MXPA97005268A - Metodo para prevenir el rechazo de transplantes - Google Patents

Abstract

Un método para reducir el rechazo de aloinjertos que comprende tejido donador que contiene células presentadoras de antígeno (APC), método el cual comprende:a. poner en contacto el tejido donador con un agente fotosensibilizador para obtener un tejido donador modificado;b. exponer el tejido donador modificado a una luz que tiene una longitud de onda absorbida por el agente fotosensibilizador durante un tiempo suficiente para hacer disminuir las APC en el tejido donador;y c. transplantar el tejido pobre en APC en tejido del receptor. Sometiendo el tejido donador a terapia fotodinámica, el tiempo de sobrevivencia promedio de los injertos, particularmente los aloinjertos de piel, se alarga significativamente. El fotosensibilizador también puede ser parte de un conjugado que contiene una porción específica para el objetivo.

Description

MÉTODO PARA PREVENIR EL RECHAZO DE TRA SPLANTES CAMPO TÉCNICO La invención se relaciona con los procedimientos para suministrar aloinjertos en terapia y para prevenir el rechazo de aloinjertos por un receptor. En particular, se relaciona con el tratamiento del tejido donador con técnicas de terapia fotodinámica para hacer disminuir las células presentadoras de antigenos del tejido y para diminuir la inmunogenicidad de las células contenidas en él.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El éxito de un transplante de un aloinjerto en un huésped depende de factores tales como los antigenos sobre el tejido transplantado que son reconocidos por el receptor como extraños y pueden provocar la respuesta de rechazo, las células en el sistema inmune del receptor que median el rechazo, y las reacciones que modifican ya sea la presentación del antigeno extraño o la respuesta celular. Se sabe que un componente significativo del rechazo de aloinjertos se debe a la presencia en el tejido del donador de células no parenquimales (leucocitos pasajeros) .

REF: 25137 También se sabe que los productos del complejo de histocompatibilidad principal (MHC) juegan un papel importante en la mediación de un ataque por el tejido injertado contra el receptor. El MHC es generalmente complejo debido a que incluye muchas posiciones diferentes, cada una de las cuales codifica para antigenos de la superficie celular por separado, y debido a que las posiciones tienen un polimorfismo extenso. La posiciones del MHC caen en dos clases diferentes, Clase I o Clase II, en base a su distribución en los tejidos, la estructura de los antigenos expresados y sus funciones. Los antigenos de la Clase I, presentes sobre todas las células nucleadas, sirven como objetivos principales para los linfocitos T citotóxicos (CD8+) . Los antigenos de la Clase II no se encuentran distribuidos en los tejidos tan ampliamente y sirven como objetivos primarios para los linfocitos de helper (CD8+) . Las formas polimórficas de las posiciones individuales del antigeno leucocitico humano (HLA) , el MHC en humanos, han sido reconocidas por anticuerpos y por varias técnicas in vitro que miden el reconocimiento de los linfocitos T. Esas respuestas, mediadas por el reconocimiento del receptor del polimorfismo en el donador, se correlacionan con las fuertes reacciones de rechazo que toman lugar in vivo. La investigación en las bases celulares del rechazo de injertos, usando estudios tanto in vitro como in vivo, ha revelado que ambos linfocitos CD4' y CD8+ participan en la respuesta de rechazo. Los intentos por prolongarla sobrevivencia de los aloinjertos y xenoinjertos después del transplante, tanto en modelos experimentales como en la práctica médica, se han centrado principalmente sobre la supresión del aparato inmune del receptor. Este tratamiento tiene como su objetivo principal la inmunosupresión preventiva y/o el tratamiento del rechazo del injerto. Los ejemplos de agentes usados para la inmunosupresión incluyen fármacos citotóxicos, antimetabolitos, corticosteroides y suero antilifocitico. Los agentes inmunosupresores no específicos encontrados particularmente efectivos en la inmunosupresión preventiva (azatioprina, bromocriptina, metil prednisona, prednisona, y ciclosporina A) mejoraron significativamente el éxito clínico de los transplantes. La nefrotoxicidad de la ciclosporina A después del transplante renal ha sido reducida por la coadministración de esteroides tales como la prednisolona o prednisolona en conjunto la azatioprina. Además, se han injertado riñones exitosamente usando globulina anti-linfocitico seguido por ciclosporina A. Otro protocolo es la irradiación linfoide total del receptor antes del transplante, seguida por una inmunosupresión minima des ^és del transplante. El tratamiento del rechazo ha implicado el uso de esteroides, 2-amino-6-aril-5-pirimidinas sustituidas, globulina anti-linfocitica heteróloga y anticuerpos monoclonales para varias poblaciones de leucocitos . La complicación principal de los fármacos inmunosupresores son las infecciones. De manera adicional, la inmunosupresión sistémica es acompañada por efectos tóxicos indeseables, por ejemplo, nefrotoxicidad cuando la ciclosporina A se usa después del transplante renal, y reducción en el nivel de mastocitos hematopoyéticos . Los fármacos inmunosupresores también pueden conducir a obesidad, una pobre cicatrización de las heridas, hipoglicemia esteroidal, psicosis esteroidal, leucopenia, hemorragia gastrointestinal, linfoma e hipertensión. En vista de esas complicaciones, los inmunólogos de los transplantes han buscado métodos para suprimir la capacidad de respuesta inmune en una forma especifica del antigeno de modo que únicamente la respuesta al aloantigeno del donador pudiera perderse. Tal inmunosupresión especi-ica generalmente se ha logrado modificando ya sea la antigenicidad del tejido a ser injertado o las células especificas capaces de mediar el rechazo. En ciertos casos, en que la inmunidad o tolerancia sean inducidas depende de la forma en la que el antigeno sea presentado al sistema inmune. Otras estrategias antirrechazos se han enfocado sobre la eliminación o atenuación de los leucocitos pasajeros que contienen MHC, es decir, las células presentadoras de antigenos ("APC"), en los tejidos del donador antes del transplante. Las técnicas que han sido reportadas para este propósito incluyen el timo durante tiempos prolongados del tejido donador (Lafferty et al . , "La Inmunogenicidad del Aloinjerto Tiroidal se Reduce después de un Periodo en el Cultivo del Órgano", Science, 188:259 (1975)). Se ha encontrado que el pretratamiento de los tejidos de aloinjerto por crecimiento en cultivo tisular antes del transplante en dos sistemas de modelo murino conduce a la aceptación permanente a través de las barreras del MHC (Lafferty et al . , Transplantation, 22_: 138-49 (1976); Bowen et al., Lancet, 2:585-86 (1979)). Existe la hipótesis de que tal tratamiento da como resultado el agotamiento de las células linfoides pasajeras y de este modo la ausencia de una población celular estimuladora necesaria para la inmunogenicidad tisular. Por ejemplo, se han usado algunos pares de HLA del donador-receptor, por ejemplo, en injertos vasculares y de riñon y algunas veces antes de transfusiones sanguíneas. El tejido donador ha sido tratado como factor del crecimiento, tal como el TGF-beta (Czarniecki et al., Patente Norteamericana No. 5,135,915 expedida el 4 de Agosto de 1992) , algunas veces en combinación con tiempos de cultivo prolongados (Orton, Patente Norteamericana No. 5,192,312 expedida el 9 de Marzo de 1993) . El tejido d Jor puede ser tratado con luz UV (Reemts a et al., Patente Norteamericana No. 4,946,438 expedida el 7 de Agosto de 1990; y Lau et al . , "Prolongación de la Sobrevivencia del Aloinjerto de Islotes de Rata por Irradiación Ultravioleta Directa del Injerto, Science, 223: 607 (1984)), algunas veces en conjunto con microencapsulación (Weber et al., Patente Norteamericana No. 5,227,298, expedida el 13 de Julio de 1993). Otros atores han mostrado membranas de barrera solas, tales como la bicapa comprendida de una primer capa no citotóxica y una segunda capa externa de un material polimérico biocompatible y semipermeable enseñado por Cochrum, Patente Norteamericana No. 4,696,286 expedida el 29 de Septiembre de 1987. Los tejidos donadores han sido tratados con una amplia variedad de sustancias, tales como la aplicación tópica de ciclosporina a los injertos de piel, de acuerdo a lo descrito por Hewitt et al., Patente Norteamericana No. 4,996,193 expedida el 26 de Febrero de 1991, y la perfusión de un riñon donador con caloña linfocitica, de acuerdo a lo descrito por Jones et al., Patente Norteamericana No. 4,294,824 expedida el 13 de Octubre de 1981. El tiempo de sobrevivencia de los injertos de piel ha sido prolongado mediante el tratamiento in vitro con cortisona, talidomida, o uretano antes del implante en una animal de laboratorio. La cantidad de fármaco aplicado localmente a la piel es usualmente más pequeña que la cantidad requerida para lograr un efecto similar por inyección sistémica del fármaco en el receptor. La piel donadora ha sido tratada in vitro con estreptocinasa/esterptodornasa, preparaciones de ARN y ADN del receptor, o soluciones de glutaraldehido, antes del transplante para reducir la antigenicidad de la piel a ser injertada. Los métodos más sofisticados han implicado el tratamiento del tejido donador con un anticuerpo monoclonal dirigido contra el producto del MHC junto con complemento (Faustman et al . , "Prolongación de la Sobrevivencia del Aloinjerto de Islotes Murinos por Pretratamiento de los Islotes con Anticuerpo Dirigido a Determinantes la", Proc. Nati. Acad. Sci EUA, 78:5156 (1981)) o el tratamiento del tejido donador con una inmunoconjugado de anticuerpo dirigido contra el MHC (Shizuru, J. A., et al . , "Inhibición de Cultivos de Islotes Pancreáticos de Linfocitos Mezclados de Rata con Inmunotoxina Anti-Ia", Transplantation, 42 : 660 (1986)). Se obtuvieron resultados variables por esos métodos.

De este modo, existe la necesidad en la técnica de un método para prolongar la sobrevivencia del injerto en las operaciones de transplante que pudiera reducir al minimo la toxicidad y otros efectos adversos que surgen del uso de grandes dosis de inmunosuprecores. La técnica empleada de acuerdo a la presente invención para destruir selectivamente esas células APC implica poner en contacto el tejido donador con una fotosensibilizador, seguido por la exposición a la luz, y a continuación el transplante. Anteriormente ya se hablan usado métodos fotodinámicos similares principalmente para destruir tejidos tales como tejidos tumorales, placas ateroscleróticas, enfermedades de la piel superficial, y patógenos indeseados en la sangre (Levy et al., Patentes Norteamericanas Nos. 5,283,255 expedida el 1 de Febrero de 1994; 4,883,790 expedida el 28 de Noviembre de 1989; 4,920,143 expedida el 24 de Abril de 1990; 5,095,030 expedida el 10 de Marzo de 1992; y 5,171,749 expedida el 15 de Diciembre de 1992, las descripciones de las cuales se incorporan aqui jomo referencia) . Véase también, Dougherty et al . , Patentes Norteamericanas Nos. 4,932,934 expedida el 12 de Junio de 1990; 4,889,129 expedida el 26 de Diciembre de 1989; 5,028,621 expedida el 2 de Julio de 1991; 4,866,168 expedida el 12 de Septiembre de 1989; 5,145,863 expedida el 8 de Septiembre de 1992, y 4,649,151 expedida el 10 de Marzo de 1987, las cuales se incorporan aqui como referencia. Por ejemplo, la Patente Norteamericana No. 4,866,168 de Dougherty et al . , describe una composición vendida bajo la marca "Photofrin II", la cual se obtiene recuperando la porción de alto peso molecular agregada del derivado de la hematoporfirina. Otro ejemplo especifico, Patente Norteamericana No. 4,883,790 de Levy et al . , describe el uso de un grupo de compuestos relacionados designados como "monohidrobenzoporfirinas" para propósitos análogos. Además, se ha descrito el uso de muchos varios fotosensibilizadores o estructuras similares. Véase, por ejemplo, los derivados (1-hidroxietil) deuteroporfirina, éteres hematoporfirinicos hidrofóbicos y compuestos preparados a partir de metil feoforbida (Pandey et al., Patente Norteamericana No. 5,002,962 expedida el 26 de Marzo de 1991); conjugados de pirofioforbida (Pandey et al., Patente Norteamericana No. 5,314,905); derivados de bacterioclorofila a (Dougherty, Patentes Norteamericanas Nos. 5,171,741 y 5,173,504); dimeros ligados de monovilo y éter divinilico (Ward, Patente Norteamericana No. 4,961,920); derivados de benzoporfirina (Allison et al., Patente Norteamericana No. 5,214,036); compuestos de dibenzoporfirina (Dolphin et al., Patentes Norteamericanas Nos. 5,308,608 y 5,149,708); las llamadas porfirinas "verdes", tales como los derivadas de monobenzoporfirina (Jamieson et al., Patente Norteamericana No. 5,087,636); compuestos de porfirina que contienen doble enlaces exociclicos (Chang et al., Patente Norteamericana No. 5,064,952); y composiciones de porfimero sódico (Clauss et al., Patente Norteamericana No. 5,244,914). Las descripciones de todas esas patentes se incorporan aqui como referencia. En general, esos fármacos se consideran, en una primera aproximación, como intercambiables en su utilidad con respecto a la terapia fotodinámica. Aunque la terapia fotodinámica se relaciona principalmente con el tratamiento de células tumorales, anteriormente se han probado aplicaciones adicionales. Por ejemplo, esos fármacos fotosensibilizadores pueden usarse en protocolos para eliminar placas ateroscleróticas, y en el tratamiento de la sangre y otros fluidos corporales para destruir organismos infecciosos. Sin embargo, la terapia fotodinámica aparentemente aún no ha sido usada para erradicar los leucocitos pasajeros en el tejido de aloinjerto donador. Una ventaja particular de la presente invención es que, al igual que los regímenes terapéuticos que implican la administración de un fármaco fotosensibilizador a un organismo, el tejido donador puede ser tratado de manera más apropiada in vitro antes de un procedimiento de transplante real. De esta manera, los problemas asociados con asegurar los niveles apropiados de exposición a la luz de, por ejemplo, un conjugado asociado con células objetivo dentro de un organismo, se obvian de manera sustancial.

Además, el método de la invención da como resultado injertos que son estables inmunológicamente en los huéspedes adecuados, funcionales biológicamente y capaces de ser almacenados antes del transplante. De este modo, la invención permite el establecimiento de un banco de injertos tratados fotodinámicamente que pueden usarse para almacenarse a corto plazo .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona un procedimiento para reducir al minimo el rechazo de transplantes en sujetos animales. Antes del transplante, el tejido donado, el cual contiene células presentadoras de antigenos (APC) , se pone en contacto con un agente fotosensibilizador y se expone a una luz que tiene una longitud de onda absorbida por el agente fotosensibilizador durante un tiempo suficiente para hacer disminuir las APC. Este tratamiento no mata a los queratinocitos pero puede alterar su expresión de antigenos de la Clase Y y/o II, asi como las citocinas que secretan, de modo que la inmugenicidad de la piel por si misma disminuye. En una modalidad, el agente fotosensibilizador se encuentra en forma de un conjugado que comprende un componente especifico para el objetivo para aumentar la interacción entre al agente fotosensibilizador y las APC objetivo. El fármaco fotosensibilizador media la destrucción de las APC cuando al aloinjerto es irradiado a una longitud de onda adecuada absorbida por el agente fotosensibilizador.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 muestra la estructura de compuestos de BPD particularmente útiles como agentes fotosensibilizadores en la invención.

MODOS DE LLEVAR A CABO LA INVENCIÓN De acuerdo con la invención descrita más adelante, antes del transplante del tejido donador, este se pone en contacto con un agente fotosensibilizador. El término "tejido donador" abarca cualquier tipo de tejido transplantable o inplantable de un donador diferente al receptor que contiene APC. El tejido donador usado en la invención puede ser cualquiera de una amplia variedad de tejidos tales, por ejemplo, tejido blando tal como la membrana amniótica de un neonato, médula ósea, células precursoras hematopoyéticas, colágeno y proteina ósea para estimular el crecimiento del cartílago; órganos tales como la piel, corazón, hígado, bazo, páncreas, lóbulo tiroide, pulmón, riñon, órganos tubulares (por ejemplo, intestinos, vasos sanguíneos o esófago) ; y partes de órganos tales como válvulas cardiacas y células aisladas o grupos de células, tales como las células de los islotes del páncreas o las células del higado. Los órganos tubulares puede usarse para reemplazar porciones dañadas del esófago, vasos sanguíneos o conducto biliar. Los injertos de piel pueden usarse, no únicamente para quemaduras, sino también como pósitos para un intestino dañado o para cerrar ciertos defectos tales como una hernia diafrag ática. En una modalidad particularmente preferida, el tejido donador es el tejido cutáneo o células de islotes pancreáticos . El término "injerto" como se usa aqui se refiere al material biológico derivado de un donador para ser transplantado en un receptor. El término "transplante" y variaciones del mismo se refiere a la inserción de un injerto en un receptor, ya sea que el transplante sea singeneico (en donde el donador y el receptor son genéticamente idénticos) , alogeneicos (en donde el donador y el receptor son de diferentes orígenes genéticos pero de la misma especie) , o xenogeneico (en donde el donador y el receptor son de diferentes especies) . De este modo, en un escenario tipico, el huésped es humano y el injerto es un isoinjerto, derivado de un humano del mismo o diferente origen genético. En otro escenario, el injerto se deriva de una especies diferente en la cual se transplanta, incluyendo animales de especies ampliamente separadas filogenéticamente, por ejemplo, un corazón de babuino que es transplantado en un huésped humano . El tejido donador puede ser tomado de cualquier fuente, ya sea de cadáveres o donadores vivientes. Los ejemplos de donadores adecuados incluyen animales vivos tales como animales de laboratorio, por ejemplo, perros, gatos, ratones, ratas, jerbos, cobayos, vacas, primates, o seres humanos. Los donadores son preferiblemente mamíferos, incluyendo los seres humanos. Los donadores humanos son preferiblemente voluntaras, donadores relacionados sanguíneamente que están normales tras el examen físico y del mismo grupo sanguíneo ABO principal, debido a que el cruce de las barreras del grupo sanguíneo principal puede perjudicar la sobrevivencia de un aloinjerto. Sin embargo, es posible transplantar, por ejemplo, un riñon de un donador del tipo O en un receptor A, B o AB. El término "aloinjerto" se refiere las células y tejidos que se originan con o se derivan de un donador de la misma especies que el receptor. De manera preferible el donador es de la misma especie que el receptor. El término "receptor" como se usa aqui se refiere a cualquier huésped con transplante compatible. Por "compatible" significa un huésped que aceptará el injerto donado. Los ejemplos de receptores potencialmente útiles incluyen animales, preferiblemente mamíferos tales como animales de granja, por ejemplo, caballos, vacas u ovejas; mascotas domésticas, por ejemplo, perros o gatos; animales de laboratorio, tales como ratones, ratas, jerbos o cobayos; o primates, por ejemplo, simios o seres humanos. De manera más preferible, el receptor es un ser humano. Si tanto el -nador como el injerto y el huésped son humanos, ellos están preferiblemente equiparados para los antigenos HLA de la clase II para mejorar la histocompatibilidad.

Agentes Fotosensibilizadores En general, cualquiera de una gran variedad de compuestos que son útiles en la terapia fotodinámica clásica son adecuados para usarse en la presente invención. Como es bien sabido por aquellos expertos en esta técnica, una clase principal de agente fotosensibilizadores conocidos son los compuestos relacionados con la porfirina. Como se describió con algún detalle anteriormente, esos fármacos incluyen derivados de hematoporfirina; la fracción de alto peso molecular del derivado de la hematoporfirina, comercializado como composición fotosensibilizadora de Photofrin II y componentes activos de los mismos; varios derivados sintéticos de porfirinas; tales como las monohidrobenzoporfirinas, también conocidas como derivados de benzoporfirina o BPD; porfirinas verdes; y varios otros compuestos policiclicos que se cree generan un singulete de oxigeno cuando se irradian, causando de este modo la destrucción del tejido. Los métodos para la preparación de los compuestos fotosensibilizadores adecuados se describen de manera más completa en las patentes descritas anteriormente, y en las publicaciones citadas aqui. De manera preferible, el agente fotosensibilizador es BPD. En principio, la característica critica de cualquier agente fotosensibilizador es su propensidad, cuando se expone a la luz de una longitud de onda capaz de ser absorbida por el fotosensibilizador, a exhibir un efecto citotóxico sobre las células en las cuales se localiza. Aunque se cree que, en muchos casos, el efecto citotóxico es resultado de la formación de un singulete de oxigeno tras la exposición, el modo exacto de operación no es critico para la presente invención. Como se discutió con alguna extensión en las patentes de Dougherty et al . , mencionadas anteriormente, un número de propiedades especificas adicionales están asociadas de manera tipica con los agentes fotosensibilizadores efectivos. Entre las propiedades de los fotosensibilizadores en general que son de significado particular en la práctica de la presente invención están la ausencia relativa de toxicidad a las células en ausencia del efecto fotoquimico y una fácil eliminación de los te idos en ausencia de una interacción especifica con el objetivo entre células particulares y el fotosensibilizador. Los agentes fotosensibilizadores de la presente invención preferiblemente tienen un espectro de absorción que está dentro del intervalo de longitudes de onda de entre 350 nm y 1200 nm, espectro de absorción el cual puede ser diseñado para la penetración deseada en una forma conocida per se, de manera preferible entre aproximadamente 400 y 900, y de manera más preferible entre 600 y 800. Los agentes fotosens__-ilizadores de la invención se dosifican en una forma consistente con una buena práctica médica, tomando en cuanta la naturaleza del transplante y el padecimiento que desee tratarse, la especie del donador, la condición médica del receptor individual, la presencia de cualquier otro fármaco en el tejido donador o en el cuerpo del receptor, y otros factores conocidos por los médicos. Una cantidad terapéuticamente efectiva de fotosensibilizador usada para el contacto del injerto es una cantidad que es efectiva para reducir la inmunogenicidad del injerto, de modo que sea compatible con el receptor y no sea rechazado. Una cantidad generalmente efectiva para este propósito se encuentra en el intervalo de aproximadamente 0.1 hasta aproximadamente 10 µg/mL, de manera preferible de aproximadamente 0.1 hasta aproximadamente 20 µg/mL y, de manera más preferible, de aproximadamente 0.25 hasta - aproximadamente 1.0 µg/mL. El agente fotosensibilizador puede ser combinado con uno o más agentes inmunosupresores para aumentar el efecto inmunosupresor sobre el injerto. La cantidad efectiva de esos otros agentes depende de la cantidad del agente fotosensibilizador presente en la formulación, el tipo de transplante, la causa del transplante, el sitio de liberación, el método de administración, el programa de administración, otros factores discutidos anteriormente, y otros factores conocidos por los médicos. Típicamente, el agente fotosensibilizador se formula mezclándolo a temperaturas ambiente, pH apropiados, y el grado deseado de pureza, con uno o más portadores fisiológicamente aceptables, es decir, portadores que no son tóxicos a los receptores a las dosis y concentraciones empleadas. El pH de la formulación depende principalmente del uso particular y la concentración de fotosensibilizador, pero preferiblemente fluctúa de cualquier manera de aproximadamente 3 hasta aproximadamente 8. De manera preferible, el fotosensibilizador se mantiene a un pH neutro (por ejemplo, de aproximadamente 6.5 a aproximadamente 7.5) para prevenir que se adh_ .ra al recipiente en el cual es colocado, como ocurre a valores de pH que se aproximan a los niveles fisiológicos, y para asegurar la activación del fotosensibilizador. De este modo, la formulación en una solución de electrolito que contiene un amortiguador de sal equilibrado a pH 6.5, pero que no contiene suero bovino fetal ("FBS"), es una modalidad adecuada. La razón por la que el FBS se omite es debido a que contiene componentes antigénicos que podrían exacerbar la reacción del aloinjerto. Si el agente fotosensibilizador se adhiere a los recipientes en los cuales los injertos son tratados, se agrega opcionalmente un ingrediente no antigénico, tal como seroalbúmina humana, en una cantidad que no interfiera con el agente fotosensibilizador de la perfusión o adherencia al injerto que está siendo tratado. Si la formulación de agente fotosensibilizador va a ser aplicada tópicamente, por ejemplo, esta debe ser colocada sobre un injerto de piel antes del transplante, se prefiere usar una solución viscosa tal como un gel, en lugar de una solución no viscosa. El gel puede lograrse, por ejemplo, mezclando la solución del agente fotosensibilizador con un agente gelificante, tal como un polisacárido, preferiblemente un polisacárido soluble en agua, por ejemplo, ácido hialurónico, almidones, y derivados de celulosa, por ejemplo, metilcelulosa, hidroxietil celulosa y carboximetil celulosa. Cuando un polisacárido está presente en una formulación de gel, la cantidad usualmente presente está en el intervalo de aproximadamente 1-90% en peso del gel, de manera más preferible de aproximadamente 1-20%. Los ejemplos de otros polisacáridos para este propósito, y una determinación de la solubilidad de los polisacáridos, se encuentran en la EP 267,015 publicada el 11 de Mayo de 1988, la descripción de la cual se incorpora aqui como referencia. Si el injerto a ser tratado va a ser almacenado durante algún periodo de tiempo, el agente fotosensibilizador se formula preferiblemente en o se agrega a una emulsión perfluoroquimica (que actúa como un sustituto de la sangre) para permitir que altas concentraciones de oxigeno alcancen el injerto. Tales emulsiones comprenden un compuesto perfluoroqui ico tal como perfluorodecalina y/o perfluorotripropilamina emulsificada con un tensoactivo en agua. El compuesto perfluoroquimico se elige de modo que sea el menos tóxico al receptor. Los ejemplos de tensoactivos adecuados incluyen a los tensoactivos de poloxámero, los cuales representan una serie de moléculas que son polímeros de bloques de óxido de etileno y óxido de propileno, ya sea solos o tomados en mezcla con un fosfolípido tal como la lecitina de huevo. Otro ejemplo de una emulsión comercialmente disponible de Green Cross es el Fluosol-DA al 20%, el cual contiene perfluorodecalina y perfluorotripropilamina emulsificadas con el tensoactivo de poloxámero, Pluronic F-68. Las emulsiones perfluoroquimicas y sus efectos en los mamíferos se describen de manera más completa en Bollands et al., J. Pharm. Phar acol., 39:1021-1024 (1987), la descripción de la cual se incorpora aqui como referencia. La formulación fotosensibilizadora para usarse en la administración terapéutica es preferiblemente estéril. La esterilidad se logra fácilmente por filtración estéril a través de membrana (0.2 micrones) . Una vez formulado y esterilizado, el fotosensibilizador puede no ser estable a la desnaturalización oxidativa. Sin embargo, las formulaciones liofilizadas para reconstitución, por ejemplo, que contienen BPD, son adecuadas para almacenarse.

Sistemas para la Elección de Objetivos El uso de esos agentes fotosensibilizadores en la destrucción de la capacidad del tejido donador para iniciar un rechazo injerto versus huésped se mejora mediante la conjugación de fotosensibilizador con un agente especifico para el objetivo. En particular, el material fotosensibilizador puede ser conjugado con (1) una porción que hace blanco objetivamente en las células presentadoras de antigenos (APC) en el tejido donador directamente; (2) una porción que hace blanco específicamente sobre un material intermediario, el cual marca las APC para la elección del objetivo por el conjugado; o (3) células T para la situación injerto vs . huésped. En cualquier caso, una vez que el tejido donador ha sido modificado por la interacción con el conjugado, este se expone en una forma conocida per se para efectuar una disminución sustancial del contenido de APC en el tejido donador. La invención proporciona conjugados que contienen fotosensibilizador, específicos, útiles para hacer blanco en APC en el tejido donador del aloinjerto, asi como un método para destruir APC en el tejido donador generalmente por terapia fotodinámica ("PDT") . Una formulación útil en este proceso consiste esencialmente de un agente fotosensibilizador y un sistema para ligar un "agente buscador" con el fotosensibilizador. Otra formulación comprende la combinación de un sistema para hacer blanco en APC y un agente fotosensibilizador conjugado con un agente buscador para el sistema que hace blanco en APC. Con cualquier formulación, el objetivo final de liberar el fármaco fotosensibilizador a las APC es idéntico. Las APC elegidas como blanco pueden ser accesadas por una variedad de diferentes tipos de agentes específicos para el objetivo, incluyendo las porciones inmunoespecificas para los productos de la glicoproteina MHC y factores de linfocina para las cuales esas células contienen receptores.

Típicamente, para la reacción con las glicoproteinas MHC, pueden usarse anticuerpos creados contra esas glicoproteinas, ya sea poligonales o monoclonales . Los antisueros policlonales se preparan de manera convencional, por ejemplo, inyectan, a un mamífero adecuado un antigeno para el cual se desee el anticuerpo, ensayando el nivel de anticuerpo en el suero contra el antigeno, y preparando antisueros cuando los títulos sean altos. Las preparaciones de anticuerpo monoclonal también pueden prepararse de manera convencional, por el método de Koehler and Milstein, " ", J. de , : (19 ), usando, por ejemplo, linfocitos de sangre periférica o células de bazo de animales inmunizados e inmortalizando esas células ya sea por inyección viral, por fusión con mielomas, o por otros procedimientos convencionales seleccionando para la producción de loa anticuerpos deseados por las colonias aisladas. Además de los anticuerpos, también pueden emplearse fragmentos inmurreactivos adecuados, tales como los fragmentos Fab, Fab' , o F(ab)2. Muchos anticuerpos adecuados para usarse en la formación del mecanismo para la elección del objetivo ya se encuentran disponibles en la técnica. Por ejemplo, el uso de fragmentos inmunológicamente reactivos como sustitutos para los anticuerpos completos es descrito por Spiegelberg, H. L., "Inmunoensayos en Laboratorio Clínico", , 3:1-23 (1978). Además de la inmurreactividad, la elección del blanco pude efectuarse usando los ligandos receptores que hacen blanco en los receptores en la superficie de las células APC, por ejemplo, sobre la base de la co plementaridad de los contornos o patrones de carga entre el receptor y el ligando. Como se usa aquí, el término "ligando receptor" se refiere a cualquier sustancia, natural o sintética, que se una específicamente a un receptor de la superficie de las células APC. Esos ligandos receptores incluyen factores de linfocina, por ejemplo, IL2. De acuerdo con una modalidad particular de la presente invención, el agente fotssensibilizador se conjuga con un agente especifico para el objetivo para un intermediario el cual, a su vez, es específico para el APC. Por ejemplo, en el caso de las células de rata que presentan la, podría usarse el anticuerpo anti-Ia de rata de ratón como intermediario. En este caso, un conjugado de agente fotosensibilizador acoplado al anticuerpo anti-ratón podría hacer blanco sobre las células marcadas con el anticuerpo murino precisamente de la misma manera que lo haría directamente un conjugado que comprende anticuerpo anti-Ia de rata.

Métodos de Conjugación El sistema para la elección del objetivo puede conjugarse directamente con el fármaco fotosensibilizador usando los métodos convencionales y la tecnología del enlazante, como se sabe generalmente en la técnica y se describe a manera de ejemplo en las patentes de Levy et al . anteriormente mencionadas. Para proteínas tales como Ig y otros polipéptidos, puede efectuarse una unión covalente directa entre el agente fotosensibilizador y el componente específico para el objetivo usando, por ejemplo, un agente deshidratante tal como una carbodiimida. Por supuesto también pueden unirse las porciones activas del conjugado a través del uso de compuestos enlazantes que sean bifuncionales y capaces de unirse covalentemente con cada uno de los dos componentes activos. Cualquier técnica efectiva conocida en la técnica que sea adecuada para unir dos porciones químicas cae dentro del alcance de la invención. Debe comprenderse ampliamente que la porción enlazante es un enlace covalente o cualquier porción enlazante disponible en la técnica o derivable de la misma usando técnicas estándar. De manera alternativa, la elección del blanco puede ser mediada por agentes específicos adicionales. Por ejemplo, como se ilustra más adelante, un anticuerpo secundario dirigido contra el anticuerpo específico de las APC puede ligarse directamente a un fotosensibilizador, y el agente que hace blanco en la glicoproteína MHC puede usarse un puente entre el inmunoconjugado y la célula objetivo.

Protocolo de Tratamiento La eliminación o atenuación funcional de las APC, o modulación de otras células de la piel, tales como los queratenocitos, de acuerdo con la presente invención se efectúa en una forma relativamente sencilla poniendo en contacto el tejido donador directamente con el agente fotosensibilizador, el cual puede estar en forma conjugada, bajo condiciones que permitan la formación de una fuerte asociación entre el agente fotosensibilizador (o el componente específico para el objetivo del conjugado que contiene el fotosensibilizador) y las PAC objetivo, reduciendo una vez al mínimo la concentración del fotosensibilizador en el tejido donador. El contacto adecuado implica aplicar la composición a una o más superficies del injerto o incubar o perfundir un injerto de órgano, con la formulación de fotosensibilizador de la invención. El tratamiento generalmente toma lugar durante al menos un minuto, de manera preferible de aproximadamente 1 minuto hasta aproximadamente 72 horas, y de manera aún más preferible de aproximadamente 2 minutos hasta aproximadamente 24 horas. El tiempo de contacto depende de factores tales como la concentración del agente fotosensibilizador en la formulación, el injerto a ser tratad-, y el tipo particular de formulación. La perfusión se logra por cualquier procedimiento adecuado. Por ejemplo, un órgano puede ser perfundido vía un dispositivo que proporciona una presión o perfusión constante que tenga un regulador de presión y una situación de desbordamiento entre una bomba y el órgano. De manera alternativa, el órgano puede ser colocado en una cámara hiperbárica vía una puerta sell^dora, y el perfundido liberado a la cámara por medio de una bomba que extrae el fluido de un reservorio, opcionalmente mientras el pert_adido usado es retornado al reservorio por medio de una válvula. Para injertos de piel, la formulación puede ser esparcida o rociada sobre la superficie inferior de la piel a ser injertada, de modo que exista una capa de fotosensibilizador entre la superficie inferior del donador y el tejido del receptor. De manera preferible, sin embargo, el injerto de piel completo se sumerge en la composición fotosensibilizadora. El paso de contacto puede tomar lugar a una amplia variedad de temperaturas, evitando únicamente aquellas temperaturas suficientemente grandes para desnaturalizar o en otras circunstancias afectar de manera dañina el injerto y aquellas temperaturas suficientemente bajas para reducir al mínimo la absorción celular del fotosensibilizador. De manera preferible, el paso de contacto toma lugar a una temperatura en el intervalo de aproximadamente 5°C hasta aproximadamente 40°C, de manera preferible, de aproximadamente 15°C hasta aproximadamente 37°C y, de manera más preferible, a temperatura ambiente. Después de una distribución apropiada del fotosensibilizador para asegurar que este se asocie de manera apropiada con las APC objetivo, el tejido donador así tratado se somete a exposición con una luz que tenga una longitud de onda que se absorbida por el agente fotosensibilizador y conduzca a la activación de las propiedades citotóxicas del fotosensibilizador. Tal exposición es, por supuesto, totalmente convencional en la técnica de la terapia fotodinámica. Los métodos y aparatos ejemplares para este propósito se describen, por ejemplo, en las Patentes de Dougherty et al . anteriormente mencionadas. Después de que el injerto ha sido puesto en contacto con el fotosensibilizador y expuesto a la luz, puede almacenarse hasta aproximadamente 24-48 horas. De manera preferible, sin embargo, este se usa inmediatamente en un procedimiento de transplante. La vida de almacenamiento puede aumentarse como se describió anteriormente usando un sustituto de la sangre en la formulación (por ejemplo, una emulsión perfluoroquímica) , o perfundiendo el injerto con una formulación de agente fotosensibilízador que contenga agente isotónico congelado y anticoagulante, seguido por glicerol, para permitir el congelamiento de los injertos con poca destrucción de las células, como se describe en la JP 60061501 publicada el 9 de Abril de 1985. Además, el injerto puede ser preservado con diferentes líquidos que incluyen la formulación, mientras los órganos están siendo enfriados a temperaturas de congelación para preservar el órgano semipermanentemente sin necrosis celular. Antes del transplante, el injerto se lava preferiblemente libre de composición de agente fotosensibilizador, enjuagando este en una solución salina fisiológica o por otros medios apropiadas para este propósito. También, antes del transplante, puede darse al receptor una o más perfusiones sanguíneas específicas para el donador con células mononucleares de sangre periférica tratada con PDT para ayudar a la sobrevivencia del injerto. Un procedimiento alternativo es someter el recipiente a irradiación linfoide total antes de la operación de transplante. Puede efectuarse otros procedimientos pretransplante que pudieran ser benéficos para el receptor del transplante particular como parte del método de la invención.

En algunos casos, es deseable modificar la superficie del injerto para proporcionar grupos cargados positiva o negativamente, mediante el uso de un aminoácido o polímero adecuado o mediante la unión de una fuente fisiológicamente aceptable de grupos funcionales cargados. Por ejemplo, una superficie cargada negativamente es apropiada para los bazos sanguíneos para disminuir la coagulación sanguínea. También es deseable en ciertas circunstancias hacer la superficie hidrofóbica o hidrifílica mediante el acoplamiento, por ejemplo, de fenilalanina, serina, o lisina a la superficie. Un agente inmunosupresor particularmente efectivo para esas modificaciones de la superficie es el glutaraldehido. El procedimiento de transplante en sí dependerá del padecimiento particular que este siendo tratado, la condición del paciente, etc. El médico reconocerá el procedimiento apropiado que debe usarse en cualquier caso dado. Los transplantes se verifican opcionalmente de manera sistémica durante el periodo poste oratorio crítico (los primeros tres meses) usando cualquier procedimiento adecuado, tal como angiografía intravenosa con radionúclidos. Después del transplante, con frecuencia se usa la terapia de inmunosupresión, usando un inmunosupresor apropiado, como aspecto importante para asegurar la sobrevivencia del injerto.

El método de la invención puede ser suplementado mediante o usado en combinación con la misma o dosis reducidas de agente inmunosupresor administrado simultáneamente al donador sistémicamente, el tejido donador in vitro, o el receptor, ya sea local o sistémicamente. El término "agente inmunosupresor" como se usa aquí se refiere a sustancias que actúan suprimiendo o enmascarando el sistema inmune de huésped en el cual el injerto está siendo transplantado. Este podría incluir sustancias que suprimen la producción de citosina, desregular o suprimen la expresión de autoantígenos, o enmascaran los antígenos MHC. Los ejemplos de tales agentes incluyen las 2-amino-6-aril-5-pirimidinas sustituidas, azatioprina o ciclofosfamida, bromocriptina, glutaraldehído, anticuerpos antiidiotípicos para antígenos MHC, ciclosporina A, uno o más esteroides, preferiblemente corticosteroides y glucocosticosteroides tales como la prednisona, metil prednisolona, y hexametasona; anticuerpos anti-interferon-gamma; anticuerpos anti-factor alfa de la necrosis tumo al; anticuerpos anti-factor beta de la necrosis tumoral, anticuerpos anti-interleucina 2; anticuerpos anti receptor de citosina tales como los anticuerpos anti receptor de IL-2; anti-globulina linfocítica heterólogo; anticuerpos pan-T, preferiblemente anticuerpos monoclonales OKT-3; anticuerpos para CD4; estreptocinasa, estreptodornasa; o ARN o ADN del huésped. Una cantidad efectiva, la cual se determina mediante esas consideraciones, es la cantidad mínima necesaria para prevenir una respuesta inmune que pudiera dar como resultado el rechazo del injerto por el receptor, pero tan necesaria para lograr un tiempo de sobrevivencia prolongado del injerto. Tal cantidad es preferiblemente inferior a la cantidad que es tóxica al receptor o vuelve al receptor significativamente más susceptible a infecciones. La C5" tidad de agente inmunosupresor requerida por la invención es típicamente inferior a la normalmente requerida para injertos transplantados que no han sido pretratados, y depende de las circunstancias individuales que rodean al transplante y el tipo de agente inmunosupresor que sea usado. Como ejemplo específico, la cantidad farmacéuticamente efectiva total de agente inmunosupresor, ciclosporina A, administrada parenteralmente por dosis estará en el intervalo de aproximadamente 0.1 a 20 mg/kg de peso corporal del paciente por día, en comparación con el intervalo típico de aproximadamente 5 hasta aproximadamente 15 mg/kg/día de ciclosporina A actualmente usado en la terapia in unosupresora convencional. Para transplantes renales, la práctica usual es administrar dosis masivas de glucocorticosteroides en periodos cortos, por ejemplo, metilprednisolona en dosis de varios gramos por día dadas durante 3 a 5 días, seguidas por 20 a 100 mg de prednisona, sin pretratamiento fotodinámico del tejido injertado. Con el pretratamiento de la invención, podrían ser útiles dosis significativamente menores. Como se hizo notar anteriormente, esas cantidades sugeridas de inmunosupresores se someten a un gran trato de discreción terapéutica. El factor clave en la selecciór de una dosis y programa adecuados es el resultado obtenido, es decir, la sobrevivencia a largo plazo del injerto. Por ejemplo, pueden ser necesarias dosis relativamente altas ya sea inicialmente para el tratamiento del rechazo hiperagudo del injerto, lo cual puede atribuirse a la destrucción del injerto mediada por anticuerpos, o en una etapa tardía caracterizada por la declinación súbita de la función del injerto. Cuando se usa un agente inmunosupresor, este puede ser administrado por cualesquier medios adecuados, incluyendo la administración parenteral, y, si se desea por tratamiento inmunosupresor local, administración intralesional. Las perfusiones parenterales incluyen la administración intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal o subcutánea. Además, cuando se usa un agente inmunosupresor, este se administra de manera adecuada por infusión pulsátil, particularmente con dosis declinantes o por infusión continua. Los siguientes ejemplos son para ilustrar, pero no para limitar la invención: Ejemplo 1 Preparación de un Conjugado BPD-Ra-MIq El agente fotosensibilizador BPD-MA mostrado en la Figura 1 se diluyó, en la oscuridad, de una concentración de 1 r. /mi a 200 pg/ml en solución salina amortiguada con fosfatos y se mezcló con una cantidad conocida de anti-Ig de ratón (RaMIg) , la cual se obtuvo de Cedar Lañe Laboratories o se preparó inmunizando conejos con inmunoglobulina de ratón y purificando los anticuerpos sobre columnas inmunoabsorbentes. La mezcla se incubó a temperatura ambiente durante una hora en la oscuridad, y el conjugado resultante se dializó durante la noche a través de una membrana permeable a moléculas que tiene un peso molecular de menos de 12-14 kd contra tres litros de PBS a 4/C. Los estudios modelo con BPD-MA marcado muestran que el conjugado retenido tiene una relación BPD:Ab 10-20. La fracción retenida de la diálisis se congeló entonces y liofilizó y almacenó en la oscuridad.

Ejemplo 2 Tratamiento del Tejido del Aloinjerto con el Conjugado Se aisló tejido de islotes pancreáticos donador de ratas como sigue: Se anestesiaron ratas SD macho (200-250 g) con uretano intraperitoneal (100 mg/kg) y, a través de una laparotomía en la línea media, se indujo paro cardiorrespiratorio con neumotorasis bilateral. El conducto biliar común proximal se canuló y se ocluyó distalmente en su punto de entrada al duodeno. A continuación se distendió el páncreas en forma retrógrada con solución de colagenasa fría (4/C) (Type XI, Sigma Chemicals) a una concentración de 0.42 mg (650 U.) por mi. Después de la distensión de la colagenasa in situ, se efectúo una pancreotomia total. Las glándulas se digirieron durante 22 minutos en un baño de agua a 37/C. Las glándulas digeridas se dispersaron por trituración a través de una pipeta siliconizada, estéril. La suspensión de tejido crudo se hizo pasar a través de un filtro con el tamiz de 200 micrones para remover los conductos no digeridos, bazos sanguíneos y nodos linfáticos, y a continuación se centrifugó a través de un gradiente discontinuo de dextran que consistió de dos monocapas de gravedad específica de 1.065 y 1.031, respectivamente. El tejido de islote menos denso se aspiró de la interfaz de la monocapa, se lavó, y se purificó adicionalmente extrayendo manualmente bajo un microscopio de disección. Usando esta técnica, se cosecharon 300-400 islotes funcional y morfológicamente intactos por páncreas. Los islotes se cultivaron in vitro durante un día en medio F-12 de Ham suple entado con 25% de suero de carnero, amortiguador h£PES 15 mM, y 1% de estrepfungizona. Los islotes cultivados se incubaron inicialmente con un anticuerpo monoclonal anti-Ia de rata comercialmente disponible (designado como OX-6) , obtenible de SeraLab a 0.2 mg/ml durante horas a /C. El OX-6 es inmunoespecifico contra el producto del MHC de la clase II. Las porciones de los islotes tratados con OX-6 se incubaron con, respectivamente, (1) conjugado Ra-MIg-BPD que tiene una relación de BPD:lAb de 6.5; (2) el mismo conjugado a una relación de BPD:lAb de 20; (3) un conjugado de BDP con el anticuerpo irrelevante GA-7sIgG a BPD:lAb de 6.5; (4) BPD solo; y (5) medio solo a 20/C curante dos horas en la oscuridad. Las mezclas de incubación se expusieron entonces a 10 Joules/cm2 de energía luminosa a una longitud de onda de 400-800 mm. Los cultivos irradiados se probaron entonces histológicamente para determinar la disminución de APC.

Ejemplo 3 Caracterización del Tejido Donador Los estudios histológicos, aproximadamente 75-100 islotes que habían sido tratados con el conjugado BPD:lAb 6.5 se transplantaron bajo la cápsula renal de ratas SD singenéicas receptoras y ratas WF alogenéicas. En ambos transplantes singenéicos y alogenéicos, todos los receptores dieron resultados exitosos. En particular, se observó un reemplazo completo del injerto sin infiltrado linfocítico y sin tejido endocrino identificable en ambos transplantes singenéico y alogenéico. En los estudios de agotamiento o disminución de APC, los islotes se inmunotiñeron principalmente con el anticuerpo OX-6. Las células así tratadas se sometieron a una tinción secundaria con anti-Ig de ratón de cabra marcado con FITC (Jackson Laboratories) y se sometieron a microscopía fluorescente. En las preparaciones que habían sido tratadas con los conjugados, no se observaron células con MHC de la clase II identificables. En los controles (conjugado con anticuerpo irrelevante, BPD solo, y medio), sin embargo, se detectó la presencia de esas células por microscopía fluorescente, puesto que el anticuerpo secundario marcado con FITC marcó las APC y emitió fluorescencia verde.

Ejemplo 4 Prevención del Rechazo de Aloinjerto de Piel Para establecer una linea básica que represente el rechazo mínimo, se efectuaron nueve sininjertos (el donador y el receptor son el mismo animal) en ratones BALB/c, de acuerdo con los procedimientos estándar (Billingham et al., "La Técnica de Injertar Piel Libre en Mamíferos", J. Exp. Biol., 28^:385-99 (1951), como sigue: Se afeitó y depiló la piel trocal del ratón que estaba siendo injertado. El rato se anestesió entonces con la inyección intraperitoneal de una mezcla de clorhidrato de ceta ina 20 TI, xilasina 10 TI, y PBS 70 TI, después de lo cual se obtuvo un espesor total de piel (1 cm x 1 cm) por disección cuidadosa, dejando un lecho de injerto adecuado y teniendo cuidado en mantener los pináculos carnosos intactos. Los injertos de piel autóloga se reaplicaron entonces al sitio del injerto y se mantuvieron en su lugar aplicando una pequeña cantidad de cuatro gotas de adhesivo tisular Vetbond a la interfaz entre el injerto y el lecho del injerto. El injerto se presionó hacia abajo con esponjas de gasa recubierta con jalea de petróleo, y el injerto y las esponjas se mantuvieron en su lugar con cinta de vendaje Vetrap, la cual se enrolló alrededor del cuerpo para formar una "envuelta corporal". El porcentaje de éxito de los sininjertos a largo plazo, es decir, más de 120 días, fue mayor del 90%. El rechazo del injerto se consideró completo cuando existió al menos 80* de necrosis del injerto. La sobrevivencia del injerto se expresó como una media en términos del tiempo de sobrevivencia en días ± la desviación estándar. También se efectuaron transplantes de piel alogeneica entre ratones C57BL/6 (donadores, H-2b) y BALB/c (receptores, H-2d) como controles, usando los mismos procedimientos descritos anteriormente excepto que cada injerto de piel se tomó de un ratón donador y se aplicó al lecho del injerto de un ratón receptor diferente. En resumen, se afeitó y depiló la piel troncal de los ratones donadores, después de lo cual se obtuvieron injertos de piel completa (1 cm x 1 cm) . Los ratones receptores se afeitaron y a continuación se anestesiaron mediante la inyección intraperitoneal de la mezcla de clorhidrato de cetamina 20 TI, xilasina 10 TI, y PBS 70 TI. El lecho del injerto de cada receptor se preparó mediante la disección cuidadosa de la piel troncal (1 cm x 1 cm) , teniendo cuidado en mantener los pináculos carnosos intactos. Los injertos se aplicaron al sitio de injerto alogeneico, y se mantuvieron en su lugar aplicando adhesivo tisular Vetbond, esponjas de gasa recubierta con jalea de petróleo, y cinta de vendaje Vetrap, para formar una "envuelta corporal". El tiempo de sobrevivencia promedio fue de 11.1 días (desviación estándar de 1.9) . De acuerdo con el método de la invención, la muestra de piel a ser injertada sobre un receptor se puso en contacto primero in vitro con una solución 1.0 Tg/mL de agente fotosensibilizador BPD durante una hora. La piel se suspendió a continuación en una solución de electrolito que no contenía suero bovino fetal ("FBS") durante 30 minutos y se expuso a la luz roja de diodos emisores de luz ("LED") (10 J/cm2 a 690 nm ± 10 nm) . Después de este tratamiento con luz, la piel expuesta se transplantó a un ratón receptor como se describió anteriormente. El animal se vigiló para detectar el rechazo a partir del día 8 después del transplante. El tiempo de sobrevivencia promedio para los aloinjertos se incrementó a 18.5 días (desviación estándar de 2.1). Esos resultados se tabulan a continuación en la Tabla I para una más fácil comparación: TABLA 1 Tiempo de Sobrevivencia Número de Promedio .nimales de (Desviación Tipo de Injerto Prueba Estándar) Sininjerto 9 Indefinido Aloinjertos 16 11 .1 días (1.9) Aloinjerto con 6 18 .5 días (2.1) pretratamiento de la piel donadora Los resultados sugieren que el efecto inmunomodulador del tratamiento fotodinámico sobre el tejido a ser injertado podría dar como resultado un tiempo de sobrevivencia del injerto significativamente prolongado. El experimento se repitió para comparar nuevamente los injertos efectuados de acuerdo a la invención, haciendo variar la concentración (de 0.25 a l.OTg/mL) del agente fotosensibilizador BPD, con injertos control, estándar. Los resultados de esas pruebas se resumen a continuación en la Tabla 2: TABLA 2 Tiempo de Sobrevivencia T-.„o de Injerto (No. Promedio de Animales de Fotosensibilizador (Desviación Prueba) y Dosis de Luz Estándar) Aloinjerto Control 0 7.5 días (0.84) (10) Aloinjertos con 1.0 Tg/mL de BPD, 11.0 días (0.0) pretratamiento de la LED de 10 J/cm2 piel donadora (5) Aloinjertos con 0.5 Tg/mL de BPD, 14.3 días (1.51 pretratamiento de la LED de 10 J/cm2 piel donadora (5) Debido a que parece ser que escalar al doble el agente fotosensibilizador no prolonga significativamente por sí mismo el tiempo de sobrevivencia del injerto, se postuló que los efectos inmunomoduladores del tratamiento fotodinámico del tejido a ser injertado pueden depender de los efectos selectivos sobre las poblaciones celulares en la piel y pueden no necesariamente deberse al efecto citotóxico conocido de la terapia fotodinámica.

Ejemplo 5 Examen Histológico de la Piel a ser Injertada Para examinar los efectos de tratar los injertos de piel con terapia fotodinámica bajo condiciones que dan como resultado tiempos de sobrevivencia prolongados, se obtuvieron muestras de piel y se trataron como se describió anteriormente excepto con un intervalo diferente de concentración de agente fotosensibilizador, es decir, 0.25 ó 0.50 Tg/mL de BPD. Algunos tejidos se incubaron en solución de electrolito sola, sin ningún agente fotosensibilizador presente, como muestras control. Todas las muestras de tejido se incubaron durante un periodo de 24 horas, después de lo cual se expuso un número representativo a la luz. Cuando se dio, la exposición a la luz fue con luz roja a un nivel de energía de 10 J/cm2. Todas las muestras se colocaron entonces en formalina y se sometieron a un examen histológico. Los tejidos incubados en solución de electrolito sola (muestras control) o en una solución de 0.50 Tg/mL de BPD, sin ser expuestos a la luz, parecen ser normales. Sin embargo, las muestras tratadas ya sea con 0.25 ó 0.50 Tg/mL de BPD, seguido por el tratamiento con luz roja, exhibieron los siguientes cambios: alargamiento nuclear, vacuolación perinuclear, disminución en la eosinofilia de las células epiteliales, incremento en el volumen citoplásmico, el incremento de los espacios intracelulares entre los queratinocitos sobre la superficie epitelial. Se postuló que, en base a esos halla -gos histológicos, el tratamiento fotodinámico de la invención dio como resultado un grado de daño celular, en lugar de la muerte celular. El mecanismo de este efecto no citotóxico inesperado no se conoce. Deberá ser claro a aquellos expertos en la técnica que pueden hacerse modificaciones y/o variaciones de la materia objeto de la descripción sin apartarse del alcance de la invención reivindicada a continuación.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención. Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes:

Claims (13)

REIVINDICACIONES ENMENDADAS PARA MÉXICO

1. El uso de .n agente fotosensibilizador para preparar un medicamento para reducir el rechazo de aloinjertos que comprende tejido donador que contiene células presentadoras de antígeno (APC) , el medicamento para un método, caracterizado porque comprende: a. poner en contacto el tejido donador con un agente fotosensibilizador para obtener un tejido modificado b. exponer el tejido donador modificado a una luz que tiene una longitud de onda absorbida por el agente fotosensibilizador durante un tiempo suficiente para modular las APC en el tejido donador; y c. transplantar el tejido donador que contiene APC moduladas en el tejido del receptor.

2. El uso de conformidad con la reivindicación 1, en donde el tejido donador es tejido cutáneo o islotes pancreáticos.

3. El uso de conformidad con la reivindicación 1, en donde el agente fotosensibilizador es un BPD.

4. El uso de conformidad con la reivin -.cación 1, caracterizado porque al menos una de las longitudes de onda de la luz está en la porción visible del espectro electromagnético .

5. El uso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el agente fotosensibilizador está en forma de una solución que fluctúa en concentración de 0.25 a 1.0 µg/ml.

6. El uso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque, durante el paso de exposición b, el tejido donador modificado se suspende en una solución de electrolito.

7. El uso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la dosis de luz durante el paso de exposición b es de aproximadamente 10 J/cm2.

8. El uso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el agente fotosensibilizador se encuentra en forir de un conjugado que comprende un componente específico para el objetivo.

9. El uso de conformidad con la reivindicación, en donde el agente específico al objetivo comprende un agente que se enlaza específicamente con la célula presentadora de antlgeno (APC).

10. El uso de conformidad con la reivindicación 8, en donde el agente especifico al objetivo es un anticuerpo, un fragmento del mismo, o un ligando del receptor para un receptor que esté sobre la superficie de las células presentadoras de antígeno (APC).

11. El uso de conformidad con la reivindicación 8, en donde el agente que se enlaza a un marcador, que a su vez se enlaza específicamente con las APC.

12. Un tejido donador que tiene una susceptibilidad reducida de rechazo a aloinjertos, caracterizado porque se prepara mediante el uso de un médicamente en el método de conformidad con la reivindicación 1

13. Una composición de interés, caracterizada porque comprende un tejido donador que contiene células presentadoras de antígeno (APC) en una mezcla con un agente fotosensibilizador. comprende un agente específico para el objetivo capaz de afectar la elección del objetivo por las APC en el tejido donador.