MXPA00003437A

MXPA00003437A - Adncs que codifican para proteinas humanas que tienen dominios de transmembrana

Info

Publication number: MXPA00003437A
Application number: MXPA/A/2000/003437A
Authority: MX
Inventors: Seishi Kato; Shingo Sekine
Original assignee: Seishi Kato; Protegene Inc; Sagami Chemical Research Center; Shingo Sekine
Priority date: 1997-10-08
Filing date: 2000-04-07
Publication date: 2001-11-21

Abstract

La invención provee ADNcs que codifican para proteínas humanas que poseen dominios de transmembrana, asícomo también células eucarióticas que expresan dichos Los ADNcs pueden ser utilizados como sondas para la diagnosis de genes y fuentes de genes para la terapia de genes. Ademas, los ADNcs pueden ser utilizados para la expresión a gran escala de dichas proteínas. Células en donde estos genes de proteínas de membrana son introducidos y las proteínas de membrana son expresadas en grandes cantidades, pueden ser utilizados para la detección de los correspondientes ligandos, tamizaje de nuevos productos farmacéuticos de bajo peso molecular, y similares.

Description

ADNcs UE CODIFICAN PARA PROTEÍNAS HUMANAS QUE TIENEN BOMINIOS BE TRANSMEMBRANA 'uampo ole a¡ La presente invención se refiere a ADNcs que codifican para proteínas humanas que tienen dominios de transmembrana y células eucarioticas que expresan dichos ADNcs. Los ADNcs de la presente invención pueden ser usados como sondas para la diagnosis de genes y como fuentes de genes para la terapia de genes. Además, los ADNcs pueden ser utilizados como fuentes de genes para la producción a gran escala de las proteínas codificadas por dichos ADNcs. Células, en donde dichos ADNcs son expresados, pueden ser usadas para la detección de los ligandos correspondientes, así como para el tamizaje de nuevos productos farmacéuticos de bajo peso molecular, y similares.

Apíece eEtes die la Invención Las proteínas de membrana juegan papeles importantes, como receptores de señal, canales de iones, transportadores, etc., en la transportación de material y la transmisión de información que son mediadas por la membrana celular. Sus ejemplos incluyen receptores ar? una variedad de ciíocinas, canales de iones para el ion sodio, ion potasio, ion cloro, etc., transportadores para sacáridos y aminoácidos y similares, y así sucesivamente, en donde los genes para muchos de ellos ya han sido clonados. Se ha aclarado que las anormalidades de estas proteínas de membrana están asociados con un número de enfermedades hasta ahora criptógenas. Por ejemplo, un gene de una pro tema de membrana que tiene doce dominios de transmembrana fue identificado como cl gene responsable de la fibrosis cística [Romens, J. M. et al., Science 245: 1059-1065 (1989)]. Además, se ha aclarado que varias proteínas de membrana actúan como receptores cuando un virus infecta las células. Por ejemplo, se ha revelado que el HIV-1 infecta las células a través cíe la mediación de una fusina de proteína de membrana, que tiene una proteína de membrana cn la membrana de las células T, un antígeno de CD-4 y siete dominios de íransmembrana [Feng, Y. ei al., Science 272: 872-877 (1996)]. Por lo tanto, se anticipa que el descubrimiento de una nueva proteína de membrana conduce a la aclaración de las causas de muchas j-** — enfermedades, de manera que ha sido deseable el aislamiento de un nuevo gene que codifique para la proteína de membrana. Hasta ahora, debido a la dificultad en la purificación, muchas de las proteínas de membrana han sido aisladas a través de un planteamiento procedente de lado de los genes. Un método general es la así denominada clonación de expresión, la cual comprende la transfección de una biblioteca de ADNc en células eucarioíicas para expresar ADNcs y la posterior detección de las células que expresan la proteína de membrana objetivo en la membrana mediante una técnica inmunológica usando un anticuerpo o una técnica fisiológica en el cambio en la permeabilidad de la membrana. Sin embargo, este método es aplicable solamente a la clonación de un gene de una proteína de membrana con una función conocida. En general, las proteínas de membrana poseen dominios de transmembrana hidroíóbicos dentro de las proteínas, en donde, después de la síntesis de ellas en el ribosoma, estos dominios permanecen en la membrana de fosfolípido pare ser atrapados en la membrana. En consecuencia, la evidencia del ADNc para la codificación de la proteína de membrana es proveída mediante la determinación de toda la secuencia de bases de un ADNc de longitud completa, seguida por la detección de dominios de transmembrana altamente hidrofóbicos en la secuencia de aminoácidos de la proteína codificada por dicho ADNc. jeíñvos de Ea Invención El objetivo de la presente invención consiste en proveer nuevas proteínas humanas que tienen dominios de transmembrana y ADNs que codifican para dichas proteínas, así como también células eucarioticas de transformación que son capaces de expresar dichos ADNcs. Como resultado de estudios intensos, los presentes inventores han tenido éxito en la clonación de ADNcs que codifican para proteínas que tienen dominios de transmembrana procedentes del banco de ADNc humano de longitud completa, realizando de esta manera la presente invención. En otras palabras, la presente invención proporciona ADNcs que codifican para proteínas humanas que tienen dominios de transmembrana, ejemplificados por ADNcs que contienen cualquiera de las secuencias de bases representadas por las Secuencias Nos. 1 y 2, así como también células eucarioticas de transformación que son capaces de expresar dichos ADNcs.

Breve Descripción die los Bilbnjos La Figura 1 es una ilustración del perfil de hidrofobicidad/hidrofilicidad de la proteína codificada por la clona HP00567. La Figura 2 es una ilustración del perfil de hidrofobicidad/hidrofilicidad de la proteína codificada por la clona HP00991.

Descripción Detallada de las Modalidades Preferidas Los ADNcs de la presente invención pueden ser clonados, por ejemplo, a partir de bibliotecas de ADNc de origen de célula humana. Estos ADNcs son sintetizados usando como modelo ARNs poli(A)+ extraídos de células humanas. Las células humanas pueden ser células liberadas del cuerpo humano, por ejemplo, por operación o pueden ser células cultivadas. Los ADNcs pueden ser sintetizados usando cualquier método seleccionado del método de Okayama- Berg [Okayama, H. and Berg, P. Mol. Cell. Biol. 2: 161-170 (1982)], el método de Gubler- Hoffman [Gubler, U. and Hoffman, J. Gene 25: 263-269 (1983)] y similares, pero se prefiere emplear el método capping [Kato, S. et al., Gene 150: 243-250 (1994)] como se ilustra en los Ejemplos, con el objeto de obtener una clona de longitud completa en una forma efectiva. La selección primaria de uno de los ADNcs que codifica para las proteínas humanas que tienen dominio(s) de transmembrana es realizada mediante la secuenciación de una secuencia de bases parcial de una clona de ADNc seleccionada aleatoriamente a partir de biblioteca de ADNc, secuenciación de la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de bases, y el íeconocimiento de ia presencia o ausencia de un sitio hidrofóbico en la región de la secuencia de aminoácidos con terminación N resultante. Enseguida, la selección secundaria es llevada a cabo mediante la determinación de la secuencia completa mediante el secuenciamiento y la expresión de proteína por la traducción in vitro. ">-, Los ADNcs de la presente invención están caracterizados por contener cualquiera de las secuencias de bases representadas por la Secuencia No. 1 y la Secuencia No. 2 o las secuencias cié bases representadas por la Secuencia No. 3 y la Secuencia No. 4. La Tabla 1 resume el número de clona (número HP), las células que proporcionan el ADNc, el número de bases totales del ADNc y el número de los residuos de aminoácido de la proteína codificada, para cada uno de los 0 ADNcs.

Tabla Número de Número Número de Número de Secuencia HP Células Bases Aminoácidos 1, 3 HP09567 PMA-U937 3570 476 2, 4 HP00991 Cáncer de estomago 819 185 Por consiguiente, las mismas clonas como los ADNcs de la presente invención pueden ser fácilmente obtenidas mediante tamizaje de las bibliotecas de ADNc construidas a partir de las líneas celulares humanas y tejidos humanos utilizados en la presente invención mediante el uso cíe una sonda de oligonucleótido sintetizada sobre la base de la secuencia de bases de ADNc descrita en cualquiera de las Secuencias Nos. 1 y 2. En general, el polimorfismo debido a la diferencia individual es frecuentemente observado en genes humanos. Por lo tanto, cualquier ADNc que sea sometido a inserción o deieción de uno o varios nucleótidos y/o substitución con otros nucleótidos en las Secuencias os. 1 a 4 caerá dentro del alcance de la presente invención. Los ADNcs de la presente invención incluyen fragmentos de ADNc (más de 10 bp) conteniendo cualquier secuencia de bases parcial en la secuencia de bases representada por las Secuencias Nos. 1 y 2 o en las secuencias de bases representadas por las Secuencias Nos. 3 y 4. También, fragmentos de ADN consistentes en una cadena de sentido y una cadena de anti-sentido caerán dentro de este alcance. Estos fragmentos de ADNc pueden ser usados como las sondas para ia diagnosis de genes. En el caso en el que uno de los ADNcs de la presente invención es expresado en células eiicariodcas. el ADNc de la presente invención puede ser expresado como una proteína de íransmembrana en la superficie de la membrana celular, cuando la región de traducción de dicho ADNc es sometida a recombinación a un vector de expresión para células eucarioticas que tengan un promotor, m a región de empalme, un sitio de adición de poli(A), etc., seguido de la introducción dentro de las células eucarioticas. El vector de expresión es ejemplificado por pKAI, PED6dpc2, pCDM8, pSVK3, pMSG, pSVL, pBK-CMV, pBK-RSV, vector EBV, pRS. pYES2, etc. Ejemplos de las células eucarioticas a ser utilizadas en general incluyen células de cuit-vos de mamíferos, tales como células renales de mono COS7, células de ovario de hámster Chino CHO, etc., levaduras de gemación, levaduras de escisión, levaduras de gusano de seda, células de huevecillo de Xenopus laevis, etc., pero pueden emplearse cualesquiera células eucarioticas, siempre y cuando ellas sean capaces de expresar los presentes ADNcs sobre la superficie de la membrana. El vector de expresión puede ser introducido dentro de las células eucarioticas por métodos conocidos en la técnica, tales como el método de la electroforación, el método del fosfato de potasio, el método de la liposoma, o el método del DEAE-dextrano, etc. Además de las actividades y usos descritos anteriormente, los polinucleótidos y proteínas de la presente invención pueden presentar uno o más de los usos o actividades biológicas (incluyendo aquellas asociadas con ensayos citados aquí) identificadas más adelante. Los usos o actividades descritas para las proteínas de la presente invención pueden ser proveídos mediante la administración o uso de tales proteínas o mediante la administración o uso de polinucleótidos que codifican para tales proteínas (tal como, por ejemplo, en terapias de genes o vectores apropiados para la introducción de ADN).

Usos y Utilidades en Investigación Los polinucleótidos proveídos por la presente invención pueden ser utilizados por la comunidad investigadora para varios propósitos. Los polinucleótidos pueden ser usados para expresar proteína recombinante para análisis, caracterización o uso terapéutico; como marcadores para tejidos en los que la proteína correspondiente es expresada preferencialmente ya sea constitutivamente o en una etapa particular de diferenciación o desarrollo del tejido o en estados enfermizos); corno marcadores de peso molecular en geles Southern; como marcadores o banderas de cromosomas (cuando se marcan) para identificar cromosomas o para mapec de posiciones de genes relacionados; para comparación con secuencias de ADN endógenas en pacientes para identificar desordenes genéticos potenciales; como sondas para hibridación y así descubrir nuevas secuencias de ADN relacionadas; como una fuente de información para derivar primarios PCR para rastreo genético; como una sonda para "substraer'" secuencias conocidas en el proceso de descubrimiento de nuevos polinucleótidos: para la selección y mareaje de oligómeros para unión a un "chip genético" u otro soporte, incluyendo para el examen de patrones de expresión; para generar anticuerpos de anti-protetna usando técnicas de inmunización de ADN; y como un antígeno para generar anticuerpos de anti-ADN o para estimular otra respuesta inmune. En donde el polinucleótido codifica para una proteína que se une o potencialmente se unirá a otra proteína (tal como, por ejemplo, en una interacción receptor-ligando), el polinucleótido también puede ser usado en ensayos de trampa por interacción (tal como, por ejemplo, aquel descrito en Guris et al., Cell 75: 791-803 (1993)) para identificar polinucleótidos que codifican la otra proteína con la cual ocurre la unión o para identificar inhibidores de la interacción de unión. Las proteínas proveídas por la presente invención pueden de manera similar ser usadas en ensayos para determinar actividad biológica, incluyendo en un panel de múltiples proteínas para tamizaje de alto rendimiento; para generar anticuerpos o para producir otra respuesta inmune; como un reactivo (incluyendo el reactivo marcador) en ensayos diseñados para determinar cuantitativamente niveles de la proteína (o su receptor) en fluidos biológicos; como marcadores para tejidos en los que la correspondiente proteína es preferencialmente expresada (ya sea constitutivamente o en una etapa particular de diferenciación o desarrollo de tejido o en un estado enfermizo); y, por supuesto, para aislar receptores o ligandos correlativos. En donde la proteína se une o potencialmente se une a otra proteína (tal como, por ejemplo, en una interacción receptor-ligando), la proteína puede ser usada para identificar la otra proteína con la cual ocurre la unión o para identificar inhibidores de la interacción de unión. Las proteínas involucradas en estas interacciones de unión también pueden ser utilizadas para tamizar pépüdos o pequeños inhibidores de moléculas o agonistas de la interacción de unión.

Cualesquiera de estas utilidades en investigación son capaces de ser desarrolladas en grado reactivo o en formato de juego (kit) para la comercialización como productos de investigación. Los métodos para realizar los usos enlistados anteriormente son bastante conocidos por aquellos capacitados en la técnica. Las referencias que describen tales métodos incluyen, sin limitación, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2"d ed. Cold Spring Harbor Laboralory Press, Sambrook, J., E.F. Fritsch and T. Maniatis eds., 1989, y "Methods in Enzymology: Guide to Molecular Cloning Techniques", Academic Press, Berger, S.L. and A.R. Kimmel eds., 1987.

Uses Nutricionales Los polinucleótidos y proteínas de la presente invención también pueden ser utilizados como fuentes o suplementos nutricionales. Tales usos incluyen, sin limitación, el uso como un suplemento de aminoácidos o proteínas, el uso como fuente de carbono, el uso como fuente de ÍS-V -4 nitrógeno y el uso como una fuente de carbohidratos. En tales casos la proteína o polinucleótido de la invención puede ser agregado a la alimentación de un organismo particular o puede ser administrado como una preparación sólida o líquida separada, tal como en ia forma de un polvo, pildoras, soluciones, suspensiones o cápsulas. En el caso de 5 microorganismos, la proteína o polinucleótido de la invención puede ser agregado al medio en o sobre el cual el microorganismo es cultivado.

Actividad de Citocina y de Proliferación/Diferenciación Celular Una proteína de la invención puede exhibir actividad de proliferación de célula, l o citocina (ya sea de inducción o inhibición) o de diferenciación celular (ya sea de inducción o inhibición), o puede inducir la producción de otras citocinas en ciertas poblaciones de células.

Muchos factores de proteínas descubiertos hasta la fecha, incluyendo todas las citocinas conocidas, han presentado actividad en uno o más ensayos de proliferación de células dependientes de factor, y de aquí que los ensayos sirven como una confirmación conveniente de actividad de citocina. La actividad de una proteína de la presente invención es evidenciada por uno de un número de ensayos rutinarios de proliferación de células dependientes de factor para líneas celulares que incluyen, sin limitación, 32D, DA2, DA1G, TÍO, B9, B9/1 1, BaF3, MC9/G, M+ (preB M+), 2E8, RB5, DAI, 123, T1165, HT2, CTLL2, TF-1, Mo7e y CMK. La actividad de la proteína de la invención puede, entre otros medios, ser medida por 0 los siguientes métodos: Los ensayos para proliferación de timocitos o células T incluyen, sin limitación, aquellos descritos en Current Protocols in Immunology, Ed. by J.E. Coligan, A.M. Kruisbeek, D.H. Marguiles, E.M. Shevach, W. Strober, Pub. Greene Publishing Associates and Wiley Interscience (Chapter 3, In Vitro assays for Mouse Lymphocyte Function 3.1-3.19; Chapter 7, 5 ímmunologic studies in Humans); Takai et al., J. Immunol. 137:3494-3500, 1986; Bertagnolli et al, J. Immunol. 145:1706-1712, 1990; Bertagnolli et al, Cellular Immunology 133:327- 341 , 1991; Bertagnolli, et al., J. Immunol. 149:3778-3783, 1992; Bowman et al., J. Immunol. 152: 1756-1761, 1994. Las pruebas para determinar producción de citocina y/o proliferación de células del 0 bazo, células del nodo linfático o timocítos incluyen, sin limitación, las descritas en: Po?yclonal T cell stimulation, Kruisbeek, A.M. & Shevach, E.M. In Current Protocols in Immunology. J.E.e.a. Coligan eds. Vol. 1 pp. 3.12.1-3.12.14, John Wiley & Sons, Toronto, 1994 : y Measurements of mouse and human Interferon ?, Schreiber, R.D. In Current Protocols in Lii unology, J.E.e.a. Coligan eds. Vol 1 p. 6.8.1-6.8.8, John Wiley & Sons, Toronto, 1994. Los ensayos para determinar la proliferación y diferenciación de células hematopoiéticas y linfopoiéticas incluyen, sin limitación, aquellos descritos en : Measurement of Human and Murine Interleukin 2 and Interleukin 4, Bottomly, K., Davis, L.S. and Lipsky, P.E. In Current Protocols in Immunology. J.E.e.a Coligan eds. Vol 1 pp. 6.3.1 -6.3.12, John Wiley and Sons, Toronto. 1991; deVries et al., J. Exp. Med. 173: 1205-121 1, 1991 ; Moreau et al., Nature 336:690-692, 1988; Greenberger et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 80:2931 -2938. 1983; Measurement of mouse and human interleukin 6 - Nordan, R. In Curren! Pr?tocols in Immunology. J.E.e.a Coligan eds. Vol 1 pp. 6.6.1-6.6.5, John Wiley and Sons, Toi-oiilo. 1991 ; Smith et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 83:1857-1861, 1986; Measurement of human Interleukin 1 1 - Bennett, F. Giannotti, J. Clark, S.C. and Turner, K.J. In Curren! Protocols in Immunology. J.E.e.a Coligan eds. Vol 1 pp. 6.15.1, John Wiley and Sons, Toronío. 1991. Measurement of mouse and human Interleukin 9 - Ciarletta, A. Giannotti, J., Clark, S.C. and Turner, K.J. In Current Protocols in Irnmunology. J.E.e.a Coligan eds. Vol 1 pp. 6.13.1 , John Wiley and Sons, Toronto. 1991. Los ensayos para determinar las respuestas de clonas de células T a antígenos (los cuales identificarán, entre otros, proteínas que afectan las interacciones de células APC-T así como los efectos de células T directas midiendo la proliferación y producción de citocina) ciuyen, sin limitación, aquellos descritos en: Current Protocols in Immunology, Ecl by J.?.e.a Coligan, A.M. Kruisbeek, D.H. Margulies, E.M. Shevach, W. Strober, Pub. Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience (Chapter 3, In Vitro assays for Mousc Lymphocyte Function; Chapter 6, Cytokines and their cellular receptors; Chapter 7, Irnmunologic studies in Humans); Weinberger et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 77:6091-6095. 1980; Weinberger et al., Eur. J. Immun. 1 1 :405-41 1 , 1981 ; Takai et al., J. Immunol. 137:3494-3500, 1986; Takai et al., J. Immunol. 140:508-512, 1988.

Actividad de Estimulación o Supresión Inmunológica Una proteína de la presente invención puede también exhibir actividad de estimulación inmunológica o de supresión de inmunológica, incluyendo sin limitación las actividades para las cuales se han descrito aquí ensayos. Una proteína puede ser útil en el tratamiento de varias deficiencias y desórdenes inmunológicos (incluyendo la inmunodeficiencia combinada severa (SCID)), por ejemplo, en la regulación (hacia arriba o hacia abajo) del crecimiento y proliferación de linfocitos T y/o B, así como efectuar la actividad citolítica de células NK y otras poblaciones de células. Estas deficiencias inmunológicas pueden ser genéticas o de causa viral (por ejemplo, HIV) así como también por infecciones bacterianas o por hongos, o pueden resultar de desórdenes autoinmunológicos. Más específicamente, las enfermedades infecciosas causadas por virus, bacterias, hongos u otra infección pueden ser tratadas usando una proteína cíe la presente invención, incluyendo infecciones por HIV, virus de hepatitis, virus de herpes, micobacíerias, lesmania spp, malaria spp y diversas infecciones por hongos como la candidiasis. Por supuesto, en este sentido, una proteína de la presente invención también puede ser útil en donde generalmente fuese indicado reforzar el sistema inmunológico, por ejemplo, en el tratamiento del cáncer. Los desórdenes autoinmunológicos que pueden ser tratados usando una proteína de la presente invención incluyen, por ejemplo, enfermedad de tejido conectivo, esclerosis múltiple, lupus eriíromatoso sistémico, artritis reumatoidea, inflamación pulmonar autoinmune, síndrome de Guillain-Barre, tiroiditis autoinmune, diabetes meilitus dependiente de insulina, miastenia gravis, enfermedad de injerto versus huésped y enfermedad de inflamación de ojos por autoinmunidad. Dicha proteína de la presente invención también pude ser útil en el tratamiento de reacciones y condiciones alérgicas, tales como el asma (particularmente asma alérgica) y otros problemas respiratorios. Otras condiciones, en las que se desea supresión inmunológica (incluyendo, por ejemplo, trasplante de órganos) también pueden ser tratadas usando una proteína de la presente invención. El uso de las proteínas de la invención también puede ser posible para respuestas inmunes, en un número de formas. La hiporegulación puede estar en la forma de inhibición o bloqueo de una respuesta inmune ya en curso, o puede involucrar la prevención de la inducción de una respuesta inmune. Las funciones de células T activadas pueden ser inhibidas mediante la supresión de respuestas de células T o induciendo la tolerancia específica en células T, o ambas. La inmunosupresión de respuestas de células T es generalmente un proceso activo, no antígeno-específico, el cual requiere de exposición continua de las células T al agente de supresión. La tolerancia, que involucra la inducción de no-respuesta o anergia en células T, es susceptible de distinción a partir de la inmunosupresión porque es generalmente específico a antígeno y persiste después de que ha terminado la exposición al agente creador óe tolerancia. Operacionalmente, la tolerancia puede ser demostrada por la falta de una respuesta de célula T bajo re-exposición a un antígeno específico en la ausencia del agente creaaor de tolerancia. La hiporegulación o prevención de una o más funciones antígenas (incluyendo sin limitación funciones de antígeno de linfocito B (tal como, por ejemplo, B7)), por ejemplo, previniendo la síntesis de linfocina de alto nivel mediante células T activadas, será útil en situaciones de transplantes de tejido, piel y órganos y en enfermedad de injerto versus huésped (GVHD). Por ejemplo, el bloqueo de la función de células T debería resultar en la destrucción reducida de tejido en transplantes de tejido. Típicamente, en transplantes de tejido, el rechazo del íransplante es iniciado a través del reconocimiento como extraño por las células T, seguido por una reacción inmune que destruye el transplante. La administración de una molécula que inhiba o bloquee la interacción de un antígeno de linfocito B7 con su(s) ligando(s) natural(es) en células inmunes (tales como una forma monomérica soluble de un péptido que tiene actividad B7-2 sola o en conjunto con una forma monomérica de un péptido que tiene una actividad de otro antígeno de linfocito B (por ejemplo, B7-1, B7-3) o anticuerpo de bloqueo), anees del íransplante puede conducir a la unión de la molécula al (los) ligando(s) natural (es) en las células inmunes sin la transmisión de la correspondiente señal co-estimulante. El bloqueo de ia función antígeno del linfocito B en este caso previene la síntesis de citocina por células inmunes, tales como células T, y así actúa como un inmunosupresor. Más aún, la falta de co-estimuiación también puede ser suficiente para anergizar las células T, induciendo de esta forma tolerancia en un sujeto. La inducción de tolerancia de larga duración por reactivos de bloqueo de antígeno de linfocito B puede evitar la necesidad de administración repetida de estos reactivos de bloqueo. Para lograr suficiente inmunosupresión o tolerancia en un sujeto, puede también ser necesario bloquear la función de una combinación de antígenos de linfocito E. La eficacia de reactivos de bloqueo particular en la prevención de un rechazo del trapsplante de un órgano o GVHD puede ser evaluada usando modelos animales que sean capaces de predecir la eficacia en humanos. Ejemplos de sistemas apropiados que puedan ser usados incluyen injertos cardiacos alogeneicos en ratas e injertos de células isleta, pancreáticas enogenéicas en ratones, ambas de las cuales han sido usadas para examinar los efectos Inmunosupresores de proteínas de fusión CTLA4Ig in vivo como se describe en Lenschow et el., Science 257:789-792 (1992) y Turka et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 89: 1 1 102-1 1 105 ( 1992). Además, pueden usarse modelos de murino de GVHD (ver Paul de., Fundamental ímmunology, Raven Press, New York, 1989, pp. 846-847 para determinar el efecto de bloqueo de ia función antígeno de linfocito B in vivo en el desarrollo de esa enfermedad. El bloqueo de la función antígeno también puede ser terapéuticamente útil para el tratamiento de enfermedades autoinmunes. Muchos desórdenes autoinmunes son el resultado de la activación inapropiada de células T que son reactivas contra el mismo tejido y la cual promueve la producción de citocinas y auto-anticuerpos involucrados en la patología de las enfermedades. La prevención de la activación de células T autoreactivas puede reducir o eliminar síntomas de la enfermedad. La administración de reactivos que bloquean la coestimulación de células T rompiendo las interacciones receptopligando de los antígenos de linfocitos B, puede utilizarse para inhibir la activación de células T y prevenir la producción de autoanticuerpos o citocinas derivadas de células T que pueden estar involucradas en el proceso enfermizo. Adicionalmente, los reactivos de bloqueo pueden inducir la tolerancia específica al antígeno, de células T autoreactivas que podría conducir al alivio de larga duración ele la enfermedad. La eficacia de los reactivos de bloqueo en la prevención o mejoramiento de los desórdenes autoinmunes puede ser determinada usando un número de modelos de animal bien caracterizados de enfermedades autoinmunes humanas. Los ejemplos incluyen encefalitis autoinmune experimental de murino, eritomatosis de lupus sistémica en ratones MRL/lpr/lpr o ratones NZB híbridos, artritis de colágeno autoinmune de murino, diabetes meilitus en ratones NOD y ratas BB, y miastenia gravis experimental de murino (ver Paul ed., Fundamental Immunology, Raven Press, New York, 1989, pp. 840-856). La sobreregulación de una función antígeno (preferiblemente una función antígeno de linfocito B), como un medio de sobre regular respuestas inmunes, también puede ser útil en terapias. Las sobreregulación de respuestas inmunes puede ser en la forma de mejorar una respuesta inmune existente o provocar una respuesta inmune inicial. Por ejemplo, el mejorar una respuesta inmune a través de la estimulación de la función antígeno de linfocito B puede ser útil en casos de infección viral. Además, enfermedades virales sistémicas tales como la fi-B m influenza, et resfriado común y la encefalitis podrían ser aliviadas mediante la administración sistémica de formas estimulantes de antígenos de linfocitos B. Alternativamente, las respuestas inmunes anti -virales pueden ser mejoradas en un pací eme infectado mediante la remoción de células T del paciente, coestimulando las células T in vitro con APCs pulsadas de antígeno viral ya sea expresando un péptido de la presente invención o conjuntamente con una forma estimulante de un péptido soluble de la presente invención y reiníroduciendo las células T activadas in vitro dentro del paciente. Otro método para mejorar las respuestas inmune anti-virales consistiría en asilar células infectadas de un paciente, transfectarlas con un ácido nucleico que codifica para una proteína de la presente invención como se describió aquí, de manera que las células expresen toda o una parte de la pro teína sobre su superficie, y reintroducir las células transfectadas dentro del paciente. Las células infectadas serían ahora capaces de entregar una señal co-estimulante a, y de esta forma activar, las células T in vivo. En otra aplicación, la sobreregulación o mejoramiento de la función antígeno (preferiblemente función antígeno de linfocitos B) podría ser útil en la inducción de inmunidad tumoral. Las células de tumor (por ejemplo, sarcoma, melanoma, linfoma, leucemia, neuroblastoma, carcinoma) transfectadas con un ácido nucleico que codifica para cuando menos un péptido de la presente invención pueden ser administradas a un sujeto para superar la tolerancia especifica al tumor en el sujeto. Si se desea, las células de tumor pueden ser transfectadas para expresar una combinación de péptidos. Por ejemplo, las células de tumor obtenidas de un paciente pueden ser transfectadas ex vivo con un vector de expresión que dirige la expresión de un péptido que tiene actividad similar a B7-2, solo o en combinación con un péptido que tiene actividad similar a B7-1 y/o actividad similar a B7-3. Las células tumorales transfectadas son regresadas al paciente para que resulte en la expresión de los péptidos sobre la superficie de las células transfectadas. Alternativamente, pueden usarse técnicas de terapia de genes para señalar como objetivo una célula de tumor para transfecciói" in vivo. La presencia del péptido de la presente invención, que tiene la actividad de un(os) antígeno(s) de linfocitos B sobre la superficie de las células de tumor provee la señal de coestimulación necesaria para que las células T induzcan una respuesta inmune mediada por células T contra las células de tumor transfectadas. Además, las células de tumor que carecen de moléculas MHC clase I o MH£?jclase 11, o que no re-expresan suficientes cantidades de moléculas MHC clase I o MHC clase II, pueden ser transfectadas con ácido nucleico que codifica para todo o una porción de (por ejemplo, una porción truncada de dominio cucplásmica) de una proteína de cadena a de MHC clase I y proteína de microglobulina ß2 o una proteína de cadena a de MHC clase II y una proteína de cadena ß de MHC clase II para expresar de esía forma proteínas MHC clase I o MHC clase II sobre la superficie de la célula. La expresión de la MHC clase I o clases II apropiada, en conjunto con un péptido que tiene la actividad ele un antígeno de linfocito B (por ejemplo, B7-1, B7-2, B7-3) induce una respuesta inmune mediada por células T contra la célula de tumor transfecíada. Opcionalmente, un gene que codifica una construcción antisentido que bloquea la expresión de una proteína asociada MHC clase II, tal como la cadena constante, también puede ser cotransfectado con un ADN que codifica para un péptido que tiene la actividad de antígeno de linfocito B para promover la presentación de antígenos asociados a tumor e inducir inmunidad específica a tumor. Así, la inducción de una respuesta inmune mediada por células T en un sujeto humano puede ser suficiente para superar tolerancia específica a tumor en el sujeto. La actividad de una proteína de la invención también puede, entre otros medios, ser medida por ios siguientes métodos: Los ensayos adecuados para determinar citotoxicidad de esplenocitos o timocitos incluyen, sin limitación, aquellos descritos en Current Protocols in Immunology, Editado por J.E. Coligan, A.M. Kruisbeek, D.H. Margulies, E.M. Shevach, W. Strober, Pub. Greene Fublishing Associates and Wiley-Interscience (Chapter 3, In Vitro assays for Mouse Lymphocyíe Function 3.1.-3.19; Chapter 7, Immunologic studies in Humans); Herrmann et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 78:2488-2492, 1981; Herrmann et al., J. Immunol. 128:1968-1974, 1982, Handa et al, J. Immunol. 135-1564-1572, 1985; Takai et al., J. Immunol. 137:3494-3500, 1986; Takai et al., J. Immunol. 140:508-512. 1988; Herrmann et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 78:2488-2492, 1981; Herrmann et al., J. Immunol. 128:1968-1974, 1982; Handa eí al., J. Immunol. 135:1564-1572, 1985; Takai et al., J. Immunol. 137:3494-3500, 1986; Bowrnan et al., J. Virology 61:1992-1998; Takai et al., J. Immunol. 140:508-512, 1988; Bertagnolli et al., Cellular Immunology 133:327-341, 1991; Brown et al., J. Immunol. 153:3079-3092, 1994.

Los ensayos para determinar las respuestas de inmunoglobulina dependiente de células T y conmutación isotipo (las cuales identificarán, entre otras, a las proteínas que modulan respuestas de anticuerpos dependientes de células T y que afectan perfiles Thl/Th2) incluyen. sin limitación, aquellos descritos en: Maliszewski, J. Immunol. 144:3028-3033, 1990; y 5 Assays for B cell function: In vitro antibody production, Mond, J.J. and Brunswick, M In Current Protocols in Immunology. J.E.e.a. Coligan eds. Vol 1 pp. 3.8.1-3.8.16, John Wiley and Sons, Toronto. 1994. Las pruebas mezcladas de reacción de linfocitos (MLR) (las cuales identificarán, entre otras, proteínas que generan predominantemente respuestas de Thl y CTL) incluyen, sin l o limitación, aquellas descritas en Current Protocols in Immunology, Editado por J.E. Coligan, A.M. Kruisbeek, D.H. Margulies, E.M. Shevach, W. Strober, Pub. Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience (Chapter 3, In Vitro assays for Mouse Lymphocyte Function 3 -3.19; Chapter 7, Immunologic studies in Humans); Takai et al., J. Immunol. 137:3494-3500, 1986; Takai et al., J. Immunol. 140:508-512, 1988; Bertagnolli et al., J. immunol. 149:3778-3783, 1992. Ensayos dependientes de células dendríticas (los cuales identificarán, entre otras, proteínas expresadas por células dendríticas que activan células T naturales) incluyen, sin limitación, aquellos descritos en: Guery et al., J. Immunol. 134:536-544, 1995; Inaba et al . Journal of Experimental Medicine 173:549-559, 1991 ; Macatonia et al., Journal of 0 Immunology 154:5071-5079, 1995; Porgador et al., Journal of Experimental Medicine 132:255-260, 1995; Nair et al., Journal of Virology 67:4062-4069, 1993; Huang et al., Science 264 :961 -965. 1994 ; Macatonia et al., Journal of Experimental Medicine 169: 1255-1264, 1989, Bha awaj et al., Journal of Clinical Investigation 94:797-807, 1994; e Inaba et al., Journal of Experimental Medicine 172:631-640, 1990. 5 Las pruebas para determinar la sobrevivencia/apoptosis de linfociíos (las cuales identificarán, eníre otras, las proteínas que previenen la apoptosis después de la inducción superaníígena y las proteínas que regulan la homeóstasis de linfocitos) incluyen, sin limitación, squellas descritas en: Darzynkiewicz et al., Cytometry 13:795-808, 1992, Gorczyca et al., Leukemia 7:659-670, 1993 Gorczyca et al, Cáncer Research 53 : 1 45-1951. 0 1993; líoh et al., Cell 66:233-243, 1991 ; Zacharchuk, Journal of Immunology 1 5:4037-4045, £¿ SU? . ? ßßU ?5 t 19^0. Zamai et al., Cytometry 14:891-897, 1993; Gorczyca et al, International Journal of Oncotogy 1 :639-648, 1992. Las pruebas para las proteínas que influencian etapas tempranas de desarrollo y confinamiento de células T incluyen, sin limitación, aquellas descritas en Antica et al., Blood 84; 111-117, 1994; Fine et al., Cellular Immunology 155:111-122, 1994; Galy et al., Blood 85:2770-2778, 1995; Toki et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 88:7548-7551, 1991.

Actividad de Regulación de Hematopoiesis Una proteína de la presente invención puede ser útil en la regulación de la hemaíopoiesis y, en consecuencia, en el tratamiento de deficiencias de células mieloides o linfoides. Aún una actividad biológica marginal en apoyo de células formadoras de colonias o ae líneas celulares dependientes de factor, indica envolvimiento en la regulación de hematopoiesis, esto es, en el soporte del crecimiento y la proliferación de células progenitoras entroides solas o en combinación con otras citocinas, indicando utilidad de esta manera, por ejemplo, en el tratamiento de diversas anemias o para usarse en conjunto con irradiación/quimioterapia para estimular la producción de precursores eritroides y/o células eritroides; en soportar el crecimiento y proliferación de células mieloides tales como los granulocitos y monocitos/macrófagos (esto es, actividad CSF tradicional) útiles, por ejemplo, en conjunto con la quimioterapia para prevenir o tratar la mielo-supresión consecuente; en soportar el crecimiento y proliferación de megacariocitos y consecuentemente de plaquetas, permitiendo de esta forma la prevención o tratamiento de diversos desordenes de plaquetas tales como la írombocitopenia, y en general para utilizarse en lugar o en forma complementaria a transfusiones de plaquetas; y/o en sostener el crecimiento y proliferación de células progenituras hematopoiéticas que sean capaces de madurar a todas y cada una de las células hematopoiéticas anteriormente mencionadas y por lo tanto encuentran utilidad terapéutica en diversos desordenes de células progenitoras (tales como aquellos usualmente tratados con transplantes, incluyendo, sin limitación, anemia aplástica y hemoglobinuria nocturna paroxismal) así como en el repoblamiento de la división de células progenituras que resulta de la irradiación/quimioterapia, ya sea in vivo o ex vivo (esto es, en conjunto con el transpíante de médula ósea o con el transplante de células progenitoras periféricas (homologas o heterólogas)) como células normales o genéticamente manipuladas por terapia de genes.

La actividad de una proteína de la invención puede, entre otros medios, ser medida pollos siguientes métodos: Pruebas apropiadas para determinar la proliferación y diferenciación de varias líneas he atopoié ticas se han citado anteriormente. Las pruebas para la diferenciación de células progenitoras embrionarias (las cuales identificarán, entre otras, proteínas que influencian la hematopoiesis de la diferenciación embrionaria) incluyen, sin limitación, aquellas descritas en Johansson et al. Cellular Biology 15:141-151, 1995; Keller et al., Molecular and Cellular Biology 13:473-486, 1993: McClenahan et al., Blood 81 :2903-2915, 1993. Las pruebas para determinar la supervivencia y diferenciación de células progenitoras (que identificarán, entre otras, proteínas que regulan la linfo-hematopoiesis) incluyen, sin limitación, aquellas descritas en: Methylcellulose colony forming assays, Freshney, M.G. ín Culture of Hematopoietic Cells, R.I. Freshney, et al eds. Vol pp 265-268, Wiley-Liss, Inc.. New York, NY 1994; Hirayama et al., Proc Nati. Acad. Sci. USA 89:5907-591 1, 1992; Primitive hematopoietic colony forming cells with high proliferative potential, McNiece, I.K. y Briddell, R.A. In Culture of Hematopoietic Cells. R.I. Freshney, et al. eds. Vol pp. 23-39, Wiley-Liss, Inc. New York, NY 1994; Neben et al., Experimental Hematology 22:353-359. 1994; Cobblestone área forming cell assay, Ploemacher, R.E. In Culture of Hematopoietic Cells. R.I. Freshney et al., eds. Vol pp. 1-21, Wiley-Liss, Inc. New York, NY 1994; Long temí bone marrovv cultures in the presence of stromal cells, Spooncer, E., Dexter, M. and Alien, T. ín Culture of Hematopoietic Cells. R.I. Freshney et al., eds. Vol pp. 163-179, Wiley-Liss, Inc., New York, NY 1994; Long term culture initiating cell assay, Sutherland, H.J. In Culture of Hernatopietic Cells, R.I. Freshney et al, eds. Vol pp. 139-162, Wiley-Liss, Inc. New York, NY. 1994.

Actividad de Crecimiento de Tejido Una proteína de la presente invención también puede tener utilidad en composiciones usadas para el crecimiento o regeneración de tejido óseo, de cartílago, de tendón, de ligamento y/o de nervio, así como para curar heridas y reparación o reemplazo de tejido, y en el tratamiento de quemaduras, incisiones y úlceras.

Una proteina de la presente invención, la cual induce el crecimiento de cartílago y/o hueso en circunstancias en las que normalmente no hay hueso formado, tiene aplicación en la curación de fracturas óseas y daños o defectos a cartílago en humanos y otros animales. Dicha preparación empleando una proteína de la invención puede tener uso profiláctico en la reducción tanto de fracturas cerradas como abiertas y también en la fijación mejorada de uniones artificiales. La formación de hueso nuevo inducida por un agente osteogénico contribuye a ia reparación de defectos craneofaciales congénitos, inducidos por traumatismo, o inducidos por resección oncológica, y también es útil en cirugía plástica cosmética. Una proíeína de esta invención también puede ser útil en el tratamiento de enfermedad periodeníal y en oíros procesos de reparación de dientes. Tales agentes pueden proveer un ambiente para atraer células formadoras de hueso, estimular el crecimiento de células formadoras de hueso o inducir la diferenciación de progenitores de células formadoras de hueso. Una proteína de la invención también puede ser útil en el tratamiento de osteoporosis u osteoartritis , tal como a través de la estimulación de la reparación de hueso y/o cartílago o mediante el bloqueo de la inflamación o procesos de destrucción de tejido (actividad colagenasa, actividad osteoclástica, etc.) mediada por procesos inflamatorios. Otra categoría de actividad de regeneración de tejido que puede ser atribuible a la proteína de la presente invención es la formación de tendón/ligamento. Una proteína de la presente invención, la cual induce tejido similar a tendón/ligamento u otra formación de tejido en circunstancias en las que dicho tejido no es normalmente formado, tiene aplicación en la curación de desgarres de tendón o ligamento, deformidades y otros defectos de tendón o ligamento en humanos y otros animales. Dicha preparación empleando una proteína inductora de tejido similar a tendón/ligamento puede tener uso profiláctico en la prevención de daños a tejido de tendón o ligamento, así como en el uso para fijación mejorada de tendón o ligamento a hueso u otros tejidos, y en la reparación de defectos de tejido de tendón o ligamento. La formación de tejido nuevo de tendón/ligamento, inducida por una composición de la presente invención contribuye a la reparación de defectos de tendón o ligamento congénitos, inducidos por traumatismo o de otro origen, y también es útil en cirugía plástica cosmética para la fijación o reparación de tendones o ligamentos. Las composiciones de la presente invención pueden proveer un ambiente para atraer células formadoras de tendón o ligamento, estimular el crecimiento de células formadoras de tendón o ligamento, inducir la diferenciación de orogenitores de células formadoras de tendón o ligamento, o inducir el crecimiento de células o progenitores de tendón/ligamento ex vivo para retorno in vivo para efectuar ia reparación de rejido. Las composiciones de la invención también pueden ser útiles en el tratamiento de tendoniíis, síndrome de túnel carpiano y otros defectos de tendón o ligamento. Las composiciones también pueden incluir una matriz apropiada y/o un agente secuestrante como un portador como se conoce bien en la técnica. La proteína de la presente invención también puede ser útil para la proliferación de células nerviosas y para la regeneración de tejido nervioso y del cerebro, esto es, para cl tratamiento de enfermedades y neuropatías del sistema nervioso central o periférico, así como de desordenes mecánicos y traumáticos que involucren la degeneración, muerte o lesiones a células nerviosas o al tejido nervioso. Más específicamente, una proteína puede ser empleada en el tratamiento de enfermedades del sistema nervioso periférico, tales como daños al nervio periférico, neuropatía periférica y neuropatías localizadas, y enfermedades del sistema nervioso central, tales como la enfermedad de Alzheimer, Parkinson, Huntingíon, esclerosis lateral amiotrópica y el síndrome de Shy-Drager. Condiciones adicionales que pueden ser tratadas de acuerdo con la presente invención incluyen desordenes mecánicos y traumáticos. tales como desordenes de la médula espinal, lesiones de la cabeza y enfermedades cerebrovasculares tales como ataque apopléjico. También pueden ser tratables usando una proteína de ia presente invención neuropatías periféricas que resultan de quimioterapia u otras terapias médicas. Las proteínas de la invención también pueden ser útiles para promover el mejor y más rápido cien-e de heridas sin sanar, incluyendo sin limitación, úlceras por presión, úlceras asociadas con insuficiencia vascular, heridas por traumatismo y por cirugía, y similares. Se espera que una proteína de la presente invención también puede exhibir actividad para la generación o regeneración de otros tejidos tales como tejidos de órganos (incluyendo. por ejemplo, páncreas, hígado, intestino, riñon, piel, endotelio), de músculo (suave, esquelético o cardiaco) y vascular (incluyendo endotelio vascular), o para promover el crecimiento de células que comprenden dichos tejidos. Parte de los efectos deseados puede ser mediante la inhibición o modulación de la cicatrización fibriótica para permitir que el tejido normal se regenere. Una proteína de la invención también puede presentar actividad angiogénica. ^4¿ "s-á?*^ Una proteína de la presente invención también puede ser útil para la protección o regeneración del intestino y para el tratamiento de la fibrosis de pulmón o hígado, daño por reperíusión en varios tejidos y condiciones resultantes de daño sistémico de citocina. Una oro teína de la presente invención también puede ser útil para promover o inhibir la diferenciación de tejidos descritos anteriormeníe de tejidos o células precursoras; o para inhibir el crecimiento de los íejidos descritos anteriormente. La actividad de una proteína de la invención puede, entre otros medios, ser medida pollos siguientes métodos: Los ensayos para determinar la actividad de generación de tejido incluyen, sin limitación, aquellos descritos en la Publicación de Patente Internacional No. WO95/16035 (hueso, cartílago, tendón); Publicación de Patente Internacional No. WO95/05846 (nervio, nervioso); Publicación de Patente Internacional No. WO91/07491 (piel, endotelio). Los ensayos para determinar actividad de curación de heridas incluyen, sin limitación, aquellos descritos en: Winter, Epidermal Wound Healing, pps. 71-1 12 (Maibach, Hl and Rovee, DT, eds.) Year Book Medical Publishers, Inc., Chicago, según fue modificado por Eaglslein and Mertz, J. Invest. Dermatol. 71 :382-84 (1978).

Actividad de Activina/Inhibina Una proteína de la presente invención también puede exhibir actividades relacionadas con activina o inhibina. Las inhibinas se caracterizan por su capacidad de inhibir la liberación de la hormona estimulante del folículo (FSH), mientras que las adivinas están caracterizadas por su capacidad de estimular la liberación de la hormona estimulante del folículo (FSH). Pollo tanto, una proteína de la presente invención, sola o en heterodímeros con un miembro de la familia alfa de inhibinas, puede ser útil como un anticonceptivo basado en la capacidad de inhibir o disminuir la fertilidad en mamíferos hembras y disminuir la espermatogénesis en mamíferos machos. La administración de cantidades suficientes de otras inhibinas puede inducir la infertilidad en estos mamíferos. Alternativamente, la proteína de la invención, como un homodímero o como un heterodímero con otras subunidades de proteína del grupo de inhibinas beta, puede ser útil como un terapéutico inductor de la fertilidad, basado en la capacidad de las moléculas de activina en la estimulación de la liberación de FSH de células de la pituitaria anterior. Ver, por ejemplo, la Patente de los E.U.A. No. 4,798,885. Una 'rm; ' proteína de la presente invención también puede ser útil para adelantar el comienzo de la fertilidad en mamíferos sexualmente inmaduros, con el propósito de incrementar el ciclo de desempeño productivo de animales domésticos tales como vacas, ovejas y cerdos. La actividad de la proíeína de la invención puede, entre otros medios, ser medida pollos siguientes métodos: Los ensayos para determinar la actividad de activina inhibina incluyen, sin limitación, aquellos descritos en Vale et al, Endocrinology 91 :562-572, 1972; Ling et al., Nature 321 :779-782, 1986; Vale et al., Nature 321:776-779, 1986; Masón et al, Nature, 318:659-663, 1985; Forage et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 83:3091-3095, 1986.

Actividad Quimiotáctica/Quimiocinética Una proíeína de la presente invención puede tener actividad qumiocinética o quimioíáctica (por ejemplo, actuar como una quimiocina) para células de mamífero, incluyendo, por ejemplo, monocitos, fibroblastos, neutrófilos, células T, células mast, eosinófiías, y células epiteliales y/o endoteliales. Las proteínas quimiocinéticas y quimioíácticas pueden utilizarse para movilizar o atraer una población de células deseadas a un siíio de acción deseado. Las proíeínas quimiotácticas o quimiocinéticas proveen ventajas particulares en el tratamiento de heridas y otras lesiones de tejidos, así como en el tratamiento de infecciones localizadas. Por ejemplo, la atracción de linfocitos, monocitos o neutrófilos hacia tumores o sitios de infección puede resultar en respuestas inmunes mejoradas contra el tumor o agente infeccioso. Una proteína o péptido tiene actividad quimioíáctica para una población celular particular sí ésta puede estimular, directa o indirectamente, la orientación o movimiento dirigido de dicha población celular. Preferiblemente, la proteína o péptido tiene la capacidad de estimular directamente el movimiento dirigido de células. El que una proteína particular tenga actividad quimiotácíica para una población de células puede ser fácilmente determinado empleando dicha proteína o péptido en cualquier ensayo conocido para quimiotaxis celular. La actividad de una proteína de la invención puede, entre otros medios, ser medida pollos siguientes métodos: Los ensayos para determinar la actividad quimiotáctica (que identificarán proteínas que inducen o previenen la quimiotaxis) consisten en ensayos que miden la capacidad de una ***»rt- proteína para inducir la migración de células a íravés de una membrana así como también la capacidad ele una proteína para inducir la~ ? ¡^?ón de una población de células a otra j E Coligan, A.M. Kruisbeek, D.H. Margulies, E.M. Shevach, W. Strober, Publicado por Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience (Chapter 6.12, Measurement of alpha and beta Chemokines 6.12.1-6.12.28; Taub et al., J. Clin. Invest. 95:1370-1376, 1995; Lind eí al., APMIS 103:140-146, 1995; Muller et al., Eur J. Immunol. 25; 1744-1748; Gruber et al , J. Oflmmunol. 152:5860-5867, 1994; Johnston et al., J. oflmmunol. 153:1762-1768, 1994.

Actividad Hemosíáíica y Trombolítica Una pro teína de la invención también puede presentar actividad hemostática o trornbolítica. Como resultado de esto, se espera que dicha proteína sea útil en el tratamiento de diveisos desordenes de la coagulación (incluyendo desordenes hereditarios, tales como hemofilias) o para mejorar la coagulación y otros eventos hemostáíicos en el tratamiento de heridas íesul tantes de traumas, cirugías u otras causas. Una proteína de la invención íambién puede ser útil para disolver o inhibir la formación de trombosis y para el tratamiento y prevención de condiciones resultantes de ella (tales como, por ejemplo, infarto de los vasos del sistema nervioso central o cardiaco (e. g., ataque). La actividad de una proteína de la presente invención puede, entre otros medios, ser medida por los siguientes métodos: Los ensayos para determinar la actividad hemostática y trombolítica incluyen, sin limitación, aquellos descritos en: Linet eí al., J. Clin. Pharmacol. 26:131-140, 1986; Burdick eí ai., Thiombosis Res. 45:413-419, 1987; Humphrey eí al., Fibrinolysis 5:71-79 (1991); Schaub, F.osíaglandins 35:467-474, 1988.

Actividad de Receptor/Ligando Una proteína de la preseníe invención íambién puede demostrar actividad como receptores, ligandos o inhibidores de receptores o agonistas de interacciones de receptor/ligando. Los ejemplos de tales receptores y ligandos incluyen, sin limitación, receptores de citocinas y sus ligandos, receptores de quinasas y sus ligandos, receptores de fosfatases y sus ligandos, receptores involucrados en interacciones de célula-célula y sus ligandos (incluyendo, sin limitación, molóc^^Ké adhesión celular (tales como selectinas, íníegrinas y sus ligandos) y parejas recep|| flBSb involucradas en presentación de antígeno, reconocimiento de antígeno y desarrollo aS"t:espuestas inmunes celulares y humorales). Los receptores y ligandos también son útiles para el tamizaje de péptido potencial o inhibidores de moléculas pequeñas de la interacción relevante receptor/ligando. Una proteína de la presente invención (incluyendo, sin limitación, fragmentos de receptores y ligandos) puede por ella misma ser útil como inhibidor de las interacciones de receptor/ligando. La actividad de una proteína de la presente invención puede, entre otros medios, ser medida por los siguientes métodos: Las pruebas adecuadas para determinar actividad de receptor-ligando incluyen, sin limitación las descritos en: Current Protocols in Immunology, editado por J.E. Coligan, A.M. Kruisbeek, D.H. Margulies, E.M. Shevach, W. Strober, Pub. Greene Publishing Associates and V/iley-Interscience (Chapler 7.28, Measurements of Cellular Adhesión under staíic conditions 7.28.1-7.28.22), Takai eí al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 84:6864-6868, 1987; Bierer eí al., J. Exp. Med. 168:1145-1156, 1988; Rosensíein eí al, J. Exp. Med 169: 149-160 1989; Stoltenborg et al., J. Immunol. Methods 175:59-68, 1994; Stití eí al., Cell 80:661-670. 1995.

Actividad Anti-Inflamaíoria Las proteínas de la presente invención también pueden presentar actividad antiinflamatoria. La actividad anti-inflamatoria puede ser lograda proveyendo un estímulo a las células involucradas en la respuesta inflamatoria, inhibiendo o promoviendo las interacciones célula-célula (tal como, por ejemplo, la adhesión celular), inhibiendo o promoviendo la quimiotaxis de células involucradas en el proceso inflamatorio, inhibiendo o promoviendo la extravasación celular, o estimulando o suprimiendo la producción de otros factores que inhiben o promueven más direcíameníe una respuesta inflamatoria. Las proteínas que presentan dichas actividades pueden ser utilizadas para tratar condiciones inflamatorias (inckryendo condiciones crónicas o agudas) incluyendo, sin limitación, la inflamación asociada a infecciones (tales como el choque séptico, sepsis o el síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS)), daño por isquemia-reperfusión, mortalidad por endotoxina, substancia o material antígeno.

Actividad de Inhibición de Tumores A.den ás de las actividades descritas anteriormente para el traíamienío inmunológico o de prevención de íumores, una proteína de la presente invención puede exhibir otras actividades anti-íumores. Una proíeína puede inhibir el crecimiento de tumores directa o indirectamente (tal como, por ejemplo, vía ADCC). Una proteína puede presentar su actividad inhibitoria de tumores actuando sobre el tejido del tumor o el tejido precursor del tumor, inhibiendo la formación de los tejidos necesarios para sostener el crecimiento del tumor (tal corno, por ejemplo, inhibiendo la angiogénesis), causando la producción de otros factores, agentes o tipos de células que inhiben el crecimiento del tumor, o suprimiendo, eliminando o inhibiendo factores, agentes o tipos de células que promueven el crecimiento del tumor.

Otras Acíividades Una proteína de la invención también puede presentar una o más de las siguientes actividades o efecíos: inhibir el crecimiento, infección o función de, o exterminar, agentes infecciosos, incluyendo, sin limitación, bacterias, virus, hongos y otros parásitos; afectar (supresión o mejoramiento) características corporales, incluyendo, sin limitación, altura, peso, color de pelo, color de ojos, piel, proporción grasa/carne o pigmentación de otros tejidos, o tamaño o forma parcial del cuerpo (tal como, por ejemplo, aumento o disminución del pecho. cambios en la forma o configuración de huesos); afectar bioritmos o ciclos o ritmos circaclianos; afecíar la fertilidad de sujetos machos o hembras, afecíar el meíabolismo. caíabclismo, anabolismo, procesamiento, utilización, almacenamiento o eliminación de grasa, íípidos, proteínas, carbohidratos, vitaminas, minerales, cofactores u oíros factores o componentes nutrimentales de la dieta; afectar características del comportamiento, incluyendo, sin limitación, apetito, libido, estrés, percepción (incluyendo desordenes de la percepción), depresión (incluyendo desordenes depresivos) y comportamientos violentos; provisión de efectos analgésicos u oíros efectos reductores del dolor; promoción de la diferenciación y ae desórdenes hiperproliferativos (íales como, por ejemplo, la psoriasis); actividad similar a inmunoglobulina (íal como, por ejemplo, la capacidad de unirse a anlígenos o complementos); y ia capacidad de actuar como un antígeno en una composición de vacuna para elevar la respuesta inmune contra dicha proteína u otro material o entidad que sea reactivo de alguna forma con dicha proteína.

Ejemplos La presente invención es materializada con mayor deíalle por los siguientes ejemplos, pero esía modalidad no preíende resíringir la présenle invención. Las operaciones básicas y las reacciones de enzima con relación a la recombinación de ADN son llevadas a cabo de acuerdo con la literatura ["Molecular Cloning. A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboraíory. 1989]. A menos que se especifique oíra cosa, las enzimas de restricción y una variedad de enzimas de modificación a ser utilizadas fueron aquellas disponibles en TAKARA SHUZO. Las instrucciones del fabricante fueron usadas para las composiciones reguladoras así como para las condiciones de reacción, en cada una de las reacciones de enzima. La síntesis de ADNc fue llevada a cabo de acuerdo con la literatura [Kato, S. eí al., Gene 150: 243-250 (1994)]. (1) Preparación de ARN Polv(A + La línea celular de linfoma de hisíiocilo U937 (ATCC CRL 1593) estimulada con ésíer de forboí y tejidos de cáncer de estómago obtenidos por operación fueron usados como células de humano para extraer ARNms. La línea celular fue incubada medíante un procedimiento convencional. Después de que aproximadamente 1 g de células de humano fue homogeneizado en 20 ml de solución de tiocianato de guanidina 5.5 M, se preparó ARNm íoíal de acuerdo con la literatura [Okayarns, H. eí al., "Methods in Enzimology", vol. 164, Academic Press, 1987]. Este fue sorneíido a cromatografía en una columna de oligo(dT)-celulosa lavada con solución reguladora «^• ^s^^s^ís^»^ ae Tps-ácido clorhídrico 20 M (pH 7.6)fNaCl 0. 5 M, y EDTA 1 mM para obtener un ARN ?oly(A)t de acuerdo con la literatura at?tes mencionada.

Diez microgramos del ARN poli(Aj^tntes mencionado fueron disueltos en una solución reguladora ele Tris-ácido clorhídrico 100 mM (pH 8), fue agregada una unidad de fosfatasa alcalina de erigen bacteriano y libre de RNasa y la solución resultante se dejó reaccional- a 37 °C durante mía hora. Después la solución de reacción experimentó la extracción de fenol, seguida por precipitación de etanol, los granulos obtenidos fueron disueltos en una solución conteniendo acétalo de sodio 50 mM (pH 6), EDTA 1 mM, 2-mercaptoetanol al 0.1% y Triíon X-100 al 0.01%. A esío le fue agregada una unidad de una pirofosfaíasa acida originaria de íabaco (?piceníre Technologies) y la solución resultante en un volumen toíal de 100 µl fue dejada que reaccionara a 37 °C duraníe una hora. Después de que la solución de reacción experimentó la exíracción con fenol seguida por la precipitación con etanol, los granulos así obtenidos fueron disuelíos en agua para obtener una solución de ARN poli(A)+ decapado. El ARN poli(A)+ decapado y 3 nmol de un oligonucleóíido quimérico de ADN-ARN (5'-dG-dG-dG-dG-dA-dA-dT-dT-dC-dG-dA-G-G-A-3') fueron disueltos en una solución conteniendo solución reguladora de Tris-ácido clorhídrico 50 mM (pH 7.5), ATP 0.5 mM, MgC 5 mM, 2-mercaptoeíanol 10 mM y 25% de polietilenglicol, a lo cual se agregaron 50 unidades de ligasa de ARN T4 y la solución resultante en un volumen toíal de 30 µl fue dejada que reaccionara a 20 °C duraníe 12 horas. Después de que la solución de reacción experimentó la exíracción con fenol seguida por la precipilación con eíanol, los granulos así obtenidos fueron disuelíes en agua para obtener un ARN quimérico poli(A)+ oligo-caped. Después de que el vector pKAl desarrollado por los presentes inventores (Publicación Kokai de Patente Japonesa No. 1992-117292) fue digerido con Kpnl, una cola de aproximadamente 60 dT fue agregada usando una transferasa terminal. Un primario de vector a ser utilizado más adelante fue preparado mediante digestión de este producto con EcoRV para eliminar mía cola dT en un costado. Después de que 6 µg del ARN poli(A)+ oligo-caped quimérico, preparado con anterioridad, fuera recocido con 1.2 µg del primario vectorial, el producto resultaníe fue disuelto en una solución conteniendo solución reguladora de Tris-ácido clorhídrico 50 mM (pH 8.3), KCl 75 mM, MgCl2 3 mM, ditiotreitol 10 mM Y ífijjSfcS mM (dATP + dCTP + dGTP + dTTP), fueron agregadas 200 m idades de una tra HHH ??nversa (GIBCO-BRL), y la reacción en un volumen tola! de 20 µl se dejó correr a 42 ¡Krurante una hora. Después de que la solución de reacción experimentó la extracción con fenol seguida por la precipitación con etanol, los granulos obtenidos de esía forma fueron disueltos en una solución conteniendo solución reguladora de Tris-ácido clorhídrico 50 mM (pH 7.5), NaCl 100 mM, MgCl2 10 mM y ditiotreitol 1 mM. A esto se le agregaron 100 unidades de EcoRI y la solución resultante en un volumen toíal de 20 µl se dejó reaccionar a 37 °C durante una hora. Después de que la solución de reacción experimentó la extracción con fenol seguida por la precipitación con etanol, los granulos así obtenidos fueron disueltos en una solución conteniendo solución reguladora de Tris-ácido clorhídrico 20 mM (pH 7.5), KCl 100 mM, MgCl24 mM, (NH4)2S04 10 mM y 50 µg/ml de albúmina de suero bovino. A esto se le agregaron 60 unidades de una ligasa de ADN de Escherichia col/ y la mezcla resultante se dejó que reaccionara a 16 °C durante 16 horas. A la solución de reacción se agregaron 2 µl de dMTP 2 mM, 4 unidades de polimerasa I de ADN de Escherichia coli y 0.1 unidades de RNasa H de Escherichia coli, y la mezcla resultaníe se dejó reaccionar a 12 °C duraníe una hora y posteriormente a 22 °C durante una hora. Enseguida, la solución de la reacción de la síntesis del ADNc file usada para la transformación de Escherichia coli DH12S(GIBCO-BRL). La transformación fue llevada a cabo mediante el método de electroforación. Una parte del transformante fue asperjada sobre el medio de cultivo de agar 2xYT conteniendo 100 µg/ml de ampicilina y la mezcla fue incubada a 37 °C durante toda la noche. Una colonia formada en el medio de cultivo de agar fue tomada aleatoriamente y se inoculó en 2 ml del medio de cultivo 2xYT conteniendo 100 µg/ml de ampicilina. Después de incubación a 37 °C durante toda la noche, el medio de cultivo fue centrifugado para separar la miscela, a partir de la cual se preparó un ADN de plásmido medíanle el método de lísis alcalina. El ADN de plásmido fue sometido a digestión doble con EcoRI y Notl, seguida de electroforesia en gel de agarosa al 8%, para determinar el tamaño del inserto de ADNc. Además, usando el plásmido así obtenido como un modelo, la reacción de secuencia fue llevada a cabo usando mi primario universal M13 marcado con un tinte fluorescente y polimerasa Taq (un equipo de Applied Biosistems Inc.) y posteriormente el producto se examinó mediante va secuenciador de ADN fluorescente (Apph d Biosystems Inc.) para determinar una secuencia c!e bases de aproximadamente 400 bp en la íe?toínación 5' del ADNc. La información de la secuencia fue presentada como una base de datos de un banco de ADNc de homo/proteína. (3) Selección de ADNcs que Codifican para Proteínas que Tienen Dominios de transmembrana. Una secuencia de bases registrada en el banco de ADNc de homo/proteína fue convertida a tres marcos de secuencias de aminoácidos y se examinó la presencia o ausencia de mi marco de lectura abierta (ORF) comenzando desde el codón de iniciación. Posteriormente, la selección fue hecha para determinar la presencia de una secuencia señal que es característica para una proteína secretada en la terminación N de la porción codificada por el ORF. Estas clonas fueron secuenciadas desde ambas direcciones 5' y 3' usando el método de deleción y utilizando exonucleasa III para determinar la secuencia de bases completa. Los perfiles de hidrofobicidad/hidrofilicidad fueron obtenidos para proteínas codificadas por el ORF mediante el método de Kyte-Doolitlle (Kyíe, J. & Dooliítle, R. F., J. Mol. Biol. 157: 105-132 (1982)] para examinar la presencia o ausencia de m a región hidrofóbica. En el caso en el que existe una región hidrofóbica de un dominio de transmembrana putativa en la secuencia de aminoácidos de una proteína codificada, esta proteína fue considerada como una proíeína de membrana. (4) Síntesis de Proteína por Traducción In Vitro El vector plásmido portando el ADNc de la presente invención fue utilizado para la íranscripción/íraducción in vitro con un equipo de lisato de reticulociío de conejo TNT (Promega).

En este caso, se agregó [35S]meíionina para marcar el producío de expresión con un radioisótopo.

Cada una de las reacciones fue lleva a cabo siguiendo los protocolos anexos al equipo. Dos microgramos clel plásmido se dejaron reaccionar a 30 °C durante 90 minutos en 25 µl toíales de un solución de reacción coníeniendo 12.5 µl del lisato de reíiculociío de conejo TNT, 0.5 µtl de la solución reguladora (anexa al equipo), 2 µl de una mezcla de aminoácidos (libres de metionina). 2 µl de [35S]meíionina (Amersham) (0.37 MBq/µl), 0.5 µl de polimerasa de ARN T7 y 20 U de RNsina. A 3 µl de la solución de reacción resultante les fueron agregados 2 µl del regulador de muesíra SDS (solución reguladora de Tris-ácido clorhídrico 125 mM, pH 6.8, 2-mercapíoeíanol 120 mM, 2% de solución SDS, 0.025% de azul de bromofenol y 20% de glicerol) y la solución (5) Expresión en COS7 Después de que la Escherichia coli (hospedero: JM109) portando el vector de expresión de la pi oleína de la preseníe invención fue incubada a 37 °C duraníe 2 horas en 2 ml del medio de cultivo 2?VT conteniendo 100 µg/ml de ampicilina, el fago auxiliador M13K07 (50 µl) fue agiegado y la incubación fue continuada a 37 °C durante toda la noche. Un sobrenadante separado por centrifugación se sometió a precipitación con polietilenglicol para obtener partículas de fago de una sola cadena. Estas partículas fueron suspendidas en 100 µl de Tris 1 mM-EDTA 0 1 rnlví, pH 8 (TE). También, se uíilizaron como controles unas suspensiones de partículas de fago de una sola cadena preparada en la misma forma de pSSD3 y a partir del vector pKAl -UPA conteniendo un ADNc de longitud completa de uroquinasa [Yokoyama-Kobayashi, M eí al , Gene 163- 193-196 (1995)]. Las células del culíivo de origen de riñon de simio, COS7, fueron incubadas a 37 °C en la presencia de 5% de CO2 en el medio de cultivo de Eagle modificado por Dulbecco's (DMEM) conteniendo 10% de albúmina de bovino fetal. En un plato de 6 pozos (Nunc. Inc., 3 cm de diámetro de pozo) fueron inoculadas 1 x 105 células COS7 y la incubación se llevó a cabo a 37 °C durante 22 horas en la presencia de 5% de C02. Después de que el medio de cultivo fue reíiraao, la superficie celular fue lavada con una solución reguladora de fosfato y posteriormente lavada otra vez con DMEM conteniendo Tris-ácido clorhídrico 50 mM (pH 7.5) (TDMEM) A las células resultantes les fue agregado 1 µl de la suspensión de fago de una sola cadena, 0.6 ml de medio de culíivo DMEM, y 3 µl de TRANSFECTAM™ (IBF Inc.) y la mezcla resultante fue cubada a 37 °C durante 3 horas en la presencia de 5% de C02. Después de que la solución muestra fue retirada, la superficie de las células fue lavada con TDMEM, 2 ml por pozo de DMEM conteniendo 10% de albúmina de bovino fetal fueron agregados, y la incubación se llevó a cabo a 37 °C durante 2 días en la presencia de 5% de C02. Además, después de que la incubación se coníinuó durante una hora en el medio de culíivo conteniendo [33S]cisíeína o : K-* [°S]metionina, las células fueron recolectadas, disueltas, y posteriormente sometidas a SDS-PAGE, mediante lo cual pudo observarse la presencia de una banda correspondiente al producto ae expresión de cada proteína. Por ej emploma f |p0991 produjo una banda de 18 kDa sobre la fracción de membrana. (6) Ejemplos de Clonas <HP00567> (Secuencias Nos. 1 y 3) La determinación de la secuencia de bases completa del inserto de ADNc de la clona HP00567 obtenida a partir de las bibliotecas de ADNc de la línea celular U937 de linfoma de histiocito humano estimulado con éster de forbol reveló la estructura consisteníe en una región de no traducción 5' de 1 19 bp, un ORF de 1431 bp, y una región de no íraducción 3' de 2020 bp. El ORF codifica para una proteína consistente en 476 residuos de aminoácido y existían cuando menos nueve dominios de transmembrana. La Figura 1 describe el perfil de hidrofobicidad/hidrofilicidad de la presente proteína, obtenido por el método de Kyte-Doolilíle. La traducción in vitro resultó en la observación de que no existía ninguna banda correspondiente al peso molecular de 52,264 pronosticada a partir del ORF y se formó una mancha de un producto de traducción de un peso molecular elevado. La investigación de la base de datos de la proíeína usando la secuencia de aminoácidos de la presente proíeína reveló que la proíeína era completamente idéntica con la subunidad de proteína Secóla de translocación de proteína de rata (SWISS-PROT No. de Acceso P38378). Además la búsqueda clel GenBank usando las secuencias de bases del presente ADNc reveló la presencia de secuencias que poseían una homología de 90% (Por ejemplo, No. de Acceso ?A301007) en EST, pero, puesto que ellas eran secuencias parciales, no pudo juzgarse si alguna de ellas codificaba o no para la misma proteína como la proteína de la presente invención. La subunidad de proteína Secóla de translocación de proteína de rata juega un papel importante de la translocación de proteína a través de la membrana del retículo endoplásmico [Gorlich, D. Et al., Cell 71 : 489-503 (1992)] En consecuencia, la presente proteína es un homólogo humano de la subunidad de proteína Secóla de translocación de proteína de raía. Los presentes ADNcs pueden ser utilizados para la diagnosis y tratamiento de enfermedades que están asociadas con la insuficiencia de función del retículo endoplásmico. <HP00991> (Secuencias La determinación de-la secuencia de bases éQínpleta para el inserto de ADNc de residuos de aminoácido y existían cuatro dominios de transmembrana. La Figura 2 ilustra el perfil cíe hicliOfobicidad/hidrofilicidad de la presente proteína, obtenido por el método de Kyte-Doolittle. La traducción in vitro resulíó en la formación de un producío de traducción de 21 kDa que era casi consistente con el peso molecular de 21,080 pronosticado a partir del ORF. La investigación en la base de datos de proteína usando la secuencia de aminoácidos de la presente proteína reveló que la proíeína era análoga a la subunidad de proteína ? asociada a translocación de rata (SWISS-PROT No. de Acceso Q08013). La Tabla 2 indica la comparación de las secuencias de aminoácidos entre la proteína humana de la presente invención (HP) y la subunidad de proteína ? asociada a translocación de rata (RN) de rata. En dicha Tabla 2, las marcas ele " - ", " * " y " . " representan una abertura, un residuo de aminoácido idéntico a aquel en la proleína de la presente invención y un residuo de aminoácido análogo a aquel en la proteína de la presente invención, respectivamente. Ambas proteínas poseían una homología de 98.4% en la región completa.

Tabla 2 HS MAPKGSSKQQSEEDLLLQDFSRNLSAKSSALFFGNAFIVSAIPIWLYWRIWHMDLIQSAV RN MAPKGGSKQOSEEDLLLQDFSRNLSAKSSALFFGNAFIVSAIPIWLYWRIWHMDLIQSAV HS LYSVMTLVSTYLVAFAYKNVKFVLKHKVAOKREDAVSKEVTRKLSEADNRKMSRKEKDER * * * * ******************************************************** RM LYSVMTLVSTYLVAFAYKNVKFVLKHKVAQKREDAVSKEVTRKLSEADNRKMSRKEKDER HS IL KK EVADYEATTFSIFYNNTLFLVVVIVASFFILKNFNPTVNYILSISASSGLIALL *************************** ************** ***************** RM IL KKNEVADYEATTFSIFYNNTLFLVLVIVASFFILKNFNPRVNYILSISASSGLIALL HS STGSK RN STGSK Además, la búsqueda en GenBank usando la secuencia de bases del presente ADNc reveló la presencia de secuencias que poseían una homología de 90% o más (por ejemplo, Acceso No. AA317439) en EST, pero, debido a que^^s lían secuencias parciales no pudo juzgarse si alguna de esías secuencias codificaba o no p'ala ia misma proíeína que la proíeína de ia presente invención. La subunidad de proteína ? asociada a íranslocación de raía es una de las subunidades del complejo que eslá asociado con la localización de proteínas del retículo endoplásmico [Hartmann, E. Et al.„ Eur. J. Biochem. 214: 375-381 (1993)]. En consecuencia, la presente proíeína es considerada como que juega un papel importante en la retención y pliegue de proteína en el retículo endoplásmico. Los presentes ADNcs pueden ser uíilizados para la diagnosis y tratamiento de enfermedades que están asociadas con la insuficiencia de función del retículo endoplásmico.

Aplicación Industrial La presente invención provee ADNcs que codifican para proteínas humanas que tienen dominios de transmembrana, así como también células eucarioticas que expresan dichos ADNcs. Los ADNcs de la presente invención pueden ser utilizados como sondas para la diagnosis de genes y como fuentes de genes para terapia de genes. Además, los ADNcs pueden ser usados para la expresión a gran escala de dichas proteínas. Las células en donde estos genes de proteínas cíe membrana son introducidos y las proteínas de membrana son expresadas en grandes cantidades, pueden ser empleadas para la detección de los ligandos correspondientes, el íamizaje ele novedosas medicinas de bajo peso molecular, y similares. La présenle invención íambién provee genes correspondientes a las secuencias de polinucleótidos descritos aquí. "Genes correspondientes" son las regiones del genoma que son íranscriías para producir los ARNms a partir de los cuales secuencias de polinucleóíidos de ADNc son derivados y pueden incluir regiones contiguas del genoma necesario para la expresión regulada de tales genes. Los genes correspondientes pueden por lo tanto incluir, pero no se limitan a, secuencias de codificación, regiones sin traducción 5' y 3', exones empalmados alíernaíivameníe, intrones, promotores, mejoradores y silenciadores o elementos supresores. Los genes correspondientes pueden ser aislados de acuerdo con métodos conocidos usando la información de secuencia descrita aquí. Tales métodos incluyen la preparación de sondas o primarios e partir de la informacio r de secuencias descriía para la identificación y/o amplificación de genes en bibliotecas genómicas apropiadas u otras fuentes de materiales genómicos. Un "gene aislado" es un gene queAa; t!o separado de las secuencias de codificación adyacentes, si las hay, presentes en el geno¡¡j¡|pft organismo a partir del cual el gene fue aislado. Se proveen organismos que tienen expresión mejorada, reducida o modificada de los genes correspondientes a las secuencias de polinucleótidos descritos aquí. El cambio deseado en la expresión de gene puede ser logrado a través del uso de polinucleótidos de antisentido o ribozimas que unen y/o separan el ARNm transcrito a partir del gene (Albert and Morris, 1994, Trends Pharmacol. Sci., 15(7): 250-254; Lavarosky et al., 1997, Biochem, Mol. Med. 62(1); 1 1-12; y Hampel, 1998, Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 58: 1-39; la totalidad de los cuales se incorpora aquí como referencia). Se proveen animales transgénicos que tienen copias múltiples del(los) gene(s) correspondiente(s) a las secuencias de polinucleótidos descritas aquí, preferiblemente producidos mediante la transformación de células con construcciones genéticas que son establemente mantenidas dentro de las células transformadas y su progenie. También se proveen animales íransgénicos que tienen regiones de control genético modificadas que incrementan o reducen los niveles de expresión de genes, o que cambian temporal o espacialmeníe los patrones de expresión de genes (ver Pateníe Europea No. 0 649 464 Bl, incorporada a la présenle como referencia). Además se proveen organismos en los que el(los) gene(s) correspondieníe(s) a las secuencias de polinucleóíidos descriías aquí han sido parcial o íoíalmeníe inactivados, a íravés de la inserción de secuencias extrañas dentro del(los) gene(s) corres?ondiente(s) o a íravés de la deleción de todos o parte de los genes correspondientes. La inactivación de genes parcial o completa puede ser llevada a cabo a través de la inserción, preferiblemente seguida de corte impreciso, de elementos transposables (Plasíerk, 1992. Bioessays 14(9): 629-633; Zwaal eí al., 1993, Proc. Naíl. Acad. Sci. USA 90(16): 7431-7435; Clark et al., 1994, Proa Nati. Acad. Sci. USA 91(2): 719-722; la totalidad de los cuales se incorpora a la presente como referencias), o a través de recombinación homologa, preferiblemente detecíada mediante estrategias de selección genética positiva/negativa (Mansour eí al., 1988, Nature 336: 348-352; Patentes de los E.U.A. Nos. 5,464,764; 5,487,992; 5,627,059; 5,631,153; 5,614,396; 5,616,491 y 5,679,523, la totalidad de las cuales se incorpora a la presente como referencias). Estos organismos con expresión de genes alterada son preferiblemente eucariotes y, más preferiblemente, son mamíferos. Tales organismos son útiles para el desarrollo de modelos no humanos para el estadio^ desordenes que involucran los genes correspondientes, 7 para ei desarrollo de sistemas de prueba para ia identificación de moléculas que interactúan con un receptor), a presente invención íambiéñ^Troporciona formas solubles de tales proteínas. dichas formas, parte o la totalidad de los dominios intracelulares y de transmembrana de la proíeína son eliminados de manera tal que la proteína es toíalmeníe secretada a partir de la célula en la que es expresada. Los dominios intracelulares y de transmembrana de proteínas de la invención puede ser identificada de acuerdo con técnicas conocidas para la determinación de tales dominios a partir de información de secuencia. Proteínas y fragmentos de proteínas de la presente invención incluyen proteínas con longitudes de las secuencias de aminoácidos que son cuando menos 25% (más preferiblemente cuando menos 50%, y más preferiblemente cuando menos 75%) de la longitud de una proíeína descrita y tienen cuando menos 60% de identidad de secuencia (más preferiblemente, cuando menos 75% de ideníidad, más preferiblemeníe cuando menos 90% o 95%) de identidad) con aquella proíeína descrita, en donde la identidad de secuencia es determinada comparando las secuencias de aminoácidos de las proteínas cuando se alinean a fin de maximizar el traslape y la identidad en tanto que se reduce las aberturas de secuencia. También se incluyen la presente invención proteínas y fragmentos de proteínas que contienen mi segmento preferiblemente comprendiendo 8 o más (más preferiblemente 20 o más, más preferiblemente 30 o más) aminoácidos contiguos que comparten cuando menos 75% de idenlidad de secuencia (más preferiblemente, cuando menos 85% de identidad, más preferiblemente cuando menos 95% de identidad) con cualquier segmento de cualquiera de las proteínas descriías. Los homólogos de especie de los polinucleótidos y proteínas descritas también son proveídas por la presente invención. Como se emplea aquí, una "especie homologa" es una proteína o polinucleóíido con una especie diferente de origen a partir de aquel de una proteína o polinucleótido dado, pero con similitudes de secuencia importantes a la proteína o polinucleótido dado, según se determinó por aquellos capacilados en la técnica. Los homólogos de especie pueden ser aislados e identificados elaborando sondas o primarios adecuados a partir de las secuencias proveídas por la presente y tamizando una fuente de ácido nucleico adecuada a partir de las especies deseadas.

La invención íambién abarcl? anles alélicas de los polinucleóíidos o proteínas descritas, esto es, formas alternativas que ocun'en de manera natural, de los polinucleótidos La invención íambién incluye polinucTeótidos con secuencias complemeníarias a de los polinucleótidos descritos aquí. La presente invención también incluye polinucleótidos capaces de hibridizar bajo condiciones de astringencia reducida, más preferiblemente condiciones astringeníes, y más preferiblemente condiciones altamente astringentes, a los polinucleótidos descritos aquí Ejemplos de condiciones de astringencia son mostradas en la tabla siguiente: condiciones de alia astringencia son aquellas que son cuando menos tan astringentes como, por ejemplo, las condiciones A-F; condiciones aslringeníes son cuando menos tan astringentes como, por ejemplo las condiciones G-L; y condiciones de astringencia reducida con cuando menos tan astringeníes como, por ejemplo las condiciones M-R. 1 ?a long ud del híbrido es aquella anticipada por la(s) región(es) hibrid?zada(s) de los polipucleótidos de hibridación. Cuando hibpda un polinucleótido a un polinucleótido objetivo de secuencia desconocida, se supone que la longitud del htopdo es aquella del polinucleótido de hibridación. Cuando polinucleófidos de secuencia conocida son hibridados, la longitud del híbndo puede ser determinada alineando las secuencias de los polinucleóiidos e identificando la región o legiones de complemeniariedad ópiima de secuencia.

SSPE > IxSSPE es 0.15M NaCI, 10 mM EDTA, pH 7.4) puede ser substituido por SSC {IxSSC es 0.15ÍV1 ¡\laCI y 15 mM ciíraío de sodio) en la hibridación y se realizan lavados con reguladores de lavado durante i minutos después de que la hibridación es completa. ,*,• con las siguientes ecuaciones. Para híbridos menores de 18 pares de bases de longitud, Tm(°C)=2(¿ de A ^ T bases) - 4(# ás G + C bases). Para híbridos eníre 18 y 49 pares de bases de longitud, Tm(°C)=81.5 + 16.6(log?o[Na+]) + 0 1 (%G + C)- (600/N). En donde N es el número de bases en el híbrido, y [Na+] es la concentración de iones sodio en el isgula oi de hibridación ([Na para lxSSC~0.165M).

Ejemplos adicionales de condiciones de astringencia para la hibridación de polinucleótidos se proveen en Sambrook, J., E. F. Fritsch, y T. Maniaíis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manuel, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY, capítulos 9 y 11 y en Currenl Protocols in Molecular Biology, 1995, F.M. Ausubel et al., eds John Wiley & Sons, Inc., secciones 2.10 y 6.3-6.4., incorporados aquí como referencia. Preferiblemente, cada uno de tales polinucleótido de hibridación tiene una longitud que es cuando menos 25% más (más preferiblemente cuando menos 50%, y más preferiblemente cuando menos 75%) de la longitud del polinucleótido de la presente invención al cual hibrida, y tiene cuando menos 60% de identidad de secuencia (más preferiblemente, cuando menos 75% de identidad; más preferiblemente cuando menos 90% o 95% de ideníidad) con el polinucleólido de la presente invención al cual hibrida, en donde la identidad de secuencia es determinada compaiando las secuencias de los polinucleótidos de hibridación cuando se alinean a fin de maximizar el traslape e identidad en tanto que se reducen las aberturas de secuencia. _IST¿ WFDE SECUENCIAS <110> Sagami Chemical Research CeQter "íS " <120> ADNcs que codifican pal bteínas humanas que poseen dominios de transmembrana. <130> 660855 <L¡G> <141> <150> Japan 9-276270 <151> 1997-10-08 <160> 6 <170> Windows 95 (Word 98) . J. ^J > i <211> 1428 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 ATGGCAATCA AATTTCTGGA AGTCATCAAG CCCTTCTGTG TCATCCTGCC GGAAATTCAG 60 AAGCCAGAGA GGAAGATTCA GTTTAAGGAG AAAGTGCTGT GGACCGCTAT CACCCTCTTT 120 a^CTTCTTAG TGTGCTGCCA GATTCCCCTG TTTGGGATCA TGTCTTCAGA TTCAGCTGAC 180 CCTTTCTATT GGATGAGAGT GATTCTAGCC TCTAACAGAG GCACATTGAT GGAGCTAGGG 240 ATCTCTCCTA TTGTCACGTC TGGCCTTATA ATGCAACTCT TGGCTGGCGC CAAGATAATT 300 GAAGTTGGTG ACACCCCAAA AGACCGAGCT CTCTTCAACG GAGCCCAAAA GTTATTTGGC 360 fGATCATTA CTATCGGCCA GTCTATCGTG TATGTGATGA CCGGGATGTA TGGGGACCCT 420 TCTGAAATGG GTGCTGGAAT TTGCCTGCTA ATCACCATTC AGCTCTTTGT TGCTGGCTTA 480 TTGTC TAC TTTTGGATGA ACTCCTGCAA AAAGGATATG GCCTTGGCTC TGGTATTTCT 4 n CTCTTCATTG CAACTAACAT CTGTGAAACC ATCGTATGGA AGGCATTCAG CCCCACTACT 600 GTCAACACTG GCCGAGGAAT GGAATTTGAA GGTGCTATCA TCGCACTTTT CCATCTGCTG 660 GCCACACGCA CAGACAAGGT CCGAGCCCTT CGGGAGGCGT TCTACCGCCA GAATCTTCCC 720 AACCTCATGA ATCTCATCGC TGGTCATCTA TTTCCAGGGC 780 TTCCGAGTGG ACCTGCCAAT CAAGTCGGCC CGCTACCGTG GCCAGTACAA CACCTATCCC 840 "-TCAAGCTCT TCTATACGTC CAACATCCCC AGTCTGCCCT GGTGTCCAAC 900 TTTATGTCA TCTCCCAAAT GCTCTCAGCT GCAACTTGCT GGTCAGCCTG 960 CTGGGCACCT GGTCGGACAC GTCTTCTGGG GGCCCAGCAC GTGCTTATCC AGTTGGTGGC 1020 CTTTGCTATT ACCTGTCCCC TCCAGAATCT TTTGGCTCCG TGT AG AGA CCCGGTCCAT 1080 GCAGTTGTAT ACATAGTGTT CATGCTGGGC TCCTGTGCAT TCTTCTCCAA AACGTGGATT 1140 3PGGTCTCAG GTTCCTCTGC CAAAGATGTT GCAAAGCAGC TGAAGGAGCA GCAGATGGTG J200 ^TGAGAGGCC ACCGAGAGAC CTCCATGGTC CATGAACTCA ACCGGTACAT CCCCACAGCC 1260 GCGGCCTTTG GTGGGCTGTG CATCGGGGCC CTCTCGGTCC TGGCTGACTT CCTAGGCGCC 1320 ATTGGGTCTG GAACCGGGAT CCTGCTCGCA GTCACAATCA TCTACCAGTA CTTTGAGATC 1380 TTCGTTAAGG AGCAAAGCGA GGTTGGCAGC ATGGGGGCCC TGCTCTTC 1428 <210> 2 <21I> 555 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 ATGGCTCCTA AAGGCAGCTC CAAACAGCAG TCTGAGGAGG ACCTGCTCCT GCAGGATTTC 60 AGCCGCAATC TCTCGGCCAA GTCCTCCGCG CTCTTCTTCG GAAACGCGTT CATCGTGTCT 120 CCCATCCCCA TCTGGTTATA CTGGCGAATA TGGCATATGG ATCTTATTCA GTCTGCTGTT 180 TGGTATAGTG TGATGACCCT GTAAGCACA TATTTGGTAG CCTTTGCATA CAAGAATGTG 240 AAATTGGTTC TCAAGCACAA AGTAGCACAG AAGAGGGAGG ATGCTGTTTC CAAAGAAGTG 300 ACTCGAAAAC TTTCTGAAGC TGATAATAGA AAGATGTCTC GGAAGGAGAA AGATGAAAGA 360 ATCTTGTGGA AGAAGAATGA AGTTGCTGAT TATGAAGCTA CAACATTTTC CATCTTCTAT 420 A?CAACACTC TGTTCCTGGT CGTGGTCATT GTTGCTTCCT TCTTCATATT GAAGAACTTC 480 AACCCCACAG TGAACTACAT ATTGTCCATA AGTGCTTCAT CAGGACTCAT CGCCCTCCTG 540 TCTACTGGCT CCAAA <212> DNA <213> Homo sapiens ACTGACGTGT CTCTCGGCGG AGCTGCTGTG CAGTGGAACG CGCTGGGCCG CGGGCAGCGT 60 CGCCTCACGC GGAGCAGAGC TGAGCTGAAG CGGGACCCGG AGCCCGAGCA GCCGCCGCC 119 ATG GCA ATC AAA TTT CTG GAA GTC ATC AAG CCC TTC TGT GTC ATC CTG 167 Met Ala He Lys Phe Leu Glu Val He Lys Pro Phe Cys Val He Leu 5 10 15 CCG GAA ATT CAG AAG CCA GAG AGG AAG ATT CAG TTT AAG GAG AAA GTG 215 Pro Glu He Gln Lys Pro Glu Arg Lys He Gln Phe Lys Glu Lys Val 20 25 30 CTG TGG ACC GCT ATC ACC CTC TTT ATC TTC TTA GTG TGC TGC CAG ATT 263 Leu Trp Thr Ala He Thr Leu Phe He Phe Leu Val Cys Cys Gln He 35 40 45 CCC CTG TTT GGG ATC ATG TCT TCA GAT TCA GCT GAC CCT TTC TAT TGG 311 Pro Leu Phe Gly He Met Ser Ser Asp Ser Ala Asp Pro Phe Tyr Trp 50 55 60 ATG AGA GTG ATT CTA GCC TCT AAC AGA GGC AC TTG ATG GAG CTA GGG 359 ixiet Arg Val He Leu Ala Ser Asn Arg Gly Thr Leu Met Glu Leu Gly 65 70 75 80 ATC TCT CCT ATT GTC ACG TCT GGC CTT ATA ATG CAA CTC TTG GCT GGC 407 He Ser Pro He Val Thr Ser Gly Leu He Met Gln Leu Leu Ala Gly 85 90 95 GCC AAG ATA ATT GAA GTT GGT GAC ACC CCA AAA GAC CGA GCT CTC TTC 455 Ala Lys He He Glu Val Gly Asp Thr Pro Lys Asp Arg Ala Leu Phe 100 105 110 AAC GGA GCC CAA AAG TTA TTT GGC ATG ATC ATT ACT ATC GGC CAG TCT 503 Asn Gly Ala Gln Lys Leu Phe Gly Met He He Thr He Gly Gln Ser 115 120 125 ATC GTG TAT GTG ATG ACC GGG ATG TAT GGG GAC CCT TCT GAA ATG GGT 551 He Val Tyr Val Met Thr Gly Met Tyr Gly Asp Pro Ser Glu Met Gly 130 135 140 GCT GGA ATT TGC CTG CTA ATC ACC ATT CAG CTC TTT GTT GCT GGC TTA 599 Ala Gly He Cys Leu Leu He Thr He Gln Leu Phe Val Ala Gly Leu 145 150 155 160 i.re GTC ;TA CTT TTG GAT G?A SCTG CAA AAA GGA TAT GGC CTT GGC 647 '?e Va± Leu Leu Leu Asp Glu Leu Gln Lys Gly Tyr Gly Leu Gly 165 170 175 TCT GGT ATT TCT CTC TTC ATT GCA ACT AAC ATC TGT GAA ACC ATC GTA 695 Ser Gly He Ser Leu Phe He Ala Thr Asn He Cys Glu Thr He Val 180 185 190 TGG AAG GCA TTC AGC CCC ACT ACT GTC AAC ACT GGC CGA GGA ATG GAA 743 Trp Lys Ala Phe Ser Pro Thr Thr Val Asn Thr Gly Arg Gly Met Glu 195 200 205 TTT GAA GGT GCT ATC ATC GCA CTT TTC CAT CTG CTG GCC ACÁ CGC ACÁ 791 Phe Glu Gly Ala He He Ala Leu Phe His Leu Leu Ala Thr Arg Thr 210 215 220 GAC AAG GTC CGA GCC CTT CGG GAG GCG TTC TAC CGC CAG AAT CTT CCC 839 Asp Lys Val Arg Ala Leu Arg Glu Ala Phe Tyr Arg Gln Asn Leu Pro 225 230 235 240 AAC CTC ATG AAT CTC ATC GCC ACC ATC TTT GTC TTT GCA GTG GTC ATC 887 Asn Leu Met Asn Leu He Ala Thr He Phe Val Phe Ala Val Val He 245 250 255 TAT TTC CAG GGC TTC CGA GTG GAC CTG CCA ATC AAG TCG GCC CGC TAC 935 Tyr Phe Gln Gly Phe Arg Val Asp Leu Pro He Lys Ser Ala Arg Tyr 260 265 270 CGT GGC CAG TAC AAC ACC TAT CCC ATC AAG CTC TTC TAT ACG TCC AAC 983 Arg Gly Gln Tyr Asn Thr Tyr Pro He Lys Leu Phe Tyr Thr Ser Asn 275 280 285 ATC CCC ATC ATC CTG CAG TCT GCC CTG GTG TCC AAC CTT TAT GTC ATC 1031 He Pro He He Leu Gln Ser Ala Leu Val Ser Asn Leu Tyr Val He 290 295 300 TCC CAA ATG CTC TCA GCT CGC TTC AGT GGC AAC TTG CTG GTC AGC CTG 1079 Ser Gln Met Leu Ser Ala Arg Phe Ser Gly Asn Leu Leu Val Ser Leu 305 310 315 320 CTG GGC ACC TGG TCG GAC ACG TCT TCT GGG GGC CCA GCA CGT GCT TAT 1127 Leu Gly Thr Trp Ser Asp Thr Ser Ser Gly Gly Pro Ala Arg Ala Tyr 325 330 335 CCA GTT GGT GGC CTT TGC TAT TAC CTG TCC CCT CCA GAA TCT TTT GGC 1175 Pro Val Gly Gly Leu Cys Tyr Tyr Leu Ser Pro Pro Glu Ser Phe Gly 340 345 350 TCC GTG TTA GAA GAC CCG GTC CAT GCA GTT GTA TAC ATA GTG TTC ATG 1223 Ser Val Leu Glu Asp Pro Val His Ala Val Val Tyr He Val Phe Met 355 360 365 CTG GGC TCC TGT GCA TTC TTC TCC AAA ACG TGG ATT GAG GTC TCA GGT 1271 Lea Giy Ser Cys Ala Phe Phe Ser Lys Thr Trp He Glu Val Ser Gly 3~C 375 380 TCC TCT GCC AAA GAT GTT GCA AAG CAG CTG AAG GAG CAG CAG ATG GTG 131S Ser Ser Ala Lys Asp Val Ala Lys Gln Leu Lys Glu Gln Gln Met Val 385 390 395 400 ATG AGA GGC CAC CGA GAG ACC TCC ATG GTC CAT GAA CTC AAC CGG TAC 1367 Met Arg Gly His Arg Glu Thr Ser Met Val His Glu Leu Asn Arg Tyr 405 410 415 ATC CCC ACÁ GCC GCG GCC TTT GGT GGG CTG TGC ATC GGG GCC CTC TCG 1415 He Pro Thr Ala Ala Ala Phe Gly Gly Leu Cys He Gly Ala Leu Ser 420 425 430 GTC CTG GCT GAC TTC CTA GGC GCC ATT GGG TCT GGA ACC GGG ATC CTG 1463 Val Leu Ala Asp Phe Leu Gly Ala He Gly Ser Gly Thr Gly He Leu 435 440 445 CTC GCA GTC ACÁ ATC ATC TAC CAG TAC TTT GAG ATC TTC GTT AAG GAG 1511 Leu Ala Val Thr He He Tyr Gln Tyr Phe Glu He Phe Val Lys Glu 450 455 460 CAA AGC GAG GTT GGC AGC ATG GGG GCC CTG CTC TTC TGA GCCCGTCTCC 1560 Gln Ser Glu Val Gly Ser Met Gly Ala Leu Leu Phe 465 470 475 CGGACAGGTT GAGGAAGCTG CTCCAGAAGC GCCTCGGAAG GGGAGCTCTC ATCATGGCGC 1620 GTGCTGCTGC GGCATATGGA CTTTTAATAA TGTTTTTGAA TTTCGTATTC TTTCATTCCA 1680 CTGTGTAAAG TGCTAGACAT TTTCCAATTT AAAATTTTGC TTTTTATCCT GGCACTGGCA 1740 AAAAGAACTG TGAAAGTGAA ATTTTATTCA GCCGACTGCC AGAGAAGTGG GAATGGTATA 1800 GGATTGTCCC CAAGTGTCCA TGTAACTTTT GTTTTAACCT TTGCACCTTC TCAGTGCTGT 1360 ATGCGGCTGC AGCCGTCTCA CCTGTTTCCC CACAAAGGGA ATTTCTCACT CTGGTTGGAA 1920 GCACAAACAC TGAAATGTCT ACGTTTCATT TTGGCAGTAG GGTGTGAAGC TGGGAGCAGA 1980 TCATGTATTT CCCGGAGACG TGGGACCTTG CTGGCATGTC TCCTTCACAA TCAGGCGTGG 2040 GAATATCTGG CTTAGGACTG TTTCTCTCTA AGACACCATT GTTTTCCCTT ATTTTAAAAG 2100 TGATTTTTTT AAGGACAGAA CTTCTTCCAA AAGAGAGGGA TGGCTTTCCC AGAAGACACT 2160 CCTGGCCATC TGTGGATTTG TCTGTGCACC TATTGGCTCT TCTAGCTGAC TCTTCTGGTT 2220 GGGCTTAGAG TCTGCCTGTT TCTGCTAGCT CCGTGTTTAG TCCACTTGGG TCATCAGCTC 2280 TGCCAAGCTG AGCCTGGCCA AGCTAGGTGG ACAGACCCTT GCAGTGATGT CCGTTTGTCC 2340 h¡?*i? ?¡£¿ ¡¡M*¿¿£ gi AGATTCTGCC AGTCATCACT GGACACGTCT CCÍQGCAGCT GCCCTAGCAA GGGGAGACAT 2400 TGTGGTAGCT ATCAGACATG GACAGAAACT GACTTAGTGC TCACAAGCCC CTACACCTTC 2460 TGGGCTGAAG ATCACCCAGC TGTGTTCAGA ATTTTCTTAC TGTGCTTAGG ACTGCACGCA 2520 TGAGCAGA CACCACCGAC TTCCTTTCTG CGTCACCAGT GTCGTCAGCA GAGAGAGGAC -758 (• .-.GCACAGGCT CAAGGTTGGT AGTGAAGTCA GGTTCGGGGT GCATGGGCTG TGGTGGTGTT 2640 GATCAGTTGC TCCAGTGTTT GAAATAAGAA GACTCATGTT TATGTCTGGA ATAAGTTCTG 2700 TTTGTGCTGA CAGGTGGCCT AGGTCCTGGA GATGAGCACC CTCTCTCTGG CCTTTAGGGA 2760 GTCCCCTCTT AGGACAGGCA CTGCCCAGCA GCAAGGGCAG CAGAGTTGGG TGCTAAGATC 2820 CTGAGGAGCT CGAGGTTTCG AGCTGGCTTT AGACATTGGT GGGACCAAGG ATGTTTTGCA 2880 GGATGCCCTG ATCCTAAGAA GGGGGCCTGG GGGTGCGTGC AGCCTGTCGG GGAGACCCCA 2940 CTCTGACAGT GGGCACACGG CAGCCTGCAA AGCACAGGGC CACCGCCACA GCCCGGCAGA 3000 GGGGCACACT CTGGAGACCT TGCTGGCAGT GCTAGCCAGG AAACAGAGTG ACCAAGGGAC 3060 AAGAAGGGAC TTGCCTAAAG CCACCCAGCA ACTCAGCAGC AGAACCAAGA TGGGCCCAG 3120 GCTCCTCCAT ATGGCCCAGG GCTTACCACC CTATCACACG TGGCCTTGTC TAGACCCAGT 3180 CCTGAGCAGG GGAGAGGCTC TTGAGACCTG ATGCCCTCCT ACCCACATGG TTCTCCCACT 3240 GCCCTGTCTG CTCTGCTGCT ACAGAGGGGC AGGGCCTCCC CCAGCCCACG CTTAGGAATG 3300 CTTGGCCTCT GGCAGGCAGG CAGCTGTACC CAAGCTGGTG GGCAGGGGGC TGGAAGGCAC 3360 CAGGCCTCAG GAGGAGCCCC ATAGTCCCGC CTGCAGCCTG TAACCATCGG CTGGGCCCTG 3420 CAAGGCCCAC ACTCACGCCC TGTGGGTGAT GGTCACGGTG GGTGGGTGGG GGCTGACCCC 3480 AGCTTCCAGG GGACTGTCAC TGTGGACGCC AAAATGGCAT AACTGAGATA AGGTGAATAA 3540 GTGACAAATA AAGCCAGTTT TTTACAAGGT 3570 <210> 4 <211> 476 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Ala lie Lys Phe Leu Glu Val lie Lys Pro Phe Cys Val lie Leu 1 5 10 15 Tc Giu lie Gln Lys Pro Glu Arg Lys lie Gln Phe Lys Glu Lys Val 20 25 30 Leu Trp Thr Ala lie Thr Leu Phe lie Phe Leu Val Cys Cys Gln lie 35 40 45 Pro Leu Phe Gly lie Met Ser Ser Asp Ser Ala Asp Pro Phe Tyr Trp 50 55 60 Met Arg Val lie Leu Ala Ser Asn Arg Gly Thr Leu Met Glu Leu Gly 65 70 75 80 lie Ser Pro lie Val Thr Ser Gly Leu lie Met Gln Leu Leu Ala Gly 85 90 95 Ala Lys lie lie Glu Val Gly Asp Thr Pro Lys Asp Arg Ala Leu Phe 100 105 110 Asn Gly Ala Gln Lys Leu Phe Gly Met He He Thr He Gly Gln Ser 115 120 125 He Val Tyr Val Met Thr Gly Met Tyr Gly Asp Pro Ser Glu Met Gly 130 135 140 Ala Gly He Cys Leu Leu He Thr He Gln Leu Phe Val Ala Gly Leu 145 150 155 160 He Val Leu Leu Leu Asp Glu Leu Leu Gln Lys Gly Tyr Gly Leu Gly 165 170 175 Ser Gly He Ser Leu Phe He Ala Thr Asn He Cys Glu Thr He Val 180 185 190 Trp Lys Ala Phe Ser Pro Thr Thr Val Asn Thr Gly Arg Gly Met Glu 195 200 205 Phe Glu Gly Ala He He Ala Leu Phe His Leu Leu Ala Thr Arg Thr 210 215 220 Asp Lys Val Arg Ala Leu Arg Glu Ala Phe Tyr Arg Gln Asn Leu Pro 225 230 235 240 Asn Leu Met Asn Leu He Ala Thr He Phe Val Phe Ala Val Val He 245 250 255 rWÉjÉft»"^**»^^' Tyr Phe Gln Giy Phe Arg Val Asp Leu Pro He Lys Ser Ala Arg Tyr 260 26! ?rg 3 y Gln Tyr Asn Thr Tyr Pro He Lys Leu Phe Tyr Thr Ser Asn 2^5 280 285 Iré Pro He He Leu Gln Ser Ala Leu Val Ser Asn Leu Tyr Val He 290 295 300 Ser Gln Met Leu Ser Ala Arg Phe Ser Gly Asn Leu Leu Val Ser Leu 305 310 315 320 Leu Gly Thr Trp Ser Asp Thr Ser Ser Gly Gly Pro Ala Arg Ala Tyr 325 330 335 Pro Val Gly Gly Leu Cys Tyr Tyr Leu Ser Pro Pro Glu Ser Phe Gly 340 345 350 Ser Val Leu Glu Asp Pro Val His Ala Val Val Tyr He Val Phe Met 355 360 365 Leu Gly Ser Cys Ala Phe Phe Ser Lys Thr Trp He Glu Val Ser Gly 370 375 380 Ser Ser Ala Lys Asp Val Ala Lys Gln Leu Lys Glu Gln Gln Met Val 385 390 395 400 Met Arg Gly His Arg Glu Thr Ser Met Val His Glu Leu Asn Arg Tyr 405 410 415 He Pro Thr Ala Ala Ala Phe Gly Gly Leu Cys He Gly Ala Leu Ser 420 425 430 Val Leu Ala Asp Phe Leu Gly Ala He Gly Ser Gly Thr Gly He Leu 435 440 445 Leu Ala Val Thr He He Tyr Gln Tyr Phe Glu He Phe Val Lys Glu 450 455 460 Gln Ser Glu Val Gly Ser Met Gly Ala Leu Leu Phe 465 470 475 <210> 5 <211> 819 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 A' GTCAAGGGCC TTTGCCCGCC TTGGCGGCCG GCTCTACGTT CCCTGTTCTC GCCTGCAGCT 60 .TG :CT AAA GGC AGC TCC AAA CAG CAG TCT GAG GAG GAC CTG 110 Mee Ala Pro Lys Gly Ser Ser Lys Gln Gln Ser Glu Glu Asp Leu 5 10 15 CTC CTG CAG GAT TTC AGC CGC AAT CTC TCG GCC AAG TCC TCC GCG CTC 158 Leu Leu Gln Asp Phe Ser Arg Asn Leu Ser Ala Lys Ser Ser Ala Leu 20 25 30 TTC TTC GGA AAC GCG TTC ATC GTG TCT GCC ATC CCC ATC TGG TTA TAC 206 Phe Phe Gly Asn Ala Phe He Val Ser Ala He Pro He Trp Leu Tyr 35 40 45 TGG CGA ATA TGG CAT ATG GAT CTT ATT CAG TCT GCT GTT TTG TAT AGT 254 Trp Arg He Trp His Met Asp Leu He Gln Ser Ala Val Leu Tyr Ser 50 55 60 GTG ATG ACC CTA GTA AGC ACÁ TAT TTG GTA GCC TTT GCA TAC AAG AAT 302 Val Met Thr Leu Val Ser Thr Tyr Leu Val Ala Phe Ala Tyr Lys Asn 65 70 75 GTG AAA TTT GTT CTC AAG CAC AAA GTA GCA CAG AAG AGG GAG GAT GCT 350 Val Lys Phe Val Leu Lys His Lys Val Ala Gln Lys Arg Glu Asp Ala 80 85 90 95 GTT TCC AAA GAA GTG ACT CGA AAA CTT TCT GAA GCT GAT AAT AGA AAG 398 Val Ser Lys Glu Val Thr Arg Lys Leu Ser Glu Ala Asp Asn Arg Lys 100 105 110 ATG TCT CGG AAG GAG AAA GAT GAA AGA ATC TTG TGG AAG AAG AAT GAA 446 Met Ser Arg Lys Glu Lys Asp Glu Arg He Leu Trp Lys Lys Asn Glu 115 120 125 GTT GCT GAT TAT GAA GCT ACÁ ACÁ TTT TCC ATC TTC TAT AAC AAC ACT 494 Val Ala Asp Tyr Glu Ala Thr Thr Phe Ser He Phe Tyr Asn Asn Thr 130 135 140 CTG TTC CTG GTC GTG GTC ATT GTT GCT TCC TTC TTC ATA TTG AAG AAC 542 Leu Phe Leu Val Val Val He Val Ala Ser Phe Phe He Leu Lys Asn 145 150 155 TTC AAC CCC ACÁ GTG AAC TAC ATA TTG TCC ATA AGT GCT TCA TCA GGA 590 Phe Asn Pro Thr Val Asn Tyr He Leu Ser He Ser Ala Ser Ser Gly 160 165 170 175 CTC ATC GCC CTC CTG TCT ACT GGC TCC AAA TAGACCATGT CAGCTTCACC 640 Leu He Ala Leu Leu Ser Thr Gly Ser Lys CCCTGGCTTT GTGTC AAGTAGCAGG GTGGTCAGGG 700 TGGGAGACAC AAGATGTTTT TATAGTCTAG AGCCTTTAAA AAACCCAGCA GAATGTAATT 760 CAGTATTTGT TTATTGGCTG TTTTTTGACA GATTGTTGAA ATTAAATGAA TTGAAAGGG 819 <210> 6 <2il> 185 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Met Ala Pro Lys Gly Ser Ser Lys Gln Gln Ser Glu Glu Asp Leu 1 5 10 15 Leu Leu Gln Asp Phe Ser Arg Asn Leu Ser Ala Lys Ser Ser Ala Leu 20 25 30 Phe Phe Gly Asn Ala Phe He Val Ser Ala He Pro He Trp Leu Tyr 35 40 45 Trp Arg He Trp His Met Asp Leu He Gln Ser Ala Val Leu Tyr Ser 50 55 60 Val Met Thr Leu Val Ser Thr Tyr Leu Val Ala Phe Ala Tyr Lys Asn 65 70 75 Val Lys Phe Val Leu Lys His Lys Val Ala Gln Lys Arg Glu Asp Ala 80 85 90 95 Val Ser Lys Glu Val Thr Arg Lys Leu Ser Glu Ala Asp Asn Arg Lys 100 105 110 Met Ser Arg Lys Glu Lys Asp Glu Arg He Leu Trp Lys Lys Asn Glu 115 120 125 Val Ala Asp Tyr Glu Ala Thr Thr Phe Ser He Phe Tyr Asn Asn Thr 130 135 140 Leu Phe Leu Val Val Val He Val Ala Ser Phe Phe He Leu Lys Asn 145 150 155 Phe Asn Pro Thr Val Asn Tyr He Leu Ser He Ser Ala Ser Ser Gly 160 165 170 175 Leu He Ala Leu Leu Ser Thr Gly Ser Lys 180 185

Claims

Nov ad de la I vem én ? -«I. 1 Un ADNc que compl ide la secuencia de aminoácidos representada por la

Secuencia No. 1 o la Secuencia No. 2.
2. El ADN de conformidad con la reivindicación 1, el cual comprende la secuencia de bases Representadas por la Secuencia No. 3 o la Secuencia No. 4.
3. Un vector de expresión capaz de expresar el ADN de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en traducción in vitro o una célula eucarioíica.
4. Una célula eucariotica de transformación, capaz de expresar el ADN de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, para producir una proteína codificada por dicho ADN.