con la basal, y esta respuesta fue abolida por el MK-329. Las respuestas crecientes '# de proteína pancreática y fluido se ilustran en las Figuras 12A y 12B. La Figura 13 ilustra las respuestas de colecistoquinina en plasma en los mismos experimentos, determinadas sobre muestras de sangre retiradas 60 minutos después del inicio de la infusión de los compuestos de prueba. El factor de liberación de colecistoquinina luminal.,.35 , ', incrementó de una manera significativa la concentración de colecistoquinina en plasma, comparándose con los niveles básales de NaCl, o factor de liberación de colecistoquinina luminal1.6. Los niveles básales de la colecistoquinina en plasma fueron más altos que los reportados anteriormente en ratas con el 100 por ciento del jugo pancreático regresado al 1 intestino, posiblemente debido a que el retorno parcial del jugo pancreático no suprime completamente la secreción espontánea de colecistoquinina bajo estas condiciones. Los i resultados ilustrados en las Figuras 11 a 13 indican fuertemente que el estímulo de la secreción pancreática por el 0 factor de liberación de colecistoquinina luminal.,.35, es mediado por la liberación de colecistoquinina. i 5.6.1.8 Efecto de la Digestión Tríptica de Factor de i Liberación de Colecistoquinina Luminal.,_35 sobre la Actividad Liberadora de Colecistoquinina 5 La Figura 14 ilustra el efecto de la incubación del factor de liberación de colecistoquinina luminal1.35 con tripsina bovina purificada (1 miligramo/mililitro) a 37 °C durante 24 horas. El factor de liberación de colecistoquinina luminal de control indica que el factor de liberación de 0 colecistoquinina luminal.,.35 se incubó bajo las mismas condiciones pero sin tripsina. El control de tripsina consistió en una solución de tripsina incubada bajo las mismas condiciones, pero sin factor de liberación de colecistoquinina luminal.,_35. La digestión tríptica abolió completamente la 5 respuesta secretora pancreática al factor de liberación de colecistoquinina luminal.,_35. El control de tripsina no contuvo actividad de tripsina residual, asegurando que la falta de efecto del factor de liberación de colecistoquinina luminal.,_35 incubado con la tripsina, no se debió a un efecto supresor de 5 la tripsina sobre la secreción pancreática. Este resultado muestra que el factor de liberación de colecistoquinina } luminal.,.35 cumple con el requerimiento de un péptido liberador de colecistoquinina sensible a la tripsina secretado por el intestino, y tiene actividad similar a aquella del polipéptido 0 nativo. 5.6.1.9 Efecto del Factor de Liberación de Colecistoquinina inal^jg Sobre la Secreción de Colecistoquinina por las Células de la Mucosa Intestinal dispersas in vitro La Figura 15 ilustra la relación de la respuesta a 5 la dosis de la liberación de colecistoquinina al factor de liberación de colecistoquinina luminal.,_35 en células intestinales dispersas de rata. El factor de liberación de colecistoquinina luminal,.35 incrementó de una manera significativa la liberación de colecistoquinina, comparándose 0 con la liberación basal, en concentraciones de 5 nM y 50 nM de factor de liberación de colecistoquinina luminal.,_35. Estos resultados muestran que el factor de liberación de colecistoquinina luminal,.35 estimula directamente la liberación de colecistoquinina desde las células de la mucosa intestinal, 5 presumiblemente desde las células "I" de la colecistoquinina, * y pueden mediar el estímulo indirecto ocasionado por los } nutrientes en el mismo sistema. 5.6.2 In unoneutralización del Factor de Liberación de Colecistoquinina Luminal.,_35 5 La Inmunoneutralización del Factor de Liberación de Colecistoquinina Luminal Inhibe la Respuesta Secretora Pancreática y de Colecistoquinina a la Desviación del Jugo Biliar-Pancreático y a la Difusión de Peptona La peptona estimula la secreción pancreática cuando se introduce intraduodenalmente en ausencia de jugo pancreático en el intestino, y esta respuesta es mediada por la colecistoquinina y por el factor de liberación de ; colecistoquinina luminal endógeno. Para determinar si el factor de liberación de colecistoquinina luminal endógeno media verdaderamente esta respuesta, se probó el efecto de la infusión de peptona duodenal sobre la secreción pancreática en ratas infundidas de una manera concomitante intraduodenalmente con IgG purificada (antisuero #22322) obtenida de ratas inmunizadas con factor de liberación de colecistoquinina luminal7.23 (Quality Controlled Biochemicals, Inc., Hopkinton, MA) . Como se ilustra en las Figuras 16A y 16B, la IgG antifactor de liberación de colecistoquinina luminal, administrada simultáneamente con peptona al 5 por ciento, anuló , . completamente la respuesta secretora pancreática a esta solución nutriente. La IgG de conejo de control, de plasma de Í89 conejo no inmunizado, no tuvo efecto inhibidor alguno sobre la ¡' respuesta secretora pancreática a la peptona bajo las mismas condiciones. Estos resultados indican fuertemente que la respuesta secretora pancreática a la peptona es mediada por el factor de liberación de colecistoquinina luminal. Para determinar el papel del factor de liberación de colecistoquinina luminal en las respuestas secretora i pancreática y de colecistoquinina en plasma a la desviación del jugo biliar-pancreático en la rata, se utilizó un 0 antisuero diferente. Se produjeron antisueros en conejos para ; el fragmento de factor de liberación de colecistoquinina luminal22.37. Este antisuero se utilizó sin mayor purificación. i Se inyectaron intravenosamente los antisueros, en 0.1 mililitros, en ratas, aproximadamente 1 hora antes de la 5 desviación del jugo biliar-pancreático desde el duodeno. Los resultados se compararon con los resultados obtenidos en las mismas ratas el día anterior, que habían recibido 0.1 mililitro de suero de conejo normal de una manera similar. Los ;< resultados se ilustran en las Figuras 17A, 17B, y 18. 0 La desviación del jugo biliar-pancreático estimuló de una manera significativa la secreción de proteína pancreática y de fluido en ambos grupos. Para determinar si el antisuers de factor de liberación de colecistoquinina luminal inhibía esta respuesta, como se predeciría, se calculó el 5 incremento (producción mayor que la basal) , y se compararon Fr las respuestas pico para cada grupo. Estos resultados (insertos en las Figuras 17A y 17B) muestran que el antisuero de factor de liberación de colecistoquinina luminal (anticuerpo de FLCL) inhibió de una manera significativa las respuestas de fluido y proteína pancreáticos a la desviación del jugo biliar-pancreático. La Figura 18 ilustra las respuestas de colecistoquinina en plasma en el mismo experimento, * determinadas sobre muestras de sangre retiradas 30 minutos después de la desviación del jugo biliar-pancreático. El antisuero de factor de liberación de colecistoquinina luminal suprimió de una manera significativa las concentraciones de colecistoquinina en plasma, comparándose con las ratas que no recibieron antisuero, y comparándose con las ratas que recibieron suero de conejo normal. Los resultados de este experimento indican fuertemente que el factor de liberación de colecistoquinina luminal media, en parte, la respuesta secretora pancreática y de colecistoquinina en plasma a la desviación del jugo biliar-pancreático. 20 La Figura 19 ilustra la falta de efecto directo del factor de liberación de colecistoquinina luminal,.35 sobre las células pancreáticas. Se incubaron acinos pancreáticos aislados con concentraciones crecientes de colecistoquinina-8 o de factor de liberación de colecistoquinina luminal,_35, y liberación de amilasa hacia el medio medido. El factor de liberación de colecistoquinina luminal,_35 no tuvo efecto alguno sobre la liberación de amilasa en concentraciones en donde la colecistoquinina-8 incrementaba dependiendo de la dosis, la liberación de amilasa. Estos resultados indicaron que el factor de liberación de colecistoquinina luminal2.35 no estimula directamente al páncreas. Por consiguiente, el estímulo de la secreción pancreática mediante el factor de liberación de colecistoquinina luminal,_35 intraduodenal e intravenoso es probablemente indirecta, por medio de la liberación de colecistoquinina. 5.6.3 Fragmentos y Epítopos de Factor de Liberación de Colecistoquinina Luminal Se determinará el factor de liberación de colecistoquinina luminal más pequeño con una actividad agonista de factor de liberación de colecistoquinina luminal completa. Esta actividad biológica se determinará con la prueba in vivo y/o in vitro descrita anteriormente. Debido a que la actividad del factor de liberación de colecistoquinina luminal se destruye por la actividad proteolítica de la tripsina, y debido a que solamente hay tres sitios sensibles a la tripsina (dos Usinas y una arginina), el rastreo del fragmento inicial se conducirá alrededor de estos residuos de aminoácidos básicos. Se prepararán péptidos que tengan aproximadamente 30 aminoácidos con una lisina o arginina centrada, basándose en la secuencia del factor de liberación de colecistoquinina luminal ya conocida o para determinarse. Cuando se identifique el fragmento activo, se acortará sistemáticamente el enlace con el péptido que rodea a los aminoácidos básicos. Después de cada acortamiento, se determinará la actividad biológica, hasta que se determine la actividad biológica completa con un fragmento de tamaño mínimo. Una vez hecho esto, entonces el aminoácido básico central puede ser reemplazado por un aminoácido tal como, por ejemplo, homoarginina que dé como resultado un péptido más I 0 sensible a la hidrólisis por la tripsina, pero que retenga la actividad biológica. De una manera alternativa, la arginina o 1 la lisina pueden ser sustituidas por un aminoácido no básico. El paso final será garantizar que el fragmento insensible a la tripsina también tenga la actividad liberadora de 5 colecistoquinina biológica deseada. Por supuesto, se entiende que los análogos de factor de liberación de colecistoquinina luminal que no sean de péptido, del fragmento activo de un tamaño mínimo, se pueden preparar mediante métodos bien conocidos por los expertos en 0 este campo. Estos enlaces que no son de péptido, pueden eliminar la necesidad de reemplazar la sensibilidad a la tripsina que señala el aminoácido básico. * * * * * i Las siguientes referencias se incorporan en la parte 5 pertinente por referencia en la presente por las razones citadas anteriormente. * 6.0 Referencias Agerberth y colaboradores, FEBS Lett, 281: 227-30, 1991. 5 Agerberth y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. 86:8590- 8594, 1989. Ayalon y colaboradores, Digestión, 24:118-125, 1982. i Berghorn K y Bonnett J, GE. H. "cFos Immunoreactivity is Enhanced with Biotin Amplification'1 , J. Histochem Cytochem; I 0 42:1635-1642, 1994. Blundell J.E., Hill A. J. , Peikin S.R., Ryan C.A. , Physiol ¡r Behav . 48:241-246, 1990. Chang y colaboradores, J. Physiol (Lond) , 320:393-401, 1981. Chey y colaboradores, Am. J. Phvsiol, 246 :G248-G252 , 1984. 5 Cuber y colaboradores, Am. J. Physiol, 259 :G191-G197 , 1990. 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LISTADO DE SECUENCIAS (1) INFORMACIÓN GENERAL: (i) SOLICITANTE: (A) NOMBRE: BOARD OF REGENTS, THE UNIVERSITY OF TEXAS SYSTEM; DUKE UNIVERSITY Y THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CALIFORNIA. (B) CALLE: 201 West 7th Street; 011 Alien Building y 300 Lakeside Dr. , 22nd Floor (C) CIUDAD: Austin; Durham y Oakland. (D) ESTADO: Texas; Carolina del Norte y California. (E) PAÍS: EUA; EUA Y EUA (F) CÓDIGO POSTAL (ZIP): 78701; 27708 y 94612-3550 (ii) TITULO DE LA INVENCIÓN: FACTOR DE LIBERACIÓN DE COLECISTOQUININA LUMINAL (iii) NUMERO DE SECUENCIAS: 9 (iv) FORMA LEGIBLE POR COMPUTADORA: (A) TIPO DE MEDIO: Disco flexible (B) COMPUTADORA: IBM PC compatible (C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: PatentIn Reléase #1.0, Versión #1.30 (EPO) (vi) DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR: (A) NUMERO DE SOLICITUD: US 60/005,872 (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: 26-OCT-1995 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO : 1: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: 10 (A) LONGITUD: 41 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADENA: (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 1: Ser Thr Phe Trp Ala Tyr Gln Pro Asp Gly Asp Asn Asp Pro Thr Asp 1 5 10 15 Tyr Gln Lys Tyr Glu His Thr Ser Ser Pro Ser Gln Leu Leu Ala Pro j 20 25 30 ^0 Gly Asp Tyr Pro Cys Val He Glu Val 35 40 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO : 2: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: 25 (A) LONGITUD: 123 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal ( ix) CARACTERÍSTICAS : (A) NOMBRE/CLAVE : base_modificada (B) LOCALIZACION: 3..123 (D) OTRA INFORMACIÓN: /base_mod=OTRA/nota="N = T, A, C ó G" (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO : 2: ACNACNTTTT GGGCNTATCA ACCNGATGGN GATAATGATC CNACNGATTA TCAAAAATAT 6 GAACATACNT GNTGNCCNTG NCAATTNTTN GCNCCNGGNG ATTATCCNTG TGTNATTGAA 1 GTN 1 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO : 3: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 35 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADENA: (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO : 3: Ser Thr Phe Trp Ala Tyr Gln Pro Asp Gly Asp Asn Asp Pro Thr Asp i _ 5 10 15 Tyr Gln Lys Tyr Glu His Thr Ser Ser Pro Ser Gln Leu Leu Ala Pro 20 25 30 Gly Asp Tyr 35 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO : 4: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 23 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE : base_modificada (B) LOCALIZACION: 3..21 (D) OTRA INFORMACIÓN: /base_mod= OTRA /nota = "Y = T ó C" (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE : base_modificada (B) LOCALIZACION: 9..18 (D) OTRA INFORMACIÓN: /base_mod= OTRA /nota = "N = Inosina" (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE: base modificada MI 202 (B) LOCALIZACION: 15..16 (D) OTRA INFORMACIÓN: /base_mod= OTRA /nota = "R = A ó G" ¡5 (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO : 4 TTYTGGGCNT AYCARCCNGA YGG 23 1: 5" (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 5: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: 0 (A) LONGITUD: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE : base_modificada (B) LOCALIZACION: 3..18 (D) OTRA INFORMACIÓN: /base_mod= OTRA /nota = "Y = T ó C" 0 (ix) CARACTERÍSTICAS: ¡V (A) NOMBRE/CLAVE: base_modificada (B) LOCALIZACION: 9..15 (D) OTRA INFORMACIÓN: /base_mod= OTRA /nota = "H 5 = A, C ó T" (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE : base_modificada (B) LOCALIZACION: 12..13 (D) OTRA INFORMACIÓN: /base_mod= OTRA /nota = "R = A ó G" (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 5: TTYTGGGCHC ARCCCHGAYGG 20 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 6: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 23 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ix) CARACTERÍSTICAS : (A) NOMBRE/CLAVE : base_modificada (B) LOCALIZACION: 3..21 (D) OTRA INFORMACIÓN: /base_mod= OTRA /nota = "Y = T ó C" (ix) CARACTERÍSTICAS : (A) NOMBRE/CLAVE: base_modificada (B) LOCALIZACION: 12..15 (D) OTRA INFORMACIÓN: /base_mod=OTRA/nota = "N = Inosina" (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 6 GAYAAYGAYC CNACNGAYTA YCA 23 ll (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO : 7: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 17 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal 0 (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE : base_modificada (B) LOCALIZACION: 3..9 ! (D) OTRA INFORMACIÓN: /base_mod= OTRA /nota = "R í 5 = A ó G" (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE: base_modificada (B) LOCALIZACION: 6..15 i (D) OTRA INFORMACIÓN: /base_mod= OTRA /nota ?? ? = C ó T" (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO : 7: GTRTGYTCRT AYTTYTG 17 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 8: I 5 (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 23 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE : base_modificada (B) LOCALIZACION: 3..21 (D) OTRA INFORMACIÓN: /base_mod= OTRA /nota = "N = Inosina" (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE : base_modificada (B) LOCALIZACION: 9..18 (D) OTRA INFORMACIÓN: /base_mod= OTRA /nota = "R = A ó G" (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO : 8: TCNATNACRC ANGGRTARTC NCC 23 ¡¡<r (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO : 9: 20 (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 26 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal 25 (ix) CARACTERÍSTICAS : I' '??, (A) NOMBRE/CLAVE: base_modificada (B) LOCALIZACION: 3..12 (D) OTRA INFORMACIÓN: /base_mod= OTRA /nota = "D = G, A ó T" (ÍX) CARACTERÍSTICAS : (A) NOMBRE/CLAVE: base_modificada r. 'i (B) LOCALIZACION: 6..7 (D) OTRA INFORMACIÓN: /base_mod= OTRA /nota = "S ' = G ó C" ( ix) CARACTERÍSTICAS : (A) NOMBRE/CLAVE: base_modificada (B) LOCALIZACION: 9..21 (D) OTRA INFORMACIÓN: /base_mod= OTRA /nota = "R ?é = A, ó G" (ix) CARACTERÍSTICAS : (A) NOMBRE/CLAVE: base_modificada (B) LOCALIZACION: 24..25 '«I (D) OTRA INFORMACIÓN: /base_mod= OTRA /nota = "N = T, A, C ó G" (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 9: TCDATSACRC ADGGRGGRTA RTCNCC 26

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito la invención que antecede, se 'll considera como una novedad, y por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES 1. Un polipéptido de liberación de colecistoquinina aislado que se fija específicamente con anticuerpos criados contra un polipéptido que tiene cuando menos la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:l. i ! 10
2. Un polipéptido aislado que comprende a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:l. V.
3. El polipéptido de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 2, definido además porque tiene una masa determinada mediante espectrometría de masas de 15 aproximadamente 8136 dáltones.
4. El polipéptido de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 1, que se aisla a partir de secreciones luminales del intestino delgado.
5. El polipéptido de conformidad con lo reclamado 20 en la reivindicación 2, que estimula la liberación de colecistoquinina .
6. El polipéptido de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 1, que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N0:1. 25
7. El polipéptido de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 1, definido además por tener cuando menos del 85 por ciento de homología con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1. I i í l .'I
8. Un polipéptido de liberación de colecistoquinina aislado que comprende: a) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N0:1; ó b) la secuencia de |l,j aminoácidos de la SEQ ID NO:l desde la posición 1 hasta la posición 35; ó c) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:l, desde la posición 11 hasta la posición 25; ó d) la V? secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:l, desde la posición 1 hasta la posición 6; ó e) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:l, desde la posición 7 hasta la posición 23; ó f) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N0:1, desde la posición 22 hasta la posición 37; ó g) la secuencia de aminoácidos de 15 la SEQ ID NO: 1, desde la posición 1 hasta la 35, en donde la lisina es reemplazada con alanina en la posición 19; ó h) variantes funcionales u homologas del mismo.
9. Una composición que comprende al polipéptido de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 1 o en la 20 reivindicación 2.
10. La composición de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 9, definida además por comprender un excipiente fisiológicamente aceptable.
11. Un anticuerpo purificado que se fija 25 específicamente al polipéptido de conformidad con lo reclamado 'I'
12. El anticuerpo de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 11, en donde el anticuerpo está enlazado con una etiqueta detectable.
13. Un método para generar una respuesta inmune, el cual comprende administrar a un mamífero, una composición farmacéutica que comprenda una cantidad inmunológicamente efectiva de la composición de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 9. %- 10
14. Un método para detectar el péptido de liberación de colecistoquinina luminal de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 8 en una muestra biológica, el cual comprende los pasos de: a) obtener una muestra biológica de la que se sospeche que contiene un péptido de liberación de 1,5 colecistoquinina luminal; b) poner en contacto esta muestra con un primer anticuerpo que se fije a la proteína o al ^ péptido de conformidad con lo reclamado en la reivindicación T^^ 8, bajo condiciones efectivas para permitir la formación de un complejo inmune; y c) detectar el complejo inmune así formado. 20
15. Un estuche de inmunodetección que comprende, en un elemento de recipiente adecuado, una o más proteínas o polipéptidos de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 8, o un anticuerpo que se fije a una proteína o péptido de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 25 8, y un reactivo de inmunodetección.
16. Un segmento de ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido de liberación de colecistoquinina, que se fija específicamente con anticuerpos criados contra un polipéptido que tiene cuando menos la secuencia de aminoácidos parcial de la SEQ ID NO: 1.
17. Un segmento de ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:l.
18. El segmento de ácido nucleico de conformidad 0 con lo reclamado en la reivindicación 16 o en la ' reivindicación 17, definido además por comprender la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID N0:2, o el complemento de la misma, o una secuencia que se hibrida a la SEQ ID NO : 2 bajo j.; condiciones de alta estringencia. 5
19. El segmento de ácido nucleico de conformidad i y con lo reclamado en la reivindicación 16 o en la reivindicación 17, en donde el polipéptido codificado tiene la I !. secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N0:1. ^
20. El segmento de ácido nucleico de conformidad 0 con lo reclamado en la reivindicación 16 o en la reivindicación 17, definido además como un segmento de ARN.
21. Un vector recombinante que comprende un ' segmento de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1. 5
22. Un vector recombinante que comprende un segmento de ADN que comprende un polipéptido de liberación de colecistoquinina, que se fija específicamente con anticuerpos criados contra un polipéptido que tiene cuando menos la secuencia de aminoácidos parcial de la SEQ ID NO:l.
23. El vector recombinante de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 21 ó 22, en donde el segmento de ADN comprende una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la SEQ ID NO : 2.
24. Una célula anfitriona recombinante que 0 comprende un vector recombinante de conformidad con lo i! reclamado en la reivindicación 21 o en la reivindicación 22.
25. La célula anfitriona recombinante de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 24, en donde la célula anfitriona es S. utans . 5
26. Un método para suprimir el apetito, el cual comprende : proporcionar una composición de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 10; y administrar esta composición a un sujeto que la necesite, en una cantidad efectiva para suprimir el apetito. 0
27. Un método para estimular la contracción de la I ' vesícula biliar, o para tratar una enfermedad de la vesícula biliar relacionada con formación de cálculos biliares, comprendiendo el método: proporcionar una composición de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 10; y 5 administrar esta composición a un sujeto que la necesite, en una cantidad efectiva para estimular el vaciado de la vesícula biliar.
28. Un método para inhibir el vaciado gástrico, comprendiendo el método: proporcionar una composición de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 10; y administrar esta composición a un sujeto que la necesite, en una cantidad efectiva para demorar el vaciado gástrico.
29. Un método para estimular la secreción de insulina, el cual comprende: proporcionar una composición de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 10; y administrar esta composición a un sujeto que la necesite, en una cantidad efectiva para estimular la secreción de insulina.
30. Un método para preparar una preparación oralmente administrable útil para suprimir el apetito, estimular el vaciado de la vesícula biliar, inhibir el vaciado estomacal, y estimular la secreción de insulina, comprendiendo el método formular una preparación oralmente aceptable que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva del polipéptido de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 1 o en la reivindicación 2.
31. Un método para utilizar un segmento de ADN que incluye un gen de liberación de colecistoquinina aislado que codifica al polipéptido de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 1 o en la reivindicación 2, el cual comprende los pasos de: a) preparar un vector recombinante, en donde un gen de liberación de colecistoquinina que codifica el polipéptido de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 1 o en la reivindicación 2, se coloca bajo el control de un promotor; b) introducir este vector recombinante en una célula anfitriona recombinante; c) cultivar la célula anfitriona recombinante bajo condiciones efectivas para permitir la expresión de una proteína o péptido de liberación de colecistoquinina codificado; y d) recolectar la proteína o > el péptido de liberación de colecistoquinina expresado. RESUMEN DE LA INVENCIÓN El factor de liberación de colecistoquinina luminal (FLCL) es una proteína liberadora de colecistoquinina (CCK) aislada de la secreción intestinal de rata. El factor de liberación de colecistoquinina luminal purificado se caracterizó por el peso molecular, la secuencia de aminoácidos parcial, y la actividad liberadora de colecistoquinina, como se muestra en estudios en vivo de anticuerpos anti-factor de liberación de colecistoquinina luminal, en el bloqueo del efecto liberador de colecistoquinina del factor de liberación de colecistoquinina luminal. Los estudios de fijación demostraron la localización en el duodeno, en el páncreas, y en las fibras nerviosas a través de todo el páncreas, en las fibras sensoriales y en los cuerpos celulares de los ganglios nudosos, así como en las fibras nerviosas simpáticas de la médula adrenal. El factor de liberación de colecistoquinina luminal parece ser un neuropéptido presente en los sistemas nerviosos entérico, parasimpático, y simpático, pero no en el cerebro. La inmunorreactividad del factor de liberación de colecistoquinina luminal también está presente en los enterocitos de las puntas de las vellosidades del intestino delgado. Tomados juntos, los estudios indican que el factor de liberación de colecistoquinina luminal es un neuropéptido que puede tener varias funciones en los sistemas gastrointestinales y en otros sistemas. Los estudios de inmunoafinidad que utilizan anticuerpos criados para el factor de liberación de colecistoquinina luminal1_6 sintético, y los estudios de infusión del lumen del intestino delgado, indicando que el factor de liberación de colecistoquinina luminal puede ser el péptido liberador de colecistoquinina presente en la secreción intestinal que media la regulación de retroalimentación negativa de la secreción de enzima % pancreática y de liberación de colecistoquinina. El factor de 10 liberación de colecistoquinina luminal y las especies funcionalmente relacionadas, tienen potencial de desarrollo para el tratamiento de la secreción de insulina, el vaciado gástrico y de la vesícula biliar, y de regímenes que requieran de control o supresión de apetito. 15