MXPA97004225A - Fragmentos de anticuerpos monoclonales que tienenactividad inmunosupresora - Google Patents

Abstract

La invención consta de fragmentos mAb monovalentes (Fab) De mAb que tienen la capacidad de reducir la sensibilidad de la expresión del HLA-DR en células presentadoras del antígeno. Los fragmentos Fab pueden reducir la sensibilidad de dicha expresión del HLA-DR sin la citotoxicidad del mAb madre o de los fragmentos bivalentes (F(ab)'2) del mAb. Los fragmentos Fab de la invención son por lo tanto potentes compuestos inmunosupresores específicos para el MHC de clase II, sin efectos citotóxicos colaterales.

Description

FRAGMENTOS DE ANTICUERPOS MONOCLONALES QUE TIENEN ACTIVIDAD INMUNOSUPRESORA Las moléculas del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) de clase II se unen a fragmentos de péptido antigénicos y los expone a las células T (células "Th") cooperadoras (CD4+) (ref. 1) . Se ha demostrado que los anticuerpos monoclonales ( Ab) específicos para las moléculas de MHC de clase II son inhibidores selectivos extremadamente potentes de las respuestas de las células Th in vitro (ref. 2) . Desde su descubrimiento han sido considerados como potenciales fármacos para el tratamiento inmunosupresor selectivo de trastornos autoinmunes, como la artritis reumatoide. Inicialmente, los estudios in vivo demostraron la influencia benéfica de estos mAbs sobre las respuestas hétero- y autoinmunes inducidas por las células Th (Refs. 3-6). Sin embargo, en algunos casos, la aplicación experimental in vivo de los mAbs específicos para el MHC de clase II se asoció con complicaciones inesperadas dando como resultado la muerte de primates de laboratorio (refs. 7, 8) . La última observación anuló el interés de estudios posteriores de inmunomodulación por mAbs específicos del MHC. Una reciente publicación ha descrito que una REF: 24428 reducción de diez veces la expresión del MHC de clase II en ratones transgénicos ocasiona la insensibilidad de las células Th debido a la presentación ineficaz del antigeno (ref. 19) . Esto demuestra que la reducción de la expresión del MHC de clase II se corresponde con la inmunosupresión en un modelo in vivo. De acuerdo con la invención, se ha descubierto sorprendentemente que los fragmentos de mAb monovalentes (Fab) de un mAb que tenga la capacidad de reducir la sensibilidad de la expresión del HLA-DR pueden ellos mismos reducir la sensibilidad de dicha expresión del HLA-DR sin la citotoxicidad del propio mAb o de los fragmentos bivalentes (F(ab)'2) de dicho mAb. Los fragmentos Fab de la invención son por lo tanto potentes compuestos inmunosupresores específicos del MHC de clase II, sin efectos citotóxicos colaterales . Antes de describir la presente invención en términos más específicos se da a continuación una breve descripción de las figuras.

Fig. 1 Efectos de un péptido competidor de la unión del DR y de un mAb especifico para el DR, sobre la linea Priess de células B transformadas con el EBV.

Fig. 2 Curso en el tiempo de los efectos modulantes y citotóxicos del mAb L243 sobre las células LG2.

Fig. 3 Duración de los efectos modulantes y citotóxicos del L243 sobre las LG2 después de eliminar los mAb.

Fig. 4 Reducción de la sensibilidad de la expresión del HLA-DR sobre diferentes poblaciones de APC después del cultivo conjunto con los mAb L243 específicos para el DR y con sus fragmentos.

Fig. 5 Efectos de las concentraciones crecientes de un fragmento Fab especifico para el DR, sobre la linea LG2 de células B transformadas con el EBV.

Fig. 6 Efectos del co-cultivo prolongado de L243 y de sus fragmentos, sobre células LG2.

Fig. 7 Dependencia de la. citotoxicidad de la EBV-LCL, de la unión entrecruzada con el DR.

Fig. 8 Selectividad de la reducción de la sensibilidad del DR sobre las células B en reposo y los monocitos/macrófagos .

Fig. 9 Selectividad de la reducción de la sensibilidad del DR sobre los blastos de células B.

Fig. 10 Selectividad de la reducción de la sensibilidad del DR sobre las células LG2.

Fig. 11 Ninguna selectividad de alotipos de la reducción de sensibilidad del DR mediante mAb.

Fig. 12 Reducción de la sensibilidad de la pan-clase II sobre las células TS-10 mediante 1-1C4 Fab.

Fig. 13 La ausencia de secreción del TNFa aumenta mediante el co-cultivo de las células LG2 y Priess con L243 y fragmentos del mismo.

Fig. 14 Concentración de anticuerpo necesaria para la inhibición de la célula Th y la reducción de sensibilidad del DR.

Fig. 15 Efecto de los mAb anti-DR y de los fragmentos Fab sobre la presentación del antígeno mediante las APC fijadas .

Fig. 16 Efecto de la carga de antígeno sobre la potencia de los mAb, fragmentos Fab, y péptidos antagonistas .

Fig. 17 Efectos relativos de los Fab y de los péptidos sobre las curvas dosificación del antígeno/respuesta.

Fig. 18 Efecto de los antagonistas de clase II sobre la respuesta continuada de la célula Th.

Ciertos anticuerpos monoclonales (mAbs) que son específicos para el HLA-DR (antígeno de leucocitos humanos del tipo "DR"; una molécula de clase II del complejo principal de histocompatibilidad ("MHC")) pueden reducir la sensibilidad de la expresión de las moléculas de HLA-DR sobre la superficie de leucocitos que son células presentadoras de antígenos ("APC"), alrededor de un 90 %. Los mismos mAbs inhiben también la activación de los clones de la célula Th humana lo cual requiere la presentación del antígeno por las moléculas de HLA-DR para la activación. La potencia inhibidora de estos mAbs es de varios cientos a varios miles de veces mayor que la de los péptidos antagonistas normalmente disponibles (ver tabla 1, m s adelante) . Esta reducción de la sensibilidad de la expresión del HLA-DR y la inhibición de la activación de las células Th es una actividad farmacológica que da como resultado la in unosupresión. Esta inmunosupresión sería de utilidad en el tratamiento de enfermedades autoinmunes, especialmente la artritis reumatoide. De acuerdo con la invención, se ha descubierto sorprendentemente que los fragmentos monovalentes mAb que se unen a los antígenos (Fab) , de mAbs que tienen la capacidad de reducir la sensibilidad de la expresión del HLA-DR pueden ellos mismos reducir la sensibilidad de la expresión del HLA-DR sin la citotoxicidad del propio mAb, o de los fragmentos bivalentes (F(ab)'2) del mAb. Los fragmentos Fab de la invención son por lo tanto, potentes compuestos inmunosupresores específicos del MHC de clase II sin efectos citotóxicos colaterales. Así, la presente invención consta de un fragmento Fab de un mAb anti-HLA-DR en el cual dicho mAb intacto es citotóxico para las células presentadoras de antígeno y reduce la sensibilidad de la expresión del HLA-DR sobre las restantes células presentadores de antígeno. Este mAb inhibe la activación de las células Th. Los mAbs a partir de los cuales derivan los fragmentos Fab de la presente invención se unen todos al primer dominio del HLA-DR.

Ejemplos de tres mAbs que reducen la sensibilidad, de utilidad de acuerdo con la invención, son : LB3.1 (IgG2b de ratón, específico para pan-DRal; refs. 9- 10) ; L243 (IgG2a de ratón, específico para pan-DRal; refs. 10- 11); ATCC entrada n° HB55) ; y SFR3-DR5 (IgG2b de rata, específico para DRB1*110X; ref. 13; ATCC entrada n° HB-151) . Además, se generó por medios convencionales un mAb, 1-1C4, reductor de la sensibilidad del HLA-DR, (IgG2a de ratón, específico para la cadena beta; ref. 14), que además reduce la sensibilidad del HLA-DQ y -DP, como se describe en el Ejemplo 22. Así, los fragmentos Fab de los anteriores mAbs son abarcados por la presente invención. Consistente con la capacidad de reducir la sensibilidad del mAbs para inhibir la activación de células Th, cinco mAbs no reductores de la sensibilidad, el CCCL20 (IgG2 de ratón, específico para tres (cadena ß) formas alélicas DRB1, (DRB1*0101, DRB1*0401, DRB1*0404); ref. 12) y los 8D1, 9F1, 9F2, 10F12 (todos cuatro IgGl de ratón) , inhiben la activación de células Th sólo muy débilmente o nada en absoluto.

Los mAbs activos son citotóxicos para las células linfoblastoides B y para una pequeña proporción de células B activadas normalmente. Al igual que los mAbs, los fragmentos F(ab)'2 bivalentes de estos mAbs inducen la reducción de sensibilidad pero son también citotóxicos. Sin embargo, de acuerdo con la invención, los fragmentos Fab monovalentes de estos mAbs carecen de citotoxicidad, pero sorprendentemente conservan la propiedad de reducir la sensibilidad que tiene el mAb madre. Los mAbs anti-HLA-DR empleados para obtener los fragmentos Fab de la invención pueden obtenerse por cualquier medio convencional, p. ej . generalmente por el procedimiento descrito primeramente por Kohler y Mílstein. Mediante la inyección de un antígeno a un ratón o rata, conejo, oveja o similar (de preferencia un ratón) , pueden prepararse anticuerpos monoclonales recuperando las células productoras de anticuerpos de uno de estos animales inmunizados e inmortalizando dichas células obtenidas de forma convencional como p. ej . por fusión con células de mieloma, p. ej . células de mieloma de ratón PAI , SP2/0- ó células SP2/0-Agl4 [ATCC n° CRL 1581; ATCC n° CRL 8287] [para una norma general para la obtención de anticuerpos, ver p. ej . "Antibodies-A Laboratory Manual", Harlow & Lee, edic. Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988)]. A continuación pueden seleccionarse los sobrenadantes de los cultivos de dichos hibridomas para detectar los anticuerpos monoclonales (mAbs) mediante procedimientos convencionales como los radioin unoensayos, enzímoinmunoensayos o unión inmune en punto o ensayos de inmunofluorescencia . Los mAbs pueden purificarse a partir de los sobrenadantes de hibridomas mediante procedimientos cromatográficos convencionales, como por ejemplo, . cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad sobre la proteína A, anticuerpos anti-inmunoglobulinas, o el antígeno o una parte del mismo unido a un soporte sólido, HPLC y similares. La producción de un mAb de utilidad de acuerdo con la invención se ilustra en el ejemplo 22. Para la producción de grandes cantidades de mAbs, de acuerdo con los métodos ya conocidos en la especialidad, pueden inyectarse intraperitonealmente hibridomas que segreguen el anticuerpo deseado, en ratones que han sido tratados previamente con p. ej . pristana antes de la inyección. Pueden obtenerse hasta alrededor de 100 mg de un mAb mediante los tumores de ascitis resultantes en un ratón. Los mAbs pueden purificarse a partir del líquido ascítico producido por dichos tumores por los métodos indicados anteriormente.

Los mAbs pueden caracterizarse de acuerdo con sus subclases mediante métodos conocidos, como p. ej . la in unodifusión de Ouchterlony. También es conocido en la especialidad que los mAbs pueden modificarse para varias utilizaciones o pueden generarse fragmentos de los mismos, que todavía conservan la capacidad de unirse al antígeno. Estos fragmentos pueden generarse por ejemplo por digestión enzimática de los mAbs con papaína, pepsina o similares. El inmunógeno para la producción de mAb que puede utilizarse de acuerdo con la invención es de preferencia el HLA-DR cadena ß [ver p. ej . WO92/10589; J. Biol. Chemistry, 262, 8748-8758 (1987); la información de la secuencia puede obtenerse también de las bases de datos de secuencias, por ejemplo el Genbank ( Intelligenetics, California, USA), European Bioinformatics Institute (Hinxton Hall, Cambridge, GB) , NBRF (Georgetown University, Medical Centre, Washington DC, USA) y Vecbase (University of Wisconsin, Biotechnology Centre, Medision, Wisconsin, USA) ; estas secuencias pueden ser utilizadas mediante métodos conocidos en la especialidad para obtener el antígeno para la preparación de los anticuerpos monoclonales para utilizar en la presente invención] , el cual se purifica a continuación por medios convencionales, como p. ej . SDS-PAGE. La identificación de los mAbs anti-HLA-DR anteriormente descritos, que son citotóxicos para las células APC y también reducen la sensibilidad de la expresión del HLA-DR, puede efectuarse mediante cualquier medio convencional. De preferencia esta identificación del mAb anti-HLA-DR se realiza de acuerdo con el ejemplo 3 en donde se utiliza una línea celular (EBV-LCL) B-linfoblástica humana transformada con el virus Epstein-Barr como un modelo de una APC (en particular, células B activadas) . De preferencia se utilizan cultivos de por lo menos 1 ml conteniendo alrededor de 105 células EBV-LCL por mililitro. El cultivo se incuba con 20 nM del mAb anti-HLA-DR durante 16 horas y el número de células muertas y la expresión del HLA-DR mediante las restantes células viables se determina mediante medios convencionales. Para la finalidad de esta invención la citotoxicidad y la reducción de la sensibilidad se definen como sigue: 1) el mAb es citotóxico para las células presentadoras de antígeno si, en las condiciones anteriores, por lo menos el 25 %, de preferencia el 40 % de las células presentadoras de antígeno EBV-LCL, mueren por el mAb intacto; y 2) el mAb reduce la sensibilidad de expresión de HLA-DR sobre las células presentadoras de antígeno, si en las condiciones anteriores reduce el número de moléculas HLA-DR sobre la superficie de las células EBV-LCL presentadoras de antígeno, que permanecen vivas por lo menos en un promedio del 50 % . Las células presentadoras de antígeno EBV-LCL se marcan para detectar las células muertas y medir la expresión de HLA-DR de las restantes células viables mediante una inmunofluorescencia convencional. Las células se analizan empleando un citómetro de flujo (p. ej . FACScan, Becton-Dickinson, San José, California), y se calcula por medios convencionales el tanto por ciento de células muertas y la reducción de la expresión del HLA-DR sobre las restantes células, de preferencia empleando el programa de computadora usado normalmente con el citómetro de flujo (p. ej . el programa LYSIS II con el citómetro FACScan) . Las EBV-LCL empleadas para explorar los anticuerpos monoclonales con las deseadas propiedades, no son especiales. Puede emplearse cualquier EBV-LCL convencional de acuerdo con la invención. Ejemplos de EBV-LCL de utilidad de acuerdo con la invención son las células Priess (ECACC (Salisbury, UK) inscripción n° 86052111), LG2 (Istituto Nazionale Per La Ricerca Sul Cancro (Genova, Italia) inscripción n° G201 12301), y TS-10 (ECACC (Salisbury, UK) inscripción n° 85102911) . El fragmento Fab de los mAbs descritos anteriormente puede ser obtenido por cualquiera de los medios convencionales. El fragmento Fab puede obtenerse por digestión del mAb madre con pepsina y aislando los fragmentos Fab mediante medios ya conocidos en la especialidad (p. ej . Andrew y Titus, "Fragmentation of immunoglobulin G", Current Protocols in Immunology, Coligan y col., eds. (Greene & Wiley 1994)). Consecuentemente, este proceso y un fragmento Fab, siempre que esté obtenido mediante dicho proceso, son también un objeto de la presente invención. De preferencia, los fragmentos Fab de la invención se obtienen mediante una línea celular recombinante que expresa un gen que codifica el fragmento Fab deseado. Estas líneas celulares recombinantes pueden ser obtenidas por cualquiera de los medios convencionales. Por ejemplo, la porción del gen que codifica el fragmento Fab podría ser clonado por medios convencionales a partir del hibridoma que segrega el mAb madre del fragmento Fab. El ADNc del fragmento Fab puede incorporarse a continuación por medios convencionales a un vector de expresión, el cual a su vez se utiliza para transfectar una línea celular apropiada . Los fragmentos Fab preferidos de la invención, se "humanizan" de forma que sean menos antigénicos cuando se administran a los seres humanos que un fragmento Fab que se obtiene directamente de un animal, de preferencia un mAb de ratón. El método por el cual se obtienen los fragmentos humanizados de Fab de la invención, no es crítico. Puede emplearse cualquiera de los medios convencionales conocidos en la especialidad. Estos métodos utilizan el hecho de que cualquier inmunoglobulina (Ig), tal como un anticuerpo monoclonal, consta de un dominio constante y un dominio variable en donde tiene lugar la unión con el antígeno. El dominio variable, a su vez, consta de seis regiones determinantes de la complementariedad ("CDR") empotradas en una región de estructura (tres CDR en la cadena ligera y tres CDR en la cadena pesada de la Ig) . (ref. 42). Son las CDR las responsables de la especificidad del mAb. Puesto que los mAbs son de ratón u otras especies de origen animal, la humanización de los mAbs se realiza esencialmente reemplazando por lo menos uno, pero de preferencia todos los seis CDR de una inmunoglobulina humana, con los correspondientes CDR de un mAb animal que tiene la especificidad deseada. Así la Ig humana sirve de estructura • para las CDR de animal. En estos procedimientos, el mAb animal, normalmente ratón, recibe el nombre de "donador" y la Ig humana se designa como "receptor". Además, puede efectuarse también una "sintonización fina" de la secuencia de aminoácidos del mAb humanizado, como se llama en la especialidad, para optimizar la especificidad para el antígeno del mAb humanizado. Por ejemplo, la publicación de la solicitud de patente internacional N° WO 90/7861 describe que un panel de 10-20 Ig humanas deben someterse a selección, y la Ig humana cuya región variable tiene el grado mayor de homología con la región variable del mAb de ratón donador, habitualmente el 65-70% o una homología mayor, debe utilizarse como receptor. Pueden efectuarse otras substituciones de aminoácidos del donador para los aminoácidos del receptor (habitualmente alrededor de tres substituciones) fuera de los CDR basados sobre los cuatro criterios descritos en la patente WO 90/7861 en las páginas 12-15. En otro ejemplo de humanización conocido en la especialidad, la patente EP 0 620 276 describe una jerarquía de substituciones particulares que pueden efectuarse en un receptor Ig fuera del implantado donador CDR con el fin de aumentar la especificidad del mAb humanizado. Estas substituciones se describen como eliminando la necesidad de seleccionar un receptor Ig humano cuya región variable tiene un alto grado de homología con la región variable del donador mAb. Un protocolo específico para la humanización figura en la patente EP 0 620 276 en las páginas 8-9. Los métodos para generar secuencias de ADN para la expresión en una célula hospedadora de un mAb intacto humanizado de utilidad para la obtención de fragmentos de Fab de la invención, o para la expresión de un fragmento Fab humanizado de la invención, ya son conocidos en la especialidad y no son especiales. Dichos métodos incluyen p. ej . la mutagénesis inducida en un sitio, construcción de toda la región variable empleando oligonucleótidos solapados que incorporan los CDR animales sobre una estructura humana, y empleando el injerto de PCR (WO 90/7861, EP 0 620 276, ref. 43) . Así, la invención puede describirse además, como un fragmento Fab que consta de un fragmento Fab de inmunoglobulina Fab y seis regiones determinantes complementariamente, que est n contenidas dentro de dicho fragmento Fab de inmunoglobulina, en donde de una a seis de dichas regiones determinantes complementariamente son las regiones determinantes complementariamente de un anticuerpo monoclonal que tiene las siguientes propiedades: 1) el anticuerpo monoclonal se une con el primer dominio del HLA-DR, 2) él anticuerpo monoclonal es citotóxico para las células presentadoras del antígeno que expresan el HLA-DR, 3) el anticuerpo monoclonal reduce la sensibilidad de la expresión del HLA-DR sobre las células presentadoras del antígeno. La modalidad preferida de la invención es un fragmento Fab humanizado, de acuerdo con lo anterior, el fragmento Fab de inmunoglobulina es humano y el anticuerpo monoclonal que tiene las propiedades 1-3 es animal, de preferencia de ratón. Este fragmento Fab humanizado debe ser un fragmento Fab de inmunoglobulina humana en el cual de uno a seis de los CDR contenidos en el mismo han sido substituidos por los correspondientes CDR del mAb animal. Así el fragmento Fab preferido de la invención es un fragmento Fab que consta de un fragmento Fab de inmunoglobulina humana y seis regiones determinantes complementariamente que están contenidas dentro de dicho fragmento Fab de inmunoglobulina humana, en el cual de una a seis de dichas regiones determinantes complementariamente son las regiones determinantes complementariamente de un anticuerpo monoclonal que tiene las propiedades 1-3 anteriores. Se prefiere que este fragmento Fab humanizado, de la invención, contenga todos los seis CDR del mAb animal. En el caso de que el fragmento Fab de inmunoglobulina sea de origen animal, se considera que el fragmento Fab de la invención puede ser un fragmento Fab del mismo anticuerpo monoclonal, el cual tiene las propiedades 1-3 anteriores. Dicho fragmento Fab puede ser de utilidad como producto intermedio para emplear en la obtención de los CDR animales que estarán contenidos en el fragmento Fab preferido humanizado de la invención. Los fragmentos Fab preferidos de la invención tienen propiedades similares a los fragmentos Fab obtenidos a partir de los anticuerpos monoclonales LB3.1, L243, SFR3-DR5 y 1-1C4, descritos anteriormente. Dado que los fragmentos Fab de la invención inhiben la activación de las células Th, pueden utilizarse en el tratamiento de varias enfermedades en las que las células Th activadas constituyen una fuente de los trastornos o síntomas de la enfermedad. Una de estas enfermedades es la artritis reumatoide (ref. 33) . La reducción de la sensibilidad de la HLA-DR sobre las APC de un paciente con artritis reumatoide, y por esta razón la inhibición de la activación de las células Th en dicho paciente, disminuirían o paralizarían la progresión de la enfermedad. La inhibición de la activación de las células Th en un paciente con artritis reumatoide aliviaría también los síntomas como el dolor y la inflamación, al disminuir o interrumpir la liberación de inductores que son la causa de estos síntomas .. Así, la invención comprende también el fragmento Fab como ha sido descrito hasta aquí y su empleo como agente terapéuticamente activo, especialmente como agente inmunosupresor y m s específicamente para el tratamiento de la artritis reumatoide y un método de supresión de la respuesta inmune de un paciente, que consiste en la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un fragmento Fab de la invención, a un paciente que necesita este tratamiento. La invención consta además de un método de tratar la artritis reumatoide en un paciente mediante la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un fragmento Fab de la invención a un paciente que necesita dicho tratamiento. La cantidad de fragmento Fab que debe administrarse puede determinarse mediante cualquier medio convencional. La administración del fragmento Fab puede también efectuarse mediante cualquier medio convencional . La administración del fragmento Fab de la invención se efectúa de preferencia empleando una composición farmacéutica de la invención (descrita a continuación) . La administración se efectúa de preferencia por vía parenteral (subcutáneamente, intramuscular, o intravenosa) , en especial por vía intravenosa. La dosificación requerida para inhibir la activación de las células Th de un paciente y por lo tanto tratar la artritis reumatoide puede determinarse por cualquiera de los medios convencionales, p. ej . mediante pruebas clínicas de delimitación de dosis. Sin embargo, se prefiere una dosificación de alrededor de 1-10 mg/día i.v. especialmente alrededor de 3-7 mg/día, en particular alrededor de 5 mg/día (refs. 34, 35), de preferencia administrada como un bolo. El tratamiento es de preferencia una vez al día durante una semana o menos, aunque el tratamiento diario puede continuarse hasta las tres semanas, si es necesario. Los fragmentos Fab de la invención pueden formularse como una composición farmacéutica fluida, p. ej . para administración parenteral, que consta del fragmento Fab de la invención disuelto en un material de soporte fluido convencional farmacéuticamente aceptable. La composición puede además comprender otras substancias farmacológicamente activas. De preferencia, la composición contiene alrededor del 0.5-5 mg/ml de un fragmento Fab de la invención, especialmente alrededor de 1-2 mg/ml. El soporte fluido preferido es la solución salina fisiológica estéril. Los resultados descritos a continuación en los ejemplos 1-7 indican que la inhibición de la activación de las células Th mediante el mAb específico de HLA-DR puede operar por múltiples acciones: (a) eliminación de las células APC disponibles mediante citotoxicidad directa, (b) reducción de las moléculas de HLA-DR disponibles sobre las restantes células viables de APC mediante reducción de la sensibilidad de la expresión en la superficie celular, (c) obstaculización de la interacción de MHC-TcR de la clase II. La inhibición de las células Th puede ocurrir también mediante el bloqueo por el mAb de la ranura de la unión peptídica sobre la molécula de DR, convirtiéndola en inaccesible para el antígeno (30) . Se comprende por lo tanto, el por qué los mAbs son mayores inhibidores de células Th que los péptidos antagonistas habituales, puesto que el efecto de estos últimos se basa exclusivamente en el bloqueo del sitio de unión al antígeno de las moléculas HLA-DR. Los mecanismos en los que se basa la citotoxicidad y la reducción de la sensibilidad de la clase II mediante el anticuerpo quedan por investigar. Sin embargo, est claro que la citotoxicidad requiere la unión entrecruzada, mientras que la reducción de sensibilidad se logra también con fragmentos monovalentes Fab de la invención sin la citotoxicidad del mAb madre. Esta diferencia permite la separación de estas dos propiedades mediante fragmentación del anticuerpo. Aceptando que los efectos colaterales previamente observados de los Ab anticlase II (refs. 7, 8) fueron asociados al menos en parte, con la citotoxicidad directa, los fragmentos Fab de la invención son adecuados para el empleo terapéutico de estos anticuerpos como inmunosupresores, sin los efectos adversos. Ej emplos Ejemplo 1 Especificidad del isotipo del mAb anti-DR Se determinaron las especificidades exactas de los mAbs mediante su capacidad para teñir las líneas celulares de ratón transfectadas con genes de HLA humano de clase II. Métodos. Se tintaron líneas de fibroblastos de ratón transfectadas con los genes humanos indicados de clase II (15), así como células hospedadoras sin transfectar (L tk") , mediante inmunofluorescencia indirecta estándar, empleando mAb específico para DR, e Ig de cabra anti-ratón conjugada con FITC (Southern, Birmingham, Alabama) , como reactivos primario y secundario respectivamente. Se analizaron muestras en un citómetro de flujo FACScan (Becton-Dickinson, San José, California) . Los resultados están indicados en la Tabla 1. "+ " y "-" indican la presencia y ausencia de la unión al anticuerpo, respectivamente; "NT" significa no ensayado. Conclusión: Los anticuerpos 8D1, 9F1, 9F2 y 10F12 son específicos para pan-DR, mientras que el 1-1C4 puede reconocer los tres isotipos humanos de clase II (DR, DP y DQ) .

Tabla 1. Modelo de tinciones del mAb especifico de pan-DR Linea de HLA clase Ab fobroblastos II expresado | - 1 C4 8D 9F1 9F2 10F12 de ratón Lmlk L57.23 DRA*010I/ + NT + + + DRB1*0I0I L2436 DRA*0I0I/ + + + + + DRBI*040I 1.164 II DRA*0I01/ + NT NT NT NT DRB 1*0402 L259 I DRA*0I01/ + NT NT NT NT DRB 1*0403 300.7 DRA*0I0I/ + NT + NT NT DRB 1 *0404 L24I.2 DRA*0I0I/ + NT + NT NT DRB 1*0701 L91.7 DRA*0I01/ + NT + + + DRBI*I 101 LI67.2 DRA*0I0I/ + NT NT NT NT DRB1*1401 182.I DRA*0I0I/ + NT NT NT NT LI05.I DRA*0I0I/ + NT NT NT + DRB3*0202 LI68.2 DRA*0101/ + NT N NT NT DRB3*0101 L2576 DRA*0I01/ + NT N NT r-1 DRB4*0I0I Ejemplo 2 Especificidad para la cadena V dominio, de los mAbs anti -HLA-DR Métodos: Empleando el clonado estándar de genes, la tecnología recombinante y de transfección (10), se generaron dos líneas celulares B de ratón que expresan moléculas de clase II quiméricas humanas/de ratón. Se derivó el transfectante M12.C3.25 a partir de una línea M12.C3 (15) hospedadora negativa de clase II de ratón, y expresa el producto MHC compuesto de los dominios al y ßl derivados de una molécula humana HLA-DRA*0101/DRB1*0401, y los dominios a2 y ß2 de una proteína I-Ed de ratón, a la cual no se unen los reactivos específicos de DR. Se derivó el transfectante CH27.105 a partir de una línea CH27 (16) hospedadora positiva de clase II de ratón, y expresa la cadena Eßk original de ratón asociada con la cadena a quimérica humana/de ratón descrita anteriormente. Se efectuó la tinción de inmunofluorescencia indirecta estándar, empleando los anticuerpos indicados IgG2 e IgGl, en conjunción con la proteína A-FITC (Boehringer, Mannheim, Alemania) y la IgGi-FITC de cabra anti-ratón (Southern, Bir ingham, Alabama), respectivamente. Las muestras fueron analizadas en un citómetro de flujo FACScan (Becton-Dickinson, San José, California) . Los resultados están indicados en la Tabla 2 (presentación como en la Tabla 1) . Conclusión: Los resultados confirman la especificidad para el DRal, previamente informada, de los LB3.1 y L243 (10) . Los anticuerpos 8D1 y 1-1C4 son ßl-específicos, mientras que el epitopo reconocido mediante el CCCL20 actúa como dominio ß2-dependiente . Los reactivos restantes (9F1, 9F2, 10F12) parecen unirse al (a los) determinante (s) expresados por el (los) segundo (s) dominio (s) HLA-DR. El epitopo correspondiente del anti-DRBl*110X mAb no podría ser mapeado empleando estos transfectantes, puesto que el SFR3-DR5 no reconoce el alotipo DRB1*0401.

Tabla 2. Union del anti-DR mAb a las lineas celulares B de ratón, transfectadas con genes de clase II recomoinantes humanos-de ratón quiméricos.

Linea celular de ratón M I 2. C 3 M12.C3.25 CH27 CH27.I05 Expresión de la proteina derivada humana de clase II. ?itul-Ea2/DKÍU- DRal-Ea2/l-ßl-Eß2 HB2 in?b. I.B .I 1.243 I-IC4 8DI 9FI 00 9F2 I0FI2 CCCL20 NT NT Efecto de los anti-DR mAbs y sus fragmentos sobre la expresión de HLA-DR y la viabilidad celular Se examinó la expresión de DR y la viabilidad de las células presentadoras de antígeno (APC) , cultivadas previamente con un péptido aXA (17) competidor de unión al DR, o bien con mAb DR-específico, a las respectivas concentraciones que en el caso del .aXA y dos mAb (LB3.1, 1-1C4), bloquearon la presentación del antígeno a las células Th. Como APC se empleó una línea celular humana de linfoblastos B transformada con el virus de Epstein-Barr (EBV-LCL) .

Ejemplo 3 Efectos de un péptido competidor de unión DR v un mAb DR-específico sobre una EBV-LCL Métodos: Se cultivaron EBV-LCL (Priess, ECACC (Salisbury, UK) inscripción n° 86052111) (105 células/ml) en presencia de mAb DR-específico (LB3.1, 1-1C4, CCCL20) ó el péptido aXA (aXAAAKTAAAAa-NH2 ; ref. 17) a la concentración indicada en la Fig. 1 durante 16 horas. A continuación se lavaron las células y se tintaron mediante inmunofluorescencia indirecta estándar empleando mAb DR-específico [LB3.1 (a), CCCL20 (b) , 1-1C4 (c)], e Ig de cabra anti-ratón conjugada con FITC (Southern Biotechnology Associates Inc., Birmingham, Alabama) como reactivos primario y secundario, respectivamente. Las muestras fueron analizadas con un citómetro de flujo FACScan (Becton-Dickinson, San José, California) . Los resultados est n indicados en la Fig. 1. El eje de las X representa la expresión de HLA-DR, y el eje de las Y la fluorescencia de las células muertas tintadas con yoduro de propidio, ambos en unidades arbitrarias de fluorescencia. "Fondo" representa el control de la población celular cultivada durante 16 horas en un medio normal y a continuación marcado sin reactivo primario, respectivamente. Conclusión: El cultivo conjunto con el péptido aXA (fig. la) no afectó significativamente ni a la viabilidad de la célula ni a la expresión del DR, mientras que el mAb LB3.1 específico de DR (fig. la) y el 1-1C4 (fig. le) indujo una alta citotoxicidad así como redujo la expresión del DR en las células viables restantes. Sin embargo, estas propiedades no fueron compartidas por todos los mAbs anti-DR, puesto que el CCCL20 no afectó ni a la viabilidad ni a la expresión de DR, incluso con una concentración aumentada (fig. Ib) .

La reducción de la modulación y de la citotoxicidad en la EBV-LCL podría inducirse con dos mAb específicos para la DR, los L243 y SFR-DR5, mientras que para otros cuatro, el mAb anti-DR (8D1, 9F1, 9F2 y 10F12) no fueron ni citotóxicos ni redujeron la expresión de DR (no figuran datos) .

Ejemplo 4 Variación en el tiempo de los efectos de modulación v citotóxicos del mAb L243 en la LG2 Métodos: La EBV-LCL LG2 (Istituto Nazionale Per La Ricerca Sul Cancro (Genova, Italia) inscripción n° G201 12301) (10D células/ml) se cultivó en presencia del mAb L243 específico para DR (Becton-Dickinson) a la concentración de 10 nM durante el período de tiempo indicado. A continuación, se lavaron las células y se tiñeron mediante in unofluorescencia estándar indirecta empleando el mAb L243 específico para DR y la Ig de cabra anti-ratón conjugada con FITC (Southern, Bir ingham, Alabama) como reactivos primario y secundario, respectivamente. Las células muertas se tiñeron con yoduro de propidio, y las muestras se analizaron en un citómetro de flujo FACScan. Los resultados est n indicados en la fig. 2. Los histogramas representan un relativo número de células muertas (claro) y las células vivas que expresan cantidades decrecientes de HLA-DR (oscuro) . Conclusión: Los estudios cinéticos in vitro demostraron una citotoxicidad detectable del mAb después de 2 horas, y una toxicidad plana después de 8 horas. La reducción de sensibilidad de DR se hizo detectable después de 4 horas, alcanzando su pico después de 8 horas.

Ejemplo 5 Duración de los efectos de modulación v, citotóxicos del L243 sobre la LG2 después de eliminar el mAb.

Métodos: Se cultivaron células EBV-LCL LG2 (105 células/ml) en presencia del mAb L243 específico para DR (Becton-Dickinson) a la concentración de 10 nM durante el período de tiempo indicado. El anticuerpo se eliminó por lavado 3x y el cultivo de células se reanudó con el mismo volumen de medio fresco, como se ha indicado. A continuación, se lavaron las células y se tiñeron mediante inmunofluorescencia estándar indirecta empleando el mAb L243 específico para DR y la Ig de cabra anti-ratón conjugada con FITC (Southern, Birmingham, Alabama) como reactivos primario y secundario, respectivamente. Las células muertas se tiñeron con yoduro de propidio, y las muestras se analizaron en un citómetro de flujo FACScan. Los resultados están indicados en la fig. 3. Los histogramas representan un número relativo de células muertas (claro) y las células vivas que expresan cantidades decrecientes de HLA-DR (oscuro) . Conclusión: La reducción de sensibilidad de DR inducida por el anticuerpo perduró durante 16 horas después de eliminar el mAb.

Ejemplo 6 Reducción de la sensibilidad de la expresión de HLA-DR sobre diferentes poblaciones de APC después del cultivo conjunto con mAb L243 específico para DR, y sus fragmentos Se examinaron los efectos del mAb anti-DR sobre diferentes subpoblaciones de células no transformadas con MHC clase II positiva. Se examinaron además, las células B en reposo y activadas, monocitos/macrófagos y las células Th activadas.

Métodos: Se efectuó el aislamiento de las células B y de monocitos/macrófagos a partir de sangre periférica fresca, eliminando las células T más los monocitos o células B (cuando interesa) antes del cultivo, empleando perlas magnéticas (Dynal) previamente recubiertas con mAb específico para CD3 (SK7) y CD14 (MFP9) ó CD19 (4G7), respectivamente (Becton-Dickinson) . Las blastocélulas Th y B se generaron por estimulación durante 3-5 días in vitro de células mononucleares de sangre periférica con fitohemaglutinina (1 µg/ml; Sigma) y mitógeno "pokeweed" (2, 5 ug/ml; Sigma), respectivamente. El L243 fue digerido con pepsina y papaína con el fin de aislar los fragmentos F(ab) ?2 y Fab, respectivamente, como se describe en la ref. 18. Los anticuerpos sin digerir y sus fragmentos Fe se eliminaron mediante cromatografía de afinidad sobre columnas de proteína G. Se cultivaron células APC (105 células/ml) en presencia de concentraciones equivalentes del anticuerpo L243 completo (10 nM) o de sus fragmentos F(ab) '2 (10 nM) y Fab (20 nM) , durante 16 horas, como se indica en la fig. 4. A continuación se lavaron las células y se tintaron como en el ejemplo 3. Los resultados est n indicados en la fig. 4. El eje de las X representa la expresión de HLA-DR, y el ej e de las Y la fluorescencia de las células muertas tintadas con yoduro de propidio, ambos en unidades arbitrarias de fluorescencia. Los números indican los porcentajes de células en los correspondientes cuadrantes. "Tintura de DR con FITC" y "Fondo de la tintura con FITC" representan el control de poblaciones celulares cultivadas durante 16 horas en un medio normal y a continuación marcadas con y sin el reactivo primario respectivamente. Conclusión: La expresión en la superficie celular de moléculas de DR disminuyó en todas las poblaciones en presencia de un mAb completo, así como sus fragmentos bi- y monovalentes F(ab)'2 y Fab, respectivamente. La magnitud de la reducción de DR fue alta en las células B (80-90 %), intermedia en las APC monocíticas (50-65 %), y baja (menos del 50 %) en los blastos de células Th. El cultivo conjunto de EBV-LCL y los blastos de células B preactivadas, con reactivos anti-DR bivalentes [mAb completo y F(ab) '2] dio como resultado una citotoxicidad alta (60-70 %) y marginal (5-15 %), respectivamente, mientras que los fragmentos monovalentes (Fab) solo indujeron una reducción de la sensibilidad sin una muerte celular significativa. El efecto citotóxico estuvo completamente ausente en subpopulaciones de células B en reposo, linfocitos Th activados y monocitos/macrófagos preincubados con cualquier forma de mAb específico para DR, empleados en estos experimentos. Perfiles similares (parcialmente mostrados en secciones más adelante) se obtuvieron empleando mAb 1-1C4 y LB3.1 y sus fragmentos Fab. [el fragmento F(ab)'2 del anticuerpo LB3.1 no puede ser generado debido a que su isotipo no permite la digestión con papaína] .

Ejemplo 7 Efectos de concentraciones crecientes del fragmento Fab específico para DR en la línea celular LG2 de células B transformadas con el EBV Se exploró la diferencia en términos de citotoxicidad entre los reactivos mAb monovalentes y divalentes para determinar si era solamente cuantitativa o bien se debía a un mecanismo de acción cualitativamente distinto.

Métodos: Como en los ejemplos 3 y 6. Los resultados están indicados en la fig. 5. La presentación es como en la fig. 1.

Conclusión: Una concentración creciente de L243-Fab no surtió ningún efecto para inducir una disminución significativa de la viabilidad de las células APC.

Ejemplo 8 Efectos de un prolongado cultivo conjunto de L243 y sus fragmentos, sobre las células LG2 Métodos: Se cultivaron células APC (105/ml) en presencia de concentraciones equivalentes del anticuerpo L243 completo (10 nM) o de su fragmento Fab (20 nM) durante el período de tiempo indicado. A continuación se lavaron las células y se tintaron como en el ejemplo 6. Los resultados están indicados en la fig. 6. La presentación es como en la fig. 2. Conclusión: Un cultivo conjunto prolongado no indujo ninguna disminución significativa en la viabilidad de las células APC.

Ejemplo 9 La citotoxicidad de la línea celular EBV-LCL depende de la unión entrecruzada enDR Métodos: Se cultivaron células EBV-LCL (Priess) (105 células/ml) durante 16 horas en presencia de fragmentos L243 Fab (20 nM) y perlas magnéticas previamente recubiertas de Ig de cabra anti-ratón ("anti-Ig"; Dynal), con el fin de tener una unión cruzada de los fragmentos Fab unidos a la membrana celular, como se ha indicado. A continuación se lavaron las células y se tintaron como en el ejemplo 6. Los resultados están indicados en la fig. 7. La presentación es como en la fig. 1. Conclusión: La unión cruzada del Fab unido al HLA-DR generó un efecto citotóxico en la EBV-LCL.

A partir de los resultados descritos hasta aquí, se llegó a las conclusiones siguientes: (a) El HLA-DR expresado en cualquier tipo de célula sanguínea monocelular puede reducir su sensibilidad mediante su unión con mAb específico; (b) Inesperadamente, la unión del DR con reactivos monovalentes (Fab) puede conducir también a la reducción de la sensibilidad del DR; (c) Dado que la citotoxicidad es aparente solamente en el EBV, un modelo de células B activadas, y células B previamente activadas con mitógeno, es probablemente dependiente del estado de activación de las células B; y (d) la citotoxicidad es la consecuencia de la unión entrecruzada de DR con ligandos bivalentes [mAb Y F(ab) '2 completo, Fab unido entrecruzado], y no requiere la porción Fe del anticuerpo.

Estudios previos han demostrado que la unión de las moléculas de clase II con el conjunto de receptores mAb ó células T, señala una serie de cambios en las APC tales como la secreción de citoquina (refs. 19-20) , modulación del crecimiento celular y secreción de inmunoglobulina (refs. 21-28), aumento de la sensibilidad de la coestimulación (ref. 15) y moléculas de adhesión celular (refs. 20, 29) y la reducción de la sensibilidad de CD23 (ref. 25) . Era por lo tanto importante establecer si la disminución de la expresión de DR mediante el precultivo con mAb estaba restringida a la molécula de clase II ligada mediante el anticuerpo, o era parte de una reducción inducida globalmente de la sensibilidad de numerosas proteínas de la superficie celular. Se analizó la expresión de los isotipos DP y DQ de la clase II de HLA, moléculas de la clase I de HLA y una adhesión de la proteína CD18 sin ninguna relación con el MCH, sobre diferentes subpopulaciones de células APC después del cultivo conjunto con los fragmentos F(ab)'2 ó Fab de L243.

Ejemplo 10 Selectividad de la reducción de sensibilidad de DR en las células B en reposo y monocitos/macrófagos.

Métodos: Como en el ejemplo 6, se efectuó la tintura por inmunofluorescencia indirecta mediante los reactivos mAb específico para los HLA-DP (clon B7/21), -DQ, (SK10), CD18 (L130) (todos de la subclase Igd Becton-Dickinson) , y anti-HLA de clase I (IgG2a W6-32, Accurate, estbury, New York) , en conjunción con IgGi de cabra, anti-ratón, con FITC y proteína A marcada con FITC (Boehringer), respectivamente. Este procedimiento excluye el marcado indirecto adicional con FITC del fragmento de anticuerpo residual unido a la membrana, específico para el DR. Los resultados están indicados en la fig. 8. La presentación es como en la figura 4. "Control" representa una población celular cultivada durante 16 horas en un medio normal y subsiguiente marcado con proteína A e IgGl de cabra, anti-ratón, conjugada con FITC, juntos. Conclusión: Mientras que las moléculas de DR presentaron una expresión reducida, las moléculas de DP, DQ de clase I, y las moléculas CD18 permanecieron sin afectar, tanto en las células B en reposo, como en los monocitos/macrófagos precultivados con fragmentos F (ab), 2.

Ejemplo 11 Selectividad de la reducción de sensibilidad del DR en blastocélulas B.

Métodos: Como en el ejemplo 10. Los resultados est n indicados en la fig. 9. La presentación es como en la fig. 4. Conclusión: Mientras las moléculas de DR experimentaron una reducción de su sensibilidad, la expresión de las moléculas de DP, DQ de clase I, y las moléculas de CD18 permanecieron sin afectar en las blastocélulas B precultivadas con fragmentos F(ab)'2.

Ejemplo 12 Selectividad de la reducción de sensibilidad del DR en células LG2 Métodos: Como en el ejemplo 10. Los resultados están indicados en la fig. 10. La presentación es como en la fig. 4 Conclusión: Mientras la expresión de las moléculas de DR se redujo selectivamente mediante la ligación con el fragmento Fab, los fragmentos F{ab)'2 bivalentes indujeron una reducción de la sensibilidad significativa de los isotipos de la otra clase II, de las moléculas de clase I y de CD18. Dado que el nivel de modulación no selectiva es solamente dos veces y la reducción del DR es de diez veces, es razonable suponer que la disminución de la expresión de otras moléculas de la superficie molecular est asociada con una nocividad general de los reactivos bivalentes en la EBV-LCL.

Ejemplo 13 Selectividad alotípica de la reducción de sensibilidad del DR mediante mAb Los mAb modulantes, LB3.1, L243 y 1-1C4 son pan-DR específicos, es decir, no distinguen entre diferentes formas alélicas del HLA-DR. Por lo tanto, no son adecuados para el análisis de la especificidad alotípica de la reducción de sensibilidad del DR. Sin embargo, esta cuestión podría ser tratada empleando el reductor de sensibilidad mAb SFR3-DR5 que es exclusivamente específico para el DRB1*110X (antig amente, DR5; ref. 13) .

Método: Se cultivaron células B (aisladas a partir de sangre periférica fresca de un donador heterozigótico DRB1*0101/1101X como en el ejemplo 6), en presencia del Ab SFR3-DR5 específico para DRB1*110X (20% de fluido sobrenadante de hibridoma; ref. 14). A continuación, se lavaron las células y se tintaron mediante ' inmunofluorescencia estándar indirecta con mAb SFR3-DR5 específico para DRB1*110X ó bien con mAb CCCL20 específico para DRB1*1101 (12), en conjunción con Ig de cabra anti-ratón & rata (Southern), como est indicado.

Los resultados están indicados en la fig. 11. La presentación es como en la fig. 4. Conclusión: El reactivo SFR3-DR5 específico para DRB1*110X indujo la reducción de sensibilidad de los dos alomorfos del DR, expresados mediante células B en reposo heterocigóticas, afectando también al alotipo DR no reconocido por el mAb. De ello se infiere que la reducción de sensibilidad de la DR no parece ser específica del alotipo.

Ejemplo 14 Reducción de la sensibilidad de la pan-clase II en células TS-10 mediante 1-1C4 Fab Puesto que el mAb 1-1C4 puede reconocer la cadena beta de los tres isótopos HLA de clase II (DR, DP, DQ) era importante analizar si es capaz de reducir correspondientemente la expresión de los mismos.

Métodos: Se cultivaron células EBV-LCL TS-10 (ECACC (Salisbury, UK) inscripción n° 85102911) en presencia de 1-1C4 Fab (20 nM) , mAb anti-DP (10 nM) ó mAb anti-DQ (10 nM) durante 16 horas, como se ha indicado. A continuación, se lavaron las células y se tiñeron como en los ejemplos 6 y 10. Los resultados están indicados en la fig. 12. están indicados los perfiles de tinción del histograma de las células mantenidas vivas. El eje de las X representa la intensidad de la fluorescencia en unidades arbitrarias, y el eje de las Y el número relativo de células. Los histogramas en blanco representan el control de poblaciones de células marcadas con los respectivos reactivos secundarios. Conclusión: El 1-1C4 Fab redujo la sensibilidad de la expresión de los tres isotipos de clase II (DR, DP, DQ) con una intensidad de reducción comparable a la alcanzada mediante el mAb específico para el isótopo (anti-Dp, anti-DQ) . Esta reducción de la sensibilidad de pan-clase II mediante el 1-1C4 Fab fue selectiva, puesto que el HLA de clase I y las moléculas CD18 no resultaron afectadas. Por lo tanto, además de ser de utilidad para el tratamiento de indicaciones asociadas al HLR-DR tales como la artritis reumatoide, los fragmentos Fab de la invención obtenidos a partir de los mAbs de toda la clase II, tales como el 1-1C4 serían de utilidad para el tratamiento de enfermedades ligadas a la expresión del HLA-DP y -DQ tales como la esclerosis múltiple, el tipo I de diabetes mellitus, yasthenia gravis, eritematosis, rechazo de trasplantes de órganos, y la enfermedad del injerto versus hospedador (refs. 36-41).

Ejemplo 15 Ausencia de aumento de secreción TNFa mediante el cultivo conjunto de células LG2 y células Priess con L243 y sus fragmentos.

Estudios previos han demostrado que la unión entrecruzada de las moléculas de DR mediante el L243 en la línea JY de células B transformadas con el EBV, aumentó la secreción de TNFa (20) . Dado que esto podría ser un posible mecanismo para la citotoxicidad, se midió la liberación de TNFa por las células Priess y LG2 cultivadas conjuntamente con el mismo L243 y sus f agmentos .

Métodos. Se cultivaron células APC (105 células/ml) en presencia de concentraciones equivalentes del anticuerpo L243 completo (10 nM) o sus fragmentos F(ab)'2 (10 nM) y Fab (20 nM) durante 16 horas, como se ha indicado. Se midió la concentración de TNFa en los sobrenadantes de los cultivos empleando el equipo ELISA estándar controlado internamente (T cell Diagnostics, Cambridge, Massachussets) . Los efectos citotóxicos y de modulación de la DR, de los reactivos monoclonales fueron confirmados mediante in unofluorescencia como en el ejemplo 4 (no se indican los datos). Los resultados están indicados en la fig. 13.

Conclusión: No se detectó ningún aumento significativo del TNFa en estos cultivos. Por lo tanto, el mecanismo de la citotoxicidad así como el de la reducción selectiva de la sensibilidad del DR queda por investigar.

Inhibición de la respuesta de las células Th con el mAbs anti-DR y sus fragmentos Ejemplo 16 Inhibición de la respuesta de las células Th con el mAb anti-DR, sus fragmentos ycon los péptidos que se unen al DR Métodos: Clones de células Th positivos CD4, NBHAC25, KMHA25 y DSHABB10 preparados según la ref. 32 responden a la hemaglutinina (HA) del virus de la influenza, péptido HA307-319 (PKYVKQNTLKLAT) presentado mediante DRA/DRB1*0101, DRA/DRB1* 0401 y DRA/DRB1* 0401 respectivamente. Las células Th se incubaron con células APC tratadas con mitomicina C, el antígeno (134 nM) e inhibidores. Se midió la proliferación de las células Th específicas para el antígeno mediante el ensayo estándar de incorporación de 3H-timidina. Los resultados están indicados en la Tabla 3. Conclusión: Los mAbs, LB 3.1, L243 y 1-1C4, es decir, aquellos que inducen la reducción de la sensibilidad de las moléculas de DR, fueron también potentes inhibidores de la activación de las células Th cooperadoras. Por el contrario, los mAb que no redujeron la sensibilidad del DR (CCCL20, 8D1, 9F1, 9F2, 10F12) o bien no afectaron las respuestas de las células Th, o bien indujeron un efecto inhibidor marginal (tabla 3) . Así, la capacidad de reducir la sensibilidad del DR, se corresponde con la actividad inhibidora. Además, estos resultados indican que la reducción de la sensibilidad del mAb tiende a reconocer los epitopos situados en los dominios de la unión peptídica (al y ßl) de las moléculas de la clase II.

Tuulc- J. InniDici?n tfe x respuesta de c-t. ccjuid-i 1" con mAb auci-üR, sus fragmentos, y péptidos de unión con el DR.

Clon Tli ?l'C: Antígeno Inhibidor Actividad biológica del inhibidor I)RB1*<* Especifi- Reducción % Máximo iC50c (o IC?,d(o cidad del de la sensibi- de rango, en rungo, en domino DR I dad del DR inhibición nM) nM) NHI1?C25 LG2:0101 H?307-31 1,113.1 m?b ul 100 3-8 660 I.B3.1 lab al 100 2-8 0.-120. l'BMC:0101 H?307-319 LB3.1 mAb al 100 0.9 30 LB3.1 Fab al + 100 70 500 Native HA I.B3.1 mAb al i 100 <0.1 0.6 LB3.1 Fab al + 100 0.8 60 LG2:0101 IIA307-319 L243 mAb al 100 3-8 6-20 L243 ul 100 30 F(ab)'z L243 Fab al 100 7-40 40-180 1-1C4 mAb ßl 100 1-4 6-20 1-1C4 Fab ßl 100 4-12 20-60 CCCL20 ß2 0-26 N/Ae N/A mAb 8D1 mAb ßl 0-18 N/A N/A 9F1 mAb 2 31 - b N/A N/A 9F2 mAb 2 42-4/ N/A N/A 10F12 mAb 42-52 40 N/A aXA/aXRA 240- alßl 48-7 N/A peptido^ 270.0008 m/ 1-8 al l 2.100 N/A pcp?i l?n KMI I?25 Priess: H?307-3 19 LB3.1 mAb a l 100 1 .8 i 6-20 0401 PBMC: 0401 Nalive MA LB3.1 m?b al J00_ SI: DSI IABB 10 Priess: 1IA307-3 9 LB3.1 mAb al 100 4 18 0401 l - lC4 n?Ab ßl + 100 3,8 20_ M C Fab ß l + 100 1 7 80 1.243 Fab al + 100 18 1 80 L? o 0 a moléculas de DR que presentan el antígeno a los clones de Th. b lograda a 60 nM para mAb y sus fragmentos, y a 10 µM para los péptidos antagonistas, c concentración necesaria para el 50% de inhibición de la respuesta de las células Th proliferativas específicas para el antígeno. Valor más alto y más bajo de 3 a 4 experimentos . 5 d Concentración necesaria para el 94 % de inhibición de la respuesta de las células Th proliferativas específicas para el antígeno. Valor más alto y más bajo de 3 a 4 experimentos . e No es posible: Los valores de ICS0 y IC,« no pueden establecerse ya que los niveles de inhibición medidos fueron inferiores al 50 % y 94 % respectivamente. f aXA (péptido CY760.50, aXAAAKTAAAAa-NH, ; ref. 17) y aXRA (aXRAMKTLAAAa-NH2) equivalente para la capacidad inhibitoria de las células T. g Depende de la carga de antígeno (HA307-319 desde 13,4 pM hasta 134 nM) . h Ac-YRAMATLA-NH, .

Ejemplo 17 Concentración de anticuerpo necesaria para la inhibición la reducción de las células Th y de la sensibilidaddel DR Para estudiar más a fondo la correlación demostrada en el ejemplo 16, se determinó la necesaria concentración de anticuerpo para la reducción de la sensibilidad e inhibición.

Métodos: Se incubaron los clones de células KMHA25 y DSHABB10 (ver en tabla 3) con células Priess tratadas en C con mitomicina, como APC, péptido HA307 -319 como antígeno (330 nM) , y las concentraciones indicadas de mAb LB3.1. La proliferación de células Th específicas para el antígeno (panel superior) se midió mediante la incorporación de 3H-timidina, 3 días más tarde. Se efectuó la citometría de flujo de las células Priess con mAb LB3.1 (panel inferior) como en el ejemplo 3. Los resultados están indicados en la fig. 14. Conclusión: Se logró una inhibición casi completa de las respuestas de Th, con una concentración de mAb que indujo el 90 % de reducción de la sensibilidad de DR en aproximadamente 2/3 de APC (sin matarlas), sugiriendo la necesidad de una concentración similar para ambos fenómenos .

Ejemplo 18 Efecto del mAb anti-DR y los fragmentos Fab sobre la presentación del antígeno mediante APC fijadas.

Se investigó si la reducción de sensibilidad del DR es el único mecanismo implicado en la inhibición de la respuesta de las células Th.

Métodos: Las células APC (LG-2) se fijaron con glutaraldehído (Fluka Chemie, Buchs, Suiza). Se midió la respuesta del clon de células Th, NBHAC25 a las LG-2 tratadas con mitomicina ("My") o fijadas ("Fix"), más HA307-319 (134 nM) en presencia de mAb o Fab, como en el ejemplo 17. Los resultados están indicados en la fig. 15. Conclusión: Los mAbs anti-clase II y sus fragmentos Fab pueden también inhibir la respuesta de las células Th al péptido antígeno presentado en células APC fijadas (esto es, muertas), en donde la reducción de la sensibilidad de las moléculas de clase II no es posible. Así, por lo menos un mecanismo adicional, lo más probable un obstáculo estérico de la interacción del receptor (TCR) del antígeno de las células Th de clase II, juega un papel en la inhibición de las células Th.

Ejemplo 19 Efecto de la carga de antígeno sobre la potencia del mAb, Fab, y péptido antagonistas.

Se comparó la relativa eficacia de los mAbs anti-clase II, sus fragmentos y de los péptidos antagonistas del sitio de unión, en la inhibición de la respuesta de las células Th.

Métodos: Como en el ejemplo 15. Clon de Th, NBHAC25; APC, LG-2. Panel superior HA 307-319 13,4 nM, nivel inferior 330 nM. Péptidos como en la tabla 3. Los resultados están indicados en la fig. 16. Conclusión: Los anticuerpos y los fragmentos Fab son comparables en cuanto a su capacidad inhibitoria, siendo este último sólo marginalmente menos eficaz que el primero. Sin embargo, ambos fueron varios cientos de veces mas eficaces, que los péptidos. Es importante resaltar que el aumento de la concentración de antígeno (30 veces mayor en el panel inferior que en el panel superior de la fig. 16) ocasionó una menor eficacia del péptido antagonista pero no afectó la potencia del mAb. Esta observación se explica por diferencias en el mecanismo de inhibición: mientras los péptidos compiten directamente con el antígeno para los sitios de unión de la clase II, los anticuerpos reducen la sensibilidad de la expresión de clase II así como impiden la interacción MHC-TCR.

Ejemplo 20 Efectos relativos del Fab y los péptidos en las curvas dosis de antígeno-respuesta Se comparó la capacidad de los fragmentos Fab y de los péptidos para inhibir la respuesta de las células Th en un amplio margen de concentraciones de antígeno .

Métodos. Como en el ejemplo 17. Clones de Th, NBHAC25; APC, LG-2; HA307-319 a partir de 13,4 pM a 134 nM; Fab, 100 nM; péptido aXA, 100 µM. Los resultados están indicados en la fig. 17.

Conclusión: Es evidente a partir de los datos, que los fragmentos Fab tienen la capacidad de inhibir la respuesta de las células Th a ~ 1000 veces más alta en las concentraciones de antígeno que en los péptidos, y esta diferencia se mantiene constante durante todo el margen de concentraciones de antígeno.

Ejemplo 21 Efecto de los antagonistas de la clase II sobre la células continuada de las respuesta Th Era importante establecer si las diferentes clases de antagonistas de la clase II podían interferir con una respuesta continuada de las células Th. Aunque esta cuestión no pudo ser investigada debidamente dentro del corto marco de tiempo de la respuesta in vitro de las células Th, se hizo un intento de comparación entre los fragmentos Fab y los péptidos, añadidos en diferentes momentos al sistema ApC-antígeno-células Th.

Métodos. Como en el ejemplo 17. Clon de células Th, NBHAC25; APC, LG-2; HA307-319, 4 nM. Incubación de APC con HA a partir de 2 horas en adelante. Clon añadido a las O horas. Se empleó el Fab de LB3.1. Los resultados están indicados en la fig. 18. Conclusión: La adición retrasada de un péptido antagonista dio como resultado una gradual supresión, dependiente del tiempo, de la actividad inhibidora, la cual no pudo restablecerse mediante un aumento de la concentración del competidor. Por el contrario, los fragmentos Fab causaron una inhir..ción casi completa incluso cuando se añadieron 2 horas después de las células Th, y la pequeña potencia inhibidora pudo compensarse mediante una adición retrasada con concentraciones mayores de Fab. Así, los fragmentos Fab parecen ser más eficaces en interferir con la respuesta continuada de las células Th que los péptidos competidores de los que se dispone habitualmente.

Ejemplo 22 Producción del mAb 1-1C4 El HLA-DR se inmunoprecipitó a partir de células EBV-LCL Priess, empleando el mAb L243, y las cadenas HLA-DR a y ß se separaron ediante SDS-PAGE. Una banda electroforética de 28k que contenía la cadena DR-ß se cortó del gel y se empleó para inmunizar un ratón BALB/c. A continuación, se inmortalizaron las células B del ratón inmune mediante la fusión con la línea de mielomas PAI-0 [Stocker, W. y col., Research Disclosure, . 217. 155-157 (1982)] con el fin de obtener hibridomas que segregaran el mAb. Los sobrenadantes de los cultivos de dichos hibridomas fueron sometidos a selección para detectar su capacidad de inhibir la activación del clon KMHA25 de las células Th, HA/DRB1*0401 (ver tabla 3) en presencia del antígeno HA 307-319 y células Priess como APC. Se identificó el hibridoma 1-1C4 como el que segregaba un mAb que tenía una capacidad inhibitoria. REFERENCIAS 1. Babbitt, B. et al. Nature, 317, 359-361 (1985). 2. Baxevanis, C.N. et al. [mmurnogenetics 11, 617-625 (1980) . 3. Rosenbau , J.T. et al. J. Exp. Med., 154, 1694-1702 (t981) . 4. Waldor, M.K. et al. Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 80, 2713-2717 (1983) . 5. Jonker, M. et al. J. Autoimmurn., 1, 399-414 (1988). 6. Stevens, H.P. et al. Transplant. Proc., 22, 1783- 1784 (1990) . 7. Billing, R. & Chatterjee, S. Transplant. Proc. 15, 649-650 (1983) . 8. Jonker, M. et al. Transplant. Proc., 23, 264-265 (1991) . 9. Gorga, J.C. et al. Cell. Immurnol., 103, 160-173 (1986) . 10. oods, A. et al. J. Exp. Med., 180, 173-181 (1994). 11. Lampson, L.A. & Levy, R. J. Immunol. 125, 293-299 (1980) . 12. Déjelo, C.L. et al. Humman Immunol., 17, 135-136 (1986) . 13-. Radka, S.F. et al. J. Immunol., 130, 1863-1866 (1983) . 14. Cammarota, G. et al. Nature, 356, 799- 801 (1992).

. Nabavi, N. et al. Nature, 360, 266-268 (1992). 16. Pennell, C.A. et al. Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 82, 3799-3803 (1985) . 17. Ishioka, G. Y. et al. J. Immunol., 152, 4310-4319 (1993) . 18. Andrew, S.M. & Titus, J.A. Current Protocols in Immunology (eds. Coligan, J.E. et al.) 1, 2.8.1-2.8.10 (Greene & Wiley, New York, 1994) 19. Palacios, R. Proc. Natn. Acad. Sci. USA 82, 6652-6656 (1985) . 20. Altomonte, M. et al. J. Immunol., 151, 5115-5122 (1993) . 21. Palacios, R. et al. Proc. natn. Acad. Sci. USA, 80, 3456-3460 (1983) . 22. Clement, L.T. et al. J. I munol., 136, 2375-2381 (1986) . 23. Howard, D.R. et al. Exp. He atol., 14, 887-895 (1986) . 24. Vaickus, L. et al. Cell. Immunol., 119, 445-458 (1989) . 25. Kabelitz, D. & Janssen. O. Cell. Immunol., 120, 21-30 (1989) . 26. Holte, H. et al. Eur. J. Immunol. 19, 1221-1225 (1989) . 27. Newell, M.K. et al. Proc. natl. Acad. Sci. USA, 90, 10459- 10463 (1993) . 28. Truman, J.-P. et al. Int. Immunol., 6, 887-896 (1994) . 29. Mourad, W. et al. J. Exp. Med., 172 1513-1516 (1990) ., 30. Naquet, P. et al. Immunogenetics . , 18, 559- 574 (1983) . 31. Gilfillan, S. et al. J. Immunol., 147, 407 4-4081 ( 1991) . 32. Panina-Bordignon, P. et al. Eur. J. Immunol., 19, 2237-2242 (1989) . 33. Harris, E.D. Jr . N. Engl. J. Med., 322(18): 1277 (1990) . 34. Cosimi, B. et al. N. Engl. J. Med., 305, 308-314 (1981) . 35. Chatenoud, L. et al. Eur. J. Im unol., 12, 979-982 (t982) . 36. Svejgaard, A. et al. I munol. Rev., 7 0, t93-218 (1983) . 37. Todd, J.A. et al. Science, 240 1003-1009 (1988). 38. Nepom, . G T. et al. Immunol., 9, 493-525 (1991). 39. Sprent, J. et al. J. Exp. Med. 163, 998-1011 (1986) . 40. Santos, G.W. Im unol. Rev. 88, 169-192 (1985). 41. Lehmann, P.V. et al. J. Exp. Med., 171, 1485-t496 (t990) . 42. Co, M.S. and Queen, C. Nature, 351, 501-502 (1991). 43. Lewis, A.P. and Crowe, J.S. Gene, 101, 297-302 (1991) .

Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. Un fragmento Fab caracterizado porque consta de un fragmento Fab de inmunoglobulina y seis regiones determinantes complementariamente, que están contenidos dentro de dicho segmento Fab, en el cual de una a seis de dichas regiones etemiantes complementariamente son regiones determinantes complementariamente de un anticuerpo monoclonal que tiene las siguientes propiedades: 1) el anticuerpo monoclonal se une al primer dominio del HLA-DR, 2) el anticuerpo monoclonal es citotóxico para las células presentadoras del antígeno, que expresan el HLA-DR, 3) el anticuerpo monoclonal reduce la sensibilidad de la expresión del HLA-DR en las células presentadoras del antígeno.

2. El fragmento Fab de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo monoclonal de ratón.

3. El fragmento Fab de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la inmunoglobulina es una inmunoglobulina humana.

4. El fragmento Fab de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque las seis regiones determinantes complementariamente de dicho fragmento Fab son las seis regiones determinantes complementariamente de dicho anticuerpo monoclonal.

5. Una composición farmacéutica fluida caracterizada porque consta de: 1) un soporte fluido farmacéuticamente aceptable; y 2) una cantidad terapéuticamente eficaz de un fragmento Fab como se ha reivindicado en una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4.

6. La composición de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque la cantidad del fragmento Fab es de 0.5 a 5 mg/ml de la composición fluida .

7. La composición de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque la cantidad del fragmento Fab es de 1 a 2 mg/ml de la composición fluida .

8. Un procedimiento para la preparación de un fragmento Fab como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque un anticuerpo monoclonal como se ha definido en las reivindicaciones 1 ó 2, se escinde mediante pepsina y los fragmentos Fab se aislan mediante métodos ya conocidos en el estado actual de la especialidad.

9. Un fragmento Fab, caracterizado porque se prepara mediante el procedimiento de la reivindicación

10. Un fragmento Fab de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque es una substancia terapéuticamente activa, especialmente como agente inmunosupresor .

11. Uso de un fragmento Fab de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, para la supresión de la respuesta inmune de un paciente.

12. Empleo de un fragmento Fab de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para el tratamiento de la artritis reumatoide.

13. La invención como se ha descrito hasta aquí

14. Un método para la supresión de la respuesta inmune de un paciente, que comprende la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un fragmento Fab que comprende un fragmento Fab como se ha definido en la reivindicación 3 ó 4.