MXPA00008085A - Proteinas humanas que tienen dominios de transmembrana y adns que codifican para estas proteinas - Google Patents

Abstract

La invención provee ADNcs que codifican para proteínas humanas que poseen dominios de transmembrana, asícomo también células eucarióticas que expresan dichos ADNcs. Los ADNcs pueden ser utilizados como sondas para la diagnosis de genes y fuentes de genes para la terapia de genes- además, los ADNcs pueden ser utilizados para la expresión a gran escala de dichas proteínas. Células en donde estos genes de proteínas de membrana son introducidos y las proteínas de membrana son expresadas en grandes cantidades, pueden ser utilizadas para la detección de los correspondientes ligandos, tamizaje de nuevos productos farmacéuticos de bajo peso molecular, y similares.

Description

PROTEÍNAS HUMANAS QUE TIENEN DOMINIOS DE TRANSMEMBRANA Y ADNS QUE CODIFICAN PARA ESTAS PROTEÍNAS Campo de la Invención La presente invención se relaciona con proteínas humanas que tienen dominios de transmembrana, ADNcs que codifican para estas proteínas, y vectores de expresión de dichos ADNcs, así como también células eucarioticas que expresan dichos ADNcs. Las proteínas de la presente invención pueden ser usadas como compuestos farmacéuticos o como antígenos para la preparación de anticuerpos contra dichas proteínas. Los ADNcs humanos de la presente invención pueden ser usados como sondas para la diagnosis de genes y como fuentes de genes para la terapia de genes. Además, los ADNcs pueden ser usados como fuentes de genes para la producción a gran escala de las proteínas codificadas por dichos ADNcs. Las células, en donde estos genes de proteínas de membrana son introducidos y proteínas de membrana son expresadas en grandes cantidades, pueden ser usadas para la detección de los ligandos correspondientes así como para el tamizaje de nuevos productos farmacéuticos de bajo peso molecular, y similares.

Antecedentes de la Invención Las proteínas de membrana juegan papeles importantes, como receptores de señal, canales de iones, transportadores, etc., en la membrana de transportación de material y la transmisión de información que son mediadas por la membrana celular. Sus ejemplos incluyen receptores para una variedad de citocinas, canales de iones para el ion sodio, ion potasio, ion cloro, etc., transportadores para sacáridos y aminoácidos y similares, y así sucesivamente, en donde los genes para muchos de ellos ya han sido clonados. Se ha aclarado que las anormalidades de estas proteínas de membrana están asociados con un número de enfermedades hasta ahora criptógenas. Por ejemplo, un gene de una proteína de membrana que tiene doce dominios de transmembrana fue identificado como el gene responsable de la fibrosis cística [Romens, J. M. et al., Science 245: 1059-1065 (1989)]. Además, se ha aclarado que varias proteínas de membrana actúan como receptores cuando un virus infecta las células. Por ejemplo, se ha revelado que el HIV-1 infecta las células a través de la mediación de una fusina de proteína de membrana, que tiene una proteína de membrana en la membrana de las células T, un antígeno de CD-4 y siete dominios de transmembrana [Feng, Y. Et al., Science 272: 872-877 (1996)]. Por lo tanto, se anticipa que el descubrimiento de una nueva proteína de membrana conduce a la aclaración de las causas de muchas enfermedades, de manera que ha sido deseable el aislamiento de un nuevo gene que codifique para la proteína de membrana. Hasta ahora, debido a la dificultad en la purificación, muchas de las proteínas de membrana han sido aisladas a través de un planteamiento procedente de lado de los genes. Un método general es la así denominada clonación de expresión, la cual comprende la transfección de una biblioteca de ADNc en células eucarioticas para expresar ADNcs y la posterior detección de las células que expresan la proteína de membrana objetivo en la membrana mediante una técnica inmunológica usando un anticuerpo o una técnica fisiológica en el cambio en la permeabilidad de la membrana. Sin embargo, este método es aplicable solamente a la clonación de un gene de una proteína de membrana con una función conocida. En general, las proteínas de membrana poseen dominios de transmembrana hidrofóbicos dentro de las proteínas, en donde, después de la síntesis de ellas en el ribosoma, estos dominios permanecen en la membrana de fosfolípido para ser atrapados en la membrana. En consecuencia, la evidencia del ADNc para la codificación de la proteína de membrana es proveída mediante la determinación de toda la secuencia de bases de un ADNc de longitud completa, seguida por la detección de dominios de transmembrana altamente hidrofóbicos en la secuencia de aminoácidos de la proteína codificada por dicho ADNc.

Objetivos de la Invención El objetivo de la presente invención consiste en proveer nuevas proteínas humanas que tienen dominios de transmembrana, ADNs que codifican para dichas proteínas, y vectores de expresión de dichos ADNcs, así como también células eucarioticas de transformación que son capaces^de expresar dichos ADNcs. Como resultado de estudios intensos, los presentes inventores han tenido éxito en la clonación de ADNcs que codifican para proteínas que tienen dominios de transmembrana procedentes del banco de ADNc humano de longitud completa, realizando de esta manera la presente invención. En otras palabras, la presente invención proporciona proteínas humanas que tienen dominios de transmembrana, es decir, proteínas que contienen cualquiera de las secuencias de aminoácidos representadas por las Secuencias Nos. 1 a 7. Más aún, la presente invención provee ADNs que codifican para las proteínas anteriormente mencionadas, ejemplificadas por ADNcs que contienen cualquiera de las secuencias de bases representadas por las Secuencias Nos. 8, 15, 17, 19, 21, 23, 25 y 27, así como también células eucarioticas de transformación que son capaces de expresar dichos ADNcs.

Breve Descripción de los Dibujos La Figura 1 es una ilustración del perfil de hidrofobicidad/hidrofilicidad de la proteína codificada por la clona HPO 1434. La Figura 2 es una ilustración del perfil de hidrofobicidad/hidrofilicidad de la proteína codificada por la clona HPO 1512. La Figura 3 es una ilustración del perfil de hidrofobicidad/hidrofilicidad de la proteína codificada por la clona HP02080. La Figura 4 es una ilustración del perfil de hidrofobicidad/hidrofilicidad de la proteína codificada por la clona HP02239. La Figura 5 es una ilustración del perfil de hidrofobicidad/hidrofilicidad de la proteína codificada por la clona HP02375. La Figura 6 es una ilustración del perfil de hidrofobicidad/hidrofilicidad de la proteína codificada por la clona HP 10517. La Figura 7 es una ilustración del perfil de hidrofobicidad/hidrofilicidad de la proteína codificada por la clona HP 10521.

Descripción Detallada de las Modalidades Preferidas Las proteínas de la presente invención pueden ser obtenidas, por ejemplo, mediante un método para el aislamiento a partir de órganos humanos, líneas celulares, etc., un método para la preparación de péptidos mediante la síntesis química, o un método de producción con la tecnología del ADN recombinante usando los ADNs que codifican para los dominios de transmembrana de la presente invención, en donde preferiblemente se emplea el método de obtención mediante la tecnología del ADN recombinante. Por ejemplo, la expresión in vitro de las proteínas puede lograrse mediante la preparación de un ARN mediante la transcripción in vitro desde un vector que tiene uno de los ADNcs de la presente invención, seguida por la traducción in vitro usando este ARN como un modelo. También, la recombinación de la región de traducción en un vector de expresión apropiado por el método conocido en la técnica conduce a la producción de una gran cantidad de la proteína codificada mediante el uso de células procarióticas tales como Escherichia coli, Bacillus subtili, etc. y células eucarioticas tales como levaduras, células de insecto, células de mamíferos, etc. En el caso en el que una de las proteínas de la presente invención es producida por la expresión del ADN mediante traducción in vitro, la proteína de la presente invención puede ser producida in vitro, cuando la región de traducción de dicho ADNc es sometida a recombinación a un vector que tiene un promotor de polimerasa de ARN, seguido de la adición a un sistema de traducción in vitro tal como un lisato de reticulocito de conejo o un extracto de germen de trigo, conteniendo una polimerasa de AJRN correspondiente al promotor. Los inhibidores de polimerasa de ARN son ejemplificados por T7, T3, SP6 y similares. Los vectores que contienen dichos inhibidores de polimerasa de ARN son ejemplificados por pKAl, pCDM8, ?T3/7 18, pT7/3 19, pBluescript II, y similares. Además, una proteína de membrana de la presente invención puede ser expresada como la forma incorporada en la membrana del microsoma, cuando un microsoma de páncreas de perro o similar es agregado dentro del sistema de reacción. En el caso en el que una proteína de la presente invención es producida por la expresión de un ADN en un microorganismo tal como la Escherichia coli, etc., un vector de expresión recombinante que porta la región de traducción en el ADNc de la presente invención es construido en un vector de expresión que tiene un origen, un promotor, un sitio de unión de ribosoma, un sitio de clonación de ADNc, una terminación, etc. que pueda ser replicada en el microorganismo y, después de la transformación de las células hospederas con dicho vector de expresión, el transformante así obtenido es incubado, mediante lo cual la proteína codificada por dicho ADNc puede ser producida a gran escala en el microorganismo. En ese caso, un fragmento de proteína conteniendo una región opcional puede ser obtenida realizando la expresión con la inserción de un codón de iniciación y un codón de terminación enfrente de y detrás de una región de traducción opcional. Alternativamente, una proteína de fusión con otra proteína puede ser expresada. Solamente una porción de proteína que codifica para dicho ADNc puede ser obtenida mediante la división de dicha proteína de fusión con una proteasa apropiada. Ejemplos del vector de expresión para la Escherichia coli incluyen el sistema pUC, pBluescript II, el sistema de expresión pET, el sistema de expresión pGEX, y similares. En el caso en el que una de las proteínas de la presente invención es producida mediante expresión del ADN en células eucarioticas, la proteína de la presente invención puede ser producida como una proteína de transmembrana en la superficie de la membrana celular, cuando la región de traducción de dicho ADNc es sometida a recombinación a un vector de expresión para células eucarioticas que tengan un promotor, una región de empalme, un sitio de inserción de poli(A), etc., seguida de la introducción dentro de las células eucarioticas. El vector de expresión es ejemplificado por pKAl, pCDM8, pSVK3, pMSG, pSVL, pBK-CMV, pBK-RSV, vector EBV, pRS, pYES2, etc. Ejemplos de las células eucarioticas que pueden ser utilizadas, en general, incluyen células de cultivos de mamíferos, tales como células de riñon de mono COS77 células de ovario de hámster Chino CHO, etc., levaduras de gemación, levaduras de escisión, levaduras de gusano de seda, células de huevecillo de Xenopus laevis, etc. Sin embargo, pueden emplearse cualesquiera células eucarioticas, siempre y cuando dichas células sean capaces de expresar las presentes proteínas sobre la superficie de la membrana. El vector de expresión puede ser introducido dentro de las células eucarioticas por métodos que se conocen en el estado de la técnica, tales como el método de la electroforesia, el método del fosfato de potasio, el método de la liposoma, o el método del DEAE-dextrano, etc. Después de que una de las proteínas de la presente invención es expresada en células procarióticas o eucarioticas, la proteína objetivo puede ser aislada del medio de cultivo y purificada mediante una combinación de procesos de separación conocidos en la técnica. Tales ejemplos incluyen el tratamiento con un agente desnaturalizador tal como urea, o un agente tensoactivo, tratamiento ultrasónico, digestión enzimática, salazón o precipitación con solvente, diálisis, centrifugación, ultrafiltración, filtración en gel, SDS-PAGE, enfoque de punto isoeléctrico, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía hidrofóbica, cromatografía de afinidad, cromatografía de fase inversa, etc. Las proteínas de la presente invención incluyen fragmentos de péptido (residuos de más de 5 aminoácidos) que contienen cualquier secuencia parcial de aminoácidos en las secuencias de aminoácidos que son representadas por las Secuencias Nos. 1 a 7. Estos fragmentos de péptido pueden ser empleados como antígenos para la preparación de los anticuefos. Por consiguiente, entre las proteínas de la presente invención, aquellas que tienen la secuencia señal son secretadas en la forma de proteínas de maduración sobre la superficie de las células, después de que las secuencias señal son eliminadas. Por lo tanto, estas proteínas de maduración caerán dentro del alcance de la presente invención. Las secuencias de aminoácidos con terminación N de las proteínas de maduración pueden ser fácilmente identificadas empleando el método para la determinación del sitio de división en una secuencia señal [Publicación Kokai de Patente Japonesa No. 1996-187100]. Además, algunas proteínas de membrana son sometidas al procesamiento sobre la superficie celular para ser convertidas a las formas secretoras. Estos péptidos o proteínas en las formas secretoras también caerán dentro del alcance de la presente invención. Cuando los sitios de unión a la cadena de azúcar están presentes en las secuencias de aminoácidos, la expresión en células eucarioticas apropiadas proporcionará proteínas en donde las cadenas de azúcar están agregadas. En consecuencia, tales proteínas o péptidos en donde las cadenas azúcar están agregadas, de igual manera, caerán dentro del alcance de la presente invención. Los ADNs de la presente invención incluyen todos los ADNs que codifican para las proteínas anteriormente mencionadas. Dichos ADNs pueden ser obtenidos usando el método de síntesis química, un método de clonación de ADN y similares. Los ADNcs de la presente invención pueden ser clonados, por ejemplo, a partir de bibliotecas de ADNc de origen de células humanas. Estos ADNcs son sintetizados usando como modelos ARNs poli(A)+ extraídos de células humanas. Las células humanas pueden ser células liberadas del cuefo humano, por ejemplo, mediante operación o pueden ser células que han sido cultivadas. Los ADNcs pueden ser sintetizados usando cualquier método seleccionado del método de Okayama-Berg [Okayama, H. and Berg, P. Mol. Cell. Biol. 2: 161-170 (1982)], el método de Gubler-Hoffman [Gubler, U. and Hoffman, J. Gene 25: 263-269 (1983)] y métodos similares, pero se prefiere emplear el método capping [Kato, S. et al., Gene 150: 243-250 (1994)] como se ilustra en los Ejemplos, con el objeto de obtener una clona de longitud completa en una forma efectiva. Además, pueden utilizarse bibliotecas de ADNc humano comercialmente disponibles. La clonación de los ADNcs de la presente invención a partir de bibliotecas de ADNc puede ser llevada a cabo mediante síntesis de un oligonucleótido sobre la base de una porción opcional en las secuencias de bases de ADNc de la presente invención, seguida por tamizaje usando este oligonucleótido como la sonda de acuerdo con la hibridación de colonia o placa po un método conocido en la técnica. Además, los fragmentos de ADNc de la presente invención pueden ser preparados mediante síntesis de un oligonucleótido que va a ser hibridado en ambas terminaciones del fragmento de ADNc objetivo, seguida por el uso de este oligonucleótido como el primario para el método de RT-PCR a partir de un ARNm que es aislado a partir de células humanas. Los ADNcs de la presente invención están caracterizados por contener cualquiera de las secuencias de bases representadas por las Secuencias Nos. 8 a 14 o las secuencias de bases representadas por las Secuencias Nos. 15, 17, 19, 21, 23, 25 y 27. La Tabla 1 resume el número de clona (número HP), las células que proporcionan el ADNc, el número de bases totales del ADNc y el número de los residuos de aminoácido de la proteína codificada, para cada uno de los ADNcs. Tabla 1 1, 8, 15 HP01434 Cáncer de estomago 761 129 2, 9, 16 HP01512 Cáncer de estomago 701 135 3, 10, 17 HP02080 Saos-2 393 79 4, 11 , 18 HP02239 Cáncer de estomago 1033 144 5, 12, 19 HP02375 PMA-U937 1270 282 6. 13. 20 HP10517 Hígado 836 100 7. 14. 21 HP10521 Hígado 1022 225 Por consiguiente, las mismas clonas como los ADNcs de la presente invención pueden ser fácilmente obtenidas mediante tamizaje de las bibliotecas de ADNc construidas a partir de las líneas celulares humanas y tejidos humanos utilizados en la presente invención mediante el uso de una sonda de oligonucleótido sintetizada sobre la base de la secuencia de bases de ADNc descrita en cualquiera de las Secuencias Nos. 8 a 15, 17, 19, 21, 23, 25 y 27. En general, el polimorfismo debido a la diferencia individual es frecuentemente observado en genes humanos. Por lo tanto, cualquier ADNc que sea sometido a inserción o deleción de uno o varios nucleótidos y/o substitución con otros nucleótidos en las Secuencias Nos. 8 a 15, 17, 19, 21, 23, 25 y 27 caerá dentro del alcance de la presente mvención.

En una forma similar, cualquier proteína que sea producida por estas modificaciones que comprenden la inserción o deleción de uno o múltiples aminoácidos y/o la substitución con otros aminoácidos caerá dentro del alcance de la presente invención, mientras dicha proteína posea la actividad de cualquier proteína que tenga las secuencias de aminoácidos representadas por las Secuencias Nos. 1 a 7. Los ADNcs de la presente invención incluyen fragmentos de ADNc (más de 10 bp) conteniendo cualquier secuencia de bases parcial en la secuencia de bases representada por las Secuencias Nos. 8 a 14 o en las secuencias de bases representadas por las Secuencias Nos. 15, 17, 19, 21, 23, 25, y 27. También, fragmentos de ADN consistentes en una cadena de sentido y una cadena de anti-sentido caerán dentro de este alcance. Estos fragmentos de ADN pueden ser usados como las sondas para la diagnosis de genes. Además de las actividades y usos descritos anteriormente, los polinucleótidos y proteínas de la presente invención pueden presentar uno o más de los usos o actividades biológicas (incluyendo aquellas asociadas con ensayos citados aquí) identificadas más adelante. Los usos o actividades descritas para las proteínas de la presente invención pueden ser proveídos mediante la administración o uso de tales proteínas o mediante la administración o uso de polinucleótidos que codifican para tales proteínas (tal como, por ejemplo, en terapias de genes o vectores apropiados para la introducción de ADN).

Usos y Utilidades en Investigación Los polinucleótidos proveídos por la presente invención pueden ser utilizados por la comunidad investigadora para varios propósitos. Los polinucleótidos pueden ser usados para expresar proteína recombinante para análisis, caracterización o uso terapéutico; como marcadores para tejidos en los que la proteína correspondiente es expresada preferencialmente (ya sea constitutivamente o en una etapa particular de diferenciación o desarrollo del tejido o en estados enfermizos); como marcadores de peso molecular en geles Southern; como marcadores o banderas de cromosomas (cuando se marcan) para identificar cromosomas o para mapeo de posiciones de genes relacionados; para comparación con secuencias de ADN endógenas en pacientes para identificar desordenes genéticos potenciales; como sondas par hibridación y así descubrir nuevas secuencias de ADN relacionadas; como una fuente de información para derivar primarios PCR para rastreo genético; como una sonda par "substraer" secuencias conocidas en el proceso de descubrimiento de nuevos polinucleótidos; para la selección y mareaje de oligómeros para unión a un "chip genético" u otro soporte, incluyendo para el examen de patrones de expresión; para generar anticuefos de anti-proteína usando técnicas de inmunización de ADN; y como un antígeno para generar anticuefos de anti- ADN o para estimular otra respuesta inmune. En donde el polinucleótido codifica para una proteína que se une o potencialmente se unirá a otra proteína (tal como, por ejemplo, en una interacción receptor-ligando), el polinucleótido también puede ser usado en ensayos de trampa por interacción (tal como, por ejemplo, aquel descrito en Guris et al., Cell 75: 791-803 (1993)) para identificar polinucleótidos que codifican la otra proteína con la cual ocurre la unión o para identificar inhibidores de la interacción de unión. Las proteínas proveídas por la presente invención pueden de manera similar ser usadas en ensayos para determinar actividad biológica, incluyendo en un panel de múltiples proteínas para tamizaje de alto rendimiento; para generar anticuefos o para producir otra respuesta inmune; como un reactivo (incluyendo el reactivo marcador) en ensayos diseñados para determinar en forma cuantitativa los niveles de la proteína (o su receptor) en fluidos biológicos; como marcadores para tejidos en los que la correspondiente proteína es preferencialmente expresada (ya sea constitutivamente o en una etapa particular de diferenciación o desarrollo de tejido o en un estado enfermizo); y, por supuesto, para aislar receptores o ligandos correlativos. En donde la proteína se une o potencialmente se une a otra proteína (tal como, por ejemplo, en una interacción receptor-ligando), la proteína puede ser usada para identificar la otra proteína con la cual ocurre la unión o para identificar inhibidores de la interacción de unión. Las proteínas involucradas en estas interacciones de unión también pueden ser utilizadas para tamizar péptidos o pequeños inhibidores de moléculas o agonistas de la interacción de unión. Cualesquiera de estas utilidades en investigación son capaces de ser desarrolladas en grado reactivo o en formato de juego (kit) para la comercialización como productos de investigación. Los métodos para realizar los usos enlistados anteriormente son bastante conocidos por aquellos capacitados en la técnica. Las referencias que describen tales métodos incluyen, sin limitación, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Sambrook, J., E.F. Fritsch and T. Maniatis eds., 1989, y "Methods in Enzymology: Guide to Molecular Cloning Techniques", Academic Press, Berger, S.L. and A.R. Kimmel eds., 1987.

Usos Nutricionales Los polinucleótidos y proteínas de la presente invención también pueden ser utilizados como fuentes o suplementos nutricionales. Tales usos incluyen, sin limitación, el uso como un suplemento de aminoácidos o proteínas, el uso como fuente de carbono, el uso como fuente de nitrógeno y el uso como una fuente de carbohidratos. En tales casos la proteína o polinucleótido de la invención puede ser agregado a la alimentación de un organismo particular o puede ser administrado como una preparación sólida o líquida separada, tal como en la forma de un polvo, pildoras, soluciones, suspensiones o cápsulas. En el caso de microorganismos, la proteína o polinucleótido de la invención puede ser agregado al medio en o sobre el cual el microorganismo es cultivado.

Actividad de Citocina y de Proliferación/Diferenciación Celular Una proteína de la presente invención puede exhibir actividad de proliferación de célula, citocina (ya sea de inducción o inhibición) o de diferenciación celular (ya sea de inducción o inhibición), o puede inducir la producción de otras citocinas en ciertas poblaciones de células. Muchos factores de proteínas descubiertos hasta la fecha, incluyendo todas las citocinas conocidas, han presentado actividad en uno o más ensayos de proliferación de células dependientes de factor, y de aquí que los ensayos sirven como una confirmación conveniente de actividad de citocina. La actividad de una proteína de la presente invención es evidenciada por uno de un número de ensayos rutinarios de proliferación de células dependientes de factor para líneas celulares que incluyen, sin limitación, 32D, DA2, DA1 G, TÍO, B9, B9/1 1, BaF3, MC9/G, M+ (preB M+), 2E8, RB5, DAI, 123, TI 165, HT2, CTLL2, TF-l, Mo7e y CMK. La actividad de una proteína de la invención puede, entre otros medios, ser medida por los siguientes métodos: Los ensayos para proliferación de timocitos o células T incluyen, sin limitación, aquellos descritos en Current Protocols in Immunology, Ed. by J.E. Coligan, A.M. Kruisbeek, D.H. Marguiles, E.M. Shevach, W. Strober, Pub. Greene Publishing Associates and Wiley Interscience (Chapter 3, In Vitro assays for Mouse Lymphocyte Function 3.1-3.19; Chapter 7, Immunologic studies in Humans); Takai et al., J. Immunol. 137:3494-3500, 1986; Bertagnolli et al., J. Immunol. 145:1706-1712, 1990; Bertagnolli et al., Cellular Immunology 133:327-341 , 1991; Bertagnolli, et al., J. Immunol. 149:3778-3783, 1992; Bowman et al., J. Immunol. 152:1756-1761, 1994. Los ensayos para determinar producción de citocina y/o proliferación de células del bazo, células del nodo linfático o timocitos incluyen, sin limitación, aquellos descritos en: Polyclonal T cell stimulation, Kruisbeek, A.M. and Shevach, E.M. In Current Protocols in Immunology. J.E.e.a. Coligan eds. Vol. 1 pp. 3.12.1-3.12.14, John Wiley and Sons, Toronto, 1994; y Measurements of mouse and human Interferon ?, Schreiber, R.D. In Current Protocols in Immunology, J.E.e.a. Coligan eds. Vol 1 pp. 6.8.1-6.8.8, John Wiley and Sons, Toronto, 1994. Los ensayos para determinar la proliferación y diferenciación de células hematopoiéticas y linfopoiéticas incluyen, sin limitación, aquellos descritos en : Measurement of Human and Murine Interleukin 2 and Interleukin 4, Bottomly, K., Davis, L.S. and Lipsky, P.E. In Current Protocols in Immunology. J.E.e.a Coligan eds. Vol 1 pp. 6.3.1-6.3.12, John Wiley and Sons, Toronto. 1991; deVries et al., J. Exp. Med. 173:1205-1211, 1991 ; Moreau et al., Nature 336:690-692, 1988; Greenberger et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 80:2931-2938, 1983; Measurement of mouse and human interleukin 6 - Nordan, R. In Current Protocols in Immunology. J.E.e.a Coligan eds. Vol 1 pp. 6.6.1-6.6.5, John Wiley and Sons, Toronto. 1991 ; Smith et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 83:1857-1861, 1986; Measurement of human Interleukin 11 - Bennett, F. Giannotti, J. Clark, S.C. and Turner, K.J. In Current Protocols in Immunology. J.E.e.a Coligan eds. Vol 1 pp. 6.15.1, John Wiley and Sons, Toroñto. 1991. Measurement of mouse and human Interleukin 9 - Ciarletta, A. Giannotti, J., Clark, S.C. and Turner, K.J. In Current Protocols in Immunology. J.E.e.a Coligan eds. Vol 1 pp. 6".13.1, John Wiley and Sons, Toronto. 1991. Los ensayos para determinar las respuestas de clonas de células T a antígenos (los cuales identificarán, entre otros, proteínas que afectan las interacciones de células APC-T así como los efectos de células T directas midiendo la proliferación y producción de citocina) incluyen, sin limitación, aquellos descritos en: Current Protocols in Immunology, Ed by J.E.e.a Coligan, A.M. Kruisbeek, D.H. Margulies, E.M. Shevach, W. Strober, Pub. Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience (Chapter 3, In Vitro assays for Mous Lymphocyte Function; Chapter 6, Cytokines and their cellular receptors; Chapter 7 Immunologic studies in Humans); Weinberger et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 77:6091 6095, 1980; Weinberger et al., Eur. J. Immun. 11:405-411, 1981; Takai et al., J. Immunol 137:3494-3500, 1986; Takai et al., J. Immunol. 140:508-512, 1988.

Actividad de Estimulación o Supresión Inmunológica . Una proteína de la presente invención puede también exhibir actividad de estimulació inmunológica o de supresión de inmunológica, incluyendo sin limitación las actividades par las cuales se han descrito aquí ensayos. Una proteína puede ser útil en el tratamiento de varia deficiencias y desórdenes inmunológicos (incluyendo la inmunodeficiencia combinada sever (SCID)), por ejemplo, en la regulación (hacia arriba o hacia abajo) del crecimiento proliferación de linfocitos T y/o B, así como efectuar la actividad citolítica de células NK otras poblaciones de células. Estas deficiencias inmunológicas pueden ser genéticas o de caus viral (por ejemplo, HIV) así como también por infecciones bacterianas o por hongos, o puede resultar de desórdenes autoinmunológicos. Más específicamente, las enfermedades infecciosa causadas por virus, bacterias, hongos u otra infección pueden ser tratadas usando una proteín de la presente invención, incluyendo infecciones por HIV, virus de hepatitis, virus de hefes micobacterias, lesmania spp, malaria spp y diversas infecciones por hongos como l candidiasis. Por supuesto, en este sentido, una proteína de la presente invención también pued ser útil en donde generalmente fuese indicado reforzar el sistema inmunológico, por ejemplo en el tratamiento del cáncer. Los desórdenes autoinmunológicos que pueden ser tratados usando una proteína de l presente invención incluyen, por ejemplo, enfermedad de tejido conectivo, esclerosis múltiple lupus eritematoso sistémico, artritis reumatoidea, inflamación pulmonar autoinmune, síndrom de Guillain-Barre, tiroiditis autoinmune, diabetes mellitus dependiente de insulina, miasteni gravis, enfermedad de injerto versus huésped y enfermedad de inflamación de ojos po autoinmunidad. Dicha proteína de la presente invención también pude ser útil en el tratamient de reacciones y condiciones alérgicas, tales como el asma (particularmente asma alérgica) otros problemas respiratorios. Otras condiciones, en las que se desea supresión inmunológic (incluyendo, por ejemplo, trasplante de órganos) también pueden ser tratadas usando una proteína de la presente invención. El uso de las proteínas de la invención también puede ser posible para respuestas inmunes, en un número de formas. La hiporegulación puede estar en la forma de inhibición o bloqueo de una respuesta inmune ya en curso, o puede involucrar la prevención de la inducción de una respuesta inmune. Las funciones de células T activadas pueden ser inhibidas mediante la supresión de respuestas de células T o induciendo la tolerancia específica en células T, o ambas. La inmunosupresión de respuestas de células T es generalmente un proceso activo, no antígeno-específico, el cual requiere de exposición continua de las células T al agente de supresión. La tolerancia, que involucra la inducción de no-respuesta o anergia en células T, es susceptible de distinción a partir de la inmunosupresión porque es generalmente específico a antígeno y persiste después de que ha terminado la exposición al agente creador de tolerancia. Operacionalmente, la tolerancia puede ser demostrada por la falta de una respuesta de célula T bajo re-exposición a un antígeno específico en la ausencia del agente creador de tolerancia. La hiporegulación o prevención de una o más funciones antígenas (incluyendo sin limitación funciones de antígeno de linfocito B (tal como, por ejemplo, B7)), por ejemplo, previniendo la síntesis de linfocina de alto nivel mediante células T activadas, será útil en situaciones de transplantes de tejido, piel y órganos y en enfermedad de injerto versus huésped (GVHD). Por ejemplo, el bloqueo de la función de células T debería resultar en la destrucción reducida de tejido en transplantes de tejido. Típicamente, en transplantes de tejido, el rechazo del transplante es iniciado a través del reconocimiento como extraño por las células T, seguido por una reacción inmune que destruye el transplante. La administración de una molécula que inhiba o bloquee la interacción de un antígeno de linfocito B7 con su(s) ligando(s) natural(es) en células inmunes (tales como una forma monomérica soluble de un péptido que tiene actividad B7-2 sola o en conjunto con una forma monomérica de un péptido que tiene una actividad de otro antígeno de linfocito B (por ejemplo, B7-1, B7-3) o anticuerpo de bloqueo), antes del transplante puede conducir a la unión de la molécula al (los) ligando(s) natural(es) en las células inmunes sin la transmisión de la correspondiente señal co-estimulante. El bloqueo de la función antígeno del linfocito B en este caso previene la síntesis de citocina por células inmunes, tales como células T, y así actúa como un inmunosupresor. Más aún, la falta de co- estimulación también puede ser suficiente para anergizar las células T, induciendo de esta forma tolerancia en un sujeto. La inducción de tolerancia de larga duración por reactivos de bloqueo de antígeno de linfocito B puede evitar la necesidad de administración repetida de estos reactivos de bloqueo. Para lograr suficiente inmunosupresión o tolerancia en un sujeto, puede también ser necesario bloquear la función de una combinación de antígenos de linfocito B. La eficacia de reactivos de bloqueo particular en la prevención de un rechazo del transplante de un órgano o GVHD puede ser evaluada usando modelos animales que sean capaces de predecir la eficacia en humanos. Ejemplos de sistemas apropiados que puedan ser usados incluyen injertos cardiacos alogeneicos en ratas e injertos de células isleta, pancreáticas xenogenéicas en ratones, ambas de las cuales han sido usadas para examinar los efectos inmunosupresores de proteínas de fusión CTLA4Ig in vivo como se describe en Lenschow et al., Science 257:789-792 (1992) y Turka et al, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 89:11 102-11105 (1992). Además, pueden usarse modelos de murino de GVHD (ver Paul de., Fundamental Immunology, Raven Press, New York, 1989, pp. 846-847 para determinar el efecto de bloqueo de la función antígeno de linfocito B in vivo en el desarrollo de esa enfermedad. El bloqueo de la función antígeno también puede ser terapéuticamente útil para el tratamiento de enfermedades autoinmunes. Muchos desórdenes autoinmunes son el resultado de la activación inapropiada de células T que son reactivas contra el mismo tejido y la cual promueve la producción de citocinas y auto-anticuerpos involucrados en la patología de las enfermedades. La prevención de la activación de células T autoreactivas puede reducir o eliminar síntomas de la enfermedad. La administración de reactivos que bloquean la coestimulación de células T rompiendo las interacciones receptopligando de los antígenos de linfocitos B, puede utilizarse para inhibir la activación de células T y prevenir la producción de autoanticuefos o citocinas derivadas de células T que pueden estar involucradas en el proceso enfermizo. Adicionalmente, los reactivos de bloqueo pueden inducir la tolerancia específica al antígeno, de células T autoreactivas que podría conducir al alivio de larga duración de la enfermedad. La eficacia de los reactivos de bloqueo en la prevención o mejoramiento de los desórdenes autoinmunes puede ser determinada usando un número de modelos de animal bien caracterizados de enfermedades autoinmunes humanas. Los ejemplos incluyen encefalitis autoinmune experimental de murino, eritematosis de lupus sistémica en ratones MRL/lpr/lpr o ratones NZB híbridos, artritis de colágeno autoinmune de murino, diabetes mellitus en ratones NOD y ratas BB, y miastenia gravis experimental de murino (ve Paul ed., Fundamental Immunology, Raven Press, New York, 1989, pp. 840-856). La sobreregulación de una función antígeno (preferiblemente una función antígeno de linfocito B), como un medio de sobre regular respuestas inmunes, también puede ser útil e terapias. Las sobreregulación de respuestas inmunes puede ser en la forma de mejorar un respuesta inmune existente o provocar una respuesta inmune inicial. Por ejemplo, el mejora una respuesta inmune a través de la estimulación de la función antígeno de linfocito B pued ser útil en casos de infección viral. Además, enfermedades virales sistémicas tales como l influenza, el resfriado común y la encefalitis podrían ser aliviadas mediante la administració sistémica de formas estimulantes de antígenos de linfocitos B. Alternativamente, las respuestas inmunes anti-virales pueden ser mejoradas en u paciente infectado mediante la remoción de células T del paciente, coestimulando las células in vitro con APCs pulsadas de antígeno viral ya sea expresando un péptido de la present invención o conjuntamente con una forma estimulante de un péptido soluble de la present invención y reintroduciendo las células T activadas in vitro dentro del paciente. Otro métod para mejorar las respuestas inmune anti-virales consistiría en aislar células infectadas de u paciente, transfectarlas con un ácido nucleico que codifica para una proteína de la present invención como se describió aquí, de manera que las células expresen toda o una parte de l proteína sobre su superficie, y reintroducir las células transfectadas dentro del paciente. La células infectadas serían ahora capaces de entregar una señal co-estimulante a, y de esta form activar, las células T in vivo. En otra aplicación, la sobreregulación o mejoramiento de la función antígen (preferiblemente función antígeno de linfocitos B) podría ser útil en la inducción d inmunidad tumoral. Las células de tumor (por ejemplo, sarcoma, melanoma, linfoma leucemia, neuroblastoma, carcinoma) transfectadas con un ácido nucleico que codifica par cuando menos un péptido de la presente invención pueden ser administradas a un sujeto par superar la tolerancia especifica al tumor en el sujeto. Si se desea, las células de tumor puede ser transfectadas para expresar una combinación de péptidos. Por ejemplo, las células d tumor obtenidas de un paciente pueden ser transfectadas ex vivo con un vector de expresió que dirige la expresión de un péptido que tiene actividad similar a B7-2, solo o e combinación con un péptido que tiene actividad similar a B7-1 y/o actividad similar a B7-3. Las células tumorales transfectadas son regresadas al paciente para que resulte en la expresión de los péptidos sobre la superficie de las células transfectadas. Alternativamente, pueden usarse técnicas de terapia de genes para señalar como objetivo una célula de tumor para transfección in vivo. La presencia del péptido de la presente invención, que tiene la actividad de un(os) antígeno(s) de linfocitos B sobre la superficie de las células de tumor provee la señal de coestimulación necesaria para que las células T induzcan una respuesta inmune mediada por células T contra las células de tumor transfectadas. Además, las células de tumor que carecen de moléculas MHC clase I o MHC clase II, o que no re-expresan suficientes cantidades de moléculas MHC clase I o MHC clase II, pueden ser transfectadas con ácido nucleico que- codifica para todo o una porción de (por ejemplo, una porción truncada de dominio citoplásmica) de una proteína de cadena a de MHC clase I y proteína de microglobulina ß2 o una proteína de cadena a de MHC clase II y una proteína de cadena ß de MHC clase II para expresar de esta forma proteínas MHC clase I o MHC clase II sobre la superficie de la célula. La expresión de la MHC clase I o clases II apropiada, en conjunto con un péptido que tiene la actividad de un antígeno de linfocito B (por ejemplo, B7-1, B7-2, B7-3) induce una respuesta inmune mediada por células T contra la célula de tumor transfectada. Opcionalmente, un gene que codifica una construcción antisentido que bloquea la expresión de una proteína asociada MHC clase II, tal como la cadena constante, también puede ser cotransfectado con un ADN que codifica para un péptido que tiene la actividad de antígeno de linfocito B para promover la presentación de antígenos asociados a tumor e inducir inmunidad específica a tumor. Así, la inducción de una respuesta inmune mediada por células T en un sujeto humano puede ser suficiente para superar tolerancia específica a tumor en el sujeto. La actividad de una proteína de la invención también puede, entre otros medios, ser medida por los siguientes métodos: Los ensayos adecuados para determinar citotoxicidad de esplenocitos o timocitos incluyen, sin limitación, aquellos descritos en Current Protocols in Immunology, Editado por J.E. Coligan, A.M. Kruisbeek, D.H. Margulies, E.M. Shevach, W. Strober, Pub. Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience (Chapter 3, In Vitro assays for Mouse Lymphocyte Function 3.1.-3.19; Chapter 7, Immunologic studies in Humans); Herrmann et al, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 78:2488-2492, 1981; Herrmann et al., J. Immúnol. 128:1968-1974, 1982; Handa et al., J. Immunol. 135-1564-1572, 1985; Takai et al., J. Immunol. 137:3494-3500, 1986; Takai et al., J. Immunol. 140:508-512. 1988; Herrmann et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 78:2488-2492, 1981 ; Herrmann et al., J. Immunol. 128:1968-1974, 1982; Handa et al., J. Immunol. 135:1564-1572, 1985; Takai et al., J. Immunol. 137:3494-3500, 1986; Bowman et al, J. Virology 61 :1992-1998; Takai et al., J. Immunol. 140:508-512, 1988; Bertagnolli et al., Cellular Immunology 133:327-341, 1991; Brown et al., J. Immunol. 153:3079-3092, 1994. Los ensayos para determinar las respuestas de inmunoglobulina dependiente de células T y~ conmutación isotipo (las cuales identificarán, entre otras, a las proteínas que modulan respuestas de anticuerpos dependientes de células T y que afectan perfiles Thl/Th2) incluyen, sin limitación, aquellos descritos en: Maliszewski, J. Immunol. 144:3028-3033, 1990; y Assays for B cell function: In vitro antibody production, Mond, J.J. and Brunswick, M. In Curren. Protocols in Immunology. J.E.e.a. Coligan eds. Vol 1 pp. 3.8.1-3.8.16, John Wiley and Sons, Toronto. 1994. Las pruebas mezcladas de reacción de linfocitos (MLR) (las cuales identificarán, entre otras, proteínas que generan predominantemente respuestas de Thl y CTL) incluyen, sin limitación, aquellas descritas en Current Protocols in Immunology, Editado por J.E. Coligan, A.M. Kruisbeek, D.H. Margulies, E.M. Shevach, W. Strober, Pub. Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience (Chapter 3, In Vitro assays for Mouse Lymphocyte Function 3.1-3.19; Chapter 7, Immunologic studies in Humans); Takai et al., J. Immunol. 137:3494-3500, 1986; Takai et al., I. Immunol. 140:508-512, 1988; Bertagnolli et al., J. Immunol. 149:3778-3783, 1992. Ensayos dependientes de células dendríticas (los cuales identificarán, entre otras, proteínas expresadas por células dendríticas que activan células T naturales) incluyen, sin limitación, aquellos descritos en: Guery et al., J. Immunol. 134:536-544, 1995; Inaba et al., Journal of Experimental Medicine 173:549-559, 1991; Macatonia et al., Journal of I munology 154:5071-5079, 1995; Porgador et al., Journal of Experimental Medicine 182:255-260, 1995; Nair et al., Journal of Virology 67:4062-4069, 1993; Huang et al., Science 264:961-965, 1994; Macatonia et al., Journal of Experimental Medicine 169:1255-1264, 1989; Bhardwaj et al., Journal of Clinical Investigation 94:797-807, 1994; e Inaba et al., Journal of Experimental Medicine 172:631-640, 1990. Las pruebas para determinar la sobrevivencia/apoptosis de linfocitos (las cuales identificarán, entre otras, las proteínas que previenen la apoptosis después de la inducción superantígena y las proteínas que regulan la homeóstasis de linfocitos) incluyen, sin limitación, aquellas descritas en: Darzynkiewicz et al., Cytometry 13:795-808, 1992; Gorczyca et al., Leukemia 7:659-670, 1993 Gorczyca et al, Cáncer Research 53:1945-1951, 1993; Itoh et al., Cell 66:233-243, 1991; Zacharchuk, Journal of Immunology 145:4037-4045, 1990; Zamai et al., Cytometry 14:891-897, 1993; Gorczyca et al., International Journal of Oncology 1 :639-648, 1992. Las pruebas para las proteínas que influencian etapas tempranas de desarrollo y confinamiento de células T incluyen, sin limitación, aquellas descritas en Antica et al., Blood 84;111-117, 1994; Fine et al., Cellular Immunology 155:111-122, 1994; Galy et al., Blood 85:2770-2778, 1995; Toki et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 88:7548-7551, 1991.

Actividad de Regulación de Hematopoiesis _ ' Una proteína de la presente invención puede ser útil en la regulación de la hematopoiesis y, en consecuencia, en el tratamiento de deficiencias de células mieloides o linfoides. Aún una actividad biológica marginal en apoyo de células formadoras de colonias o de líneas celulares dependientes de factor, indica envolvimiento en la regulación de hematopoiesis, esto es, en el soporte del crecimiento y la proliferación de células progenitoras eritroides solas o en combinación con otras citocinas, indicando utilidad de esta manera, por ejemplo, en el tratamiento de diversas anemias o para usarse en conjunto con irradiación/quimioterapia para estimular la producción de precursores eritroides y/o células eritroides; en soportar el crecimiento y proliferación de células mieloides tales como los granulocitos y monocitos/macrófagos (esto es, actividad CSF tradicional) útiles, por ejemplo, en conjunto con la quimioterapia para prevenir o tratar la mielo-supresión consecuente; en soportar el crecimiento y proliferación de megacariocitos y consecuentemente de plaquetas, permitiendo de esta forma la prevención o tratamiento de diversos desordenes de plaquetas tales como la trombocitopenia, y en general para utilizarse en lugar o en forma complementaria a transfusiones de plaquetas; y/o en sostener el crecimiento y proliferación de células pluripotenciales hematopoiéticas que sean capaces de madurar a todas y cada una de las células hematopoiéticas anteriormente mencionadas y por lo tanto encuentran utilidad terapéutica en diversos desordenes de células pluripotenciales (tales como aquellos usualmente tratados con transplantes, incluyendo, sin limitación, anemia aplástica y hemoglobinuria nocturna paroxísmal) así como en el repoblamiento de la división de células pluripotenciales que resulta de la irradiación/quimioterapia, ya sea in vivo o ex vivo (esto es, en conjunto con el transplante de médula ósea o con el transplante de células progenitoras periféricas (homologas o heterólogas)) como células normales o genéticamente manipuladas por terapia de genes. La actividad de una proteína de la invención puede, entre otros medios, ser medida por los siguientes métodos: Pruebas apropiadas para determinar la proliferación y diferenciación de varias líneas hematopoiéticas se han citado anteriormente. Las pruebas para la diferenciación de células progenitoras embrionarias (las cuales identificarán, entre otras, proteínas que influencian la hematopoiesis de la diferenciación embrionaria) incluyen, sin limitación, aquellas descritas en Johansson et al. Cellular Biology 15:141-151, 1995; Keller et al., Molecular and Cellular Biology 13:473-486, 1993; McClanahan et al., Blood 81:2903-2915, 1993. Las pruebas para determinar la supervivencia y diferenciación de células progenitoras (que identificarán, entre otras, proteínas que regulan la linfo-hematopoiesis) incluyen, sin limitación, aquellas descritas en: Methylcellulose colony forming assays, Freshney, M.G. In Culture of Hematopoietic Cells, R.I. Freshney, et al eds. Vol pp 265-268, Wiley-Liss, Inc., New York, NY 1994; Hirayama et al., Proc Nati. Acad. Sci. USA 89:5907-5911, 1992; Primitive hematopoietic colony forming cells with high proliferative potential, McNiece, I.K. y Briddell, R.A. In Culture of Hematopoietic Cells. R.I. Freshney, et al. eds. Vol pp. 23-39, Wiley-Liss, Inc. New York, NY 1994; Neben et al., Experimental Hematology 22:353-359, 1994; Cobblestone área forming cell assay, Ploemacher, R.E. In Culture of Hematopoietic Cells. R.I. Freshney et al., eds. Vol pp. 1-21, Wiley-Liss, Inc. New York, NY 1994; Long term bone marrow cultures in the presence of stromal cells, Spooncer, E., Dexter, M. and Alien, T. In Culture of Hematopoietic Cells. R.I. Freshney et al., eds. Vol pp. 163-179, Wiley-Liss, Inc., New York, NY 1994; Long term culture initiating cell assay, Sutherland, H.J. In Culture of 2o Hematopietic Cells, R.I. Freshney et al., eds. Vol pp. 139-162, Wiley-Liss, Inc. New York, NY. 1994.

Actividad de Crecimiento de Tejido Una proteína de la presente invención también puede tener utilidad en composicione usadas para el crecimiento o regeneración de tejido óseo, de cartílago, de tendón, de ligament y/o de nervio, así como para curar heridas y reparación o reemplazo de tejido, y en e tratamiento de quemaduras, incisiones y úlceras. Una proteína de la presente invención, la cual induce el crecimiento de cartílago y/ hueso en circunstancias en las que normalmente no hay hueso formado, tiene aplicación en l curación de fracturas óseas y daños o defectos a cartílago en humanos y otros animales. Dich preparación empleando una proteína de la invención puede tener uso profiláctico en l reducción tanto de fracturas cerradas como abiertas y también en la fijación mejorada d uniones artificiales. La formación de hueso nuevo inducida por un agente osteogénic contribuye a la reparación de defectos cráneo faciales congénitos, inducidos por traumatismo, inducidos por resección oncológica, y también es útil en cirugía plástica cosmética. Una proteína de esta invención también puede ser útil en el tratamiento de enfermeda periodental y en otros procesos de reparación de dientes. Tales agentes pueden proveer u ambiente para atraer células formadoras de hueso, estimular el crecimiento de célula formádoras de hueso o inducir la diferenciación de progenitores de células formadoras d hueso. Una proteína de la invención también puede ser útil en el tratamiento de osteoporosis osteoartritis , tal como a través de la estimulación de la reparación de hueso y/o cartílago mediante el bloqueo de la inflamación o procesos de destrucción de tejido (activida colagenasa, actividad osteoclástica, etc.) mediada por procesos inflamatorios. Otra categoría de actividad de regeneración de tejido que puede ser atribuible a l proteína de la presente invención es la formación de tendón/ligamento. Una proteína de l presente invención, la cual induce tejido similar a tendón/ligamento u otra formación de tejid en circunstancias en las que dicho tejido no es normalmente formado, tiene aplicación en l curación de desgarres de tendón o ligamento, deformidades y otros defectos de tendón ligamento en humanos y otros animales. Dicha preparación empleando una proteína inductor de tejido similar a tendón/ligamento puede tener uso profiláctico en la prevención de daños tejido de tendón o ligamento, así como en el uso para fijación mejorada de tendón o ligament a hueso u otros tejidos, y en la reparación de defectos de tejido de tendón o ligamento. L formación de tejido nuevo de tendón/ligamento, inducida por una composición de la present invención contribuye a la reparación de defectos de tendón o ligamento congénitos, inducido por traumatismo o de otro origen, y también es útil en cirugía plástica cosmética para l fijación o reparación de tendones o ligamentos. Las composiciones de la presente invenció pueden proveer un ambiente para atraer células formadoras de tendón o ligamento, estimula el crecimiento de células formadoras de tendón o ligamento, inducir la diferenciación d progenitores de células formadoras de tendón o ligamento, o inducir el crecimiento de célula o progenitores de tendón/ligamento ex vivo para retorno in vivo para efectuar la reparación d tejido. Las composiciones de la invención también pueden ser útiles en el tratamiento d tendonitis, síndrome de túnel cafiano y otros defectos de tendón o ligamento. La composiciones también pueden incluir una matriz apropiada y/o un agente secuestrante com un portador como se conoce bien en la técnica. La proteína de la presente invención también puede ser útil para la proliferación d células nerviosas y para la regeneración de tejido nervioso y del cerebro, esto es, para e tratamiento de enfermedades y neuropatías del sistema nervioso central y periférico, así com de desordenes mecánicos y traumáticos que involucren la degeneración, muerte o lesiones células nerviosas o al tejido nervioso. Más específicamente, una proteína puede ser emplead en el tratamiento de enfermedades del sistema nervioso periférico, tales como daños al nervi periférico, neuropatía periférica y neuropatías localizadas, y enfermedades del sistem nervioso central, tales como la enfermedad de Alzheimer, Parkinson, Huntington, esclerosi lateral amiotrópica y el síndrome de Shy-Drager. Condiciones adicionales que pueden se tratadas de acuerdo con la presente invención incluyen desordenes mecánicos y traumáticos tales como desordenes de la médula espinal, lesiones de la cabeza y enfermedade cerebrovasculares tales como ataque apopléjico. También pueden ser tratables usando un proteína de la presente invención neuropatías periféricas que resultan de quimioterapia u otra terapias médicas. Las proteínas de la invención también pueden ser útiles para promover el mejor y má rápido cierre de heridas sin sanar, incluyendo sin limitación, úlceras por presión, úlcera asociadas con insuficiencia vascular, heridas por traumatismo y por cirugía, y similares.

Se espera que una proteína de la presente invención también puede exhibir actividad para la generación o regeneración de otros tejidos tales como tejidos de órganos (incluyendo, por ejemplo, páncreas, hígado, intestino, riñon, piel, endotelio), de músculo (liso, esquelético o cardiaco) y vascular (incluyendo endotelio vascular), o para promover el crecimiento de células que comprenden dichos tejidos. Parte de los efectos deseados puede ser mediante la inhibición o modulación de la cicatrización fibri ótica para permitir que el tejido normal se regenere. Una proteína de la invención también puede presentar actividad angiogénica. Una proteína de la presente invención también puede ser útil para la protección o regeneración del intestino y para el tratamiento de la fibrosis de pulmón o hígado, daño por reperfusión en varios tejidos y condiciones resultantes de daño sistémico de citocina. Una proteína de la presente invención también puede ser útil para promover o inhibir la diferenciación de tejidos descritos anteriormente de tejidos o células precursoras; o para inhibir el crecimiento de los tejidos descritos anteriormente. La actividad de una proteína de la invención puede, entre otros medios, ser medida por los siguientes métodos: Los ensayos para determinar la actividad de generación de tejido incluyen, sin limitación, aquellos descritos en la Publicación de Patente Internacional No. WO95/16035 (hueso, cartílago, tendón); Publicación de Patente Internacional No. WO95/05846 (nervio, nervioso); Publicación de Patente Internacional No. WO91/07491 (piel, endotelio). Los ensayos para determinar actividad de curación de heridas incluyen, sin limitación, aquellos descritos en: Winter, Epidemial Wound Healing, pps. 71-112 (Maibach, Hl and Rovee, DT, eds.) Year Book Medical Publishers, Inc., Chicago, según fue modificado por Eaglstein and Mertz, J. Invest. Dermatol. 71:382-84 (1978).

Actividad de Activina/Inhibina Una proteína de la presente invención también puede exhibir actividades relacionadas con activina o inhibina. Las inhibinas se caracterizan por su capacidad de inhibir la liberación de la hormona estimulante del folículo (FSH), mientras que las activinas están caracterizadas por su capacidad de estimular la liberación de la hormona estimulante del folículo (FSH). Por lo tanto, una proteína de la presente invención, sola o en heterodímeros con un miembro de la familia alfa de inhibinas, puede ser útil como un anticonceptivo basado en la capacidad de inhibir o disminuir la fertilidad en mamíferos hembras y disminuir la espermatogénesis en mamíferos machos. La administración de cantidades suficientes de otras inhibinas puede inducir la infertilidad en estos mamíferos. Alternativamente, la proteína de la invención, como un homodímero o como un heterodímero con otras subunidades de proteína del grupo de inhibinas beta, puede ser útil como un terapéutico inductor de la fertilidad, basado en la capacidad de las moléculas de activina en la estimulación de la liberación de FSH de células de la pituitaria anterior. Ver, por ejemplo, la Patente de los E.U.A. No. 4,798,885. Una proteína de la presente invención también puede ser útil para adelantar el comienzo de la fertilidad en mamíferos sexualmente inmaduros, con el propósito de incrementar el ciclo de desempeño productivo de animales domésticos tales como vacas, ovejas y cerdos. La actividad de una proteína de la invención puede, entre otros medios, ser medida por los siguientes métodos: Los ensayos para determinar la actividad de activina/inhibina incluyen, sin limitación, aquellos descritos en Vale et al., Endocrinology 91:562-572, 1972; Ling et al., Nature 321 :779-782, 1986; Vale et al., Nature 321:776-779, 1986; Masón et al., Nature, 318:659-663, 1985; Forage et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 83:3091-3095, 1986.

Actividad Quimiotáctica/Quimiocinética Una proteína de la presente invención puede tener actividad qumiocinética o quimiotáctica (por ejemplo, actuar como una quimiocina) para células de mamífero, incluyendo, por ejemplo, monocitos, fibroblastos, neutrófilos, células T, células mast, eosinófilas, y células epiteliales y/o endoteliales. Las proteínas quimiocinéticas y quimiotácticas pueden utilizarse para movilizar o atraer una población de células deseadas a un sitio de acción deseado. Las proteínas quimiotácticas o quimiocinéticas proveen ventajas particulares en el tratamiento de heridas y otras lesiones de tejidos, así como en el tratamiento de infecciones localizadas. Por ejemplo, la atracción de linfocitos, monocitos o neutrófílos hacia tumores o sitios de infección puede resultar en respuestas inmunes mejoradas contra el tumor o agente infeccioso. Una proteína o péptido tiene actividad quimiotáctica para una población celular particular sí ésta puede estimular, directa o indirectamente, la orientación o movimiento dirigido de dicha población celular. Preferiblemente, la proteína o péptido tiene la capacidad de estimular directamente el movimiento dirigido de células. El que una proteína particular tenga actividad quimiotáctica para una población de células puede ser fácilmente determinado empleando dicha proteína o péptido en cualquier ensayo conocido para quimiotaxia celular. La actividad de una proteína de la invención puede, entre otros medios, ser medida por los siguientes métodos: Los ensayos para determinar la actividad quimiotáctica (que identificarán proteínas que inducen o previenen la quimiotaxia) consisten en ensayos que miden la capacidad de una proteína para inducir la migración de células a través de una membrana así como también la capacidad de una proteína para inducir la adhesión de una población de células a otra población de células. Los ensayos apropiados para determinar el movimiento y adhesión incluyen, sin limitación, aquellos descritos en Current Protocols in Immunology, Editado por J. E. Coligan, A.M. Kruisbeek, D.H. Margulies, E.M. Shevach, W. Strober, Publicado por Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience (Chapter 6.12, Measurement of alpha and beta Chemokines 6.12.1-6.12.28; Taub et al., J. Clin. Invest. 95:1370-1376, 1995; Lind et al., APMIS 103:140-146, 1995; Muller et al., Eur J. Immunol. 25; 1744-1748; Gruber et al., J. Oflmmunol. 152:5860-5867, 1994; Johnston et al., J. of Immunol. 153:1762-1768, 1994.

Actividad Hemostática y Trombolítica Una proteína de la invención también puede presentar actividad hemostática o trombolítica. Como resultado de esto, se espera que dicha proteína sea útil en el tratamiento de diversos desordenes de la coagulación (incluyendo desordenes hereditarios, tales como hemofilias) o para mejorar la coagulación y otros eventos hemostáticos en el tratamiento de heridas resultantes de traumas, cirugías u otras causas. Una proteína de la invención también puede ser útil para disolver o inhibir la formación de trombosis y para el tratamiento y prevención de condiciones resultantes de ella (tales como, por ejemplo, infarto de los vasos del sistema nervioso central o cardiaco (e. g., ataque). La actividad de una proteína de la presente invención puede, entre otros medios, ser medida por los siguientes métodos: Los ensayos para determinar la actividad hemostática y trombolítica incluyen, sin limitación, aquellos descritos en: Linet et al., J. Clin. Pharmacol. 26:131-140, 1986; Burdick et al., Thrombosis Res. 45:413-419, 1987; Humphrey et al., Fibrinolysis 5:71-79 (1991); Schaub, Prostaglandins 35:467-474, 1988.

Actividad de Receptor/Ligando Una proteína de la presente invención también puede demostrar actividad como receptores, ligandos o inhibidores de receptores o agonistas de interacciones de receptor/ligando. Los ejemplos de tales receptores y ligandos incluyen, sin limitación, receptores de citocinas y sus ligandos, receptores de quinasas y sus ligandos, receptores de fosfatasas y sus ligandos, receptores involucrados en interacciones de célula-célula y sus ligandos (incluyendo, sin limitación, moléculas de adhesión celular (tales como selectinas, integrinas y sus ligandos) y parejas receptor/ligando involucradas en presentación de antígeno, reconocimiento de antígeno y desarrollo de respuestas inmunes celulares y humorales). Los receptores y ligandos también son útiles para el tamizaje de péptido potencial o inhibidores de moléculas pequeñas de la interacción relevante receptor/ligando. Una proteína de la presente invención (incluyendo, sin limitación, fragmentos de receptores y ligandos) puede por ella misma ser útil como inhibidor de las interacciones de receptor/ligando. La actividad de una proteína de la presente invención puede, entre otros medios, ser medida por los siguientes métodos: Las pruebas adecuadas para determinar actividad de receptor-ligando incluyen, sin limitación las descritos en: Current Protocols in Immunology, editado por J.E. Coligan, A.M. Kruisbeek, D.H. Margulies, E.M. Shevach, W. Strober, Pub. Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience (Chapter 7.28, Measurements of Cellular Adhesión under static conditions 7.28.1-7.28.22), Takai et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 84:6864-6868, 1987; Bierer et al., J. Exp. Med. 168:1145-1156, 1988; Rosenstein et al., J. Exp. Med 169: 149-160 1989; Sto?tenborg et al., J. Immunol. Methods 175:59-68, 1994; Stitt et al., Cell 80:661-670, 1995.

Actividad Anti-Inflamatoria Las proteínas de la presente invención también pueden presentar actividad antiinflamatoria. La actividad anti-inflamatoria puede ser lograda proveyendo un estímulo a las células involucradas en la respuesta inflamatoria, inhibiendo o promoviendo las interacciones célula-célula (tal como, por ejemplo, la adhesión celular), inhibiendo o promoviendo la químiotaxis de células involucradas en el proceso inflamatorio, inhibiendo o promoviendo la extravasación celular, o estimulando o suprimiendo la producción de otros factores que inhiben o promueven más directamente una respuesta inflamatoria. Las proteínas que presentan dichas actividades pueden ser utilizadas para tratar condiciones inflamatorias (incluyendo condiciones crónicas o agudas) incluyendo, sin limitación, la inflamación asociada a infecciones (tales como el choque séptico, sepsis o el síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS)), daño por isquemia-reperfusión, mortalidad por endotoxina, artritis, rechazo hiperagudo mediado por complemento, nefritis, daño pulmonar inducido por citocina o quimiocina, enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad de Crohn o resultante de la sobre-producción de citocinas tales como el TNF o la IL-1. Las proteínas de la invención también pueden ser útiles para tratar la anafiláxis y la hipersensibilidad a una substancia o material antígeno.

Actividad de Inhibición de Tumores Además de las actividades descritas anteriormente para el tratamiento inmunológico o de prevención de tumores, una proteína de la presente invención puede exhibir otras actividades anti-tumores. Una proteína puede inhibir el crecimiento de tumores directa o indirectamente (tal como, por ejemplo, vía ADCC). Una proteína puede presentar su actividad inhibitoria de tumores actuando sobre el tejido del tumor o el tejido precursor del tumor, inhibiendo la formación de los tejidos necesarios para sostener el crecimiento del tumor (tal como, por ejemplo, inhibiendo la angiogénesis), causando la producción de otros factores, agentes o tipos de células que inhiben el crecimiento del tumor, o suprimiendo, eliminando o inhibiendo factores, agentes o tipos de células que promueven el crecimiento del tumor.

Otras Actividades Una proteína de la invención también puede presentar una o más de las siguientes actividades o efectos: inhibir el crecimiento, infección o función de, o exterminar, agentes infecciosos, incluyendo, sin limitación, bacterias, virus, hongos y otros parásitos; afectar (supresión o mejoramiento) características coforales, incluyendo, sin limitación, altura, peso, color de pelo, color de ojos, piel, proporción grasa/carne o pigmentación de otros tejidos, o tamaño o forma parcial del cuefo (tal como, por ejemplo, aumento o disminución del pecho, cambios en la forma o configuración de huesos); afectar bioritmos o ciclos o ritmos circadianos; afectar la fertilidad de sujetos machos o hembras, afectar el metabolismo, catabolismo, anabolismo, procesamiento, utilización, almacenamiento o eliminación de grasa, lípidos, proteínas, carbohidratos, vitaminas, minerales, cofactores u otros factores o componentes nutrimentales de la dieta; afectar características del comportamiento, incluyendo, sin limitación, apetito, libido, estrés, percepción (incluyendo desordenes de la percepción), depresión (incluyendo desordenes depresivos) y comportamientos violentos; provisión de efectos analgésicos u otros efectos reductores del dolor; promoción de la diferenciación y crecimiento de células progenitoras embriónicas en linajes distintos a los linajes hematopoiéticos; actividad hormonal o endocrina; en el caso de enzimas, corregir deficiencias de las enzimas y el tratamiento de enfermedades relacionadas con las deficiencias; tratamiento de desórdenes hipefroliferativos (tales como, por ejemplo, la psoriasis); actividad similar a inmunoglobulina (por ejemplo, la capacidad de unirse a antígenos o complementos); y la capacidad de actuar como un antígeno en una vacuna para elevar la respuesta inmune contra dicha proteína u otro material o entidad que sea reactivo de alguna forma con dicha proteína.

Ejemplos La presente invención es materializada con mayor detalle por los siguientes ejemplos, pero esta modalidad no pretende restringir la presente invención. Las operaciones básicas y las reacciones de enzima con relación a la recombinación de ADN son llevadas a cabo de acuerdo con la literatura ["Molecular Cloning. A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, 1989]. A menos que se especifique otra cosa, las enzimas de restricción y una variedad de enzimas de modificación a ser utilizadas fueron aquellas disponibles en TAKARA SHUZO. Las instrucciones del fabricante fueron usadas para las composiciones reguladoras así como para las condiciones de reacción, en cada una de las reacciones de enzima. La síntesis de ADNc fue llevada a cabo de acuerdo con la literatura [Kato, S. et al., Gene 150: 243-250 (1994)]. m Preparación de ARN Polyf A.+ La línea celular de linfoma de histiocito U937 (ATCC CRL 1593) estimulada con éster de forbol la línea celular de osteosarcoma Saos-2 (ATCC MTB 85), tejidos de cáncer de estómago obtenidos por operación, y el hígado fueron usados para células de humano para extraer ARNms. La línea celular fue incubada mediante un procedimiento convencional. Después de que aproximadamente 1 g de células de humano fue homogeneizado en 20 ml de solución de tiocianato de guanidina 5.5 M, se preparó ARNm total de acuerdo con la literatura [Okayama, H. et al., "Methods in Enzimology", vol. 164, Academic Press, 1987]. Este fue sometido a cromatografía usando una columna de oligo(dT)-celulosa lavada con solución reguladora de Tris-ácido clorhídrico 20 mM (pH 7.6), NaCl 0. 5 M, y EDTA 1 mM para obtener un ARN po!y(A)+ de acuerdo con la literatura antes mencionada. (2) Construcción de una Biblioteca de ADNc Diez microgramos del ARN poli(A)+ antes mencionado fueron disueltos en una solución reguladora de Tris-ácido clorhídrico 100 mM (pH 8), fue agregada una unidad de fosfatasa alcalina de origen bacteriano y libre de RNasa y la solución resultante se dejó reaccionar a 37 °C durante una hora. Después la solución de reacción experimentó la extracción de fenol, seguida por precipitación de etanol, los granulos obtenidos fueron disueltos en una solución conteniendo acetato de sodio 50 mM (pH 6), EDTA 1 mM, 2-mercaptoetanol al 0.1% y Tritón X-100 al 0.01%. A esto le fue agregada una unidad de una pirofosfatasa acida originaria de tabaco (Epicentre Technologies) y la solución resultante en un volumen total de 100 µl fue dejada que reaccionara a 37 °C durante una hora. Después de que la solución de reacción experimentó la extracción con fenol seguida por la precipitación con etanol, los granulos así obtenidos fueron disueltos en agua para obtener una solución de ARN poli(A)+ decapado. El ARN poli(A)+ decapado y 3 nmol de un oligonucleótido quimérico de ADN- ARN (5'-dG-dG-dG-dG-dA-dA-dT-dT-dC-dG-dA-G-G-A-3') fueron disueltos en una solución conteniendo solución reguladora de Tris-ácido clorhídrico 50 mM (pH 7.5), ATP 0.5 mM, MgCl2 5 mM, 2-mercaptoetanol 10 mM y 25% de polietilenglicol, a lo cual se agregaron 50 unidades de ligasa de ARN T4 y la solución resultante en un volumen total de 30 µl fue dejada que reaccionara a 20 °C durante 12 horas. Después de que la solución de reacción experimentó la extracción con fenol seguida por la precipitación con etanol, los granulos así obtenidos fueron disueltos en agua para obtener un ARN quimérico poli(A)+ oligo-caped.

Después de que el vector pKAl desarrollado por los presentes inventores (Publicación Kokai de Patente Japonesa No. 1992-117292) fue digerido con Kpnl, una cola de aproximadamente 60 dT fue agregada usando una transferasa terminal. Un primario de vector a ser utilizado más adelante fue preparado mediante digestión de este producto con EcoRV para eliminar una cola dT en un costado. Después de que 6 µg del ARN poli(A)+ oligo-caped quimérico, preparado con anterioridad, fuera recocido con 1.2 µg del primario vectorial, el producto resultante fue disuelto en una solución conteniendo solución reguladora de Tris-ácido clorhídrico 50 mM (pH 8.3), KCl 75 mM, MgCl2 3 mM, ditiotreitol 10 mM y dNTP 1.25 mM (dATP + dCTP + dGTP + dTTP), fueron agregadas 200 unidades de una transcriptasa inversa (GIBCO-BRL), y la reacción en un volumen total de 20 µl se dejó correr a 42 °C durante una hora. Después de que la solución de reacción experimentó la extracción con fenol seguida por la precipitación con etanol, los granulos obtenidos de esta forma fueron disueltos en una solución conteniendo solución reguladora de Tris-ácido clorhídrico 50 mM (pH 7.5), NaCl 100 mM, MgCl2 10 mM y ditiotreitol 1 mM. A esto se le agregaron 100 unidades de EcoRI y la solución resultante en un volumen total de 20 µl se dejó reaccionar a 37 °C por una hora. Después de que la solución de reacción sufrió la extracción con fenol seguida por la precipitación con etanol, los granulos así obtenidos fueron disueltos en una solución conteniendo solución reguladora de Tris-ácido clorhídrico 20 mM (pH 7.5), KCl 100 mM, MgCl2 4 mM, (NH4)2SO4 10 mM y 50 µg/ml de albúmina de suero bovino. A esto se le agregaron 60 unidades de una ligasa de ADN de Escherichia coli y la mezcla resultante se dejó que reaccionara a 16 °C durante 16 horas. A la solución de reacción se agregaron 2 µl de dNTP 2 mM, 4 unidades de polimerasa I de ADN de Escherichia coli y 0.1 unidades de RNasa H de Escherichia coli, y la mezcla resultante se dejó reaccionar a 12 °C durante una hora y posteriormente a 22 °C durante una hora. Enseguida, la solución de la reacción de la síntesis del ADNc fue usada para la transformación de Escherichia coli DH12S(GIBCO-BRL). La transformación fue llevada a cabo mediante el método de electroforación. Una parte del transformante fue asperjada sobre el medio de cultivo de agar 2xYT conteniendo 100 µg/ml de ampicilina y la mezcla fue incubada a 37 °C durante toda la noche. Una colonia formada en el medio de cultivo de agar fue tomada aleatoriamente y se inoculó en 2 ml del medio de cultivo 2xYT conteniendo 100 µg/ml de ampicilina. Después de incubación a 37 °C durante toda la noche, el medio de cultivo fue centrifugado para separar la miscela, a partir de la cual se preparó un ADN de plásmido mediante el método de lísis alcalina. El ADN de plásmido fue sometido a digestión doble con EcoRI y Notl, seguida de electroforesia en gel de agarosa al 8%, para determinar el tamaño del inserto de ADNc. Además, usando el plásmido así obtenido como un modelo, la reacción de secuencia fue llevada a cabo usando un primario universal M13 marcado con un tinte fluorescente y polimerasa Taq (un equipo de Applied Biosistems Inc.) y posteriormente el producto se examinó mediante un secuenciador de ADN fluorescente (Applied Biosystems Inc.) para determinar una secuencia de bases de aproximadamente 400 bp en la terminación 5' del ADNc. La información de la secuencia fue presentada como una base de datos de un banco de ADNc de homo/proteína. (3) Selección de ADNcs que Codifican para Proteínas que Tienen Dominios de transmembrana. Una secuencia de bases registrada en el banco de ADNc de homo/proteína fue convertida a tres marcos de secuencias de aminoácidos y se examinó la presencia o ausencia de un marco de lectura abierta (ORF) comenzando desde el codón de iniciación. Posteriormente, la selección fue hecha para la presencia de una secuencia señal que es característica para una proteína secretada en la terminación N de la porción codificada por el ORF. Estas clonas fueron secuenciadas desde ambas direcciones 5' y 3' usando el método de deleción y utilizando exonucleasa III para determinar la secuencia de bases completa. Los perfiles de hidrofobicidad/hidrofilicidad fueron obtenidos para proteínas codificadas por el ORF mediante el método de Kyte-Doolittle (Kyte, J. & Doolittle, R. F., J. Mol. Biol. 157: 105-132 (1982)] para examinar la presencia o ausencia de una región hidrofóbica. En el caso en el que existe una región hidrofóbica de un dominio de transmembrana putativa en la secuencia de aminoácidos de una proteína codificada, esta proteína fue considerada como una proteína de membrana. (4) Verificación Funcional de Secuencia de Señal Secretoria o Dominios de _ Transmembrana. _ Se verificó por el método descrito en la literatura [Yokoyama-Kobayashi, M. et al., Gene 163: 193-196 (1995)] el que la región hidrofóbica con terminación N en el candidato de clona de proteína secretada obtenido en las etapas antes mencionadas funciona como una secuencia de señal secretoria. Primero, el plásmido conteniendo el ADNc objetivo fue dividido en un sitio de enzima de restricción apropiado que existía corriente abajo de la porción esperada para la codificación de la secuencia de señal secretoria. En el caso en que este sitio de restricción era una terminación sobresaliendo, el sitio fue hecho que terminara romo mediante el tratamiento Klenow o tratamiento con la polimerasa de T4DNA. La digestión con HindIII fue adicionalmente llevada a cabo y un fragmento de ADN conteniendo el promotor SV40 y un ADNc que codificaba para la secuencia de señal secretoria corriente abajo del promotor fue separado mediante electroforesia en gel de agarosa. El fragmento resultante fue insertado entre el sitio HindIII en pSSD3 (DDBJ EMBL/Registro GenBank No. AB007632) y un sitio de enzima de restricción seleccionado a fin de empatar con el marco de codificación de uroquinasa, construyendo de esta forma un vector que expresa una proteína de fusión de la secuencia de señal secretoria del ADNc objetivo y el dominio proteasa de uroquinasa. Después de que la Escherichia coli (hospedero: JM109) portando el vector de expresión de proteína de fusión fue incubada a 37 °C durante 2 horas en 2 ml del medio de cultivo 2xYT conteniendo 100 µg/ml de ampicilina, el fago auxiliador M13KO7 (50 µl) fue agregado y la incubación fue continuada a 37 °C durante toda la noche. Un sobrenadante separado por centrifugación se sometió a precipitación con polietilenglicol para obtener partículas fago de una sola cadena. Estas partículas fueron suspendidas en 100 µl de Tris 1 mM-EDTA 0.1 mM, pH 8 (TE). También, se utilizaron como controles unas suspensiones de partículas de fago de una sola cadena preparada en la misma forma de pSSD3 y a partir del vector pKAl-UPA conteniendo un ADNc de longitud completa de uroquinasa [Yokoyama-Kobayashi, M. et al., Gene 163: 193-196 (1995)]. Las células del cultivo de origen de riñon de simio, COS7, fueron incubadas a 37 °C en la presencia de 5% de CO2 en el medio de cultivo de Eagle modificado por Dulbecco's (DMEM) conteniendo 10% de albúmina de bovino fetal. En un plato de 6 pozos (Nunc. Inc., 3 cm de diámetro de pozo) fueron inoculadas 1 x 105 células COS7 y la incubación se llevó a cabo a 37 °C durante 22 horas en la presencia de 5% de CO2. Después de que el medio de cultivo fue retirado, la superficie celular fue lavada con una solución reguladora de fosfato y posteriormente lavada otra vez con DMEM conteniendo Tris-ácido clorhídrico 50 mM (pH 7.5) (TDMEM). A las células resultantes les fue agregado 1 µl de la suspensión de fago de una sola cadena, 0.6 ml de medio de cultivo DMEM, y 3 µl de TRANSFECTAM™ (IBF Inc.) y la mezcla resultante fue incubada a 37 °C durante 3 horas en la presencia de 5% de CO2. Después de que la solución muestra fue retirada, la superficie de las células fue lavada con TDMEM, 2 ml por pozo de DMEM conteniendo 10% de albúmina de bovino fetal fueron agregados, y la incubación se llevó a cabo a 37 °C durante 2 días en la presencia de 5% de CO2. A 10 ml de solución reguladora de fosfato 50 mM (pH 7.4) conteniendo 2% de fibrinógeno de bovino (Miles Inc.), 0.5% de agarosa y cloruro de calcio 1 mM fueron agregadas 10 unidades de trombina humana (Mochida Pharmaceutical Co., Ltd.) y la mezcla resultante fue solidificada en un plato de 9 cm de diámetro para preparar una placa de fibrina. Diez microlitros del sobrenadante del medio de cultivo de las células COS7 transfectadas fueron dispersados sobre la placa de fibrina, la cual fue incubada a 37 °C durante 15 horas. En el caso en el que aparece un circulo claro sobre la placa de fibrina, se considera que un fragmento de ADNc codifica para la secuencia de aminoácidos que funciona como una secuencia de señal secretoria. Por otro lado, en el caso en el que no se formó un circulo claro, las células fueron lavadas bien, posteriormente la lámina de fibrina fue colocada sobre las células, y la incubación se llevó a cabo a 37 °C durante 15 horas. En el caso en el que se formó una porción clara sobre la lámina de fibrina, esto indica que la actividad de uroquinasa era expresada en la superficie de las células. En otras palabras, el fragmento de ADNc es considerado como que codifica para los dominios de transmembrana. (5) Síntesis de Proteína por Traducción In Vitro El vector plásmido portando el ADNc de la presente invención fue utilizado para la transcripción/traducción in vitro con un equipo de lisato de reticulocito de conejo TNT (Promega). En éste caso, se agregó [35S]metionina para marcar el producto de expresión con un radioisótopo. Cada una de las reacciones fue llevada a cabo siguiendo los protocolos anexos al equipo. Dos microgramos del plásmido se dejaron reaccionar a 30 °C durante 90 minutos en 25 µl totales de una solución de reacción conteniendo 12.5 µl del lisato de reticulocito de conejo TNT, 0.5 µl de la solución reguladora (anexa al equipo), 2 µl de una mezcla de aminoácidos (libres de metionina), 2 µl de [35S]metionina (Amersham) (0.37 MBq/µl), 0.5 µl de polimerasa de ARN T7 y 20 U de RNsina. A 3 µl de la solución de reacción resultante les fueron agregados 2 µl del regulador de muestra SDS (solución reguladora de Tris-ácido clorhídrico 125 mM, pH 6.8, 2-mercaptoetanol 120 mM, 2% de solución SDS, 0.025% de azul de bromofenol y 20% de glicerol) y la solución resultante fue calentada a 95 °C durante 3 minutos y posteriormente sometida a electroforesia en gel de SDS-poliacrilamida. El peso molecular del producto de traducción fue determinado llevando a cabo la autoradiograf?a. (6) Expresión en COS7 Escherichia coli poseyendo un vector de expresión de la proteína de la invención fue infectada con el fago auxiliador M13KO7 y se obtuvieron partículas de fago de una sola cadena mediante el método anteriormente mencionado. El fago así obtenido se utilizó para la introducción de cada vector de expresión en las células de cultivo de origen de riñon de mono, COS7. Después de la incubación a 37 °C en la presencia de 5% de CO2 durante 2 días, la incubación se continuó durante una hora en el medio de cultivo conteniendo [35S]cisteína o [35S]metionina. La recolección y disolución de las células, seguida del sometimiento a SDS-PAGE, permitió observar la presencia de una banda correspondiente al producto de expresión de cada proteína, la cual existía en las células COS7. (7) Ejemplos de Clonas <HP01434> (Secuencias Nos. 1, 8 y 15) La determinación de la secuencia de bases completa del inserto de ADNc de la clona HPO 1434 obtenida a partir de las bibliotecas de ADNc de cáncer de estómago humano reveló la estructura consistente en una región de no traducción 5' de 69 bp, un ORF de 390 bp, y una región de no traducción 3' de 302 bp. El ORF codifica para una pro teína consistente en 129 residuos de aminoácido y existía un dominio de transmembrana putativo. La Figura 1 describe el perfil de hidrofobicidad hidrofilicidad de la presente proteína obtenida por el método de Kyte-Doolittle. La traducción in vitro resultó en la formación de un producto de traducción de 17 kDa que era un poco más pequeño que el peso molecular de 14,795 pronosticado a partir de ORF. La introducción de un vector de expresión, en donde el fragmento HindIII-PstI (punta romada mediante tratamiento con polimerasa T4RNA) conteniendo una porción de ADN codificando para los 68 residuos de aminoácido de la terminación N de la presente proteína fue insertado dentro del sitio HindlII-PmaCI de pSSD3, dentro de las células COS7 reveló que la actividad de uroquinasa no era detectable en el medio de cultivo para indicar que la presente proteína permanece en la membrana. La investigación de la base de datos de la proteína usando la secuencia de aminoácidos de la presente proteína reveló que la proteína era análoga a la proteína de unión a FK506 de murino (No. de acceso SWISS-PROT P45878). La Tabla 2 indica la comparación de la secuencia de aminoácidos entre la proteína humana de la presente invención (HP) y la proteína de unión a FK506 de murino Allí, las marcas de "-", " * " y " . " representan un vacío, un residuo de aminoácido idéntico a aquel en la proteína de la presente invención y un residuo de aminoácido análogo a aquel en la proteína de la presente invención, respectivamente. Ambas proteínas poseían una homología de 46.8% en los 94 residuos aminoácido.

Tabla 2 HS MHFLFRFIVF YLWGLFTAQRQKKEESTEEVKIEVLHRPENCSKTSKKGDLLNAHYDGYL zk ~k -k zk zk zk zk-zk zk -k -k zk zk ~k MM MRLS ILTILSICLSA]_A?ATGAEGKRKLQIGVKKRVDHCPIKSRKGDV HMHYTGKL HS AKDGSKFYCSRTQNEGHPKWFVLGVGQVIKGLDIñ_^DMCPGE Il_ VVI PPSFAYGKEGY zk zk -k -k c ?- - -k "k "k -k -k -k -k -k -k ie -k -k i -k -k -k -k -k -k -k -k z zk MM -EDGTEFDSSLPQN-- -QPFVFSLGTGQVIKGWDQGLLGMCEGEKRKLVI PSELGYGERGA HS DKPLLAKGI MM PPKIPGGATLVFEVELLKIERRSEL Además, la investigación del GenBank usando la secuencia de bases del presente ADNc reveló el registro de secuencias que poseían una analogía de 90% o más (por ejemplo, No. de Acceso AA431230) en EST, pero ninguna de las secuencias era más corta que los presentes ADNc y no se encontró que contuvieran el codón de iniciación. La proteína de unión a FK506 de murino posee la actividad de prolisis de peptidilo-transisomerasa y está asociada con el plegamiento de proteínas [Hendrickson, B. A. Et al., Gene 134: 271-275 (1993)]. <HP01512> (Secuencias Nos. 2, 9 y 17) La determinación de la secuencia de bases completa para el inserto de ADNc de la clona HP01512 obtenida a partir de las bibliotecas de ADNc de cáncer de estómago humano reveló la estructura consistente en una región de no traducción 5' de 45 bp, un ORF de 408 bp, y una región de no traducción 3' de 248 bp. El ORF codifica para una proteína consistente en 135 residuos de aminoácido y existía un dominio de transmembrana putativo. La Figura 2 ilustra el perfil de hidrofobicidad/hidrofilicidad de la presente proteína obtenida por el método de Kyte-Doolittle. La investigación de la base de datos de la proteína usando la secuencia de aminoácidos de la presente proteína reveló que la proteína era análoga a la proteína imaginaria de nemátodo WO2B12.7 (No. de acceso PID 1044857). La Tabla 3 indica la comparación de la secuencia de aminoácidos entre la proteína humana de la presente invención (HP) y la proteína imaginaría de nemátodo W02B12.7 (CE). Allí, las marcas de "-", " * " y " . " representan un vacío, un residuo de aminoácido idéntico a aquel en la proteína de la presente invención y un residuo de aminoácido análogo a aquel en la proteína de la presente invención, respectivamente. Los 87 aminoácidos residuos de la terminación C poseían una homología de 49.4 con el costado de la terminación N de la proteína imaginaría de nemátodo W0B12.7.

Tabla 3 HS MVLESVARIVKVQLPAYLKRLPVPESITGFARLTVSEWLRLLPFLGVLALLGYLA • zk -k -k "k k CE MTIAGFCALSLIQDHCCWTTPQHCSVAELGTMPCPTQVSGRCVATTAAVLAGGALIGYLV HS VRPE PKKKQQKDSLINLKIQKENPKVVNEINIEDLCLTKAAYCRC RSKTFPACDGSHN -k -k ~k -k * * •k-k-k zk - ic-k'k - -k :k -k -k - ~k ~k CE GYKF GQRSARCNYKIQLDSNKIVDTVDIEDIG-EKKAFCRC KSEK PYCDGSHG HS KHNELTGDNVGPLILKKKEV -k- ic -k ~k -k "k " "k "k zk zk zk CE KHNKETGDNVGPLIVKSEKNLYIYIIISDFY NHTNDLKHQIAQLERKTATIPKLENQLH Además, la búsqueda en GenBank usando la secuencia de bases del presente ADNc reveló la presencia de secuencias que poseían una homología de 90% o más (por ejemplo, Acceso No. AA429420) en EST, pero puesto que éstas eran secuencias parciales, no podía juzgarse si cualquiera de estas secuencias codificaba o no para la misma proteína que la proteína de la presente invención. <HP02080> (Secuencias Nos. 3, 10, 19) La determinación de la secuencia de bases completa para el inserto de ADNc de la clona HP02080 que fue obtenida a partir de las bibliotecas de ADNc de la línea celular Saos-2 de osteosarcoma humano reveló la estructura que consistía en una región de no traducción 5' de 80 bp, un ORF de 240 bp, y una región de no traducción 3' de 73 bp. El ORF codifica para una proteína consistente en 79 residuos de aminoácido y existía un dominio de transmembrana putativo. La Figura 3 describe el perfil de hidrofobicidad/hidrofilicidad de la presente proteína obtenida por el método de Kyte-Doolittle. La traducción in vitro resultó en la formación de un producto de traducción de 10 kDa que era casi consistente con el peso molecular de 8,177 pronosticado a partir de ORF. La búsqueda de la proteína en la base de datos, haciendo uso de la secuencia de aminoácidos de la presente proteína reveló que la proteína era análoga de una proteína imaginaria de levadura LpglOp (No. de Acceso PID 1749572). La Tabla 4 indica la comparación de la secuencia de aminoácidos entre la proteína humana de la presente invención (HP) y la proteína imaginaría de levadura LpglOp (SC). Allí, las marcas de "-", " * " y " . " representan un vacío, un residuo de aminoácido idéntico a aquel en la proteína de la presente invención y un residuo de aminoácido análogo a aquel en la proteína de la presente invención, respectivamente. Las dos proteínas poseían una homología de 46.3% en la región completa.

Tabla 4 HS MPVAVGPYGQSQPSCFDRVKMGFVMGCAVGMAAGALFGTFSCLRIGMRGRELMGGIGKTM SC MQSMQPSTVDKLKMGAIMGSAAGLGIGFLFGGVAVLRYGPGPRGFLRTLGQYM HS MQSGGTFGTFMAIGMGIRC "k -k-k-k -k zk -k zk zk zk SC LTSAATFGFFMSIGSVIRNEDIPLIQQSGSH NQRLLNENANSSRIFALAMQQAKSSPRK Además, la búsqueda en GenBank usando la secuencia de bases del presente ADNc reveló la presencia de secuencias que poseían una homología de 90% o más (por ejemplo, Acceso No. AA348987) en EST, pero puesto que éstas eran secuencias parciales, no podía juzgarse si alguna de estas secuencias codificaba o no para la misma proteína que la proteína de la presente invención. <HP02239> (Secuencias Nos. 4, 11 y 21) La determinación de la secuencia de bases completa para el inserto de ADNc de la clona HP02239 obtenida a partir de las bibliotecas de ADNc de cáncer de estómago humano reveló la estructura consistente en una región de no traducción 5' de 47 bp, un ORF de 435 bp, y una región de no traducción 3' de 551 bp. El ORF codifica para una proteína consistente en 144 residuos de aminoácido y existían tres dominios de transmembrana putativos. La Figura 4 ilustra el perfil de hidrofobicidad hidrofilicidad de la presente proteína obtenida por el método de Kyte-Doolittle. La traducción in vitro resultó en la formación de un producto de traducción de 17 kDa que era casi idéntico con el peso molecular de 16,687 pronosticado a partir de ORF. La investigación de la base de datos de la proteína usando la secuencia de aminoácidos de la presente proteína reveló que la proteína era análoga al cornichon de ratón (No. de Acceso PID 2460430). La Tabla 5 indica la comparación de la secuencia de aminoácidos entre la proteína humana de la presente invención (HP) y la cornicho de ratón (MM). Allí, las marcas de " * " y " . " representan un residuo de aminoácido idéntico a aquel en la proteína de la presente invención y un residuo de aminoácido análogo a aquel en la proteína de la presente invención, respectivamente. Las dos proteínas poseían una homología de 99.3%) en la región completa.

Tabla 5 HS AFTFAAFCYMLALLLTAALIFFAIWHIIAFDELKTDYKNPIDQCNTLNPLVLPEYLIHA kkkzkki i kkkkkkkkkkkkkkkzkkkkkkkk-kkkzk-k-kkk-kkkkzkzkrkzkzk-k-kzkk-k'k'k-kzkzk'k-kk MM MAFTF_^FCYMLALLLTAALIFFAIWHIIAFDELKTDYKNPIDQCNTLNPLVLPEYLIHA HS FFCVMFLC^AEWLTLGLNMPLIAYHI RYMSRPVMSGPGLYDPTTIMNADILAYCQKEGW jck&kkkkkkkkkkkkkkkkkk'k' zk'k-k-k-kk-k-k-kk'kk-k zkk-kkzkzk'k- -k'kzkk-kzkk-k-kkk'k'k-kzk MM FFCVMFLCAAEWLTLGLNMPLI_?YHIWRYMSRPVMSAPGLYDPTTIMNADILAYCQKEG HS CKLAFYLLAFFYYLYGMIYVLVSS ************************ MM CKLAFYLLAFFYYLYGMIYVLVSS Además, la búsqueda en GenBank usando la secuencia de bases del presente ADNc reveló la presencia de secuencias que poseían una homología de 90% o más (por ejemplo, Acceso No. WO2973) en EST, pero puesto que éstas eran secuencias parciales, no podía juzgarse si alguna de estas secuencias codificaba o no para la misma proteína que la proteína de la presente invención. Se ha encontrado la cornichon en la génesis de Drosophila como una proteína de membrana que es esencial para la morfogénesis [Roth, S. et al., Cell 81 -.961-912, (1995)]. <HP02375> (Secuencias Nos.5, 12 y 23) La determinación de la secuencia de bases completa para el inserto de ADNc de la clona HP02375 obtenida a partir de las bibliotecas de ADNc de la línea celular U937 de linfoma humano reveló la estructura consistente en una región de no traducción 5' de 85 bp, un ORF de 849 bp, y una región de no traducción 3' de 336 bp. El ORF codifica para una proteína consistente en 282 residuos de aminoácido y poseía una secuencia similar a señal en la terminación N y un dominio de transmembrana en la terminación C. En consecuencia, la presente proteína es considerada como que es una proteína de membrana tipo I. La Figura 5 ilustra el perfil de hidrofobicidad/hidrofilicidad de la presente proteína obtenida por el método de Kyte-Doolittle. La investigación de la base de datos de la proteína usando la secuencia de aminoácidos de la presente proteína reveló que ésta tenía una analogía con la proteína 1 humana relacionada con LDL (No. de Acceso PID 1708865). La Tabla 6 indica la comparación de la secuencia de aminoácidos entre la proteína humana de la presente invención (HP) y la proteína 1 humana relacionada con LDL (LR). Allí, las marcas de "-", " * " y " . " representan un vacío, un residuo de aminoácido idéntico a aquel en la proteína de la presente invención y un residuo de aminoácido análogo a aquel en la proteína de la presente invención, respectivamente. Una parte intermedia de la presente proteína posee una homología de 36.4% con la porción del dominio de la clase A del receptor de LDL de la proteína 1 humana relacionada con LDL. Particularmente, la posición de cisteina era conservada.

Tabla 6 HS MSGGWMAQVGAW LR CGDRSDESASCAYPTCFPLTQFTOSpSIGRCININWRCDNDNDCGDNSDEAGCSHSCSSTQF HS RTGALGLALLLLLGLGLGLEAAASPLSTPTSAQAAGPSSGSCPPTKFQCRTSGLCVPLT zkzkzkk k -k zk -k -k -k LR KCNSGRCIPEHWTCDGDNDCGDYSDETHA CTNQATRPPGGCHTDEFQCRLDGLCIPLRW HS RCDRDLDCSDGSDEEECR—IEPCTQKGQ—C-PPPPGLPCP—CTGVSDCSGGTDKKLR *** * ** *_ *** .* .. * . * * * ** * LR RCDGDTDCMDSSDEKSCEGVTHVCDPSVKFGCKDSARCISKAWVCDGDNDCEDNSDEE— HS NCSRLACLAGELRCTLSDD-CIPLTWRCDGHPDCPDSSDELGCGTNEILPEGDATTMGPP ** *** *** ** * *** LR NCESLACRPPSHPCANNTSVCLPPDKLCDGNDDCGDGSDEGELCDQCSLNNGGCSHNCSV HS .^LES?/TSLRNATTMGPPVTLESVPSVGNATSSSAGDQSGSPTAYGVIAAAAVLSASLVT LR APGEGIVCSCPLG-ELGPDNHTCQIQSYCAKHLKCSQKCDQNKFSVKCSCYEG VLEPDG HS ATLLLLSWLRAQERLRPLGLLVAMKESLLLSEQKTSLP LR ESCRSLDPFKPFIIFSNRHEIRRIDLHKGDYSVLVPGLRNTIALDFHLSQSALYWTDWE Además, la búsqueda en GenBank usando la secuencia de bases del presente ADNc reveló el registro de secuencias que poseían una homología de 90% o más (por ejemplo, Acceso No. H94922) en EST, pero ninguna de ellas era más corta que el presente ADNc y se encontró que no contenía codón de iniciación.

La proteína 1 humana relacionada con LDL ha demostrado ser un receptor de a2~ macroglobulina [Kristensen, T. Et al, FEBS Lett. 276: 151-155 (1990)]. La proteína que posee dicho dominio clase A del receptor de LDL es considerada como que trabaja como un receptor para proteínas que existen en el suero. <HP 10517> (Secuencias Nos. 6, 13 y 25) La determinación de la secuencia de bases completa del inserto de ADNc de la clona HPl 0517 obtenida a partir de las bibliotecas de ADNc de hígado humano reveló la estructura consistente en una región de no traducción 5' de 163 bp, un ORF de 303 bp, y una región de no traducción 3' de 370 bp. El ORF codifica para una proteína consistente en 100 residuos de aminoácido y poseía un dominio de transmembrana. La Figura 6 ilustra el perfil de hidrofobicidad/hidrofilicidad de la presente proteína obtenida por el método de Kyte-Doolittle. La traducción in vitro resultó en la formación de un producto de traducción de 12 kDa que era casi idéntico con el peso molecular de 11,796 pronosticado a partir del ORF. La investigación de la base de datos de la proteína usando la secuencia de aminoácidos de la presente proteína no identificó ninguna proteína conocida que tuviera analogía. Además, la búsqueda en GenBank usando la secuencia de bases del presente ADNc reveló la presencia de secuencias que poseían una homología de 90% o más (por ejemplo, Acceso No. R68523) en EST, pero puesto que éstas eran secuencias parciales, no podía juzgarse si alguna de estas secuencias codificaba o no para la misma proteína que la proteína de la presente invención. <HP10521> (Secuencias Nos. 7, 14 y 27) La determinación de la secuencia de bases completa del inserto de ADNc de la clona HPl 0521 obtenida a partir de las bibliotecas de ADNc de hígado humano reveló la estructura consistente en una región de no traducción 5' de 55 bp, un ORF de 678 bp, y una región de no traducción 3' de 289 bp. El ORF codifica para una proteína consistente en 225 residuos de aminoácido y poseía cuatro dominios de transmembrana. La Figura 7 ilustra el perfil de hidrofobicidad/hidrofilicidad de la presente proteína obtenida por el método de Kyte-Doolittle. La traducción in vitro resultó en la formación de un producto de traducción de 27 kDa que era un poco más grande que el peso molecular de 24,809 pronosticado a partir del ORF.

La investigación de la base de datos de la proteína usando la secuencia de aminoácidos de la presente proteína no reveló la presencia de ninguna proteína conocida que tuviera analogía. También, la búsqueda en GenBank usando la secuencia de bases del presente ADNc reveló la presencia de secuencias que poseían una homología de 90% o más (por ejemplo, Acceso No. AA043627) en EST, pero puesto que éstas eran secuencias parciales, no podía juzgarse si alguna de estas secuencias codificaba o no para la misma proteína que la proteína de la presente invención.

Aplicación Industrial La presente invención provee proteínas humanas que tienen dominios de transmembrana, ADNcs que codifican para dichas proteínas, y vectores de expresión de dichos ADNcs, así como también células eucarioticas que expresan dichos ADNcs. La totalidad de las proteínas de la presente invención existen en la membrana celular, de manera que son consideradas como que son proteínas que controlan la proliferación y la diferenciación de las células. En consecuencia, las proteínas de la presente invención pueden ser usadas como compuestos farmacéuticos tales como agentes carcinostáticos relacionados con el control de la proliferación y diferenciación de - las células, o como antígenos para la preparación de anticuefos contra dichas proteínas. Los ADNcs de la presente invención pueden ser utilizados como sondas para la diagnosis de genes y como fuentes de genes para terapia de genes. Además, los ADNcs pueden ser usados para la expresión de grandes cantidades de dichas proteínas. Las células en donde estos genes de proteínas de membrana son introducidos para poseer dichas proteínas en la superficie de la membrana, pueden ser empleadas para la detección de los ligandos correspondientes, el tamizaje de novedosas medicinas de bajo peso molecular, y similares. La presente invención también provee genes correspondientes a las secuencias de polinucleótidos descritos aquí. "Genes correspondientes" son las regiones del genoma que son transcritas para producir los ARNms a partir de los cuales secuencias de polinucleótidos de ADNc son derivados y pueden incluir regiones contiguas del genoma necesario para la expresión regulada de tales genes. Los genes correspondientes pueden por lo tanto incluir, pero no se limitan a, secuencias de codificación, regiones sin traducción 5' y 3', exones empalmados alternativamente, intrones, promotores, mejoradores y silenciadores o elementos supresores. Los genes correspondientes pueden ser aislados de acuerdo con métodos conocidos usando la información de secuencia descrita aquí. Tales métodos incluyen la preparación de sondas o primarios a partir de la información de secuencias descrita para la identificación y/o amplificación de genes en bibliotecas genómicas apropiadas u otras fuentes de materiales genómicos. Un "gene aislado" es un gene que ha sido separado de las secuencias de codificación adyacentes, si las hay, presentes en el genoma del organismo a partir del cual el gene fue aislado.

Se proveen organismos que tienen expresión mejorada, reducida o modificada de los genes correspondientes a las secuencias de polinucleótidos descritos aquí. El cambio deseado en la expresión de gene puede ser logrado a través del uso de polinucleótidos de antisentido o ribozimas que unen y/o separan el ARNm transcrito a partir del gene (Albert and Morris, 1994, Trends Pharmacol. Sci., 15(7): 250-254; Lavarosky et al., 1997, Biochem, Mol. Med. 62(1); 1 1-22; y Hampel, 1998, Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 58: 1-39; la totalidad de los cuales se incofora aquí como referencia). Se proveen animales transgénicos que tienen copias múltiples del(los) gene(s) correspondiente(s) a las secuencias de polinucleótidos descritas aquí, preferiblemente producidos mediante la transformación de células con construcciones genéticas que son establemente mantenidas dentro de las células transformadas y su progenie. También se proveen animales transgénicos que tienen regiones de control genético modificadas que incrementan o reducen los niveles de expresión de genes, o que cambian temporal o espacialmente los patrones de expresión de genes (ver Patente Europea No. 0 649 464 Bl, incoforada a la presente como referencia). Además se proveen organismos en los que el(los) gene(s) correspondiente(s) a las secuencias de polinucleótidos descritas aquí han sido parcial o totalmente inactivados, a través de la inserción de secuencias extrañas dentro del(los) gene(s) correspondiente(s) o a través de la deleción de todos o parte de los genes correspondientes. La inactivación de genes parcial o completa puede ser llevada a cabo a través de la inserción, preferiblemente seguida de corte impreciso, de elementos transposables (Plasterk, 1992, Bioessays 14(9): 629-633; Zwaal et al., 1993, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90(16): 7431-7435; Clark et al., 1994, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91(2): 719-722; la totalidad de los cuales se incofora a la presente como referencias), o a través de recombinación homologa, preferiblemente detectada mediante estrategias de selección genética positiva negativa (Mansour et al., 1988, Nature 336: 348-352; Patentes de los E.U.A. Nos. 5,464,764; 5,487,992; 5,627,059; 5,631,153; 5,614,396; 5,616,491 y 5,679,523, la totalidad de las cuales se incofora a la presente como referencias). Estos organismos con expresión de genes alterada son preferiblemente eucariotes y, más preferiblemente, son mamíferos. Tales organismos son útiles para el desarrollo de modelos no humanos para el estudio de desordenes que involucran los genes correspondientes, y para el desarrollo de sistemas de prueba para la identificación de moléculas que interactúan con la(s) proteína(s) producto del(los) correspondiente(s) gene(s). En donde la proteína de la presente invención está unida a membrana (por ejemplo, es un receptor), la presente invención también proporciona formas solubles de tales proteínas. En dichas formas, parte o la totalidad de los dominios intracelulares y de transmembrana de la proteína son eliminados de manera tal que la proteína es totalmente secretada a partir de la célula en la que es expresada. Los dominios intracelulares y de transmembrana de proteínas de la invención puede ser identificada de acuerdo con técnicas conocidas para la determinación de tales dominios a partir de información de secuencia. Proteínas y fragmentos de proteínas de la presente invención incluyen proteínas con longitudes de las secuencias de aminoácidos que son cuando menos 25% (más preferiblemente cuando menos 50%, y más preferiblemente cuando menos 75%) de la longitud de una proteína descrita y tienen cuando menos 60% de identidad de secuencia (más preferiblemente, cuando menos 75% de identidad, más preferiblemente cuando menos 90% o 95% "de identidad) con aquella proteína descrita, en donde la identidad de secuencia es determinada comparando las secuencias de aminoácidos de las proteínas cuando se alinean a fin de maximizar el traslape y la identidad en tanto que se reduce las aberturas de secuencia. También se incluyen la presente invención proteínas y fragmentos de proteínas que contienen un segmento preferiblemente comprendiendo 8 o más (más preferiblemente 20 o más, más preferiblemente 30 o más) aminoácidos contiguos que comparten cuando menos 75%) de identidad de secuencia (más preferiblemente, cuando menos 85% de identidad, más preferiblemente cuando menos 95% de identidad) con cualquier segmento de cualquiera de las proteínas descritas. Los homólogos de especie de los polinucleótidos y proteínas descritas también son proveídas por la presente invención. Como se emplea aquí, una "especie homologa" es una proteína o polinucleótido con una especie diferente de origen a partir de aquel de una proteína o polinucleótido dado, pero con similitudes de secuencia importantes a la proteína o polinucleótido dado, según se determinó por aquellos capacitados en la técnica. Los homólogos de especie pueden ser aislados e identificados elaborando sondas o primarios adecuados a partir de las secuencias proveídas por la presente y tamizando una fuente de ácido nucleico adecuada a partir de las especies deseadas. "La invención también abarca variantes alélicas de los polinucleótidos o proteínas descritas; esto es, formas alternativas que ocurren de manera natural, de los polinucleótidos aislados que también codifican proteínas que son idénticas, homologas o están relacionadas con aquella codificada por los polinucleótidos. La invención también incluye polinucleótidos con secuencias complementarias a aquellas de los polinucleótidos descritos aquí. La presente invención también incluye polinucleótidos capaces de hibridizar bajo condiciones de astringencia reducida, más preferiblemente condiciones astringentes, y más preferiblemente condiciones altamente astringentes, a los polinucleótidos descritos aquí. Ejemplos de condiciones de astringencia son mostradas en la tabla siguiente: condiciones de alta astringencia son aquellas que son cuando menos tan astringentes como, por ejemplo, las condiciones A-F; condiciones astringentes son cuando menos tan astringentes como, por ejemplo las condiciones G-L; y condiciones de astringencia reducida con cuando menos tan astringentes como, por ejemplo las condiciones M-R.

Tabla 1 La longitud del híbrido es aquella anticipada por la(s) región(es) hibridizada(s) de los polinucleótidos de hibridación. Cuando hibrida un polinucleótido a un polinucleótido objetivo de secuencia desconocida, se supone que la longitud del híbrido es aquella del polinucleótido de hibridación. Cuando polinucleótidos de secuencia conocida son hibridados, la longitud del híbrido puede ser determinada alineando las secuencias de los polinucleótidos e identificando la región o regiones de complementariedad óptima de secuencia. 2 SSPE (lxSSPE es 0.15M NaCl, 10 mM NaH2PO4, y 1.25 mM EDTA, pH 7.4) puede ser substituido por SSC (lxSSC es 0.15M NaCl y 15 mM citrato de sodio) en la hibridación y se realizan lavados con reguladores de lavado durante 15 minutos después de que la hibridación es completa. *T_-TR: la temperatura de hibridación para híbridos que se anticipa son menores de 50 pares de bases en longitud, debe ser de 5-10 °C menos que la temperatura de fusión (Tm) del híbrido. En donde Tm es determinada de acuerdo con las siguientes ecuaciones. Para híbridos menores de 18 pares de bases de longitud, Tm(°C)=2(# de A + T bases) + 4(# de G + C bases). Para híbridos entre 18 y 49 pares de bases de longitud, Tm(°C)=81.5 + ló.driogiofNa ]) + 0.41 (%G+C)-(600 N). En donde N es el número de bases en el híbrido, y [Na+] es la concentración de iones sodio en el regulador de hibridación ([Na+] para lxSSC=0.I65M).

Ejemplos adicionales de condiciones de astringencia para la hibridación de polinucleótidos se proveen en Sambrook, J., E. F. Fritsch, y T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manuel, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY, capítulos 9 y 11 y en Current Protocols in Molecular Biology, 1995, F.M. Ausubel et al., eds. John Wiley & Sons, Inc., secciones 2.10 y 6.3-6.4., incoforados aquí como referencia. Preferiblemente, cada uno de tales polinucleótido de hibridación tiene una longitud que es cuando menos 25% más (más preferiblemente cuando menos 50%, y más preferiblemente cuando menos 75%) de la longitud del polinucleótido de la presente invención al cual híbrida, y tiene cuando menos 60% de identidad de secuencia (más preferiblemente, cuando menos 75% de identidad; más preferiblemente cuando menos 90% o 95% de identidad) con el polinucleótido de la presente invención al cual híbrida, en donde la identidad de secuencia es determinada comparando las secuencias de los polinucleótidos de hibridación cuando se alinean a fin de maximizar el traslape e identidad en tanto que se reducen las aberturas de secuencia.

LISTADO DE SECUENCIAS <110> Sagami Chemical Research Center et al. <120> TProteinas Humanas que Poseen Dominios de Transmembrana y ADNc que Codifican para estas Proteínas. <130 _561098 " <141> 1999-02-25 <150> JP 10-046607 <151> 1998-02-27 <160> 28 <170> Windows 95 (Word 98) <210> 1 <211> 129 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met His Phe Leu Phe Arg Phe lie Val Phe Phe Tyr Leu Trp Gly Leu 1 5 10 15 Phe Thr Ala Gln Arg Gln Lys Lys Glu Glu Ser Thr Glu Glu Val Lys 20 25 30 lie Glu Val Leu His Arg Pro Glu Asn Cys Ser Lys Thr Ser Lys Lys 35 40 45 Gly Asp Leu Leu Asn Ala His Tyr Asp Gly Tyr Leu Ala Lys Asp Gly 50 55 60 Ser Lys Phe Tyr Cys Ser Arg Thr Gln Asn Glu Gly His Pro Lys Trp 65 70 75 80 Phe Val Leu Gly Val Gly Gln Val He Lys Gly Leu Asp He Ala Met 85 90 95 Thr Asp Met Cys Pro Gly Glu Lys Arg Lys Val Val "lie Pro Pro Ser 100 105 110 Phe Ala Tyr Gly Lys Glu Gly Tyr Asp Lys Pro Leu Leu Ala Lys Gly 115 " 120 125 He <210> 2 <211> T35 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Val Leu Glu Ser Val Ala Arg He Val Lys Val Gln Leu Pro Ala 1 5 10 15 Tyr Leu Lys Arg Leu Pro Val Pro Glu Ser He Thr Gly Phe Ala Arg 20 25 30 Leu Thr Val Ser Glu Trp Leu Arg Leu Leu Pro Phe Leu Gly Val Leu 35 40 45 Ala Leu Leu Gly Tyr Leu Ala Val Arg Pro Phe Leu Pro Lys Lys Lys 50 55 60 Gln Gln Lys Asp Ser Leu He Asn Leu Lys He Gln Lys Glu Asn Pro 65 70 75 80 Lys Val Val Asn Glu He Asn He Glu Asp Leu Cys Leu Thr Lys Ala 85 90 95 Ala Tyr Cys Arg Cys Trp Arg Ser Lys Thr Phe Pro Ala Cys Asp Gly 100 105 110 Ser H?s Asn Lys His Asn Glu Leu Thr Gly Asp Asn Val Gly Pro Leu 115 120 125 He Leu Lys Lys Lys Glu Val 130 135 <210> 3 <211> 79 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Pro Val Ala Val Gly Pro Tyr Gly Gln Ser Gln Pro Ser Cys Phe 1 5 10 15 Asp Arg Val Lys Met Gly Phe'Val Met Gly Cys Ala Val Gly Met Ala 20 25 30 Ala Gly Ala Leu Phe Gly Thr Phe Ser Cys Leu Arg He Gly Met Arg 35 40 45 Gly Arg Glu Leu Met Gly Gly He Gly Lys Thr Met Met Gln Ser Gly 50 55 60 Gly Thr Phe Gly Thr Phe Met Ala He Gly Met Gly He Arg Cys 65 70 75 <210> 4 <211> 144 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Ala Phe Thr Phe Ala Ala Phe Cys Tyr Met Leu Ala Leu Leu Le'u 1 5 10 15 Thr Ala Ala Leu He Phe Phe Ala He Trp His He He Ala Phe Asp 20 25 30 Glu Leu Lys Thr Asp Tyr Lys Asn Pro He Asp Gln Cys Asri Thr Leu 35 40 45 Asn Pro Leu Val Leu Pro Glu Tyr Leu He His Ala Phe Phe Cys Val 50 55 . 60 Met Phe Leu Cys Ala Ala Glu Trp Leu Thr Leu Gly Leu Asn Met Pro 65 70 75 80 Leu Leu Ala Tyr His He Trp Arg Tyr Met Ser Arg Pro Val Met Ser 85 90 95 Gly Pro Gly Leu Tyr Asp Pro Thr Thr He Met Asn Ala Asp He Leu 100 105 110 Ala Tyr Cys Gln Lys Glu Gly Trp Cys Lys Leu Ala Phe Tyr Leu Leu 115 120 125 Ala Phe Phe Tyr Tyr Leu Tyr Gly Met He Tyr Val Leu Val Ser Ser 130 135 140 <210> 5 <211> 282 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Met Ser Gly Gly Trp Met Ala Gln Val Gly Ala Trp Arg Thr Gly Ala' 1 '5 10 15 Leu Gly Leu Ala Leu Leu Leu Leu Leu Gly Leu Gly Leu Gly Leu Glu 20 25 30 Ala Ala Ala Ser Pro Leu Ser Thr Pro Thr Ser Ala Gln Ala 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CGC AAC TGC AGC CGC CTG GCC TGC CTA GCA GGC GAG CTC 496 Lys Lys Leu Arg Asn Cys Ser Arg Leu Ala Cys Leu Ala Gly Glu Leu 125 130 135 CGT TGC ACG CTG AGC GAT GAC TGC ATT CCA CTC ACG TGG CGC TGC GAC 544 Arg Cys Thr Leu Ser Asp Asp Cys He Pro Leu Thr Trp Arg Cys Asp 140 145 150 GGC CAC CCA GAC TGT CCC GAC TCC AGC GAC GAG CTC GGC TGT GGA ACC 592 Gly His Pro Asp Cys Pro Asp Ser Ser Asp Glu Leu Gly Cys Gly Thr 155 160 165 AAT GAG ATC CTC CCG GAA GGG GAT GCC ACÁ ACC ATG GGG CCC CCT GTG 640 Asn Glu He Leu Pro Glu Gly Asp Ala Thr Thr Met Gly Pro Pro Val 170 175 180 " 185 ACC CTG GAG AGT GTC ACC TCT CTC AGG AAT GCC ACÁ ACC ATG GGG CCC 688 Thr Leu Glu Ser Val Thr Ser Leu Arg Asn Ala Thr Thr Met Gly Pro 190 195 200 CCT GTG ACC CTG GAG AGT GTC CCC TCT GTC GGG AAT GCC AC TCC TCC 736 Pro Val Thr Leu Glu Ser Val Pro Ser Val Gly Asn Ala Thr Ser Ser 205 210 215 TCT GCC GGA GAC CAG TCT GGA AGC CCA ACT GCC TAT GGG GTT ATT GCA 784 Ser Ala Gly Asp Gln Ser Gly Ser Pro Thr Ala Tyr Gly Val He Ala 220 225 230 GCT GCT GCG GTG CTC AGT GCA AGC CTG GTC ACC GCC ACC CTC CTC CTT 832 Ala Ala Ala Val Leu Ser Ala Ser Leu Val Thr Ala Thr Leu Leu Leu 235 240 245 TTG ICC TGG CTC CGA GCC CAG GAG CGC CTC CGC CCA CTG GGG TÍA CTG 880 Leu Ser Trp Leu Arg Ala Gln Glu Arg Leu Arg Pro Leu Gly Leu Leu 250 255 260 265 GTG GCC ATG AAG GAG TCC CTG CTG CTG TCA GAA CAG AAG ACC TCG CTG 928 Val Ala Met Lys Glu Ser Leu Leu Leu Ser Glu Gln Lys Thr Ser Leu 270 275 280 CCC TGAGGACAAG CACTTGCCAC CACCGTCACT CAGCCCTGGG CGTAGCCGG 980 Pro ACAGGAGGAG AGCAGTGATG CGGATGGGTA CCCGGGCACA CCAGCCCTCA GAGACCTGAG 1040 CTCTTCTGGC CACGTGGAAC CTCGAACCCG AGCTCCTGCA GAAGTGGCCC TGGAGATTGA 1100 GGGTCCCTGG ACACTCCCTA TGGAGATCCG GGGAGCTAGG ATGGGGAACC TGCCACAGCC 1160 AGAACTGAGG GGCTGGCCCC AGGCAGCTCC CAGGGGGTAG AACGGCCCTG TGCTTAAGAC 1220 ACTCCTGCTG CCCCGTCTGA GGGTGGCGAT TAAAGTTGCT TCACATCCTC 1270 <210> 24 <211>^282 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Met Ser Gly Gly Trp Met Ala Gln Val 1 5 Gly Ala Trp Arg Thr Gly Ala Leu Gly Leu Ala Leu Leu Leu Leu Leu 10 15 20 25 Gly Leu Gly Leu Gly Leu Glu Ala Ala Ala Ser Pro Leu Ser Thr Pro 30 35 40 Thr Ser Ala Gln Ala Ala Gly Pro Ser Ser Gly Ser Cys Pro Pro Thr 45 50 55 Lys Phe Gln Cys Arg Thr Ser Gly Leu Cys Val Pro Leu Thr Trp Arg 60 65 70 Cys Asp Arg Asp Leu Asp Cys Ser Asp Gly Ser Asp Glu Glu Glu Cys 75 80 85 Arg He Glu Pro Cys Thr Gln Lys Gly Gln Cys Pro Pro Pro Pro Gly 90 95 100 105 Leu Pro Cys Pro Cys Thr Gly Val Ser Asp Cys Ser Gly Gly Thr Asp 110 115 120 Lys Lys Leu Arg Asn Cys Ser Arg Leu Ala Cys Leu Ala Gly Glu Leu 125 130 135 Arg Cys Thr Leu Ser Asp Asp Cys He Pro Leu Thr Trp Arg Cys Asp 140 145 150 Gly His Pro Asp Cys Pro Asp Ser Ser Asp Glu Leu Gly Cys Gly Thr 155 160 165 Asn Glu He Leu Pro Glu Gly Asp Ala Thr Thr Met Gly Pro Pro Val 170 175 180 185 Thr Leu Glu Ser Val Thr Ser Leu Arg Asn Ala Thr Thr Met Gly Pro 190 195 200 Pro Val Thr Leu Glu Ser Val Pro Ser Val Gly Asn Ala Thr Ser Ser 205 210 215 Ser Ala Gly Asp Gln Ser Gly Ser Pro Thr Ala Tyr Gly Val He Ala 220 225 230 Ala ¿Ha Ala Val Leu Ser Ala Ser Leu Val Thr Ala Thr Leu Leu Leu 235 240 245 Leu Ser Trp Leu Arg Ala Gln Glu Arg Leu Arg Pro Leu Gly Leu Leu 250 255 260 265 Val Ala Met Lys Glu Ser Leu Leu Leu Ser Glu Gln Lys Thr Ser Leu 270 275 280 Pro <210> 25 <211> 836 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 25 AAAAAAAAGG AAATGACGAA GGCAGAGGGC GTCCAGGTCC GCTCGGTAAC CGTTTCCCGC 60 GCGCCCGGCC CCGACTCCGG GGTAAAGAGC CCCGGAGCGG AGCAGCGCTG GCCGCGTGCC 120 GCCTCCGGAG CCGGCAGCCC CCATGGCTGG GGGTTATGGA GTG ATG GGT GAC GAT 175 Met Gly Asp Asp 1 GGT TCT ATT GAT TAT ACT GTT CAC GAA GCC TGG AAT GAA GCC ACC AAT 223 Gly Ser He Asp Tyr Thr Val His Glu Ala Trp Asn Glu Ala Thr Asn 5 10 15 20 GTT TAC TTG ATA GTT ATC CTT GTT AGC TTC GGT CTC TTC ATG TAT GCC 271 Val Tyr Leu He Val He Leu Val Ser Phe Gly Leu Phe Met Tyr Ala 25 30 35 AAA AGG AAC AAA AGG AGA ATT ATG AGG ATA TTC AGT GTG CCA CCT ACÁ 319 Lys Arg Asn Lys Arg Arg He Met Arg He Phe Ser Val Pro Pro Thr 40 45 50 GAG GAA ACT TTG TCA GAG CCC AAC TTT TAT GAC ACG ATA AGC AAG ATT 367 Glu Glu Thr Leu Ser Glu Pro Asn Phe Tyr Asp Thr He Ser Lys He 55 60 65 CGT TTA AGA CAA CAÁ CTG GAA ATG TAT TCC ATT TCA AGA AAG TAC GAC 415 Arg Leu Arg Gln Gln Leu Glu Met Tyr Ser He Ser Arg Lys Tyr Asp 70 75 80 TAT CAG CAG CCA CAA AAC CAA GCT GAC AGT GTG CAÁ CTC TCA TTG GAA 463 Tyr Gln Gln Pro Gln Asn Gln Ala Asp Ser Val Gln Leu Ser Leu Glu 85 90 95 100 TGAAACC TCAGAAAAAG AGCAACAGAA GTAATTGTTT CAAGCTCCTG ATTCTTTCTA 520 CTAAATCATG AACAGCTTTA AAAACATTTC TGTCTGCATA AAATTATTTT ACTTGTAACT 580 TTTCCCCAAT TGTTCTGTGC ATTGTTTTGC CTTTTTAAAT TACATCTCCA AGTGGCTCAA 640 AAGGCCTTGA CACAGGGAAC CTGCACATAT CCAGGATATG TGTAACCAGC GATGGTGACT 700 TGACCTTGCC AAGACCTGTG ATTCCTTCAG GATACAATCA GTGAGAAATA AAAACACATC 760 TTGGGAAGTG GGAATCCTGG AGTTTATGCC ATTTGCAATA TTAAAAAATA AAAATGCAAG 820 TTATTATTTC AATAAT 836 <210> 26 <211> 100 <212> PRT <213> Hamo sapiens <400> 26 Met Gly Asp Asp 1 Gly Ser He Asp Tyr Thr Val His Glu Ala Trp Asn Glu Ala Thr Asn 5 10 15 20 Val Tyr Leu He Val He Leu Val Ser Phe Gly Leu Phe Met Tyr Ala 25 30 35 Lys Arg Asn Lys Arg Arg He Met Arg He Phe Ser Val Pro Pro Thr 40 45 50 Glu Glu Thr Leu Ser Glu Pro Asn Phe Tyr Asp Thr He Ser Lys He 55 60 65 Arg Leu Arg Gln Gln Leu Glu Met Tyr Ser He Ser Arg Lys Tyr Asp 70 75 80 Tyr Gln Gln Pro Gln Asn Gln Ala Asp Ser Val Gln Leu Ser Leu Glu 85 90 95 100 <210> 27 <211> 1022 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 27 AGCCCTCCCG CCGCCCGCTC GCAGGTCCCG AGGAGCGCAG ACTGTGTCCC TGACA ATG 58 Met 1 GGA AC GCC GAC AGT GAT GAG ATG GCC CCG GAG GCC CCA CAG CAC ACC 106 Gly Thr Ala Asp Ser Asp Glu Met Ala Pro Glu Ala Pro Gln His Thr 5 10 15 CAC ATC GAT GTG CAC ATC CAC CAG GAG TCT GCC CTG GCC AAG CTC CTG 154 His He Asp Val His He His Gln Glu Ser Ala Leu Ala Lys Leu Leu 20 25 30 CTC ACC TGC TGC TCT GCG CTG CGG CCC CGG GCC ACC CAG GCC AGG GGC 202 Leu Thr Cys Cys Ser Ala Leu Arg Pro Arg Ala Thr Gln Ala Arg Gly 35 40 45 AGC AGC CGG CTG CTG GTG GCC TCG TGG GTG ATG CAG ATC GTG CTG GGG 250 Ser Ser Arg Leu Leu Val Ala Ser Trp Val Met Gln He Val Leu Gly 50 55 60 65 ATC TTG AGT GCA GTC CTA GGA GGA TTT TTC TAC ATC CGC GAC TAC ACC 298 He Leu Ser Ala Val Leu Gly Gly Phe Phe Tyr He Arg Asp Tyr Thr 70 75 80 CTC CTC GTC ACC TCG GGA GCT GCC ATC TGG ACÁ GGG GCT GTG GCT GTG 346 Leu Leu Val Thr Ser Gly Ala Ala He Trp Thr Gly Ala Val Ala Val 85 90 95 CTG GCT GGA GCT GCT GCC TTC ATT TAC GAG AAA CGG GGT GGT ACÁ TAC 394 Leu Ala Gly Ala Ala Ala Phe He Tyr Glu Lys Arg Gly Gly Thr Tyr 100 105 110 TGG GCC CTG CTG AGG ACT CTG CTA GCG CTG GCA GCT TTC TCC ACÁ GCC 442 Trp Ala Leu Leu Arg Thr Leu Leu Ala Leu Ala Ala Phe Ser Thr Ala 115 120 125 ATC GCT GCC CTC AAA CTT TGG AAT GAA GAT TTC CGA TAT GGC TAC TCT 490 He Ala Ala Leu Lys Leu Trp Asn Glu Asp Phe Arg Tyr Gly Tyr Ser 130 135 140 145 TAT TAC AAC AGT GCC TGC CGC ATC TCC AGC TCG AGT GAC TGG AAC ACT 538 Tyr Tyr Asn Ser Ala Cys Arg He Ser Ser Ser Ser Asp Trp Asn Thr 150 155 160 CCA GCC CCC ACT CAG AGT CCA GAA GAA GTC AGA AGG CTA CAC CTA TGT 586 Pro Ala Pro Thr Gln Ser Pro Glu Glu Val Arg Arg Leu His Leu Cys 165 170 175 ACC TCC TTC ATG GAC ATG CTG AAG GCC TTG TTC AGA ACC CTT CAG GCC 634 Thr Ser Phe Met Asp Met Leu Lys Ala Leu Phe Arg Thr Leu Gln Ala 180 185 190 ATG CTC TTG GGT GTC TGG ATT CTG CTG CTT CTG GCA TCT CTG GCC CCT 682 Met Leu Leu Gly Val Trp He Leu Leu Leu Leu Ala Ser Leu Ala Pro 195 200 205 CTG TGG CTG TAC TGC TGG AGA ATG TTC CCA ACC AAA GGG GTG ?GT_ CCC 730 Leu Trp Leu Tyr Cys Trp Arg Met Phe Pro Thr Lys Gly Val Ser Pro 210 215 220 225 TAAGAAAAGA GACCAGAAGG AAATGTTGGA AGTGAGTGGA ATCTAGCCAT GCCTCTCCTG 790 ATTATTAGTG CCTGGTGCTT CTGCACCGGG CGTCCCTGCA TCTGACTGCT GGAAGAAGAA 850 CCAGACTGAG GAAAAGAGGC TCTTCAACAG CCCCAGTTAT CCTGGCCCCA TGACCGTGGC 910 CACAGCCCTG CTCCAGCAGC ACTTGCCCAT TCCTTACACC CCTTCCCCAT CCTGCTCCGC 970 TTCATGTCCC CTCCTGAGTA GTCATGTGAT AATAAACTCT CATGTTATTG TT 1022 <210> 28 <211> 225 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28 Met 1 Gly Thr Ala Asp Ser Asp Glu Met Ala Pro Glu Ala Pro Gln His Thr 5 10 15 His He Asp Val His He His Gln Glu Ser Ala Leu Ala Lys Leu Leu 20 25 30 Leu Thr Cys Cys Ser Ala Leu Arg Pro Arg Ala Thr Gln Ala Arg Gly 35 40 45 Ser Ser Arg Leu Leu Val Ala Ser Trp Val Met Gln He Val Leu Gly 50 55 60 - 65 He Leu Ser Ala Val Leu Gly Gly Phe Phe Tyr He Arg Asp Tyr Thr 70 75 80 Leu Leu Val Thr Ser Gly Ala Ala lie Trp Thr Gly Ala Val Ala Val 85 90 95 Leu Ala Gly Ala Ala Ala Phe He Tyr Glu Lys Arg Gly Gly Thr Tyr 100 105 110 Trp Ala Leu Leu Arg Thr Leu Leu Ala Leu Ala Ala Phe Ser Thr Ala 115 120 125 He Ala Ala Leu Lys Leu Trp' Asn Glu Asp Phe Arg Tyr Gly Tyr Ser 130 135 140 " 145 Tyr Tyr Asn Ser Ala Cys Arg He Ser Ser Ser Ser Asp Trp Asn Thr 150 155 160 Pro Ala Pro Thr Gln Ser Pro Glu Glu Val Arg Arg Leu His Leu Cys 165 170 175 Thr Ser Phe Met Asp Met Leu Lys Ala Leu Phe Arg Thr Leu Gln Ala 180 185 190 Met Leu Leu Gly Val Trp He Leu Leu Leu Leu Ala Ser Leu Ala Pro 195 200 205 Leu Trp Leu Tyr Cys Trp Arg Met Phe Pro Thr Lys Gly Val Ser Pro 210 215 220 .1225

Claims (4)

1. Novedad de la Invención 1. Proteínas que contienen cualquiera de las secuencias de aminoácidos representada por la Secuencia No. 1 o la Secuencia No. 2.
2. 2. El ADN de conformidad con la reivindicación 1, el cual comprende la secuencia de bases Representadas por la Secuencia No. 3 o la Secuencia No. 4.
3. 3. Un vector de expresión capaz de expresar el ADN de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en traducción in vitro o una célula eucariótica.
4. 4. Una célula eucariótica de transformación, capaz de expresar el ADN de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, para producir una proteína codificada por dicho ADN.