MXPA97001000A - Composiciones repelentes que contienen aldehidos flavonoides - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere:Se describen composiciones repelentes que contienen aldehídos flavonoides tales como aldehído cinámico, aldehído alfa-hexilcinámico y/o aldehído de coniferilo, junto con métodos para su uso como repelentes de plagas, que incluyen moscas, cucarachas,áfidos, moscas blancas de la hoja plateada, mosquitos, garrapatas, pulgas, saltamontes de hojas, tripsidas,ácaros araña manchados, caracoles, babosas, mosquillas picadoras, tijeretas y polillas.

Description

COMPOSICIONES REPELENTES QUE CONTIENEN ALDEHIDOS FLAVONOIDES CAMPO TÉCNICO Esta invención se refiere a aldehidos flavonoides como repelentes de plagas. El ejemplo básico de la invención es el uso del aldehido cinámico como un repelente de mosquitos y plagas agrícolas, tales como pulgones y tripsidas.

ANTECEDENTES DE LA TÉCNICA ANTERIOR En muchos países actuales, enfermedades tales como paludismo, fiebres hemorrágicas transmitidas por vectores alergias a las cucarachas, pulgas de la suciedad, peste bubónica, virus de las garrapatas, rickettsias, bacterias espiroquetas, esquistosomiasis de los caracoles y fiebre de la mosca de la arena, siguen siendo responsables de graves enfermedades y de numerosas muertes en la población, en general. La preocupación creciente por proteger especies en peligro de extinción y la tendencia decreciente en la disponibilidad de los plaguicidas de amplio espectro para la salud pública, obligan a los investigadores a buscar otros medios económicos de protección contra los vectores de la enfermedad. Por otra parte, el costo de los plaguicidas, a menudo es demasiado alto para muchos de los países menos desarrollados y la resistencia creciente a estos compuestos desarrollada por las poblaciones de vectores, representan problemas cada vez mayores. El uso de repelentes es un excelente medio alternativo para proporcionar alivio, cuando otros métodos convencionales, para el control de los vectores, no son factibles. Para los vectores objetivo que afecta a los mamíferos, los repelentes aplicados correctamente a la piel y/o a la ropa, son un medio económico y práctico para reduci r las picaduras de los artrópodos hematófagos y para evitar la transmisión de enfermedades por los vectores. Los repelentes son eficaces contra una extensa variedad de vectores de enfermedades, mientras que la prevención de la enfermedad requiere el desarrollo de una vacuna separada para cada patología. Por otra parte, sólo algunas vacunas son eficaces contra las enfermedades transmitidas por vectores. Las enfermedades transmitidas por vectores también afectan a las plantas . Por ejemplo, la enfermedad del olmo holandés ha destruido millones de olmos en los Estados U nidos. La enfermedad es causada por un hongo que es propagado de un árbol hacia otro, por una especie particular de insectos atraídos a los olmos. Los métodos actuales de profilaxis sólo han tenido éxito limitado. Existe la necesidad de una profilaxis eficaz para esta destructiva enfermedad de las plantas. La reducción del uso de repelentes en el control de vectores y la prevención de enfermedades, generalmente se basan en cuestiones de seg uridad y de costo . Por ejemplo , uno de los repelentes utilizados más extensamente en el pasado era el 6-2-2 , que contenía ftalato de dimetilo, hexanodiol etílico e Indalona en la proporción de 6:2:2. El ftalato de dimetilo y la Indalona todavía se utilizan en grado limitado, pero en 1991 La Agencia de Protección del Medio Ambiente de los Estados Unidos canceló todos los registros del hexanodiol etílico a petición de los fabricantes interesados. Esta medida fue adoptada debido a nuevos informes sobre posibles efectos adversos durante el desarrollo fetal. Como otro ejemplo, uno de los repelentes de mosquitos más eficaces es el DEET (N , N-dietil-1 ,3-metilbenzamida). Este material prácticamente desplazó a otros repelentes para uso tópico y sigue siendo el repelente más utilizado en la actualidad, casi 40 años después de su descubrimiento. Sin embargo, en los últimos años, la permetrina, un derivado sintético del piretro, ha reemplazado, en su mayoría, a la DEET para usarse en la ropa y otros artículos de tela. Como repelente, la DEET es sumamente eficaz, pero también puede causar efectos alérgicos y tóxicos, especialmente cuando se utiliza repetidamente en la piel a altas concentraciones. Las fórmulas repelentes que contienen 90-99% de DEET, se consideran concentraciones altas, mientras que las que contienen 50% o menos de DEET se consideran tan eficaces como una concentración del 100%. Una concentración del 33% de DEET ofrece una protección eficaz durante 10-14 horas. Sin embargo, para los productos que contienen concentraciones todavía bajas de DEET, se recomienda que la piel sea limpiada con jabón suave y enjuagada con agua tan pronto como ya no se necesite el repelente, con el objeto de reducir al mínimo las posibles reacciones adversas. Estas recomendaciones frecuentemente son imprácticas en los países del tercer mundo y para uso militar. . Existen composiciones repelentes para aplicarse tópicamente a un mamífero, así como para impedir que los insectos entren en los hogares u otras áreas. Sin embargo, la seguridad de muchas de las composiciones tópicas ha sido puesta en tela de juicio. Por otra parte , muchas de las composiciones tópicas son de eficacia limitada, especialmente en las áreas de infestación severa con insectos. El tratamiento de las infestaciones externas de insectos, tales como piojos o ladillas, en un mam ífero, a menudo incluye la aplicación tópica de composiciones insecticidas tóxicas, potentes e irritantes en la piel o el cuero cabelludo . Con frecuencia se desarrolla irritación y también se sabe que su uso a largo plazo , causa efectos adversos para la salud . Existe la necesidad de una composición repelente tópica eficaz para un mam ífero . Las composiciones repelentes para evitar la entrada de insectos a los recintos son igualmente ineficaces. Muchas de las composiciones repelentes conocidas son peligrosas para utilizarse en espacios cerrados debido a su alta toxicidad , especialmente donde los niños y animales domésticos pueden entrar en contacto con ellas. Existe la necesidad de una composición repelente eficaz, q ue no sea tóxica ni irritante . Las infestaciones con insectos de los árboles y otras plantas leñosas destruyen anualmente mi llones de árboles de producción agrícola y ornamentales. Los tratamientos actuales sólo son parcialmente satisfactorios y hasta podrían hacer perder el valor de una cosecha de productos agrícolas debido a su toxicidad persistente. Por lo tanto, también existe la necesidad de encontrar un medio eficaz, relativamente no persistente para repeler las infestaciones de insectos en los árboles y arbustos leñosos.

Literatura Relacionada La patente de E. U .A. No . 5,093,326 describe composiciones repelentes que incluyen un hidrocarburo insaturado, ozonizado, que incluye terpenos. La patente de E. U .A. 5, 365,017 describe la preparación de una planta transgénica con concentraciones mayores de cicloarterol. Entre las publicaciones relacionadas con las fórmulas de repelentes se encuentran Reifenrath y otros (1989), J.Am. Mosquito Control Association 5:45-61 , y Reifenrath (1995) , Cosmetics & Toiletries Magazine 1 10:85-93.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a composiciones repelentes que contienen aldehidos flavonoides y a métodos para utilizar dichas composiciones . Las composiciones repelentes contienen un compuesto de la siguiente fórmula ( 1 ): (1) en donde R representa -CH2OH o -CHO; n es un número de 0 a 3, y cada Ri representa independientemente OH o un substituyente orgánico que contiene de 1 a 10 átomos de carbono y de 0 a 5 átomos heterogéneos, en donde, el número total de carbonos y átomos heterogéneos en todos los substituyentes R(, de dicho compuesto, no es mayor que 15, y R4 representa hidrógeno o un constituyente inorgánico que contiene de 1 a 10 átomos de carbono. Estos compuestos incluyen productos naturales, tales como el aldehido cinámico. También son de interés los aldehidos substituidos en la posición alfa, tales como el aldehido alfa-hexilcinámico (HCA). Al utilizarse, los compuestos se aplican a una superficie tal como la piel, la ropa, corteza, los componentes del habitat, y áreas similares, en donde se desea repeler a los insectos y a otras plagas. La invención encuentra uso, por ejemplo, en la prevención de enfermedades e infecciones que podrían ser causadas por el contacto con un insecto vector portador de enfermedades o con otros vectores plagas.

DESCRIPCIÓN DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS Se proveen métodos y composiciones para obtener y/o mantener un área substancialmente libre de insectos y otras plagas.

Se provee un método para repeler plagas y microorganismos causantes en mamíferos, aves, peces y sus hábitats, así como para mantener las semillas, plántulas, plantas y partes de las plantas tales como el fruto, substancialmente libres de organismos patógenos tales como hongos, insectos y otras plagas, al igual que virus, bacterias, espiroquetas y otros microorganismos causantes de enfermedades e insectos chupadores de savia. Se cubre la superficie que interese, con un aldehido flavonoide, en una cantidad suficiente para repeler un insecto u otra plaga. La cantidad de repelente que se aplique dependerá, en parte, de la naturaleza de la superficie y, en cierta medida, de la fórmula y el método de preparación específicos que se utilicen y, por lo tanto, debe ser determinada empíricamente para obtener los resultados óptimos contra el insecto o la plaga de que se trate. Las composiciones y los métodos de la presente invención ofrecen varias ventajas sobre las composiciones y métodos actuales. Una ventaja importante es que los componentes de la fórmula están generalmente considerados como seguros (GRAS) y aprobadas para uso alimentario. Por ejemplo, varios de los aldehidos aromáticos que podrían encontrar uso en la presente invención, tales como el aldehido alfa-hexilcinámico (HCA), el cinamaldehído y la vainillina, son agentes saborizantes sintéticos, generalmente considerados como seguros (GRAS), (Título 21 del Código de Reglamentos Federales, parte 172.515). El HCA se utilizaba antes de la década de 1950, y en la actualidad se utiliza extensamente en preparaciones de consumo (jabones, detergentes, cremas, lociones, perfumes), (monografías sobre materias primas para fragancias. Food Cosmet. Toxicol. 12:supl., 915, 1974). Al HCA le fue otorgado el estado de GRAS (generalmente reconocido como seguro) por la FEMA (Asociación de Fabricantes de Extractos Saborizantes. Encuesta de los niveles de uso de ingredientes saborizantes. No. 2569. Fd. Technol., Champaign, 19:[parte 2] 155, 1965), en 1965, y está aprobado por la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos (FDA) para uso en alimentos (Título.21 del Código de Reglamentos Federales, parte 121.1164). El consejo de Europa (1970), (Consejo de Europa. Substancias Saborizantes Naturales y Artificiales. Convenio Parcial en el Campo Social y de la Salud Pública. Estrasburgo, Lista A (1), Serie 1, No. 129, página 55, 1970) incluyó el HCA en la lista de substancias saborizantes artificiales, admisibles a una concentración de 1 ppm. Los agentes tensoactivos que pueden ser utilizados como emulsificantes en las fórmulas de la presente invención, tales como Tweens (polisorbatos) también se utilizan ya como aditivos para alimentos, al igual que la saponina (la cual, también tiene un estado de Generalmente Reconocida como Segura [GRAS]). Además, se puede controlar el grado de residualidad de las fórmulas. Esto es muy benéfico para los programas integrados de control de plagas con insectos benéficos, porque pueden obtenerse efectos residuales a corto plazo. El control a largo plazo de los microorganismos patógenos da como resultado una planta más saludable y un mejor rendimiento de productos agrícolas de la planta huésped, en comparación con las plantas no transgénicas. Los aldehidos aromáticos, en particular, tienen propiedades organolépticas y olfatorias positivas que, en algunos casos, pueden mejorar el sabor y/o el olor de los productos tratados, y eliminar el olor desagradable asociado con muchos repelentes de plagas. El olor del aldehido alfa-hexilcinámico (HCA), por ejemplo, se describe como floral o parecido al jazmín, con. cierto carácter herbáceo (Hoja de Datos Técnicos). Para las plantas, los ingredientes activos pueden ser fabricados por la planta después de la introducción del gen o los genes responsables de la síntesis de los varios aldehidos en el genoma de la célula vegetal. El uso de plantas transgénicas, en vez de la aplicación tópica del repelente a la planta, disminuye la probabilidad de causar efectos secundarios adversos en los trabajadores del campo o los animales, los peces, o las aves, que ingieran los tejidos o partes de las plantas, ya que muchos de los compuestos de la fórmula (1), en particular los compuestos de las fórmulas (3) y (4), son aditivos alimenticios clasificados como GRAS. Además, la presente invención supera el fracaso de los plaguicidas actuales para translocarse, por ejemplo, a las raíces, para el tratamiento de la filoxera. También, la prevención de la infestación al repeler el vector que transporta las enfermedades o que daña el objetivo de la planta, reduce significativamente el número de animales o plantas objetivo que sucumbirán a la enfermedad transportada por la plaga, o que serán dañados por las actividades de la misma, tales como, por ejemplo, el daño causado por las moscas hembra del Mediterráneo, cuando ponen sus huevos en los frutos.

Cuando se aplican a animales, incluyendo el ser humano, las fórmulas de la presente invención no son tóxicas, ni irritantes a la piel, en las concentraciones utilizadas. Por ejemplo, el alfa- hexilcinamaldehído (HCA) tiene una dosis letal media DL50 oral de 3.1 g/kg en las ratas, y una DL5o dérmica de más de 3 g/kg (Moreno, O.M. Informe a la RIFM, 24 de marzo de 19971). Se encontró que el HCA era moderadamente irritante cuando el compuesto puro se aplicaba a la piel intacta o excoriada del conejo durante 24 horas bajo oclusión (Moreno). Cuando se analizó con petrolato, a una concentración del 12%, el HCA no causó irritación después de una prueba de 48 horas de duración en parche cerrado, realizada en seres humanos, y no causó sensibilización, en una prueba de maximización realizada en 25 •seres humanos (Kligman [1966] J. Invest. Dermatol. 47:393). El HCA al 20% en ftalato de dimetilo, no dio lugar a reacciones positivas, en una prueba de agresión repetida en parche, llevada a cabo en 100 seres humanos. Jimbo tabuló los datos de alergenicidad encontrados en la literatura para 18 compuestos de fragancias. Mientras que el aldehido cinámico causó una reacción positiva en la prueba de maximización en el ser humano, el HCA dio resultados negativos. Los resultados de la prueba del parche con HCA al 2%, en 100 pacientes con eccema y dermatitis fueron negativos (0 de los 100). Ninguno de cuatro pacientes sensibles al cinamaldehído al 2% demostró reacción cruzada con HCA al 2%. La sensibilización cutánea comunicada frecuentemente para el cinamaldehído, probablemente sea iniciada por la reacción de grupos amino sobre las proteínas con el grupo funcional aldehido. La situación de los grupo alquilos grandes, en la posición alfa (por ejemplo, el grupo hexilo del HCA) relativo al grupo aldehido, puede reducir esta reactividad creando una barrera esférica, así como reduciendo la electrofilicidad del carbón aldehídico. Los cinamaldehídos substituidos en la posición alfa, para los cuales la sensibilización cutánea es rara, reaccionan lentamente o no reaccionan con las aminas, en comparación con el cinamaldehído. En estudios, en donde se utilizó la prueba de maximización de cobayos, Senma y otros describieron una tendencia con respecto a que, a medida que aumentaba el número de hidrocarburos de los grupos alquilo que reemplazaban al hidrógeno alfa en el cinamaldehído, la tasa de reacciones de sensibilización declinaba. Estas fórmulas también ofrecen un control eficaz de múltiples organismos, tales como hongos e insectos. También se ha comunicado que los compuestos presentan actividad inhibidora contra la germinación de esporas de C. botulinum (Bowles y Miller, G. Food Protection [1993] 56: 788-794). Esta eficacia contra múltiples objetivos reduce la necesidad de aplicar múltiples agentes a una planta o animal, para lograr su protección y substancialmente elimina la necesidad de aplicar plaguicidas. En situaciones específicas, por ejemplo, aquellas en donde un insecto daña a un animal o a una parte o tejido de una planta, y se desarrolla una enfermedad fungal o bacteriana secundaria, este aspecto de la invención es particularmente ventajoso. La fórmula genera corresponde presentada en (1 ) , anteriormente. Una fórmula preferida se presenta en (2) a continuación : en donde Ri representa -CHO, R2 representa -OH o un substituyente orgánico que contiene de 1 a 10 átomos de carbono, R3 representa un grupo metoxi o un substituyente orgánico que contiene de 1 a 10 átomos de carbono, y R4 representa u n hidrógeno o un substituyente orgánico que contiene de 1 a 10 átomos de carbono. Particularmente interesantes con los aldeh idos flavonoides, especialmente los aldehidos aromáticos . Ejemplos de aldehidos aromáticos que pueden utilizarse en la presente invención, son el aldehido cinámico (3) que se muestra a conti nuación: y el aldehido coniferilo (4), que se presenta a contin uación : - Otros compuestos interesantes incluyen análogos del compuesto de la fórmula (1 ), tales como los substituidos en la posición alfa con un alquilo, como un grupo hexilo o un grupo alquilo ramificado, como un grupo amilo. Generalmente, el grupo en la posición alfa es de C-5 a C-10. Tales compuestos incluyen a-hexil cinamaldehído y a-amil cinamaldehído. La estructura química del aldehido a-hexil cinámico (HCA) se presenta en (5) a continuación: El nombre del Chemical Abstracts Service (CAS) del HCA es 2-(fenilmetileno) octanal y el Número de Registro CAS es [101 -86-0]. El compuesto también se describe con el nombre químico de 2-hexil-3-fenil-2-propenal. La fórmula del compuesto es C15H20O y su peso molecular es de 216.3. El HCA puede obtenerse de Firmenich; el producto de este proveedor está compuesto principalmente del isómero (E)-cis (máximo 93.8%) , y el isómero (Z)-trans (máximo 6%). Entre los componentes menores - está el producto de la autocondensación aldólica del octanal (1 - 1.5%) (Comunicación Personal, June Burkhardt, Firmenich, Plainsboro, Nueva Jersey). Los compuestos pueden utilizarse solos o en combinación con otras substancias activas o inactivas, y pueden aplicarse mediante pulverización, vertido, inmersión, en forma de líquidos concentrados, soluciones , suspensiones, polvos y similares, conteniendo la concentración del compuesto activo, que sea la más adecuada para un propósito particular de que se trate. También puede aplicarse, por ejemplo, en forma de solución diluida, en un disolvente adecuado, directamente a la rizósfera, ya sea como parte de un programa de riego o como una aplicación separada. Para usarse como pulverización foliar, aunque el aldehido puede formularse sólo, puede volverse sustantivo incluyendo una cantidad suficiente de un emulsificante tal como Tween 80. Otros detergentes que pueden utilizarse incluyen los agentes tensoactivos aniónicos, tales como los descritos en la patente de E. U .A. N o. 4,978 ,686. Otros compuestos que pueden utilizarse solos o junto con detergentes incluyen las saponinas de una variedad de fuentes, particularmente Yucca shidigera o Yucca valida. Generalmente , los detergentes y otros agentes utilizados en la fórmula disminuyen las propiedades repelentes de los aldehidos flavonoides, pero si aumentan las propiedades sustantivas de la fórmula (véase , por ejemplo, patente de E. U .A . No. 4,477,361 ) , y tal vez mejoren las propiedades plaguicidas , incluso las fungicidas (véase más adelante) . Para aumentar las propiedades antimicóticas de la fórmula, pueden incluirse en la misma compuestos adicionales tal como una preparación acuosa de una sal de ácido poliprótico, tal como bicarbonato de sodio, sulfato de sodio , fosfato de sodio o bifosfato de sodio . La em ulsión resultante es diluida en una concentración apropiada para utilizarse.

En una modalidad preferida, la fórmula contiene a-hexilcinámico, aldehido cinámico y/o aldehido de coniferilo, en una fórmula con Tween 80 o saponina como emulsificante, y puede incluir bicarbonato de sodio. La fórmula preferida para repeler moscas, mosquitos, pulgas, garrapatas, piojos, cucarachas-, ácaros araña manchados, moscas blancas de la hoja plateada, áfidos, saltamontes de hojas, tripsidas y hormigas, es de 10-5000 ppm; para garrapatas, 100-2500 ppm; generalmente, la cantidad total del aldehido o aldehidos, presentes en la fórmula, es de 2% o menos. Las fórmulas son eficaces sin el uso de otros antioxidantes, además de las propiedades antioxidantes inherentes de algunos aldehidos en particular, por ejemplo, el aldehido de coniferilo. Los alcoholes, como los glicoles con inclusión del glicol propilénico, tampoco son necesarios para que las fórmulas sean eficaces y, en realidad, pueden ser perjudiciales para la planta. La estabilidad de la fórmula puede ser evaluada mediante varios métodos, incluyendo pruebas aceleradas, en donde una fórmula de interés es expuesta a temperaturas elevadas durante un tiempo predeterminado. Se toman muestras de las fórmulas a intervalos regulares y se analizan químicamente utilizando métodos conocidos por aquellos expertos en la técnica, con el objeto de determinar la velocidad y la naturaleza de la degradación. Por ejemplo, el HCA puede ser analizado mediante cromatografía de gas-líquido (GLC), utilizando una columna capilar de polidimetilsiloxano, no polar, de 30 metros (por ejemplo, HP-1, Hewlett-Packard, o SPB- 1, Supelco) y un detector de ionización de llama (Comunicación Personal). Utilizando helio como gas portador (8 ml/min) y una temperatura de la columna de aproximadamente 240°C, el isómero (E)-cis (el componente, principal) tiene un tiempo de retención de aproximadamente 6.0 minutos, y el isómero (Z)-trans (el componente menor) tiene un tiempo de retención de aproximadamente 6.3 minutos. La cantidad más eficaz para las composiciones, incluyendo los compuestos de la fórmula (3) y/o de las fórmulas (4) o (5), así como la cantidad de otros compuestos de la fórmula (1) que puedan encontrar uso, puede ser determinada utilizando protocolos conocidos por aquellos expertos en la técnica, para evaluar la eficacia repelente de los compuestos. A continuación se presentan ejemplos de tales protocolos, los que también pueden utilizarse para optimizar cada fórmula para patógenos específicos, utilizando cualquiera de los compuestos comprendidos por la fórmula (1) o la (5), así como para aplicaciones específicas para reducir al mínimo la fitotoxicidad de la planta o la sensibilidad de ia piel u otros efectos secundarios para los animales, mientras se incrementa al máximo el efecto antipatógeno de la fórmula. En algunos casos, la eficacia de la fórmula puede ser incrementada añadiéndole uno o más componentes, por ejemplo, un compuesto distinto a aquel de la fórmula (1) o (5), donde se desee alterar los aspectos particulares de la misma. Por ejemplo, en ciertas aplicaciones en plantas, podría ser conveniente reducir el efecto de fitotoxicidad si ésta es considerable (con una clasificación de fitotoxicidad de dos o menos, prefiriéndose de uno o menos, véase más adelante), o aumentar el efecto repelente de la fórmula, o ambas cosas. Es preferible que el o los componentes adicionales reduzcan al mínimo cualquier efecto secundario para las plantas o los animales y, al mismo tiempo, aumenten el efecto repelente de la fórmula. De interés particular es el uso de uno o más componentes que sean sinérgicos, para aumentar la repelencia y reducir al mínimo cualquier efecto secundario relacionado con una fórmula en particular. El término "sinérgico" indica un componente que, en virtud de su presencia, aumenta el efecto deseado a un grado mayor que el de un efecto meramente aditivo. La concentración de uno o más de los otros ingredientes de la fórmula puede modificarse mientras se conservan o aumentan los efectos repelentes deseados de la fórmula. De interés especial, es el añadido de componentes a una fórmula para permitir una reducción en la concentración de uno o más de los otros ingredientes en una fórmula dada, mientras se mantiene substancialmente la eficacia de la fórmula. La combinación de tal componente con otros ingredientes de la fórmula, puede lograrse en uno o más pasos en cualquier etapa adecuada de la mezcla y/o aplicación de la composición. Entre los componentes adicionales preferidos se encuentran las saponinas, ya que pueden substituir a agentes tensoactivos como compuestos emulsificantes y, además, presentan un efecto promotor del crecimiento, al menos para algunas plantas, a las concentraciones utilizadas. Generalmente, el uso de saponina no interfiere con las propiedades repelentes de la fórmula. Las saponinas son una clase de compuestos, cada uno formado por una porción de sapogenina y una porción de azúcar.. La sapogenina puede ser un esteroide o un triterpeno, y la porción de azúcar puede ser glucosa, galactosa, una pentosa o una metilpentosa. S. Budavari, ed., The Merck Index, 11o. ed., Merck & Co., Inc., Rahway, N.J., 1990, página 1328. Las saponinas para utilizarse en la presente invención, pueden ser producidas y/o aisladas de varias parte de la planta, incluyendo el fruto, las hojas, las semillas y/o la raíz, utilizando los medios conocidos en la técnica, desde una diversidad de fuentes, incluyendo las varias plantas conocidas como productoras, las cuales comprenden desde la yuca, la quillaja, el agave, el tabaco, el orozuz, el frijol soya, el ginseng y el espárrago, hasta el palo de aloe. Las saponinas que deben utilizarse, en la presente invención, de preferencia son atóxicas para los seres humanos y los animales superiores. Con óptima preferencia, la saponina para utilizarse en la presente invención, es de grado alimenticio no tóxico, obteniéndose de plantas de yuca. Incluso las muy preferidas son las saponinas de Yucca schidigera o Y. valida, y sus equivalentes. Las saponinas generalmente se preparan mediante un procedimiento de extracción por prensado en frío y se utiliza en extracto del líquido resultante. También se puede usar la fibra de yuca que normalmente se seca al sol, se caliente y se apresta por tamizado Generalmente, una cantidad eficaz de saponina varía entre una solución acuosa al 0.01 y al 0.1 % , y muy preferiblemente alrededor del 0.01 % v/v de extracto de saponina 10° Brix. Se conocen varias saponinas relacionadas estructuralmente, siendo su característica estructural más variable el patrón de la glucosilación. Las saponinas también pueden contener modificaciones adicionales , tales como las sarasaponinas, que son saponinas con un esteroide enlazado, y la estructura de las saponinas puede ser modificada mediante cualquiera de los medios enzimáticos, químicos , y/o mecánicos conocidos en la técnica. Las saponinas de Yucca schidigera contienen saponinas esteroides, las principales sapogeninas siendo la sarasapogenina y la tigogenina. Al ser sometida a hidrólisis, la saraponina produce sarasaspogenina (sarasaspogenina 5-beta , 20-betaF, 22-delta F, 25-beta F ; también conocida como espirostan-3-beta-01 y parigenina) , glucosa y galactosa . La sarasaspogenina tiene una fórmula molecular de C27H 4O3. Nobel , Park S. , Aga ves, Oxford U niv. Press, N ueva York, 1994. Se conoce una variedad de saponinas estructuralmente relacionadas, cuya característica estructural más variable es el patrón de glucosilación . S. Budavari , ed . , The Merck Index, 1 1 o. ed. , Merck & Co. , Inc. , Rahway, N .J . , 1990, página 1328. Las saponinas también pueden contener modificaciones adicionales , como las sarasaponinas , que son saponinas con un esteroide enlazado, y la estructura de la saponina puede modificarse mediante cualquiera de los numerosos medios enzimáticos, qu ímicos y/o mecánicos conocidos en la técnica. Generalmente, una cantidad eficaz de r )_ saponina es de aproximadamente 0.01 a 3%, y muy preferiblemente de alrededor de 0.25% v/v en solución acuosa de extracto de saponina 10° Brix. El término 10° Brix es utilizado en la tecnología de la química del azúcar. Los grados Brix son iguales al porcentaje en peso del azúcar en la solución. Hawley, ed.,The Condensed Chemical Dictionary, 10o. ed.,Van Nostrand Reinhold, Nueva York, 1981, página 149. En las aplicaciones en donde la fórmula se vaya a utilizar para preparar el suelo u otro substrato de crecimiento para la siembre de plantas sensibles a patógenos específicos, particularmente donde el substrato de crecimiento ya esté infestado, las fórmulas de la presente invención pueden añadirse directamente a la rizósfera o al substrato, o pueden unirse a un soporte sólido o encapsularse en un material que las libere a tiempos programados para repeler los insectos indeseables y otras plagas. Cuando se utiliza un portador sólido, deben evitarse los materiales que puedan causar la oxidación de los aldehidos reactivos. Los ejemplos de sistemas de entrega que pueden utilizarse, incluyen almidón-dextran, y similares. Véase, Yuan y otros, Fundamental and Applied Toxicology (1993) 20:83-87, para obtener otros ejemplos de materiales apropiados. Además de los compuestos específicos de las fórmulas (1), (2), (3), (4) y (5), anteriores, los precursores de cualquiera de los compuestos que producen un compuesto de las fórmulas indicadas anteriormente, por acción de un sistema biológico de los precursores, se consideran como equivalentes a los compuestos de la invención. Por consiguiente, los compuestos precursores de partes o tejidos de plantas serían equivalentes a la práctica de la presente invención. La conversión biológica de compuestos precursores a aldehidos flavonoides se describe, por ejemplo, en la solicitud de patente de E.U.A. No. 5,149,715, y las referencias que en ellas se citan. Véase también Casey y Dobb Enzyme Microb. Technol. (1992) 14:739-747. El método de la presente invención se lleva a cabo introduciendo en la superficie, que interese, una cantidad de un agente repelente suficiente para repeler el insecto u otra plaga. Como alternativa, cuando la superficie de interés sea la piel, la capa, el pelo, la ropa y similares, la aplicación puede hacerse poniendo en contacto la superficie que interese con una forma que se ha vuelto sustantiva para la superficie de interés, de manera que la cantidad repelente de la fórmula permanezca en la superficie tratada, de ese modo, y sea liberada a una velocidad suficiente para repeler al insecto u otras plagas sensibles. Una fórmula que contenga el agente repelente, generalmente, se introduce mediante la aplicación tópica a una superficie. Por ejemplo, la fórmula es aplicada mediante aspersión, como una fórmula húmeda o seca a la superficie y/o al lado inferior de la superficie de interés, según se aplique. Entre las fórmulas adecuadas para aplicación se encuentran las aspersiones, barras y aceites o ungüentos repelentes. En algunos casos, la superficie de interés puede impregnarse con la fórmula repelente por absorción dentro de la superficie. Como alternativa, la fórmula puede aplicarse húmeda o seca a la rizósfera, donde puede evaporizarse cerca de las raíces y de los organismos patógenos asociados, que colonizan las raíces, a una velocidad suficiente para repeler a un insecto o plaga sensible. En algunos casos, puede introducirse aire dentro de la rizósfera para aumentar el procedimiento de vaporización. Para evitar la entrada de los insectos en el área, las composiciones de la presente invención pueden aplicarse a las superficies dentro y/o alrededor del área, por ejemplo, las composiciones pueden aplicarse a las puertas, ventanas y otras aberturas de un edificio, y/o a las superficies que rodean tales aberturas. Cuando la superficie de interés sea una planta o parte de una planta, la presencia del agente repelente puede ser el resultado de la aplicación tópica; por ejemplo, las composiciones pueden aplicarse en forma aérea a las cosechas, o por elaboración desde la planta huésped, como resultado de la modificación genética de la planta huésped. Los aldehidos aromáticos y alifáticos de esta invención, pueden prepararse mediante varios métodos sintéticos conocidos por aquellos expertos en la técnica. Por ejemplo, véase J. March, ed..Apéndice B, Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure, 2o. ed., McGraw-Hill, Nueva York, 1977. El cinamaldehído puede prepararse sintéticamente, por ejemplo, por la oxidación del alcohol cinamílico (Traynelis y otros, J.Am. Chem. Soc. [1964] 86:298), o por la condensación de estireno con formilmetilanilina (patente británica 504, 125) . Los aldehidos de que se trata también pueden obtenerse aislándolos de fuentes naturales. Por ejemplo, el cinamaldehído puede aislarse del hongo de podredumbre de madera, Stereum subpileatum. Birkinshaw y otros, Biochem. J. (1957) 66 : 188, y el aldeh ido a-hexilcinámico (HCA) puede obtenerse a partir del arroz, o sintetizarse como se describe en la patente de E. U .A. No. 5,055,621 . Un método preferido para producir un componente deseado de las fórmulas actuales , en una planta huésped , es por medio del ADN recombinante, especialmente modificando la concentración de por lo menos un compuesto de interés en la fórmula ( 1 ) , (2), (3) , (4) o (5) en los tejidos vegetales de interés, mediante la construcción de plantas transgénicas utilizando técnicas recombi nantes bien conocidas. Los métodos incluyen transformar una célula vegetal de interés con un cassette de expresión funcional en u na célula de la planta que comprenda como componentes vinculados operativamente en la dirección 5' a 3' de la transcripción , una región reguladora de la iniciación de la transcripción y translación , unida en la lectura del cuadro 5' a una secuencia de ADN que codifique y que sea capaz de modular la producción y/o sea requerida para producir el compuesto de interés, y las regiones de terminación de la translación y transcripción . La expresión de una enzima requerida para producir el compuesto de interés , provee lo necesario para un au mento en la producción del compuesto como resultado de las concentraciones alteradas de las enzimas que pa rticipan en la biosíntesis de los compuestos. De interés particular es el control selectivo del aldehido cinámico y/o de coniferilo y/o la producción de HCA en los tejidos vegetales tales como las hojas, raíces, frutos y semillas. Uno o más compuestos de las fórmulas de la presente pueden producirse modulando la expresión de uno o más genes, o de un gen codificador o más enzimas o un pasaje o grupo enzimático necesario para controlar la concentración del compuesto de interés en una planta, parte de planta, célula vegetal, tejido vegetal específico y/o asociado con una etapa particular del crecimiento de la planta. La enzima o enzimas pueden estar en un pasaje biosintético o en un pasaje de degradación y la regulación será creciente o decreciente, respectivamente; es decir, para modular la expresión de un gen vegetal indígena o endógeno, un gen vegetal indígena es uno que es nativo al genoma de la planta huésped. Un gen vegetal endógeno es uno que se encuentra presente en el genoma de la planta huésped que interesa, y que puede ser un gen indígena o un gen que está presente como resultado de infección de la planta (por ejemplo, un gen viral), o que se ha incorporado naturalmente de otra manera en el genoma de la planta. La planta huésped también puede ser modificada por medios recombinantes o mediante métodos de propagación de plantas tradicionales, para introducir uno o más genes exógenos a la planta huésped, que codifiquen enzimas que controlen la concentración del compuesto que interesen y/o que estén en el pasaje sintético para uno o más compuestos de las fórmulas (1), (2), (3), (4) o (5). El término "modulación de la expresión del gen" pretende indicar el control de la producción de un producto génico de interés a nivel de la transcripción , translación y/o postranslación . La concentración del compuesto de interés se controla modulando la expresión de uno o más genes endógenos o transgenes codificadores de una o más enzimas necesarias para sintetizar el compuesto de interés. Los métodos para la modulación de la expresión génica en plantas, son conocidos en el aire. La variación en las condiciones de crecimiento o la aplicación exógena de compuestos a una planta, puede afectar la expresión del gen. A nivel molecular, la expresión del gen depende substancialmente de las regiones de control de transcripción , translación y terminación , que regulan la expresión de una región codificadora de gen estructural . Al explotar las señales de la planta que regulan estas regiones de control o por la manipulación recombinante directa de las regiones de control, se pueden modular, por ejemplo, la expresión de un gen codificador de una enzima necesaria para controlar la concentración de aldeh ido cinámico . Para utilizar en un transgen proporcionado exógenamente a una planta huésped, el transgen incluirá regiones de control que se seleccionan y diseñan para lograr el tejido y/o concentración y programa deseados de expresión del gen . Según sea apropiado, las regiones de control pueden ser homologas (nativas) o no homologas (no nativas) al gen de interés . El término "homólogo" quiere dar a entender que la región o reg iones de control es o son de, o substancialmente semejantes a , una región de control normalmente asociada con el gen de interés. El término "no homólogo" quiere decir que la región o regiones de control se origina u originan de una fuente o secuencia diferente de nucleótidos o que es o son substancialmente diferentes de la región p regiones de control normalmente asociadas con el gen de interés. Por ejemplo, si la secuencia de codificación de la enzima es no homologa de origen en comparación con las regiones de control, para tener la expresión del gen en una célula de la planta de interés, se deben proveer regiones regulatorias de la iniciación o promotoras funcionales de la transcripción y translación de estas células de la planta, vinculadas operativamente con la secuencia de codificación. Las señales de iniciación de transcripción y translación funcionales en las células de las plantas comprenden las de los genes que están presentes en la planta huésped u otras especies de plantas y la expresión selectiva o constitutiva directa en una planta huésped. De interés particular son las regiones de control de los genes que regulan selectivamente la expresión génica estructural en una planta, parte de la planta, célula de la planta, tejido específico de la planta y/o asociada con una etapa en particular del crecimiento de la planta. Se prefieren las regiones de control que son conocidas en la técnica y, en particular, las regiones de control o promotoras de la transcripción que pueden ser utilizadas para modular la expresión de un gen que codifique una enzima requerida para controlar el nivel del componente de la fórmula (1), (2), (3), (4) y/o (5) en una planta, parte de la planta, célula de la planta o tejido específico de la planta y/o que esté asociada con una etapa en particular del crecimiento de la planta. Por ejemplo, los factores promotores que proporcionan patrones de expresión diferenciales en los frutos se describen en las patentes de E.U.A. No. 4,943,674 y 5,175,095; en la semilla, en la patente de E.U.A. No. 5,315,001, y en los tejidos de desarrollo rápido y los brotes tiernos en la patente de E.U.A. No. 5,177,011. Para el control selectivo de la biosíntesis del aldehido cinámico y/o el aldehido de coniferilo y/o el HCA en el tejido vegetal que interesa, las células de las plantas se transforman con un cassette de expresión que contenga ADN que codifica un gen estructural de una o más enzimas requeridas para sintetizar el aldehido cinámico y/o el aldehido de coniferilo y/o el HCA y capaz de aumentar la cantidad de estos aldehidos en el tejido de interés. De interés particular, son los genes que codifican una o más enzimas capaces de metabolizar un compuesto precursor requerido para la biosíntesis del aldehido cinámico y/o el aldehido de coniferilo y/o el HCA, a partir de los substratos que normalmente se encuentran en una célula de la planta, más particularmente la expresión transgénica de por lo menos un compuesto de la fórmula (1), (2), (3), (4) o (5). Se pueden preparar construcciones de ADN para expresar un gen que interese, que provean lo necesario para la integración del cassette de expresión en el genoma de una planta huésped. La integración puede llevarse a cabo utilizando sistemas de transformación conocidos en la técnica como Agrobacterium, electoporación o transformación de alta velocidad mediada por micropartículas. Dependiendo de la aplicación, la saponina o uno de los otros compuestos que interesen pueden expresarse preferencialmente en un tejido de interés y/o en una organela particular. El carácter específico tisular se logra utilizando regiones regulatorias de la transcripción que presentan el perfil de expresión deseado. La translocación de la enzima de una organela en particular, se logra utilizando u n péptido de translocación apropiado . Los métodos para la expresión específica de construcciones del ADN en tejidos y organelas han sido descritos y se conocen en la técnica. Para verificar la regulación y expresión del gen de interés, existen varias técnicas para determinar si las secuencias deseadas del ADN presentes en la célula de la planta son integradas en el genoma y si están siendo transcritas. Para detectar el AR N mensajero que codifica la enzima deseada pueden emplearse técnicas tales como el ensayo N orthen blot. La expresión puede detectarse demás mediante el ensayo de la actividad enzimática o el inmunoanálisis del producto proteico . Con preferencia óptima , el nivel del com puesto de interés presente en una planta huésped se mide utilizando métodos conocidos en la técnica . U n fenotipo deseado, por ejemplo, es aumentar el contenido de HCA en un tejido vegetal de interés medido mediante la expresión del gen de interés y/o la concentración de HCA presente en la planta h uésped en comparación con una planta testigo . Para la introducción de uno o más compuestos de las fórmulas de la presente en el organismo objetivo , una planta huésped que exprese un gen que codifique una enzima requerida para controlar el nivel del compuesto de interés da como resultado la exposición de un organismo objetivo a por lo menos un componente de la fórmula repelente . Por lo menos un componente de la fórmula repelente puede ser expresado por la planta huésped y, opcionalmente, otros componentes de la fórmula repelente son aplicados en forma exógena a la planta huésped de modo que la combinación evoque el efecto repelente deseado. Pueden prepararse plantas transgénicas que tienen mayor capacidad para acumular aldeh idos flavonoides, tales como cinamaldehído y aldeh ido de coniferilo y HCA , para proporcionar autoprotección contra las plagas vegetales o para ser utilizados como una fuente natural de aldehidos flavonoides para extracción y uso subsiguiente como un repelente. La acumulación de aldeh idos flavonoides puede lograrse mediante la regulación decreciente de la expresión de los genes específicos de la planta que codifican las enzimas que producen metabolismo adicional de los aldehidos deseados o desvían los productos metabólicos intermedios de los aldehidos deseados. En el caso del cinamaldehído, por ejemplo, esto incluye la regulación decreciente de la expresión de la cinamato 4-hidroxilasa (CA4H) y alcohol cinámico-deshidrogenasa (CAD). La CA4H ordinariamente desvía algún ácido cinámico del cinamaldeh ído para producir ácido p-coumárico , siendo éste un producto metabólico intermedio . La reducción de la actividad CA4H por sí sola no es suficiente para causar acumulación del cinamaldehído, porque el alcohol cinámico-deshidrogenasa puede convertir rápidamente el cinamaldehído en alcohol cinamílico, en cual entonces se incorpora en la lignina o se acumula en forma de glucósidos. La reducción simultánea de las actividades de CA4H y de CAD da como resultado un aumento del flujo metabólico del ácido cinámico a cinamaldehído y una reducción de la conversión del cinamaldehído en alcohol cinamílico. Algún cinamaldehído es incorporado en la lignina, pero el cinamaldehído (ya sea libre o en forma de glucósidos) también se acumula en concentraciones superiores a las normales, especialmente en las épocas en que la biosíntesis del ácido cinámico se encuentra elevada. Esto ocurre cuando el nivel de actividad de liasa amoniacal fenilalanínica (PAL; el primer paso y el paso limitante de la velocidad en el metabolismo general de los fenil propanoides), (Hahlbrock y Scheel, [1989], Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 40:347-369) es alto, una situación que se presenta naturalmente en las plantas en respuesta a una amplia variedad de estímulos, incluyendo la invasión por patógenos fúngicos y los daños mecánicos asociados con las heridas y la alimentación de los insectos. Se ha propuesto la actividad inhibidora CAD en plantas transgénicas como un método para reducir la síntesis de lignina en las plantas y, por consiguiente, mejorar la capacidad de digestión de las cosechas de forrajes (WO93/05159). Estos experimentos sugirieron que la biosíntesis de la lignina había sido alterada cualitativa, pero no necesariamente cuantitativamente, pero no demostraron ni pusieron en evidencia la conveniencia de acumular cinamaldehído como un método para aumentar la repelencia de los insectos y otras plagas. Varios genes CA4H y CAD de plantas han sido clonados y sus secuencias están disponibles en GenBank. Ciertas porciones de estos genes, que incluyen secuencias nucleótidas que se conservan entre diferentes especies vegetales, pueden utilizarse directamente en un vector de expresión vegetal (orientación antisentido o en sentido) para suprimir la expresión de los genes endógenos correspondientes (por ejemplo , Pear y otros, Antisense Res. and Develop. [1993] 3: 181 -190, Napoli y otros, The Plant Cell (1990) 2 :279-289) . Muy preferiblemente, estas secuencias conservadas de genes se utilizan para aislar clones ADNc de CA4H y CAD a partir de una biblioteca de ADNc de la especie vegetal que se va a modificar. Los clonos ADNc resultantes, o porciones de los mismos, se introducen entonces en un vector de expresión vegetal (antisentido o en sentido) y se utilizan para transformar la o las plantas que interesen . Las construcciones de ADN de acuerdo con la invención , preferiblemente comprenden una secuencia de al menos 50 bases que es homologa a los genes endógenos CA4H o CAD. Se puede obtener una molécula de ADN recombinante vinculando operativamente un vector con un segmento úti l de ADN para formar un plásm ido que pueda utilizarse para transformar la planta. Un vector capaz de dirigir la expresión de ARN desde una porción clonada de u n gen se conoce como un "vector de expresión".

Tales vectores de expresión contienen elementos de control de la expresión, con inclusión de un promotor. Los vectores típicos, que son útiles para la expresión de los genes en plantas avanzadas, son bien conocidos en la técnica e incluyen vectores derivados del plásmido Ti de Agrobacterium Tumefaciens descrito por Rogers y otros, Methods in Enzymology (1987) 153:253-277. Un promotor común, utilizado para proveer una expresión constitutiva potente de un gen introducido, es el virus del mosaico de la coliflor (CaMV), promotor 35 S (abastecedor, Pharmacia, Piscataway, NJ). Se pueden utilizar promotores constitutivos (como el CaMV 35S) o los inducibles o regulados por el desarrollo (como el promotor del gen PAL o de los genes endógenos CA4H o CAD). El uso de un promotor constitutivo tenderá a afectar las funciones en todas las partes de la planta, mientras que el de un promotor inducible o regulado por el desarrollo tiene la ventaja de que el ARN antisentido o en sentido solamente se produce en el tejido y bajo las condiciones en que se requiera. El uso de los promotores regulados por el desarrollo se prefiere en esta invención debido a que se sabe que la regulación decreciente de la biosíntesis del fenilpropanoide es capaz de causar efectos secundarios indeseables en el desarrollo de las plantas transgénicas que contienen un gen PAL heterólogo (Elkind y otros Proc. Nat. Acad. Sci. [1990] 87:9057-9061). Se dispone de varios métodos diferentes de transformación para la transformación de rutina de una amplia gama de especies vegetales. Uno que es especialmente eficiente para la transferencia del ADN a plantas dicotiledóneas implica el uso de Agrobacterium. En este método, el gen de interés se inserta entre los bordes de la región T-ADN que han sido unidos para formar un plásmido recombinante pequeño con un gen marcador que puede seleccionarse (por ejemplo, codificando neomicina fosfotransferasa II o fosfinotricina acetiltransferasa). El plásmido recombinante se introduce entonces en un huésped Agrobacterium mediante transformación o unión de tres progenitores. La cepa de Agrobacterium portadora del o de los genes que interesan, se utiliza entonces para transformar el tejido de la planta cultivando conjuntamente las bacterias con un tejido vegetal apropiado (por ejemplo, un disco de hoja). Las células transformadas se seleccionan en cultivo tisular, utilizando el agente apropiado de selección y las plantas se vuelven, entonces a generar (véase Horsch y otros [1985] Science 227 :1229- 1231). Otros métodos que se han utilizado en la transformación de células vegetales y, en particular, las plantas más recalcitrantes de cultivo, incluyen protocolos biolísticos y de electroporación (para obtener protocolos detallados, véase Sanford y otros, [1993] Methods in Enzymology 217:483-509, y Potter, [1993] Methods in Enzymology 217:461-478). Una vez que se han producido plantas transgénicas, se utilizaron los ensayos enzimáticos convencionales para CA4H y CAD para determinar el nivel de supresión de la actividad enzimática logrado en transformantes diversos. Es probable que sólo una fracción reducida de los transformantes producidos presente una actividad enzimática residual suficientemente baja como para ocasionar la acumulación de los aldehidos flavonoides sin producir también algún efecto secundario indeseable en el desarrollo de la planta. Por tal razón, un método preferido para producir los transformantes deseados con CA4H y CAD suprimidos, consiste en introducir los dos genes por separado en diferentes transformantes y después combinarlos mediante cruzamientos sexuales normales. Esto permite un número mayor de combinaciones de niveles de supresión de genes que se pueden evaluar al mismo tiempo. Una alternativa a la producción excesiva de aldehidos flavonoides en plantas transgénicas, consiste en utilizar los genes vegetales para conferir, a un huésped microbiano, la capacidad de sintetizar aldehidos flavonoides específicos. Los microbios resultantes pueden utilizarse para producir los aldehidos flavonoides en un sistema de fermentación o como sistema de entrega natural de los aldehidos flavonoides en preparaciones microbianas viables o no. Las levaduras, especialmente Sachoromyces cerevisiae, son los organismos preferidos para este fin, debido a que ya se han alterado para expresión de alto nivel de PAL (Faulkener y otros [1994] Gene 143:13020) y una cinamato 4-hidroxilasa vegetal ha demostrado funcionar en la levadura (Urban y otros [1994] Eur. J. Biochem. 222:843-850). La expresión de PAL introduce la capacidad de producir ácido cinámico a partir de fenilalanina. Se necesitan dos pasos enzimáticos adicionales para producir cinamaldehído a partir de fenilalanina. En las plantas, estos pasos son catalizados por las enzimas cinamato:CoAligasa (CL) y cinamoíl CoA reductasa (CCoAR). Pero, como la 4-coumarato CoA ligasa (4CL) también puede utilizar ácido cinámico como substancia (Knobloch y Hahlbrock [1977] Arch. Biochem. Biophys. 184:237-248), se puede utilizar 4CL en vez de CL. Más de 20 genes PAL clonados y más de 6 genes 4CL se han descrito con detalle suficiente (GenBank) como para facilitar su uso en la práctica de esta invención. Se obtiene un gen para CCoAR aplicando técnicas normales de clonado de genes para aislar un clon ADNc utilizando una secuencia de sonda derivada de la secuencia aminoácida del extremo terminal N, o fragmentos peptídicos, de la proteína purificada. CCoAR se ha purificado y caracterizado parcialmente a partir de cultivos de soya (Wengenmayer y otros [1976] Eur. J. Biochem., 65:529., 65:529-536; Luderitz y Grisebach [1981] Eur. J. Biochem. 119:115-124), savia cambial de abeto (luderitz y Grisebach, supra), xilema de álamo (Sarni y otros [1984] Eur. J. Biochem. 139:259-265) y xilema diferenciante de Eucalyptus gunnii (Goffner y otros [1994] Plant Physiol. 106:625-632). El método preferido de purificación es el de Goffner y otros (supra) porque da como resultado una sola banda proteica en los geles de poliacrilamida-SDS que pueden utilizarse para obtener las secuencias de proteínas. Los genes clonados se introducen en vectores normales de expresión y se utilizan para transformar un huésped microbiano, preferiblemente una levadura, utilizando técnicas normales de transformación, tales como electroporación (Becker y Guárante [1991] Methods in Enzymol. 194:182-187). Se utilizan ensayos enzimáticos normales para confirmar la expresión funcional de los genes alterados, y se utilizan ensayos para aldehidos flavonoides para seleccionar cepas con producción máxima. Ya que los aldehidos flavonoides tienen propiedades antimicrobianas, se prefiere utilizar vectores de expresión que causarán la expresión de los genes introducidos sólo tardíamente en el ciclo de crecimiento o como respuesta a un inductor químico. También puede ser deseable cultivar el huésped microbiano alterado en un reactor inmovilizado de célula entera (por ejemplo, Evans y otros [1987] Biotechnology and Bioengineering 30:1067-1072) para evitar que los aldehidos se acumulen en el medio de cultivo. Los insectos y otras plagas objetivo, incluyen los que son vectores para organismos patógenos, tales como hongos que colonizan una superficie de una parte de una planta, que es evocadora para el hongo. Por evocador se quiere dar a entender que la planta secreta elementos de nutrición necesarios para el hongo. Ejemplos de hongos y de las partes de plantas que colonizan, son los siguientes: mancha negra en la fruta; especies de Fusarium en las raíces y hojas de flores, y especies de Fusarium y Aspergillus en las raíces y las hojas. El Fusarium causa marchitamiento basculares de los vegetales y flores anuales, las plantas herbáceas ornamentales perennes, las cosechas de plantación y el árbol de la mimosa. Las diversas plantas son atacadas por formas o razas especiales de los hongos. Verticulum ( V. albo-atrium y V. dahlise) causan marchitamientos vasculares y colonizan las raíces, flores y hojas. Además los siguientes también representan organismos objetivo: especies de Phragmidium; Diplocaopan rosae; Sphaerotheca tannosa; Oibiapsis sicula; Phytophthora taraesitica; Phytophthora infestans, especies de Puccinia; especies de Alternarla; especies de Susaiun; Botrytis ciñera; Sclerotinia homoeocarca; Tricophyton mentagrophpytes; enfermedad del olmo holandés Ceratocystis ulmi) y marchitamiento del roble (C. fagacearum) . Ceratocystis causa marchitamientos vasculares, mayormente de los árboles. Además se incluyen algas azul verdosas (cianobacterias) . Los vectores para estas enfermedades, que pueden ser repelidas por las fórmulas de esta invención , incluyen los cascarudos y avispas. Los organismos objetivos también incluyen insectos que dañan las plantas que colonizan , especialmente de las órdenes Orthoptera; Thysanoptera, que incluye el gorgojo de agua y las tripsidas, y Homoptera, que incluye áfidos como el áfido de la podredumbre y el áfido de la hoja, los saltamontes de hoja, las moscas blancas, los gusanos harinosos, las tripsidas, las cigarras , los ciempiés , como los ciempiés aterciopelados, la polilla mimosa, el arrollador de hoja y los insectos de escamas. Otros organismos objetivo incluyen los arácnidos (particularmente las mosquitas araña) , las moscas (Musca domestica) , las cucarachas, los gastrópodos, las polillas y las chinches (Cimex lectularis) y sus parientes cerca nos (el gusano de aves de corral [Haematosiphon indorus Duges], el parásito de la paloma europea [Cimex columbarius Jerjus] y el parásito de las golondrinas [Oeciains vicarius Hrovath]). También de interés especial es la prevención de la infestación con filoxera en las uvas repeliendo el parásito. Para esta aplicación, es necesario poner la fórmula en las raíces de las plantas, que son el sitio usual para la filoxera. Cuando se utiliza en una forma sólida o microencapsulada, la posología utilizada es típicamente del orden de 1 a 35% con base en p/p, determinándose la carga máxima en función del material de envoltura seleccionado. Se utilizan técnicas químicas analíticas para determinar y optimizar la tasa de liberación. Para propósitos cualitativos, se pueden utilizar técnicas de CG para determinar la cantidad de aldehido liberado. Las muestras de producto encapsulado (granulado) se mezclan con los tipos de suelos seleccionados y se toman muestras a diversos intervalos para medir la liberación. Como alternativa, también pueden analizarse los gases volátiles liberados de la fórmula. Para medir la actividad de las aplicaciones por irrigación foliar y por goteo, también puede evaluarse la estabilidad de las fórmulas con el transcurso del tiempo, utilizando la metodología de CG y métodos conocidos por los expertos en la técnica. También pueden prepararse extracciones de metanol o alcohol de las fórmulas por análisis mediante CLAP. El método preferido para repeler filorexa y otras plagas localizadas en las raíces, sin embargo, consiste en proveer una respuesta sistémica, por ejemplo, a la aplicación foliar de la fórmula, que entonces se transloca a la raíz. El tiempo de dichas aplicaciones deberá determinarse empíricamente para cada tipo de plantas, ya que el flujo de agua desde las hojas hacia las raíces es necesario para lograr la translocación. En general, este flujo es mayor a las temperaturas más bajas, por ejemplo, durante las primeras horas de la noche, durante la noche o en las primeras horas de la mañana, y antes o después de desarrollarse el fruto o el vegetal. Las fórmulas de que se trata, en particular las que contienen HCA, también son útiles para tratar: uvas para repeler placas tales como tripsidas, nemátodos y arrolladores de hojas; rosas para repeler tripsidas y áfidos del melón; ganado bovino para repeler garrapatas blandas; el ser humano para repeler mosquitos; las manzanas para repeler polillas mimosas; los animales para repeler pulgas; los hábitats de las cucarachas para evitar o eliminar la infestación por cucarachas, y el maíz para repeler el áfido de las raíces. Además de tratar una planta huésped, las semillas también pueden ser tratadas utilizando las fórmulas correspondientes, para repeler insectos y otras plagas que atacan las semillas y/o que actúan como vectores para microorganismos patógenos. Las semillas pueden espolvorearse con la preparación en polvo (véase patente de E.U.A. 4,978,686 para los ejemplos de materiales inorgánicos a los cuales se pueden adsorber las fórmulas) o mezclarse en un substrato vegetal como la vermiculita. Las plántulas cultivadas bajo condiciones estériles a partir de semillas tratadas están libres de hongos e insectos sensibles. Además, las plántulas también pueden tratarse con las fórmulas de la presente. En ciertos casos puede ser necesario ajustar la fórmula de tratamiento con el fin de reducir cualquier fitotoxicidad asociada con el tratamiento, ya que es más probable que los brotes tiernos jóvenes exhiban síntomas fitotóxicos. Las fórmulas de tratamiento también son útiles para controlar el tiempo de polinización de las plantas en floración. Por ejemplo, para evitar o retrasar la polinización, las fórmulas se aplican en cantidad suficiente para repeler las abejas y otros insectos polinizantes. Al ajustar la residualidad de la fórmula se puede controlar la duración del intervalo de inhibición de la polinización. Por otra parte, en plantas en las cuales se necesita la polinización cruzada para la fertilización, se debe evitar la aplicación de la fórmula durante este período, si el insecto polinizante es repelido por la fórmula. Para poder determinar la sensibilidad de insectos específicos a la repelencia de las composiciones reclamadas, se utilizan pruebas in vitro e in vivo que comparan el comportamiento de la plaga de que se trata hacia, por ejemplo, acercarse al alimento de "cebo"en presencia y ausencia de la fórmula de prueba utilizada. La eficacia de la fórmula con el transcurso del tiempo, puede evaluarse extendiendo el intervalo de la observación hasta que algunos de los insectos de prueba (menos de aproximadamente un 50%) sean repelidos de la proximidad del cebo. Para los insectos vectores patógenos, normalmente es necesario una repelencia mayor que un 90%. Para la plaga molesta común, es adecuada una reducción en la magnitud del 80% (por ejemplo, en las áreas del jardín y donde hay alimentos). Las fórmulas también se necesitan para evaluar por fitotoxicidad para el uso en plantas y por sensibilidad dérmica, especialmente cuando se utilizan en la piel y/o la ropa del ser humano; se vigila el desarrollo de dermatitis . por contacto y sensibilidad olfatoria utilizando pruebas para la sensibilidad dérmica conocidas por los expertos en la técnica. Del mismo modo, las pruebas de fitotoxicidad pueden realizarse utilizando métodos conocidos por los versados en la técnica. La fitotoxicidad puede clasificarse como sigue, en orden de severidad creciente de la toxicidad: 0-plantas sin síntomas; 1-emparduscamiento muy leve del hipocotilo (sin otros síntomas); 2-algún marchitamiento de la planta, muerte de las hojas inferiores, algún emparduscamiento del sistema vascular; 3-marchitamiento de toda la planta, hojas moribundas, hipocotilo con síntomas externos e internos; 4-necrosis del tallo, planta moribunda. Se prefiere que la fórmula tenga una clasificación de fitotoxicidad de 2 o menos; de preferencia, 1 o menos. Los componentes de una fórmula que se va a utilizar para una aplicación en particular, pueden determinarse evaluando en primer lugar los límites de concentración sobre los cuales un componente dado carece de actividad hasta aquellos que ofrecen el máximo de actividad (una curva de respuesta a la dosis) y luego evaluar este componente por separado y en combinación con otros componentes de interés para una formulada dada. Los efectos repelentes y/o fitotóxicos y/o dérmicos de una fórmula en particular, en un insecto dado o en otra plaga y el huésped, se miden entonces para cada fórmula y componente con o sin un diluyente en serie de cualquier componente adicional que interese. Los rangos posológicos opcionales se calculan in vitro e in vivo utilizando técnicas conocidas por los expertos en la materia. Se identifican fórmulas que proporcionen: repelencia del 90% y/o una clasificación de fitotoxicidad de 2 o menos para las plantas, la clasificación óptima siendo de 1 o menos, y substancialmente libre de dermatitis por contacto para los animales y las aves. Los ejemplos siguientes se ofrecen como ilustración y no pretenden presentar limitaciones.

EJEMPLOS Se utilizaron los siguientes productos en los protocolos de los ejemplos dados a continuación: (1) aldehido cinámico de Spectrum Chemical Co., Nueva Jersey, E.U.A.; (2) aldehido de coniferilo de ADIN Chemical Co., VF; (3) bicarbonato de sodio y Tween 80 de Spectrum Chemical Co., Nueva Jersey, E.U.A.

EJEMPLO 1 Moscas (Musca domestica) El propósito de este experimento fue evaluar la actividad repelente del aldehido cinámico y el aldehido a-hexilcinámico contra moscas (Musca domestica). Se ponen en libertad 20 moscas hembras de 2-3 días de vida en una jaula de 62 x 62 x 34 cm, con techo de tejido de alambre de malla 325, para permitir la circulación del aire (Carolina Biological Supplies). Se preparó un cebo con leche dulce (Carnation) (90%) más glucosa (10%) y un colorante (azul de bromofenol al 0.01%), colocando 1 ml de la fórmula en una caja de petri de 3.5 cm, que se dejó dentro de una jaula de pino (Carolina Biological Supplies), practicando un agujero con un diámetro de 1 cm a través de su parte superior para permitir el acceso a la jaula que contiene el cebo. Se coloca una caja de petri de 3.5 cm para agua, con 5 ml de H2O, en la jaula. Después de 24 horas, se retiran las moscas y se aplastan sobre papel de filtro para verificar la presencia de colorante, lo que indicaría la actividad de alimentación. La entrada del más del 10% de las moscas se toma como una indicación de la falta de actividad repelente de la fórmula.

EJEMPLO 2 Cucarachas (Blatella germanic) El propósito de este experimento fue evaluar la actividad repelente de la fórmula del aldehido cinámico contra las cucarachas (Blatella germanic). Se liberan 50 ninfas y adultos con una longitud de 1.5 a 3.5 cm, en una jaula de 62 x 62 x 34 cm, con un techo de tejido de alambre de malla 325 para permitir la circulación de aire. La superficie interior de las paredes de la jaula, desde los 5 a los 10 cm del piso, se tratan con una mezcla de aceite mineral y jalea de petróleo (2:3), para evitar que las cucarachas escapen. Los insectos se alimentan con comida para perros (Purina), leche en polvo y agua durante 48 horas para aclimatarlos. Se doblan dos veces dos papeles de filtro Whatman "C" (4 x 4 cm) y se engrapan y humedecen con 1 ml de la fórmula. Se permite que los papeles de filtro se sequen al aire. Después de secarse al aire, el papel de filtro se coloca dentro de uno de dos cubos de 4 x 4 x 4 cm, cada uno con una puerta individual de 0.75 cm a nivel del piso (base) para permitir la entrada. Los dos cubos de albergue se colocan en el piso de la jaula con una separación de 14 cm entre sí. Al cabo de 24 horas, los cubos de albergue se retiran y se extraen y se cuentan las cucarachas albergadas. Una entrada de más del 10% de las cucarachas en los cubos de albergue se considera como una indicación de pérdida de la repelencia de la fórmula.

EJEMPLO 3 Afidos (Aphid fabae) El propósito de este experimento es determinar la actividad repelente de una fórmula de aldehido cinámico contra los áfidos de frijoles negros. Se cultivan plantas de remolachas azucareras (Beta vulgaris) en recipientes de 7.5 mm con tierra de cultivo, en un invernadero. Cuando las plantas presenten 3 hojas, se seleccionan 8 plantas al azar. En estudios separados, se tratan cuatro plantas con aldehido cinámico a 50 ppm; 50 ppm de fórmula de aldehido cinámico (NaHCO3+Tween 80); NaHCO3; Tween 80, y blanco de fórmula. El tratamiento es una aplicación foliar de 5 ml de material rociado como una niebla fina con un aspersor manual (Gilmour). Cuatro plantas de dejan sin tratar y una se rocía solamente con agua. Las plantas tratadas y no tratadas se colocan en dos hileras, A o B, tratadas o no tratadas, respectivamente, en una caja de jaula de 60 x 60 x 30 cm con un techo de tejido de alambre de malla 325 para permitir la circulación de aire. A las 4, 8 y 24 horas se cuenta y se registra el número de áfidos en las plantas tratadas y no tratadas, hileras A y B.

EJEMPLO 4 Mosca blanca de la hoja plateada ITetranychus urticae) El propósito de este experimento es determinar la actividad repelente del aldehido cinámico contra la mosca blanca de la hoja plateada. En un invernadero, se cultivan plantas de algodón en recipientes de 7.5 mm con tierra de cultivo. Cuando las plantas muestras tres hojas, se seleccionan ocho plantas al azar. En investigaciones separadas, se tratan cuatro plantas con aldehido cinámico a 50 ppm; 50 ppm de la fórmula de aldehido cinámico (NaHCO3+Tween 80); NaHCO3; Tween 80, y blanco de fórmula. El tratamiento es una aplicación foliar de 5 ml del material rociado como una niebla fina con un rociador manual (Gilmour). Cuatro plantas no tratadas reciben un rociado foliar con 5 ml de agua. Las plantas tratadas y no tratadas se colocan en dos hileras, A o B, tratadas y no tratadas, respectivamente, en una caja de jaula de 60 x 60 x 30 cm con un techo de tejido de alambre de malla 325 para permitir la circulación del aire. A las 4, 8 y 24 horas se cuenta el número de las moscas blancas de hojas plateadas presentes en las plantas de las hileras A y B (tratadas y no tratadas). A las 48 horas se cuenta y se anota el número de huevos en las plantas de cada hilera.

EJEMPLO 5 Saltamontes de hojas (Cicadellidae) El propósito de este experimento es determinar la actividad repelente del aldehido cinámico contra saltamontes de hojas. En un invernadero, se cultivan plantas de algodón en recipientes de 7.5 mm con tierra de cultivo. Cuando las plantas muestras tres hojas, se seleccionan ocho plantas al azar. En investigaciones separadas, se tratan cuatro plantas con aldehido cinámico a 50 ppm; 50 ppm de la fórmula de aldehido cinámico (NaHCO3+Tween 80); NaHCO3; Tween 80, y blanco de fórmula. El tratamiento es una aplicación foliar de 5 ml del material rociado como una niebla fina con un rociador manual (Gilmour). Cuatro plantas no tratadas reciben un rociado foliar con 5 ml de H2O. Las plantas tratadas y no tratadas se colocan en dos hileras, A o B, tratadas y no tratadas, respectivamente, en una caja de jaula de 60 x 60 x 30 cm con un techo de tejido de alambre de malla 325 para permitir la circulación del aire. A las 4, 8 y 24 horas se cuenta el número de saltamontes de hojas presentes en las plantas de las hileras A y B (tratadas y no tratadas). A las 48 horas se cuenta y se anota el número de huevos en las plantas de cada hilera.

EJEMPLO 6 Tripsida ( Thysanoptera) El propósito de este experimento es determinar la actividad repelente del aldeh ido cinámico contra la tripsida. En un invernadero, se cultivan plantas de algodón en recipientes de 7.5 mm con tierra de cultivo. Cuando las plantas muestras tres hojas, se seleccionan ocho plantas al azar. En investigaciones separadas , se tratan cuatro plantas con aldehido cinámico a 50 ppm ; 50 ppm de la fórmula de aldehido cinámico (NaHCO3+Tween 80); NaHCO3; Tween 80 , y blanco de fórmula . El tratamiento es una aplicación foliar de 5 ml del material rociado como una n iebla fina con un rociador manual (Gilmour) . Cuatro plantas no tratadas reciben un rociado foliar con 5 ml de agua. Las plantas tratadas y no tratadas se colocan en dos hileras, A o B, tratadas y no tratadas, respectivamente, en una caja de jaula de 60 x 60 x 30 cm con un techo de tejido de alambre de malla 325 para permitir la circulación del aire. A las 4 , 8 y 24 horas se cuenta el número de tripsidas en las plantas de las hileras A y B (tratadas y no tratadas) . A las 48 horas se cuenta y se anota el número de huevos (en hendiduras de las hojas) en las plantas de cada hilera.

EJEMPLO 7 Acaro araña manchado {Tetranychus urticae) El propósito de este experimento es determinar la actividad repelente del aldehido cinámico contra acaro araña manchado. En un invernadero, se cultivan plantas de algodón en recipientes de 7.5 mm con tierra de cultivo. Cuando las plantas muestras tres hojas, se seleccionan ocho plantas al azar. En investigaciones separadas, se tratan cuatro plantas con aldehido cinámico a 50 ppm; 50 ppm de la fórmula de aldehido cinámico (NaHCO3+Tween 80); NaHCO3; Tween 80, y blanco de fórmula. El tratamiento es una aplicación foliar de 5 ml del material rociado como una niebla fina con un rociador manual (Gilmour). Cuatro plantas no tratadas reciben un rociado foliar con 5 ml de agua. Las plantas tratadas y no tratadas se colocan en dos hileras, A o B, tratadas y no tratadas, respectivamente, en una caja de jaula de 60 x 60 x 30 cm con un techo de tejido de alambre de malla 325 para permitir la circulación del aire. A las 4, 8 y 24 horas se cuenta el número de ácaros araña manchados presentes en las plantas de las hileras A y B (tratadas y no tratadas). A las 48 horas se cuenta y se anota el número de huevos en las plantas de cada hilera.

EJEMPLO 8 Mosquito ÍAedes Aegypti) Procedimiento de la prueba de repelencia in vitro El propósito de este experimento es evaluar la repelencia del aldeh ido cinámico contra los mosquitos. Se introducen 20 mosquitos hembras adultas de aproximadamente 4 días de vida, en cámaras de prueba. Se transfiere con pipeta, 4 ml de una fórmula de prueba en un círculo de papel filtro Whatman No. 2 , y se seca al aire. El papel filtro tratado se coloca en la entrada de ventilación de la cámara. Se burbujea CO2 a través del agua en el extremo de la entrada de ventilación de una cámara olfatométrica de túnel de viento; se utiliza el ajuste más lento de rpm de un ventilador. Se abre la cámara de trampa durante 5 minutos y luego se cierra y se cuenta y se registra al número de mosquitos. Como control positivo se utiliza DEET al 23% .

Procedimiento de la prueba de repelencia. Estudio de campo El propósito de este experimento es bioanalizar la actividad del aldehido cinámico como un repelente de mosquitos. Se cortaron dos círculos con un diámetro de 18 cm, y dos con un diámetro de 16 cm , de un rollo de material de tejido de nylon para atrapar mosquitos, de malla de 1 mm . El círculo de tratamiento (16 cm) se remojó en 1 ml de fórmula: aldehido cinámico (2%) en Tween 80 al 2% y NaHCO3, después de lo cual se dejó secar al aire durante 2 horas. Se introdujeron 10 mosquitos hembras Aedes aegypti en ayunas (de 5-7 días de vida) , obtenidas del Centro Agrícola Kearney, Laboratorio de Investigaciones para el Control de Mosquitos, en cada uno de dos cartones Kearney (Fischer) de una pinta para mosquitos (cartón testigo y de tratamiento) . Cada cartón se cubrió con uno de los círculos de malla de 18 cm y se selló con un reborde del cartón de una pinta, el cual se había retirado de la tapa. Un voluntario hombre colocó el círculo tratado de 16 mm sobre una de sus piernas (que se había lavado y enjuagado con agua y jabón) y el círculo de 16 mm no tratado en la otra pierna (que se había lavado y enjuagado con agua y jabón), Los cartones de una pinta de mosquitos se colocaron en contacto estrecho del lado de la malla con el lado de la malla sobre los parches de la pierna durante 5 minutos. Los mosq uitos no entraron en contacto directo con el compuesto. Después de 5 minutos, se contó el número de insectos bien alimentados de cada 10. Los resultados se presentan en el Cuadro I , a contin uación. Del total de 30 insectos evaluados, solamente dos no fueron repelidos por la fórmula de ácido cinámico, en comparación con 19 en el grupo testigo (no tratado) .

CUADRO I Repelencia de Mosquitos (No. de insectos bien alimentados/10 insectos) Estudio 1 Estudio 2 Estudio 3 Suma Fórmula de aldehido 0/10 2/10 0/10 2/30 cinámico1 Testigo (no tratado) 5/10 7/10 7/10 19/30 1 Aldehido cinámico (2%) con 2% de Tween 80 y 6% de NaHCO3 en H2O.

Se utiliza un protocolo similar al descrito anteriormente para probar el aldehido a-hexilcinámico.

EJEMPLO 9 Repelencia de Lepidooteran ovipositional El propósito de este experimento es determinar la repelencia del aldehido cinámico contra los gusanos adultos de polillas remolacheras. Se construye un dispositivo que fuerza una corriente de aire sobre plantas tratadas y no tratadas en recipientes, en una caja de vuelo. Se tratan 5 plantas de tomate en el momento en el que desarrollan 3 hojas, con 5 ml de diversas concentraciones de la fórmula química y sus componentes, y se colocan en la jaula. Cinco plantas de tomate se rocían con 5 ml de H2O como plantas testigos y se colocan en la jaula. Se liberan 40 gusanos adultos remolacheros ponedores de huevos (Spodoptera Exigna) en la jaula . Se pone en marcha el ventilador de evacuación de aire en el aparato y se permite que una corriente lineal de aire, de baja velocidad , fluya a través de la jaula como plumajos de aire evaporando la fórmula química. Después de 24 horas, se determina la postura de huevos en las plantas tratadas, en ias no tratadas, y en las paredes de la jaula.

EJEMPLO 10 Filoxera - Prueba del vapor para repelencia El propósito de este experimento es evaluar la repelencia del vapor de aldehido cinámico a la filoxera. Se colocan trozos de raíces de plantas con huevos viables de filoxera (n-30) en placas de 50 x 9 mm , q ue han sido tratadas en sus superficies internas con 400 ml de un producto de concentración conocida. El agente qu ímico no se coloca directamente en la raíz, ya que la absorción o el metabolismo de la raíz no es un factor. Las placas se tapan y se sellan con cinta. Al término de 7 días, las placas se abren, y se determina si los insectos pueden establecerse y desarrollarse en las ra íces , o si los insectos recién salidos del huevo evitan las raíces y m ueren .

EJEMPLO 1 1 Superproducción de aldehidos flavonoides en plantas trans énicas Se preparan 20 µg de ARN poliA y se sintetiza ADNc. Parte de esto se clona en el vector lambda-ZAP I I (un vector de clonación comercialmente disponible). Se seleccionan por lo menos 500,000 recombinantes utilizando una sonda oligonucleótida diseñada a partir de secuencias conservadas de genes clonados CA4H y CAD obtenidos de Gen Bank, o diseñada a partir de la secuencia peptídica de proteína purificada proveniente de la planta huésped prevista. Se seleccionan clonos potentemente hibridantes y se utilizan para volver a seleccionar la biblioteca ADNc. Los clonos resultantes se secuencian para permitir la introducción de secuencias apropiadas de genes en un cassette de expresión de plantas en orientación antisentido o en sentido. Las construcciones antisentido y en sentido se introducen en Agrobacterium tumefaciens LBA4404 por transformación directa siguiendo los procedimientos publicados . Se transforman discos de hojas de tabaco (N. tabacum, variedad Samsun) utilizando procedimientos publicados bien establecidos (Horsch y otros [1985] Science 227: 1229- 1231 ) . Se identifican las plantas que contienen construcciones CA4H o CAD mediante PCR y se seleccionan para análisis posterior. Se utiliza material de plantas testigos transformadas y no transformadas para determinaciones de la actividad enzimática CA4 H y CAD utilizando análisis publicados bien establecidos. Las plantas en donde la actividad de CA4H o CAD se ha reducido a menos del 20% de la actividad observada en plantas testigos, se seleccionan para análisis posterior. Las plantas seleccionadas con baja actividad de CA4H se cruzan con plantas con baja actividad de CAD, y la progenie que herede ambas construcciones genéticas se selecciona mediante PCR. Las plantas con actividad CA4H suprimida y CAD suprimida, se analizan por producción de aldehido flavonoide, utilizando los procedimientos publicados normales. Las que producen aldehidos flavonoides se analizan entonces por eficacia para repeler insectos u otras plagas utilizando cualquier ejemplo apropiado, por ejemplo, el Ejemplo 3, para analizar plantas de algodón transgénicas para su capacidad de repeler ácidos.

EJEMPLO 12 Producción de a ldehidos flavonoides en sistemas microbianos Se genera una biblioteca de AD Nc utilizando ARN extraído de tallos de tabaco de 6 semanas . Se preparan 20 µg de ARN poliA y se sintetiza ADNc. Parte de esto se clona en el vector lambda-ZAP I I (un vector de clonación comercialmente disponible) . Se seleccionan por lo menos 500,000 recombinantes utilizando una sonda oligonucleótida diseñada a partir de secuencias de secuencia peptídica de proteína CCoAR pu rificada proveniente del tejido de tallos de tabaco de 6 semanas , utilizando el protocolo de Goffner y otros (1994) Plant Physiol. 106:625. Se seleccionan clonos potentemente hibridantes y se utilizan para volver a seleccionar la biblioteca ADNc. Los clonos resultantes son secuenciados para permitir la identificación de insertos de ADNc de longitud completa y la introducción de secuencias de gen CCoAR apropiadas en el vector de expresión de levadura pMTL81 10 (Faulkner y otros [1994] Gene 143: 13-20) . Las secuencias codificadoras para liasa amoniacal fenilalanínica (PAL; Gen Bank locus RH DPAL) de Rhodosporidium toruloides y una 4-coumarato :CoAI ligasa de perejil (4CL; GenBank locus PC4CL1 AA) , se introducen de modo similar en factores de expresión de levaduras equivalentes. Las construcciones PAL, 4C L y CCoAR se utilizan para transformar las cepas de Saccharomyces cerevisiae por electoporación utilizando procedimientos publicados establecidos (Becker y Guarente, Methods in Enzymology 194: 182-187, 1991 ; Simón [1993] Methods in Enzymol 217: 478-483) . Se seleccionan transformantes en medio mínimo carente de leucina. Las cepas transformantes portadoras de las tres construcciones génicas se identifican con PCR y se seleccionan para análisis posterior. Los extractos de cepas testigos transformadas y no transformadas se utilizan para hacer determinaciones de actividades enzimáticas de PAL, 4CL y CCoAR, utilizando pruebas publicadas bien establecidas. Las cepas en las cuales la actividad de PAL, 4C L y CCoAR es significativamente mayor que la actividad de fondo detectada en las cepas testigo, se seleccionan para análisis posterior. Las cepas seleccionadas se analizan para la producción de aldehido flavonoide, utilizando procedimientos publicados normales y las que producen cantidades significativas de cinamaldehído se seleccionan para la optimización de las condiciones de fermentación. Los productos resultantes se analizan entonces para su eficacia en repeler insectos y otras pruebas utilizando cualquiera de los métodos descritos .

EJEMPLO 13 Actividad de HCA como repelente de insectos El propósito de este experimento es determinar si el aldehido a-hexilcinámico es un repelente eficaz de insectos. Después de pruebas negativas de irritación cutánea realizadas en conejos en la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos (FDA) , se evaluó el HCA en la piel de 2 a 4 sujetos h umanos varones. Se frotó 1 ml del compuesto sobre un antebrazo. Se utilizó un guante para proteger la mano sin tratar, mientras el antebrazo tratado se exponía en una jaula que contenía un número elevado (2 , 000-4, 000) de mosquitos no alimentados, durante 3 minutos, a i ntervalos de aproximadamente 30 minutos hasta haberse recibido dos picaduras (dos picaduras en un período de análisis o una picadura en cada uno de dos períodos consecutivos de análisis) . El período entre la aplicación y el momento en que se recibieron dos picaduras, se defin ió como el "tiem po de protección". El HCA se definió como 3 ( 121 - 180 mi nutos de duración) contra el mosquito de la fiebre amarilla (Aedes aegypti [L]), y como 2 (31 a 60 minutos de duración) contra el mosquito del paludismo (Anopheles quadrimaculatus Say). El HCA también fue evaluado en la ropa tratada contra el mosquito de la fiebre amarilla. En estas pruebas se utilizaron medias de algodón mercerizado de mujer. Una sección medida por encima del tobillo se impregnó con HCA a una tasa equivalente a 3.3 g/pie cuadrado. La media se colocó sobre una rejilla para secarse y luego se colgó en una línea bajo techo. Las primeras pruebas se hicieron 24 horas después del tratamiento. La media se estiró sobre el brazo, colocando la porción tratada a mitad del antebrazo. La mano no tratada se protegió con un guante y el brazo cubierto con la media se expuso durante un minuto en una jaula de prueba. Si se recibían 5 picaduras, el tratamiento se consideraba ineficaz. Si se recibían menos de 5 picaduras, las exposiciones se continuaban diariamente hasta el día 14 y a intervalos semanales o bisemanales, posteriormente. El HCA recibió una clasificación de 4 en esta prueba (eficaz por más de 10 días), el mismo valor comunicado para DEET. Estos ejemplos demuestran que las fórmulas de la presente, el aldehido cinámico y el aldehido a-hexilcinámico, son repelentes eficaces contra los mosquitos. Todas las publicaciones y solicitudes de patentes mencionadas en esta especificación, indican el nivel de aptitud de las personas expertas en la técnica. Todas las publicaciones y solicitudes de patentes se incorporan aquí por referencia, en la misma medida que si se indicara específica e individualmente que cada publicación o solicitud de patente individual fuera incorporada por referencia. Ahora que la invención ha sido totalmente descrita, será evidente que los expertos en la técnica pueden hacer muchos cambios y modificaciones sin apartarse del espíritu o del alcance de las reivindicaciones anexas.

Claims (9)

REIVINDICACIONES

1.- Una composición para repeler plagas, dicha composición repelente comprende por lo menos un aldehido flavonoide a una concentración suficiente para proveer un aroma, el cual repele plagas, en donde dicha concentración es de 10-5,000 ppm de la composición total.

2.- La composición de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho aldehido flavonoide es aldehido cinámico, aldehido a-hexilcinámico, y/o aldehido de coniferilo.

3.- La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1,2 y 19, en donde dicha composición comprende además saponina.

4.- Un método para repeler plagas, v.gr., insectos, desde la cercanía del cuerpo de un mamífero; dicho método comprende la aplicación tópica de una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-2, 3, y 17-19, en una cantidad que no ocasiona irritación dérmica.

5.- El método de acuerdo con la reivindicación 4, en donde dicha composición está en una forma que se selecciona del grupo que consiste de una aspersión, una barra, un aceite repelente y un ungüento.

6.- El método de acuerdo con la reivindicación 4 o reivindicación 5, en donde dicho mamífero se selecciona del grupo que consiste de un ser humano, un bovino, y un ovino 7 - El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4-6, en donde dicho mamífero es un ser humano y dichas plagas son pulgas o mosquitos. 8.- El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4-6, en donde dicho mamífero es un bovino y dichas plagas son garrapatas blandas. 9 - Un método para repeler plagas de la cercanía de una planta, dicho método comprende la aplicación de una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-2, 3, y 17-19, en donde dicha planta se selecciona del grupo que consiste de uvas, rosas, manzanas y maíz, dicha composición tiene una fitotoxicidad que varía de dos o menos. 10.- El método de acuerdo con la reivindicación 9, en donde dicha planta es una planta de uvas y dichas plagas se seleccionan del grupo que consiste de tripsidas, nemátodos filorexa y arrolladores de hojas. 11.- El método de acuerdo con la reivindicación 9, en donde dicha planta es una planta de rosa y dichas plagas son tripsidas o áfidos del melón. 12.- El método de acuerdo con la reivindicación 9, en donde dicha planta es un manzano y dichas plagas son polillas mimosas. 13.- El método de acuerdo con la reivindicación 9, en donde dicha planta es una planta de maíz y dichas plagas son áfidos de la raíz. 14.- Un método para evitar el ingreso de insectos a un área a través de la aplicación de una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-2, 4, y 17-19 a la cercanía de dicho ingreso. 15.- El método de acuerdo con la reivindicación 14, en donde dichos insectos son cucarachas. 16.- Un método para evitar las infestaciones de un árbol por parte de las plagas, dicho método comprende: el contacto del tronco de dicho árbol con una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-2, 3, y 17-20. 1

7.- Una composición para repeler plagas, dicha composición repelente comprende saponina y por lo menos un aldehido flavonoide a una concentración suficiente para proveer un aroma que repele las plagas. 1

8.- Una composición de acuerdo con la reivindicación 17, en donde dicho aldehido flavonoide se selecciona del grupo que consiste de aldehido cinámico, aldehido a-hexilcinámico, y aldehido de coniferilo. 1

9.- Una composición para repeler plagas, dicha composición comprende por lo menos un aldehido a-hexilcinámico y un aldehido de coniferilo, a una concentración suficiente para proveer un aroma que repele las plagas. 20.- Un método para evitar infestaciones de un árbol por parte de las plagas, dicho método comprende: el contacto del tronco de dicho árbol con una composición que comprende por lo menos un aldehido flavonoide a una concentración suficiente para proveer un aroma que repele las plagas.