MXPA98000690A - Procedimiento para la caracterizacion de la glicosilacion de glicoproteinas, asi como para la determinacion in vitro de la biodisponibilidad de glicoproteinas - Google Patents

Abstract

El objeto de la presente invención es un procedimiento para la caracterización de la glicosilación de glicoproteinas, asícomo un procedimiento in vitro para la determinación de la biodisponibilidad de glicoproteinas, que se basa en el"número de cargas hipotético"(en adelante denominado"Z") y que se puede emplear tanto para glicoproteinas endógenas como también para glicoproteinas exógenas.

Description

Procedimiento para la caracterización tíe la gl icosilación de gíicoproteínas, asi cerno para la determinación in vitro de l a biodisponibil idad de gl icoproteinas Objeto de la presente invención es un procedimiento para la caracterización de la glicosilación de glicoproteinas , asi como un procedimiento in vitro para la determinación de la biodisponibilidad de glicoproteinas , que se basa en el "número de cargas hipotético" (en adelante denominado "Z" ) y que se puede emplear tanto para glicoproteinas endógenas como también para glicoproteinas exógenas . Glicoproteinas exógenas son, en este contexto, por ejemplo glicoprot'eínas recombinantes, terapéuticas, obtenidas de células de mamíferos ( tales como por ejemplo interleu-quina 2 , eri tropoyet ina, activador de plasminógeno de tej idos o antitrombina III ) . Estas sustancias han despertado en los últimos años un interés considerable por parte de instituciones científicas , farmacéuticas y de la administración. A este respecto, glicoproteinas endógenas son gl icoproteinas de suero humano o no humano (por ejemplo bovino) (por ejemplo, aj-glicoproteina acida humana, trans fe-rrina humana o fetuina bovina) , pero también glicoproteinas de otras especies, tales como por ejemplo ovomucoide de gal linas o tiroglubulina de cerdos . La investigación, desarrollo y producción de glicoproteinas terapéuticas , asi como su autorización administrativa o clínica, requieren una compleja analítica en relación con el tiempo de semivida in vivo, la seguridad biológica, la definición del producto y la uniformidad de las tandas . En este aspecto, hasta ahora desempeña un importante papel como parámetro, sobre todo la porción de ácido sialinico ( ácido N-aceti lneuraminico, Neu5Ac ) , puesto que se parte de que la presencia o ausencia de Neu5Ac codetermina de modo decisivo el tiempo de semivida en circulación de una glicoproteina en la sangre o su aclaramiento. No obstante, la investigación exacta de las cadenas laterales de hidratos de carbono de una glicoproteina requiere un análisis muy costoso y complejo, que exige un elevado grado de experiencia y de infraestructura instrumental (tal como por ejemplo CG-EM, FAB-EM y espectroscopia de 1H-RMN de alta resolución) . Sobre todo, las autoridades responsables de la autorización de glicoproteinas terapéuticas (por ejemplo EPO), exigen todavia, por razones de seguridad, la determinación muy compleja, que requiere mucho tiempo, cara pero muy inexacta, de la actividad terapéutica de la glicoproteina en experimentos con animales (ensayo in vivo). Sin embargo, seria más conveniente disponer de un ensayo in vitro que, por una parte fuera fácil de realizar y fiable, y por otra, fuera suficiente para los justificadamente elevados requisitos de las administraciones autorizadoras. En relación con la realización de determinaciones adicionales, se ha logrado ya en cierta medida reemplazar los largos y costosos métodos de la glicoanalitica por procedimientos cromatográficos normalizables (Hermentin et al. (1992) Anal. B±ochem. , 203, 281-289; idem., ibid., (1992) 206, 419-429). Sin embargo, hasta ahora no habia ningún parámetro que hubiera satisfecho los requisitos de las administraciones autorizadoras, como sustitutivo de un ensayo in vivo para la biodisponibilidad de una glicoproteina. Por consiguiente, la presente invención se basó en el problema técnico de poner a disposición un procedimiento in vitro que fuese apropiado para determinar el grado de glicosilación de una glicoproteína, de manera tan sencilla y fiable que fuera adecuado para reemplazar los procedimientos in vivo conocidos, por ejemplo para la determinación de la biodisponibilidad y la uniformidad de las tandas. La solución de este problema técnico se logra por la consecución de las formas de realización caracterizadas en las reivindicaciones. Sorprendentemente, se comprobó que el valor Z se correlaciona de manera sobresaliente y bien reproducible con la biodisponibilidad/actividad biológica de una glicoprotei-na, encontradas en los procedimientos in vivo. Debido a la buena reproducibilidad y a la exactitud analítica, Z se puede emplear también ventajosamente en un procedimiento para la determinación de la uniformidad de las tandas. Las presentes investigaciones permiten llegar a la conclusión de que a través de Z se caracteriza el "estado de glicosilación". Por consiguiente, por medio de la determinación de Z se puede comparar de manera sencilla la glicosila-ción. Por "estado de glicosilación" de una glicoproteína se entiende, en relación con la presente invención, la composición de la agrupación de glicanos, a base de glicanos bi-, tri- y tetra-antenarios y su correspondiente grado de sialilación (el contenido en ácido N-acetilneuraminico unido), asi como el contenido en grupos sulfato o fosfato. Por biodisponibilidad de un agente terapéutico de glicoproteína se entiende la capacidad del agente terapéutico para desplegar in vivo su actividad biológica o su eficacia terapéutica. Por consiguiente, la biodisponibilidad y la actividad biológica se determinan de manera decisiva a partir del comportamiento de aclaramiento in vivo, es decir de la separación del agente terapéutico de la circulación sanguínea. Por ejemplo, para el EPO es conocido que, en caso de una ausencia del ácido N-acetilneuraminico fijado en posición terminal a las cadenas de azúcares N-glicosidicos, se elimina muy rápidamente de la circulación sanguínea por medio del llamado "asialo-receptor" en el hígado y, por consiguiente, no puede desplegar su actividad biológica. El Z de una glicoproteina terapéutica se correlaciona dß manera sorprendente con «1 tiempo dß semivida in vivo de la glicoproteina y, por consiguiente, representa un parámetro de medida completamente nuevo, que permite estimar de antemano, de modo y manera muy sencillo, el comportamiento de aclaramiento a esperar de la glicoproteína terapéutica, de tanda a tanda. Consecuentemente, Z permite también una predicción sobre la seguridad biológica a esperar de la glicoproteina, de tanda a tanda, y sobre su actividad terapéutica. Por consiguiente, mediante la determinación de Z de una glicoproteina terapéutica de tanda a tanda, se puede prescindir, por ejemplo, de la determinación muy compleja, que consume mucho tiempo, cara y muy inexacta, de la eficacia terapéutica de la glicoproteina en experimentos con animales (ensayo in vivo). Además, esto posibilita un nueva y considerable contribución a la reducción de los experimentos con animales yr por consiguiente, a una protección mejorada de los animales. Al mismo tiempo, Z representa una medida especialmente apropiada de la uniformidad de las tandas. Sorprendentemente, y de especial valor es también el hecho de que, en el caso de glicoproteinas endógenas, por lo tanto en el caso de, por ejemplo, una glicoproteína de suero humana, en la que la glicosilación varia, por ejemplo, con una enfermedad, el valor Z se puede definir como un parámetro de medida diagnóstico, que se correlaciona con la enfermedad y que, por consiguiente, permite una predicción sobre la gravedad de la enfermedad. Por ejemplo, en el caso de enfermedades inflamatorias, esto es válido por ejemplo para las "glicoproteinas de fase aguda", tal como por ejemplo la a-L-glicoproteina acida, de la que es conocido que la glicosilación varia con la aparición de una inflamación (De Graaf et al. (1993) J. Exp. Med. 177, 657-666). Éste es asimismo el caso en enfermedades tumorales, en las que el contenido en ácido sialínico unido a la proteina (y por lo tanto la glicosilación) varia con el progreso de la enfermedad tumoral (Shahangian et al. (1991) Clin. chßm. 37, 200-204). Por ejemplo, por la determinación del valor Z de una glicoproteína asociada a un tumor de un paciente, se puede hacer una predicción sobre la fase de la enfermedad tumoral, partiendo de la comprobación de que la sialilación varía durante el crecimiento del tumor (Shahangian et al., ibid., pág. 200).

Recientemente, en un volumen especial de Glycokon-jugate J. (volumen 12, n2 3, Junio de 1995) se publicó una serie de artículos que confirman que la glicosilación de determinadas glicoproteinas varía con una enfermedad. Así, por ejemplo, son apropiados la a-fetoproteina para la detección precoz del hepatocarcinoma (Aoyagi, ibid., págs. 194-199), los hidratos de carbono-antigenos circulantes relacionados con los grupos sanguíneos, como marcadores de tumores (0rntoff y Bech. ibid., págs. 200-205), el inhibidor de o^-proteinasa y la haptoglobina para el diagnóstico del carcinoma ovárico (Turner et al., ibid., págs. 211-218), la transferrina para la caracterización del liquido cerebroespinal, para el diagnóstico del abuso secreto del alcohol y del "síndrome de glicoproteinas deficientes en hidratos de carbono" (De Jong et al., ibid. págs. 219-226), así como las glicoformas de la ai-glicoproteina acida para el diagnóstico de inflamaciones y cánceres (Mackiewicz y Mackie icz, ibid., págs. 241-247). En todos estos diagnósticos y en otros más, se puede recurrir ventajosamente al valor Z para la determinación de la fase de la enfermedad de un paciente. Es fundamental para la invención el reconocimiento de que la distribución de los grupos glicano uniformes en cuanto a la carga, en especial de aquéllos con diferente grado de sialilación (desde asialo hasta pentasialo), es una caracteristica decisiva para la biodisponibilidad de una glicoproteina y la uniformidad de las tandas. En tal caso, según la invención, es esencial ponderar los grupos glicano uniformes en cuanto a la carga en relación con su carga, en especial su grado de sialilación. Estas porciones ponderadas se resumen en el valor Z. El valor Z de un glicoproteína se puede determinar muy bien y de manera exacta, por ejemplo por el empleo de un procedimiento optimizado y cromatográficamente normalizado, tal como se describió recientemente (Hermentin et al. (1992) Anal. Biochem. , 203, 281-289).

El valor Z de una glicoproteina se determina debido a que a) se libera y aisla la agrupación de glicanos de la glicoproteina de manera conocida de por sí, por vía química (por ejemplo mediante hidrazinolisis) o por via enzimática (por ejemplo mediante PNGasa F), b) se separa la misma, en pricnpio según la carga, de manera conocida de por sí mediante cromatografía de intercambio de iones (preferentemente mediante HPAE-PAD (cromatografía de intercambio de aniones a pH elevado, con detección amperométrica por impulsos), c) se determinan de manera conocida de por sí las porciones porcentuales de la superficie de los grupos de picos o de glicanos separados según la carga, d) las porciones porcentuales de la superficie de los grupos de picos o de glicanos en el intervalo neutro (asialo-, as), monosialo-(MS) , disialo-(DiS) , trisialo- (TriS), tetrasialo-(TetraS ) y pentasialo-(PentaS) se multiplican por cero (asialo), 1 (MS), 2 (DiS), 3 (TriS), 4 (tetraS) o 5 (PentaS), respectivamente, y e) se suman los productos resultantes en cada caso. Respecto a la determinación de Z, las cadenas de azúcares de las glicoproteínas, enlazadas por Asn, se pueden liberar de modo conocido de por sí, en principio de dos maneras, a saber, por via química (por ejemplo mediante hidrazinolisis) o enzimáticamente (por ejemplo mediante N-glicanasa o PNGasa F). Según el caso, el procedimiento enzimático requiere optimizar las condiciones de reacción -por ejemplo una digestión tríptica previa de la glicoprotei-na, o la adición de un detergente apropiado. Y también la hidrazinolisis requiere un conocimiento especial de la técnica, si se quieren minimizar las reacciones secundarias.

Sin embargo, hoy en día se puede llevar a cabo de manera totalmente automática con un aparato de la entidad Oxford GlycoSystems (el GlycoPrep 1000). En la HPAEC (cromatografía de intercambio de aniones a pH elevado), los N-glicanos se pueden separar en principio según la carga, esto es, según el número de sus radicales de ácido sialínico (Her entin et al. (1992) Anal. B±oahem. 203, 281-289), por lo que es apropiado de manera excelente para la determinación del valor Z de glicoproteinas. Se encontró asi que, al trazar el mapa de la agrupación de N-glicanos de glicoproteínas por medio de HPAE-PAD, los glicanos de igual carga - que por regla general son glicanos con el mismo número de restos Neu5Ac - la mayoria de las veces se pueden reunir en grupos de picos claramente separados unos de otros. A titulo de ejemplo, esto se representa en el ejemplo de la agrupación de glicanos de rhu IL-4R (CHO) (Figura 1). En tal caso, se ha acreditado el empleo de dos patrones internos, de los que uno (Pl = por ejemplo LNnT o LNFP-V, Oxford GlycoSystems) eluye antes de los picos individuales de la agrupación de glicanos y el otro [P2 = (Neu5Ac)3] eluye después de los picos individuales de la agrupación de glicanos, de manera que los glicanos detectados están siempre en el intervalo de tiempos de retención entre los dos patrones, y su superficie total, que corresponde al 100 %, se puede calcular fácilmente con ayuda del soporte lógico de evaluación de la cromatografía. Por consiguiente, la superficie total de los picos se obtiene por integración y suma de los picos que se encuentran entre los tiempos de retención de los dos patrones Pl y P2. Por la misma via se pueden reunir también de modo integrado los grupos de picos separados según la carga, con 0, 1, 2, 3, 4 y 5 cargas negativas, y calcular la superficie "F" de sus correspondientes grupos de picos como porción porcentual de la superficie total de los picos de la agrupación de glicanos. En tal caso, se admite el mismo factor de respuesta para todos los glicanos. El cálculo del número de cargas hipotético Z se realiza según la ecuación I: Z = F(as) * O + F(MS) * 1 + F(Dis) * 2 + F(TriS) * 3 + F (TetraS) * 4 + F(PentaS) * 5 (I) en donde F(as), F (MS) , F (DiS) , F (TriS) , F(TetraS ) y F(Pentas) representan cada uno la porción porcentual de la superficie de los grupos de picos en el intervalo asialo, monosialo, disialo, trisialo, tetrasialo y pentasialo, referido a las superficies de los picos = 100 %. De esta manera, se obtiene para una glicoproteina que presenta predominantemente estructuras tetrasialo-(C4-4 ) tetraantenarias, tal como por ejemplo eritropoyetina recombinante, un Z de aproximadamente 400. Análogamente, para una glicoproteina que presenta predominantemente estructuras trisialo-(C3-3 ) triantenarias, tal como fetuina bovina, un Z de aproximadamente 300, y para una glicoproteína que presenta predominantemente estructuras disialo- (C2-2 ) biantenarias, tal como antitrombina III humana, un Z de aproximadamente 200. Para una glicoproteina que, por ejemplo, presenta sólo estructuras asialo, tal como por ejemplo ribonucleasa B de páncreas de ganado vacuno, o que presentan las llamadas "trunkated forms" (estructuras de tronco), tal como por ejemplo ovomucoide de gallinas, se obtiene un Z de aproximadamente 0. Desde el punto de vista analítico, es deseable separar primero cromatográficamente, según el grado de sialilación, la agrupación de glicanos aislada de una glicoproteina, antes de que se empleen otros métodos de separación que sean necesarios. Esto puede realizarse mediante columnas de intercambio de aniones, tales como por ejemplo Glycopac* DEAE (Waters), Mono TQ* (Pharmacia), Gen-Pack* FAX (Waters), o mediante HPAEC en resinas cambiadoras de aniones, en forma de pelicula (CarboPak PA-1« o CarboPak PA-100®, Dionex) (Lee y Rice (1994) en: "Glycobiology - A Practical Approach", Capitulo 3C, págs. 127-163, IRL Press, compiladores: Fukuda y Kobata).

Recientemente se ha demostrado que la HPAE-PAD satisface de manera excelente los criterios de un método cromatográfico rápido, económico y, sobre todo, bien reproducible, para la ordenación estructural de las cadenas de oligosacáridos de glicoproteínas (Hermentin et al. (1992) Anal. Biochem. 203, 281-289; Hermentin et al. (1992) Anal. Bíoahem. 206, 419-429). En este procedimiento, la separación de los oligosacáridos se realiza bajo condiciones alcalinas en una columna de intercambio de aniones (CarboPac PA-1 o CarboPac PA-100 de la entidad Dionex). Este procedimiento separa los N-glicanos aislados de la glicoproteina, primero según su carga, y hace posible asi una predicción sobre la composición de la agrupación de N-glicanos de estructuras neutras (asialo), asi como mono-, di-, tri- y tetra-sialo (es decir, N-glicanos con cero a cuatro restos de ácido neurami-nico cargados negativamente). La medición de los azúcares se realiza de manera muy selectiva y sensible, y sin derivatización de los glicanos - mediante detección amperométrica por impulsos en un electrodo de oro. La determinación de Z se validó a titulo de ejemplo en numerosos experimentos con rhu IL-4R (una glicoproteina terapéutica de Behringwerke AG) . Con ello se pudo demostrar que el número de cargas hipotético se puede considerar como un nuevo parámetro característico, fiable y de gran poder de predicción, para la glicosilación de proteínas. A continuación se encuentran diversos ejemplos para la determinación de Z a partir de los cromatogramas HPAE-PAD obtenidos. Para ello, los glicanos de diferentes glicoproteínas se liberaron y aislaron de manera conocida de por si, mediante hidrazinolisis automatizada (con empleo de GlycoPrep 1000®, Oxford GlycoSystems, OGS) o por via enzimática (mediante PNGasa F), o se adquirieron directamente como agrupaciones de glicanos de la entidad Oxford GlycoSystems, y se midieron mediante HPAE-PAD en gradientes patrones "P" (Her etin et al. (1992) Anal. Bioahem. 203, 281-289). A titulo de ejemplo, se muestra la determinación de Z en el ejemplo del cromatograma HPAE-PAD de rhu IL-4R (Figura 1); el cálculo correspondiente se encuentra en la Tabla 1. La determinación de Z se realizó análogamente para todos los demás ejemplos. La determinación de Z para la a^-glicoproteina acida (AGP) se desvia algo de la determinación de las otras glicoproteinas mencionadas, porque la AGP presenta en sus N-glicanos restos de fucosa antenaria (Hermentin et al. (1992) Anal. Biochem. 206, 419-429). Tales N-glicanos eluyen en la HPAEC en el gradiente patrón "P" aproximadamente unos 4 min antes, en comparación con el correspondiente N-glicano no fucosilado. Por consiguiente, en el caso de la agrupación de N-glicanos de AGP no se llega a la limpia separación en grupos de picos unitarios según la carga, observada en los otros ejemplos, sino a una superposición de estos grupos de picos (Hermentin et al. (1992) Anal. Biochem. 206, 419-429). La determinación del número de cargas hipotético se realizó en el caso de AGP basándose en la ordenación de los picos según la carga, según Hermentin et al. (1992) (Anal. Biochem. 206, 419-429). Z se determinó de este modo en los Ejemplos 9 y 10. En los casos en que los N-glicanos de una glicoproteina contienen, junto al ácido neuramínico, por ejemplo también grupos sulfato, la determinación de Z se realiza por ejemplo de manera que los grupos de picos separados según las cargas, que están en el cromatograma en el intervalo de 6 o 7 cargas, se multiplican por 6 o 7, respectivamente. Los valores Z determinados para una serie de glicoproteinas están resumidos en la Tabla 3. Los Ejemplos mencionados a continuación no limitan la invención.

Ejemplo 1: Validación de la determinación de Z con rhu IL-4R (CHO) (Tanda E4-930914) a) Validación con 1,0 mg de rhu IL-4R por reactor de hidrazinolisis La determinación de Z se validó con rhu IL-4R (CHO) como glicoproteina de referencia. Para ello, la agrupación de glicanos de la muestra IL-4R (tanda E4-930914, Behringwerke AG) se liberó y aisló en 3 días diferentes en 6 tandas distintas, mediante hidrazinolisis automática - en presencia de LNFP-V como patrón interno Pl - (GlycoPrep 1000», Oxford GlycoSystems; hidrazinolisis simultánea en ambos reactores; cada tanda 1 mg de IL-4R por reactor). Cada una de las 6 agrupaciones de glicanos se desalinizó de forma superfina sobre Sephadex G-25 (Pharmacia) (relleno de la columna 21 x 1 cm) y se midió tres veces (en tres dias distintos; cada vez con adición de P2 = (Neu5Ac)3) en la HPAE-PAD, y del cromatograma obtenido en cada caso se determinó el valor Z correspondiente con ayuda de la ecuación 1. En la Tabla 1 se presentan detalladamente las correspondientes porciones de las superficies de los picos integradas en cada caso para cada uno de las 18 operaciones individuales HPAE-PAD, asi como las sumas realizadas cada vez según la ecuación 1. Como ejemplo ilustrativo y operación de referencia sirve el cromatograma del mapa HPAE-PAD de la Figura 1. En este caso, se determinó Z para la muestras IL-4R mencionada con Z = 201 ± 3 (CV = 1,4 %) con una reproducibi-lidad muy elevada (Tabla 2). b) Validación con 0,5 mg de rhu IL-4R por reactor de hidrazinolisis En un segundo experimento de validación, la hidrazinolisis se llevó a cabo y se promedió en 6 tandas diferentes, de modo análogo al del Ejemplo la) con 0,5 mg de rhu IL-4R por reactor. En este caso se determinó Z con Z = 194 ± 5 (CV = 2,3 %) (Tabla 2).

Tabla 1: Cálculo de Z del perfil del mapa de rhu IL-4R (CHO) (Tanda E4-9300914) de la Figura 1 Ejemplo 2: Determinación de Z de rhu IL-4R (CHO) (Tanda E4-930914) después de digestión con PNGasa F - sin y con CHAPS La liberación de los N-glicanos se realizó después de la reducción de la glicoproteina (500 µg) mediante ditioeritrol (DTE; 25 µl de una solución acuosa de DTE 0,3 M) durante 10 min a 70"C. El exceso de DTE se eliminó por concentración en un cartucho Centricon con limites de exclusión de 10.000 D (entidad Amicon), y el producto concentrado se lavó posteriormente tres veces con tampón de digestión glicanasa en tubitos Centricon. Después, se transfirió el producto concentrado a una capsulita Eppendorf y se digirió en tampón de digestión glicanasa (500 µl) a) con y b) sin la presencia de 0,5 % de CHAPS, mediante PNGasa F (Boehringer Mannheim; 5 unidades) en tampón fosfato sódico 50 mM, pH 7,6, durante 48 h a 37*C. Después de la desalinización, se determinaron los siguientes valores Z de modo análogo al Ejemplo la: a) (sin CHAPS): Z = 208; b) (con CHAPS): Z - 206 (Tabla 2). Por consiguiente, se pudo demostrar que por la adición del detergente CHAPS no se puede lograr ninguna mejora de la desglicosilación. c) Alternativamente, rhu IL-4R se carboxamidometiló, después de la reducción mediante ditiotreitol (DTT), y se digirió mediante tripsina, tal como se describió por Hermentin et al. (1992) (Anal. Biochem. 206, 419). Des- pues, se realizó la liberación de los glicanos de modo análogo al Ejemplo 2b), en presencia de 0,5 % de CHAPS. En este caso se determinó el valor Z como Z = 200 (Tabla 2). d) Análogamente al Ejemplo 2 c), se realizó la digestión del rhu IL-4R mediante la enzima Lis C, en vez de la enzima tripsina.

Por lo demás, se procedió como en el Ejemplo 2 c). En este caso se determinó el valor Z como Z = 204 (Tabla 2). El valor medio de los números de cargas determinados según los Ejemplos 2 a) - 2 d) es Z = 204,5 ± 3,4 (CV = 1,7 %) (Tabla 2). Estos cuatro números de cargas están en buena concordancia con el número de cargas medio determinados en los Ejemplos la y Ib, después de hidrazinolisis automática, de Z = 201 (la; 1,0 mg de IL-4R por reactor) o Z = 194 (Ib; 0,5 mg de IL-4R por reactor). (Tabla 2).

Tabla 2: Validación de la determinación de Z mediante rhu IL-4R (CHO) como glicoproteina modelo Tanda Preparación del grupo de Z Z Desv. CV Número Número Ej. glicanos determivalor tipica de expede nación medio rimentos operaindiviciones dual HPAE-PAD E4-930914 GlycoPrep (1,0 mg/reactor) 201 ± 3 1,4 % 6 18 la E4-930914 GlycoPrep (0, 5 mg/reactor) 194 ± 5 2,3 % 6 18 Ib E4-930914 PNGasa F (sin CHAPS) 208 2a E4-930914 PNGasa F (con 0, 5% CHAPS) 206 2b E4-930914 PNGasa F (tripsina/con 200 204,5 ± 3,4 1,7 % 4 4 2c 0,5 % de CHAPS) E4-930914 PNGasa F (Lis C/con 0,5 % 204 2d de CHAPS Bll- GlycoPrep (0,5 mg/reactor) 243 3 930406 Bll- PNGasa F (sin CHAPS) 241 4a 930406 Bll- PNGasa F (con 0,5% CHAPS) 246 243,5 ± 3,5 1,5 % 2 2 4b 930406 1 1 2 tanda Bii-cnr nfi de rhu IL-4R se puede indicar un valor de Z de 7. = 3-n (Tabla 2). Por consiguiente se encontró que el material del clon Bll-930406 (Z * 243) (Ejemplos 3 y 4), frente al aclaramiento in vivo de una glicoproteina en el modelo de ratón Una preparación de receptor de interleuquina-4 (rmur IL-4R, Behringwerke AG) de ratón, soluble, obtenido a partir de células BHK, se separó en 5 fracciones Q1-Q5 de manera conocida de por sí, sobre una resina intercambiadora de aniones (Q-Sepharose, Pharmacia) (Figura 2). La analítica de las fracciones individuales (enfoque isoeléctrico, determinación de ácido sialinico, contenido en componentes manosacáridos) se llevó a cabo de manera conocida de por si. El modelo de bandas EIE se barrió de manera conocida de por si, mediante un soporte lógico de evaluación de gel. Los barridos de bandas obtenidos están representados en la Figu-ra 3. Los datos analíticos obtenidos de manera conocida de por si se muestran en la Tabla 3. La determinación del contenido en ácido N-acetil-neuramínico (Neu5Ac; ácido sialinico) se realizó según Hermentin y Seidat (en GBT Moaogra.phs, vol. 15, págs. 185--188, H. S. Conradt, compilador, VCH, Weinheim / Nueva York/ Cambridge) . La determinación de monosacáridos se realizó de manera conocida de por sí, según Hardy et al. (Anal. Bíochem. (1988), 170, 54-62). A partir del resultado de la analítica de monosacáridos se determinó el cociente Neu5Ac/Gal (mol/ mol ) . Observación: Puesto que en los N-glicanos normales, el Neu5Ac está siempre unido a restos de galactosa antenarios, el cociente Neu5Ac/Gal (mol/mol) permite un cálculo del contenido en galactosa terminal. La galactosa terminal de los N-glicanos influye de nuevo en el comportamiento de aclaramiento de una glicoproteína, puesto que las glicoproteínas con galactosa terminal en los N-glicanos se eliminan de la sangre, a través del llamado asialo-receptor, en el hígado. Por consiguiente, el grado de sialilación (Neu5Ac/Gal; mol /mol) permite una predicción sobre el aclaramiento a esperar de una glicoproteina en el hígado. Sin embargo, la determinación del grado de sialilación se configura como relativamente inexacta, puesto que en el grado de sialilación se suman las varianzas de ambos ensayos (los de determinación de Neu5Ac y de determinación de Gal). Por consiguiente, es necesario un parámetro más exacto que describa el comportamiento de aclaramiento de una glicoproteína en el caso de aplicación in vivo. A partir del resultado de la analítica de monosacáridos se calculó, además, el cociente de la proporción molar de mañosa y galactosa (Man/Gal; mol/mol), que permite una indicación sobre la composición de los N-glicanos con estructuras de "alto contenido en ma osa" y estructuras "de tipo complejo". Observación: La relación Man/Gal permite asimismo una predicción sobre el comportamiento de aclaramiento a esperar de una glicoproteina, puesto que las glicoproteínas con estructuras de "elevado contenido en mañosa" se eliminan asimismo de la circulación sanguínea a través de un receptor en el higado (el llamado receptor de "elevada mañosa"). Puesto que el contenido en estructuras de "elevado contenido en mañosa" entra en el cálculo del número de cargas hipotético según la ecuación 1, Z refleja también el contenido en estructuras de "elevado contenido en mañosa" y, por consiguiente, permite una predicción del aclaramiento por medio del "receptor de elevada mañosa". El valor Z para las fracciones individuales se determinó análogamente al Ejemplo 1.

Tabla 3: Además, las fracciones individuales se examinaron de manera conocida de por si en cuanto a su comportamiento de aclaramiento en el modelo de ratón (AUD) (Tabla 3). Para ello se inyectaron partes alicuotas de las fracciones individuales en ratones y se siguió el aclaramien-to de rmur IL-4R desde la sangre de los ratones en un ELISA. El régimen de aclaramiento de IL-4R se determinó como sigue: ratones hembra BALB/C recibieron en la vena caudal una inyección en bolo de IL-4R (10 µg, 0,2 µg/kg). Cinco, 10 y 30 min después de la aplicación se extrajeron muestras de sangre, mediante punción del complejo venoso retroorbital, para la obtención de suero. La concentración de IL-4R en las correspondientes muestras de suero se determinó mediante un ELISA. La curva de la concentración de IL-4R determinada en el suero frente al tiempo (AUD5_30) se calculó con empleo de la llamada regla del trapecio (Koch (1985), Apoth. ztg. , 29, fasciculo 17, Abril de 1975). A partir de ella se calculó el aclaramiento inicial (Acl5_30) por la ecuación Acl5_3o = Dosis/AUD5_30.

Resultado: Como es apreciable a partir de los barridos de las bandas EIE mostrados en la Figura 3, resultan en el EIE diferencias que discurran de manera continua en las muestras de bandas de las glicoformas para las fracciones Ql a Q4, mientras que las fracciones Q4 y Q5 en el EIE resultan ser no diferenciables. Sin embargo, el enfoque isoeléctrico implica el inconveniente de que no es explicable cuantitativamente o lo es sólo muy difícilmente, y por consiguiente, más que nada proporciona sólo un parámetro de medida cualitativo. El contenido en ácido sialínico aumenta de modo continuo desde la fracción Ql (13,6 µg/mg) a la fracción Q4 (109,5 µg/mg), mientras que se manifiesta prácticamente idéntico en las fracciones Q4 y Q5 (Tabla 3). Por consiguien-te, los resultados de la determinación de ácido sialinico se correlacionan bien con los resultados del enfoque isoeléctrico. De manera similar al contenido en ácido sialinico, aunque menos acusadamente, aumenta también el grado de sialilación (cociente Neu5Ac/Gal ) desde la fracción Ql (0,20 restos Neu5Ac por resto de galactosa) hasta la fracción Q4 (0,67 restos Neu5Ac por resto de galactosa), pero cae de nuevo en la fracción Q5 (0,63 restos Neu5Ac por resto de galactosa) hasta aproximadamente el valor de la fracción Q3 (0,62 restos Neu5Ac por resto de galactosa) (Tabla 3). Esta caida del valor del análisis de la fracción Q5 hasta el valor de la fracción Q3 no se observó en la determinación de ácido sialínico ni en el enfoque isoeléctrico. Por consiguiente, es de presumir que el grado de sialilación (Neu5Ac/Gal, mol/mol) representa un parámetro menos fiable que la determinación de Neu5Ac o ßl enfoque isoeléctrico, porque en el cociente dßl grado de sialilación se suman las inexactitudes de los dos ensayos individuales (asi, la determinación de ácido neurami-nico y la analítica de los componentes monosacáridos). De modo inverso, el cociente Man/Gal disminuye continuamente desde la fracción Ql (3,02 mol/mol) hasta la fracción Q4 (1,04 mol/mol), y permanece prácticamente constante en la fracción Q5 (0,98 mol/mol), dentro del marco de la exactitud de la medición (Tabla 3). El cociente Man/Gal, debido a su curso continuo desde la fracción Ql a la Q5, aparece de nuevo como un parámetro fiable y que permite hacer predicciones - análogamente a la determinación de Neu5Ac y el enfoque isoeléctrico. El valor Z determinado según la ecuación 1 o el Ejemplo 1 aumenta, como era de esperar, paralelamente al contenido en ácido sialinico y discurre de modo continuo desde Z = 147 (fracción Ql) hasta Z = 248 (fracción Q4), mientras que permanece constante desde la fracción Q4 (Z = 248) hasta la fracción Q5 (Z = 247) (Tabla 3). Por consiguiente, la determinación de Z refleja muy bien tanto los resultados de la determinación de ácido sialinico como también el curso cualitativo del enfoque isoeléctrico, y parece ser superior (al igual que la determinación de Neu5Ac y el EIE) a la determinación del grado de sialilación (Nau5Ac/Gal; mol/mol) . (Sin embargo, en el Ejemplo 6 siguien-te se demuestra que la determinación de Z resulta ser también superior a la determinación de Neu5Ac). El comportamiento de aclaramiento (AUD, área bajo los datos; µg/ml*min) de las fracciones Q1-Q5 se determinó asimismo de manera conocida de por si. En este caso, el tiempo de semivida en circulación del IL-4R en la sangre del ratón es tanto mayor cuanto mayor sea el AUD. Tal como se deduce de la Tabla 3, el AUD aumenta continuamente desde la fracción Ql (AUD = 1) hasta la fracción Q5 (AUD = 86). Por consiguiente, resulta una buena correlación del AUD con el EIE, el contenido en ácido sialinico, el cociente Man/Gal (mol/mol) y el valor Z para las fracciones Q1-Q4. ünicamente para la fracción Q5 resulta una desviación del AUD respecto a los parámetros de medida mencionados. Por consiguiente, se encontró que el aclaramiento se correlaciona estrechamente con el número de cargas y que Z - en comparación con un patrón apropiado - permite una buena predicción del comporta-miento de aclaramiento a esperar de una glicoproteína en la aplicación in vivo. Observación: Por falta de material, no se pudo reproducir si en el caso de esta desviación del AUD respecto a los restantes valores de medida analíticos se trata de un estado de cosas real o de un artefacto (valor anómalo). Además, hay que retener que, por razones de protección de los animales, el AUD se calculó en cada caso con sólo un ratón por punto de medición del AUD, lo que relativiza la fiabilidad del valor AUD en comparación con los valores de medición analíticos. Resultado: Consecuentemente, para la predicción del comportamiento de aclaramiento in vivo a esperar de una glicoprotei-na, el valor Z posee la ventaja especial de que Z, según la ecuación 1, incluye tanto el aclaramiento a esperar a través del asialo-receptor, como también el aclaramiento a esperar a través del receptor de "elevada mañosa" y, por consiguiente, hace posible una predicción del comportamiento de aclaramiento a esperar más exacta que cualquier otro de los métodos de análisis citados.

Ejemplo 6: Z y la estabilidad al almacenamiento de rhu IL-4R (CHO) Para la determinación de la capacidad de almacenamiento de IL-4R en el medio de cultivo del fermentador, se almacenaron partes alicuotas de los cultivos a diferentes temperaturas (temperatura ambiente, +4°C, -20°C y -70°C). Se tomaron partes alícuotas en el momento cero, asi como después de 1, 2 y 3 meses. De estas partes alicuotas se purificó el IL-4R de manera conocida de por si, mediante cromatografía de afinidad sobre un anticuerpo monoclonal anti-IL-4R inmovilizado. En cada caso, se determinó el contenido en ácido neuraminico y el valor Z (análogamente al Ejemplo 1) de las muestras de IL-4R purificadas. Los resultados están resumidos en la Figura 4. Como se aprecia en la Figura 4a, el valor Z para las muestras almacenadas a -70°C y -20°C se manifiesta constante, pero cae claramente en el de las almacenadas a +4°C y masivamente en las muestras almacenadas a temperatura ambiente, al aumentar la duración del almacenamiento. Los resultados de la determinación del ácido neuramínico (Figura 4b) son de un valor de predicción claramente menor, aunque permiten reconocer una tendencia análoga del número de cargas. Por tanto, es evidente que la determinación del número de cargas es superior a la determinación del ácido neuraminico, desde el punto de vista analítico. La ventaja se basa en la elevada exactitud con la que se puede determinar el número de cargas, con la ventaja especial de que para la determinación del número de cargas -al contrario que para la determinación del ácido neuramínico - no es necesaria la referencia a la concentración de (glico)proteina y, por consiguiente, la inexactitud de la determinación de la proteina no entra en el resultado del ensayo. Por consiguiente, se pudo demostrar que el valor Z es apropiado de manera sobresaliente como parámetro para examinar la estabilidad al almacenamiento de una glicoproteina.

Ejemplo 7: Determinación del valor Z de rhu EPO (BHK) La liberación de los N-glicanos se realizó a partir de rhu EPO (BHK) (Merckle AG) por medio de PNGasa F, de manera conocida de por sí (Nimtz et al., Eur. J. Biochem. (1993) 213, 39-56). El valor Z se determinó análogamente al Ejemplo 1, con Z = 323 (Tabla 4). Observación: Nimtz et al. (Eur. J. Biochem. (1993) 213, 39-56) investigaron muy extensamente la glicosilación de rhu EPO (BHK) (Merckle AG) en un detallado estudio analítico (mediante CG-EM, FAB-EM y 1H-RMN) . Según el mismo, la agrupación de N-glicanos del citado rhu EPO (BHK) contiene 40,9 % de N-glicanos tetrasialilados, 35,0 % de N-glicanos trisialila-dos y 21,1 % de N-glicanos disialilados. A partir de estos datos, se calcula para la agrupación de N-glicanos, con empleo de la ecuación 1, un valor Z de Z = 40,9x4 + 35,0x3 + 21,1x2 = 311. Sorprendentemente, este número de cargas de Z = 311, calculado según los datos de Nimtz et al., está en muy buena concordancia con el número de cargas de Z = 323 calculado según el Ejemplo 1. La diferencia entre ambos números de cargas es de 12, lo que corresponde a una diferencia porcentual menor que 4 %. Sin embargo, la determinación del número de cargas según el Ejemplo 1 se configura como comparativamente mucho más barata, rápida y sencilla. Por consiguiente, el valor Z se revela como un nuevo parámetro de medida mucho más útil y ventajoso para la caracterización del estado de glicosilación de una glicoproteina.

Ejemplo 8: Determinación del valor Z de rhu EPO (CHO) La liberación de los N-glicanos se realizó a partir de rhu EPO (CHO) (Boehringer Mannheim) por medio de PNGasa F, de manera conocida de por sí (Nimtz et al., ibid.). El valor Z se determinó análogamente al Ejemplo 1, con Z = 361 (Tabla 4). Observación: Watson et al. ( Glycobiolog (1994) 4, 227-237) investigaron la glicosilación de rhu EPO (CHO) (Amgen), asimismo en un detallado estudio analítico. Según dicho estudio, los N-glicanos del citado rhu EPO (CHO) están sialilados en más del 90 %, lo que explica el elevado número de cargas, en comparación con el BHK-EPO del Ejemplo 9. Watson et al. (ibid) separaron la agrupación de N-gl i -canos obtenida por digestión con PNGasa-F, sobre una columna de intercambiador de aniones DEAE Glycopack® de la entidad Waters. El cromatograma reproducido en la Fig. 1 de la publicación de Watson et al. (pág. 228) se aprovechó en el marco de la presente invención para la determinación de Z según la ecuación 1. En este caso se determinó para el CHO-EPO de Amgen un Z = 367, que está en muy buena concordancia con el número de cargas de Z = 361 determinado en el Ejemplo 8 para el CHO-EPO de Boehringer Mannheim. En el trabajo de doctorado de C.H. Hokke (Hokke et al. (1993), en Hokke, C.H. "Structure determination of glycoprotein glycans" (tesis doctoral), págs. 51-90) está descrita, la explicación detallada de las estructuras de los azúcares de rhu EPO (CHO) de la entidad Organon Technika. En tal caso, se pudo demostrar para este EPO que en el 18-20 % de los N-glicanos faltaba un radical de ácido neuraminico, y en el 3 % de los N-glicanos, dos de dichos restos. Los datos presentados por Hokke permitieron el cálculo de Z en el marco de la presente invención, para dar un Z = 286. Este número de cargas está claramente disminuido frente al Z del CHO-EPO de Amgen (Z = 367) y al Z del CHO-EPO de Boehringer Mannheim (Z = 361), pero también frente al Z de BHK-EPO de Merckle (Z = 323). Por esta razón, se debe aceptar para el CHO-EPO de la entidad Organon Teknika un aclaramiento marcadamente elevado y - unido con ello - una actividad biológica marcadamente menor. Observación: Tal como se indica en los Ejemplos precedentes y en el texto de introducción, la glicosilación (y por lo tanto el número de cargas) puede variar de tanda a tanda, según la obtención de la glicoproteina correspondiente. Esto se comprueba una vez más en los Ejemplos 9 y 10.

Ejemplo 9: Z y la comparación de diferentes agrupaciones de N-glicanos de AGP Hermentin et al. (Anal. Biochem. (1992) 206, 419--429) realizaron una comparación de agrupaciones de N-glicanos de AGP (tanda 281184, Behring erke AG) preparadas por distintas vias, y las compararon con una "N-Glycan Library" de AGP (LB-001, OGS) adquirida comercialmente. Los cromato-gramas de mapas HPAE-PAD obtenidos en cada caso se publicaron (Hermentin et al., ibid.). En la publicación mencionada se demostró que los cromatogramas de mapas se diferenciaban como consecuencia de la pérdida de ácido N-acetilneuraminico unido - y esto se documentó por una superposición de los cromato-gramas de mapas (Hermentin et al., ibid., Fig. 5). En el marco de la presente invención, se determinó (análogamente al Ejemplo 1) retrospectivamente el número de cargas correspondiente para los cromatogramas de mapas de AGP publicados por Hermentin et al. (ibid., Fig. 5). En este caso resultó un aumento del número de cargas, tal como sigue: Operación a: Z = 248 (LB-001, OGS; "derivado de hidrazinolisis" ) Operación b: Z = 262 ("hidrazinolisis a gran escala", 50 mg de AGP) Operación c: Z = 276 ("hidrazinolisis a gran escala", 1.000 mg de AGP) Operación d: Z = 285 ("hidrazinolisis automatizada", 2 mg de AGP Operación e: Z = 289 ("derivado de PNGasa-F, después de digestión AGo triptica previa) Los valores Z de las operaciones, con sus correspondientes números de cargas, aportan pruebas de la diferente naturaleza de los grupos de glicanos. Pero también justifican el hecho de la analogía de los cromatogramas de las operaciones d e, probados por Hermentin et al. (ibid.) a través de la comparación de los cromatogramas de mapas. Esto aporta de nuevo pruebas del significado de gran poder de predicción, útil y por tanto ventajoso del número de cargas Z. cargas Z .

Ejemplo 10: Z y la digestión PNGasa F de AGP Observación: Del AGP es conocido que, sin una digestión tríptica previa y/o una adición de detergentes especiales, sus N-glicanos sólo se puede disociar de un modo incompleto con PNGasa F (Nuck et al. (1990), Glycoaonjus»te J. 7, 279-286). En el Ejemplo 10 se muestra que la obtención incompleta de la agrupación de N-glicanos de AGP (en el caso de empleo de PNGasa F) se puede reconocer mediante el cálculo del número de cargas (análogamente al Ejemplo 1): Para ello, se aislaron los N-glicanos de AGP (tal como se describió en los Ejemplos 7 y 8) después de 48 horas de incubación con PNGasa F. De la agrupación de N-glicanos aislados se determinó el número de cargas, de modo análogo al Ejemplo 1, para dar Z = 248. Este valor está claramente por debajo del valor de Z = 289 determinado según el Ejemplo 9 ("Operación e"). Por consiguiente, con ayuda de los números de carga se puede deducir que en caso de incubación de AGP con PNGasa F según el Ejemplo 10 (por lo tanto, sin la digestión con AGP tríptica previa empleada en el Ejemplo 9), manifiestamente los N-glicanos más altamente cargados se disocian de manera especialmente dificil. Esto confirma de nuevo la importancia de gran poder de predicción, útil y por tanto ventajosa del número de cargas Z y de su importancia como parámetro diagnóstico del estado de glicosilación de una glicoproteina. Por ejemplo, mediante la determinación de los valores Z de AGP de donantes individuales se puede hacer una predicción sobre el grado de una inflamación (De Graf et al., J. Exp. Med. (1993), 177, 657-666).

Ejemplo 11: Z de diferentes glicoproteínas Puesto que el valor Z se ha revelado como un parámetro de medida nuevo y muy útil y ventajoso para la caracterización del estado de glicosilación de una glicoproteina, en la Tabla 4 están indicados, a título de ejemplo, números de cargas de diferentes glicoproteínas, determinados análogamente al Ejemplo 1. El origen de cada glicoproteína y la preparación u origen de la respectiva agrupación de N-glicanos (preparación mediante hidrazinolisis o PNGasa F, o adquirida comercialmente de la entidad Oxford GlycoSystems (OGS), Abingdon, Inglaterra) es asimismo visible en la Tabla 4. Por consiguiente, los valores Z se prestan de manera muy ventajosa para la caracterización del estado de glicosilación de una glicoproteina.

Tabla 4 Descripción de las Figuras Figura 1 La Figura 1 muestra el perfil del mapa de N-glicanos de rhu IL-4R (tanda E4-930914) después de separación mediante HPAE--PAD bajo condiciones normalizadas, según Hermentin et al., Anal. Biochem. 203 (1992) págs. 281-289. Observación: Pl: patrón interno 1 P2: patrón interno 2 Los glicanos se encuentran en el cromatograma entre Pl y P2.

Los picos delante de Pl proceden de la hidrazinolisis; los picos detrás de P2 son de naturaleza desconocida. Figura 2 La Figura 2 muestra el fraccionamiento de rmur IL-4R (tanda 018PP) mediante cromatografía de intercambio de aniones en Q-Sepharose FF. Figura 3 La Figura 3 muestra el enfoque isoeléctrico (EIE) de las fracciones de rmur IL-4R, tanda 018PP, obtenidas en Q-Sepharose según la Figura 2. Los datos analíticos correspondientes se encuentran en la Tabla 3. Figura 4 La Figura 4a muestra la caída de Z, la Figura 4b la caida del contenido en NANA, de rhu IL-4R en la porción sobrenadante del cultivo, en el almacenamiento a temperatura ambiente (RT), +4"C, -20'C y -70°C.

Claims (2)

1. Reivindicaciones la.- Procedimiento para la caracterización de la glicosilación de una glicoproteína, por medio de un número de cargas hipotético (Z), que se obtiene debido a que a) se aisla la agrupación de glicanos de la glicoproteina, b) dichos glicanos se separan mediante cromatografía de intercambio de iones, primero según la carga, c) se determinan las porciones porcentuales de superficie de los grupos de picos (de los glicanos) separados según la carga, d) las porciones porcentuales de superficie de los grupos de picos en el intervalo neutro (asialo), monosialo (MS), disialo (diS), trisialo (TriS), tetrasialo (TetraS) y pentasialo (PentaS) se multiplican por cero (asialo), 1 (MS), 2 (DiS), 3 (TriS), 4 (TetraS) o 5 (PentaS), respectivamente, y e) se suman los productos resultantes en cada caso. 2^.- Procedimiento para la determinación in vitro de la biodisponibilidad de una glicoproteína, en el que el número de cargas obtenido para la glicoproteina con el procedimiento según la reivindicación ía se relaciona con un valor patrón que ha sido obtenido en una determinación in vivo. 3a.- Procedimiento para la determinación in vitro de la biodisponibilidad de una glicoproteina, en el que el número de cargas obtenido para la glicoproteina con el procedimiento según la reivindicación la se relaciona con un valor patrón que ha sido obtenido por cálculo. 4a.- Procedimiento para la determinación de la uniformidad de las tandas de una glicoproteína, en el que el número de cargas obtenido para la glicoproteína con el procedimiento según la reivindicación la se relaciona con un valor patrón que ha sido obtenido con el procedimiento según la reivindicación la para una preparación patrón. 5a.- Procedimiento para la determinación de la uniformidad de las tandas de una glicoproteína, en el que el número de cargas obtenido para la glicoproteína con el procedimiento según la reivindicación la se relaciona con un valor patrón que ha sido obtenido por cálculo. 6a.- Procedimiento según la reivindicación la, caracterizado porque la liberación de la agrupación de glicanos desde la glicoproteína se realiza por hidrazinolisis. 7a.- Procedimiento según la reivindicación la, caracterizado porque la liberación de la agrupación de glicanos desde la glicoproteína se realiza por via enzimáti-ca. 8a.- Procedimiento según la reivindicación la, caracterizado porque la cromatografía de intercambio de iones es una HPAE-PAD (cromatografía de intercambio de aniones a pH elevado, con detección amperométrica por pulsos). 9a.- Procedimiento según la reivindicación la, para la caracterización del estado de glicosilación de una glicoproteina. 10a.- Procedimiento según la reivindicación 2a o 3a, para la comprobación de la biodisponibilidad de una glicoproteína. 11».- Procedimiento según la reivindicación 4a o 5 , para la comprobación de la uniformidad de las tandas de una glicoproteina producida por tecnología celular. 12a.- Utilización de un procedimiento según la reivindicación la, como agente auxiliar de diagnóstico o como agente de diagnóstico. 13a.- Procedimiento según la reivindicación la, para la comprobación del estado de la enfermedad de una especie, a través de su estado de glicosilación de una glicoproteina caracteristica de la enfermedad. 14a.- Procedimiento según la reivindicación la, para la comprobación del estado de la enfermedad de un paciente, a través del estado de glicosilación de una glicoproteína caracteristica de la enfermedad. 15a.- Procedimiento según la reivindicación 7 , caracterizado porque la liberación se realiza mediante PNGasa F.