MXPA98000981A - Promotor del gen de endoglina humana y su uso - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere al promotor del gen de endoglina humana o restos funcionales del mismo, y a su uso para preparar un fármaco.

Description

Promotor del gen de endoglina humana y su uso El presente invento se refiere al promotor del gen de endoglina humana o restos funcionales del mismo, y a su utilización para preparar un fármaco. Uno de los problemas importantes en la terapia génica es el control de la transcripción y traducción del gen efector que se introduce en la célula. Al nivel de la transcripción, este control es hecho posible añadiendo una secuencia de promotor o intensificador aguas arriba de la secuencia de codificación del gen efector. Se entiende que "la secuencia de promotor" es un segmento de gen al que son capaces de fijarse proteínas reguladoras, las que se denominan factores de transcripción, que en su totalidad activan la transcripción del gen efector aguas abajo. Las regiones que están situadas en la dirección de transcripción son designadas secuencias "aguas abajo", mientras que las secuencias que están dispuestas en la dirección opuesta son designadas secuencias "aguas arriba". Se entiende generalmente que un "gen efector" es un gen estructural cuyo producto génico tiene, por ejemplo, un efecto deseable en el sentido de la terapia génica. Tales secuencias de promotores o intensificadores pueden ser no específicas para células, específicas para células, específicas para virus, específicas metabólicamente o específicas para ciclos celulares. Ejemplos de estas secuencias de promotores y su utilización, p.ej. para la terapia génica de diferentes enfermedades, se enumeran en las Solicitudes de Patente PCT WO 96/06940, WO 96/06938, WO 96/06941 y WO 96/06939. Además, estas solicitudes de patente presentan técnicas y ejemplos para combinar estas secuencias de promotores, p.ej. con la finalidad de controlar a un gen efector de manera específica para células y de manera específica para ciclos celulares. Dependiendo de la elección y de las combinaciones de los promotores, estos últimos realizan una transcripción más o menos restringida y/o más o menos potente del gen efector que es dependiente de estos promotores. La célula endotelial es un ejemplo de una ventajosa célula diana para la terapia génica, por una parte puesto que las células endoteliales son directamente accesibles a entes artificiales génicos que se inyectan en el sistema circulatorio y, por otra parte, puesto que están implicadas directamente en el desarrollo y progreso de cierto número de enfermedades, tales como enfermedades tumorales, inflamacio-nes, alergias, enfermedades autoinmunes, reacciones de rechazo de órganos y trastornos de la circulación y coagulación y también en procesos de curación, y/o están directamente adyacentes al sitio de estos trastornos. Como regla general, los promotores específicos de células dianas son promotores de genes para las proteínas que son formadas de manera particularmente vigorosa, o en gran extensión de manera exclusiva, en la célula diana relevante. En el caso de la célula endotelial, la endoglína es un ejemplo de una de estas proteínas. La endoglina es un receptor no transferidor de señales del TGFß (Gougos y colaboradores, J. Biol. Chem. 265, 8.361 (1990), Cheifetz, J. Biol. Chem. 267, 19.027 (1992), Moren y colaboradores, BBRC 189, 356, (1992)). Aunque se presenta en pequeñas cantidades en un endotelio normal, es expresada en una extensión acrecentada en un endotelio en proliferación (Westphal y colaboradores, J. Invest. Derm. 100, 27 (1993), Burrows y colaboradores, Pharmac. Ther. 65, 155 (1994)). No se dispone de información adicional con respecto a la fuerza del promotor ni a la especificidad para células. A pesar del hecho de que el gen de endoglina se ha conocido desde hace aproximadamente 4 años (Bellon y colaboradores, (1993)) hasta el momento no ha resultado posible aislar el promotor de endoglina. La secuencia de ADNc para la endoglina humana ha sido descrita por Bellon y colaboradores (Eur. J., Immunol . 23, 2.340 (1993)), mientras que la de la endoglina murina ha sido descrita por Ge y colaboradores (Gene 138, 201 (1994)).

Aunque se dispone de información acerca de la secuencia de una parte de la región no traducida en 5 ' del gen de endoglina, no se sabe nada acerca de la función de esta región ni acerca de la región de promotor. El receptor de VEGF es otra proteína específica de células endoteliales. En este caso, se distingue entre dos receptores (Píate y colaboradores, Int. J. Cáncer 59, 520 (1994)); por un lado, el receptor 1 de VEGF (flt-1), (de Vries y colaboradores, Science 255, 989 (1992)), que contiene una tirosina-quinasa similar a fms en el resto citoplásmico, y el receptor 2 de VEGF (flk-1, KDR) , (Terman y colaboradores, BBRC 187, 1.579 (1992)), que contiene una tirosina-quinasa en el resto citoplásmico. Ambos receptores son encontrados casi exclusivamente en células endoteliales (Senger y colaboradores, Cáncer Metast . Rev. 12, 303 (1993)). Otras tirosina-quinasas de receptores específicos para células endoteliales son tie-1 o tie-2 (Partanen y colaboradores, Mol. Cell. Biol. 12, 1.698 (1992), Schnürch y Risau, Development 119, 957 (1993) , Dumont y colaboradores, Oncogene 7, 1.471 (1992)), y el receptor B61 (receptor de Eck) , (Bartley y colaboradores, Nature 368, 558 (1994), Pandey y colaboradores, Science 268, 567 (1995), van der Geer y colaboradores, Ann. Rev. Cell. Biol. 10, 251 (1994)). Otras proteínas específicas de células endoteliales son la molécula B61, que representa al ligando para el receptor de B61 (Holz an y colaboradores, J. Am. Soc. Nephrol. 4, 466 (1993), Bartley y colaboradores, Nature 368, 558 (1994)), endotelina, en particular endotelina B (O'Reilly y colaboradores, J. Cardiovasc. Pharm. 22, 18 (1993), Benatti y colaboradores, J. Clin. Invest. 91, 1.149 (1993), O'Reilly y colaboradores, BBRC 193, 834 (1993)), cuya secuencia de promotor ha sido descrita por Benatti y colaboradores, J. Clin. Invest. 91, 1.149 (1993), endotelina 1 (Yanasiga a y colaboradores, Nature 332, 411 (1988)), cuya secuencia de promotor ha sido descrita por Wilson y colaboradores, Mol. Cell. Biol. 10, 4.654 (1990), receptores de endotelina, en particular el receptor de endotelina B (Webb y colaboradores, Mol. Pharmacol. 47, 730 (1995)), Haendler y colaboradores, J. Cardiovasc . Pharm. 20, 1 (1992)), receptores de manosa-6-fosfato (Perales y colaboradores, Eur. J. Biochem. 226, 225 (1994) ) , cuyas secuencias de promotores han sido descritas por Ludwig y colaboradores (Gene 142, 311 (1994), Oshima y colaboradores (J. Biol. Chem. 263, 2.553 (1988) y Pohlmann y colaboradores (PNAS USA 84, 5.575 (1987) y el factor de von Willebrand (vWF) , cuya secuencia de promotor ha sido descrita por Jahroudi y Lynch (Mol. Cell. Biol. 14, 999 (1994)), Ferreira y colaboradores (Biochem. J. 293, 641 (1993)) y Aird y colaboradores (PNAS USA 92, 4.567 (1995)). Otras proteínas específicas para células endoteliales son IL-1 en la forma, por ejemplo, de IL-la e IL-lß, que son producidas por células endoteliales activadas (Warner y colaboradores, J. Im unol . 139, 1.911 (1987)) y cuyas secuencias de promotores han sido descritas por Hangen y colaboradores, Mol. Carcinog. 2, 68 (1986), Turner y colaboradores, J. Immunol . 143, 3.556 (1989), Fenton y colaboradores, J. Im unol . 138, 3.972 (1987), Bensi y colaboradores, Cell Growth Diff. 1, 491, (1990), Hiscott y colaboradores, Mol. Cell. Biol. 13, 6.231 (1993) y Morí y colaboradores, Blood 84, 1.688 (1994), el receptor de IL-1, cuya secuencia de promotor ha sido descrita por Ye y colaboradores, PNAS USA 90, 2.295 (1993), y la molécula de adhesión a células vasculares (VCAM-1) , siendo activada por lipopolisacáridos la expresión de VCAM-1 en células endoteliales, TNF-a (Neish y colaboradores, Mol. Cell. Biol. 15, 2.558 (1995)), IL-4 (Iademarco y colaboradores, J. Clin'. Invest. 95, 264 (1995)) e IL-5 (Marni y colaboradores, J. Clin. Invest. 92, 1.866 (1993)). La secuencia de promotor de VCAM-l ha sido descrita por Neish y colaboradores, Mol. Cell. Biol. 15, 2.558 (1995), Ahmad y colaboradores, J. Biol. Chem. 270, 8.976 (1995), Neish y colaboradores, J. Exp. Med. 176, 1.583 (1992), Iademarco y colaboradores, J. Biol. Chem. 267, 16.323 (1992), y Cybulsky y colaboradores, PNAS USA 88, 7.859 (1991) . Otros promotores específicos para células endoteliales son secuencias de activadores sintéticos, puesto que las secuencias de activadores sintéticos, que se componen de sitios de fijación oligomerizados para factores de transcripción que son activos preferente o selectivamente en células endoteliales, por ejemplo el factor de transcripción GATA-2, cuyo sitio de fijación en el gen de endotelina-1 es 5'-TTATCT-31 (Lee y colaboradores, Biol. Chem. 266, 16.188 (1991), Dorfmann y colaboradores, J. Biol. Chem. 267, 1.279 (1992) y Wilson y colaboradores, Mol. Cell. Biol. 10, 4.854 (1990)), se pueden utilizar también como una alternativa a promotores específicos para el endotelio natural, y el transportador de glucosa- 1 endotelial, específico para el cerebro, puesto que las células endoteliales cerebrales expresan característicamente este transportador muy intensa-mente con el fin de efectuar el transporte transendotelial de D-glucosa al interior del cerebro (Gerhart y colaboradores, J. Neurosci. Res. 22, 464 (1989)) . La secuencia de promotor ha sido descrita por Murakami y colaboradores (J. Biol. Chem. 267, 9.300 (1992)). Aunque son bastante específicos para células endoteliales, algunos de estos promotores, por ejemplo el promotor para el gen para el factor de von Willebrand o para el gen del receptor 1 de VEGF (flk-1) son, sin embargo, sólo de actividad relativamente baja. Aunque la actividad de tales promotores "débiles" se puede aumentar combinándolos con un promotor basal (p.ej. SV40) o un intensificador, esto conduce entonces usualmente a una disminución concomitante en la especificidad. Por lo tanto, el objeto del presente invento fue el de descubrir un promotor que a la vez fuese fuerte y específico para el endotelio. Sorprendentemente, se ha descubierto ahora que el promotor del gen de endoglina posee estas propiedades, entre otras . Por lo tanto, el invento se refiere al promotor del gen de endoglina humana, o a restos funcionales y sus variantes. Se ha descubierto que este promotor se extiende a lo largo de un máximo de 2.415 pares de bases (véase Tabla 1, SEQ ID NO: 1) y preferiblemente abarca la secuencia de nucleótidos 1-2.378, inclusive la secuencia de iniciación. Con el fin de caracterizar al promotor de acuerdo con el invento, la secuencia de promotor del gen de endoglina, o partes de ella, se enlazó/enlazaron a un gen reportero (p.ej. el gen que codifica la enzima luciferasa) en el plásmido pGL3 (Promega) , y células endoteliales (línea celular ?CV-304) y, por comparación, células de carcinoma cervical (línea celular HeLa) fueron transfectadas con este ente artificial. Sorprendentemente, se descubrió que el promotor de endoglina es aproximadamente 80 veces tan fuerte como el promotor de vWF. Esto resulta tan sorprendente puesto que el vWF es expresado, tal como antes se menciona, de una manera específica para el endotelio y consiguientemente se hubiera esperado que la fuerza del promotor de endoglina sería similar a la del promotor de vWF. Se descubrió también que el promotor de endoglina es aproximadamente 30 veces más activo en células endoteliales que en células de carcinoma cervical. Esto es sorprendente, puesto que el promotor de vWF, que similarmente es específico para el endotelio, tiene una fuerza similar en células de carcinoma cervical y en células endoteliales. Consiguientemente, el promotor del gen de vWF es distinguiblemente sobrepasado por el promotor de endoglina de acuerdo con el invento, tanto con respecto a la fuerza como con respecto a la especificidad para el endotelio. Se descubrió además que ciertas partes de la secuencia de promotor de acuerdo con el invento presentan también una intensa actividad específica para células endoteliales. Por lo tanto, las siguientes actividades relativas, basadas en la actividad del promotor de SV40 como un patrón, se obtuvieron, en células endoteliales, para los entes artificiales terminalmente suprimidos en 5 ' del promotor de gen de endoglina, que se enumeran seguidamente: Secuencia de nucleótidos Actividad relativa Promotor de SV40 Promotor de endoglina (Tabla 1, SEQ ID NO: 1) 1-2.415 11,5 Secuencias parciales : 36-2.415 10,2 470-2.415 13,0 948-2.415 10,0 1.310-2.415 2,0 1.847-2.415 3,3 2.339-2.415 0,2 Se entiende por lo tanto que la expresión "restos funcionales del promotor" significa todas las secuencias parciales del promotor de acuerdo con el invento, que poseen actividad de promotor, en particular las secuencias parciales desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 2.378, desde aproximadamente 36 hasta aproximadamente 2.378, desde aproximadamente 470 hasta aproximadamente 2.378 y desde aproximadamente 948 hasta aproximadamente 2.378, y también las secuencias parciales desde aproximadamente 36 hasta aproximadamente 2.415, desde aproximadamente 470 hasta aproximadamente 2.415 y desde aproximadamente 948 hasta aproximadamente 2.415, preferiblemente las secuencias parciales desde aproximadamente 470 hasta aproximadamente 2.415 y desde aproximadamente 470 hasta aproximadamente 2.378. Las secuencias parciales que poseen actividad de promotor se extienden también, por ejemplo, desde aproximada-mente 1.310 hasta aproximadamente 2.415 y desde aproximadamente 1.310 hasta aproximadamente 2.378 y desde aproximadamente 1.847 hasta aproximadamente 2.415 y desde aproximadamente 1.847 hasta aproximadamente 2.378. Sin embargo, el presente invento no está restringido al promotor que se describe en SEQ ID NO: 1, y a sus restos funcionales, sino que también comprende variantes que poseen actividad de promotor. Las variantes de esta naturaleza comprenden, por ejemplo, supresiones, adiciones, inserciones y/o sustituciones de una o más bases, con preferencia de desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 50, en particular de desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 25, en especial de desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 5 bases. La actividad de promotor se puede medir con facilidad, por ejemplo utilizando el análisis de luciferasa que se describe. El presente invento se refiere además a un ente artificial de ácido nucleico, que comprende a) por lo menos una secuencia de ácido nucleico del promotor de acuerdo con el invento (componente a) ) y, cuando sea apropiado, b) al menos un gen efector (componente b) ) , siendo activada por el componente a) la transcripción de este gen efector. El componente a) está situado preferiblemente aguas arriba del componente b) . El invento se refiere además a un ente artificial de ácido nucleico en el que la secuencia de promotor del gen de endoglina de acuerdo con el invento está combinada con otra secuencia de promotor específica para células diana, específica para virus, específica metabólicamente o específica para ciclos celulares, y con al menos un gen efector, y en el que esta combinación de secuencias de promotores controla la activación de la transcripción de al menos un gen efector. El ente artificial de ácido nucleico de acuerdo con el invento se compone preferiblemente de ADN. La expresión "ente artificial de ácido nucleico" se entiende como que significa estructuras artificiales que se componen de un ácido nucleico y que se pueden transcribir en las células dianas. Éstos se introducen preferiblemente en un vector, por ejemplo en vectores no víricos, tales como plásmidos, o vectores víricos. Una persona experimentada está familiarizada con la preparación de vectores no víricos y de vectores víricos.

El presente invento se refiere también a células que albergan un ente artificial de ácido nucleico de acuerdo con el invento. En general, la elección del gen efector depende de la enfermedad que haya de ser tratada con el ente artificial de gen . E]emplos de estos genes efectores para la terapia de enfermedades tumorales, leucemias, enfermedades autoinmunes, alergias, artritis, inflamaciones, rechazos de órganos, reacciones de injerto frente a hospedante, enfermedades del sistema de coagulación de la sangre, enfermedades cardiovasculares, anemias, infecciones y daños para el sistema nervioso central (SNC) , se describen con detalle en las Solicitudes de Patente WO 96/06940, WO 96/06938, WO 96/06941 y WO 96/06939. Por ejemplo, los genes efectores conformes al presente invento codifican una citoquina, una quimioquina, un factor de crecimiento, un receptor para una citoquina, un receptor para una quimioquina o un receptor para un factor de crecimiento, y además, un antagonista de citoquina, una proteína que induce citostasis, citotoxicidad o apoptosis, un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo, un inhibidor de la angiogénesis, un factor de coagulación, un inhibidor de la coagulación, una proteína fibrinolítica, una enzima que disocia un precursor de un fármaco, formando con ello un fármaco, una proteína que ejerce un efecto sobre la circulación sanguínea, o un antígeno de un agente patógeno infeccio-so que evoca una reacción inmune. El ente artificial de ácido nucleico de acuerdo con el invento puede comprender adicionalmente dos o más genes efectores idénticos o diferentes que están enlazados uno con otro por la vía de secuencias de promotores o sitios de entrada ribosomales internos (IRES) . Ejemplos de éstos se dan en las solicitudes de patente que antes se mencionan. El ente artificial de ácido nucleico de acuerdo con el invento se puede utilizar, por ejemplo, para expresar un gen sólo específicamente para células endoteliales o específicamente para células endoteliales y de una manera metabólicamente específica, específicamente para células endoteliales y específicamente para ciclos celulares y/o específicamente para células endoteliales y específicamente para virus, siendo el gen preferiblemente un gen que codifica un compuesto farmacológicamente activo o bien una enzima que disocia a un precursor inactivo de un fármaco, formando con ello un fármaco activo. Se da preferencia a utilizar el ente artificial de ácido nucleico de acuerdo con el invento para preparar un fármaco destinado a tratar las enfermedades antes mencionadas, comprendiendo la preparación del producto farmacéutico por lo general la clonación del ente artificial de ácido nucleico en el seno de un vector apropiado, que luego, por ejemplo, es administrado al paciente. Una persona experta está familiarizada con otras aplicaciones del promotor de acuerdo con el invento o del ente artificial de ácido nucleico de acuerdo con el invento. El siguiente Ejemplo, conjuntamente con la Tabla y las Figuras, está destinado a describir el invento con mayor detalle sin limitarlo.

Descripción de la Tabla y las Figuras: Tabla 1: Secuencia del promotor de endoglina humana . El par de bases 1 corresponde a la región de la secuencia que está situada más alejada en 5 ' . Una secuencia Alu muy conservada está situada en la región de los. pares de bases 1.360-1.666, mientras que la homología con el ADNc de M. musculus documentado comienza en la región 3' en el par de bases 2.300 y la parte documentada del ADNc de H. sapiens (región no traducida en 5') comienza en el par de bases 2.379. Figura 1: Clonación del promotor de endoglina humana. A: un factor del promotor de endoglina humana que se había preparado mediante reacción en cadena de polimerasa (PCR) fue ligado en el sitio de clonación TA del vector pCR 2.1 (Invitrogen) . B : un fragmento que contenía el promotor de endoglina humana fue escindido desde el ente artificial pCR 2.1 Endo con las enzimas Mlul y Xhol y clonado en el vector reportero de luciferasa pGL3 (Promega) . Figura 2: Actividad de luciferasa de diferentes promotores específicos para células endoteliales. Todos los promotores son clonados en el seno de pGL3 y todos los valores son normalizados con respecto al promotor basal de SV40. SV40: promotor basal de SV40 sin intensificador. PGL3Endo: promotor de endoglina (véase la Figura IB) . vWF + intensificador de SV40: el promotor del factor de von Willebrand intensificado con un intensificador de SV40 aguas arriba, flk-1: el promotor para el receptor de VEGF flk-1 (-224/ATG de partida) . vWF : el promotor del factor de von Willebrand (-487/+247) sin intensificadores adicionales. Figura 3: Actividad de luciferasa del promotor de endoglina humana en células endoteliales y células no endoteliales. Los entes artificiales son los mismos que en la Figura 2. Normalizada con respecto al promotor basal de SV40, la actividad del promotor de endoglina en la línea de células endoteliales ECV304 fue comparada con su actividad en la línea de células de carcinoma cervical HeLa. En este análisis, la actividad en células ECV304 es aproximadamente 29 veces mayor que en células HeLa. Figura 4: Sitios de fijación putativos para factores de transcripción en el promotor de endoglina. Solamente se muestra la región entre la secuencia Alu y el comienzo del ADNc. Todos los sitios de fijación están situados en la cadena más (+) .

E emplo El estuche PromoterFinder® DNA Walking kit (Clontech) se utilizó para clonar el promotor. Utilizando este estuche, se amplificó un fragmento de aproximadamente 2,4 kilo-pares de bases situado en 5 ' de la secuencia documentada, en dos tandas de PCR, desde la región no traducida en 5' del ADNc de endoglina humana con la ayuda de los dos cebadores específicos para el gen.

E1: GCTGGGCTGGAGTTGCTGTCCGAAGGATG (SEQ ID NO.: 2) E2: AATGGATGGCAGTGACAGCAGCAGTCCTG (SEQ ID NO.: 3) Las condiciones de PCR para esto fueron las siguientes : 1. PCR: Cebador El, 25 s a 94°C, 25 s x 94°C, 20 s a 63°C, 4 min a 68°C, 39 ciclos, 4 min a 68°C 2. PCR (anidado): Cebador E2 , 25 s a 94°C, 25 s a 94°C, 20 s a 61°C, 4 min a 68°C, 26 ciclos, 4 min a 68°C Polimerasa: Sistema de PCR Expand® Long Témplate (Boehringer Mannheim) El fragmento de PCR se purificó a través de columnas de centrifugación QIAquick® (Qiagen) y se insertó en un vector de clonación TA (estuche Original TA Cloning® kit (Invitrogen)). Este ente artificial, pCR 2.1. Endo (véase la Figura la) fue secuenciado y la región clonada fue identifi-cada como una región en 5 ' de 2.415 pares de bases del gen de endoglina humana (acerca de la secuencia, véase la Tabla 1) .

La región clonada procedente de este vector fue clonada en un vector reportero de luciferasa, a saber pGL3 (Promega) , y se ensayó en cuanto a su actividad de promotor, como el ente artificial pGL3Endo (véase la Figura Ib) en células HeLa y ECV304. Las células fueron transfectadas o bien por el método de DEAE/dextrano (adaptado a partir del de Sompayrac y colaboradores, PNAS 78, 7.575 (1981)) o utilizando Lipofect-AMINE'* (Gibco BRL) . Al igual que el ente artificial pGLeEndo, el promotor basal de SV40 fue transfectado como un patrón; el promotor de flk-1- (VEGF) (-225/ATG de partida) y también el promotor del factor de von Willebrand (vWF) (-487/+247) con o sin el mtensificador de SV40, también fueron transfectados. Este último ente artificial del promotor de vWF que contiene un intensificador de SV40 es distinguible en el hecho de que su actividad es marcadamente mayor que la del promotor de tipo salvaje, mientras que no se suprime su selectividad, si bien queda reducida. Todos los entes artificiales fueron clonados en el seno de pGL3 , y el análisis de luciferasa se realizó tal como se describe en los artículos de Herber y colaboradores (Oncogene 9, 1.295 (1994)) y Lucibello y colaboradores (EMBO J. 14, 132 (1995)). La actividad de luciferasa que presentan los diferentes promotores en células ECV304 (Figura 2) demuestra que el fragmento clonado de la región en 5' del gen de endoglina posee una actividad de promotor. Esta actividad es muy alta si se la compara con la de los otros promotores típicos específicos para células endoteliales. Es cuatro veces mayor que la del promotor flk-1 y más de ocho veces mayor que la del promotor de vWF. La actividad del ente artificial de pGL3Endo es mayor incluso cuando el promotor de vWF es intensificado con una secuencia intensificadora de SV40. Estos datos confirman que la región clonada es el promotor de gen de endoglina humana. La Figura 3 muestra una comparación de la actividad del promotor de endoglina en células ECV304 con la existente en la línea de células de carcinoma cervical HeLa. Cuando se normaliza con respecto al promotor basal de SV40, la actividad existente en células ECV304 es aproximadamente 29 veces mayor que en células HeLa. Esto indica que el promotor clonado no solamente es activo en células endoteliales sino que también es selectivo para estas células. La Figura 4 describe sitios de fijación putativos para factores de transcripción en el promotor de endoglina. Algunos sitios de fijación potencial homólogos en gran manera, que podrían ser responsables de la selectividad y actividad del promotor y que incluyen varios sitios de fijación a NF-KB conservados, están situados en la región comprendida entre una secuencia Alu conservada y el ADNc documentado.

Tabla 1 : (SEQ ID NO: 1) 1 CGGGGGTTCC TCCTCTGTAA AGTGGAGGTA 31 TAACGGTACC CACCTCCTGG GGTGGCTGTG 61 AGGATTCAGA GCTGATAAGG TGAACGCCTA 91 GGGCGGGCCC TGGTGCAGAG AGAGCGCTCA 121 GCTCCTAGGG CTGGATTAAC TGTCCCTGGG 151 GCACAGATCT CGGTCTGGGG CCTGTGGAAA 181 CCTCAGAGCC ACCCCTGAAC CCCCACCGAG 211 CCACCCTTTG CCTCGCAGTG CCCATGGCCT 241 CGTCTCCGAG GTTACAGGAA AAGGCAGAGG 271 AGATGCCCTT CTCAGGGTGG CCCTCTGGGA 301 GAGGACACTC TCCCTTGACC TCAAAGCCAC 331 GCTTGGCTGC AAACTGGCCA GGCAGCCACA 361 AGGCTGGGCA AGCAGAACGA TCCCTAATCC 391 CCACCCAAAG AGCCACACCG ACCCTCCCAG 421 CCGCTGTGAC AGCTCCTGCA GAGACAAACA 451 CACGGCCTAC TCTTGTCACC CGGGCCGGCC 481 AATAAGCACG GAGAGGCAAG GCCTCAGACC 51 1 CTGGACAGAC ATCCTCCCTC CAGAGGCACC 541 AGGGCCTCAG CCTTCTCCTC CCTCCCTGGG 571 CCTCAATTTC TCCACCTGTG ACCCAGGGCA 601 GGTGGATCCA GGGAGAAGAA CCTTCTGGCT 631 CCATCTCACC ATGGGTCCTG GCAGCACACA 661 CAAAGATTTG GCCTCTCAAA GCCTAGCTCT 691 GCCAGCGTCC TTCTGCTCAA GAACTCTCCA 721 TGACTCCCAG TGGCCCTAAG GACAAAGTCC 751 TGGCATTTGA GGCCCTCCCA ATGCAGGGCC 781 AGACTCTGCC TCTCCAGCTT CCTGTCCCCA 811 CCACACCCCT GCTGGTCTCA CGGTGGTCCG 841 ACTGTTTCCT GCTTCTGTGC CTTTGCTTAG 871 TCTGGCACCC CTGCCTGGCA TGCTTTCCTC 901 ACCCCTTCTT CTCCCCAATC CCAACTCACC 931 CAGTCTTTCA AAGGGCAGGC CTAAATACCA 961 GGCCCTCCAG GTGGCCCAGG ATTCCTTCTC 991 TGAGCTTTCA TGGGCCTGGC CCTGGGTGCT 1021 ACCTGTGAGT AGTCCCACGG TGGGTACATA 1051 GTAGGTGCGC TTACTGTTCG CAGAATGAAC 1081 ATGGGACAGT TTGGGGACTG TCACCCAGCT 11 11 CAGGGAGCAC TGATGGGGAA GCATCTCCTG 1141 TATGTCCCAG GGCTCAGTGC TGTAGTGTCC 1171 TGACCCTCAG AAATCTCATA ATGGCTTGGT 1201 CAGGAAGGCA TCGTGCCCCA CTTTGCAAAC 1231 AGGGGGTGCT GAGAATTGAG GGGCCTTGTC 1261 CAAGGTCTCA TGGCTAGGAG CAAGCAGAAT 1291 CGGATTTGAA CCCAGGGCCA CGTGACTTCA 1321 GAAGTGCCAT TAAAGTCCCC ATAATTCGGA 1351 GCTGTCTTCT I I I I I I I I I I CTTTCT I N I 1381 TTTGAGACCG AGCCTCACTC TGTCACCTAG 1411 GCCAGGAGTG CAGTGGTCTG ATCTCAGCTC 1441 ACTGCAACCT CCGCCTCCTA GGTTCAAGTG 1471 ATTCTCTAGC CTCAGCCTCC CAAGTAGCTG 1501 GGACTACAGG CGCACGTCAT CATGCCCAGC 1531 TAACTTTTGT A l I I I I AGTA GAGATGGGTT 1561 TTCACCATGT TGGTCAGGCT GGTCTCGAAC 1591 TCCTGACCTC AAGTGATCCG TCTGCCTCGG 1621 CCTCTCAAAG TGCTGGGATT ATAGGCTTGA 1651 GCCACTACAC TCGGCCTGGA GCTGTGTTTT 1681 GTCGGTGAAG GATTTTCCAC CCATGAAGGG 1711 GTCAGACGTG AAGCGTGTGG CCCTGGGCAG 1741 CTCCTCTGAG CCCAGAGACG CCAGCCCTAG 1771 CCGCCTTGCT GTGCCACTTT GGGACTTCCC 1801 TCCCTAGCCT GAGCTTCAGT TTTCCTGCCT 1831 GTTAGGCAGC CCCATGTCAA CTGCACTTAG 1861 TAGGCCGGGT TTGATGCCCG ACAAGACGTG 1891 AAGTGGTGGA GGTGGGCAGG ATCCCAGCGC 1921 TACCATCTTC TTGAACCAGT GATCTCAACA 1951 CATCGGATTT CTGTTTCCTC ATCTGCAAAA 1981 TGGGATCAGT GAGCTCAGGT GGGTCACAAA 2011 TTCTACAGGA ACTACTTTAG CCAAGCCCGG 2041 CCCCCTGAAA GTTCCCCTCG GTGGGCAGTT 2071 AGGGTGATTG TTTTCATCTG TGGGGCTCCC 2101 TGATGCGTCC CACCCACCAG CCTTGGAGAG 2131 GGTGGGATGG GAGGGTGGGG TGCTTGGGGA 2161 GACAAGCCTA GAGCCTGGGC CCTCCCACCC 2191 CACTGCCTCC CCCCATCCCA GGGCCCCCCA 2221 CCCAGTGACA AAGCCCGTGG CACTTCCTCT 2251 ACCCGGTTGG CAGGCGGCCT GGCCCAGCCC 2281 CTTCTCTAAG GAAGCGCATT TCCTGCCTCC 2311 CTGGGCCGGC CGGGCTGGAT GAGCCGGGAG 2341 CTCCCTGCTG CCGGTCATAC CACAGCCTTC 2371 ATCTGCGCCC TGGGGCCAGG ACTGCTGCTG 2401 TCACTGCCAT CCATT

Claims (13)

REIVINDICACIONES

1.- Un promotor del gen de endoglina humana, que comprende la secuencia descrita en la Tabla 1 o restos funcionales y sus variantes. 2.- El promotor según la reivindicación 1, en el que los restos funcionales comprenden las secuencias desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 2.378, desde aproximadamente 36 hasta aproximadamente 2.378, desde aproximadamente 470 hasta aproximadamente 2.378, desde aproximadamente 948 hasta aproximadamente 2.378, desde aproximadamente 1.310 hasta aproximadamente 2.378, desde aproximadamente 1.857 hasta aproximadamente 2.378, desde aproximadamente 36 hasta aproximadamente 2.415, desde aproximadamente 470 hasta aproximadamente 2.415, desde aproximadamente 948 hasta aproximadamente 2.415, desde aproximadamente 1.310 hasta aproximadamente 2.415, o desde aproximadamente 1.847 hasta aproximadamente

2.415.

3. - Un ente artificial de ácido nucleico, que comprende por lo menos una secuencia de promotor del gen de endoglina humana según la reivindicación 1 ó 2.

4. - Un ente artificial de ácido nucleico según la reivindicación 3, que comprende adicionalmente un gen efector, activando la secuencia de promotor del gen de endoglina humana (componente a) ) la transcripción del gen efector (componente b) ) .

5.- Un ente artificial de ácido nucleico según la reivindicación 4, en el que la secuencia de promotor de endoglina humana está dispuesta aguas arriba del gen efector.

6.- Un ente artificial de ácido nucleico según una de las reivindicaciones 3 a 5, en el que la secuencia de promotor de endoglina humana está combinada con al menos una secuencia de activación adicional, seleccionándose esta secuencia de activación adicional entre el grupo que comprende una secuencia de activación específica para virus, específica metabólicamente, específica para células o específica para ciclos celulares.

7.- Un ente artificial de ácido nucleico según una de las reivindicaciones 3 a 6, en el que el ácido nucleico es ADN.

8. - Un ente artificial de ácido nucleico según una de las reivindicaciones 3 a 7, que es insertado en un vector.

9.- Un ente artificial de ácido nucleico según la reivindicación 8, en el que el vector es un vector de plásmido o un vector vírico.

10.- Un ente artificial de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 9, en el que el gen efector es un gen que codifica un compuesto activo que se selecciona entre el grupo que consta de citoquinas, quimio-quinas, factores de crecimiento, receptores para citoquinas, receptores para quimioquinas, receptores para factores de crecimiento y también antagonistas de citoquinas, proteínas que tienen un efecto antiproliferativo, citostático o apoptótico, anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, inhibidores de la angiogénesis, factores de coagulación, inhibidores de la coagulación, proteínas fibrinolíticas, una enzima que disocia a un precursor de un fármaco, formando con ello un fármaco, una proteína que tiene un efecto sobre la circulación sanguínea, o un antígeno o un patógeno infeccioso que evoca una reacción inmune.

11.- Un ente artificial de ácido nucleico según una de las reivindicaciones 3 a 10, que comprende varios genes efectores que están enlazados unos con otros mediante secuencias de promotores o sitios de entrada ribosomales internos (IRES) .

12.- Una célula que alberga un ante artificial de ácido nucleico según una de las reivindicaciones 3 a 11.

13.- El uso de un ente artificial de ácido nucleico según una de las reivindicaciones 3 a 10, o de una célula según la reivindicación 12, para preparar un fármaco destinado a tratar una enfermedad que se selecciona entre el grupo que consta de enfermedades tumorales, leucemias, enfermedades autoínmunes, alergias, artritis, inflamaciones, rechazos de órganos, reacciones de injerto frente a hospedante, enfermedades de coagulación sanguínea, enfermedades cardiovasculares, anemia, infecciones o daño para el sistema nervioso central (SNC) .