MXPA98002286A - Vehiculos e incrementadores de transcitosis paraliberacion de farmacos - Google Patents

Abstract

La transcitosis de un agente fisiológicamente activo que ejerce su acción después de pasar a través de endotelios, epitelios y mesotelios y que contiene el receptor GP60, se incrementa mediante formulación o conjugación con un incrementador o vehículo de transcitosis seleccionado de albúmina y fragmentos de la misma, anticuerpo anti-GP60 y fragmentos del mismo, fragmentos del péptido GP60, y proteína disulfuro isomerasa, y fragmentos de la misma.

Description

VEHÍCULOS E INCREMENTADORES DE TRANSCITOSIS PARA LIBERACIÓN DE FÁRMACOS CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a liberación de fármacos. En particular, la invención se refiere a vehículos e incrementadores de transcitosis capaces de liberar e incrementar el paso de fármacos a través del endotelio, epitelio y mesotelio que contienen el receptor GP60.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Para la mayoría de los fármacos administrados mediante las rutas intraarterial o intravenosa, el sitio deseado de actividad molecular está fuera de la vasculatura.

Para fármacos que se administran a través de las vías respiratorias, el sitio deseado de actividad es, normalmente, más allá de la primera barrera celular del epitelio alveolar, bronquiolar o traqueal. En ambos casos, existe una barrera endotelial o epitelial que debe ser atravesada antes de que el fármaco pueda mediar su efecto. Para fármacos lipofílicos pequeños, parece haber una ruta paracelular entre las estrechas uniones de las células de barrera. Sin embargo, para fármacos hidrofílicos y agentes activos macromoleculares más grandes tales como péptidos, proteínas, genes o nucleótidos de antisentido, la única ruta para cruzar la barrera es a través de las células. Esto presenta un problema particular para los fármacos administrados intravenosamente que tienen vidas medias extremadamente cortas, debido a una rápida degradación o depuración de primer paso por el hígado. Para mantener los niveles terapéuticos en balance con dicha excreción y degradación, frecuentemente son necesarias grandes dosis o infusiones. De esta manera, existe una evidente necesidad en la técnica de mecanismos más rápidos para liberar fármacos a través de las barreras celulares. Hay muchos reportes de receptores específicos que median eventos endocitóticos, en donde un ligando se une al receptor y después se interna, formando un complejo con el receptor, mediante un proceso similar a la pinocitosis. Esto incluye la invaginación de la membrana celular en la región del complejo de ligando y receptor, y después se libera del ligando en la célula mediante un proceso que no está completamente entendido. Se han reportado varios sistemas de receptor endocitótico incluyendo LDL, insulina, factor de crecimiento epidérmico, factor de crecimiento semejante a insulina y tPA-PAI-I (molécula híbrida). La transcitosis abarca invaginación y formación de vesícula alrededor de un complejo de ligando y receptor, seguido por paso transcitótico con liberación mediante un proceso de invaginación invertida en la membrana basolateral. Se han conjugado anticuerpos monoclonales para el receptor de transferrina con toxinas, de manera que puedan sufrir trancsitosis, a través del endotelio he atoencefálico. Sin embargo, existe una continua necesidad en la técnica de agentes capaces de liberar o incrementar el paso de fármacos mediante transcitosis mediada por receptor, a través de barreras celulares diferentes del endotelio hematoencefálico, tal como el endotelio de la vasculatura, epitelio alveolar y mesotelio peritoneal . El receptor GP60, también referido como albondina, es una de las varias proteínas reportadas en la literatura que se unen a albúmina (Schnitzer y Oh, J. Biol. Chem 269 (8): 6072- 6082 (1994)). Otras incluyen SPARC (proteína de suero, acida, rica en cisteína), oesteonectina o proteína 40 de basamento de membrana, GP30, GP18 y GP60. La SPARC y la oesteonectina son proteínas extracelulares. GP60 comparte algo de homología con SPARC, según se determinó usando anticuerpos anti-SPARC (Schnitzer y Oh, Am. J. Physiol. 263: H1872-H1879 (1992). GP18 y GP30 son glicoproteínas de membrana encontradas en una variedad de tipos celulares, pero prevalecen particularmente en el macrófago (Schitzer y otros, J. Biol. Chem. 267: 24544-24553 (1992)). GP18 y GP30 son los denominados "receptores barredores" responsables de mediar la remoción de las formas oxidadas, glicadas o de aducto de la albúmina, por medio de endocitosis, y de esta manera se cree que tienen una función en el catabolismo de la albúmina para una gran variedad de órganos (Schnitzer and Bravo, J. Biol. Chem. 268(10): 7562-7570 (1993)). En contraste con GP18 y GP30, se ha encontrado que el receptor de GP60 se expresa exclusivamente en endotelio continuo de la vasculatura (Schnitzer, Am. J. Physiol. 262:H246-H254 (1992)), en epitelio alveolar (Kim y otros, Am.

J. Resp. and Crit. Care Med. 151:A190 (1994) e inferencialmente en el mesotelio peritoneal (Gotloib y Shostak, Kidney International. 47:1274-1284 (1995)). GP60 es particularmente abundante en el endotelio de microvasos y, de manera interesante, está ausente de la barrera hematoencefálica, en donde se observa poco flujo de albúmina (Rousseaux y otros, Methods in Enzymology 121:163 (1986)). Se ha visto que anticuerpos policlonales contra GP60 endotelial también se unen a GP60 del epitelio alveolar (Kim y otros, precitados). El receptor GP60 ha sido implicado en transcitosis mediada por receptor de albúmina a través de las barreras celulares de epitelio y endotelio (Kim y otros, precitados; Trirrupathi y otros, Molecular Biology of the Cell 4 (Supp) :338a, Abstract No. 1964 (1993)). Se conoce en la técnica la secuencia de aminoácidos de GP60 (Yamauchi y otros, Biochem. Biophys. Res. Comm. 146:1485 (1987)).

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención provee vehículos incrementadores de transcitosis capaces de transportar agentes fisiológicamente activos a través del epitelio, endotelio y mesotelio que contienen el receptor GP60. El receptor GP60 ha sido implicado en la transcitosis mediada por receptor de albúmina a través de las barreras celulares. Por medio de la invención, puede explotarse la transcitosis mediada por el receptor GP60 para el transporte, no solo de albúmina, sino también de agentes fisiológicamente activos que no pasan de manera natural a través del epitelio, endotelio y mesotelio mediante el sistema GP60. Los vehículos e incrementadores de transcitosis de la invención incluyen albúmina, fragmentos de albúmina, anticuerpos policlonales y monoclonales anti-GP60, fragmentos de anticuerpo policlonal y monoclonal anti-GP60, y fragmentos de péptido de GP60. También incluyen PDI (disulfuro isomerasa de proteína) y fragmentos de la misma (cualquier referencia subsecuente a fragmentos de GP60 puede ser interpretada como referente también a fragmentos de PDI). Un factor común puede ser un motif CGMC encontrado en PDI y por lo menos el fragmento TI- A de GP60. Si el vehículo o mejorador de transcitosis es un fragmento de péptido de GP60, se coadministra de preferencia con otros vehículos o incrementadores de transcitosis de la presente invención tales como albúmina o un fragmento de albúmina. Pueden generarse fragmentos adecuados de albúmina de 14, 20 y 32 KDa mediante rompimiento en residuos de metionina, utilizando bromuro de cianógeno y pueden reducirse adicionalmente en tamaño mediante la reducción de puentes disulfuro. Los fragmentos de anticuerpo anti-GP60 policlonales y monoclonales útiles como vehículos e incrementadores de transcitosis de conformidad con la presente invención, incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, y Fv. Los fragmentos preferidos de péptido de GP60 incluyen el péptido T3118 que corresponde a los 18 aminoácidos del extremo N de la proteína GP60. De conformidad con la invención, cuando los compuestos anteriores se conjugan con un agente fisiológicamente activo, son referidos en la presente como "vehículos de transcitosis". Cuando se coadministran de manera no conjugada con un agente fisiológicamente activo, los compuestos anteriores son referidos en la presente como "incrementadores de transcitosis". En modalidades preferidas, los vehículos e incrementadores de transcitosis de la presente invención son útiles para liberar o incrementar el paso de agentes fisiológicamente activos a través del endotelio de la vasculatura, epitelio alveolar y mesotelio peritoneal.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Como su nombre lo indica, se ha reportado en la técnica que la proteína GP60 tiene un peso molecular de aproximadamente 60 KDa. Después de un análisis más cuidadoso, se ha descubierto que es mas probable que el peso molecular "verdadero" para esta proteína es de alrededor de 57 KDa. Esta discrepancia en peso molecular se considera debida a diferencias en la preparación de la proteína y a condiciones del gel. Sin embargo, para ser consistentes con la técnica, esta proteína está referida en la presente como el receptor GP60 (con excepción del Ejemplo 1 más adelante). Se ha descubierto que puede explotarse la transcitosis mediada por el receptor GP60 para el transporte no solo de albúmina, sino también para un vasto número de agentes terapéuticamente importantes fisiológicamente activos que no pasan de manera natural a través del epitelio, endotelio y mesotelio mediante el sistema GP60. De esta manera, la presente invención provee un método mejorado para transportar agentes fisiológicamente activos, por ejemplo los que tienen pesos moleculares relativamente altos, por ejemplo 50, 100, 150 kDa o más, a través de las barreras celulares del endotelio de la vasculatura, epitelio alveolar, bronquiolar y traqueal, y el mesotelio peritonial. Los vehículos de transitosis e incrementadores capaces de liberar o incrementar el pasaje de agentes fisiológicamente activos a través del endotelio, epitelio y mesotelio que contienen GP60, incluyen albúmina, fragmentos de albúmina, anticuerpos policlonales y monoclonales anti-GP60, fragmentos de anticuerpo policlonales y monoclonales anti-GP60, y fragmentos de péptido de GP60. Si el vehículo o incrementador de transitosis es un fragmento de péptido de GP60, de preferencia será coadministrado con otros vehículos o incrementadores de transitosis de la presente invención, tales como albúmina o un fragmento de albúmina. La albúmina de mamífero es bien conocida en la técnica y está disponible con facilidad. De preferencia, la albúmina usada será de la misma especie de mamífero que el paciente. Por ejemplo, si el paciente es humano, se usará de preferencia seroalbúmina humana como el vehículo o mejorador de transcitosis. De manera similar, si el paciente es equino o bovino, se usará de preferencia seroalbúmina equina o bovina, respectivamente . Los métodos para generar fragmentos de albúmina son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, el rompimiento de albúmina en los residuos de metionina por medio de bromuro de cianógeno produce 3 péptidos particularmente adecuados de 14, 20 y 32 kDa que pueden reducirse posteriormente en tamaño por reducción de los puentes disulfuro, a los péptidos que varían en tamaño de 3.3-20 kDa. Alternativamente, puede usarse digestión con proteasa para generar fragmentos de péptido de albúmina. De acuerdo con la prueba de selección de rutina descrita más adelante, puede determinarse si algún fragmento de albúmina en particular es útil como un vehículo o incrementador de transcitosis de conformidad con la presente invención. Como se indica en los ejemplos más adelante, se ha demostrado ahora que tanto la seroalbúmina bovina como la humana, actuando como incrementadores de transcitosis, estimulan la captación de un agente fisiológicamente activo de 2.5 a 4 veces con respecto al control . Pueden generarse anticuerpos policlonales y monoclonales anti-GP60 a partir del receptor GP60 purificado de endotelio, epitelio o mesotelio. Como se discutió anteriormente, las células endoteliales, epiteliales y mesoteliales que expresan el receptor GP60 incluyen el endotelio de la vasculatura, incluyendo el endotelio capilar (Ghinea y otros, J. Cell. Biol. 107: 231-239 (1988)); endotelio arterial (Silflinger-Bi rnboi y otros, J. Cellular Physiology 149: 575-584 (1991); endotelio aórtico venoso (Schnitzer y Oh, Am. J. Physiol. (1992), precitados); epitelio de tejido alveolar (Kim y otros , precitados); y mesotelio del peritoneo (Gotloib y Shistak, precitados). Puede purificarse GP60 de epitelio, endotelio y mesotelio de acuerdo con métodos conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, Schnitzer y Oh, J. Biol. Chem. (1994), precitados) y como se describe en el ejemplo 1 más adelante. Puede ocurrir producción de anticuerpos policlonales contra GP60 purificado o un fragmento de péptido de GP60 (tal como el péptido T 3118 discutido más adelante) en ratones, conejos, o cabras, siguiendo técnicas conocidas en la técnica. En el ejemplo 1 siguiente, el receptor GP60 se eluyó de SDS-PAGE para inmunizar conejos. Se inyectaron intramuscularmente alrededor de 50 microgramos de proteína por conejo, después de mezclar con un volumen igual de adyuvante completo de Freund. Se dio una segunda inyección después de dos semanas. Los conejos se sangraron a las 4 - 6 semanas después de la segunda inyección, y se probó su respuesta inmune. Después se purificó IgG de antisuero usando una columna de proteína A-Sepharose. También puede prepararse anticuerpo monoclonal de acuerdo con técnicas conocidas (Goding, J. Immunol. Methods 39:285 (1980); Oi y Herzenberg, Selected Methods in Cellular Immunology, p. 352, Freeman , San Francisco, (1979)). Por ejemplo, se inyectan ratones Balb/c intraperitonialmente con 50-150 µg de GP60 o un fragmento de péptido de GP60. De tres a cinco días antes de fusión, los ratones positivos reciben una inyección de refuerzo de antígeno (50-150 µg de GP60 o fragmento de GP60) y después 10 µg (ruta intravenosa e intraperitonial) todos los días hasta remoción del bazo. Las células del bazo se fusionaron con células de mieloma Sp2/0-Agl4, esencialmente de conformidad con St. Groth y otros, J. I munology Methods 35:1-21 81980). Se seleccionaron sobrenadantes de cultivo mediante ELISA usando GP60 no conjugado o fragmento de GP60 como antígeno. Después se prueban cultivos positivos mediante inmunofluorescencia y Western blotting sobre células C0S-1 transfectadas con ADNc, como se describe en Lutz y otros , Experimental Cell Research 175:109-124 (1988). Se clonan dos veces hibridomas que secretan anticuerpos específicos sobre agar suave. Cada hibridoma puede ser adaptado en medio SFRI-4 libre de suero. Para producción de fluido de ascitis, se inyectaron aproximadamente 2 x 106 células en ratones Balb/c preparados primitivos. Se efectuó determinación de clase y subclase usando un equipo de isotipificación. Tanto los sobrenadantes de cultivo SFRI como los fluidos de ascitis pueden usarse como fuentes de anticuerpo monoclonal . Como se discutió, los anticuerpos policlonales y monoclonales anti-GP60 y los fragmentos de anticuerpo de la presente invención son útiles como vehículos e incrementadores de transcitosis capaces de liberar o incrementar el paso de agentes fisiológicamente activos a través del endotelio, epitelio y mesotelio que contienen el receptor GP60. Los fragmentos de anticuerpo anti-GP60 útiles como vehículos o incrementadores de transcitosis de la presente invención, incluyen fragmentos que contienen dominios individuales de unión de antígeno (Fab) producidos por digestión de papaína; o fragmentos F(ab')2 producidos por digestión limitada con pepsina (Olsson y Kaplan, Methods in Enzymology 92:3 (1993)). Otros fragmentos adecuados incluyen Fab' y FV. Puede determinarse si algún fragmento de anticuerpo' particular es útil como vehículo o incrementador de transcitosis de acuerdo con la prueba de selección de rutina descrita más adelante. En el ejemplo 3 siguiente, se demuestra que la administración de anticuerpos policlonales anti-GP60 a 37°C provoca un incremento de 1.6 a 2 veces en la captación de un agente fisiológicamente activo con respecto al nivel de un control de suero prein une. De conformidad con la invención, los anticuerpos anti-GP60 desarrollados en animales diferentes a humanos, tales como ratones y ratas, son adecuados para administración a corto plazo solamente (es decir, dosificación no crónica) debido a la respuesta inmune adversa bien conocida a los anticuerpos extraños. Sin embargo, pueden usarse métodos descritos en la técnica para producir anticuerpos monoclonales humanos para el receptor GP60, para vencer los problemas de administración de monoclonas de múrido a humanos (Olsson y Kaplan precitados), haciendo con ello los anticuerpos adecuados para administración a largo plazo o crónica. Además, los anticuerpos de múrido de la presente invención pueden "humanizarse" mediante injerto quimérico o de CDR. La región de reconocimiento del anticuerpo de múrido es injertada en la región apropiada de un anticuerpo humano, para evitar o limitar una respuesta inmune adversa en un paciente. Los fragmentos de péptido de GP60 también son útiles como vehículos e incrementadores de transcitosis de conformidad con la presente invención. Los fragmentos de péptido de GP60 particularmente adecuados incluyen los primeros 18 aminoácidos del extremo N de GP60; se ha descubierto que este es por lo menos 80% homólogo a una extensión de la proteína de unión de la hormona tiroides de bovino unida a membrana (T3). Dichos fragmentos de péptido de GP60 pueden producirse de acuerdo con cualquier técnica enzimática o física conocida, incluyendo degradación proteolítica. Alternativamente, pueden producirse sintéticamente fragmentos del péptido GP60. Como se indica en el ejemplo 5 más adelante, un péptido de extremo N sintético (T3118) de GP60 correspondiente a los primeros 18 residuos, puede producirse por síntesis en fase sólida. Este péptido, actuando como un agonista de transcitosis, estimuló la captación de albúmina humana 5 veces con respecto al control. Los métodos para conjugar los vehículos de transcitosis de la presente invención con un agente fisiológicamente activo serán fácilmente evidentes para el técnico experto e incluyen, pero no se limitan a, conjugación de glutaraldehído que incluye formación de base de Schiff; reacción de carbodiimida entre proteínas y ácidos carboxílicos; activación de anhídrido de ácido de fármacos que contienen amina, seguido por unión a carbodiimida; activación de fármacos que contienen amina primaria con anhídrido 3-(2-piridilditio)propionato-N-succinimidilo, seguido por copulación con grupos cisteína de proteínas; copulación de alcoholes de azúcar con proteínas utilizando cloruro cianúrico; y conjugación entre aminas y grupos hidroxilo mediante bisperoxidación. Por ejemplo, la entidad de aminoazúcar de un agente fisiológicamente activo puede oxidarse mediante tratamiento con peryodato de sodio y unirse directamente a los residuos de lisina sobre un vehículo de transcitosis de la presente invención mediante formación de una base de Schiff, de conformidad con el método descrito en Hurwitz y otros, Cáncer Res. 35:1175-1181 (1975). Alternativamente, un agente fisiológicamente activo puede unirse a un vehículo de transcitosis de la presente invención mediante unión mediada por carbodiimida del grupo amino del agente activo con grupos carbonilo sobre el vehículo, o con un grupo aminoalquilo de conformidad con el método descrito en Hurwitz y otros, Int. J. Cáncer 21:747-755 (1978). El agente fisiológicamente activo también puede unirse a un vehículo de transcitosis de la presente invención entrecruzando el a inoazúcar, el agente activo y grupos amino del vehículo con glutaraldehído, de conformidad con el método descrito en Belles-Isles y otros, Br. J. Cáncer 41:841-842 (1980). Otros sitios de conjugación adecuados para conjugar agentes fisiológicamente activos con uno de los vehículos de transcitosis de la presente invención pueden determinarse rutinariamente de manera empírica. Por ejemplo, puede marcarse un vehículo de transcitosis de la presente invención con fluoresceína o 125I, ya sea antes o después de conjugación con un agente fisiológicamente activo tal como insulina. Después de conjugación y mareaje, puede usarse una prueba de selección tal como la descrita en los ejemplos más adelante para determinar la captación celular del endotelio, el flujo celular epitelial, o el flujo celular mesotelial de cualquier conjugado vehículo/agente activo candidato. Dicha prueba de selección de rutina permite al experto en la materia determinar cuales vehículos de transcitosis de la presente invención retienen la capacidad para sufrir transcitosis después de conjugarse en un sitio particular con un agente fisiológicamente activo. Dicha prueba también es útil para selección de rutina de fragmentos de albúmina candidatos, los fragmentos de anticuerpo anti-GP60 y fragmentos de péptido GP60, para determinar cuales son adecuados para usarse como vehículos e incrementadores de transcitosis de conformidad con la presente invención. La conjugación de agentes fisiológicamente activos con un vehículo de transcitosis de la presente invención es particularmente adecuada para liberación intravenosa de fármacos de peso molecular bajo, que de otra manera tienen vidas medias en suero demasiado cortas, o de fármacos de péptido que se degradan rápidamente en la corriente sanguínea o removidos por excreción de primer paso en el hígado. Desde luego, en caso en que el agente fisiológicamente activo esté conjugado covalentemente con uno de los vehículos de transcistosis de la presente invención, la actividad residual del agente terapéutico debe determinarse después de la conjugación. Las técnicas para analizar la actividad de un agente terapéutico están bien establecidas en la técnica, y muchos agentes terapéuticos han sido conjugados exitosamente reteniendo substancialmente su activad. Por ejemplo, la literatura describe conjugados entre ligandos de receptor, o fragmentos del mismo, y fármacos para promover transcitosis a través de la barrera hematoencefálica. Fukta y otros, Pharm. Research 11(12) :1681 (1994), describe conjugación de peroxidasa de rábano (HRP) con insulina, lo que permitió a HRP atravesar la barrera hematoencefálica. Los investigadores continuaron produciendo fragmentos de insulina que fueron seleccionados por su capacidad para unirse con el receptor de insulina sobre células endoteliales de microvasos de cerebro bovino en cultivo. De manera similar, otros sistemas de transcitosis permiten el paso de anticuerpos ligados con fármacos activos incluyendo, entre otros, anticuerpo-metotrexate, dirigido contra el receptor de transferrina (Friden y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88:4771 (1991)), y anticuerpo-polilisina, dirigido contra el receptor del factor de crecimiento epidérmico (Chen y otros, FEBS Lett. 338:167 (1994)). A diferencia de los vehículos de transcitosis, los incrementadores de transcitosis de la invención no están conjugados con el agente fisiológicamente activo. Se ha descubierto que la co-residencia sobre el epitelio, endotelio y mesotelio que contienen el receptor GP60, de uno de los incrementadores de transcitosis de la presente invención y un agente fisiológicamente activo, es suficiente para mejorar la captación y paso del agente a través de la barrera celular. Sin desear ligarse a teoría, los incrementadores de transcitosis de la presente invención aparentemente "disparan" el mecanismo de transcitosis mediado por GP60, estimulando con ello la captación mejorada de macromoléculas co- residentes, incluyendo los agentes terapéuticos. La captación o paso de agentes fisiológicamente activos por o a través del epitelio, endotelio y mesotelio, puede ser inducida o incrementada con cualquiera de los incrementadores de transcitosis de la presente invención, ya sea solo o en combinación. Por ejemplo, los experimentos siguientes demuestran que, actuando como un agonista de transcitosis, el péptido de GP60, T3118, incrementó la captación de albúmina humana 5 veces con respecto al control. En una modalidad adicional de la presente invención, puede lograrse la liberación de agentes activos cuando uno de los conjugados de vehículo de transcitosis discutidos anteriormente se administra junto con uno o más de los incrementadores de transcitosis de la presente invención. Los conjugados de vehículos de transcitosis y las composiciones mejoradoras de transcitosis (incluyendo un agente activo) de la presente invención, se puede administrar con un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable, es decir, sustancias orgánicas o inorgánicas farmacéuticamente aceptables, adecuadas para su aplicación, que no reaccionan nocivamente con el conjugado ni con la composición. Las sustancias farmacéuticamente aceptables adecuadas incluyen, pero no se limitan a, agua, soluciones salinas, alcohol, aceites vegetales, polietilenglicoles, gelatina, lactosa, amilosa, estiarato de magnesio, talco, ácido silícico, parafina viscosa, aceite de perfume, monoglicéridos y diglicéridos de ácidos grasos, esteres de ácidos grasos de petróleo, hidroximetilcelulosa, polivinilpirrolidona, etc. Las preparaciones farmacéuticas pueden esterilizarse, y si se desea, mezclarse con agentes auxiliares tales como lubricantes, conservadores, estabilizadores, agentes humectantes, emulsionantes, sales para afectar la presión osmótica, reguladores de pH, colorante, sustancias saborizantes y/o aromáticas, que no reaccionan nocivamente con los conjugados. Para aplicación parenteral, las preparaciones particularmente adecuadas son soluciones, de preferencia soluciones oleosas y acuosas, así como suspensiones, emulsiones o implante, incluyendo supositorios. Las ampolletas son dosificaciones unitarias convenientes. Para aplicación enteral, las preparaciones particularmente adecuadas son tabletas, grageas, o cápsulas, que tienen un vehículo aglutinante tal como talco y/o un carbohidrato, el vehículo preferiblemente es lactosa y/o almidón de maíz y/o almidón de papa. Puede usarse un jarabe, elixir o similar en los cuales se emplea un vehículo endulzado. Pueden formularse composiciones de liberación sostenida incluyendo aquellas en las cuales el componente activo está protegido con recubrimientos diferencialmente degradables por ejemplo, por medio de microencapsulación, recubrimientos múltiples, etc. La administración de un conjugado o composición que comprende uno o más de los agentes fisiológicamente activos y uno o más de los vehículos o incrementadores de transcitosis de la presente invención, puede hacerse de conformidad con cualquier técnica conocida, incluyendo inyección, o a través de las vías respiratorias pulmonares. La inyección es particularmente adecuada para administración a la vasculatura y el peritoneo, mientras que las vías respiratorias pulmonares son particularmente adecuadas para administración a los alveolos. Las formulaciones adecuadas para administración pulmonar incluyen uno o más de los incrementadores de transcitosis de la presente invención en mezcla con un agente fisilógica ente activo. Formulaciones adecuadas alternativas para administración pulmonar incluyen un vehículo de transcitosis conjugado con el agente. Por ejemplo, pueden hacerse formulaciones de un dispositivo nebulizador tal como un nebulizador de chorro Acorn o DeVilbiss, en el cual el agente y el incrementador o vehículo de transcitosis se presentan como una solución acuosa en el depósito nebulizador. Alternativamente, en una modalidad preferida para administración pulmonar, la formulación se descarga desde un dispositivo inhalador de polvo seco (DPI). Se describen dispositivos DPI en Sutton y otros, en la Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. 08/487,420 y en WO-9609814. Requieren secar por aspersión la formulación en micropartículas de 2 a 5 mieras, que se prefieren para penetración alveolar. En particular, se usa para secado por aspersión un incrementador o vehículo de transcitosis de la presente invención o una mezcla de los mismos, de preferencia a una concentración de aproximadamente 20% p/v. La preparación por asperjar puede contener sustancias diferentes de los incrementadores o vehículos de transcitosis, y solvente o portador líquido. Por ejemplo, la fase acuosa puede contener 1 a 20% en peso de compuestos hidrofílicos solubles en agua, tales como azúcares y polímeros como estabilizadores, por ejemplo, alcohol polivinílico (PVA), polivinilpirrolidona (PVP), polietilenglicol (PEG), gelatina, ácido poliglutámico y polisacáridos tales como almidón, dextrano, agar, xantina y similares. Pueden usarse fases acuosas similares como el portador líquido en el cual se suspende el producto de microesferas final antes de usarse. Pueden usarse emulsionantes (0.1-5% en peso), incluyendo la mayoría de los emulsionantes fisiológicamente aceptables, por ejemplo lecitina de huevo o lecitina de soya o lecitinas sintéticas tales como lecitinas sintéticas saturadas, por ejemplo, dimi ristoilfosfatidilcolina, dipalmitoilfosfatidilcolidina, o distearoilfosfatidilcolina o lecitinas sintéticas insaturadas, tales como dioleilfosfatidilcolina o dilinoleilfosfatidinilcolina. Los emulsionantes también incluyen agentes tensioactivos tales como ácidos grasos libres, esteres de ácidos grasos con compuestos de poliaxialquileno, por ejemplo, polioxipropilenglicol y polioxietilenglicol; éteres de alcoholes grasos con polioxialquilenglicoles; esteres de ácidos grasos con sorbitan polioxialquilado; jabones; ricinoleato de glicerol-polioxietileno; homo y copolímeros de polialquilenglicoles; aceite de soya polietoxilado y aceite de ricino, así como derivados hidrogenados; éteres y esteres de sacarosa u otros carbohidratos con ácidos grasos, alcoholes grasos, estando estos opcionalmente polioxialquilados; mono, di- y trigliceridos de ácidos grasos saturados o insaturados, glicéridos o aceite de soya y sacarosa. Pueden incorporarse aditivos en la pared de las microesferas para modificar las propiedades físicas tales como dispersabilidad, elasticidad y permeabilidad al agua. Entre los aditivos útiles se incluyen compuestos que pueden "hacer hidrofóbica" la pared para disminuir la permeabilidad al agua, tales como grasas, ceras e hidrocarburos de peso molecular alto. Los aditivos que mejoran la dispersabilidad de las microesferas en el vehículo líquido inyectable son compuestos anfifáticos tales como fosfolípidos; también incrementan la permeabilidad al agua y el índice de biodegradabilidad. Los aditivos que incrementan la elasticidad de la pared incluyen plastificantes tales como miristato de isopropilo y similares. La cantidad de aditivos por incorporar en la pared es extremadamente variable y depende de las necesidades. En algunas aplicaciones, no se usa ningún aditivo; en otros casos, son posibles cantidades de aditivos que pueden alcanzar aproximadamente 20% en peso de la pared. Una solución que contiene uno o más incrementadores o vehículos de transcitosis de la presente invención y aditivo, si es el caso, es atomizada y secada por aspersión mediante cualquier técnica adecuada que origina microesferas o microcápsulas discretas de 2 a 5 mieras, como se discutió anteriormente. Como se usa en la presente, "microcápsulas" se refiere a partículas huecas que encierran un espacio, este espacio está lleno con un gas o un vapor pero con ningún material sólido. La atomización forma un aerosol de la formulación de vehículo o incrementador de transcitosis, por ejemplo forzando la formulación a través de un orificio bajo presión, o usando un atomizador de centrífuga en una cámara de aire caliente u otro gas inerte. La cámara debe ser lo suficientemente grande para que las gotas expulsadas más grandes no choquen con las paredes antes de secarse. El gas o vapor en la cámara es limpio (preferiblemente estéril y libre de pirógenos) y no tóxico cuando se administra a la corriente sanguínea en cantidades concomitantes con la administración de las microcápsulas en uso. La velocidad de evaporación del líquido de la preparación debe ser lo suficientemente alta para formar microcápsulas huecas, pero no tan alta como para reventar las microcápsulas. La velocidad de evaporación puede controlarse variando la velocidad de flujo del gas, la concentración de vehículo o incrementador de transcitosis en la formulación, la naturaleza del vehículo líquido, la velocidad de alimentación de la solución y, de manera más importante, de la temperatura del gas encontrada por el aerosol. Por ejemplo, una concentración de albúmina o fragmento de albúmina de 15 a 25% en agua, y una temperatura de gas a la entrada de por lo menos aproximadamente 100°C, de preferencia por lo menos 110°C, es suficiente para asegurar la cavidad, y la temperatura puede ser tan alta como 250°C sin reventar la cápsula. Lo óptimo es de aproximadamente 180 a 240°C, de preferencia aproximadamente 210-230°C y muy preferiblemente aproximadamente 220°C. Puesto que la temperatura del gas encontrado por el aerosol dependerá también de la velocidad a la cual se libera el aerosol, y del contenido líquido de la preparación, la temperatura de salida puede monitorearse para asegurar una temperatura adecuada en la cámara. Es adecuada una temperatura de salida de 40 a 150°C. El control de la velocidad de flujo es útil para controlar otros parámetros tales como el número de partículas huecas intactas. Las microp rtículas pueden comprender por lo menos 50%, de preferencia 70% u 80%, y de preferencia 90% en peso de incrementador de transcitosis. Para usarse en un dispositivo inhalador, las micropartículas pueden formularse con un excipiente convencional tal como lactosa o glucosa. La cantidad de agente fisiológicamente activo será elegida tomando en cuenta su naturaleza y actividad, el modo de administración y otros factores conocidos por el experto en la materia. A manera de ejemplo, el número de partículas administradas puede ser tal como para liberar 100 mg/día de a-l anti-tripsina o 0.1 mg/día de un agente activo tal como beclometasona. Más adelante, se dan otros posibles agentes fisiológicamente activos que pueden administrarse mediante micropartículas. Una modalidad adicional de la presente invención es el secado por aspersión conjunto del agente fisiológicamente activo con el incrementador de transcitosis para facilitar la estabilización del agente activo mediante la formulación, empaque, y lo que es más importante, durante la residencia en el revestimiento alveolar. En este medio, puede haber una intensa actividad proteolítica. En esta u otra modalidad, el agente activo puede estar unido covalentemente con el vehículo de transcitosis mediante uniones que se pueden romper antes de secado por aspersión. Esta modalidad representa un método para llevar el agente activo en todo el camino desde el dispositivo hasta la corriente sanguínea, y posiblemente a los blancos dentro del cuerpo. La formación de partículas con tamaño aerodinámico óptimo significa que el vehículo "físico" libera el agente activo hasta el sitio de absorción. Una vez depositado sobre los alveolos, el vehículo " molecular" protege y facilita el paso hacia la corriente sanguínea mediante el sistema de transcitosis mediado por GP60 y, una vez en la corriente sanguínea, puede incrementar la vida media circulatoria e inclusive dirigir el agente activo a ciertos sitios que contienen el receptor GP60. Tecnologías de unión adecuadas se discutieron anteriormente; además, WP-A-9317713 describe enlazadores de ácido polihidroxílico sensibles a esterasa. Dicha tecnología, usada en la derivación del vehículo de transcitosis antes del secado por aspersión, permite la producción de un sistema de vehículo covalente para liberación de agentes activos a la vasculatura general. Este utiliza el potencial de los vehículos de transcitosis para atravesar los alveolos y llevar agentes activos durante un período prolongado, mientras se protegen entidades potencialmente inestables. Aunque el agente fisiológicamente activo usado en la presente invención puede ser incluido o asociado de otra manera con las micropartículas después de su formulación, de preferencia se formula con el vehículo o incrementador de transcitosis. Las micropartículas pueden ser por lo menos parcialmente recubiertas con un material hidrofóbico o insoluble en agua tal como un ácido graso, para retrasar su velocidad de disolución y para protegerlo contra crecimiento hidroscópico. Se describen en más detalle métodos y equipo para secado por aspersión y generación de las micropartículas, por ejemplo para usarse en un dispositivo inhalador de polvo seco, en W0-A-9609814 y en la solicitud de Patente de los Estados Unidos No. 08/487,480, los contenidos de las cuales se incorporan en la presente como referencia. Las proporciones óptimas de fármaco a incrementador de transcitosis en una formulación para liberación pulmonar pueden determinarse de acuerdo con cualquier método adecuado. Una optimización in vitro de la formulación incluye el uso de monocapas epiteliales de células epiteliales humanas inmortalizadas o humanas primarias desarrolladas como monocapas sobre filtros porosos, como se describe en los ejemplos siguientes. Las combinaciones de fármaco e incrementador pueden aplicarse entonces a la cámara superior de un sistema de flujo a través de pozo, también como se describe más adelante. Usando ya sea un trazador marcado o un inmunoensayo, se determinan las velocidades de flujo del fármaco o gen a la capa inferior. La formulación óptima está definida como aquella que muestra velocidad y magnitud máxima de paso a través de la monocapa restrictiva. Una manera alternativa de optimizar la formulación abarca efectuar una determinación in vivo de pulmón del paso sanguíneo del fármaco bajo investigación. Hay estudios bien reportados en rata, cerdo y oveja (Patton y otros, Journal of Controlled Reléase 28:79 (1994), Folkesson y otros, Acta. Physiol. Scand. 147:73 (1993); Schreier y otros, Pharm. Res. 111056 (1994)); estos estudios describen métodos para instilar o aplicar como aerosol formulaciones de fármaco en la tráquea y bronquiolos y determinar la aparición en sangre del fármaco mediante inmunoensayo o actividad farmacológica. La optimización abarcaría una serie de preparaciones de animales usando diferentes proporciones del fármaco e incrementador; la formulación óptima se define como el área bajo la curva más benéfica que se iguala con el perfil farmacológico deseado del fármaco. Por ejemplo, puede requerirse simplemente que el fármaco muestre biodisponibilidad máxima, o alternativamente muestre un perfil de liberación sostenida o prolongada. Para cada caso, es probable que haya requerimientos diferentes en cuanto al nivel de incrementador incorporado en la formulación. Para fármacos que requieren disponibilidad máxima, sería conveniente utilizar el nivel máximo de incrementador y/o el incrementador que muestre el efecto de activación más alto sobre el receptor GP60. Para fármacos que requieren un período más largo de presentación a través del pulmón, sería conveniente utilizar niveles inferiores de incrementador y/o incrementadores que muestran potencial de activación menor sobre el receptor GP60 de transcitosis. La "fuerza" del incrementador o vehículo puede definirse por la magnitud en la que puede incrementarse la transcitosis de un trazado dado, por medio de la presencia del ligando de unión al receptor GP60, anticuerpo o mimético, sobre el nivel de transcitosis en ausencia del ligando. La "fuerza" del agente incrementador también puede ser un poco dependiente del fármaco. El incrementador de la captación de marcador puede variar dependiendo de la naturaleza del marcador y del incrementador de transcitosis. A continuación se tabula una sinopsis de los marcadores, incrementadores, sistema celular y magnitud de incremento sobre el control logrado para diferentes sistemas celulares de marcadores y tipo experimental. Abreviaciones usadas: 125I-BSA Albúmina bovina marcada con yodo125 125I-IgG Inmunoglobulina G marcada con yodo125 HSA Albúmina humana BSA Albúmina bovina FITC-Insulina Insulina marcada con fluoresceína GP60 Ab Anticuerpo policlonal Anti-GP60 T3118 Péptido sintético derivado de 18 residuos del extremo N de GP 60 Por "agente fisiológicamente activo", se entiende fármacos que incluyen moléculas de ácido nucleico y péptidos y proteínas medicinales. "Agente fisiológicamente activo" se utiliza recíprocamente en la presente invención con "fármaco", "activo", "agente activo" y "terapéutico". Los fármacos que se beneficiarían de una transcitosis más rápida a través de los endotelios y epitelios incluyen hormona luteinizante, (LH), gonadotropina coriónica, péptidos auriculares, interferón, las diferentes linfocinas tales como las interleucinas (I, II, III, IV, V, VI y VII), y los factores que estimulan la formación de colonias. Otros fármacos adecuados para utilizarse en la presente invención incluyen: factor liberador de hormona de crecimiento, factor liberador de corticotropina, hormona liberadora de hormona luteinizante (LHRH), somatostatina, calcitonina, hormona liberadora de tirotropina, péptido relacionado al gen de calcitonina (CGRP), proteínas tales como enzimas, incluyendo transferasas, hidrolasas, isomerasas, proteasas, ligasas, oxido rreductasas, esterasas y fosfatasas, y varios factores neurotróficos y del crecimiento, tales como somatomedinas, factores de crecimiento de la epidermis, urogastrona, factor de crecimiento de células nerviosas (NGF), factor neurotrófico ciliar (CNTF), factor neurotrófico derivado de células cerebrales (BDNF), factor neurotrófico derivado de células gliales (GDNF), factor de crecimiento de la epidermis (EGF), factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), factor de crecimiento similar a la insulina, factor de necrosis tumoral (FNT) y factor de crecimiento de transformación (TGF). Otros fármacos incluyen agonistas opioides endógenos, tales como encefalinas y endorfinas; hormonas hipotalá icas tales como gonadoliberina, melanostatina, melanoliberina, somatostatina, tiroliberina, substancia P y neurotensina; hormonas adenohipofisarias tales como corticotropina, lipotropina, melanotropina, lutropina, tirotropina, prolactina y somatotropina; hormonas neurohipofisarias; hormonas calcitrópicas (tiroides) tales como paratirina y calcitonina; factores tímicos tales como timosina, timopoyetina, factor timico circulante y factor tímico humoral; hormonas pancreáticas tales como insulina, glucagon y somatostatina; hormonas gastrointestinales tales como gastrina, colecistocinina, secretina, polipéptido gástrico inhibidor, péptido vasointestinal y motilina; hormonas ováricas tales como relaxina; hormonas vasoactivas de tejidos, tales como angiotensina y bradiquinina; y péptidos artificiales o pseudopéptidos tales como deferoxamina; y análogos de LHRH tales como buserelina, deslorelina, gonadorelina, goserelina, histerelina, leuprorelina, nafarelina o triptorelina. Habiendo descrito generalmente la invención, la misma se entenderá más fácilmente haciendo referencia a los siguientes ejemplos que se proveen a manera de ilustración, pero que no se pretende sean limitantes.

EJEMPLO 1 Crecimiento de monocapas endoteliales y epiteliales Se aislaron y cultivaron células endoteliales de microvasos pulmonares de bovino (BPMVEC) y células endoteliales de arteria pulmonar de bovino (BPAEC) de conformidad con métodos descritos (Del Vecchio y otros, In Vitro. Cell. Dev. Biol. 28A: 711-715 (1992)). Las células endoteliales fueron cultivadas como de costumbre con DMEM conteniendo FBS a 20%. Para aislar las membranas plasmáticas, las células endoteliales fueron cultivadas en frascos de rodillo de 850 cm3. A cada frasco de rodillo, se añadieron 75 ml de medio de cultivo. Se introdujo una mezcla de aire-C02. Las células fueron trasferidas después a una incubadora a 37°C, y se dejó que crecieran durante 10 a 12 días. Se aislaron células epiteliales alveolares primarias de rata (AEC) mediante métodos descritos en Uhal y otros, Am. J. Phisiol. 257: C528-C536 (1989). Las células se cultivaron en DMEM conteniendo FBS a 10% durante 2 a 4 días, tiempo en el que exhibieron respectivamente un fenotipo similar al de células de tipo II o tipo I. El fenotipo se verificó mediante métodos descritos por Uhal y otros, Am. J. Physiol. Suppl. 261: 110-117 (1991)).

Aislamiento de membranas de células endoteliales Células endoteliales cultivadas en frascos de rodillo se lavaron 2 veces con solución salina regulada en su pH con fosfato. Las células de los frascos de rodillo fueron raspadas y suspendidas en regulador de pH A (HEPES/Tris a 20 mM, NaCl a 0.15 M, PMSF a 0.1 mM a pH 7.4), y se lavaron 2 veces mediante centrifugación a 700 xg durante 10 minutos. Las células obtenidas de frascos de 6 a 8 rodillos fueron suspendidas en 75 ml de regulador de pH A y homogenizadas utilizando un homogenizador Polytron durante 1 minuto a velocidad total. El homogenizado se centrifugó a 3000 xg durante 10 minutos. El sobrenadante se recogió y se centrifugó a 40,000 xg durante 60 minutos. La pella obtenida se suspendió después en regulador de pH A y se volvió a centrifugar a 40,000 xg durante 60 minutos.

La pella final de membrana se suspendió en un volumen pequeño de regulador de pH A conteniendo EDTA a 0.2 mM, y se determinó la concentración de proteína (Lowry y otros, J. Biol. Chem. 193:265-275 (1951)). Se determinaron las actividades de la enzima marcadora de membrana plasmática, y la muestra se almacenó a -70°C hasta su uso posterior.

Blotting del ligando Se incubaron previamente las membranas de las células endoteliales con PMSF a 1 mM y EDTA A 0.5 mM durante 20 minutos a 22°C, y después se solubilizaron mezclándolas con 1.5 volúmenes de regulador de pH para solubilización (urea a 9M, SDS A 2%, (1-mercaptoetanol a 2%, Tris a 0.1 M, azul de bromofenol a 0.02%, pH 6.8). La mezcla se incubó a 22°C durante 30 minutos. Las proteínas solubilizadas se separaron mediante SDS-PAGE (Laemmli, Nature (Londres) 227:680-685 (1970)) utilizando un sistema electroforético de gel viscoso con acrilamida a 3% en el gel hacinante y acrilamida a 10% en el gel de separación. Después de electroforesis, las proteínas fueron transferidas a PVDF o membrana de nitrocelulosa. La transferencia se llevó a cabo durante 2 horas a 150 volts utilizando Tris a 25 mM, glicina a 192 mM y metanol a 20% como regulador de pH para transferencia. La unión no específica fue bloqueada incubando la membrana con CaCl2 a 5 mM en TBS (Tris a 20 mM, NaCl a 0.5 M, pH 7.5) durante 10 minutos, y después con Tween-20 a 0.5% en TBS durante la noche. Después de este paso, la membrana se lavó y se cortó en dos tiras. Una tira fue incubada durante 2 horas con 0.6 mg/ml de BSA libre de globulina en TBS conteniendo gelatina a 1.5%, y la otra tira fue incubada sin BSA. Las tiras fueron lavadas e incubadas con BSA antibovino durante 60 minutos en TBS conteniendo gelatina a 1.5%. Después, las membranas se lavaron 2 veces y se incubaron con el segundo anticuerpo (IgG anticonejo de cabra) conjugado con fosfatasa alcalina. Las bandas de proteína se localizaron después de añadir fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolilo y sal nitroazul de tetrazolio.

Purificación de la proteina Se utilizaron membranas de BPMVEC para aislar una proteína de unión a albúmina de 57 kDa. Se llevó a cabo el blotting del ligando para evaluar la presencia de esta proteína en cada paso. Las membranas de BPMVEC (100 mg) fueron preincubadas con PMSF a 1 mM y EDTA a 0.5 mM durante 30 minutos a 22°C. Las membranas fueron solubilizadas utilizando una concentración final de colato de sodio a 2.5% y urea a 4 M, a 4°C durante 3 horas, con agitación moderada. La concentración de proteína se ajustó a 4 mg/ml durante la solubilización.

Después de este tratamiento, la suspensión se centrifugó a 100,000 xg durante 60 minutos. El sobrenadante se recogió y se dializó contra HEPES/Tris a 5 mM (pH 7.2). Se recuperó más del 80% de proteínas de la membrana en el sobrenadante. La suspensión dializada se concentró mediante precipitación con etanol a 60% a 4°C. El precipitado de etanol se recogió mediante centrifugación a 10,000 xg durante 30 minutos a 4°C, y se suspendió en regulador de pH A. Este precipitado se solubilizó con Tritón X-100 a 2.5% durante la noche a 4°C con agitación moderada. La suspensión se centrifugó a 100,000 xg durante 60 minutos. El sobrenadante se recogió y se dializó contra 4 1 de Tris-HCl a 50mM, EDTA a 0.2 mM, Tritón x-100 a 0.15% y PMSF a 0.1 mM a pH 8.0 (regulador de pH B) . El extracto dializado se aplicó sobre una columna DEAE-52 (10 x 13 cm) . La columna se equilibró previamente con regulador de pH B. La columna se lavó con 50 ml de regulador de pH B después de aplicar la muestra. Las proteínas enlazadas fueron eluidas de la columna con 80 ml de gradiente lineal de NaCl de 0 a 500 mM en regulador de pH B a una velocidad de flujo de 15 ml/hora. Las fracciones de los picos individuales fueron combinadas por separado y concentradas mediante precipitación con acetona a 50%. El precipitado de acetona se utilizó para el blotting del ligando. Sólo el pico I mostró actividad de unión a la albúmina. Las proteínas presentes en el pico I se separaron después utilizando SDS-PAGE preparativa (16 cm x 16 cm, gel viscoso de 3 mm de espesor), y una proteína de 57 kDa eluida a partir del gel se utilizó para estudios posteriores.

Producción y purificación de anticuerpos La proteína de unión a la albúmina de 57 kDa eluida a partir de SDS-PAGE preparativa se utilizó para inmunizar conejos. Se inyectaron intramuscularmente aproximadamente 50 µg de proteína (por conejo) después de mezclarla con un volumen igual de adyuvante completo de Freund. Una segunda inyección se administró dos semanas después. Los conejos fueron desangrados en cuatro a seis semanas después de la segunda inyección, y se verificó la respuesta inmune. La IgG de suero preinmune y la IgG de antisuero se purificaron utilizando una columna de sefarosa A para proteínas.

Inmunoblotting Se sometieron las membranas de células endoteliales a SDS-PAGE, (Laemmli, citado anteriormente), y se transfirieron electroforéticamente a nitrocelulosa o membrana de PVDF. La unión no específica fue bloqueada con gelatina a 3% en TBS durante 5 horas a 22°C. La membrana se lavó 2 veces con Tween-20 a 0.5% en TBS, y se incubó con antisuero diluido en TBS conteniendo gelatina a 1%. La incubación se llevó a cabo durante 4 a 6 horas, se lavó 2 veces y después se incubó durante 60 minutos con el segundo anticuerpo (IgG anticonejo de cabra acoplado a fosfatasa alcalina). Después de incubación, las membranas se lavaron dos veces y las bandas de proteína se localizaron como se describió bajo el "Blotting del ligando". Los pesos moleculares de las proteínas se determinaron utilizando proteínas marcadoras conocidas.

Estudios de unión de la monocapa Se sembraron BPMVEC (3 x 105 células/pozo) en placas de cultivo de tejidos Corning de 6 pozos, y se desarrollaron hasta confluencia. Las monocapas se lavaron dos veces con medio libre de suero (HEPES/DMEM a 20 mM, pH 7.4), y se incubaron con medio libre de suero durante 15 a 20 horas en una incubadora para cultivo de tejidos. Después de esta incubación, las monocapae se lavaron dos veces con regulador de pH de unión (HEPES/Tris HBSS a 20 mM, pH 7.4), y la unión se inició añadiendo 1 ml de 125I-BSA a 1 µM en regulador de pH de unión. La incubación se llevó a cabo a 4°C durante 60 minutos. La unión se terminó lavando la monocapa tres veces con el regulador de pH de unión. La radioactividad asociada con la monocapa se determinó después de lisar las células con NaOH 1 N (Tiruppathi y otros, Am. J. Physiol. (Lung. Cell. Mol. Physiol.) L595-L601 (1992)). La unión no específica se determinó mediante la inclusión de BSA no marcado (40 mg/ml) durante el proceso de unión. Los componentes de prueba, IgG de suero preinmune y la anti-IgG de 57 kDa, se preincubaron durante 30 minutos con la monocapa antes de la adición de i 5i-BSA. Experimentos de flujo transcelular Se utilizaron las velocidades de flujo de 25i-albúmina transendoteliales en monocapas endoteliales cultivadas para evaluar el transporte de albúmina transendotelial . El sistema utilizado para eete estudio había sido descrito anteriormente (Cooper y otros, J. Appl. Physiol. 62:1076-1083 (1987); García y otros, J. Cell. Physiol. 128:96-104 (1986); Del Vecchio y otros, Vitro. Cell. Dev. Biol. 28A:711-715 (1992) y Siflinger-Birnboirn y otros, J. Cell. Physiol. 132:111-117 (1987)). El sistema mide el movimiento transendotelial de macromoléculas de indicador radioactivo en ausencia de gradientes de presión hidrostáticos y oncóticos. Consiste de compartimientos luminal y albuminal, compartimientos separados por un filtro microporoso de bicarbonato (diámetro de poro de 0.8 µm). Se sembraron BPMVEC a 105 células/filtro, y se cultivaron durante 3 a 4 días hasta lograr confluencia. Ambos compartimientos contenían el mismo medio (HEPES-DMEM a 20 mM, pH 7.4) a volúmenes de 600 ml y 25 ml , respectivamente. El compartimiento luminal se ajustó con un anillo exterior Styforoam, y "se dejó flotar" en el medio abluminal, de modo que los niveles de fluido permanecieran iguales después de muéstreos repetidos del compartimiento abluminal. El compartimiento abluminal se agitó continuamente, y todo el sistema se mantuvo a 37°C mediante un baño de agua termostáticamente regulado. La depuración transendotelial de la 125I-albúmina se determinó como el volumen de radioactividad de la cámara luminal depurado en la cámara abluminal. El cambio en volumen con el tiempo proveyó el régimen de depuración de 12SI-albúmina en µl/min, determinada mediante análisis de regresión no lineal de mínimos cuadrados (BMDP Statistical Software, Berkeley, CA).

Al inicio del experimento, el compartimiento luminal se puso a flotar en el medio abluminal, y se llenó con medio conteniendo aproximadamente 6 µCi/ml de 12S I-albúmina. Se recogieron muestras abluminales de 400 µl a intervalos de 10 minutos durante hasta 60 minutos, y la radioactividad se midió utilizando un contador gamma. Al final del experimento, se determinó el 12!>I libre en los compartimientos luminal y abluminal utilizando precipitación de TCA a 12%, y las velocidades de flujo de 125 I-albúmina transendoteliales se corrigieron para i2^! libre. El día antes del experimento, las monocapas de BPMVEC se lavaron doe veces con HEPES-DMEM a 20 mM, pH 7.4 (medio libre de suero), y se incubaron a 37°C durante 12 a 15 horas en la incubadora para cultivo de células con medio libre de suero. Después de este período de incubación, los componentes de prueba (IgG de suero preinmune y la anti-IgG de 57 kDa) se diluyeron en medio libre de suero y se incubaron con las monocapas durante los períodos deseados. Estas monocapas se utilizaron despuée para la medición del traneporte de albúmina transendotelial. Las velocidades de flujo transepitelial se midieron con modificación ligera del método descrito para células endoteliales. Se determinaron las velocidades de flujo en AEC primarias o la linea A549 de células de carcinoma pulmonar de humano cultivadas como se describe en filtros Transwell (Costar) (Evans y otros, Exper. Cell Res. 184:375-387 (1989)).

La integridad de la monocapa se define mediante resistencia eléctrica transepitelial , siendo mayor de 500 ohme/crri2. Se colocaron filtroe con monocapas intactas en una placa de cultivo de 24 pozos conteniendo 1 ml de DMEM libre de suero por pozo (cámara abluminal). La cámara luminal se llenó con 200 µl de DMEM libre de suero conteniendo la molécula de indicador radioactivo de interés (FITC-Insulina) . Los niveles de fluido en los dos compartimientos fueron loe miemoe, eliminando la presión hidrostática. El sietema de filtro ee preincubó (30 min) y ee mantuvo deepuée a 37ßC en una incubadora de CO2 durante todo el experimento de flujo. Durante 1 y 2 horae, ee obtuvieron ueetrae de 300 µl de la cámara abluminal, y ee reemplazaron de inmediato con DMEM libre de suero. La fluorescencia del material sometido a transcitosie ee regietró en un lector de placa, y la relación de FITC unido contra libre ee determinó mediante cromatografía de filtración de gel de lae muestras abluminales.

Distribución de filamentos de actina Se eetudió la dietribución de loe fila entoe de actina y loe cambioe citoeequeléticoe en monocapae endoteliales cultivadas sobre los filtros bajo condiciones idénticas a aquellas utilizadas para la medición de los regímenes de depuración de 125 I-albúmina. Después del período de tratamiento previo requerido con los componentes de prueba, las monocapas del filtro se fijaron en formalina a 10% regulada en su pH (Palleecences Inc., Warrington, PA), ee permeabiliza ron con Nonidet P40 a 1% (Sigma), y se tiñeron con faloidina de rodamina (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR) como ee deecribe en Phillipe y Tean, J. Histoche . Cytoche . 36:551-554 (1988). Los filtros intactos que contienen a las monocapas se removieron de los pozos y se montaron sobre cubreobjetos, se cubrieron con una solución de glicerina 1:1 en solución salina regulada en su pH con foefato, y deepuée ee cubrieron con un cubreobjetoe redondo y ee sellaron. Los cortes se analizaron utilizando un microscopio fluorescente Nikon Lab Diaphot (Nikon Inc., Melville, New York) y se fotografiaron utilizando una película Kodak TRI X Pan 400 ASA.

Identificación de proteínas de unión a la albúmina Se aielaron primero lae membranae plaemáticae de BPMVEC mediante centrifugación diferencial, y lae proteínae de unión a la albúmina preeentee en esta fracción de membrana ee identificaron utilizando el blotting del ligando (véaee anteriormente). Se deearrolló un método eimple para identificar proteínae nativas de unión a la albúmina en membranae de célulae endotelialee. Lae proteínas de la membrana se separaron utilizando SDS-PAGE, y después se transfirieron a PVDF o nitrocelulosa. La unión no específica se bloqueó incubando las tiras de membrana con Tween-20, y despuée ee trataron con BSA nativo monomérico libre de globulina. Las regiones de unión a BSA se identificaron utilizando anticuefo policlonal producido contra BSA nativo. El aueencia de expoeición de la tira de membrana a BSA nativo, el anti-BSA reconoció sólo un polipéptido de 67 kDa, indicando la presencia de una cantidad eignificativa de BSA unido a lae membranae de las células endoteliales. Sin embargo, cuando la tira fue tratada con BSA, el anticuefo anti-BSA reaccionó con 3 polipéptidos adicionales (110 kDa, 57 kDa y 18 kDa). De estos polipéptidos, el anticuerpo reaccionó más intensamente con 57 kDa, indicando que el polipéptido de 57 kDa es la proteína nativa principal de unión a la albúmina. Fracciones totales de membrana de células endoteliales (fracción en partículas de 100,000xg de BPMVEC y BPAEC) se prepararon y utilizaron también para el blotting del ligando. Estas fracciones en partículas mostraron también una interacción primaria de BSA con el polipéptido de 5 kDa.

Aislamiento de la proteina de unión a la albúmina de 57 kDa Dado que la unión de la albúmina nativa se observó principalmente con la proteína de 57 de kDa, se desarrolló un método para aislar eeta proteína a partir de membranae de BPMVEC. Se utilizó el blotting del ligando para evaluar la presencia de eeta proteína durante la purificación. Lae membranas de BPMVEC fueron solubilizadas inicialmente con colato de sodio a 2.5% y urea a 4M, y el extracto ee dializó y concentró mediante precipitación con etanol a 60%. Eete precipitado ee volvió a extraer con Tritón x-100 (véaee anteriormente). El extracto eolubilizado en Tritón x-100 fue cromatografiado eobre la columna de DEAE, y lae proteínae de unión fueron eluidae con un gradiente lineal (NaCl a 0-500 mM). Las proteínas ee eluyeron como 3 picoe. Lae fraccionee de cada pico fueron reunidas y examinadas para unión a albúmina utilizando la prueba del blotting del ligando. Sólo un pico (I) mostró unión a la albúmina con la región de la proteína de 57 kDa. Se llevó a cabo electroforeeis de SDS, utilizando proteínas de la membrana nativa de BPMVEC y el pico I de la columna de DEAE deepuée de teñir con azul brillante R-250 Coomaeeie. La preeencia de la proteína de 57 kDa que corresponde a la unión a la albúmina se observó con el blotting del ligando tanto en membranas nativas como en el pico I de DEAE. Se llevó a cabo también SDS-PAGE bajo condicionee no reductorae (en ausencia de ßME), y la unión a la albúmina se observó únicamente con la región de 57 kDa, sugiriendo la ausencia de enlacee de eulfuro en eeta proteína. Esta proteína se purificó además utilizando SDS-PAGE preparativa, y la proteína eluida a partir del gel se utilizó para la preparación del anticuefo.

Inmunoblotting Se separaron proteínas de membrana de BPMVEC y BPAEC utilizando SDS-PAGE, y se transfirieron a tiras de nitrocelulosa. Lae tirae fueron eometidae a inmunoblotting con el antisuero de 57 kDa. El euero preinmune no reconoció proteína alguna de membranas de BPMVEC y BPAEC. El antisuero reconoció 2 proteínae principales (57 kDa y 36 kDa), y una proteína menor (43 kDa) en ambas preparaciones de membrana. Las fracciones en partículas de BPMVEC y BPAEC se utilizaron también para inmunoblotting. El anticuerpo reconoció únicamente estae tree proteínae en las fracciones en partículae. Esto sugiere que la proteína de unión a la albúmina fue purificada hasta una homogeneidad aparente. Para estudiar la relación estructural propueeta entre lae proteínae de unión a la albúmina eecretadas y aeociadae a la membrana endotelial (SPARC), el inmunoblotting de membranae de BPMVEC ee llevó a cabo con loe anticuerpoe producidoe contra las SPARC de bovino purificadas. El antisuero producido contra las SPARC de bovino purificadas reconoció polipéptidoe de 6 kDa, 61 kDa, 57 kDa, 43 kDa y 36 kDa en membranae de BPMVEC. El antisuero de péptido terminal anti-SPARC-NH2 reaccionó fuertemente con un polipéptido de 36 kDa y débilmente con un polipéptido de 43 kDa. Esto sugiere que los receptores depuradores son baetante distintos de los receptores de albúmina nativos.

Efecto de la anti-IgG de 57 kDa sobre la unión de 1 SI-BSA a monocapas de BPMVEC La IgG de suero prein une y la anti-IgG de 57 kDa fueron purificadas por afinidad utilizando una columna de sefarosa A para proteínas. Se investigó el efecto de fracciones de IgG eobre la unión de ?2*I-BSA a monocapae de BPMVEC a 4ßC: la unión no eepecífica varió de 40 a 50%. La IgG de suero preinmune no afectó significativamente la unión específica de 1251-BSA a las monocapas de BPMVEC. En contraste, la anti-IgG de 57 kDa redujo la unión específica de 125I-BSA a las monocapas de BPMVEC en una manera dependiente de la dosis. La reducción fue máxima (40-50%) a una concentración de 200 µg/ml en anti-IgG de 57 kDa, y permaneció sin cambios hasta 1000 µg/ml. Estoe reeultados demuestran que el anticuerpo desarrollado contra la proteína de 57 kDa no reconoce totalmente el dominio de unión a la albúmina en el receptor, o que la albúmina nativa puede interactuar con otros sitioe de unión eobre la euperficie de las células endoteliales.

Activación del flujo de albúmina transendotelial por anti-IgG de 57 kDa en ausencia de cambios de forma de las células endoteliales Para estudiar los efectos de la anti-IgG de 57 kDa sobre el transporte transendotelial de la albúmina, se midieron los regímenes de depuración de 125I-BSA transendotelial en las monocapas de BPMVEC. Las monocapas fueron incubadas previamente con IgG de suero preinmume y anti-IgG de 57 kDa durante 15 minutoe, 30 minutoe y 60 minutoe, y deepuée se midieron los regímenes de depuración de 125I-BSA transendotelial hasta 60 minutos. El incremento inducido por la anti-IgG de 57 kDa eobre la permeabilidad fue dependiente del tiempo. Un período de preincubación de 30 minutoe de anti-IgG de 57 kDa dio como reeultado un incremento de 2 vecee el régimen de depuración de 1 5I-BSA eobre la IgG preinmune. No ee obeervó incremento eignificativo alguno en la permeabilidad con una preincubación durante 15 minutoe, y ee observó un cambio de 40 a 50% cuando anti-IgG de 57 kDa fue preincubada con la monocapa hasta 60 minutos. La IgG de suero preinmune no tuvo efecto alguno sobre el transporte de albúmina transendotelial durante todos los períodos de preincubación probados. El efecto de la anti-IgG de 57 kDa sobre la permeabilidad de i25 I-albúmina ee invirtió a 4°C. Se eetudió el cambio de forma de lae células endotelialee deepuée de tratarlae con IgG de euero preinmune y anti-IgG de 57 kDa, utilizando una técnica deecrita anteriormente (Phillipe y Tean, citado anteriormente; Siflinger-Birnboim y otroe, Lab. Inveet. 67:24-30 (1992)). Lae BPMVEC cultivadae eobre filtroe de nucleoporo fueron preincubadas con IgG de suero preinmune y anti-IgG de 57 kDa durante 30 minutos, y las monocapas fueron teñidas con faloidina de rodamina (véase anteriormente). En cualquier caso, no se observó "redondeo" de las células o formación de espacioe interendoteliales. Estos resultadoe sugieren que el anticuefo de anti-proteína de unión a la albúmina de 57kD activa el transporte de albúmina. Existe otra posibilidad, es decir, que este anticuerpo pueda incrementar no eepecí ficamente el traneporte pericelular de la albúmina, ampliando los eepacios de unión interendoteliales. Para delinear eeto, se estudió el efecto de la IgG anti rreceptor y de la IgG de suero preinmune sobre la morfología de las células endoteliales. El tratamiento previo de monocapas de BPMVEC con IgG de euero preinmune o IgG anti rreceptor no tuvo efecto alguno eobre loe eepacioe de unión interendotelialee. Eete anticuefo para la proteína de unión a la albúmina de 57 kDa puede activar la tranecitoeie de la albúmina. El efecto del incremento de permeabilidad de este anticuefo no ocurrió a 4°C, apoyando la conclusión de que el anticuefo activó la transcitoeie de la albúmina mediante la formación de veeículae, lae cualee ee ha demostrado son sensiblee a la temperatura (Lo y otros, J. Cell. Physiol. 151:63-70 (1992)).

EJEMPLO 2 Anticuerpos producidos contra GP60 Los anticuerpos producidos contra GP60 de células endoteliales se utilizaron para poner a prueba extractos de membrana epitelial como ee deecribe en el ejemplo 1. Loe anticuefoe anti-GP60 reconocieron una proteína de 60 kDa preeente en loe extractoe epitelialee. Eeto demueetra claramente que una proteína inmunológicamente relacionada eetá presente en este sistema.

Se cultivaron células epiteliales y endoteliales como monocapas, como se describe en el ejemplo 1, para producir monocapas confluentes que muestran la reactividad apropiada al flujo del soluto. El anticuefo anti-GP60 (200-500 µg/ml) se incubó con las monocapas a 4°C para unir el anticuefo al receptor, en ausencia de actividad metabólica que pudiera dar como resultado absorción de la GP60. La unión del anticuerpo anti-GP60 bajo estae condicionee dio como reeultado una dieminución del 80 a 90% en la unión de 125I-BSA por lae monocapas endoteliales. Las monocapas epiteliales fueron incubadas además con un segundo anticuefo para el anticuefo anti-GP60 primario de conejo, para entrelazar los receptores. Ambas monocapas ee lavaron y ee incubaron deepuée con 125I-BSA para las células epiteliales o inmunoglobulina 125 j anti-BSA para las monocapas endoteliales a 37ßC, para permitir la absorción del complejo receptor-anticuefo y la cotranscitosis del indicador radioactivo marcado con 12*I. La incubación con anticuefo anti-GP60 dio como resultado un incremento de 1.6 a 2 veces la captación sobre el nivel de un control de suero preinmune. Así, la unión del receptor GP60 por un anticuefo anti-GP60 da como resultado una activación del mecanismo de tranecitosis, incrementando así la captación de una macromolécula en la vecindad de la membrana invaginante.

EJEMPLO 3 Uso de albúmina con macromoléculas Se incubaron monocapas endoteliales a 4°C en presencia de BSA, para iniciar la unión de BSA a GP60, pero para prevenir la absorción del complejo receptor del ligando. Después de lavar exhaustivamente para remover el BSA no ligado, las célulae ee incubaron con inmunoglobulina anti-BSA marcada con 125I a 37°C, como indicador radioactivo macromolecular. El tratamiento previo con BSA incrementó la tranecitoeie del indicador radioactivo de inmunoglobulina en 1.5 vecee sobre lae célulae control incubadae previamente con inmunoglobulina anti-BSA no marcada. Despuée, cuando lae células incubadas a 370C se lavaron y se utilizaron de inmediato utilizando el mismo protocolo, no se observó flujo macromolecular alguno; esto muestra que, una vez absorbido, el receptor GP60 no está disponible para unirse al ligando. Así, moléculas grandes (150 kDa) pueden ser sometidas a cotranscitoeis conjuntamente con HSA utilizando el sietema de GP60.

EJEMPLO 4 Uso de albúmina con péptidos Monocapas epiteliales de humano y de rata se llevaron hasta confluencia, como se describe en el ejemplo 1. Las células se incubaron después con FITC-insulina (1 mg/ml) o FITC-ineulina y BSA (cada una a 1 mg/ml) a 37ßC en el eietema de flujo tranecelular deecrito anteriormente. Para las monocapae epitelialee de humano y de rata, hubo un incremento de 2.5 o 4 veces el flujo de FITC-insulina eobre el control de FITC-insulina sola. Así, la albúmina estimula también la cotranscitosie de péptidos de peso molecular pequeño a través de las células epiteliales que contienen al receptor de GP60.

EJEMPLO 5 Uso del péptido N-terminal 1-18 de GP60 Se produjo un péptido N-terminal sintético (T3118) de GP60 que corresponde a los primeros 18 reeiduos mediante sínteeis de péptidos de fase sólida. La eecuencia (SEQ ID No. 1) mueetra por lo menoe 80% de homología con la hormona tiroidea de bovino de unión a la membrana, proteína de unión (T3) (Yamauchi y otroe, Biochem. Biophys. Res. Comm. 146:1485 (1987)). Tiene 97% de homología con PDI . Se produjeron anticuerpos en conejos contra T3118, y se utilizaron para poner a prueba extractoe de membrana endotelial, para determinar eu reactividad cruzada con proteínas reconocidas por anticuerpos anti-GP60, como se describe más adelante. Se separaron proteínas de membrana de BPMVEC (100 µg) en SDS-PAGE, y se transfirieron a tiras de membrana de nitrocelulosa. La unión no específica fue bloqueada con leche seca desgrasada a 5% en solución ealina regulada en eu pH con Tris. Loe antieueroe ee diluyeron en la eolución de bloqueo, se incubaron durante 4 a 5 horas a 4°C, se lavaron y ee trataron con IgG anticonejo de cabra, conjugada con foefataea alcalina. Se identificaron las bandas de proteína utilizando proteínas marcadoras de peso molecular conocido. Los anticuerpos anti-T3118 mostraron sólo reactividad hacia la proteína GP60, y no hacia los péptidos de SPARC reconocidos por el anticuerpo anti-GP60. El péptido T3118 se utilizó despuée en un experimento de captación endotelial para determinar ei actuaba como un antagonieta del reconocimiento y captación de la albúmina. Lae monocapae endotelialee ee incubaron a 4°C en presencia de 12SI-BSA o i25i-BS más el péptido T3118. Deepuée de la incubación, lae células se lavaron exhauetiva ente, ee lisaron y se contaron para captación por el indicador radioactivo. De manera sorprendente, más que actuar como un antagonista, el péptido T3118 realmente estimuló la captación de albúmina 5 veces más sobre el control de albúmina eola. El incremento fue eaturable a una concentración de 500 µm del péptido T3118. Eetoe datoe sugieren que el péptido T3118, que funciona como un agonista, puede inducir un cambio de conformación en la albúmina, lo cual incrementa su reconocimiento por GP60, o es la señal para su captación por las células endoteliales. Será apreciado por los expertos que la invención puede llevarse a cabo en una amplia gama de parámetros equivalentes de composición, concentraciones, modos de administración y condiciones, sin apartarse del espíritu y/o el alcance de la invención, o cualquier modalidad de la misma.

LISTADO DE SECUENCIA (1) INFORMACIÓN GENERAL: (i) SOLICITANTE: (A) NOMBRE: Andaris Limited (B) CALLE: 1 Mere Way (C) CIUDAD: Ruddington (D) ESTADO: Nottingham (E) PAÍS: Reino unido (F) CÓDIGO POSTAL: (ZIP): NG1 5AQ (ii) TITULO DE LA INVENCIÓN: VEHÍCULOS E INCREMENTADORES DE TRANSCITOSIS PARA LA LIBERACIÓN DE FÁRMACO (iii) NUMERO DE SECUENCIAS: 1 (iv) FORMA LEGIBLE DE COMPUTADORA: (A) TIPO DE MEDIO: Dieco Flexible (B) COMPUTADORA: Compatible con PC IBM (C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOC/MS-DOS (D) PROGRAMAS: Patentln Releaee #1.0, Vereión #1.30 (EPO) (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 18 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADENA: (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1: Lys Pro Asp Glu Glu Asp His Val Leu Val Leu Val Lys Gly Asn 1 5 10 15 Phe Asp Val

Claims (10)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Una compoeición o conjugado de la miema que comprende un agente fieiológica ente activo que ejerce eu acción deepuée de paear a travée de endotelioe, epitelioe o meeotelioe y que contiene al receptor GP60, y un incrementador o vehículo de tranecitoeie eeleccionado a partir de albúmina y fragmentos de la misma, anticuerpo anti-GP60 y fragmentoe del miemo, fragmentos del péptido GP60, y PDI (proteína disulfuro isomeraea), y fragmentos de la misma.

2.- Una composición o conjugado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el incrementador o vehículo de transcitosis incluye el motivo CGMC.

3.- Una composición o conjugado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el incrementador o vehículo de transcitoeie comprende albúmina o un fragmento de la miema.

4.- Una compoeición o conjugado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el incrementador o vehículo de tranecitoeie comprende anticuefo anti-GP60 o un fragmento del mismo.

5.- Una composición o conjugado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el incrementador o vehículo de transcitoeie comprende un fragmento del péptido GP60.

6.- Una compoeición o conjugado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el vehículo de transcitosie comprende albúmina o un fragmento de albúmina en combinación con un fragmento del péptido GP60.

7.- Una compoeición o conjugado de conformidad con la reivindicación 5 o la reivindicación 6, caracterizado porque el fragmento del péptido GP60 ee de la SEQ ID No. l o comprende la miema.

8.- Una compoeición o conjugado de conformidad con cualquier reivindicación anterior, caracterizado porque el agente fieiológicamente activo ee eelecciona del grupo que coneiete de hormona luteinizante (LH), gonadotropina coriónica, péptidoe auricularee, interferón, linfocina I, linfocina II, linfocina III, linfocina IV, linfocina V, linfocina VI, linfocina VII, factor eetimulador de la formación de colonias, factor liberador de hormona de crecimiento, factor liberador de corticotropina, hormona liberadora de hormona luteinizante (LHRH), somatostatina, calcitonina, hormona liberadora de tirotropina, péptido relacionado al gen de calcitonina (CGRP), transferaeae, hidrolaeas, isomerasas, proteasas, ligasas, oxidorreductasae, esterasas, fosfataeas, factor de crecimiento de células nerviosae (NGF), factor neurotrófico ciliar (CNTF), factor neurotrófico derivado de células cerebrales (BDNF), factor neurotrófico derivado de células gliales (GDNF), factor de crecimiento de la epidermis (EGF), factor de crecimiento de fibroblaetoe (FGF), factor de crecimiento eimilar a la ineulina, factor de necroeie tumoral (FNT), factor de crecimiento de traneformación (TGF), encefalinae, endorfinae, gonadoliberina, melanoetatina, melanoliberina, somatostatina, ti roliberina, substancia P, neurotensina, corticotropina, lipotropina, melanotropina, lutropina, tirotropina, prolactina, eo atotropina, hormonae neurohipofieariae, paratirina, calcitonina, timosina, timopoyetina, factor tímico circulante, factor tímico humoral, insulina, glucagon, somatostatina, gastrina, colecietocinina, eecretina, polipéptido gáetrico inhibidor, péptido vasointestinal, motilina, relaxina, angiotensina, bradiquinina, somatomedinae, factores de crecimiento de la epidermis, urogaetrona, deferoxamina, bueerelina, deelorelina, gonadorelina, goeerelina, hieterelina, leuprorelina, nafarelina y triptorelina.

9.- El ueo de un incrementador de tranecitoeie como ee define en cualquiera de lae reivindicacionee 1 a 8, junto con un agente fieiológicamente activo para la fabricación de un medicamento para terapia ueando el agente.

10.- El ueo de un conjugado como ee definió en cualquiera de lae reivindicacionee 1 a 8, para la fabricación de un medicamento para terapia ueando el agente.