MXPA98001735A - Prevencion de la retrocoloracion en el lavado con piedra - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un método para formar una variación localizada de la densidad del color en la superficie de un tejido celulósico teñido, y a una composición para su uso en el método.

Description

PREVENCIÓN DE LA RETROCOLORACION EN EL LAVADO CON PIEDRA Campo Técnico Esta invención se refiere a un método para formar una variación localizada de la densidad de color en la superficie de un tejido celulósico teñido, y a una composición para su uso en el método.

Antecedentes de la Técnica En la fabricación de prendas de vestir de un tejido celulósico teñido, por ejemplo, pantalones de dril azul de algodón teñido de color Índigo, es común tratar el dril de algodón para proporcionar una apariencia de "lavado con piedra" (abrasión localizada en la superficie del dril de algodón) . Esto puede ser logrado agitando el dril de algodón en un medio acuoso que contiene un agente para abrasión mecánica tal como piedra pómez, una celulasa de abrasión o una combinación de éstas. Se prefiere hacer funcionar el proceso cerca del pH neutral, de modo que se prefiere utilizar una celulasa con una actividad elevada en este intervalo de pH. En el pasado, las preparaciones de celulasa fueron producidas generalmente por el cultivo de los Rßf.026995 microoorganismos que están presentes en forma natural, y tales preparaciones contuvieron invariablemente muchos de los diferentes componentes de la celulasa. Un proceso que utiliza tal preparación de celulasa mezclada, se describe en la patente U.S. No. 4,832,864 (de Ecolab). Las rápidos avances en las técnicas del ADN recombinante han hecho posible producir enzimas de componentes únicos con un rendimiento elevado, y los procesos que utilizan las celulasas de componentes únicos hasta ahora han llegado a ser más interesantes. Por consiguiente, la patente WO 91/17243 y la patente WO 95/09225 (Novo Nordisk) describen un proceso que utiliza una endoglucanasa de un solo componente denotada EG V con un peso molecular de aproximadamente 43 kD derivada de la cepa DSM 1800 del Humicola insolens con una actividad óptima cerca del pH neutral. La patente WO 94/21801 (Genencor) describe el uso en el "lavado con piedra" de una celulasa de un solo componente llamada EG III derivada de Trichoderma longibrachiatum la cual se reporta que tiene un pH óptimo de 5.5-6.0 y que retiene una actividad significativa a pH alcalino. La patente WO 95/16782 (Genencor International) sugiere el uso de otras celulosas de un solo componente derivadas de Trichoderma en el "lavado con piedra", pero estas celulasas son acidas y virtualmente no tienen actividad a un pH neutral.

Un problema general en los métodos de "lavado con piedra" conocidos, es aquel de la retrocoloración, es decir un fenómeno por el cual el tinte ya removido por la abrasión se deposita sobre parte del tejido o prenda de vestir para nivelar o igualar la variación deseada de la densidad del color o para decolorar las partes de color claro de las prendas de vestir.

Fundamento de la Invención Se ha encontrado sorprendentemente que, la adición de un cierto tipo de celulasa (denotada aqui posteriormente como el primer componente) reduce la retrocoloración. La celulasa en cuestión no tiene un efecto de abrasión significativo por si mismo. En consecuencia, la invención proporciona un método para formar una variación localizada de densidad del color en la superficie de un tejido celulósico teñido, que comprende agitar el tejido en un medio acuoso que tiene un pH en el intervalo de 6.5-9 y que contiene: un primer componente el cual es ya sea (a) una celulasa de la Familia 5 la cual es capaz de hidrolizar la celotriosa y/o p-nitrofenil-b-1, 4-celobiosida, o (b) una celulasa de la Familia 7, y un segundo componente el cual es ya sea (a) un agente de abrasión mecánica o (b) una celulasa que tiene una actividad de abrasión, en donde cada celulasa exhibe al menos 30% de su actividad máxima a pH 7. Otro aspecto de la invención proporciona una composición para su uso en el método, que comprende las primero y segundo componentes anteriores.

DEFINICIONES En esta especificación con las reivindicaciones, aplican las siguientes definiciones: El término "celulasa" denota una enzima que contribuye a la hidrólisis de la celulosa, tal como la celobiohidrolasa (Nomenclatura de la Enzima E.C. 3.2.1.91), una endoglucanasa (abreviada aqui posteriormente como "EG", E.C. 3.2.1.4), o una b-glucosidasa (E.C. 3.2.1.21). Las celulasas están clasificadas en familias cor. base en las similaridades de las secuencias de aminoácidos de acuerdo con el sistema de clasificación descrito en Henrissat, B. et al.; Biochem. J., (1991), 230, p. 309-16, y Henrissat, B. et al.; Biochem. J. (1993), 293, p. 781-788. Las celulasas utilizadas en esta invención son preferiblemente de componentes únicos, es decir el medio acuoso utilizado en la invención debe estar libre de otros componentes de celulasa que aquellos especificados.

Las enzimas de un solo componente pueden ser preparadas económicamente por la tecnología del ADN recombinante, es decir, las mismas pueden ser producidas por clonación de una secuencia de ADN que codifica el componente único, transformando subsiguientemente una célula huésped adecuada con la secuencia de ADN y que expresa el componente en el huésped. En consecuencia, la secuencia de ADN que codifica una celulasa útil puede ser aislada por un método general que involucra la clonación, en vectores adecuados, de una biblioteca del ADN, por ejemplo de uno de los microorganismos indicados al último en esta especificación, transformar las células huésped de levadura adecuadas con los vectores, cultivar las células huésped bajo condiciones adecuadas para expresar cualquier enzima de interés c rificada por un clon en la biblioteca del ADN, seleccionar los clones positivos para determinar cualquier actividad de la celulasa de la enzima producida por tales clones, y - aislar la enzima que codifica el ADN a partir de tales clones.

El método general se describe adicionalmente en la patente WO 94/14953 (Novo Nordisk) el contenido de la cual es incorporado aqui para referencia. La secuencia de ADN que codifica para una celulasa útil puede ser aislada por ejemplo por la selección de una biblioteca de ADNc del microorganismo en cuestión para los clones que expresan la actividad de la enzima apropiada (es decir la actividad de la celulasa) . Una secuencia de ADN que codifica para una enzima homologa, es decir una secuencia de ADN análoga, puede ser obtenible de otros microorganismos. Por ejemplo, la secuencia de ADN puede ser derivada seleccionando en forma similar una biblioteca de ADNc de otros hongos, tales como una cepa de un Aspergillus sp., en particular una cepa de A. aculeatus o A. niger, una cepa de Trichoderma sp., en particular una cepa de T. reesei, T. viride, T. longibrachiatum, T. harzianum o T. koningii o una cepa de un Neocallimastix sp., una Piromyces sp., una Penicillium sp., un Agaricus sp., o un Phanerochaete sp. Alternativamente, el ADN que codifica para una celulasa útil, de acuerdo con los procedimientos bien conocidos, puede ser aislado del ADN a partir de una fuente adecuada, tal como cualquiera de los organismos mencionados anteriormente, por el uso de sondas de oligcnucleótido sintéticas preparadas con base en una secuencia de ADN conocida. La secuencia de ADN puede ser insertada subsiguientemente en un vector de expresión recombinante. Este puede ser cualquier vector el cual puede ser sometido convenientemente a los procedimientos de ADN recombinantes, y la selección del vector frecuentemente dependerá de la célula huésped en la cual el mismo va a ser introducido. Por consiguiente, el vector puede ser un vector que se replica autónomamente, es decir un vector el cual existe como una entidad extracromosómica, la replicación del cual es idependiente de la replicación cromosómica, por ejemplo un plásmido. Alternativamente, el vector puede ser uno el cual, cuando se introduce en una célula huésped, es integrado en la genoma de la célula huésped y replicado conjuntamente con el (los) cromosoma (s) dentro del cual el mismo ha sido integrado. En el vector, la secuencia de ADN que codifica la celulasa debe estar conectada o relacionada operativamente con un promotor adecuado y una secuencia terminadora. El promotor puede ser cualquier secuencia de ADN la cual muestra una actividad transcripcional en la célula huésped de elección y puede ser derivada de los genes que codifican las proteínas ya sean homologas o heterólogas con respecto a la célula huésped. Los procedimientos utilizados para ligar las secuencias de ADN que codifican para la celulasa, el promotor y el terminador, respectivamente, y para insertarlas en los vectores adecuados, son bien conocidos por las personas expertas en la técnica (cotéjese, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY, 1989) . La célula huésped la cual es transformada con la secuencia de ADN es preferiblemente una célula eucariótica, en particular una célula fungosa tal como una levadura o una célula fungosa filamentosa. En particular, la célula puede pertenecer a una especie de Aspergillus o Trichoderma, más preferiblemente Aspergillus oryzae o Aspergillus niger. Las células fungosas pueden ser transformadas por un proceso que involucra la formación del protoplasto y la transformación del protoplasto seguido por la regeneración de la pared de la célula de una manera conocida per se. El uso del Aspergillus como un microorganismo huésped se describe en EP 238 023 (Novo Nordisk A/S), el contenido de la cual se incorpora aqui para referencia. La célula huésped también puede ser una célula de levadura, por ejemplo una cepa de Saccharomyces, en particular Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces kluyveri o Saccharomyces uvarum, una cepa de Schizosaccharomyces sp., tal como Schizosaccharomyces pombe, una cepa de Hansenula sp., Pichia sp., Yarro i sp. tal como Yarrowia lipolytica, o Kluyveromyces sp. tal como Kluyveromyces lactis. En el presente contexto, el término "homólogo" o "secuencia homologa" está propuesta para indicar una secuencia de aminoácidos que difiere de aquellas mostradas en cada uno de los listados de las secuencias mostrados aqui posteriormente, en forma respectiva, por uno o más residuos de aminoácidos. La secuencia homologa puede ser una que resulta de la modificación de una secuencia de aminoácidos mostrada en estos listados, por ejemplo que involucran la substitución de uno o más residuos de aminoácidos en uno o más sitios diferentes en la secuencia de aminoácidos, la deleción de uno o más residuos de aminoácidos en cualquiera o en ambos extremos de la enzima o en uno o más sitios en la secuencia de aminoácidos, o la inserción de uno o más residuos de aminoácidos en uno o más sitios en la secuencia de aminoácidos . Sin embargo, como será evidente para la persona experta en la técnica, los cambios de aminoácidos son preferiblemente de una naturaleza menor, que es conservativa de las substituciones de aminoácidos que no afectan significativamente el doblez o la actividad de la proteina, las deleciones pequeñas, típicamente de uno hasta aproximadamente 30 aminoácidos; las estensiones terminales de amino o de carboxilo pequeñas, tales como un residuo de metionina terminal de amino, un péptido. enlazador pequeño de hasta aproximadamente 20-25 residuos, o una extensión pequeña que facilita la purificación, tal como un tracto de poli-histidina, un epitope antigénico o un dominio de unión o aglomeración. Véase en general Ford et al., Protein Expression and Purification 2: 95-107, 1991. Los ejemplos de las substituciones conservativas están dentro del grupo de los aminoácidos básicos (tales como arginina, lisina, histidina), aminoácidos ácidos (tales como ácido glutámico y ácido aspártico) , aminoácidos polares (tales como glutamina y asparagina), aminoácidos hidrofóbicos (tales como la leucina, isoleucina, valina), aminoácidos aromáticos (tales como fenilalanina, triptófano, tirosina) y aminoácidos pequeños (tales como glicina, alanina, serina, treonina, metionina) . También será evidente para las personas expertas en la técnica, que tales substituciones se pueden hacer fuera de las regiones criticas para la función de la molécula y todavia conducirán a un polipéptido activo. Los aminoácidos esenciales para la actividad del polipéptido codificado por la construcción de ADN de la invención, y por lo tanto preferiblemente no sometidos a substitución, pueden ser identificados de acuerdo con los procedimientos conocidos en la técnica, tales como la mutagénesis dirigida al sitio o la mutagénesis de exploración de la alanina (Cunningham and Wells, Science 244, 1031-1085, 1989). En la última técnica las mutaciones son introducidas en cada residuo en la molécula, y las moléculas mutantes resultantes son probadas para verificar la actividad biológica (es decir la celulasa) para identificar los residuos de aminoácidos que son críticos para la actividad de la molécula. Los sitios de interacción de la enzima/substrato también pueden ser determinados por el análisis de la estructura cristalina como se determinó por técnicas tales como la resonancia magnética nuclear, la cristalografía o la etiquetación por fotoafinidad. Véase, por ejemplo, de Vos et al., Science 255: 306-312, 1992; Smith et al., J. Mol. Biol. 224: 899-904, 1992; Wlodaver et al., FEBS Lett. 309: 59-64, 1992. La modificación de la secuencia de aminoácidos puede ser efectuada adecuadamente por la modificación de la secuencia de ADN que codifica la enzima, por ejemplo por la mutagénesis dirigida al sitio o mutagénesis al azar o una combinación de estas técnicas de acuerdo con procedimientos bien conocidos. Alternativamente, la secuencia homologa puede ser una de una enzima derivada de otro origen que las celulasas que corresponden a las secuencias de aminoácidos mostradas en cada uno de los listados de las secuencias mostradas aqui después, respectivamente. Por consiguiente, "homólogo" puede indicar por ejemplo un polipéptido codificado por el ADN el cual se hibridiza hasta la misma sonda que el ADN que codifica para la celulasa con la secuencia de aminoácidos en cuestión bajo ciertas condiciones especificadas (tales como prerremojado en 5 x SSC y prehibridación durante 1 h a -40 °C en una solución de 20% de formamida, 5 x solución de Denhardt, fosfato de sodio 50 mM,. pH 6.8, y 50 mg de ADN de timo de ternero sometido a la acción del sonido, desnaturalizado, seguido por la hibridación en la misma solución suplementada con ATP 100 mM durante 18 horas a ~40 °C) . La secuencia homologa exhibirá normalmente un grado de homología (en términos de la identidad) de al menos 50%, tal como al menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% o aún 95% con las secuencias de aminoácidos mostrada en cada uno de los listados de las secuencias mostrados aqui después, respectivamente. La homología referida anteriormente es determinada como el grado de identidad entre las dos secuencias que indican una derivación de la primera secuencia a partir de la segunda. La homología puede ser determinada adecuadamente por medio de programas de computadora conocidos en la técnica tales como GAP provistos en el paquete de programas de GCG (Needleman S.B. and Wunsch, C.D. Journal of Molecular Biology, 48: 443-453, 1970).

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Tejido Celulósico Teñido El proceso de la invención puede ser aplicado a cualquier tipo de tejido celulósico teñido en donde se desea formar la variación localizada de la densidad del color en la superficie. Un ejemplo de interés comercial particular es el dril de algodón, particularmente el dril de algodón teñido de color Índigo para su uso en pantalones de dril azul, etc. El tejido puede ser tratado en la forma de un tejido no cosido o una prenda de vestir cosida hecha de tal tejido. Es de interés particular aplicar el proceso de la invención a un tejido o ropa de vestir limpia, nueva.

Componente 1 El primer componente es una celulasa de la Familia 5 o 7 la cual exhibe al menos 30% de su actividad óptima a pH 7. El mismo está presente en una cantidad efectiva para prevenir la retrocoloración, típicamente 0.05-5 mg/1 (como la proteina de la enzima pura), particularmente 0.1-0.5 mg/1; que corresponde típicamente a una actividad de 10-1000 ECU/1, particularmente 100-1000 ECU/1; o una actividad de 0.5-100 ECU/g de tejido.

Celulosa de la Familia 5 La celulasa de la Familia 5 utilizada en la invención es capaz de hidrolizar la celotriosa y/o la p-nitrofenil-b-1, 4-celobiosida (PNP-Cel); la celulasa puede tener una acción indirecta sobre la celotriosa, hidrolizándola para formar la celobiosa sin ninguna formación de glucosa. La capacidad de la celulosa para hidrolizar la PNP-Cel puede ser determinada por el método de ensayo descrito posteriormente, y la celulasa se considera que satisface esta condición si el ensayo proporciona un resultado arriba de 0.1 micromoles de PNP por minuto por ECU. La celulasa de la Familia 5 preferiblemente no tiene ningún dominio de unión de la celulosa. La celulasa de la Familia 5 puede ser una celulasa alcalina (por ejemplo una endoglucanasa) derivada de una cepa bacteriana tal como Bacillus o Clostridium. Una de tales celulasas de la Familia 5 es la endoglucanasa de la cepa KSM-64 del Bacillus (FERM BP-2886) . La celulasa y su secuencia de aminoácidos se describen en la patente JP-A 4-190793 (Kao) y Sumitomo et al., Biosci. Biotech. "Biochem., 56(6), 872-877 (1992). Otra celulasa de la Familia 5 es la endoglucanasa de la cepa KSM-635 (FERM BP-1485) . La celulasa y su secuencia de aminoácidos se describen en JP-A 1-281090 (Kao), US 4,945,053 e Y. Ozaki et al., Journal of General Microbiology, 1990, vol. 136, página 1973-1979. La misma tiene una actividad sobre la PNP-Cel de 0.18 micromoles de PNP/min/ECU en el ensayo anterior. Una tercera celulasa de la Familia 5 es la endoglucanasa de la cepa 1139. La celulasa y su secuencia de aminoácidos se describe en Fukumori F. et al., J. Gen.

Microbiol., 132:2329-2335 (1986) y JP-A 62-232386 (Riken) . Una cuarta celulasa de la Familia 5 es la endoglucanasa Endo 3A del Bacillus lautus NCIMB 40250 descrita en la patente WO 91/10732 (Novo Nordisk) . La secuencia de aminoácidos descrita alli se encontró al último que va a ser incorrecta, y la secuencia corregida es mostrada en la SEQ ID NO: 1. La celulosa tiene una afinidad sobre la PNP-Cel de 0.44 micromoles de PNP/min/ECU. Una quinta celulasa de la Familia 5 es la celulasa de Bacillus sp. NCIMB 40482 que tiene un peso molecular aparente de aproximadamente 45 kD, descrita en la patente WO 94/01532 (Novo Nordisk) . Su actividad sobre la PNP-Cel es de 0.22 micromoles de PNP/min/ECU. Una sexta celulasa de la Familia 5 es la endoglucanasa A a partir de Clostridium cellulolyticum descrito en E. Faure et al., Gene, 84 (1), 39-46 (1989) y Fierobe H-P et al., J. Bacteriol. 173 (24), 7956-7962 (1991) .

Celulasa de la Familia 7 La celulasa de la Familia 7 para su uso en la invención puede ser derivada de una cepa fungosa y típicamente es capaz de hidrolizar la celotriosa directamente en la celobiosa y la glucosa, y es capaz de hidrolizar la PNP-Cel, como se determina por ejemplo por el método de ensayo descrito posteriormente. La celulasa de la Familia 7 puede ser derivada de una cepa de Humicola, preferiblemente H. insolens. Un ejemplo es la endoglucanasa EG I derivada de la cepa DSM 1800 de H. insolens, descrita en la patente WO 91/17244 Novo Nordisk) . El celulosa madura tiene una secuencia de ios 415 aminoácidos mostrada en las posiciones 21-435 de la Figura 14 en la misma y tiene una actividad especifica de 200 ECU/mg (a base de la proteina de la enzima pura) . Esta celulasa puede estar truncada adicionalmente en la terminal C por hasta 18 aminoácidos para que contenga al menos 397 aminoácidos. Como ejemplo, la celulasa puede estar truncada a 402, 406, 408 o 412 aminoácidos. Otro ejemplo es una variante de la misma denotada endoglucanasa EG I* descrita en la patente WO 95/24471 (Novo Nordisk) y que tiene una secuencia de 402 aminoácidos mostrada en la Figura 3 en la misma. Alternativamente, la celulasa de la Familia 7 puede ser derivada de una cepa de Myceliophthora, preferiblemente M. Thermophila, más preferiblemente la cepa CBS 117.65. Un ejemplo es una endoglucanasa descrita en la patente WO 95/24471 (Novo Nordisk) que comprende 21-420 aminoácidos y opcionalmente también los 1-20 y/o los 421-456 aminoácidos de la secuencia mostrada en la Figura 6 en la misma. Como otra alternativa, la celulasa de la Familia 7 puede ser derivada de una cepa de Fusarium, preferiblemente F. oxysporum. Un ejemplo es una endoglucanasa derivada ael F. oxysporum descrita en la patente WO 91/17244 (Novo Nordisk) en Sheppard, P.O. et al., Gene, 150: 163-167, 1994. La secuencia de aminoácidos correcta está dada en la última referencia. Este celulasa tiene una actividad especifica de 350 ECU/mg.

Componente 2 El segundo componente es un agente de abrasión mecánica y/o una celulasa de abrasión. Una modalidad preferida de la invención utiliza una combinación de un agente de abrasión mecánica y una celulasa de abrasión como el segundo componente. Los ejemplos de los agentes de abrasión mecánica son la piedra pómez, la perlita expandida con calor y elementos de abrasión (por ejemplo bolas de abrasión) . La celulasa de abrasión es una que ejerce la abrasión o la actividad de aclaración del color, por ejemplo como se describe en la patente EP 220016 (Novo Nordisk A/S), y exhibe al menos 30% de su actividad óptima a pH 7. La misma puede ser una celulasa de la Familia 12 o 45 que tiene un dominio de unión de la celulosa. La celulasa de la Familia 45 para su uso en la invención puede ser derivada de una cepa de Humicola, preferiblemente H. insolens. Un ejemplo es una endoglucanasa denotada EG V derivada de la cepa DSM 1800 de H. insolens que tiene un peso molecular de ~43 kD. La celulasa y su secuencia de aminoácidos se describen en la patente WO 91/17243 (Novo Nordisk) . La misma tiene una actividad especifica de 430 ECU/mg.

Una celulasa de la Familia 12 para su uso en la invención puede ser derivada de una cepa de Trichoderma, preferiblemente T. longibrac iatum. Un ejemplo es la endoglucanasa EG III descrita en la patente WO 94/21801 (Genencor) que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la misma. El segundo componente está presente en una cantidad efectiva para la abrasión para formar una variación localizada de densidad del color. Si el segundo componente es una celulasa de abrasión, eel mismo está presente típicamente en una cantidad de 0.05-5 mg/1 (como la proteina de enzima pura), particularmente 0.1-0.5 mg/1; que corresponde típicamente a una actividad de 10-1000 ECU/1, particularmente 100-1000 ECU/ I; o una actividad de 0.1-100 ECU/g de tejido, particularmente 0.5-10 ECU/g.

Condiciones de Proceso El proceso de la invención se puede llevar a cabo a las condiciones convencionales en una máquina de lavado utilizada convencionalmente para el lavado con piedra (por ejemplo un extractor-lavador) . Las condiciones típicas son una temperatura de 40-60 °C y una relación de tejido : liccr desde 1 : 3 hasta 1 : 20 durante 15 minutos hasta 2 horas. Opcionalmente, como los aditivos convencionales pueden ser utilizados, por ejemplo, una solución amortiguadora, un agente tensioactivo (aniónico y/o no iónico) y/o un polímero (tal como PVP, poliacrilato y poliacrilamida) .

Ensayo para Evaluar la Actividad de la Celulasa La actividad endo de la celulasa es determinada por la reducción de la viscosidad de la CMC (carboximetil celulosa) en un viscosimetro de vibración. 1 ECU (unidad de endo-celulasa) es la cantidad de actividad la cual provoca una reducción de 10 veces la viscosidad cuando se incuba con 1 ml de una solución de 34.0 g/1 de CMC (nombre registrado Aqualon 7LFD) en una solución amortiguadora de fosfato 0.1 M (pH 7.5), 40 °C durante 30 minutos .

Ensayo para la hidrólisis de PNP-Cel La capacidad de una celulasa para hidrolizar la ?-nitrofenil-b-1, 4-celobiosida (PNP-Cel) es determinada por la detección directa, cinética de estado permanente, del color amarillo del producto de p-nitrofenol (PNP) por la absorción a 405 nm. Las condiciones del ensayo son 37 °C, pH 7.5 (0.1 M de solución amortiguadora de fosfato). La velocidad de la hidrólisis (en micromoles de PNP por minuto) es comparada con la actividad de la celulasa (ECU) , y el resultado es expresado en micromoles de PNP por minuto por ECU.

EJEMPLOS Ejemplo 1 El dril de algodón teñido de color índigo se trató junto con las muestras de telas de algodón blanco que utilizan varias combinaciones de celulasa, como sigue: pH 7 (solución amortiguadora de fosfato en agua del grifo) Temperatura 55 °C Equipo Medidor de Lavadora (recipientes de 150 ml) Componente 1 EG I derivada de Humicola insolens DSM 1800 0-2.3 ECU/ml como se indicó posteriormente Componente 2 EG V derivado de Humicola insolens DSM 1800 0 o 0.27 ECU/ml Dril de 5 g/recipiente Algodón Algodón 2 muestras de tela/recipiente Blanco Tiempo 2 horas Después del tratamiento, se colectaron las hilachas o pelusas y se midieron como una expresión de la acción de abrasión de la(s) celulasa(s). La remisión de las muestras de tela blancas después del tratamiento se midió (D R a 680 nm, con relación a un experimento sin ninguna celulasa) y se tomó como una expresión de la retrocoloración. Resultados: Se obtuvo una buena abrasión con la celulasa del componente 2. La adición de la celulasa del componente 1 redujo significativamente la retrocoloración .

Ejemplo 2 Las siguientes celulasas fueron probadas a las mismas condiciones que en el Ejemplo 1: Componente 1 EG I o EH I* derivado de Humicola insolens DSM 1800, 0, 0.67 o 1.33 ECU/ml Componente 2 EG V derivado de Humicola insolens DSM 1800, 0.7 ECU/ml La abrasión se evaluó midiendo la cantidad de las hilachas o pelusas después de cada tratamiento. Se encontró una buena abrasión en cada experimento, con un ligero incremento por la adición de EG I o EG I*. La inhibición de la retrocoloración se determinó a partir del incremento de la absorbencia del filtrado a 680 nm y a partir del incremento de la remisión del tejido blanco a 420 nm. Los resultados mostraron que esencialmente la misma inhibición de la retrocoloración fue obtenida con EG I y EG I*.

Ejemplo 3 En el primer paso, un licor de color azul del dril de algodón fue preparado agitando 12 piezas (5 x 5 cm) del dril de algodón azul con 800 ml de solución amortiguadora de fosfato (pH 7.0) y 0.8 ml de agente tensioactivo no iónico a 50 °C durante 30 minutos, seguido por filtración. En el segundo paso, 5 piezas de algodón blanco fueron incubadas con 200 ml del licor azul a 50 °C durante 30 minutos con 0-100 ECU/L de la celulasa. La celulasa probada fue una mezcla de EG I derivada de Humicola insolens DSM 1800 truncada hasta 406, 408 y 412 aminoácidos. Después de enjuague y secado, se determinó la inhibición de la retrocoloración a partir del incremento de la luminosidad f (L*) de las muestras de tela blanca como se midió por el Dr. Lange Micro Color Data Station, Resultados (promedio para 5 muestras de tela) : Los resultados demuestran que la EG I es efectiva para reducir la retrocoloración del dril de algodón azul sobre el algodón blanco.

Ejemplo 4 Una celulasa alcalina de Bacillus de la Familia 5 de acuerdo con la invención se probó de la misma manera que en el Ejemplo 3. Los resultados fueron como sigue: Los resultados demuestran que esta celulasa también es efectiva para reducir la retrocoloración.

Ejemplo 5 4 Piezas (5 x 5 cm) de dril de algodón azul desaprestadas y 8 piezas (5 x 5 cm) de algodón mercerizado blanco se agitaron en 400 ml de solución amortiguadora 50 mM (pH 7.0) que contiene una celulasa de ia Familia 5 o 7 junto con una celulasa de la Familia 45 de acuerdo con la invención [200 ECU/I de cada celulasa). Después de 30 minutos, los tejidos fueron enjuagados bajo agua del grifo que se encuentra fluyendo y se secan. La celulasa de la familia 5 fue una celulosa alcalina de Bacillus. La celulasa de la Familia 7 fue la EG I derivada de Humicola msolens truncada a 408 aminoácidos. La celulasa de la Familia 45 fue EG V derivada de Humicola insolens DSM 1800. La luminosidad (L*) de los dos tejidos y la absorbencia a 680 nm del sobrenadante fueron medidas.

Resultados: Los resultados para el algodón mercerizado muestra una luminosidad incrementada, es decir, una retrocoloración reducida, por la adición de la celulasa del segundo componente de acuerdo con la invención. Los resultados también muestran una luminosidad incrementada, para el dril de algodón azul. Una inspección visual mostró que el dril de algodón tratado de acuerdo con la invención tuvo una variación localizada más pronunciada de la intensidad del color, cuando se desee.

Los datos para la absorbencia del sobrenadante mostraron que permaneció una cantidad mayor del pigmento en el líquido después del tratamiento.

LISTADO DE LAS SECUENCIAS (1) INFORMACIÓN GENERAL: (i) SOLICITANTE: (A) NOMBRE: Novo Nordisk A/S (B) CALLE: Novo Alie (C) CIUDAD: Bagsvaerd (E) PAÍS: Dinamarca (F) CÓDIGO POSTAL (ZIP): DK-2880 (G) TELÉFONO: +45-4444-8888 (H) TELEFAX: +45-4449-3526 (ii) TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Prevención de la retro- coloración en el lavado con piedra (iii) NÚMERO DE LAS SECUENCIAS: 1 (iv) FORMA LEÍBLE DE LA COMPUTADORA: (A) TIPO DE MEDIO: Disco magnético flexible (B) COMPUTADORA: compatible con IBM PC (C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) PROGRAMA: Patentln Reléase #1.0, Versión #1.30 (EPO) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA; (A) LONGITUD: 551 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE HEBRA: (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Bacillus lautus (B) CEPA: NCIMB 40250 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1: Ala Pro Ala Val Pro Phe Gly Gln Leu Lvs Val Gln Gly Asn Gln Leu 1 5 10 15 Val Giy Gln Ser Gly Gln Ala Val Gln Leu Val Gly Mee Ser Ser Kis 20 23 30 íl Leu Gln Trp Tyr Gly Asn ?r.e Val Asn Lys Ser Ser Leu Gln Tro 35 40 45 Mee .Arg Aso ASP. Tro Gly l l-. Arg Ala Ala Met Tyr Thr 50 55 60 Ala Glu Asp Gly Tyr lie Thr Asp ?GD 3er Val Lys ASP. Lys Val Lys 65 70 " 75 33 Glu Ala Val Gin Ala Ser lie Asp Le- Gly Leu Tyr Val lie lie Asp 35 90 95 ?ro His lie Leu Ser Aso Glv Asr. Pro Asr. Tyr Lys Ala Gln Ser 100 ' 105 110 Lys Ala Phe Phe Gln Glu Met Ala Thr Leu Tyr Gly Asn Thr Pro Asn 115 120 125 Val li>e Tyr Glu lie Ala Asn Glu Pro Asn Gly Asn Val Ser Trp Ala 130 135 140 Asp Val Lys Ser Tyr Ala Glu Giu Val lia Thr Ala lie Arg Ala lie 145 150 155 160 ASD Pro Asp Gly Val Val lia Val Gly Sar Pro Thr Tro Ser Gln ASD 165 170 175 lie His Leu Ala Ala Asp Asn Pro Val Sar His Sar Asn Val Met Tyr 130 135 190 Ala Leu His Phe Tyr Ser Giy Thr Kis Giy Gln Pha Leu Arg ASD Arg 195 200 205 lie Thr Tyr Ala Met Asn Lvs Gly Ala Ala lia Pha Val Thr Glu Tro 210 2Í5 220 Glv Thr Ser ASD Ala Ser Gly Asn Gly Gly Pro Tyr Phe Pro Gln Ser 225 230 235 240 Lys Glu Trp lie Asp Phe Leu Asn Ala Arg Lys lie Ser Trp Val Asn 245 250 255 Tro Ser Leu Ala ASD Lys Val Glu Thr Ser Ala Ala Leu Met Pro Gly 260 265 270 Ala Ser Pro Thr Gly Glv Tro Thr Aso Ala Gln Leu Sar Glu Ser Gly 275 * " 230 235 Lys TrD Val Arg ASD Gln lie Arg Gir. Ala Thr Gly Gly Gly Ser Gly 290 295 300 Asn Pro Thr Ala Pro Ala Ala Pro Thr Asn Leu Ser Ala Thr Ala Giy 305 310 315 320 Asn Ala Gin Val Ser Leu Thr Tro Asn Ala Val Ser Giy Ala Thr Ser 325 330 335 ryr Thr Val Lys Arg Ala :.-.r Ser Gly Gly Pro Tyr Thr Asn Val 340 345 350 Ala Thr Giy Val Thr Ala Thr Ss: Thr Asn Thr Giy Leu Thr Asn 355 36 365 Giv Thr Thr Tvr Tyr Tyr Val Val £er Ala Ser Asn Ser Ala Gly Ser 370 * 3"5 33C Ser Ala Asn Ser Ala Gin ro Ala Ser Giy Giy Ala 39C 395 Ser Thr Gly Asn Lau Val Val :s Val Glv Aso .: Ser Ala 405 415 Thr ASD Asn Gln Met Lys ? : Lys Asn Asn Gly Th; 420 430 Thr Pro Val Asn Leu Ser Gl .-e- Arg Tyr Tyr Phe Thr Lys 435 ' 4 445 Asp Giy T r Ala As? Met Ser Ala Ser Phe Asp Trp Ala Gln He Gly 450 460 Ala Ser Asn Val Ser Ala Ala Pha Ala Asn Phe Thr Gly Ser A=n Thr 465 470 475 430 Asp Thr Tyr Val Glu Leu Ser Phe Ser Ala Gly Ser Gly Ser lie Pro 435 490 495 Ala Gly Gly Gln Thr Gly ASD lie Gln Leu Arg Met Tyr Lys Thr ASD 500 505 510 Trp Ser Asn Pha Asn Glu Ala Asn Asp Tyr Ser Tyr ASD Gly Ala Lys 515 520 52*5 Thr Ala Tyr Ala Asp Trp Asn Arg Val Thr Leu HÍS Gln Asn Gly Th' 530 535 540 Leu Val Trp Gly Thr Thr Pro 545 550 Se hace constar que con relación a esta fecha el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Habiéndose descrito la invención como antecede se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes

Claims (13)

REIVINDICACIONES

1. Un método para formar una variación localizada de la densidad del color en la superficie de un tejido celulósico teñido, caracterizado porque comprende aaitar el tejido en un medio acuoso que tiene un pH en el intervalo de 6.5-9 y que contiene: un primer componente el cual es ya sea; (a) una celulasa de la Familia 5 la cual es capaz de hidrolizarse hasta la p-nitrofenil-ß-1, 4-celobiosida, o (b) una celulosa de la Familia 7, y un segundo componente el cual es ya sea (a) un agente de abrasión mecánica o (b) una celulasa que tiene una actividad de abrasión. en donde cada celulasa exhibe al menos 30% de su actividad máxima a pH 7.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el tejido es dril de algodón teñido de color Índigo.

3. El método de conformidad con las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado porque el primer componente es una celulasa de la Familia 5 sin un dominio de unión de la celulasa derivado de una cepa bacteriana, preferiblemente una cepa de Bacillus.

4. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque la celulasa de la Familia 5 es derivada de una cepa de Bacillus seleccionada del grupo que consiste de Bacillus sp. KSM-64, 1139, KSM-635, NCIMB 40482 y Bacillus lautus NCIMB 40250, o es una celulasa que tiene al menos 60% de la homología con tal celulasa.

5. El método de conformidad con las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado porque el primer componente es una celulasa de la Familia 7 derivada de una cepa fungosa, preferiblemente una cepa de Humicola, más preferiblemente de H. insolens.

6. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque la celulasa de la Familia 7 es la endoglucanasa EG I derivada de la cepa DSM 1800 del H. insolens, o es una celulasa que tiene al menos 60% de homología con la EG I.

7. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, caracterizado porque el primer componente está presente en una cantidad de 0.1-0.5 mg/1 o a una concentración de 100-1000 ECU/I.

8. El método de conformidad con las reivindicaciones 1-7, caracterizado porque el segundo componente comprende tanto un agente de abrasión mecánica como una celulasa de abrasión.

9. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, caracterizado porque el segundo componente es una celulasa de la Familia 45 que tiene un dominio de unión de la celulosa, derivado de una cepa fungosa, preferiblemente una cepa de Humicola, más preferiblemente H. insolens.

10. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la celulasa de la Familia 45 es la endoglucanasa EG V derivada de la cepa DSM 1800 de H. insolens, o es una celulasa que tiene al menos 60% de homología con el EG V.

11. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-13, caracterizado porque esencialmente ninguna celulasa diferente del primer y segundo componentes especificados, está presente.

12. Una composición de celulasa, caracterizada porque comprende: un primer componente el cual es ya sea (a) una celulasa de la Familia 5 la cual es capaz de hidrolizarse hasta la p-nitrofenil-ß-1, 4-celobiosida, o (b) una celulasa de la Familia (7), y un segundo componente el cual es ya sea (a) un agente de abrasión mecánica o (b) una celulasa que tiene actividad de abrasión, en donde cada celulasa muestra al menos 30% de su actividad máxima a pH 7.0.

13. La composición de celulasa de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada adicionalmente por es como se definió en cualquiera de las reivindicaciones 2-11.