MXPA97004964A - Modulacion de los niveles de metabolitos toxicosen productos consumibles - Google Patents
Modulacion de los niveles de metabolitos toxicosen productos consumiblesInfo
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Abstract
Se proporcionan métodos y composiciones para controlar el nivel de metabolitos tóxicos en materiales, y particularmente en plantas, antes, durante, y/o después de la cosecha y/o del procesamiento. La invención encuentra uso para reducir el riesgo a la salud asociado con los productos de consumo tales como tabaco, alimentos de granos de cereal, productos de grano procesados tales como jarabe de maíz, frutas cítricas, verduras subterráneas, vegetales de fruta, vegetales de flor, hojas, y tallos, y flores cortadas, y para mejorar los procedimientos de prueba en animales de laboratorio mediante el control del nivel de micotoxinas asociadas con los materiales que colonizan los microorganismos productores de toxinas. Las composiciones para controlar los hongos productores de micotoxinas comprende aldehído cinámico, aldehído de coniferilo, o derivados de los mismos, que tienen la fórmula (2), en donde R1 representa -CHO, R3 representa -H, -OH, o un sustituyente orgánico que comprende de 1 a 10átomos de carbono, R2 representa -H, -OCH3, o un sustituyente orgánico que comprende de 1 a 10átomos de carbono, y R4 representa -H o un sustituyente orgánico que comprende de 1 a 10átomos de carbono.
Description
MODULACIÓN DE LOS NIVELES DE METABOLITOS TÓXICOS EN PRODUCTOS CONSUMIBLES
INTRODUCCIÓN
r»tnpr> de la Invención La invención se refiere a métodos y composiciones para controlar el nivel de metabolitos tóxicos presentes en productos consumibles. Las composiciones utilizadas incluyen aldehidos aromáticos y metabolitos fúngales secundarios.
Antecedentes de la Invención La contaminación inducida por moho y el deterioro de los productos agrícolas provoca pérdida económica y da riesgos a la salud. Los hongos de los géneros Aspergillus,
Al ternarías, Fusarium, y Penicillium pueden contaminar los cultivos alimenticios y sus productos. Las micotoxinas producidas por estos hongos incluyen aflatoxinas, fumonasinas, ácido fusárico, toxinas de TA/AAL, zearalenona, y tricoteceno, ácido 5-butilpicolínico y derivados de piridina fitotóxicos relacionados. Estas micotoxinas son altamente tóxicas para una variedad de especies, incluyendo seres humanos, y se pueden encontrar en los materiales alimenticios comercialmente preparados y en los alimentos para animales. Se pueden presentar serios problemas para la salud cuando las aves de corral, los peces, los animales, o los seres humanos ingieren materiales que se han contaminado con ciertos géneros de hongos que producen micotoxinas . Las micotoxinas son metabolitos secundarios,- las producidas por diferentes especies de Aspergillus son las mejor conocidas. Como un ejemplo, el Aspergillus flavus crece en una variedad de materiales de planta, y produce una micotoxina de bajo peso molecular, la aflatoxina, que es venenosa para los seres humanos y para muchas otras especies de animales. El peligro real y potencial de estas toxinas se demostró dramáticamente en 1960 por el envenenamiento de truchas a gran escala en los criaderos de peces comerciales, provocado por alimento para peces contaminado con hongos. Las fumonisinas también han demostrado que afectan el crecimiento y la salud de los animales domésticos de valor comercial, incluyendo caballos, cerdos, pollos, y pavos. Las fumonisinas también se han identificado en los materiales alimenticios utilizados para alimentar animales empleados ampliamente en la investigación biomédica y en las pruebas comerciales. Por consiguiente, la investigación puede estar comprometida cuando se crían animales experimentales con alimento variablemente contaminado con micotoxinas. La fumonisina representa una clase de micotoxinas que son contaminantes que se encuentran en ciertos productos de cultivo alimenticios. También, loe mismos hongos de Fusarium que colonizan el maíz almacenado y los productos de maíz, producen ácido fusárico. Las micotoxinas de fusarium son estables al calor y sobreviven a un extenso procesamiento, y se encuentran en muchos productos de maíz, incluyendo el edulcorante de maíz de fructuosa, la principal fuente de edulcorantes en la industria de alimentos, y en los productos de fermentación comercialmente producidos, tales como alcohol de grano. Otras micotoxinas que se han identificado en los materiales de maíz y en otros materiales vegetales incluyen, las toxinas de TA/AAL (análogos estructurales de la fumonisina) , lae aflatoxinas, zearalenona, tricoteceno, ácido 5-butilpicolínico, y derivados de piridina fitotóxicos relacionados. Se ha demostrado que el ácido fusárico afecta a los neurotransmisores, y por consiguiente a la función nerviosa tanto del sistema nervioso central como periférico, y la función del corazón puede ser afectada sobre una exposición al ácido fusárico y a los materiales y productos contaminados con fumonisina. Por consiguiente, la eliminación de ácido fusárico y otras micotoxinas que todavía se tienen que identificar, de los materiales consumibles, puede tener una parte significativa en el bienestar de animalee y seres humanos también. La preeencia de micotoxinae en los alimentos se puede atribuir a la distribución ampliamente extendida de los hongos y su crecimiento durante el almacenamiento y manejo de alimentos y cultivos contaminados. Se han encontrado altos niveles de todos los tipos de micotoxinas en una variedad de comodidades comeetiblee, incluyendo frijoles, cereales, cocos, cacahuates, papas dulces, y alimentos para animales comercialmente preparados . También se han identificado las micotoxinas en la leche y en los productos de la leche. Fuera del uso de conservadores químicos, la pasteurización o las condiciones de almacenamiento secas o altamente controladas que impiden o reducen el nivel de micotoxinas presentes en estos productos comerciales, han probado ser inefectivas. La contaminación con micotoxina de los productos de tabaco puede estar enlazada con la patología de enfermedades asociadas con el consumo del tabaco. Las plantas de tabaco con frecuencia están severamente contaminadas con hongos que producen micotoxinas, incluyendo la fumonisina y los hongos que producen ácido fusárico. Las fumonisinas se han implicado en el cáncer del esófago en seres humanos, el tercer cáncer más frecuente en el mundo. Tanto los organismos productores de fumonisina como de ácido fusárico están presentes en el tabaco, y por consiguiente, pueden tener un papel importante y hasta ahora no reconocido entre los consumidoree tanto de cigarrillos como de tabaco sin humo, en los cánceres oral, de la garganta, y del pulmón, así como en otras enfermedades asociadas con el consumo del tabaco. También se ha demostrado que el tabaco está contaminado con otras micotoxinas, incluyendo las aflatoxinas. Químicamente, las micotoxinas son compuestos estables al calor, de un peso molecular relativamente bajo. Por consiguiente, una vez que el alimento u otros consumibles llegan a contaminarse con niveles inaceptablemente altos de micotoxina, el producto generalmente se debe desechar. Por consiguiente, es de interés desarrollar métodos que se puedan utilizar para prevenir la contaminación de consumibles, e identificar la presencia de las micotoxinas en un producto, destoxificar los materiales no consumibles contaminados cori la toxina, para disminuir las afecciones de la salud negativas asociadas con la exposición a estos materiales. Más aun, es altamente deseable controlar el nivel y los efectos tóxicos de las toxinas microbianas que se acumulan antes, durante, y/o después de que entran los productos coneumibles en la cadena alimenticia, o de que se consumen de otra manera.
Literatura Pertinente La presencia de micotoxinas en hojas almacenadas de tabaco para mascar se describe en Varma y colaboradores, Mycopathologia (1991), 113:19-23. Las propiedades antibolutinales de varios aldehidos aromáticos y alifáticoe se describen en Bo les y Miller, J. Food Protection (1993) 56:788-794. Se han reportado otras formulaciones que incluyen aldehido cinámico para proteger cultivos del ataque por microbios patogénicos. Ver las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 4,978,686 y 5,149,715 y la Solicitud de Patente Francesa Número 2529755. Se ha reportado que los polímeros de recubrimiento formadores de película y/o antitranspirantes, tales como bicarbonato de sodio y petróleo parafínico ligero, controlan el nivel de colonización fungal. Horet y colaboradoree {Plant Disease, marzo de 1992, página 247), Elad y colaboradores {Phy toparas i tica (1989) 17:279-288) y Hagiladi y colaboradores (J. Environ Hortic (1986) 4: 69-71). En la Solicitud de Patente Japonesa Número 814965, se reporta la protección de productos de granja de insectos, microbios, y bacterias, para prevenir el daño físico a los productos de granja, utilizando una emulsión de aldehidos cinámico. Se reporta que la formulación es de acción rápida y que no deja residuos.
COMPENDIO DE LA INVENCIÓN La presente invención ee refiere a métodoe y composiciones para controlar el nivel de metabolitos tóxicos presentee en una variedad de productoe coneumibles que son colonizados o que pueden ser colonizados por microorganismos productores de toxinas . El método incluye los paso de poner en contacto un producto consumible o un precursor de este producto con una composición, particularmente un aldehido aromático que limite la colonización de, que aniquile o desplace uno o más microorganismos que colonicen el material consumible o el precursor, y que produzcan toxinas. La invención encuentra uso en el control del nivel de los metabolitos tóxicos presentes en los productos consumibles derivados de materialee de plantas, así como la disminución de la contaminación de la cadena alimenticia por toxinas fúngales y metabolitos tóxicos.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS Se proporcionan métodos y composiciones para modular el nivel de uno o más metabolitos tóxicos asociados con productos consumibles, particularmente productos agrícolas que pueden ser colonizados por uno o más microorganismos productores de toxinas. Los métodos involucran la aniquilación o el desplazamiento a largo plazo de uno o más microorganismos productores de toxinas, particularmente utilizando compuestos que se presentan de una manera natural, tales como los aldehidos aromáticos, aldehidos cinámico, aldehido de coniferilo, y aldehido alfa-hexil-cinámico (HCA) . La invención es particularmente adecuada para reducir el nivel de micotoxinas y otros metabolitos secundarios tóxicos asociados con las partes de las plantas, tales como los tallos, las hojas, raíces, fruta, semillas, y/o flores, antes, durante, y/o después de que la planta y/o la parte de la planta se cosecha y/o se procesa para su consumo. La presente invención proporciona además ensayos para la detección y cuantificación de las toxinas microbianas presentes en una muestra, con el objeto de determinar si y el grado hasta el cual se contamina una muestra. Los ensayos se utilizan para probar loe niveles de toxina asociadoe con las plantas enteras y otroe materialee bajo condiciones de campo o no de campo, durante o después de que una planta o parte de la planta se cosecha y/o se procesa en un producto consumible. Adicionalmente, se pueden emplear ensayoe para identificar loe metabolitos secundarios tóxicos producidos por ciertas especies de hongos, por ejemplo, la especie de Fusari um, que pueden ser útiles como herbicidas, insecticidas, fungicidas, y/o como agentes farmacológicos. La invención ofrece varias ventajas sobre las técnicas de destoxificación actualmente disponiblee. Una ventaja ee que ee puede prevenir o dieminuir de una manera eignificativa la contaminación de los productos agrícolae coneumiblee haeta un nivel seguro para su consumo. Los productos agrícolas se pueden tratar bien sea antes de cosecharse o después de cosecharse, generalmente por medio de una sola aplicación de la composición. Más aun, mediante el tratamiento de una planta en el campo con una sustancia que aniquile o desplace los hongos productores de micotoxina, se pueden reducir de una manera significativa los niveles de contaminación con toxina en el material cosechado. Los aldehidos aromáticos en particular tienen propiedades organolépticas o olfatorias positivas, que en algunos casos pueden mejorar el sabor y/o el olor de los productos tratados. El olor del HCA, por ejemplo, se describe como floral o de jazmín con algún carácter herbáceo (Hoja de Información Técnica) . Un número de aldehidos aromáticos y alifáticos que pueden encontrar uso en la presente invención, tales como aldehido bencénico, aldehido acético, aldehido cinámico, piperonal, y vainillina, son agentes saborizantes sintéticos generalmente considerados seguroe (GRAS) (21 CFR §172.515) . El HCA eetaba en el uso público antes de los 1950e, y actualmente ee utiliza ampliamente en preparacionee para el coneumidor (jabones, detergentes, cremae, locionee, perfumes) (Monografías sobre materias primas de fragancias. Food Cosmet. Toxicol. 12: eupl . , 915, 1974). Al HCA ee le concedió el eetado de GRAS (generalmente reconocido seguro) por la FEMA (Flavoring Extract Manufacturers ' Aeeocia ion. Eetudio de niveles de uso de ingredientee eaborizantee . No. 2569. Fd. Technol . , Champaign, 19: (parte 2) 155, 1965) en 1965, y eetá aprobado por la FDA de Estados Unidos para utilizarse en alimentos (21CFR121.1164) . El Concilio de Europa (1970)
(Concilio de Europa. Sustanciae Saborizantee Naturales y
Artificiales. Convenio parcial en el campo de la salud social y pública. Strasburgo, Lieta A(l), Serie 1, No. 129, página 55, 1970) incluyó el HCA en la lista de sustanciae eaborizantee artificiales admisibles en un nivel de 1 ppm. Se ha reportado que varios de estos compuestos tienen una actividad inhibidora contra la germinación de esporas de C. botulinu . Bowles y Miller, G. Food Protection (1993). 56: 788-794. Los tensoactivos que se pueden utilizar como emulsificantes, tales como loe Tweens (polisorbatos) , también se utilizan ya como aditivos de alimentos, como la saponina (también tiene un estado de GRAS) . En adición, se puede manejar la residualidad de la formulación. Esto eerá de gran beneficio cuando se deseen residuos a corto plazo para programas de manejo de plagas integrados con insectos benéficos. En adición, las formulaciones trabajan contra las plagas que son resistentes a otros agentes, y son efectivas sobre múltiples organismos objetivos, incluyendo no solamente los hongos productoree de micotoxina, sino también insectos objetivos. Esto reduce la neceeidad de aplicar múltiplee agentes al material de interés consumible. Los efectos de una eola aplicación de la formulación eon duraderoe, y en general es suficiente una eola aplicación para controlar el crecimiento fungal durante cuando menos un mes, o en algunos caeoe, hasta toda una temporada de crecimiento. El control a largo plazo de loe organiemos patogénicos da como resultado una planta más sana y un rendimiento mejorado del producto de la planta huésped, comparándose con las plantas no tratadas; las concentraciones más bajas y la dosis sencilla de agentes antipatogénicos, disminuyen la posibilidad de daño a la planta o a su cultivo, así como disminuyen la posibilidad de cualesquiera efectos secundarioe adversos para los trabajadores que aplican el plaguicida, o para loe animalee o avee de corral que ingieran los tejidos o las partes de las plantas tratadas. También se disminuye la fitotoxicidad de la formulación cuando se elimina el antioxidante. El tiempo de reentrada al invernadero tampoco ee una preocupación. Típicamente, las formulaciones son rápidamente letales para un organismo objetivo; esta es una característica particularmente valiosa cuando se acopla con ningún tiempo de reentrada (por ejemplo, no hay pérdida de inventarios de flores cortadas) . Para los materiales que se utilizan como materiales alimenticios para eeree humanos, o para alimento para comodidades alimenticias consumidae por seres humanos, existe una ventaja adicional en que se disminuye o se eliminan las toxinas en la cadena alimenticia. Como un ejemplo, la carne de peecado, avee de corral, y de animalee que eean alimentados de materiales tales como grano contaminado o pastos secoe contaminadoe, también eetá contaminada con toxinas. Aunque ee ha reportado que un aldehido flavonoide, el aldehido cinámico, exhibe propiedades antifungales, anteriormente no se ha utilizado en plantas en una formulación que se pretenda para proporcionar protección a largo plazo a una planta, de tal manera que se elimina la contaminación con micotoxina de los consumibles producidos de la planta, no solamente la fruta fresca o las verduras frescas," el tabaco, y los granos alimenticios para aves de corral, animales, peces, y otros elementos de la cadena alimenticia humana. Por consiguiente, el tratamiento de los materiales con los que se alimentan los animales disminuye o elimina lae toxinas en la cadena alimenticia. Otra ventaja de la invención es que se reduce la exposición medio-ambiental de los animalee y seres humanoe a, por ejemplo, agua y fuentes del aire de micotoxinas resultantee de la quemadura y/o desecho de materiales de silos contaminados de todos los tipos, mediante la destoxificación de los materialee agrícolae ya sea antes o después de la cosecha, mediante el tratamiento para disminuir o eliminar los hongos que producen las toxinas. Por lo tanto, los procedimientos de destoxificación permiten el desecho seguro de materiales tales como plantae, materiales de plantas, y materiales alimenticios derivados de loe mismos. Las composicionee que comprenden productoe naturalee se pueden utilizar para aniquilar o desplazar organismoe productoree de toxinae de las plantas o de las partes de las plantas que colonizan, limitando de esta manera la cantidad de toxina que normalmente se acumula en el material. Las compoeicionee ee aplican a la planta ya eea antes de que se coseche, o a una planta o a otro material después de la cosecha y/o el procesamiento. De una manera más preferible, la composición se aplica a la planta, a la parte de la planta, o al tejido antes de la cosecha. La composición de preferencia es biodegradable, y más preferiblemente se proporciona como una solución acuosa o como una emulsión en un tensoactivo no iónico anhidro soluble en agua, biodegradable, tal como Tween 80, opcionalmente junto con un promotor del crecimiento y un tensoactivo tal como eaponina, que ee puede derivar de la planta Yucca shidigera . La eusceptibilidad de los hongos particularee a la compoeición ee puede evaluar ya sea in vi tro o in vivo . Son de un interés particular diferentes aldehídoe, particularmente aldehídoe aromáticoe que ee pueden utilizar para aniquilar directamente loe patógenoe fungalee y/o para la inducción de reeietencia eistémica de la planta a diferentes patógenos fungalee . El método incluye el paeo de poner en contacto y/o proporcionar a una o máe partee o tejidoe de una planta enferma o de una planta eueceptible al ataque por patógenos, con un agente antipatogénico, en una cantidad suficiente para controlar el crecimiento de los organismos patogénicos objetivos. El producto modulador del crecimiento tiene una fórmula mostrada en (1) en seguida:
en donde R representa -CH2OH ó -CHO; n es un entero de 0 a 3; cada R , representa independientemente OH o un sustituyente orgánico que contiene de 1 a 6 átomoe de carbono y de 0 a 5 heteroátomos, en donde el número total de átomos de carbono y heteroátomos en todos los sustituyentes R1 de este compuesto no es mayor de 15; y R representa hidrógeno o un suetituyente orgánico que contiene de 1 a 10 átomoe de carbono. Eetoe compuestos incluyen compueetoe naturalee tales como aldehido cinámico, aldehido de coniferilo, y compuestos estrechamente relacionados y proporcionan un método para biocontrolar infestaciones por patógenos. "Biocontrol" eignifica controlar loe patógenos de plantas por medio de la actividad antipatogénica directa y/o la resietencia inducida de la planta huéeped a la infestación del patógeno. El método de la presente invención se realiza proporcionando a una superficie colonizadora del hongo de una parte de planta, tal como una hoja, raíz, o parte de flor, o de un tejido tal como xilema o el floema, una composición que incluya como su ingrediente activo, un producto natural y/o la composición se puede aplicar al sustrato en donde esté creciendo o vaya a crecer. La cantidad de agente antipatogénico que se aplica ya sea a la planta misma o a la rizoesfera dependerá del grado de infestación, y hasta algún grado, de la formulación y de la composición específica utilizada, y por consiguiente, se determina empíricamente para obtener los mejoree resultadoe. "Colonización" significa la asociación de un microorganismo o insecto con una parte o tejido de planta de donde el patógeno deriva los nutrientes, típicamente los nutrientes eeencialee, talee como aminoácidoe, particularmente metionina. "Producto natural" es un compuesto orgánico de origen natural que es único para un organismo, o es común para un pequeño número de organismos estrechamente relacionados, e incluye metabolitos secundarios de hongos y productos químicos producidos por plantas. "Se proporciona" significa la aplicación externa a una parte de planta, así como la inducción de síntesie en la planta de compuesto antifungales, ya sea compueetos endógenos a la planta y/o compueetos suministrados mediante manipulación genética. La manipulación genética se puede realizar mediante métodos de cría cruzadas tradicionales, o mediante la introducción de transgenee en la planta o en un ancestro de la planta, utilizando tecnología de ADN recombinante. Los productos naturales se pueden aislar de una fuente natural, pueden ser total o parcialmente sintéticoe, o se pueden producir mediante técnicas recombinantes, ya sea en la planta misma o en otro organismoe . Una formulación preferida se muestra en la siguiente fórmula (2) :
en donde R¡ representa -CHO, R3 representa -H, -OH, o un sustituyente orgánico que contiene de 1 a 10 átomos de carbono, R2 representa -H, un grupo metoxi, o un suetituyente orgánico que contiene de 1 a 10 átomos de carbono; y R4 representa hidrógeno o un sustituyente orgánico que contiene de 1 a 10 átomos de carbono. Son de un interés particular los aldehidos aromáticos. Los ejemplos de los aldehídoe aromáticoe útilee en la presente invención son aldehido cinámico ((3) siguiente) :
y aldehido de coniferilo ( (4) siguiente)
Otros compuesto de interés incluyen análogos del compuesto de la fórmula (1) , tal como compuestoe euetituidos en la posición alfa con un alquilo, tal como un grupo hexilo, o un grupo alquilo ramificado tal como un grupo amilo. En general, el grupo en la posición alfa ee de 5 a 10 átomoe de carbono. Eetos compuestos incluyen aldehido alfa-hexil-cinámico y aldehido alfa-amil-cinámico. La estructura química del aldehido alfa-hexil-cinámico se muestra en (5) (en eeguida) :
CH3
El nombre de Chemical Abstracts Service (CAS) ee 2-(fenilmetilen) octanal, y el Número de Registro de CAS es [101-86-0] . El compuesto también es descrito por el nombre químico de 2-hexil-3-fenil-2-propenal . La fórmula de los compuestos es C15H20O, y el peso molecular es de 216.3. El HCA se puede obtener en Firmenich; su producto se compone principalmente del isómero (E) -cis (93.8 por ciento máximo), y el isómero (Z) -trans (6 por ciento máximo). Entre los componentee menoree eetá el producto de auto-condensación de aldol del octanal (1-1.5 por ciento (Comunicación Personal, June Burkhardt, Firmenich, Plaineboro, Nueva Jereey) ) . Los compuestos se puede utilizar soloe o en combinación con otras sustancias activas o inactivas, y se pueden aplicar mediante pulverización, vertido, inmersión, en la forma de líquidos concentrados, soluciones, suspeneionee, polvos y similaree, que contengan la concentración del compuesto activo que sea más adecuada para un propósito particular a la mano. También se pueden aplicar, por ejemplo, en la forma de una solución diluida, en un solvente adecuado directamente a la rizoesfera, ya eea como parte de un programa de irrigación, o como una aplicación eeparada. Para utilizarse como una pulverización foliar, aunque el aldehido se puede formular solo, se puede hacer sustantivo incluyendo una cantidad suficiente de un emulsificante, tal como Tween 80, o un compuesto tal como saponina que tiene propiedadee tensoactivos, pero que no tiene un impacto significativo sobre lae propiedades antifungales de la formulación. En general, los detergentes en la formulación no disminuyen las propiedades antifungales de los aldehidos aromáticos, pero sí incrementan las propiedadee sustantivas de la formulación. Ver, por ejemplo, la Patente de los Eetados Unidos de Norteamérica Número 4,477,361. Otros detergentes que se pueden utilizar incluyen detergentes aniónicos, tales como loe deecritos en la Patente de los Estadoe Unidoe de Norteamérica Número 4,978,686. Se pueden incluir componentee adicionalee, talee como una preparación acuosa de una sal de un ácido poliprótico, tal como bicarbonato de sodio, sulfato de sodio, fosfato de sodio, o bifosfato de sodio en la formulación, para incrementar las propiedades antifungales de la formulación. La emulsión reeultante se diluye hasta una concentración apropiada para usarse. En una modalidad preferida, la formulación incluye aldehido alfa-hexil-cinámico, aldehido cinámico, y/o aldehido de coniferilo en una formulación que contiene Tween 80 ó saponina como un emulsificante, y opcionalmente bicarbonato de sodio. La formulación preferida es una emulsión que contiene aldehido alfa-hexil-cinámico, aldehido cinámico, y/o aldehido de coniferilo, del 0.5 por ciento al 10 por ciento en peso, y puede incluir la sal de un ácido aprótico, del 8 a 12 por ciento en peso, y el resto de agua. Se prefieren las formulaciones con del 6 a 12 por ciento de un ácido aprótico. En general, la cantidad total de aldehido presente en la formulación es del 5 por ciento o menos. Las formulaciones son efectivae sin el uso de antioxidantes diferentes de las propiedades antioxidantes inherentes de los aldehidos particulares, por ejemplo, aldehido de coniferilo. La estabilidad de la formulación se puede evaluar mediante una variedad de métodos, incluyendo pruebas aceleradas en donde se expone una formulación de interés a temperaturas elevadas durante un tiempo establecido. Se toman muestras de las formulaciones a intervalos regulares, y se analizan químicamente mediante métodos conocidos por loe expertos en este campo para determinar la velocidad y la naturaleza de la degradación. Por ejemplo, el HCA se puede analizar mediante Cromatografía de Gas-Líquido (GLC) , utilizando una columna capilar de polidimetilsiloxano no polar de 30 metroe (por ejemplo, HP-1, Hewlett-Packard, ó SPB-1, Supelco) , y un detector de ionización de flama. Ueando helio como un gas portador (8 mililitros/minuto) , y una temperatura de la columna de aproximadamente 240°C, el ieómero (E) -cie (componente mayor) tiene un tiempo de retención de aproximadamente 6.0 minutos, y el isómero (Z) -trans (componente menor) tiene un tiempo de retención de aproximadamente 6.3 minutos . La cantidad antifungal más efectiva para las composiciones que incluyen compuesto de la fórmula (3) y/o de las fórmulae (4) ó (5) , así como la cantidad de otros compuestoe de la fórmula (1) que pueden encontrar uso, se puede determinar empleando protocolos conocidos por los expertos en este campo. Como un ejemplo, para cada aplicación particular, se puede calcular la resistencia a la enfermedad promedio; en general, para un control de patógenos efectivo, el porcentaje promedio de control de la enfermedad (MPDC) es mayor del 60 por ciento, de preferencia cuando menos de aproximadamente el 70 por ciento. Estos protocolos también se pueden utilizar para optimizar cada formulación para patógenos específicos, utilizando cualquiera de los compuestos abarcados por la fórmula (1) . El porcentaje promedio de control de la enfermedad se define por la fórmula: MPDC = (MDIC-MDIT) x 100 MDIC y MDIC = Porcentaje promedio de incidencia de la enfermedad en controles no tratados . MDIT = Porcentaje promedio de incidencia de la enfermedad en el tratamiento. Las formulaciones también necesitan evaluarse por su fitotoxicidad,- por consiguiente, es importante que cuando menos una evaluación de la toxicidad a las formulaciones sea en las plantas vivas de la variedad huésped. La fitotoxicidad se puede evaluar como sigue, con el objeto de incrementar la severidad de la toxicidad: 0-plantas sin síntomas; 1-dorado muy ligero del hipocotilo (sin otros síntomas) ; 2-algún marchitamiento de la planta, muerte de las hojas inferiores, algún dorado del sistema vascular; 3-marchitamiento de toda la planta, hojas muriéndose, hipocotilo con síntomas externos e internos; 4-necrosie del tallo, muerte de la planta. La fitotoxicidad generalmente debe ser de dos o menos, de preferencia de 1 ó menos . En algunas instancias, se puede incrementar la eficacia de la formulación mediante la adición de 1 ó más componentes diferentes a la formulación, en donde sea deseable alterar aspectos particulares de la formulación. Como un ejemplo, para ciertas aplicaciones, puede ser deseable disminuir el efecto de la fitotoxicidad cuando se utilice antes de la cosecha, o para incrementar el efecto antipatogénico de la formulación, o ambae . Es preferible que los otros componentes minimicen la fitotoxicidad mientras aquel incrementen el efecto antipatogénico de la formulación. Es de un interés particular el uso de componentes para incrementar la reeistencia promedio a la enfermedad de una formulación contra los organismoe productoree de toxinae que colonizan o pueden colonizar el producto consumible. La concentración de uno o más de los otros ingredientes de la formulación se puede modificar para optimizar el efecto antipatogénico y para reducir el efecto fitotóxico de la formulación. Es de un interés particular la adición de un componente a la formulación para permitir una reducción global en la concentración de uno o más ingredientes diferentes en una formulación dada, particularmente los componentes de acuerdo con la fórmula (1) , mientras que se mantenga la eficacia global de la formulación. La combinación de esta componente con otros ingredientes se puede realizar en uno o más pasos en cualquier etapa adecuada de la mezcla y/o de la aplicación. Los componentes adicionales preferidos incluyen saponinae . Las saponinas son una clase de compuestos, cada uno consistente en una porción de sapogenina y una fracción de azúcar. La sapogenina puede ser un esteroide o un triterpeno, y la fracción de azúcar puede ser glucosa, galactosa, una pentosa, o una metilpentoea. S. Budavari, ed., The Merck Index, 11a edición, Merck & Co., Inc., Rahway, N.J., 1990, página 1328. Las saponinas para utilizarse en la presente invención se pueden producir y/o se pueden aislar de diferentes partes de plantas, incluyendo fruta, hoja, semilla, y/o raíz, utilizando elementos conocidos en la técnica, de una variedad de fuentes, incluyendo las diferentes plantas que se sabe que las producen, desde yuca, quillaja, agave, tabaco, licorice, frijol de soya, ginseng, y espárrago, hasta maderas de aloe. Las saponinas para utilizarse con la presente invención de preferencia no son tóxicas para loe seres humanos y los animales superiores. Más preferiblemente, la saponina para utilizarse en la presente invención es de grado de alimento no tóxico, siendo la fuente de plantas de yuca. Todavía se prefieren máe lae eaponinas de Yucca schidigera o Y. valida y sue equivalentee . Las saponinas más preferidas para utilizarse en la presente invención se derivan de plantas de yuca, siendo las más preferidas Yuca schidigera o Y. valida . Se conocen una variedad de saponinas estructuralmente relacionadas, siendo la característica estructural más variable el patrón de glucosilación. Lae eaponinas también pueden contener modificacionee adicionalee, tales como las sarasaponinas , que son saponinae con un eeteroide unido, y la estructura de la saponina se puede modificar mediante un número de elementos enzimáticoe, químicoe, y/o mecánicoe conocidoe en eete campo. Lae eaponinas de yuca schidigera contienen saponinae esteroidales, siendo las principales sapogeninas las sarsapogenina y tigogenina. Las sarsapogenina produce en la hidrólisis la sarsasapogenina (sarsasapogenina 5-beta, 20-betaF, 22-deltaF, 25-betaF; también conocida como espirostan-3-beta-01 y parigenina) , glucosa y galactosa. Lae sarasapogenima tiene una fórmula molecular de ^^403. Nobel, Park S., Agaves, Oxford Univ. Press, Nueva York, 1994. De conformidad con lo anterior, los derivadoe de estos compuestos que producen una formulación que tiene el efecto antipatogénico y/o fitotóxico deseado, se consideran equivalentes de la invención. Dependiendo de su estructura, una saponina dada puede tener una propiedad plaguicida particular, y se puede usar con las presentes formulaciones. En general, una cantidad efectiva de saponina está en la escala de aproximadamente el 0.01 al 3 por ciento, y más preferiblemente una solución acuosa de aproximadamente el 0.25 por ciento por volumen/volumen de extracto de saponina de 10° brix. Los grados brix son iguales al porcentaje en peso del azúcar en la solución. Hawley, ed., The Condensed Chemical Dictionary, 10* edición, Van Nostrand Reinhold, Nueva York, 1981, página 149. Cada formulación se evalúa por su efecto sobre los microorganismos productores de toxina específicos, y/o el producto consumirlo antes o después de la cosecha, tal como una planta huésped o un producto de planta, utilizando cualquiera de los compuestos de la fórmula (1) , así como otros componentes de la formulación, tales como Tween 80 y/o bicarbonato de sodio, adaptándose la combinación y la cantidad efectiva de cada componente para una aplicación particular, para minimizar la toxicidad mientras que mantenga o incremente el efecto antipatogénico de la formulación. La cantidad efectiva de cada componente se puede determinar variando sistemáticamente la cantidad de ese componente en una formulación de prueba, tratando un cultivo de interés con la formulación de prueba, y supervisando los niveles de micotoxina en la planta huésped o en el producto de planta antes y después de la cosecha, y después de un período de almacenamiento. Una cantidad efectiva de un componente de prueba se puede identificar como la cantidad que controla la micotoxina residual presente en el producto de planta en un nivel aceptable para el cultivo particular de interés. Para aplicaciones en donde la formulación se vaya a utilizar para preparar la tierra u otro sustrato del suelo para plantar plantas huéspedes susceptibles a patógenos particulares, para aplicar a un sustrato en crecimiento ya infestado, o al material cosechado, las formulaciones de la presente invención se pueden agregar directamente a la rizoesfera, al sustrato, o al material cosechado, o se pueden fijar a un eoporte eólido o se pueden encapsular en un material de liberación en tiempo. Cuando se utiliza un portador sólido, se deben evitar los materiales que puedan conducir a oxidación de los aldehidos activos. Los ejemplos de los sietemae de aplicación incluyen almidón-dextrano, y eimilares. Ver Yuan y colaboradores, Fundamental and Applied Toxicology (1993) 20: 83-87, para los ejemplos de los eistemas de aplicación. Ver también Kawada y colaboradores (1994) 10: 385-389. En adición a los compuestoe específicos de las fórmulas (1), (2), (3), (4), y (5), y opcionalmente saponina, como se estipuló anteriormente, se considera que loe derivados de cualquiera de estos compuestoe que produzcan un compuesto de la fórmula identificada anteriormente sobre la acción de un sistema biológico sobre el derivado, son equivalentes a loe compuestos de la invención. Por consiguiente, la aplicación de compuestos precursores a partee o tejidoe de plantas o materiales cosechados, sería equivalente a la práctica de la presente invención. La conversión biológica de los compuestos precursores en aldehidos aromáticos se describe, por ejemplo, en la Solicitud de Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,149,715, y en las referenciae citadae en la misma. Ver también Casey y Dobb, Enzyme Microb. Techol .
(1992) 14: 739-747. Los ejemplos de los compuestoe precureores incluyen aquellos en las trayectorias relacionadas con reeietencia adquirida y/o eistémica a la resietencia de la planta y a loe patógenoe de la planta, talee como aquelloe en lae trayectorias de liasa de amoníaco del aminoácido, e incluyen fenilalanina (para producir ácido cinámico) . Otros compuestoe precureores de interés incluyen aquellos en lae trayectoriae biológicas para las ligninas y las cumarinae, por ejemplo tiroeina para producir ácido p-cumárico. De conformidad con lo anterior, los precursores derivados de eetoe compueetoe que produzcan una formulación que tenga el efecto antipatogénico y reductor de toxina deseado, se coneideran equivalentee de la invención. Dependiendo del organiemo objetivo, el aldehido que se vaya a utilizar ee puede acoplar a un soporte sólido, opcionalmente a través de un enlazador, tal como un dominio de fijación derivado de una polisacaridaea, en donde el eoporte sólido sea un polisacárido tal como celulosa, particularmente celulosa microcristalina. La preparación de los dominios de fijación de celulosa se describe en las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,340,731; 5,202,247 y 5,166,317. Los aldehídoe se pueden acoplar a los dominios de fijación, con o sin un enlace disociable, empleando métodos bien conocidos por los expertos en este campo. También se pueden utilizar los dominios de fijación de proteínas de plataforma. Ver Shoseyen y colaboradores (Solicitud del TCP Número PCT/0594/04132) . Se pueden utilizar otros compuestos solos o en combinación con las composiciones para prevenir la acumulación de toxinas, y/o para aniquilar o desplazar uno o más microorganismoe productores de toxinas, por ejemplo H202, que ee eabe que aniquila hongoe particulares, tales como el hongo de la putrefacción blanca. Adicionalmente, para utilizarse antes de la cosecha, se pueden utilizar compueetos que induzcan una resistencia de la planta no sietémica o eietémica a diferentee hongoe para controlar la colonización de ciertos hongos bajo condiciones de campo. Cuando un material de planta está muy contaminado con la toxina microbiana, por ejemplo, loe materiales de planta desechables o para abono, el material se puede tratar adicionalmente con una cantidad efectiva de un peróxido alcalino o producto químico similar que destruya o neutralice la toxina presente en el material . Se puede emplear un proceso mecánico por separado o en combinación con el producto químico para promover el proceso de destoxificación. Los ejemplos de los métodos de destoxificación mecánicos incluyen cualquier medio que se pueda utilizar para eeparar la toxina del material, u otroe elementoe que destruyan la toxina, tales como exposición a un alto calor y presión. Si ee anticipa que un material puede llegar a contaminarse con la toxina, o si se determina que el nivel de una toxina microbiana en un material contaminado hace que el material sea inadecuado para un consumo seguro, el nivel de la toxina se puede controlar o reducir mediante el tratamiento del material, de tal manera que se reduzca el nivel de la toxina hasta un nivel seguro para su consumo. Más particularmente, para reducir o contrarrestar la toxicidad de los materiales contaminados con toxina microbiana, se puede agregar una cantidad efectiva de una o más sustancias a un producto para contrarrestar o impedir la actividad tóxica de la toxina. Las sustancias efectivas incluyen aquellas que contienen tioles o aminoácidos del grupo sulfhidrilo, y aminoácidos de azufre, por ejemplo cisteína, metionina, y sus derivados. Una fuente preferida de estos aminoácidos puede eer la pluma de pollo, pelo, pielee, peeuñae, y otros productos animales de queratina que se hayan tratado para liberar los aminoácidos asociados con ellos. Este tratamiento incluye la solubilización de los sustratos de queratina en un medio ambiente de peróxido de hidrógeno alcalino (por ejemplo NaOH + H202) . En una modalidad preferida, la concentración de peróxido alcalino es de aproximadamente el 0.5 al 2.5 por ciento, pero puede ser máe alta o máe baja según sea apropiado. Más preferiblemente, la concentración del peróxido alcalino es del alrededor del 1 al 2 por ciento. La adición de aminoácidos de azufre a los alimentos y a la alimentación contrarresta la presencia de micotoxinas, reduciendo de esta manera el riesgo para la salud potencial asociado con el consumo de estos productos . El método de la presente invención se realiza mediante la introducción, en un organismo patogénico objetivo, de una cantidad euficiente de un agente antipatogénico, para perjudicar el crecimiento y/o la viabilidad del organismo patogénico objetivo. Se introduce una formulación que contenga al agente antipatogénico en un tejido o parte de planta, ya sea antee o deepués de la cosecha. Por ejemplo, la formulación se rocía encima como una formulación húmeda o seca en la superficie y/o en el lado inferior de las hojas o de otro tejido o parte de la planta, de una planta infectada con un patógeno de planta o de una planta susceptible de infestación con un patógeno de planta, de preferencia hasta el punto de escurrimiento cuando se utilice una formulación húmeda. Las plantas ee pueden rociar antes o después de la infeetación, de preferencia antes de la infestación. Sin embargo, con el objeto de minimizar el daño a la planta huésped, en donde sea factible, es preferible tratar las plantas más viejas, ya que las hojas verdes jóvenes tienden a ser más sueceptibles a la fitotoxicidad. Opcionalmente se utiliza un promotor del crecimiento de la planta, tal como saponina, antes de la cosecha, ya eea en la formulación antipatogénica o como una formulación separada. De una manera alternativa, la formulación se puede aplicar húmeda o seca a la rizoesfera, en donde pueda hacer contacto con las raíces y los organismos patogénicos asociados que colonizan las raíces. En algunas instanciae, pueden encontrar ueo lae formulaciones de liberación en tiempo, particularmente para las aplicaciones a la rizoesfera, o a los materiales después de la cosecha. El método para introducir los ingredientes activos de la formulación en el organismos objetivo, puede ser mediante ingestión directa por el organismo patogénico deede una euperficie de planta tratada, o mediante la alimentación de un organiemo patogénico en una superficie que proporcione nutrientes de una entidad huéeped, que ee colonice por el organismo patogénico objetivo, cuyo huésped contenga o tenga en eu euperficie al agente antipatogénico. La preeencia del agente antipatogénico sobre una euperficie que proporcione nutriente de una planta huéeped, puede eer un resultado del contacto directo del agente antipatogénico con la parte de la planta, o puede ser mediante elaboración desde la planta huésped como un resultado de la inducción de la resistencia sistémica como un efecto secundario al tratamiento previo de la planta con el agente antipatogénico, o como un resultado de la modificación genética de la planta huésped. Los aldehidos aromáticoe y alifáticos de la presente invención se pueden preparar mediante diferentee métodos sintéticos conocidos por los expertoe en este campo. Por ejemplo, ver J. March, ed., apéndice B, Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure, 2a edición, McGraw-Hill, Nueva York, 1977. El aldehido cinámico se puede preparar sintéticamente, por ejemplo, mediante la oxidación de alcohol cinamílico (Traynelis y colaboradoree, J. Am. Chem. Soc . (1964) 86:298) o mediante condeneación de estireno con anilina formilmetílica (Patente Británica Número 504,125). Loe preeentee aldehidos también se pueden obtener mediante aislamiento de fuentes naturales. Por ejemplo, el aldehido cinámico se puede aislar de hongo de putrefacción de madera, Stereujn subpilea tum . Birkinshaw y colaboradoree, Biochem . J. (1957) 66:188. El HCA ee puede sintetizar como se describe, por ejemplo, en la USPN 5,055,621. A una escala de laboratorio, el HCA se puede sintetizar mediante la reacción de aldehido bencénico con octanal bajo una atmósfera de nitrógeno (condensación de aldol) (Comunicación Personal, Eric Walborsky, Firmenich Chemical Manufacturing Center, • Port Newark, Nueva Jersey) . La reacción se conduce en un matraz agitado cargado con metanol, 309 ppm de amina difenílica, hidróxido de potasio, y aldehido bencénico. En seguida de la adición lenta de octanal, la mezcla de reacción se lleva hasta un pH de 7.5 a 9.5 con ácido acético. En seguida de la evaporación del metanol y de lavar la mezcla de reacción con agua, la fase orgánica se transfiere a una unidad de destilación. Se remueve de aproximadamente el 20 al 24 por ciento de la carga del recipiente como aldehido bencénico y los "ligeroe", conetituyendo el destilado restante el "corte del corazón" del aldehido alfa-hexil-cinámico. El "corte del corazón" se somete a un fraccionamiento adicional, en donde ee puede remover del 1 al 5 por ciento (en peeo) en fracciones "ligeras", dependiendo de la evaluación del olor. El proceso comercial difiere del procedimiento a escala de laboratorio en que la amina difenílica ha sido reemplazada por un catalizador propietario . El producto final es un aceite amarillo claro que tiene una gravedad específica de 0.955 a 0.965 a 20°C, un índice de refracción de 1.548 a 1.562 a 20°C, un punto de ebullición de 305°C a una atmósfera, y un punto de fusión de 26°C. El producto comercial ee eetabiliza con la adición del 0.04 por ciento de 2, 6-di-butilo terciario-p-cresol
(hidroxitolueno butilado o BHT) , que sirve como un antioxidante (Hoja de Información Técnica, aldehido hexil-cinámico 907600, Revisión 853, Firmenich Inc., Plainsboro, Nueva Jersey) . El HCA también se puede aislar del arroz, en donde se ha reportado que se presenta naturalmente .
(Givaudan-Roure Index, Givaudan-Roure Corporation, Clifton,
Nueva Jersey, 1994, página 89) . El HCA es un compuesto de baja a moderada volatilidad, que tiene una presión de vapor de 70 x 10"5 mm Hg a 25°C. Su compuesto padre, el aldehido cinámico, tiene una presión de vapor aproximadamente 40 veces más alta (2970 x 10"5 mm. Hg a 25°C) . Para propósitos de comparación, el repelente de insectos N,N-dietil-m-toluamina tiene una presión de vapor ligeramente más alta (167 x 10"5 mm. Hg a 25°C) (Reifenrath, W.G. (1995) Volatile Substances . Cosmetics and Toiletries, 110: 85-93) . Se pueden producir uno o más componentes de las presentee formulaciones en la planta de interés modulando la expresión de uno o más genee que codifiquen una o más enzimas, o una trayectoria enzimática o grupo requerido para controlar el nivel del compuesto de interés en la planta, en la parte de la planta, en la célula de la planta, en el tejido específico de la planta y/o asociado con una etapa particular de crecimiento de la planta. La enzima puede estar en una trayectoria biosintética o en una trayectoria de degradación, y la regulación será hacia arriba o hacia abajo, respectivamente, para modular la expresión ya sea de un gen endógeno de la planta o de un transgen suministrado exógenamente a la planta. Un gen indígena de la planta es uno que ee nativo para el genoma de la planta huésped. Un gen endógeno de la planta es uno que está presente en el genoma de tipo silvestre de la planta huésped de interés. Puede ser un gen indígena o un gen que esté presente como un resultado de la infección de la planta (por ejemplo, un gen viral) , o que se incorpore de otra manera naturalmente en el genoma de la planta. La planta huésped también se puede modificar mediante elementos recombinantes, o mediante métodoe de cría de plantas tradicionales para introducir uno o más genes exógenos a la planta huéeped que codifiquen o que controlen el nivel del compuesto de interés, y como tales, que estén en la trayectoria sintética para uno o más compueetos de la fórmula (1), (2), (3), (4) ó (5). La modulación de la expresión del gen significa el control de la producción de un producto de gen de interée al nivel de la transcripción, la traslación, y/o la post-traslación. El nivel del compuesto de interés se controla modulando la expreeión de uno o máe genes o transgenes endógenos que codifiquen de una o más genes endógenos o transgenes que codifiquen una o más enzimas requeridae para sintetizar el compuesto de interés.
En la técnica se conocen métodos para modular la expresión genética en plantas. La variación en las condiciones de crecimiento o en la aplicación exógena de compueetos a una planta, puede afectar la expresión genética. Por ejemplo, las formulaciones de la presente invención se pueden utilizar para inducir una resistencia sistémica de la planta a través de la modulación de la expresión genética endógena. Al nivel molecular, la expresión genética depende sustancialmente de las regiones de control de transcripción, traslación, y terminación que regulan la expresión de una región de codificación de gen estructural. Mediante la explotación de las señales de la planta que regulan estas regiones de control, o mediante la manipulación recombinante directa de las regiones de control, se puede modular la expresión de un gen que codifique una enzima requerida para controlar el nivel de aldehidos cinámico, por ejemplo. Para utilizarse en un transgen suministrado exógenamente a una planta huésped, el tranegen incluirá regionee de control que se seleccionan y se dieeñan para alcanzar el nivel deseado y el tiempo de la expresión genética. Según sea apropiado, las regionee de control pueden eer homologas (nativas) o no homologas (no nativas) para el gen de interée. "Homólogo" significa que las regiones de control son eustancialmente similares a una región de control normalmente asociada con el gen de interés. "No homólogo" significa que las regionee de control se originan de una fuente o secuencia de nucleótidos diferente, o son sustancialmente diferentes de las regiones de control normalmente asociadas con el gen de interés . Por ejemplo, si la secuencia de codificación de la enzima es no homologa en la fuente, comparándose con las regiones de control, con el objeto de tener la expresión del gen en una célula de planta de interés, se deben proporcionar regiones o promotores reguladores de iniciación de transcripción y de traslación funcionales en estas células de planta, operablemente enlazados con la secuencia de codificación. 'Las señalee de iniciación de tranecripción y traslación funcionales en célulae de planta incluyen aquellae de loe genee que están presentee en la planta huésped y en otras especiee de planta, y dirigen la expresión constitutiva o selectiva en una planta huésped. Son de un interés particular las regiones de control de gen que regulan selectivamente la expresión genética estructural en una planta, en una parte de planta, en una célula de planta, en un tejido específico de planta y/o asociadas con una etapa particular de crecimiento de la planta. Se prefieren las regiones de control que son conocidas en este campo, y en particular, las regiones o promotores de control de transcripción que se pueden utilizar para modular la expresión de un gen que codifique un enzima requerida para controlar el nivel de un componente de la fórmula (1), (2), (3), (4), (5), y/o de saponina en una planta, en una parte de planta, en una célula de planta, o en un tejido eepecífíco de planta, y/o que están asociadoe con una etapa particular del crecimiento de la planta. Por ejemplo, los promotores que proporcionan patrones de expresión diferenciales en la fruta se describen en lae Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números USPN 4,943,674 y USPN 5,175,095; en la semillas en la Patente de los Eetadoe Unidoe de Norteamérica Número USPN 5,315,001; en los tejidos que ee desarrollan rápidamente y sacan vastagos en la Patente de loe Eetadoe Unidos de Norteamérica Número USPN 5,177,011. Un método preferido para producir un componente deseado de las presentes formulaciones en una planta huésped, es a través de elementos de ADN recombinante, particularmente mediante la modificación del nivel de cuando menos un compuesto de interés de la fórmula (1), (2), (3), (4), (5) y/o de saponina en tejidos de planta de interés, a través de la conetrucción de plantae tranegénicae, empleando técnicae recombinantee conocidae en eete campo. Loe métodoe involucran traneformar una célula de planta de interée con un caeete de expreeión funcional en una célula de planta que comprenda, como componentee operablemente enlazadoe en la dirección de tranecripción 5' a 3', una región reguladora de iniciación de tranecripción y de traslación, unida en el marco de lectura 5' con una secuencia de ADN que codifique una o máe enzimae capaces de modular la producción y/o requeridas para producir el compuesto de interés, y regiones de terminación de traslación y de transcripción. La expresión de una enzima requerida para producir el compuesto de interés proporciona un incremento en la producción del compuesto como un resultado de las concentraciones alteradas de las enzimas involucradas en la biosíntesie de los compuestos. Es de un interée particular el control selectivo de la producción de saponina, aldehidos cinámico y/o de coniferilo en tejidos de plantas, tales como hojas, raíces, frutae y eemillae. Para la biosíntesis de aldehidos cinámico en un tejido de interés, las célulae de planta se transforman con un cásete de expresión que comprende ADN que codifica un gen estructural para una o más enzimae requeridae para eintetizar aldehido cinámico, y capaces de incrementar la cantidad de aldehido cinámico en el tejido de interés. De una manera similar, para el control selectivo de la biosíntesis de saponina en un tejido de interés, las células de planta se transforman con un cásete de expresión que comprende ADN que codifica un gen estructural para una o más enzimas requeridas para sintetizar saponina, y capacee de incrementar la cantidad de eetos compuestos en el tejido de interés. Son de un interée particular loe genee que codifican una o máe enzimas capaces de metabolizar un compuesto precursor requerido para la biosínteeis del compuesto de interés de saponina, aldehidos cinámico y/o de coniferilo, a partir de sustratos normalmente encontrados en una célula de planta. De una manera más particular, ee la expreeión transgénica de cuando menos un compuesto de la fórmula (1), (2), (3), (4), (5), y una saponina. Se preparan construcciones de ADN para expresar un gen de interés, que proporcionan la integración del cásete de expresión en el genoma de una planta huésped. La integración se puede realizar utilizando sistemas de transformación conocidos en la técnica, tales como Agrobacterium, electroincorporación o transformación mediada por micropartículas de alta velocidad. Dependiendo de la aplicación, la saponina o uno de los otros compueetoe de interés, se puede expresar de preferencia en un tejido de interés y/o en un organelo particular. La eepecificidad del tejido se realiza mediante el uso de regionee reguladorae de tranecripción que tengan el perfil de expreeión deseado. La translocación de la enzima a un organelo particular se realiza mediante la utilización de un péptido de translocación apropiado. Loe métodos para la expresión específica en el tejido y el organelo de las construcciones de ADN ya se han descrito y se conocen en la técnica. Para verificar la regulación y la expresión del gen de interés, existen diferentes técnicas para determinar si las secuencias de ADN deseadas presentes en la célula de planta están integradae en el genoma y se están tranecribiendo. Se pueden emplear técnicas tales como la mancha Northern para detectar el ARN mensajero que codifica para la enzima deseada. La expresión se puede detectar adicionalmente ensayando la actividad enzimática, o mediante un inmunoensayo para el producto de proteína. Más preferiblemente, el nivel del compuesto de interés preeente en una planta huéeped se mide utilizando métodos conocidos en este campo. Por ejemplo, un fenotipo deseado es un contenido incrementado de saponina y/o aldehido aromático en un tejido de planta de interés, medido por la expresión del gen de interés y/o el nivel de saponina presente en la planta huésped, comparándose con una planta de control . Para la introducción de uno o más compuestos de las preeentee formulacionee al organismo objetivo, una planta huésped que exprese un gen que codifique una enzima requerida para controlar el nivel del compuesto de interés, da como resultado la exposición de un organiemo objetivo a cuando menos un componente de la formulación antipatogénica. En otra modalidad, la expresión selectiva del gen de interés induce resistencia sistémica de la planta huésped al ataque del patógeno o a la colonización. Se puede expresar cuando menos un componente de la formulación antipatogénica mediante la planta huésped, y opcionalmente se aplican exógenamente otros componentes de la formulación antipatogénica a la planta huéeped, de tal manera que la combinación provoque el efecto antipatogénico deseado cuando se introduzca directa o indirectamente en el organismo objetivo. Las plantas transgénicas que tienen una mayor capacidad para acumular aldehidos aromáticos, talee como aldehidos cinámico y aldehido de coniferilo, para proporcionar una auto-protección contra la planta, o para utilizarse como una fuente natural de aldehidos aromáticos para la extracción y uso subeecuente como un plaguicida químico, se pueden preparar como sigue: La acumulación de aldehidos aromáticos se puede lograr regulando hacia abajo la expresión de los genee eepecíficoe de la planta que codifiquen las enzimas con las que provoquen otro metabolismo de los aldehidos deseados, o desvíen los intermediarios metabólicos de los aldehidos deseados. En el caso del aldehido cinámico, por ejemplo, eeto involucra regular hacia abajo la expreeión de la 4-hidroxilaea de cinamato (CA4H) y de la deehidrogenaea de alcohol cinámico
(CAD) . La CA4H deevía ordinariamente algo de ácido cinámico alejándoee del aldehido cinámico para producir ácido p-cumárico, él miemo un intermediario metabólico. La reducción de la actividad de la CA4H eolamente no es suficiente para provocar la acumulación de aldehido cinámico, debido a que la CAD puede convertir rápidamente el aldehido cinámico en alcohol cinamílico, el cual entonces llega a incorporarse en la lignina, o se acumula como glucósidos. La reducción simultánea de las actividades de CA4H y CAD, da un flujo metabólico incrementado desde el ácido cinámico hasta el aldehido cinámico, y una conversión disminuida del aldehido cinámico en alcohol cinamílico. Algo del aldehido cinámico llega a incorporarse en la lignina, pero también se acumula el aldehido cinámico (ya sea libre o como glucósidos) hasta niveles arriba de los normal, particularmente en los tiempoe en que ee eleva la biosíntesie de ácido cinámico. Esto ocurre cuando el nivel de actividad de liasa de amoníaco de fenilalanina (PAL; el primer paeo limitante de la velocidad en el metaboliemo de fenilpropanoide general, Hahlbrock y Scheel, (1989) Annu. .Rev. Plant . Physiol . Plant Mol . Biol . 40:347-369) ee alto, una situación que se presenta naturalmente en las plantas en respuesta a un amplio rango de estímulos, incluyendo la invasión por patógenos fúngales y el daño mecánico asociado con las heridas y la alimentación de los ineectoe . Se ha propuesto la inhibición de la actividad de CAD en las plantas transgénicae como un método para reducir la eínteeie de lignina en las plantas, y de esta manera mejorar la digestibilidad de loe cultivos para forraje (WO 93/05159) . Estos experimentos sugirieron que la bioeínteeis de lignina había sido alterada de una manera cualitativa, pero no necesariamente cuantitativa, pero no demostraron ni apreciaron la deseabilidad de acumular aldehido cinámico como un método para incrementar la protección contra los patógenos. Se clonaron un número de genes de CA4H y CAD de plantas, y sue eecuenciae están disponibles en GenBank. Las porciones de eetos genes que incluyen secuencias de nucleótidos que ee coneervan entre diferentee eepeciee de plantae, ee pueden utilizar directamente en un vector de expreeión de planta (orientación anti-sentido o en sentido) para suprimir la expresión de los genes endógenos correepondientee (por ejemplo, Pear y colaboradoree, Antisense Res . and Develop. (1993) 3:181-190, Napoli y colaboradoree, The Plant Cell (1990) 2:279-289). Más preferiblemente, estas secuencias genéticas conservadas se utilizan para aislar los clones de ADNc de CA4H y CAD a partir de una genoteca de ADNc de la especie de planta que se vaya a modificar. Los clones de ADNc reeultantes, o las porciones de los mismoe, se introducen entonces en un vector de expreeión de planta (anti-eentido o en sentido) , y se utiliza para transformar las plantas de interés . Lae conetrucciones de ADN de acuerdo con la invención de preferencia comprenden una secuencia de cuando menos 50 bases, que sea homologa a los genee endógenos de CA4H ó CAD. Se puede producir una molécula de ADN recombinante enlazando operativamente un vector con un segmento de ADN útil para formar un plásmido que se pueda utilizar para la transformación de la planta. Un vector capaz de dirigir la expresión de ARN desde una porción clonada de un gen, es referido en la presente como un "vector de expresión" . Estos vectores de expresión contienen elementos de control de expresión, incluyendo un promotor. Los vectores típicos útiles para la expresión de genes en plantae superiores son bien conocidos en la técnica, e incluyen vectores derivadoe a partir del plásmido Ti Agrobacterium tumefaciens, deecrito por Rogers y colaboradores, Methods in Enzymology (1987) 153:253-277. Un promotor común que se utiliza para proporcionar una fuerte expresión constitutiva de un gen introducido, es el promotor 35S del virus de mosaico de coliflor (CaMV)
(disponible en Pharmacia, Piscataway, NJ) . Se pueden utilizar promotores constitutivos (tales como el CaMV 35S) , o promotoree inducibles o regulados por el desarrollo (tales como el promotor a partir de un gen PAL, o los genes endógenos de CA4H o CAD) . El uso de un promotor constitutivo tenderá a afectar las funciones en todas lae partes de la planta, mientras que el uso de un promotor inducible o regulado por el desarrollo tiene la ventaja de que el ARN anti-sentido o en sentido eolamente se produce en el tejido y bajo las condiciones requeridae. El uso de promotores reguladoe por el deearrollo se prefiere en el uso de esta invención, debido a que se sabe que la regulación hacia abajo de la biosíntesis de fenilpropanoide puede producir efectos secundarios indeseables sobre el desarrollo de las plantas transgénicas que contengan un gen PAL heterólogo (Elkind y colaboradores, (1990) Proc. Nat . Acad. Sci . 87:9057-9061). Existen un número de diferentes métodos de transformación disponibles para la transformación de rutina de un amplio rango de especies de plantas. Un método que es particularmente eficiente para la transferencia del ADN hacia las plantas dicotiledóneae, involucra el uso de Agrobacteri um . En eete método, el gen de interée ee ineerta entre los límites de la región del ADN-T que se han empalmado en un pequeño plásmido recombinante con un gen marcador seleccionable (por ejemplo, que codifica fosfotransferasa de neomicina II ó acetiltransferasa de foefinotricina) . Luego ee introduce el pláemido recombinante en un huéeped de Agrobacterium, mediante acoplamiento de transformación o triparental . La cepa de
Agrrojacterium que lleva los genes de interés, se utiliza entonces para transformar el tejido de la planta, mediante el cocultivo de la bacteria con un tejido de planta apropiado
(por ejemplo, disco de hoja) . Las células transformadas se seleccionan en el cultivo de tejido utilizando el agente de selección apropiado, y luego se regeneran las plantas (ver Horsch y colaboradores (1985) Science 227:1229-1231). Otros métodos que se han utilizado en la transformación de células de plantas, y en particular las plantas de cultivo más recalcitrantes, incluyen biolística y electroincorporación (para los protocolos detallados, ver Sanford y colaboradores , (1993) Methods in Enzymology 217:483-509; y Potter, (1993) Methods in Enzymology 217:461-478) . Una vez que se han producido las plantas transgénicae, se emplean ensayos enzimáticos convencionales para CA4H y CAD, para determinar el nivel de supresión de la actividad enzimática lograda en diferentes transformantes. Es posible que solamente una pequeña fracción de los transformantes producidos tenga una actividad enzimática residual suficientemente baja para provocar la acumulación de aldehidos aromáticos sin producir también algunoe efectos secundarios indeseablee eobre el desarrollo de la planta. Por esta razón, un método preferido para producir los transformantes deseadoe con CA4H y CAD euprimida, ee introducir los dos genee por eeparado en transformantes diferentes, y luego combinarlos mediante cruzas sexuales convencionales . Esto permite que se evalúen un mayor número de combinaciones del nivel de supresión genética al mismo tiempo. Una alternativa a la eobreproducción de aldehídoe aromáticos en plantas tranegénicae, es utilizar los genee de la planta para conferir en huésped microbiano la capacidad de sintetizar aldehidos aromáticos eepecíficoe y/o eaponinas. Los microbios resultantes se pueden utilizar ya sea para producir los aldehidos aromáticos en un sietema de fermentación, o como un sistema de aplicación natural de los aldehidos aromáticos en preparaciones microbianae viablee o no viables. Las levaduras, especialmente Sachoromyces cerevisiae, son organismos preferidos para este propósito, debido a que ya se han diseñado para la expresión de alto nivel de PAL (Faulkener y colaboradores (1994) Gene 143:13020), y se ha demostrado que una 4-hidroxilasa de cinamato de planta funciona en la levadura (Urban y colaboradores (1994) Eur. J. Biochem 222:843-850). La expresión de PAL introduce la capacidad para producir ácido cinámico a partir de fenilalanina. Se requieren doe pasos enzimáticos adicionales para producir aldehido cinámico a partir de fenilalanina. En las plantas, eetos pasos son catalizados por las enzimae cinamato :ligaea de CoA (CL) , y cinamoílo:reductasa de CoA (CCoAR) , pero ya que la 4-cumarato: ligasa de CoA (4CL) también puede utilizar ácido cinámico como sustancia (Knobloch, y Hahlbrock (1977) Arch . Biochem. Biophys . , 184:237-248), la 4CL se puede utilizar en lugar de la CL. Se han descrito con euficiente detalle (GenBank) máe de 20 genes PAL clonados y más de 6 genes de 4CL, para facilitar su uso en la práctica de la presente invención. Un gen para una CCoAR se obtiene mediante la aplicación de técnicas de clonación genética convencionales para aislar un clon de ADNc utilizando como sonda la secuencia derivada de la eecuencia de aminoácidoe del término N, o fragmentos de péptido, de la proteína purificada. La CCoAR se ha purificado y se ha caracterizado parcialmente a partir de cultivos de frijol de soya (Wengenmayer y colaboradores (1976)
Eur. J. Biochem. , 65:529-536; Luderitz y Grisebach (1981) Eur. J. Biochem . 119:115-124), de savia cambial de picea (Luderitz y Grisebach, supra) , de xilema de álamo (Sarni y colaboradores
(1984) Eur. J. Biochem. 139:259-265), y de xilema diferenciador de Eucalyptus gunnii (Goffner y colaboradores
(1994) Plant Physiol . 106:625-632). El método preferido de purificación es aquel de Goffner y colaboradores (supra) , debido a que da como resultado una sola banda de proteína en los geles de SDS-amida poliacrílica que se pueden utilizar para el secuenciamiento de la proteína. Los genes clonados se introducen en vectores de expresión convencionales, y se utilizan para transformar un huésped microbiano, de preferencia levadura, mediante técnicas de transformación convencionales, tales como electroincorporación (Becker y Guárante (1991) Methods in Enzy ol 194:182-187). Se emplean ensayos enzimáticos convencionales para confirmar la expresión funcional de los genes dieeñados, y se utilizan ensayoe para aldehidos aromáticos con el fin de eeleccionar cepas una máxima producción. Debido a que los aldehídoe aromáticoe tienen propiedades antimicrobianas, se prefiere utilizar vectoree de expresión que provoquen la expresión de los genes introducidos solamente tarde en el ciclo de crecimiento, o en respuesta a un inductor químico. También puede ser deseable cultivar el huésped microbiano diseñado en un reactor de células enteras inmovilizadas (por ejemplo, Evans y colaboradores (1987) Biotechnology and Bioengineering 30:1067-1072) para impedir que los aldehidos se acumulen en el medio de. cultivo. El material en donde se pueda controlar el nivel de micotoxina puede ser consumible o no consumible, y de preferencia es una planta o de origen de planta, aunque ee puede tratar cualquier otro material contaminado con hongoe que produzcan toxinas microbianas o que pueda se colonizado por, o que soporte el crecimiento de los microorganiemoe productores de toxinas. Son de un interés particular loe cultivoe pretendidoe para ser consumidos por aves de corral, peces y animalee, incluyendo eeres humanos, directa o indirectamente, "directa o indirectamente" significa que los cultivos podrían ser ingeridoe, por ejemplo, por eeres humanos (consumo directo) , o que es animal no humano o el ave de corral o el pez el que ingiere el cultivo y a su vez es ingerido por seree humanos (consumo indirecto) . Los cultivos pretendidos para consumo incluyen tabaco, forraje para animales y aves de corral, cultivos pretendidoe para procesarse en alcohol o en productos alimenticios talee como jarabe de maíz, y similares. Las plantas y los materiales de plantas colonizados por hongos productores de toxinas incluyen, por ejemplo, cebada y otros pastos, arroz, maíz, trigo, avena, lúpulos, casava, frijoles, papa, cacahuates, papa dulce, tomate, caña de azúcar, coco, cítricos, uvas, sorgo, melones, pepino, lechuga, espinaca, alcachofa, cebolla, tomate, fresa, y tabaco. El nivel de micotoxina también se puede controlar en los productoe derivadoe de materialee de plantas, tales como jugos procesados, productos de maíz tales como jarabe de maíz alto en fructuosa, aceite, harina, almidón, alcohol, y productos que contengan a eetos y a otroe ingredientee derivados de maíz, y productos de tabaco tales como puroe, cigarrilloe, y tabaco sin humo, mediante la inhibición o la prevención del crecimiento de los hongos productores de toxina en los materiales a partir de los cuales se producen estos artículos, ya sea antes o después de la cosecha. De una manera similar, los niveles de toxina microbiana también se pueden controlar en los pastoe para forraje, tales como paja, pasto doblado, alfalfa, trébol, y pastos de turba, y en alimentos para animalee comercialmente preparados, incluyendo aquellos para ganado, ovejas, cerdos, y caballos,- aves de corral tales como pavoe y pollos,- peces talee como trucha, pez gato, y salmón,- alimentos para mascotae doméeticas incluyendo alimentoe para perroe y gatos,- y alimentos para animales de laboratorio, mediante el tratamiento antes o después de la cosecha de los materiales mismos o de los materiales precursores . En adición a tratar una planta huésped, también se pueden tratar las semillae pretendidae para su consumo utilizando las presentes formulaciones. Las semillas se pueden empolvar con una preparación en polvo (ver la Solicitud de Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,978,686 para los ejemploe de los materiales inorgánicos en los que se pueden adsorber las formulaciones) . La invención proporciona además diferentes microorganismoe "destoxificadores" que se pueden utilizar para controlar el crecimiento de los microorganismos productores de toxinas, o que se pueden utilizar para destoxificar los metabolitoe tóxicos presentes en un material. Por ejemplo, el crecimiento fungal se pueden controlar mediante la inoculación del material, tal como una planta o producto de planta, con una o más especies de bacterias que reduzcan el crecimiento de las bacterias productoras de toxina y/u hongos . También ee pueden utilizar otros microorganismos para inocularse que degraden o conviertan una toxina en una forma menos tóxica o no tóxica. Los ejemploe de loe microorganiemos adecuados para inoculación incluyen Bacill us megateriu , B . lichenformis, B . subtilis, Cryptococcoses . Por supueeto se pueden utilizar otras bacterias destoxificadoras para lograr esencialmente el mismo resultado. Por ejemplo, se pueden identificar otras bacterias destoxificadorae empleando métodos de rastreo convencionales, en donde una bacteria productora de toxina y/o un hongo se cocultive con una o más bacterias diferentes para rastrearse por su actividad destoxificadora. Las composiciones antifungales anteriormente descritas también se pueden utilizar por separado o en conjunto con éstas y otras bacterias. Los organismos patogénicos objetivos incluyen hongos que colonizan una superficie de una parte de una planta que eea una provocadora del hongo. Provocadora significa que la planta proporciona los nutrientes requeridos por el hongo. Son de un interés particular los hongos que producen fumonieinas y ácido fusárico, y sus análogos estructurales. Con el objeto de determinar la susceptibilidad de hongos particulares a las composiciones reivindicadas, ee pueden emplear pruebas in vi tro e in vivo, talee como se describen en los Ejemplo, y se puede calcular el cambio en la velocidad de infestación (antes y después del tratamiento) como el MPDC (porcentaje promedio de control de la enfermedad) . La invención proporciona además métodos y composiciones para la identificación y cuantificación de diferentes toxinas microbianae y microorganismos productores de toxinas preeentee en una mueetra bajo condiciones de campo, y/o el material obtenido del campo, y/o los materiales derivados del mismo. Más preferiblemente, los ensayos se utilizan para probar una variedad de plantas y productos agrícolas derivados de las mismas, incluyendo materiales alimenticios y alimento para animales. Si un material está contaminado con niveles inaceptables de toxina, dependiendo del nivel de contaminación y de la toxicidad de la toxina microbiana detectada, la muestra se puede desechar y/o destoxificar. Las mueetras para ser evaluadas se pueden recolectar y preparar empleando técnicas convencionales conocidas en este campo, que sean adecuadas para un eneayo dado. En particular, la invención proporciona ensayos que se pueden utilizar para determinar el nivel de contaminación con toxina microbiana en una muestra, mediante el ensayo por la presencia o la ausencia de uno o más hongos productores de toxina y/o bacterias que puedan colonizar un material de interés. De preferencia, el ensayo se utiliza para detectar microorganismos que produzcan metabolitos tóxicos y particularmente hongos y bacterias que produzcan metabolitos secundarioe que sean tóxicos para las plantae y/o para loe animalee. Los Ejemplos de los hongoe incluyen aquellos de los géneros Ceratucystis, Fusicoccum, Helminthosporium,
Rhynochosporium y Stemphyllium y más preferiblemente aquellos de los géneroe Aspergillus, Al ternaría, Fusari um, y Penicillium . Loe Ejemplos de las bacterias incluyen
Corynejbacte ium, Erwinia, Pseudomonas y Xanthomonae . El ensayo también se puede utilizar para detectar la presencia o la ausencia de uno o más microorganismos no productores de toxinae, que indiquen la presencia o la ausencia de uno o más microorganismoe productoree de toxinae. Los ejemplos de los microorganismoe o bacteriae no productores de toxinas adecuados para utilizarse en el ensayo incluyen Bacillus megaterium, Bacillus lichenformis, Bacillus subtilis, y Cryptococcoses . Los eneayoe utilizados para identificar microorganismos son conocidos en este campo. Estos métodos incluyen el uso de técnicas de cromatografía y subconjuntoe de lae mie ae que empleen métodos de identificación de lípidoe, proteínae, y/o ácidos nucleicos. Por ejemplo, se pueden utilizar las técnicas de la tecnología de ADN recombinantes que emplean la reacción de cadena de polimerasa y/o eondas detectables . Las sondae de ácido nucleico, de anticuerpo, y/o químicas se pueden utilizar, por ejemplo, para detectar directa o indirectamente uno o más microorganismoe de interée . Otroe métodoe incluyen evaluación con microscopio y fenotípica de la planta o del material probado. También se pueden emplear técnicas de rastreo microbiológico. Por ejemplo, se pueden emplear ensayos que se apoyen en el cultivo del microorganismo, en donde ciertoe microorganiemoe de prueba puedan reeponder de una manera detectable a la presencia o a la aueencia de uno o más microorganismoe objetivos. En otra modalidad, se proporcionan ensayos para determinar el nivel de contaminación con toxina microbiana, mediante el ensayo por la preeencia o ausencia de una o más toxinas microbianas. De preferencia, el ensayo se utiliza para detectar uno o más metabolitos tóxicos producidos por uno o más microorganismos que puedan colonizar un material de interés . Las toxinas microbianas de interés incluyen toxinas bacterianas y metabolitos tóxicos producidos por hongos. Más particularmente, el ensayo se utiliza para detectar uno o más metabolitos secundarios producidos por hongos que son tóxicos para las plantae y/o para loe animalee. De una manera máe preferible, los ensayos se utilizan para probar por la presencia o por la ausencia de micotoxinas fungalee referidas como aflatoxinas, ácido fusárico, fumonisinae, toxinae de TA/AAL, aflatoxinae, zearalenona, tricoteceno, ácido 5-butilpicolínico, y derivados de piridina fitotóxicos relacionadoe. Los ensayos de la presente invención incluyen el uso de sondae detectablee, por ejemplo, diferentee sondas químicas y de anticuerpos, que reaccionen con la toxina de interée o con algún otro material producido por uno o máe microorganismos productores o no productores de toxina, que indiquen la presencia o la ausencia de la toxina. Las sondas se pueden detectar directa o indirectamente empleando técnicas convencionales. Más preferiblemente, los ensayoe incluyen sondae químicas y/o de anticuerpos detectablee. También se pueden realizar pruebas de sensibilidad microbiana para probar por la presencia o por la ausencia de una o más toxinas microbianas, o no toxinae que indiquen la presencia o la ausencia de una o más toxinas microbianae, utilizando métodoe bien conocidoe en la técnica. Por ejemplo, la sensibilidad de ciertos microorganismoe a la presencia de la toxina microbiana se puede determinar utilizando una prueba Ames estándar. En otra modalidad, la presencia o la ausencia de microorganismos productores de toxinas, o de las toxinas microbianae miemas, se puede ensayar utilizando un animal' de prueba que responda de una manera detectable cuando se exponga a la toxina y/o al microorganismos productor de la toxina. En una modalidad preferida, el animal de prueba se expone a una muestra que contiene diferentee niveles de una o más toxinas microbianas y/o microorganismos productores de toxina. Los animales se pueden exponer al material de toxina como agentes sencillos o en combinaciones. De preferencia se incluyen en la prueba animales de control expuestos a muestrae de placebo. En otra modalidad, ee proporciona un ensayo que se utiliza para probar los efectos tóxicos que llenen una o más toxinas microbianas o microorganismoe productores de toxinas sobre un animal de prueba. En particular, estos métodos se pueden utilizar para evaluar el papel de la toxina en los cánceree eoepechoeoe de preeentaree en parte como un reeultado de la expoeición a la micotoxina, más eepecíficamente loe cánceree oral, del eeófago, y del pulmón. La toxicidad dependerá de factoree tales como el nivel de toxina ingerido por el animal de prueba, el tipo de animal probado, y la duración de un estudio. La toxina o el microorganismos productor de la toxina se puede proporcionar a un animal de prueba en el alimento, en el agua, en el aire, o mediante una exposición medio-ambiental general. La toxicidad y los niveles de tolerancia dependerá del peso del cuerpo y de la madurez del animal . Se espera que la mayoría de estos niveles puedan ser establecidoe con especificidad después de una prueba clínica. Los niveles de exposición de riesgo para diferentes micotoxinas variarán dependiendo del uso de la alimentación, del alimento, o del tabaco. Diferentes animales tienen diferentes tolerancias. También, se puede eeperar que loe efectoe de la toxicidad aparezcan eolamente máe allá de la espectativa de vida del animal o de la persona. Los efectos adversoe del contacto con micotoxinas se minimiza entre los trabajadores del campo, los investigadores, y los animales de prueba. De esta manera, la invención se puede utilizar para mejorar en general los productos agrícolas, de tal manera que eean máe eeguroe para consumo humano, animal, de peces, o de aves de corral . Mediante el control de los niveles de toxina microbiana asociados con plantas y productos derivados de las mismas, se pueden reducir o eliminar los problemas de salud de animales y seree humanoe asociados con el consumo de toxinas. La invención también encuentra uso para reducir los efectos adversos de mascar y fumar tabaco, ya que es una teoría de la invención que muchas enfermedadee relacionadae con el tabaco puedan resultar de la presencia de micotoxinas en loe productoe del tabaco. Por consiguiente, ee puede reducir la toxicidad del tabaco agregando eustancias para reducir la micotoxinae y otroe metabolitos secundarios, en particular mediante el tratamiento del tabaco con suficientes cantidades de una composición inhibidora de patógenos para inhibir la producción del metabolito fungal. De una manera similar, la invención se puede utilizar para disminuir la contaminación con micotoxinas de loe árboles siempreverdee y frutalee, de madera en bruto, uvas, ornamentales, pastos, y la contaminación resultante del injerto de árboles frutales. Además, la prevención de eeta contaminación permite que los materiales alimenticios derivados de plantas o los materiales de los subproductos se desechen de una manera que no libere toxinas, en una forma que pueda eurgir del agua o del aire. Por coneiguiente, la invención ee puede utilizar para aeistir en el desecho seguro de eubproductoe agrícolae, tales como cascaras de arroz, de trigo, y de algodón, y desechos de plantas en general, que con frecuencia se desechan quemándose. Además, el contenido tóxico de los productos hechos a partir de materiales de plantas que se sabe que son colonizados por microorganismos productores de toxinas, se pueden mejorar mediante la determinación del nivel de metabolitos secundarios producidos por eepeciee particularee de hongoe, que colonizan loe materialee antes de la cosecha, por ejemplo, la especie Fusarium, y/o después de la cosecha, por ejemplo, la especie Aspergillus . En particular, los productos de maíz como el jarabe de maíz alto en fructuosa, se pueden mejorar mediante la determinación del nivel de ciertas toxinas producidas por Fusarium, y luego se toman las medidas necesarias para reducir estoe niveles. Los metabolitos secundarios tóxicos identificados de organismos tales como Fusarium spp, también pueden encontrar uso como agentes farmacológicos. Se debe anticipar que, en esta área, el reconocimiento de estructuras químicas previamente no apreciadas, dará un número de eetructurae para inveetigación con respecto a sus propiedades como herbicidas, insecticidas, fungicidas, y agentes farmacológicos, y para investigar los métodos para la producción de las estructuras en cantidades comerciales. Los siguientee ejemplos se ofrecen a manera de ilustración y no a manera de limitación.
EJEMPLOS
Ejemplo 1 Tratamiento de Patógenos Fúngales en Maíz Un experimento de tres tratamientos con una fórmula de aldehido cinámico y componentes, una fórmula de aldehido de coniferilo, y fórmulas combinadas de aldehido cinámico y de coniferilo, se evalúa sobre maíz cultivado en el campo que se sabe que es susceptible a la infestación fungal patogénica. Las plantas se bloquean por variedades antes de los tratamientos fungicidas, y se aleatorizan con respecto a las plantas. Se prueban diferentes variedades susceptibles a la infestación fungal utilizando el siguiente protocolo, el cual evalúa el efecto del aldehido cinámico y/o del aldehido de coniferilo eolo y en combinación con Tween 80 y/o NaHCO . Cada planta recibe una sola pulverización foliar hasta el escurrimiento enseguida de la evaluación de la infección fungal (según Paulus y Neleon (1988) Calif . Agrie. 42:15) . La respuesta variable registrada por cada planta es la evaluación de la infección fungal basada en la escala de evaluación de Paulus/Nelson (supra) . Las plantas se evalúan sobre eeta escala justo antee de, y cuatro días despuée del tratamiento.
Ejemplo 2 Tratamiento de la Enfermedad de Cancro de Resina (Fusarium subcrlutinans)
(a) Prueba in vitro La enfermedad de cancro de resina, provocada por el hongo Fusarium subglutinans f .sp pini, se caracteriza por una exudación resinoea sobre la superficie de los brotes, ramas, raíces expueetas, y troncos de árboles infestados. El huésped y el rango geográfico del patógeno de cancro de resina se ha incrementado mucho desde que se descubrió por primera vez en california en 1986. El patógeno se ha descubierto recientemente en México y en Japón. Fox y colaboradores (1991) Plant Dis . 75:676-682 han propuesto una asociación de escarabajos grabadores { Scolytidae,- especie IPS) como vectoree del Hongo de Cancro de Resina. Se utilizó un bioensayo basado en la inhibición de crecimiento radial de Fusarium subglutinans f sp. pini, para probar diferentes formulaciones de aldehido. El bioensayo se realizó en una forma doble ciega bajo condiciones estériles. Todas las concentraciones dadas son aquellas de las soluciones particulares antes de la dilución en el ágar. Se pasaron por pipeta 8 mililitroe de la formulación de prueba, hacia 200 mililitroe de ágar de dextroea de papa el 2 por ciento fundida (DIFCO) , y la mezcla ee diepereó en 5 platos de petri de pláetico (plato de 25 mililitros) . Se utilizaron las formulaciones de prueba de 5 ppm de benomilo como un control positivo, y H20 estéril como un control negativo. Cada uno de los cuatro platos se inoculó en el centro con un tapón de ágar transferido deede un cultivo de PDA en crecimiento de Fusarium subglutinans f. sp pini (aislado SL-1, UCB) por cada formulación de prueba. Un quinto plato se dejó sin inocular como un control para el crecimiento inhibido. Todos los platos inoculadoe y no inoculados se incubaron a 18°C durante 5 días, después de lo cual se midieron los diámetroe de lae colonias. Los resultados se proporcionan en la siguiente Tabla. Mientras mayor fue la colonia, menos efectiva fue la formulación de prueba. Ningún crecimiento de la colonia (diámetro = 0) indica una máxima inhibición del crecimiento. Loe resultados muestran que las concentraciones de aldehido cinámico en vehículo (con o sin la adición de eaponina) inhibieron el crecimiento radical de Fusarium subgl utinans, así como lo hizo el aldehido glutárico al 2 por ciento. El crecimiento radial se inhibió completamente en 12,500 ppm (ver la Tabla 1) . El incremento en el crecimiento radial visto con la adición de saponina, ee puede deber a lae caracteríeticas promotoras del crecimiento que se han reportado para la saponina.
(b) Tratamiento de Semillas de Pino de Monterrey Se planta semillas de Pino de Monterrey, la mida de las cuales se empolvan con una formulación de almidón-dexta que contiene aldehido cinámico y/o aldehido de coniferilo, de 10 a 1000 ppm, en vermiculita, en donde se ha mezclado una formulación de aldehido cinámico y/o aldehido de coniferilo, de 10 a 1000 ppm. Se agrega un inoculo de Fusarium que provoca la enfermedad de cancro de pino a la vermiculita en el momento en que se plantan las semillas. Se utilizan semillas en vermiculita no tratada como un control.
Ejemplo 3 Tratamiento de Núcleo Rojo de Fresa (Ph?tophthora Fragariae) La enfermedad de núcleo rojo de fresa es provocada por el hongo Phytophthora fragariae Hickman, que se extiende por medio del material de plantación infectado o de la tierra infestada con oosporas de larga vida de desecho infectado. Se prueban diferentes formulaciones que contienen aldehido cinámico y/o aldehido de coniferilo como sigue: las raíces de fresa maceradas infectadas con Phytophthora fragariae, se mezclan completamente con abono infestado, y se dejan descomponerse durante 4 a 6 semanas para producir un inoculo bien podrido para el tratamiento. Este se divide en lotes de 1 kilogramo, y se mezcla con 1500 mililitros de una formulación de prueba en diferentes concentraciones (ver la Tabla 2) . Después de 10 minutos de tratamiento, el abono ee enjuaga bajo agua del grifo corriente sobre un tamiz de 25 milímetros durante un mínimo de 5 minutos para remover 'todas las trazas de la formulación de prueba. El abono se pone entonces en macetas de plástico de 9 centímetros de diámetro, y se plantan con 4 plantas de fresa por maceta. Se utilizan 5 macetas por cada tratamiento. Las plantas se cultivan en una habitación de medio ambiente controlado a 15°C, y con 18 horas de luz del día,- el abono se mantiene húmedo para alentar la infección. Las macetas se ponen sobre rejillas para evitar la infección cruzada entre los tratamientos. Después de 9 semanas, se lavan las raíces de las plantas de fresa para liberarse de abono, y se examinan por los signoe de infección mediante el corte de lae raícee longitudinalmente, y buecando lae estelae rojas, y las raíces podridas o marrones. Todas las infecciones eon confirmadas mediante examen con el microscopio de los pedazoe de raíz por la preeencia de ooeporae de Phytophthora fragariae .
Tabla 1 Efecto de los Aldehidos sobre el Crecimiento Radical de Fusarium xiihcrlutinas f. sp. pini
Todas las formulacionee de aldehido cinámico se forman en Tween 80 al 2 por ciento, NaHC03 al 6 por ciento.
Tabla 2 Protocolo de rahamiPnfn
Tabla 2 (continuación)
Ejemplo 5 Manejo Después de la Cosecha de Fruta Cítrica El propósito de esta experimento es evaluar la actividad conservadora de la fruta cítrica después de la cosecha del aldehido cinámico. Se seleccionan 40 naranjas de California al azar, a partir de un lote de empaque despuée de la eliminación de la fruta dañada por la congelación. Se tratan 20 naranjas de tratamiento en un tanque con jabón y una concentración de la formulación de prueba, luego se lavan y se cepillan con jabón y biocida. Después de 5 minutos, los cítricos tratadoe se enjuagan con agua fresca. Los controles ee lavan eolamente con agua freeca. Tanto los lotes tratados como no tratados se secan (se elimina el agua de la superficie de la fruta) . El lote tratado se pulveriza en una volteadora con 100 mililitros de la formulación, se seca al aire durante 10 minutos, se empaca en cajas, y se coloca en un almacenamiento temporal . El lote de control se pulveriza en una volteadora con 100 mililitros de H20 destilada, se seca al aire durante 10 minutos, se empaca en cajas, y se coloca en un almacenamiento temporal. Después de 20 días, se evalúan ambos lotes por la descomposición fisiológica y patológica.
Ejemplo 5 Manejo Después de la Cosecha de Verduras Subterráneas (Raíces. Tubérculos, v Bulbos) El propósito de este experimento ee evaluar la actividad conservadora de verduras subterráneas del aldehido cinámico. Las porciones comestibles de este grupo de verduras se desarrollan en su mayor parte debajo del suelo, e incluyen varias eetructuras botánicas. • Raíces: betabel, zanahoria, nabo, rábano largo, rábano corto, pastinaca, papa dulce, casava, jicama,- • Tubérculos: papa, alcachofa de Jerusalém, camote ,- • Bulboe: cebolla, ajo, chalote.
Método Se seleccionan 40 papas de tubérculo al azar de bandejas de campo. Las papas se curan en una casa de empaque durante seie días para asegurar la formación del peridermo. Lae papas se remueven del curado, y se ponen en dos grupos de 20 cada uno para el ensayo. Veinte papas del grupo tratados se lavan, luego se pulverizan con 10 mililitros de cada formulación. Las papas no tratadas se lavan con H20 limpia. Las papas tratadas y no tratadae ee empacan por eeparado en un empaque para el coneumidor, y ee ponen en un almacenamiento temporal . Lae papae ee observan y se evalúan a intervalos de 30, 60, 90, y 120 días por la descomposición patológica.
Ejemplo 6 Métodos Después de la Cosecha para el Manejo de Vegetales de Fruta El objetivo de este experimento es evaluar la actividad conservadora de vegetales de fruta del aldehido cinámico. Los vegetales de fruta no son generalmente adaptables al almacenamiento a largo plazo. Las excepciones eon los chayotes duros (de invierno) y las calabazae . Loe vegetalee de fruta inmaduros de interés son las legumbres, lae curcubitáceas (chayóte blando) , las verduras solanáceas
(berenjena, pimiento, etcétera), okra y maíz dulce. Los vegetales de fruta maduros de interés son las curcubitáceas
(melón, melón dulce, y otros melones,- melón de agua, chayotes duroe, y calabazae). (Verdurae solanáceas: tomates verdes maduros y paravino, pimientos maduros) .
Método Se seleccionan cuarenta tomates de vegetales de fruta (de vino) al azar a partir de góndolas a granel de una casa de empaque. Se enjuagan con agua veinte tomates tratadoe, luego se tratan con una pulverización de 100 mililitros de formulación de prueba sobre la sección del transportador de rodilloe. Se pulverizan veinte tomatee no tratados con 100 mililitros de H0 sobre las seccionee del traneportador de rodillos. Loe tomatee tratadoe y no tratados se ponen en un empaque en lugares separados (tratados y no tratados) , y se almacenan en un almacenamiento temporal durante 10 días. Loe tomatee se observan y se evalúan en los días 3, 6, y 10 por la descomposición patológica.
Ejemplo 7 Actividad Conservadora del Aldehido Cinámico El objetivo de este experimento es evaluar la actividad conservadora de vegetales de flor, hojas, y tallos del aldehido cinámico. Los vegetales de hojas, tallos, y florales están representados (pero no limitados a) por las siguientes comodidades: • Vegetales de hojas: lechuga, col, colecitas de brueelas, apio, espinaca, cebollas verdes, achicoria de endibia, endibia; • Vegetales de tallo: espárrago, colinabo, hiñoj o ,- • Vegetalee floralee: alcachofa, brócoli, coliflor.
Método (Ejemplo Después de la Cosecha de Vegetal Floral;
Coliflor) . Se seleccionan cuarenta cabezas de coliflor de un lote de casa de empaque. Se recortan las hojas de la coliflor. Se rocían veinte cabezas tratadas con 10 mililitros de la formulación de prueba cada una, y se envuelven las cabezas . Se rocían veinte cabezas no tratadas con 10 mililitros de H0, y luego se envuelven. Las cabezas tratadas y no tratadas se ponen en cajas separadae, y se almacenan en un almacenamiento temporal durante 10 días. Las cabezas se observan en los días 3, 6, y 10 por la descompoeición patológica.
Ejemplo 8 t-r»t-»?t?-fento Después de la Cosecha de Flores Cortadas Microbios en Solución de Agua de Rosa La larga vida de las flores cortadas depende del mantenimiento de suficiente agua en las flores cortadas desde el momento de la cosecha hasta que se desvanece la flor en la casa. Los dos factores críticoe para un buen eetado de agua, son la rehidratación despuée del manejo en eeco, y el control de lae bacteriae en la solución del florero siempre que los talloe eetén agua. Aunque ee utilizan un rango de biocidas comerciales en conservadores de florero para flores cortadas, ninguno es particularmente efectivo o duradero. Este bioensayo prueba la posibilidad de prevenir el crecimiento de bacterias en las solucionee de floreros, mediante la utilización de una formulación de aldehido cinámico que tiene el potencial para un nuevo tipo de conservador de florero y biocida en eolución de florero para floree cortadae .
Métodos Se cortan veinte rosas decapitadas frescas {Hybrid tea) y veinte claveles decapitados frescos {Dianthus caryophyllus) de tal manera que 4 centímetros del tallo se extiendan más allá de la parte superior del anillo de un biberón de plástico. Las flores se colocan cada una en botellas separadas aseguradas al banco con cinta, y se revisten con revestimientoe eetériles. Diez de cada tipo de flores cortadas sirven como el grupo de tratamiento, y diez como el control. A ambos grupos de flores se lee dan 10 mililitros de H20. Las flores cortadas tratadas reciben una escala de formulación de 20 a 50 ppm. Se observa y se registra la senescencia de las flores cortadas.
Ejemplo 9 Sobreproducción de Aldehidos Aromáticos en Plantas Transgénicas Se preparan veinte microgramos de ARN poliA y se sintetiza el ADNc. Parte de esto se clona en el vector lambda-ZAP II (un vector de clonación comercialmente disponible). Se raetrean cuando menos 500,000 recombinantes utilizando una sonda de oligonucléotido diseñada a partir de secuencias conservadas de genes CA4H y CAD clonados obtenidos en GenBank, o dieeñada a partir de la eecuencia del péptido de la proteína purificada de la planta huésped pretendida. Se seleccionan los clones de hibridización fuerte, y se utilizan para volver a rastrear la genoteca del ADNc . Los clones resultantee se secuencia para hacer posible la introducción de secuenciae genéticas apropiadas en un cásete de expresión de planta ya sea en la orientación anti-sentido o en sentido. Las construcciones anti-sentido y en sentido se introducen en Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 mediante transformación directa siguiendo los procedimientos publicados. Se transforman diecos de hoja de tabaco (N. taJacum var. Samsun) utilizando procedimientos publicados bien establecidos (Horsch y colaboradores (1985) Science 227:1229-1231). Las plantae que contienen las construccionee de CA4H ó de CAD ee identifican mediante reacción de cadena de polimeraea, y ee eeleccionan para otro análieie. El material de las plantas de control transformadas y no transformadae ee utiliza para lae determinacionee de la actividad enzimática de CA4H y CAD empleando ensayos publicados bien establecidoe. Lae plantae en donde se ha reducido la actividad de CA4H ó CAD hasta menos del 20 por ciento de la que se ve en las plantas de control, se eeleccionan para otro análieie. Lae plantas seleccionadas con una baja actividad de CA4H se cruzan con plantas con una baja actividad de CAD, y se selecciona la progenie que hereda ambae conetruccionee genéticas mediante reacción de cadena de polimerasa. Las plantas con una actividad euprimida de CA4H y una actividad suprimida de CAD se analizan por su producción de aldehido aromático empleando procedimientos publicados convencionales .
Ejemplo 10 Producción de Aldehidos Aromáticos en Sistemas Microbianos Se genera una genoteca de ADNc utilizando ARN extraído de talloe de tabaco de seis semanas de edad. Se preparan 20 microgramos de ARN poliA, y se sintetiza el ADNc. Parte de esto se clona en el vector lambda-ZAP II (un vector de clonación comercialmente disponible) . Se rastrean cuando menos 500,000 recombinantes utilizando una sonda de oligonucléotido diseñada a partir de secuencias de péptido de la proteína CCoAr purificada de tejido de tallo de tabaco de seis semanae de edad, empleando el protocolo de Goffner y colaboradoree (1994) Plant Physiol 106:625-632. Se eeleccionan loe clonee de fuerte hibridización, y ee utilizan para volver a raetrear la genoteca del ADNc. Los clones resultantes se secuencia para hacer posible la identificación de los insertos de ADNc de longitud completa, y la introducción de las secuencias del gen CCoAR apropiadas en el vector de expresión de levadura pMTL8110 (Faulkner y colaboradores (1994) Gene 143:13-20). Las secuenciae de codificación para liasa de amoníaco de fenilalanina de Rhodosporidium toruloides (PAL; GenBank locus RHDPAL) y una 4-cumarato: ligasa de CoAl de perejil (4CL; GenBank locus PC4CL1AA) se introducen similarmente en vectores de expresión de levadura equivalentes. Se utilizan las construccionee PAL, 4CL, y CCoAR para transformar cepas de Saccharomyces cerevisiae, mediante electroincorporación, empleando procedimientos publicadoe eetablecidos (Becker y Guarente (1991) Methods in Enzymology 194: 182-187; Simón (1993) Methods in Enzymol 217:478-483). Se seleccionan los transformantee sobre medio mínimo que carece de leucina. Las cepae traneformantes que llevan las tres construcciones genéticas se identifican mediante reacción de cadena de polimeraea, y ee seleccionan para otro análisis. Los extractos de las cepas de control transformadas y no transformadas se utilizan para las determinaciones de las actividades enzimáticas de PAL, 4CL, y CCoAR, utilizando ensayoe publicadoe bien eetablecidos. Las cepas en donde la actividad de PAL, 4CL, y CCoAR es eignificativamente mayor que la actividad de fondo detectada en la cepae de control, ee seleccionan para otro análisis. Las cepas seleccionadae se analizan por la producción de aldehido aromático, utilizando procedimientoe publicados convencionales, y se seleccionan aquellas que producen cantidadee significativas de aldehido cinámico para la optimización de las condiciones de fermentación.
Ejemplo 11 Tratamiento de Añublo Tardío {Ph?tophtora infestans) El añublo tardío afecta al tomate, a la papa, a la berenjena, y a otras plantae de la familia de la papa: empieza cuando se establecen las esporas fúngales sobre las superficies húmedas de la planta durante loe períodos de temperatura de rocío. Se conducen experimentos para probar el control de Phytophtora infestans utilizando semilleroe de papa en el invernadero. Las plantas se inoculan por pulverización utilizando un aislado del patógeno en el ' invernadero . Las plantas ee tratan bien sea antes o después de la inoculación con el patógeno, o empleando un protocolo de tratamiento, tal como el mostrado en la Tabla 2, incluyendo un tercer panel para probar el aldehido alfa-hexil-cinámico. También se prueba un régimen de tratamiento adicional utilizando una cantidad suficiente de saponina en lugar del Tween como un emulsificante. Los efectos del tratamiento se evalúan a las doe y a lae tree semanas después del tratamiento. Ya que la mayor parte del alimento para consumo humano y animal es de origen de animal o de planta, y dada la actividad conocida de las toxinas microbianas, la presencia de toxinae microbianamente producidas que se acumulan antee de la cosecha y/o deepués de la cosecha, y que pereieten deepuée del proceeamiento, tiene posibilidades de ser cuando menoe parcialmente responsable de una multitud de desórdenee de la salud ligados a la contaminación con micotoxinas. Mediante el control de los niveles de toxina microbiana y los productos consumiblee, y aquelloe que se encuentran asociados con ciertos materiales que se encuentran en el medio ambiente, ee pueden reducir el cáncer, la enfermedad del hígado, y otrae enfermedades ligadas a la ingestión de toxinas microbianae, particularmente aquellas asociadas con el consumo de alimentos de granoe de cereales contaminados y alimentaciones de animales, y los aeociados con productos de grano procesadoe tales como jarabe de maíz. En adición, también se pueden mejorar los procedimientos de prueba con animales de laboratorio mediante el control de la micotoxinas asociadas con los alimentos para animales y ciertos materiales de prueba tales como tabaco. Más aun, mediante el control del nivel de toxina microbiana asociada con el tabaco, se pueden reducir los cánceres en seres humanos ligados a mascar o a fumar tabaco. Los metabolitos tóxicos asociados con los materiales de interés incluyen aquellos producidos por bacterias y/u hongos, y especialmente las micotoxinas fúngales y otros metabolitos secundarios que tienen propiedades similaree. Los métodos y composicionee de la invención eon particularmente adecuadoe para controlar el nivel de una o más micotoxinas producidas por hongos de los géneros Aspergill us, Al ternaría, Fusarium, y Penicillium, y más particularmente los hongos que producen una o más micotoxinas, incluyendo aflatoxinas, fumonisinae, ácido fusárico, toxinas de TA/AAL, zearalenona, y tricoteceno, ácido 5-butilpicolínico, y derivados de piridina fitotóxicos relacionados.
Todas las publicaciones y solicitudes de patente mencionadas en esta especificación indican el nivel de capacidad de los expertos en el campo al que pertenece esta invención. Todas las publicaciones y solicitudes de patente se incorporan a la presente como referencia hasta el mismo grado en que si cada publicación o solicitud de patente individual se hubiera indicado de una manera específica e individual para incorporarse como referencia. Habiéndose deecrito completamente ahora la invención, podrá ser visto por un experto ordinario en este campo, que se pueden hacer muchos cambioe y modificacionee a la miema ein apartaree del eepíritu o alcance de las reivindicaciones adjuntas.
Claims (16)
1. Un método para el biocontrol de microorganismos productores de micotoxinas en una parte de planta cosechada, comprendiendo este método: proporcionar a una parte de planta, antes o después de la cosecha de dicha parte de planta, una cantidad moduladora del crecimiento microbiano efectiva de una formulación que comprende cuando menos uno de los compuestos de la fórmula: en donde R¡ representa -CHO, R2 repreeenta -H, -OCH3, o un suetituyente orgánico que comprende de 1 a 10 átomos de carbono, R3 representa -H, -OH, o un sustituyente orgánico que comprende de l a 10 átomos de carbono, y R4 representa -H o un sustituyente orgánico que comprende de 1 a 10 átomos de carbono; en donde la formulación no es fitotóxica para la planta, y no se proporcionan otros antioxidantes diferentee de aquelloe de acuerdo con la fórmula,- mediante lo cual, ee biocontrolan los microorganismoe productores de micotoxina en dicha parte de planta.
2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde cuando menos un compuesto es aldehido cinámico, aldehido de coniferilo, o aldehido of-hexil-cinámico.
3. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en donde la cantidad moduladora del crecimiento proporciona una resietencia a la enfermedad promedio de aproximadamente el 70 por ciento o más alta.
4. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la provisión ee antes de la cosecha de la parte de la planta.
5. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la inhibición del crecimiento de los microorganismoe productoree de micotoxina, ee durante un período mayor de un mes .
6. Una composición que comprende una cantidad moduladora del crecimiento de uno o más compueetos de la fórmula: en donde Rj representa -CHO, R2 representa -H, -OCH3, o un euetituyente orgánico que comprende de 1 a 10 átomoe de carbono, R3 representa -H, -OH, o un sustituyente orgánico que comprende de 1 a 10 átomos de carbono, y R4 representa -H o un sustituyente orgánico que comprende de 1 a 10 átomos de carbono, en un vehículo agrícolamente compatible, exento de antioxidante, en donde esta composición proporciona una resistencia a la enfermedad promedio de aproximadamente el 70 por ciento o más alta contra un hongo productor de micotoxina que coloniza una o más partes de la planta coeechada, cuando ee aplica a dicha parte de planta antes o después de cosechar esta parte de planta.
7. Una composición de acuerdo con la reivindicación 6, en donde la cantidad moduladora del crecimiento produce una evaluación de fitotoxicidad de uno o menoe .
8. Una compoeición de acuerdo con la reivindicación 6 ó 7, en donde el uno o máe compuestos son aldehido cinámico o aldehido de coniferilo.
9. El uso de una composición de acuerdo con la reivindicación 6, 7, u 8, para proporcionar una resietencia a la enfermedad promedio de aproximadamente el 70 por ciento o máe alta contra un hongo productor de micotoxina.
10. El uso de acuerdo con la reivindicación 9, que produce una evaluación de fitotoxicidad de uno o menos.
ll. Plantas coeechadas o partes de plantas sustancialmente exentas de hongos productores de micotoxina obtenidas de acuerdo con el método de cualquiera de lae reivindicacionee 1 a 5.
12. Un método para inducir reeistencia de las plantae a los hongoe productoree de micotoxina, comprendiendo eete método: poner en contacto lae plantae con una formulación que comprende un vehículo agrícolamente compatible, exento de antioxidante, y una cantidad euficiente de un compuesto de la fórmula: en donde R¡ representa -CHO, R2 representa -H, -0CH3, ó un sustituyente orgánico que comprende de 1 a 10 átomos de carbono, R3 representa -H, -OH, o un suetituyente orgánico que comprende de 1 a 10 átomoe de carbono, y R4 repreeenta -H o un sustituyente orgánico que comprende de 1 a 10 átomos de carbono, para inducir reeietencia eistémica a los hongos productores de micotoxina.
13. Una compoeición para utilizaree en un método de acuerdo con la reivindicación 12, la cual comprende un vehículo agrícolamente compatible, exento de antioxidante, y una cantidad euficiente de un compuesto de acuerdo con la fórmula: R2 en donde Rj representa -CHO, R representa -H, -OCH3, ó un sustituyente orgánico que comprende de 1 a 10 átomos de carbono, R representa -H, -OH, o un sustituyente orgánico que comprende de 1 a 10 átomos de carbono, y R4 repreeenta -H o un eustituyente orgánico que comprende de 1 a 10 átomos de carbono, para inducir resistencia sistémica a los hongos productores de micotoxina.
14. La composición de acuerdo con la reivindicación 13, en donde el vehículo comprende un tensoactivo.
15. La compoeición de acuerdo con la reivindicación 14, en donde el teneoactivo ee una saponina.
16. El uso de una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicacionee 13 a 15, para inducir reeistencia sistémica en plantas contra los hongos productores de micotoxina. RESUMEN Se proporcionan métodos y composiciones para controlar el nivel de metabolitos tóxicos en materiales, y particularmente en plantas, antes, durante, y/o después de la cosecha y/o del procesamiento. La invención encuentra uso para reducir el riesgo a la salud asociado con los productos de consumo tales como tabaco, alimentos de granos de cereal, productos de grano procesados tales como jarabe de maíz, frutas cítricas, verduras subterráneas, vegetales de fruta, vegetales de flor, hojas, y tallos, y flores cortadas, y para mejorar los procedimientos de prueba en animales de laboratorio mediante el control del nivel de micotoxinas asociadas con los materiales que colonizan loe microorganiemoe productores de toxinas. Las composiciones para controlar los hongos productores de micotoxinae comprende aldehido cinámico, aldehido de coniferilo, o derivadoe de loe mismos, que tienen la fórmula (2) en donde Rj representa -CHO, R3 representa -H, -OH, o un sustituyente orgánico que comprende de 1 a 10 átomos de carbono, R representa -H, -0CH3, ó un sustituyente orgánico que comprende de 1 a 10 átomos de carbono, y R4 representa -H o un sustituyente orgánico que comprende de 1 a 10 átomos de carbono .
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