MXPA98000685A - Peptido antigenico ha-2 - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a la primera secuencia de péptidos de un antígeno H llamado menor. Los antígenos menores H se asocia con la enfermedad del huésped contra el injerto. El péptido y sus derivados encuentran muchos usos en el transplante de la médulaósea, transplante deórganos y en el tratamiento de la leucemia. El péptido y sus derivados se pueden incorporar en vacunas, formulaciones farmacéuticas y se pueden usar en equipos de prueba de diagnóstico. El péptido se deriva a partir del antígeno menor de HA-2 y tiene la secuencia YXGEVXVSV, en donde X representa una leucina o un residuo de isoleucina. Tanto los donadores como los recibidores en el transplante de la médulaósea se pueden tratar con los péptidos, opcionalmente en combinación con otros péptidos, acoplados a portadores, con excipientes y/o adyuvantes adecuados.

Description

PÉPTIDO ANTIGÉNICO HA-2 Esta invención se refiere al campo de la inmunología, especialmente la inmunología celular. En particular, se refiere al área del transplante de órganos, tejidos y células (especialmente la médula ósea) y las posibles reacciones inmunológicas provocadas por estos transplantes. Un transplante de la médula ósea (BMT, por sus siglas en inglés) encuentra su aplicación clínica en el tratamiento de por ejemplo anemia aplástica, severa, leucemia y enfermedad de inmunodeficiencia. En los días anteriores, muchos de estos transplantes dieron por resultado el rechazo del transplante o en la enfermedad del huésped contra el injerto (GvHD) . Hoy en día, es claro que estos efectos son debidos grandemente a la presencia de los antígenos principales H los cuales funcionan como una barrera principal del transplante. Por consiguiente, el éxito mejorado en el transplante de la médula ósea se reportó cuando se tomó en cuenta la correspondencia con los antígenos HLA. Hoy en día, se usan como una fuente para el material donador principalmente hermanos con HLA idénticos o individuos no relacionados con correspondencia de HLA. Aún, a pesar REF: 26768 de las me-joras en la correspondencia con HLA, asi como las mejoras en la quimioterapia y/o radioterapia pre-transplante y el uso de potentes fármacos inmunosupresores, como profilaxis, así como mejores antibióticos y mejores técnicas de aislamiento para el material donador, aproximadamente 20-70 % (dependiendo de su edad) de los recibidores aún sufren del GvHD. Un GvHD, las células T donadoras, inmunocompetentes reaccionan contra los tejidos del huésped. Por lo tanto, la donación de la médula a partir de la cual sellan removido las células T maduras ha llegado a ser un régimen frecuentemente usado. Sin embargo, esto conduce frecuentemente al rechazo o falla del injerto, así como la recurrencia de la enfermedad original, que es particularmente dramática la leucemia. Los problemas aún asociados (de manera particular) con el transplante en humanos se pueden atribuir escasamente a los antígenos principales H, puesto que el donador y el recibidor se seleccionan rutinariamente para la identidad de HLA. Por esto, la GvHD se puede provocar por la disparidad de los productos de los sistemas H llamados "menores" (mHag) , es decir, los antígenos de histocompatibilidad diferentes de aquellos codificados por el MHC.

Los Hag se han descubierto originalmente en estudios de rechazo de tumores y piel entre cepas congénitas de ratones. Se han diferido más de 40 locus de mHag, dispersados sobre el genoma, pero las estimaciones predicen la existencia de varios cientos de locus. Uno de los antígenos menores H mejor conocidos es el antígeno HY. Los varios reportes han demostrado la presencia de CTL específico anti-mHag del huésped en pacientes que sufren de GvHD después del BMT. genotípicamente idéntico (1-7) de HLA. En el laboratorio, se ha puesto mucho esfuerzo en la caracterización adicional de un número (pequeño) de CTL específicos anti-mHag del huésped. Para este fin, los clones de CTL específicos para mHag del huésped se aislaron de la sangre periférica (PBL) de los pacientes que sufren GvHD severa (8). Los análisis inmunogenéticos subsecuentes revelaron que los clones de CTL (como se describe anteriormente) identificaron cinco mHag no enlazados sexualmente, designados HA-1, -2, -3, -4, -5, que se reconocen de la manera restringida clásica de MHC (8) . El HA-3 de mHag se reconoce en la presencia de HLA-Al y los HA-1, -2 , -4 y -5 de mHag requieren la presencia del HLA-A2. Los estudios de segregación demostraron que cada nño de HA-1 a HA-5 de mHag es el producto de un gen individual que segrega de una manera Mendeliana y que HA-1 y HA-2 no se codifican dentro de la región de HLA (9) . El mHag difiere de otros en las frecuencias de los fenotipos; el HA-2 de mHag apareció muy frecuente (es decir, 95 %) y en la población saludable positiva a HLA-2 (10) . Con respecto al mHag expresado en diferentes tejidos, se observó la distribución del tejido oblicua contra restringida del mHag analizado (11) . La expresión de HA-2 de mHag se restringe a las células del linaje celular hematopoyético tal como timocitos, linfocitos de la sangre periférica, células B y/o monocitos. También, las células que presentan el antigeno, profesionales, derivadas de la médula ósea; las células dentríticas y las células de Langerhans epidérmicas expresan el HA-2 de mHag (11, 12) . El HA-2 de mHag también se expresa en las células madres hematopoyéticas (13) en las células precursoras de la leucemia clonogénica (14), así como en las células de leucemia linfoide y mieloide, recientemente aisladas (15) . Para comprobar la importancia de los sistemas antigénicos H, humanos, se investigó si el mHag se conserva en la evolución entre humanos y primates no humanos. " Para esto, las células a partir de primates no humanos se transfectaron con el gen de HLA-A2.1 humano. Y los análisis subsecuentes con los clones de CTL restringidos con HLA-A2.1, halo, humano y cuatro de HLA-A2.1 de mHag revelaron la presentación de los péptidos HY, HA-1 y HA-2 de mHag y halo del simio y mono en el contexto de la molécula de HLA-A2.1 humana, transfectada por las células objetivo del simio y mono. Adicionalmente, los péptidos se leyeron a partir de las moléculas de HLA-A2.1 expresadas en las células transfectadas del simio. Una fracción positiva de HA-2 se identificó por mostrar el mismo comportamiento en HPLC de fase invertida como la fracción de HA-2 derivada a partir de EBV-LCL humano. Esto implica que el péptido HA-2 se conserva durante al menos 35 millones de años (16) . Un estudio en perspectiva se realizó a fin de documentar el defecto de mHag en BMT genotípicamente idéntico de HLA en la ocurrencia de GvHD aguda (grado > 2) . Los resultados de la tipificación de mHag usando los clones de CTL específicos para cinco HA-1 a HA-5 de mHag, bien definidos, demostraron una correlación significante entre la desigualdad de HA-1, -2, -4 y -5 de mHag y GvHD (17) .

La presente se dirige a la caracterización bioquímica de los antígenos mH humanos. Para esto, se hace uso de las técnicas de inmunopurificación y bioquímicas aplicadas exitosamente por Rammensee y sus colaboradores (18, 19) para extraer los péptidos H murinos de las moléculas de MHC. En realidad, la separación por HPLC de moléculas Mr bajas (< de kD) obtenidas a partir de las moléculas de HLA-A2.1 clase I de MHC pareció ser exitosa. Las fracciones con la actividad sensibilizante para los clones de CTL específicos de HA-2 del antígeno h enlazados sexualmente se aislaron (20) . Para analizar la naturaleza peptídica del HA-2 del mHag, dieron a cabo dos conjuntos de experimentos. Primero, la actividad sensibilizante de las fracciones que contienen mHag, obtenidos como se describe anteriormente, es susceptible al tratamiento con proteasa, es decir, la incubación de estas fracciones de HPLC que contienen mHag con pronasa o proteinasa K abolió la actividad sensibilizante (21) . Segundo, los productos génicos TAP1 y TAP2 codificados por MHC se requirieron para la presentación peptidica de mHag en la superficie celular. Los genes transportadores TAPl y TAP2 asociados con la presentación del antígeno se requieren para la distribución de los péptidos desde el citos l con el retículo endoplásmico (22) . La disponibilidad de una línea celular humana "T2" que carece de los genes de las subunidades tanto de transporte como de proteasoma permitieron el estudio del procesamiento y presentación de los antígenos mH humanos. Se demostró que los productos génicos TAP1 y TAP2 de transporte (rata) se requirieron para el procesamiento y presentación de los péptidos antigénicos del virus de influenza y de la proteína HA-2 de mH, intracelular (23) . Sin embargo, hasta en la presente invención, no se ha tenido éxito en la identificación de las secuencias de aminoácidos de los péptidos antigénicos pertinentes en el sistema mHag ni se ha obtenido ningún éxito en la identificación de las proteínas a partir de las cuales se derivan. Ahora se ha identificado por primera vez un péptido que es una parte pertinente de HA-2 de mHag. De esta manera, esta invención proporciona un (poli) éptido que comprende un epítope de las células T que se puede obtener a partir del antígeno menor de histocompatibilidad HA-2 que comprende la secuencia YXGEVXVSV o un derivado del mismo que tiene propiedades inmunológicas similares, en donde X representa una leucina o un residuo de isoleucina.

"La manera en que se obtienen estas secuencias se describe en la parte experimental. Una parte importante de este nuevo método para arribar a esta secuencia es la purificación y la elección del material de inicio. Este nuevo método es por esto también parte del alcance de esta invención. Sin embargo, ahora que se conoce la secuencia, por supuesto no es necesario por más tiempo seguir ese método, debido a que los péptidos se pueden elaborar fácilmente de manera sintética, como es bien conocido en la técnica. Puesto que las técnicas de rutina están disponibles para la producción de péptidos sintéticos, también está dentro de la habilidad de la técnica arribar a los análogos y derivados de los péptidos descritos explícitamente, análogos y/o derivados que pueden tener las mismas o por lo menos similares propiedades y/o actividad. Por otra parte, los análogos que contrarrestan la actividad de los péptidos descritos explícitamente también están dentro de la habilidad de la técnica, dado la enseñanza de la presente invención. Para esto, los análogos y/o derivados, sean de la misma o diferente longitud, sean agonistas o antagonistas, sean similares a péptidos o peptidomiméticos, son parte del alcance de esta invención. Una modalidad preferida de la presente invención^ es el péptido con la secuencia YIGEVLVSV que induce la lisis de la célula que la presenta a una concentración muy baja del péptido presente. Esto no implica que el péptido que induce la lisis a concentraciones superiores no sea adecuado. Esto será dependiente en gran parte de la aplicación y de otras propiedades de los péptidos, que no se pueden probar todos dentro del alcance de la presente invención. Los péptidos y otras moléculas de acuerdo con la invención encuentran su utilidad en que se pueden usar para inducir la tolerancia de los sistemas inmunitarios del donador en donadores negativos de HA-2, de modo que los linfocitos residuales de la sangre periférica en el órgano eventualmente transplantado o en la médula ósea, como este, no puedan responder al material de HA-2 del huésped en un recibidor positivo a HA-2. De esta manera, se impide la GvHD. Por otra parte, se puede inducir tolerancia de los recibidores negativos a HA-2 básicamente de la misma manera, de modo que en el recibidor de un órgano o médula ósea de un .donador positivo a HA-2 no ocurra el rechazo basándose en el material de HA-2. Puede ser el caso que el péptido HA-2 actúe de una manera restringida, no alélica. En ese caso, la inducción de tolerancia no se restringe a los individuos negativos a HA-2.

-Para la inducción de tolerancia, se pueden dar repetidamente dosis muy pequeñas, por ejemplo de manera intravenosa, pero también pueden ser muy adecuadas otras rutas de administración. Otra posibilidad es la administración oral repetida de altas dosis de péptidos. Los péptidos se pueden dar solos o en combinación con otros péptidos, o como parte de grandes moléculas, o acoplados a materiales portadores en cualquiera de los excipientes adecuados. Las aplicaciones adicionales del péptido o • derivados del mismo radican en la administración profiláctica del mismo a individuos transplantados para impedir la GvHD. Esto se puede hacer ya sea con agonistas, o posiblemente en combinación con un adyuvante, o con antagonistas que puedan bloquear las células responsables. Esto se puede hacer con o sin la administración concomitante de citocinas. Adicionalmente, los péptidos de acuerdo con la invención se pueden usar para preparar agentes terapéuticos capaces de eliminar un subconjunto de células, directamente o de manera indirecta, especialmente células de origen hematopoyético. Esto se puede ilustrar por los siguientes ejemplos, que hacen referencia a los agentes terapéuticos relacionados a la leucemia. a) Un recibidor positivo a HA-2 (en el transplante de la médula ósea) se puede someter a un régimen de acondicionamiento antes del transplante de la médula ósea. Esto significa que un agente que reconoce específicamente un péptido de acuerdo con la invención (un péptido HA-2) como se presentan las células hematopoyéticas, agente que induce a la eliminación de las células que presentan dicho péptido, se administra al recibidor antes del transplante. Este agente iluminará todas las células residuales (células leucémicas) de origen hematopoyético. Este agente incluye, pero no se limita a, células T (proporcionadas preferentemente con un gen suicida) y/o anticuerpos acoplados a porciones tóxicas. b) Un donador negativo a HA-2 para el transplante de médula ósea se puede vacunar con un péptido de acuerdo con la invención, un péptido HA-2. En el transplante a un recibidor positivo a HA-2, el sistema inmunitario del donador puede eliminar cualquiera de las células que presentan el péptido HA-2 residual o recurrente en el recibidor que son por supuesto leucémicas, c) Un recibidor positivo a HA-2, transplantado, transplantado con médula ósea negativa a HA-2 (o para esa materia, positiva a HA-2) y que sufre de enfermedad recurrente (recaída) , es decir, células leucémicas positivas a HA-2, se puede tratar con (nuevamente) un agente que reconoce específicamente un péptido de acuerdo con la invención (un péptido HA-2) como se presentan las células hematopoyéticas, agente que induce la eliminación de las células que presentan dicho péptido. En el caso de la médula ósea positiva a HA-2 que se transplanta a un recibidor positivo a HA-2, es aún esencial (en el caso de la enfermedad recurrente) eliminar todas las células positivas a HA-2 aunque esto incluya el material transplantado, debido a que de otra manera la leucemia positiva a HA-2 matará al recibidor. En este último caso, el paciente se puede volver a transplantar, si es necesario . Las aplicaciones de diagnóstico están claramente dentro de la habilidad de la técnica. Incluyen, pero no se limitan a: tipificación de HA-2, detección de aberraciones genéticas y similares. Otras aplicaciones terapéuticas del péptido incluyen la inducción de tolerancia a proteínas HA-2 en enfermedades (auto) inmunitarias relacionadas a HA-2, tal como posiblemente en la artritis reumatoide. Por otra parte, se pueden usar en vacunas, en enfermedades (auto) inmunitarias relacionadas a HA-2. ?n base al péptido descrito en la presente, se pueden reproducir sondas genéticas que se pueden usar para seleccionar el gen que codifica la proteina. Por otra parte, estas sondas pueden ser útiles también en equipos de detección. En base al péptido descrito en la presente, se pueden producir células B y/o células T y anticuerpos anti-idiotípicos . Todas estas modalidades se han hecho posible por la presente descripción y por esto son parte de la presente invención. Las técnicas para producir estas modalidades están todas dentro de la habilidad de la técnica. Los intervalos de dosis de los péptidos y anticuerpos y/o otras moléculas de acuerdo con la invención que se van a usar en aplicaciones terapéuticas como se describe posteriormente en la presente se diseñan usualmente en base a estudios de dosis crecientes en la clínica. Las dosis para los péptidos pueden estar entre aproximadamente 0.1 y 1000 µg por kg de peso corporal, preferentemente entre aproximadamente 1 y 10 µg por kg de peso corporal. La invención se describirá en detalle más explicativo en la siguiente parte experimental.

PARTE EXPERIMENTAL Usando clones de CTL específicos de mHag como herramientas in vitro, se han aislado algunos mHag murinos y humanos a partir de moléculas de MHC por elución con ácido y se muestran que son péptidos presentados por las moléculas de MHC (13, 14) . La caracterización adicional, es decir, la secuencia exacta de aminoácidos de los péptidos de mHag y la identificación de las proteínas a partir de las cuales se originan estos mHag, no se han reportado hasta ahora. Únicamente, se ha caracterizado un número pequeño de mHag murinos "definidos en forma no convencional" similares a los alelos de microglobulina ß2 codificado por HA-3 (15) y el antígeno maternalmente transmitido, codificado, mitocondrial, restringido de Hmt (16) . Aquí, se reporta la identificación, por espectrometría de masas en tándem, del epítope HA-2 de mHag restringido de HLA-A2.1. Para aislar las moléculas HLA-A2.1, HLA-A2 de mHag se purificaron por cromatografía por afinidad de los linfocitos B transformados con el Virus de Epstein Barr (EBV) positivo a HLA-A2.1 (EBV-BLCL) que expresan HA-2. Los péptidos unidos a HLA-A2.1 se aislaron por el tratamiento con ácido seguido por la filtración a 10 kD (14} . Estas moléculas de baja masa molecular se fraccionaron por HPLC de fase invertida y se analizaron las fracciones individuales para la actividad sensibilizante de HA-2 de mHag por la incubación con la línea celular T2 de linfoblastoides, positiva a HLA-A2.1, negativa a HA-2 en un ensayo de liberación de 51Cr. Una fracción (fracción 33 sensibilizó T2 para la lisis por el clon de CTL específico a HA-2, 5H17 (17) (Figura la). Cuando esta fracción se volvió a cromatografiar usando un • gradiente más superficial, se observó una actividad sensibilizante de HA-2 en las fracciones 37 y 38 (Figura lb) . Sin embargo, como se valora usando la espectrometría de masas en tándem, con HPLC microcapilar/ionización por electrorrociado, estas últimas fracciones contuvieron aún más de 100 péptido de unión de HLA-A2 diferente (18) . Para determinar cual de los péptidos fue responsable para la actividad sensibilizante de HA-2, se analizó la fracción 37 usando un divisor en línea (19) , permitiendo la comparación de los datos espectrométricos de masa por el resultado del ensayo funcional. La Figura 2a muestra un valor máximo individual de la actividad sensibilizante de HA-2 en cuatro pozos adyacentes. A partir de los muchos péptidos presentes en estos pasos, el perfil de abundancia iónica relativa de los cuatro péptidos (con relaciones de masa a carga) (m/z) de 651, 869, 979, 1000) igualó el perfil de actividad de la actividad de la actividad de CTL específica de HA-2. El análisis de la disociación actividad por colisiones (CAD) realizado para las especies con m/z 979 reveló la existencia de 2 péptido diferentes, YXGEVXVSV y SXDFGTXQV (Figura 3a y 3b) . La X está para L o l, que no se puede distinguir por espectrometría de masas bajo estas condiciones. Las# mezclas de péptidos sintéticos se elaboraron con una mezcla equimolar de L e I en lugar de X y se ensayaron para la actividad de CTL sensibilizante específica de HA-2. Sobre la incubación con la mezcla de péptidos YXGEVXVSV dio por resultado la lisis de T2 (20) . A fin de definir adicionalmente el péptido necesario, natural, se sintetizaron cuatro péptidos individuales con I o L en las posiciones dos y seis y se realizaron los estudios de coelución por HPLC microcapilar de estos péptidos sintéticos y de la fracción aislada. El péptido YIGEVIVSV no co-eluyó con el péptido procesado, natural y por lo tanto se puede excluir como el epítope procesado, natural, mientras que los otros tres péptidos, YIGEVLVSV, YLGEVLVSV y YLGEVLVSV co-eluyeron (21) . Estos tres péptidos sensibilizaron todos la línea celular T2 para la lisis por el clon 5H17 (Figura 4) . El péptido YIGEVLVSV indujo 50 % de lisis a una concentración de 409 pM, mientras que estas concentraciones fueron sustancialmente superiores para los péptidos YLGEVLVSV y YLGEVIVSV (1.5 nM y 2.5 nM) . Las tres concentraciones están dentro del intervalo de 10 pM-50 nM establecida por otros epítopes procesados de forma natural (19, 22) . El clon 5H213 es un CTL derivado de manera independiente que, basándose en el análisis de-panel, también reconoce a HA-2, pero difiere ligeramente en su especificidad fina de reconocimiento de antígenos de 5H17 (10, 23) . El* clon 5H13 también reconoció las tres variantes de péptido (Figura 4b) . Mientras que la concentración de los péptidos necesaria para dar la resolución media máxima del epítope fue de 5-10 veces más alta que para 5H17, el péptido YIGEVLVSV aún se sensibilizó a concentraciones 100 veces inferiores que los otros dos. Estos resultados establecen que, a pesar de sus diferencias de especificidad fina (10, 23), tan ambos CTL específicos de HA-2 reconocieron el mismo epítope de péptido . Los estudios de enlace o unión con estos tres péptidos mostraron que el péptido YIGEVLVSV fue el aglutinante más alto a HLA-A2.1. La concentración que dio por resultado 50 % de inhibición de la unión o enlace del péptido normal, ionizado a HLA-A2.1 purificado fue de 5.6 nM, mientras que aquella para YLGEVIVSV y YLGEVLVSV fueron de 9.5 y 15 nM, respectivamente (Figura 5) . Estos valores colocan estos péptidos entre los péptidos procesados de forma natural, de mayor afinidad que se han definido hasta ahora (24) . Sin embargo, las diferencias en las afinidades de unión o enlace para estos tres péptidos es solamente un factor de tres. El hecho que YIGEVLVSV sensibiliza por reconocimiento por los clones 5H17 y 5H13 a concentraciones 50-100 veces inferiores que los otros dos péptidos indica que este péptido se reconoce con mayor afinidad por TCR y de esta manera puede ser el epítope real de HA-2. Una búsqueda de las bases de datos de las secuencias de ADN de proteína conduce a dos secuencias humanas que corresponden a 7 de entre 9 residuos al péptido YIGEVLVSV. El péptido YYGEVCVSV se deriva a partir de la glicoproteína (25) de mielina de los oligodendrocitos y el péptido YIGSVLISV fue de la IC de miosina no convencional (26) . Ambos péptidos humanos se sintetizaron y se probaron para la actividad sensibilizante. Solo el péptido YIGSVLISV derivado " de IC de miosina pudo sensibilizar las células T2 para la lisis por 5H17 y 5H13 con una concentración de inducción de lisis al 50 % de 5-50 nM (27) . El IC de miosina no convencional, humano corresponde a una gran familia de genes de miosina (28, 29), que consiste de diferentes clases y que se indican que están comprendidas en la locomoción celular del transporte por organelos (28, 29) . Todos los tipos de células expresan probablemente varias miosinas a partir de cada clase de manera simultánea. • La distribución restringida del tejido de algunas miosinas se ha reportado (26, 29) . Las búsquedas de las bases de datos mostraron que en diferentes miosinas clase I de varios orígenes, que varían desde Acanthamoeba castellanii a humana," esta secuencia de péptidos mostró la consideración de Y, I, G, V y V en la posición 1, 2, 3, 5, y 9. Notablemente, la secuencia de péptidos de HA-2 difiere de las posiciones de aminoácidos no conservadas a partir de la secuencia de péptidos de IC de miosina. El IC de miosina no convencional, humano es el único gen de miosina clase I, humano, clonado, pero hay evidencia de la presencia de al menos 2 miosinas clase I diferentes en las células humanas. Por lo tanto, no es improbable que una proteína de miosina clase I aún desconoci-da, que contenga YIGEVLVSV esté presente en humanos. De manera interesante, los estudios prolongados demuestran la conservación evolutiva de varios mHag, incluyendo HA-2, entre humanos y primates no humanos (30) . Debido a que HA-2 de mHag solo se presenta por las células hematopoyéticas, esta miosina clase I desconocida ya sea se restringe a las células hematopoyéticas y solo está presente con células hematopoyéticas debido al procesamiento específico del tejido. El polimorfismo de HA-2 de mHag es un problema interesante. El 95 % de la población positiva a HLA-A2.1 expresa el HA-2. En consecuencia, el CTL específico de HA-2 se generó in vivo entre una combinación de donador/recibidor " de médula ósea, dispar, de HA-2. El polimorfismo de HA-2 se puede explicar ya sea por las mutaciones en, o adyacentes al gen de HA-2 ó por el polimorfismo del sistema de procesamiento de antígenos. Hasta ahora, la información del mHag ha sido extremadamente escasa. Aunque la función fisiológica de mHag aún es desconocida, su papel de giro en el transplante de órganos en general, y en el transplante de la médula ósea en particular, es indiscutible.- Se reporta con la presente, el conocimiento por primera vez, de la secuencia" de aminoácidos de un mHag definido por CTL derivado GvHD. La disponibilidad de la secuencia de péptidos de mHag puede permitir la modificación in vivo de las respuestas de células T relacionadas a GvHD. Adicionalmente, puesto que el HA-2 de mHag se expresa en células de linaje hematopoyético incluyendo las células leucémicas, es un candidato para la inmunoterapia de la leucemia antes del transplante de la médula ósea.

Figura 5. Unión o enlace de los péptidos sintéticos a HLA-A2.1 purificado. Los péptidos purificados por HPLC se valoraron para la capacidad para inhibir la unión del péptido de antígeno de núcleo de la hepatitis B yodado. FLPSDYFPSV, a' moléculas de HLA- A2.1 purificadas como se describe previamente (23) .

(Círculo cerrado) , YIGEVLVSV; (triángulo cerrado) , YLGEVLVSV; (cuadrado cerrado), YLGEVIVSV; (diamante cerrado) , el GILGFVFTL del antígeno proteico Ml de la influenza. Todos los puntos de datos son en promedio o al menos dos experimentos independientes.

Referencias 1. Goul y E, Gratama JW, Blokland E, Zwaan FE, Van Rood JJ (1983) A Minor transplantation antigen detected by MHC restricted cytotoxic T lymphocytes during graft-versus-host-disease . Nature 302: 159-161. 2. Tsoi M-S, Storb R, Dobbs S, Medill I, Thomas ED (1980). Cell mediated immunity to non-HLA antigens of the host by donor lymphocytes in patient with chronic graft-vs-host disease. J. Immunol- 125: 2258-2262. 3. Tsoi M-S, Storb R, Santos E, Thomas ED (1983) Anti-host cytotoxic cells in-patients with acute graft-versus-host disease after HLA identical marrow grafting. Transplant Proc. 15: 1484-1486. 4 . Irle C, Beatty PG, Mickelson E, Thomas ED, Hansen JA (1965) Alloreactive T cell responses between HLA identical siblings. Transplantation 40- 329- 333. 5. Van Els C, Bakker A, Zwinderman AR, Zwaan FE, van Rood JJ, Goulmy E (1990) Effector mechanisms in GVHD in response to minor Histocompatibility antigens. I. Absence of correlation with CTLS . Transplantation 50: 62-66.

Irscheck E, Hladik T, Niederwieser D et al (1992) Studies on the mechanism of tolerance or Graft-versus-Host Disease in allogeneic bone marrow recipients at the level of cytotoxic T cell precursor frequencies. Blood 79. 1622-1628. Niederwieser D, Grassegger A, Aubdck J, Herold M, Nachbaur D, Rosenmary A, Gachter A, Nussbaumer W, Gaggl S, Ritter M and Huber C (1993) Correlation of minor histocompatibility antigen specific cytotoxic T lymphocytes with Graft-versus-Host Disease status and analyses of tissue distribution of their target antigens. Blood, 61: 2200-2208. Goulmy E. Class-I restricted human cytotoxic T lymphocytes directed against transplantation antigens and their possible role in organ transplantation (198 )Prog. in allergy, vol. 36: 44-72. Schreuder GMTH., Pool J, Blokland E, Van Els C, Bakker A, Van Rood JJ and Goulmy E. Genetic analysis of human minor Histocompatibility antigens demonstrates Mendelian segregation independent from HLA (1993) . Immunogenetics 38: 98-105.

Van ?1S C, D'A aro J, Pool J, Bakker A, Van den Elsen PJ, Van Road JJ and Goulmy E (1992) Immunogenetics of human minor Histocompatibility antígen: their polymorphism and immunodominance . Immunogenetics 35: 161-165. De Bueger M, Bakker A, Van Rood JJ, Van der Woude F and Goulmy E (1992) . Tissue distribution of human minor Histocompatibility antigen. Ubiquitous versus restricted tissue distribution indicates heterogeneity among human CTLs defined non-MHC antigens. J. Immunology 1992, 149- . 1788-1794. Van Loche EC, van de Kour M, Mommaas M, de Gast G and Goulmy E. (1994) . Expression of cytotoxic T cell defined minor Histocompatibility antigens on human Peripheral blood dendritic cells and skin derived Langerhans cells, manuscript submitted for publication. Marijt WAF, Veenhof WFJ, Goulmy E, Willemze R, Van Rood JJ and Falkenburg JHF (1993) . Minor histocompatibility antigen HA-1, -2, -4 and HY specific cytotoxic T cell clones inhibit human hematopoietic progenitor cell growth by a mechanism that is dependent on direct cell-cell contact. Blood 82: 3778-3785.

Falkenburg F, Goselink H, Van der Harst D, Van Luxemburg-Heijs SAP, Kooy-Winkelaar YMC, Faber LM, de Kroon J, Brand A, Fibbe WE, Willemze R and Goulmy E (1991) . Growth inhibition of clonogenic leukemic precursor cells by minor histocompatibility antigen-specific Cytotoxic T lymphocytes. J. Exp. Mad. 174: 27-33. Van der Harst D, Goulmy E, Falkenburg JHF et al (1994) . Recognition of minor histocompatibility antigens on lymphocytic and myeloid leukemic cells by cytotoxic T cell clones. 81ood 83: 1060-1066. Den Haan J, Pool J, Blokland E, Bontrop R and Goulmy E (1994) . Minor Histocompatibility antigens are conversed between primates. Manuscript in preparation. Goulmy E, Schipper R, Pool J (1994). Minor histocompatibility antigen mismatches influence the development of GVHD after HLA genotypically identical bone marrow transplantation. Manuscript subm. for publication. Rotzschke 0, Falk K, Wallny H-J, Faath S and Rammensee H-G (1990). Science 249: 2B3. Falk K, Rotzschke 0 and Rammensee H-G (1990) . Nature 348: 248.

. De Büeger M, Verreck F, Blokland E, Drijfhout J- W, Amons R, Koning F and Goulmy E (1993) . Isolation of a HLA-A2.1 extracted human minor histocompatibility peptide (1993). Eur. ' J. Immunol. 23: 614-618. 21. Den Haan JJM, Blukland E, Koning F, Drijfhout J-W and Goulmy E (1994) . Structure analysis of human minor histocompatibility antigens HA-1 and HA-2. Abstract NWO retraite. 22. Powis SJ, Twonsend RM, Deverson EV et al, (1991) Nature 354: 528. 23. Momburg F, Ortiz-Navarrete V, Neefjes J, Goulmy E, v.d. wal Y, Spits H, Powis SJ, Butcher GW, Howard JC, Walden P and Hámmerling GJ (1992) . The proteasome subunits encoded by the major histocompatibility complex are not essential for antigen presentation. Nature 360: 174-177. 24. H.J. Wallny and H-G Rammensee, Nature 343, 275 (1990). O. Rótzschke, K. Falk, H.J. Wallny, S. Faath, H-G. Rammensee, Science 249, 283 (1990) .

M. Sekimata, P. Griem, K. Egawa, H-G. Rammensee, M. Takiguchi, Int. Immunol. 4, 301 (1992) . L.

Franksson, M. Petersson, R. Kiessling, K. Karre, Eur.J. immunol., 23, 2606 (1993); 25. M. De Bueger et al. Eur . J-Immunol .23, 614 (1993); M.E. ' Kurtz, R.J. Graff, A. Adelman, D. Martin-Morgan, R.E. Click, J. Im unol. 135, 2847 (1985). H-G Rammensee, P.J. Robinson, A. Grisanti, M.J. Bevan, Nature 319, 502 (1986) . B. Perarnau at al., Nature 346, 751 (1990); B. Loveland, C-R. Wang, H. Yonekawa, E. Hermel, K. Fischer Lindahl, Cell, 60, 971 (1990); El clon 5H17 de CTL específico de HA-2 se originó de un paciente femenino que se sometió al transplante de la medula ósea para la anemia aplástica aguda. El régimen de acondicionamiento pre-transplante consistió de la irradiación de los linfoides totales y ciclofosfamida. El paciente se injerto con medula ósea no agotada de células T de su padre idéntico' a HLA. El paciente sufrió de GvHD aguda severa grado III seguida por GvHD crónica extensa. El clon de CTL específico a HA-2 se generó a partir de PBL post-BMT de acuerdo al protocolo descrito anteriormente. E. Goulmy, in Transplant, Rev. J.Morris and N.L. Tilney, Eds. (Saunders Company 2, 29, 1988); Datos no mostrados; A.L. Cox et al., Science 264, 716 (1994); Peptide mixtures YSCGEVXVSV and SXDFGTXQV were tested in several concentrations against clone 5H17-and clone 5HI3. in addition to T2, an HA-2 negative HLA-A2.1 positive EBVBLCL was used to present the peptide mixture, 32. Datos no mostrados; 33. K. Udake, T.J. Tsomides, H.N. Eisen, cell 69, 989 (1992). R.A. Henderson et al., Proc, Nati. Acad. Sci., 90, 10275 (1993). C. Mandelboim at al., Nature, 369, 67 (1994), A. Uenaka et al., J. Exp. Med., 180, 1599 (1994); 34. 5HI3 y 5H17 demostraron patrones idénticos cuando se analizaron contra 100 individuos positivos a HLA-A2.1 no relacionados, saludables. Un patrón de reacción discriminatorio entre los clones se señaló cuando se analizó una célula objetivo que expresa una molécula variante de HLA-A2 natural; . Y. Chen et al., J. Immunol., 152, 2874 (1994). J.

Ruppert et al., Cell, 74, 829 (1993); 36. 37. W.M. Bement, T. Hasson, J.A, Wirth, R.E. Cheney, M.S. Mooseker, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 91, 6549 (1994); 38. El peptide YYGEVCVSV se probó en un intervalo de concentración de 50 nM a 0.5 pM contra 5H17 así como 5H13. No se encontró actividad; 39. M.A. TituS, Curr. Opin. Cell Biol., 5, 77 (1993). E. Coudrier, A. Durrbach, D. Louvard, FEBS, 307, 87 (1992); 40. M. Mooseker, Curr. Biol., 3, 245 (1993); 41. J.M.M. den Haan, J. Pool, E. Blokland, R. Bontrop, E. Goulmy, manuscript in preparation.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la presente invención, es el que resulta claro a partir de la presente descripción de la invención.

Habiéndose descrito la invención como antecede se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes :

Claims (11)

REIVINDICACIONES

1. Un péptido que constituye un epítope de células T que se puede obtener a partir del antígeno menor de histoco patibilidad, HA-2, caracterizado porque comprende la secuencia de YXGEVXVSV o un derivado del mismo, que tiene propiedades inmunológicas similares, en donde X representa una leucina o un residuo de isoleucina.

2. Un polipéptido inmunogénico que se puede obtener a partir del antígeno menor de histocompatibilidad, HA-2, caracterizada porque comprende la secuencia YXGEVXVSV o un derivado del mismo, en donde X representa una léucina o un residuo de isoleucina.

3. Un péptido o polipéptido de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque comprende la secuencia YIGEVLVSV.

4. Un péptido o polipéptido de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque comprende la secuencia YLGEVLVSV o YLGEVIVSV. ^5. Vacuna, caracterizada porque comprende un epítope o un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4.

5. Una formulación farmacéutica, caracterizada porque comprende un epítope o un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4.

6. El péptido o polipéptido de conformidad con las reivindicaciones 1-4, para el uso como una medicina.

7. El uso de un péptido o polipéptido de acuerdo con las reivindicaciones 1-4 en la preparación de un medicamento para la inducción de tolerancia para transplantes o para prevenir el rechazo y/o la enfermedad del huésped contra el injerto.

8. Un método para la eliminación de un grupo de células hematopoyéticas (neoplásticas) que presentan a un péptido de contexto de la clase I de HLA de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizado porque la eliminación se induce directamente o de manera indirecta por el reconocimiento específico del péptido en el contexto.

9. El análogo de péptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque es un antagonista para la actividad de las células T que reconocen el péptido.

10. El método para la generación de anticuerpos, receptores de células T, células B ó_ células T anti-idiotípicas, caracterizado porque comprende los pasos inmunización de un mamífero con un péptido o un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1 6 2.

11. Anticuerpos, receptores de células T, células B o células T, caracterizado porque se pueden obtener por el método de la reivindicación 1.