MXPA98001153A - Metodos y materiales para producir plantasresistentes a patogenos - Google Patents

Abstract

Esta invención comprende un gen mutante de virus de plantas que confiere resistencia en plantas de tabaco y de tomate contra infecciones por el tobamovirus del mosaico del tabaco e infecciones por el geminivirus del moteado del tomate e infecciones por otros geminivurs relacionados;se aislóinicialmente un gen a partir del gen BC1 conocido, entre los nucleótidos 1278 a 2311 del componente B del geminivurus del moteado del tomate;después de subcionar este fragmento de ADN en un vector de expresión apropiado y de transformar el gen en plantas de tabaco, se produjo un producto génico truncado que confiere resistencia contra la infección viral a la planta recombinante en el que se expresa.

Description

MÉTODOS Y MATERIALES PARA PRODUCIR PLANTAS RESISTENTES A PATÓGENOS Referencia recíproca a la solicitud relacionada Esta solicitud describe el beneficio de la solicitud provisional de E.U.A. No. 60/015,051, presentada el 09 de Abril de 1996, y la solicitud provisional de E.U.A. No. 60/002,158, presentada el 11 de Agosto de 1995.

Agradecimiento al apoyo gubernamental Esta invención fue hecha con apoyo gubernamental bajo el programa especial de concesiones USDA/DSRS CBAG, concesiones Nos. 93-34135-8607; 92-34135-7456; y la concesión No. 90153-C del Florida Tomato Committee. El gobierno tiene ciertos derechos sobre esta invención.

CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención pertenece al campo de conferir resistencia a patógenos en plantas. Más particularmente, la invención está dirigida a plantas transgénicas resistentes a virus.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los productores de tomate sufren pérdidas importantes debidas a la infección por el geminivirus del moteado del tomate. Actualmente, los agricultores deben adquirir compuestos químicos para controlar al virus del moteado del tomate en sus campos de tomate. Del mismo modo, los agricultores que producen tabaco experimentan pérdidas debido a la infección de los cultivos de tabaco por tobamovirus del mosaico del tabaco. En consecuencia, existe la necesidad de dar una solución a este problema que sea menos costosa y menos perjudicial para el medio ambiente que los controles químicos que se utilizan actualmente. La producción de plantas transgénicas con característica fenotípicas mejoradas es un avance relativamente reciente en el arsenal disponible para los agricultores. No obstante, el valor de esta tecnología se ha demostrado repetidamente en años recientes. Sin embargo, lo que se requiere es la identificación de genes adecuados que confieran el fenotipo deseado, en este caso, resistencia al patógeno. La transformación de plantas con porciones de genomas virales puede dar como resultado plantas con resistencia a virus (Beachy, 1993). Este fenómeno se conoce como "resistencia derivada del patógeno" (Sanford y Johnson, 1985). El nivel de resistencia obtenido es variable. Esta variabilidad se ha atribuido a la naturaleza aleatoria del proceso de transformación (Lo onossoff, 1995). Líneas independientes de plantas generadas a parti r de un experimento de transformación individual pueden contener diferentes números de copias del transgen insertados en varios cromosomas. Se han observado diferencias fenotípicas entre líneas de plantas que contienen una copia individual del transgen. Parte de la variabilidad en la expresión del transgen se ha atribuido también a cambios inducidos por el cultivo de tejidos (Phillips y otros, 1994). Esta variabilidad en el fenotipo se observa también en la progenie subsecuente derivada de las plantas Ro . La introducción de una mutación (defectuosa) en una porción de una proteína de porciones múltiples se ha propuesto como una estrategia para interferir con la replicación viral. Esta interferencia con la función de genes de tipo silvestre se ha referido como una mutación negativa dominante. Maxwell y sus colaboradores han construido plantas transgénicas que expresan una proteína modificada asociada a la replicación (RAP) del geminivirus del moteado del tomate, mutada en una porción de unión a NTP, que parece interferir con la replicación viral (Hanson y otros, 1991). Este mutante negativo dominante para el gen para la RAP del geminivirus del moteado del tomate se ha puesto a prueba para la resistencia al geminivirus del moteado del tomate en tomates. Noris y otros (1994, Primer Simposio Internacional sobre Geminivirus, Almería, España) encontraron inhibición de la replicación del ADN del virus del enrollamiento foliar amarillo del tomate (TYLCV) en protoplastos de tabaco cotransfectados con el TYLCV, y un constructo de una RAP truncada expresada bajo el control de un promotor 35S del CaMV. Esta estrategia de control es probablemente muy específica del virus, ya que se ha demostrado que los sitios de unión de la RAP esenciales para el funcionamiento requieren una interacción específica de la secuencia entre la RAP y el origen de la replicación (Fontes y otros, 1994). Esto permite que los factores de transacción de la RAP discriminen entre los orígenes de replicación de geminivirus estrechamente relacionados. Debido a la diversidad y adaptabilidad de los geminivirus, las estrategias de control específicas del virus son de valor limitado bajo condiciones de campo. En años recientes, han habido varios reportes relativos a la infección de ciertas plantas por patógenos virales específicos. Por ejemplo, Von Arnim y Stanley (1992) reportaron la inhibición de la infección sistémica por el virus del mosaico de la yuca africana (ACMV) mediante una proteína de movimiento del geminivirus relacionado, el virus del mosaico dorado del tomate (TGMV) . Esto se logró reemplazando la secuencia de codificación de la proteína de la cubierta del ACMV con las secuencias del gen de movimiento BL1 o BR1 del TGMV, y probando después la capacidad del ACMV recombinante para infectar a su huésped, Nicotiana benthamiana (que es también el huésped del TGMV). Los autores encontraron que el gen del TGMV no complementó el recombinante del ACMV, y plantearon la hipótesis de que la expresión genómica directa de un mutante negativo dominante podría producir plantas resistentes a los geminivirus. Cooper y otros (1995) describió que plantas de tabaco transgénicas que expresan una proteína de movimiento defectuosa del virus del mosaico del tabaco (TMV) eran resistentes a la infección por virus múltiples, mientras que plantas transgénicas que expresan la proteína de movimiento natural exhibían susceptibilidad incrementada a la infección por el TMV y otros virus. Nejidat y Beachy (1990) describieron que plantas de tabaco transgénicas que expresan una proteína de la cubierta del TMV exhiben resistencia incrementada contra varios de los tobamovirus. Gilbertson y otros (1993) describió la patogenicidad reducida de pseudorrecombinantes de dos geminivirus bipartitas, TGV-MXI y ToMoV del moteado del tomate.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Se ha descubierto un gen mutado de virus de plantas que protege a las plantas de tabaco contra las infecciones por el geminivirus del moteado del tomate y el tobamovirus del mosaico del tabaco. Este gen de resistencia se ha introducido en el ADN cromosómico del tabaco mediante ingeniería genética. Las plantas de tabaco transgénicas que expresan este gen muestran resistencia a las infecciones por el geminivirus del moteado del tomate y el tobamovirus del mosaico del tabaco (falta de síntomas de enfermedad o reducción de los mismos cuando las plantas se inoculan con los virus). El gen mutado puede introducirse en los cromosomas de líneas de tomate y de tabaco convenientes para desarrollar cultivares/híbridos de tomate y de tabaco comercialmente mejorados. Por consiguiente, esta invención comprende un gen mutante de virus de plantas que confiere resistencia en plantas de tabaco y de tomate contra las infecciones por el tobamovirus de mosaico del tabaco y el geminivirus del moteado del tomate, así como también resistencia a las infecciones por otros geminivirus relacionados. El gen BCl conocido, entre los nucleótidos 1278 y 2311 del componente B del geminivirus del moteado del tomate, fue subclonado en un vector de expresión apropiado y transformado en plantas de tabaco. Se produjo un producto del gen mutado que confiere resistencia contra la infección viral de la planta recombinante en la que se expresa. Un objetivo de esta invención es proveer un método para conferir resistencia viral en una planta. Otro objetivo de esta invención es proveer un gen BCl mutado y cualquier fragmento del mismo que confiera resistencia viral en una planta. Otro objetivo de esta invención es proveer plantas transgénicas novedosas con resistencia viral mejorada. Otros objetivos y ventajas de esta invención llegarán a ser evidentes a partir de la revisión de la descripción completa de la invención y las reivindicaciones anexas, BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 es la secuencia del gen BCl mutado de cadena individual del geminivirus del moteado del tomate excepto para las posiciones 1742 a 1766 que inicialmente no fueron identificadas; los nucleótidos de tipo silvestre que son diferentes en el gen mutante se muestran en la caja baja del texto arriba de la secuencia del gen mutante. La Figura 2 es la secuencia mostrada en la Figura 1 junto con su cadena complementaria; los codones de inicio y de término de la traducción están subrayados; los sitios terminales son sitios de restricción HindIII. La Figura 3 es la secuencia de aminoácidos deducida del producto del gen mutado codificado por la secuencia de nucleótidos de la Figura 1, excepto para las posiciones 151 a 159, que en los esfuerzos iniciales de determinación de la secuencia, no fueron identificadas. La Figura 4 muestra una comparación de los productos del gen de tipo silvestre y del gen mutante (la proteína mutante es la secuencia inferior). La Figura 5 muestra la comparación fenotípica de plantas de tabaco Ri transgénicas que expresan la proteína BCl del TMoV. Se derivaron plantas transgénicas de una planta Ro que contenía dos copias del gen BCl (véase la Figura 6) y que no mostraba achaparramiento alguno. (A) plantas de izquierda a derecha: a. planta transgénica (BC1-3-11-5) que expresa la proteína BCl sintomática, mostrando achaparramiento, moteado y enrollamiento de las hojas. Los síntomas son más severos que aquellos inducidos por la infección por el TMoV; b. planta trangénica (BCl-3-11-2) que contiene una copia del transgen BCl no sintomático y el transgen BCl sintomático, mostrando moteado sin achaparramiento; c. planta transgénica (BC1-3-11-6) que contiene una copia del transgen BCl no sintomático; y d. tabaco no transgénico. (B) Planta de la izquierda como en b, Figura 5A, y a la derecha como en c, Figura 5A. Las plantas en A fueron fotografiadas 45 días después del transplante, y en B 90 días después. La Figura 6 muestra el análisis Southern blot de la planta transgénica Ri con diferentes fenotipos. Segregación del transgen BCl en la generación Ri de plantas de tabaco transgénicas que mostraron diferentes fenotipos en la Figura 5 BC1-3-11-1 y -2, moteado únicamente, -4 y -5, achaparramiento y moteados severos, -6 y -7, sin síntomas visibles). Se muestran para propósitos de comparación blots de BC1-3-16-2 mostrando achaparramiento y moteado, y BC1-3-6-3 y -4, sin síntomas visibles; planta NT (no transformada); y pKYsBCl, vector utilizado para la transformación. El ADN genómico de las plantas transgénicas fue ext raído y digerido con Xbal. Los Southern blots fueron sometidos a hibridación con fragmento de ADN de BCl marcado con 32 p.

La Figura 7 muestra el análisis Western blot de la fracción P30 de extractos de tejido de plantas de tabaco Ri transgénicas que expresan el gen BCl. Las hileras representan extractos de plantas descritos en la Figura 6, excepto para el extracto infeccioso del TMoV a partir de tejido infectado por el TMoV). Las fracciones subcelulares, Pl, P30 y S30, fueron preparadas (Pascal y otros, 1993) y sometidas a SDS-PAGE (Schagger) con cierta modificación e in unoblots utilizando el antisuero policlonal contra la proteína BCl expresada. Los resultados de las fracciones Pl y S30 no se muestran aquí. La Figura 8 muestra el análisis Northern blot de plantas transgénicas que expresan el gen BCl, probadas con ADN de BCl marcado. Se encontraron dos transcritos relacionados con BCl en las plantas transgénicas que expresan el gen BCl de longitud completa, mientras que sólo se encontró un transcrito en la planta transgénica que expresó una forma truncada 3' del gen BCl (BC1-3-11-6) . Las muestran indicadas son como en la figura 6. Las figuras 9A-1 a 9A-5 y 9B muestran las secuencias de nucleótidos (A) y las secuencias de aminoácidos predichas (B) de BCl del TMoV y sus mutantes transgénicos. La secuencia de nucleótidos del gen BCl del TMoV provienen del acceso U14461 del Banco de Genes. Se verificó la secuencia de ORF de BCl amplificado mediante PCR antes y después de la clonación en el vector pGEM-T. Se determinó la secuencia de BC1A a partir de una planta transgénica asintomática de copias múltiples que expresaba la proteína BCl de longitud completa. Se analizó la secuencia del producto de la PCR derivado de ADN genómico (BC1-3-6-3A). La secuencia de BClAt/r se determinó a partir del ADNc, los productos de RT-PCR, amplificados a partir del ARN total (BC1-3-11-6A) . Se verificó también la secuencia determinando la secuencia del producto de la PCR del ADN genómico y del producto clonado por PCR. Se determinó la secuencia de BC1S de una planta transgénica sintomática que expresaba la proteína BCl de longitud completa. Se analizó la secuencia después de RT-PCR de ARN total (BC1-3-11-55) , después de amplificación por PCR del ADN genómico (BC1-3-11-55) y después de amplificación por PCR de 3 líneas distintas con un fenotipo similar. Nótese que los nucleótidos y los residuos aminoácidos idénticos se indican mediante (.).

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un gen mutado de virus de plantas que cuando se expresa en una planta confiere en esa planta resistencia a la infección por fitopatógenos. En una modalidad, el gen mutado del virus es un gen BCl de geminivirus. El gen mutado de la presente invención puede prepa ra rse insertando el gen de tipo silvestre en el genoma de una planta, e identificando aquellas plantas transformadas con el gen que exhiben resistencia mejorada a la infección viral. La presente invención se refiere también a un método para conferir resistencia en una planta a la infección por fitopatógenos. El método de la invención comprende insertar un gen de movimiento viral de tipo silvestre, tal como BCl, en el genoma de una planta, e identificar después aquellas plantas que no exhiben síntomas patogénicos cuando el gen insertado se expresa, pero que tienen resistencia mejorada a la infección por patógenos. La presente invención se refiere también a plantas transgénicas y tejidos de la planta que tienen un gen mutado de la presente invención incorporado en su genoma. Lo siguiente es un ejemplo específico de la presente invención, un método para crear una planta resistente a virus utilizando el gen BCl del geminivirus del moteado del tomate para ilustrar la invención,. El método es generalmente y ampliamente aplicable a otros virus de plantas. Se conoce la secuencia completa del gen BCl del geminivirus del moteado del tomate (Abouzid y otros, 1992, incorporado en la presente invención como referencia). El gen BCl del geminivirus del moteado del tomate del componente B del genoma se aisla en cantidad suficiente para subclonarlo en un vector de expresión. Esto puede lograrse mediante cualquiera de varios métodos bien conocidos en la técnica. Un método simple es usar un par de iniciadores específicos para amplificar el segmento deseado de conformidad con la bien conocida técnica de reacción de cadena de polimerasa (PCR). Para este propósito, puede utilizarse un par iniciador útil tal como: 5'-CCCAAGCTTCGAGTTCGAAACTGC-3' (SEQ ID NO. 1) y 5'-CCCAAGCTTAACGAAGTGTGTTTGAC-3' (SEQ ID NO. 2). Todo el gen BCl o porciones del mismo pueden utilizarse para este propósito. Después de que se obtienen cantidades suficientes del gen, el gen se clona en un vector para producir una fuente estable que permite producir el gen en masa. Para este propósito, puede utilizarse cualquier vector conocido en la técnica, y las cantidades en masa del vector pueden cultivarse, por ejemplo, mediante transformación de células bacterianas componentes tales como E. coli, seguida por cosecha del ADN del plásmido. Preferiblemente, el gen se inserta en el sitio de , clonación múltiple de un vector, tal como los vectores pUC o los vectores pGEM comercialmente disponibles, que permiten la excisión del gen que tiene sitios terminales de restricción adaptados para inserción en cualquier vector deseable para expresión o integración en plantas. Para este propósito, puede utilizarse cualquier vector en el que un promotor fuerte, tal como un promotor de gen viral, esté enlazado operativamente a la secuencia de codificación del gen mutante de esta invención. Por ejemplo, el promotor 35S poderoso del virus del mosaico de la coliflor puede utilizarse para este propósito. En una modalidad de esta invención, este promotor se duplica en un vector conocido en la técnica como pKYLX 71:35S2 (Morgan y otros, 1990). Sin embargo, otros vectores de expresión en plantas pueden utilizarse para este propósito.

Después de que el gen es cortado y resubclonado en un vector de expresión deseable, el gen se transforma en una bacteria u otro vector que sea capaz de introducir el gen en una célula vegetal. Alternativamente, el gen puede introducirse en células vegetales mediante un método biolístico ([Carrer, 1995). Preferiblemente, células de A robacterium competentes se utilizan para este propósito, y secciones de la planta se exponen a Agrobacterium que aloja al gen BCl. Se prefiere regenerar las células vegetales en un medio selectivo para asegurar la captación eficiente del gen, después de lo cual las plantas regeneradas se cultivan bajo condiciones optimizadas para su supervivencia. Como resultado de este procedimiento, se ha descubierto que una gran proporción de plantas de tabaco regeneradas que eran transgénicas para el gen BCl tenían un gen espontáneamente mutado que expresaba un producto del gen mutado. Inesperadamente, las plantas que alojan al gen mutado exhibían resistencia incrementada a la infección viral por virus de plantas tanto de ADN como de ARN, sin efecto deletéreo alguno observado resultado de la expresión del gen BCl mutado (en contraste, la expresión del gen de tipo silveetre produce síntomas de enfermedad). Aun cuando los expertos en biología molecular sean capaces de clonar el gen BCl conocido en un vector de expresión en plantas para obtener el gen mutado de la presente invención, el gen mutante de esta invención se ha depositado también antes de la presentación de la presente solicitud de patente con la American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 E.U.A. El gen mutante fue clonado en un vector bacteriano (pGEM-T), y el constructo se denomina TMBClm. El depósito ha sido asignado al número de acceso ATCC No. 97244 por el depositario. El presente depósito fue depositado bajo condiciones que aseguran que el acceso al depósito estará disponible durante la suspensión de esta solicitud de patente hasta el determinado por el Comisionado de Patentes y Marcas de Fábrica intitulado además como 37 CFR 1.14 y 35 U.S.C. 122. El depósito estará disponible según lo requieran las leyes de patente extranjeras en países donde las contrapartes de la presente solicitud, o su progenie, sean presentadas. Sin embargo, debe entenderse que la disponibilidad de un depósito no constituye una licencia para poner en práctica la presente invención en derogación de los derechos de patente otorgados por acción gubernamental . Además, el depósito en cuestión será almacenado y hecho disponible al público de conformidad con las provisiones del Tratado de Budapest para el Depósito de Microorganismos, es decir, será almacenado con todos los cuidados necesarios para mantenerlo viable y no contaminado durante un período de por lo menos 5 años después de la solicitud más reciente para la provisión de una muestra del depósito y , en cualquier caso, durante un período de por lo menos treinta (30) años después de la fecha de depósito o durante la vigencia aplicable de cualquier patente que pueda derivar de la descripción del cultivo. El depositante reconoce la obligación de reemplazar el depósito si el depositario es incapaz de proveer una muestra cuando sea requerido, debido a la condición del depósito. Todas las restricciones sobre la disponibilidad del presente depósito del cultivo hacia el público serán removidas irrevocablemente por la concesión de una patente que lo describa. Para utilizar los materiales biológicos depositados, todo lo que se necesita es que el ADN sea solubilizado en un regulador de pH para transformación apropiado para el tipo de célula en el que el gen va a ser transformado. Para E. coli, las células competentes se preparan y transforman de conformidad con métodos bien conocidos en la técnica (véase Maniatis y otros, 1982), y las células transformadas se seleccionan en un medio de crecimiento con ampicilina. El plásmido se aisla después a partir de E. coli, y se corta del vector pGEM-T utilizando, por ejemplo, la enzima de restricción HindIII. El fragmento del gen cortado tiene un tamaño de aproximadamente 1100 pares de bases. El fragmento HindIII se clona después en el sitio HindIII de un vector de expresión apropiado como se describe más adelante. Además de lo anterior, la figura 1 provee la secuencia del gen mutante de esta invención, excepto para un ramo de 25 nucleótidos que corresponden a las posiciones 1742 a 1766, que no fueron identificadas en los esfuerzos iniciales de determinación de secuencia. Existen varias mutaciones en el polinucléotido de la figura 1. Dichas mutaciones forman parte de la presente invención. Además, la figura 2 provee la cadena complementaria del polinucléotido mutante y muestra el sitio terminal HindIII. La figura 3 provee la secuencia de aminoácidos deducida del producto del gen mutado, excepto para los aminoácidos 151 a 159, que no fueron identificados en la determinación de secuencia inicial. Las diferencias en la secuencia de aminoácidos entre el producto BCl de tipo silvestre y los productos BCl mutantes se muestran en la figura 9B. La figura 4 muestra una comparación entre la proteína de tipo silvestre (secuencia superior) y la proteína mutante (secuencia inferior) con base en los esfuerzos iniciales de determinación de secuencia . Aun cuando esta descripción provee un gen específico y fragmentos del mismo que confieren resistencia en plantas a la infección por geminivirus y tobamovirus, los expertos en la técnica reconocerán que mutaciones distintas o adicionales a las mutaciones específicas mostradas en la presente invención pueden lograr resultados similares. En efecto, el método enseñado en la presente invención, mediante el cual se obtuvo el gen mutante descrito en la presente invención, es ampliamente aplicable a la obtención de genes de movimiento mutados similarmente útiles de cualquier virus. Además, es predecible, con base en la presente descripción, que los presentes genes y moléculas de polinucleótidos descritos en la presente invención, así como también los genes derivados del mismo modo, pueden conferir en una planta resistencia a la infección que es causada por una amplia variedad de fitopatógenos, y que dependen del gen de movimiento u otros productos del gen para su patogénesis, incluyendo virus tanto de ADN como de ARN.

EJEMPLO 1 Desarrollo de plantas de tabaco transgénicas A. Construcción del gen BCl en un vector de expresión. Se amplificó el gen BCl (nucleótidos entre 1278 y 2311 del componente B del geminivirus del moteado del tomate; Abouzid y otros, 1992) a partir de los extractos de plantas de tomate infectadas por el geminivirus del moteado de tomate mediante la tecnología de reacción de cadena de polimerasa (PCR). Los iniciadores utilizados para amplificar el gen BCl viral fueron 5'-CCCAAGCTTCGAGTTCGAAACTGC-3' (SEQ ID NO. 1) y 5'-CCCAAGCTTAACGAAGTGTGTTTGAC-3' (SEQ ID NO. 2). El segmento BCl amplificado fue clonado en un vector pGEM-T y digerido después con HindIII. El segmento BCl cortado fue ligado en el sitio único HindIII del vector binario pKYLX71:35 S2.

B. Transformación de Agrobacterium. Se prepararon células competentes de Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 como los describen An y otros (1985). El gen BCl en el vector pKYLX 71:35 S fue transferido directamente en Agrobacterium. El clon se mantuvo en un congelador a -80°C para su uso posterior.

C. Transformación de plantas. Se utilizó Agrobacterium que posee el gen BCl en el vector pKYLX 71:35 S2 para transformar los discos de hojas de Nicotiana tobacu cv. Xanthi. Se cultivaron las células de Agrobacterium en caldo YEP contendiendo 50 µg/ml de kanamicina y 10 µg/ml de tetraciclina y 25 µg/ml de estreptomicina durante 24 a 30 horas. Las células de Agrobacterium se recogieron y se resuspendieron en caldo YEP. Los discos de hojas cortados de plántulas jóvenes estériles expandidas se sumergieron en la suspensión de Agrobacterium y se colocaron después sobre un medio selectivo conteniendo 200 µg/ml de Mefoxin y 100 µg/ml de kanamicina. La regeneración y la selección se llevaron a cabo con los medios, y tardaron de 6 a 8 semanas. Las plantas resistentes a la kanamicina se cultivaron individualmente en suelo bajo condiciones estériles durante 1 semana, y se transplanta ron después en macetas en un lugar y/o invernadero para crecimiento.

EJEMPLO 2 Análisis mediante PCR, Southern blot y ELISA La transformación de las plantas de tabaco se confirmó mediante análisis de PCR para el gen BCl en extractos de ADN cromosómico, mediante Southern blotting con una sonda de BCl, y mediante análisis de ELISA para NPT II (neomicina fosfotransferasa II). Veintitrés plantas fueron transgénicas para BCl.

EJEMPLO 3 Análisis Western blot Se pulverizaron hojas infectadas de plantas de tomate después de congelarlas en nitrógeno líquido, y se trituraron extensivamente con un mortero y mano de mortero en dos volúmenes de regulador de pH para molienda en frío con hielo (GB: Tris-HCl a 100 M, pH 8.0, EDTA a 10 mM y 5 ml de ditiotreitol) (Deom y otros, 1990). Las fracciones de membrana y de pared celular se prepararon como lo describen Pascal y otros (1993). El procedimiento de blotting fue realizado esencialmente como lo describen Towbin y otros (1979) utilizando una celda de elec roforesis Mini-Protein de Bio-Rad y una celda de transferencia electroforética Trans-Blot de Bio-Rad. El gel separador para proteínas pequeñas se preparó con 12.5% de poliacrilamida en regulador de pH en gel (Laemmli, 1970). Los geles para proteína fueron transferidos a membrana de nitrocelulosa (Trans-Blot de Bio-Rad, 0.4 µm). La detección de la proteína BCl expresada en plantas de tabaco transgénicas se llevó a cabo con el Sistema de Detección Quimioluminiscente Western-Light (TROPIX, Inc.). La proteína BCl fue detectada a un nivel relativamente alto, y los extractos de aproximadamente 50% de las plantas mostraron una proteína BCl más pequeña (truncada) (28k Da) que el tipo silvestre (33k Da).

EJEMPLO 4 Evaluación de plantas de tabaco transgénicas para síntomas debidos a la expresión del gen BCl El gen BCl se ha implicado como un elemento inductor de síntomas causados por un geminivirus bipartita durante la infección. Once plantas de tabaco transgénicas que expresaron la proteína BCl de longitud completa mostraron síntomas de enfermedad. Doce plantas que expresan la proteína BCl truncada no mostraron síntomas de enfermedad.

EJEMPLO 5 Resistencia al geminivirus del moteado del tomate y al tobamovirus del mosaico del tabaco Plantas de tabaco transformadas (generación Ri ) que expresan BCl fueron sometidas a prueba para suceptibilidad a la infección por el geminivirus del moteado del tomate mediante transmisión natural por la mosca blanca vector y mediante inoculación mecánica con extractos de plantas infectadas. Se evaluaron las plantas inoculadas para resistencia al geminivirus del moteado del tomate mediante el desarrollo de síntomas, y mediante inmunopruebas ligadas a enzima (ELISA) utilizando antisuero reactivo a la proteína de la cubierta del geminivirus del moteado del tomate. Las plantas transgénicas que expresan la proteína BCl truncada estuvieron libres de síntomas y tuvieron lecturas de ELISA muy bajas. Las plantas de tabaco transgénicas sometidas a inoculación mecánica con el tobamovirus del mosaico del tabaco mostraron síntomas de enfermedad reducidos comparativamente con plantas no transgénicas inoculadas.

EJEMPLO 6 Análisis del gen BCl que expresa la proteína truncada El gen BCl de plantas de tabaco que expresan la proteína BCl truncada fue amplificado mediante PCR, y se determinó su secuencia. Estos datos indican que el gen BCl ha sufrido utación(es) espontánea(s) en aproximadamente el 50% de las plantas de tabaco BCl ransgénicas. Durante la fase de cultivo de tejidos, las células vegetales que contienen el gen BCl mutado pueden tener un ventaja selectiva sobre las células que expresan el gen BCl de tipo silvestre.

EJEMPLO 7 Producción de plantas de tomate transgénicas El gen BCl mutado en el vector pKYLX 71:35 S2 es adecuado para producir tomates transgénicos para el gen mediante ransformación por Agrobacterium como se describió anteriormente para el tabaco. El gen BCl mutado provee resistencia similar al geminivirus del moteado del tomate en el tomate como se observa en el tabaco transgénico. La introducción de este gen BCl mutado en el cromosoma de líneas de tomate convenientes da como resultado resistencia al geminivirus del moteado del tomate en cultivares/híbridos de tomate comercialmente aceptables. Además, se predice que esta resistencia es activa contra infecciones por otros geminivirus. La reeistencia al virus de mosaico del tabaco se detectó también en el tabaco transgénico que expresa el gen BCl mutado, indicando que la resistencia a los virus de ARN también es posible con la expresión de este gen mutado de un virus de ADN de plantas. El gen mutado en el tomate ofrece resistencia al tobamovirus del mosaico del tomate, un virus relacionado al tobamovirus del mosaico del tabaco.

EJEMPLO 8 Producción de fragmentos del gen BCl útiles para conferir resistencia a virus en plantas Pueden producirse fragmentos del gen BCl mutante que son útiles para conferir resistencia a virus en plantas mediante el uso de la BAL31 exonucieasa para digestión limitada controlada por el tiempo del gen BCl mutante. Los métodos de uso de la BAL31 exonucieasa para este propósito son bien conocidos en la técnica, y han sido ampliamente utilizados durante más de una década (Wei y otros, 1983). Mediante el uso de la BAL31 exonucieasa, pueden removerse fácilmente nucleótidos de cualquiera o ambos extremos del gen BCl mutante para generar sistemáticamente y ciertamente un amplío espectro de fragmentos de ADN que tienen longitudes controladas y son de sitios controlados a lo largo de la longitud total del gen BCl mutante. Cientos de dichos fragmentos de varios puntos a lo largo de la secuencia de ADN del gen BCl mutante completo pueden generarse sistemáticamente en una tarde. Estos fragmentos del gen se clonan después en vectores apropiados y se transfieren finalmente en células vegetales de conformidad con los métodos descritos ant riormente. Las células vegetales transformadas con estos fragmentos se cultivan y regeneran habitualmente en plantas, que después son eometidas a prueba para resistencia a virus. De esta manera, se identifican habitualmente e impredeciblemente fragmentos del gen BCl mutante que son suficientes para conferir resistencia viral.

EJEMPLO 9 Producción de otros mutantes que confieren resistencia a virus en plantas Se transformaron plantas de tabaco con el gen para proteína de movimiento (gen para patogenicidad, BCl) del geminivirus del moteado del tomate (TMoV) utilizando la transformación mediada por Agrobacterium. Diferentes líneas de tabaco transgénicas que expresan la proteína BCl tuvieron fenotipos que varían desde plantas con achaparramiento y moteado foliar severos, hasta plantas sin síntomas visibles.

Los datos de secuencia para el transgen BCl para los diferentes fenotipos indicaron mutación(es) inesperada(s) . Un transgen BCl mutado suprimió la expresión fenotípica del gen BCl sintomático en líneas de tabaco que contienen ambas copias del gen BCl. La presente invención muestra que las mutaciones espontáneas en el transgen son comunes en las transformaciones mediadas por A robacterium, y que este fenómeno puede utilizarse para crear y seleccionar plantas resistentes a patógenos utilizando genes de patogenicidad durante la transformación. La expresión del gen BCl para la proteína de movimiento del geminivirus del moteado del tomate (TMov) (Abouzid y otros, 1992) se examinó en plantas de tabaco transgénicas para evaluar su función y para su utilización posible en resistencia derivada de patógenos. El gen BCl se ha implicado como un elemento inductor de síntomas por un geminivirus bipartita durante su expresión en plantas transgénicas (Pascal y otros, 1993; von Arnim y Stanley, 1992). Se obtuvieron plantas de tabaco transgénicas que expresan el gen BCl utilizando la transformación estándar mediada por A robacterium. De manera eo rp rendente, varias plantas que expresan la proteína BCl del TMoV con base en el análisis Western blot, no mostraron el fenotipo esperado de síntomas causados por el virus. Sólo 11 de las 19 plantas de tabaco Ro transgénicas que expresaron la proteína BCl mostraron síntomas de enfermedad que variaban desde moderados hasta severos. Fue inesperada la observación de que ocho plantas que expresan la proteína BCl no mostraron síntomas.

A partir de análisis adicionales, se observaron los tres fenotipos en la generación Ri derivada de una planta Ro que no mostró achaparramiento evidente alguno (Fig. 5). Los tres fenotipos observados fueron: 1) achaparramiento y moteado severos, más severos que los síntomas típicos asociados con las infecciones por el TMoV en el tabaco; 2) moteado sin achaparramiento; y 3) sin síntomas visibles, plantas indistinguibles de las plantas no transformadas. Estas plantas transgénicas se analizadon mediante Southern blots para identificar el número de copias del gen (Fig. 6). La planta transgénica que mostraba moteado ligero sin achaparramiento tuvo dos copias del gen BCl. Otra progenie de esta línea que tuvo un fenotipo de síntomas severos o un fenotipo no sintomático, sólo tuvo una copia. La progenie de otras tres líneas examinadas, una con fenotipo sintomático y dos con fenotipos no sintomáticos, tuvo 3, 3 y 5 copias del gen BCl, respectivamente. Altos niveles de expresión de la proteína BCl fueron indicados en los tejidos jóvenes en todas las plantas transgénicas mediante análisis Western blot excepto para una línea no sintomática, que mostró niveles bajos de una proteína BCl truncada. La planta no sintomática (BC1-3-6-4; fenotipo no mostrado) tuvo un nivel similar de proteína BCl como la planta sintomática (BC1-3-11-5) . Los extractos de la planta de síntomas atenuados (Fig. 5A y B: BC1-3-11-2) mostraron proteínas BCl truncadas y de longitud completa. El bajo nivel de detección de la proteína BCl truncada puede deberse a la pérdida de epítopes, ya que se perdieron 121 residuos aminoácidos en el extremo carboxilo (véase más adelante). Las proteínas BCl (de forma truncada o de longitud completa) de las plantas transgénicas no sintomáticas no se detectaron en el tejido maduro, a diferencia de lo que se observa para las plantas transgénicas que expresan la proteína BCl del tipo de síntomas severos. Esto indica que ciertas mutaciones en la proteína BCl pueden afeptar su estabilidad en la planta. Los análisis Northern blots indicaron un alto número de transcritos para todas las líneas transgénicas (Fig. 8). La planta no sintomática mostrada en la Fig. 5A tuvo un transcrito más pequeño que el esperado. Esta deleción aparente en el transcrito es consistente con la proteína BCl truncada observada en Western blots (Fig. 7). El nivel de transcritos para las plantas que expresan la proteína BCl truncada fue alto y, por lo tanto, el nivel bajo de proteína BCl truncada detectada en Western blots (Fig. 7) no se debe a la actividad del transcrito. El transcrito más grande que el transcrito esperado es el resultado de una lectura a través de las señales de terminación de BCl en las secuencias de terminación de rbcS del vector pKYLX. El gen BCl de las plantas de tabaco transgénicas que muestran los diferentes fenotipos se amplificó mediante reacción de cadena de polimerasa (PCR), y se determinó su secuencia. Los datos de secuencia revelaron mutaciones (residuo aminoácido 215 G-S, 219 S-L y 247 E-G) cerca del extremo carboxilo de la proteína BCl (Fig. 9) para el fenotipo de achaparramiento severo (Fig. 5). Dos mutantes estuvieron asociados con plantas de tabaco transgénicas no sintomáticas. Un mutante (resuelto a partir de BC1-3-6-3) mostró varios cambios cerca del extremo amino (residuo aminoácido 6 V-F, 7 N-S y 35 F-L), mientras que el otro (resuelto a partir de BC1-3-11-6, Fig. 5A) mostró un cambio en el residuo aminoácido 12 F-C, una deleción de los residuos aminoácidos 174 a 293, y una secuencia de fusión no identificada de 26 residuos aminoácidos que comienza después del residuo aminoácido 173 (Fig. 9). Esto fue consistente con la detección de una proteína BCl truncada (~10 kDa más pequeña en tamaño comparativamente con el tipo silvestre) en Western blote de extractos de estas plantas transgénicas. Se determinó la secuencia del transcrito para la proteína BCl truncada después de la transcripción inversa del ARN total extraído utilizando iniciador oligo dT seguido de amplificación de PCR utilizando un iniciador específico de BCl. Las plantas de tabaco Ro transgénicas no sintomáticas revelaron segregación en la generación R como lo indica la aparición de varias plantas sintomáticas en esta generación. Algunas líneas con atenuación de síntomas (Fig. 5B) continuaron segregando en la generación R2 , pero las plantas no sintomáticas no lo hicieron. El análisis de Southern blot (Fig. 6) indicó copias múltiples del gen BCl en el tabaco Ro . Al parecer, algunas de las líneas de tabaco Ro contenían copias de las formas sintomática y no sintomática de BCl. Esto se confirmó mediante análisis de Southern blot y Western blot de plantas de tabaco Ri seleccionadas que fueron asociadas con los diferentes fenotipos (Fig. 5). El fenotipo moteado sin achaparramiento descrito anteriormente (Fig. 5) tenía una copia de cada una de las formas sintomática y no sintomática de BCl. El tabaco transgénico que contiene copias de las formas sintomática y no sintomática del gen BCl (Fig. 5) dio como resultado no achaparramiento con fenotipo moteado moderado. Esto indicó que el gen BCl no sintomático suprimió (interferencia negativa trans-do inante) el síntoma que induce elemento(s) del gen BCl sintomático en plantas transgénicas que contienen ambas formas. El carácter silencioso de este transgen (Meins Jr. y Kunz, 1995) no fue evidente en estas plantas, ya que ambas proteínas se detectaron en Western blots (Fig. 7, BC1-3-11-2). Además, la expresión del fenotipo sintomático en generaciones subsecuentes indicó que el gen BCl sintomático no estaba en una forma inactiva en el tabaco Ro suprimido por el fenotipo. La supresión del síntoma también fue efectiva contra la infección por el virus ya que plantas de tabaco con el transgen BCl no sintomático mutado permanecieron libres de síntomas por el TMoV bajo alta presión de enfermedad a partir de moscas blancas virulíferas durante un período de 3 meses. Todas las plantas transgénicas BCl que se analizaron revelaron mutaciones espontáneas/inesperadas en el gen BCl. Se encontraron mutaciones de punto en todos los transgenes analizados, y un transgen mostró una deleción mayor en el extremo 3' con una fusión de una secuencia no identificada de ~250 nucleótidos (sin relación estrecha con secuencias en el banco de genes utilizando BLAST). Esto pudo haber ocurrido mediante un evento de entrecruzamiento cromosómico durante la dirección de la célula vegetal después de que el gen BCl se integró en el cromosoma del tabaco. En el último caso, se detecto una proteína BCl truncada (~10 kDa más pequeña en tamaño comparativamente con el tipo silvestre) en Western blots y se detectó un transcrito más pequeño en Northern blots. Esto indicó que una deleción en el transgen, así como también mutaciones de punto (descritas anteriormente) son fuentes de variación en la expresión del transgen. Otros estudios sobre la expresión de genes extraños en plantas transgénicas muestran niveles variables de expresividad en las diferentes líneas generadas o en fratrías en una línea transgénica (Hull, 1994). Niveles variables de resistencia en diferentes líneas de plantas transgénicas transformadas con el mismo gen parecen ser la norma en estudios de resistencia derivados del patógeno. Estas variaciones no se explican adecuadamente mediante efectos de posición debido a la integración aleatoria en el cromosoma de la planta durante la transformación. Se considera que el carácter silencioso de los genes en plantas transgénicas es un fenómeno general cuando copias múltiples de los transgenes se introducen en células vegetales (Meins Jr. y Kunz, 1995). Todas las plantas transgénicas Ro analizadas contenían copias múltiples del transgen BCl sin supresión evidente de la expresión del transgen. Debido a que las enseñanzas de la presente -invención utilizaron los métodos clásicos de la transformación mediada por Agrobacterium comúnmente utilizados por otros en la técnica, parte de la variación en el fenotipo esperado reportado en la literatura puede explicarse mediante mutaciones espontáneas que ocurren durante la transformación mediada por A robacterium y durante redistribuciones cromosómicas como se reporta en la presente invención para BCl del TMoV. Así, se muestra que las mutaciones de punto espontáneas en el transgen durante la ransformación mediada por Agrobacterium y otras modificaciones en el transgen mediante redistribuciones cromosómicas afectan la función y regulación de los genes con los transgenes. El tema de la invención se refiere también a moléculas de polinucleótidos mostrados en la figura 9A y los polipéptidos cuantificados por los mismos mostrados en la figura 9B, así como también otros polinucleótidos mutados que confieren resistencia viral que puede producirse utilizando las enseñanzas de la presente invención. Las mutaciones espontáneas que pueden producirse en genes de movimiento virales utilizando los métodos y materiales de la presente invención durante la transformación mediada por Agrobacterium proveen una forma simple de desarrollar plantas resistentes a patógenos. En el caso de los geminivirus, la introducción del gene de la patogenicidad (BCl para los geminivirus bipartitas, AC4 para el geminivirus monopartitas tal como el virus del enrollamiento foliar amarillo del tomate) en células vegetales mediante transformación mediada por Agrobacterium producirá selección, ya que las células trasformadas que expresan los genes no mutados de la patogenicidad no crecerán tan bien como aquellas células que expresan el gen mutado para la patogenicidad. Después de la transformación, la evaluación visual del genotipo no sintomático y el análisis de Western blot para la expresión de la proteína del gen de patogenicidad, es todo lo que se necesita para seleccionar plantas resistentes al geminivirus para análisis y evaluación posteriores. Todas las plantas de tabaco transgénicas con un fenotipo no sintomático y con expresión de la proteína BCl del TMoV mostraron resistencia al virus. Del mismo modo, ciertos genes de patogenicidad de bacterias u hongos patógenos pueden introducirse en plantas transgénicas de acuerdo con estas enseñanzas, por lo que la presión de selección dará como resultado plantas resistentes a los patógenos. Las secuencias de aminoácidos descritos en la presente invención se basan en abreviaturas normales de una sola letra para residuos de aminoácidos. Aun cuando la descripción y los ejemplos anteriores proveen detalles respecto a los métodos para realizar y usar la invención, incluyendo eu mejor modo, debe entenderse que hay variaciones y que los equivalentes funcionales obvios de la misma deben considerarse como parte de esta invención y, por lo tanto, caen dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones.

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Claims (12)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Un gen BCl mutado de virus de plantas que confiere resistencia viral mejorada a plantas que alojan dicho gen mutado.

2.- El gen de la reivindicación 1, caracterizado además porque la resistencia viral es contra un virus seleccionado a partir del grupo que consiste de tobamovirus y geminivirus.

3.- El gen mutado de la reivindicación 1, preparado mediante el procedimiento que consiste en aislar el gen natural, insertar el gen natural en el genoma de una planta e identificar las plantas que han incrementado su resistencia a la infección viral.

4.- El gen mutado de la reivindicación 1, que codifica un producto génico de aproximadamente 28 kDa.

5.- Un método para conferir en una planta resistencia mejorada contra la infección viral que comprende insertar un gen móvil viral en dicha planta e identificar una planta que expresa espontáneamente un mutante de dicho gen que confiere dicha resistencia mejorada contra la infección viral en dicha planta, mientras que al mismo tiempo no induce síntomas patogénicos en la planta.

6.- El método de la reivindicación 5, caracterizado además porque el gen de movimiento viral es un gen BCl de virus de plantas.

7.- Una planta transgénica que tiene resistencia incrementada a la infección viral, dicha planta siendo transgénica para un gen BCl mutado de virus de plantas.

8.- La planta de la reivindicación 7, que es una planta transgénica de tomate o tabaco.

9.- La planta de la reivindicación 8, caracterizada además porque la planta tiene resistencia incrementada contra la infección por el geminivirus del moteado del tomate o el tobamovirus del mosaico del tabaco.

10.- El gen mutado de la reivindicación 1, que comprende cualquiera o todas las mutaciones comparativamente con el gen del tipo silvestre, mostrado en la figura 1 o la figura 9A.

11.- El gen mutado de la reivindicación 1, que comprende toda la secuencia mostrada en la figura 9 o una porción de la misma.

12.- Una proteína BCl mutante que comprende todos los tipos silvestres o cualquiera de ellos para substituciones de aminoácidos mutantes mostrados en la figura 4 o la figura 9B.