MXPA97000352A - Enzimas novedosas termoestables y acido establesderivadas de especies de sulfolobus - Google Patents

Abstract

Las enzimas novedosas termoestables yácido estables tiene actividada-1,4 hidrolítica y una actividad 1, 6 hidrolítica que se deriva de las especies del género Sulfolobus. Estas enzimas son capaces de expresar altos niveles de actividad a-1, 4 hidrolítica, incluyendo la actividad máxima a-1, 4 hidrolítica de las mismas, a phs altamenteácidos de entre aproiximadamente 2.5 y aproximadamente 4.5. Estas a-amilasas son capaces ademas de expresar altos niveles de actividad a-1, 4 hidrolítica, incluyendo la actividad máxima a-1, 4 hidrolítica de las mismas, a temperaturas elevadas de entre aproximadamente 90øC y aproximadamente 120øC. En la presente, se exponen particularmente tales enzimas que se derivan de cepas de las especies S. acidocaldarius y en particular, Sulfolobus acidocaldarius DSM 639. Los procesos de degradación de almidón modificados (licuación y sacarificación) que utilizan estas enzimas novedosas también son expuestos en la presente.

Description

ENZIMAS NOVEDOSAS TERMOESTABLES Y ACIDO-ESTABLES DERIVADAS DE ESPECIES SULFOLOBUS Campo de la Invención La presente invención se refiere a enzimas novedosas termoestables y ácido-estables que tienen una actividad a-1,4 hidrolítica y las cuales se derivan de especies del género Sulfolobus. y en particular cepas de las especies Sulfolobus acidocaldarius, y el uso de estas enzimas novedosas en la degradación de almidón. Antecedentes de la Invención Las a-amilasas (E.C.3.2.1.1) son enzimas hidrolizantes que tienen actividad a-1,4 hidrolítica en almidón, amilopectina y almidón. Estas enzimas se utilizan para una amplia variedad de aplicaciones industriales. Tales aplicaciones industriales pueden requerir que la a-amilasa utilizada sea de ácido altamente estable y/o altamente termoestable. Una aplicación industrial importante para tales enzimas ácido-estables y termoestables que tienen tal actividad a-1,4 hidrolítica (tal como a-amilasas) es la degradación enzimática (hidrólisis) de almidón para la producción de azúcares, tales como glucosa. Debido a que el almidón está compuesto de unidades de glucosa unidas por ambos enlaces a-1,4 y a-1, 6, para completar la hidrólisis del mismo, se requiere del uso de un número de enzimas con especificaciones de substrato diferentes. Este proceso de degradación enzimática involucra dos etapas enzimáticas: licuefacción y sacarificación. En la licuefacción, típicamente los granulos de almidón son mezclados en agua en la presencia de una a-amilasa. Esta mezcla es naturalmente acídica, capaz de tener un pH de aproximadamente 4.0. Los gránulos/a-amilasa mezclados se gelatinizan después con calor al pasar a través de un cocedor a chorro, el cual eleva rápidamente la temperatura hasta aproximadamente 105°C-110°C. Después de unos cuantos minutos, la temperatura de la mezcla disminuye entonces hasta 90°C-95°C y se mantiene a esa temperatura durante al menos una hora. Las a-amilasas convencionalmente utilizadas en la licuefacción son aquellas derivadas de B . licheniformis y B . stearothermophilus . Estas a-amilasas hidrolizan el almidón y solubilizan las dextrinas, produciendo hidrolizados de baja viscosidad adecuados para el procesamiento ulterior (en sacarificación) a jarabes de azúcar, tales como jarabes de glucosa. Desafortunadamente, el uso de esas a-amilasas requiere que se hagan dos ajustes principales en la licuefacción. El primer ajuste necesario para permitir el uso de las a-amilasas convencionales en la licuefacción es elevar el pH del pH naturalmente acídico de la mezcla de almidón de aproximadamente 4.0 hasta entre aproximadamente 5.5 y aproximadamente 6.5. Tal ajuste es necesario para permitir la actividad enzimática máxima de la a-amilasa por expresarse (realmente, el pH óptimo de la a-amilasa de B . licheniformis es de aproximadamente 6.0) . Tal ajuste también es necesario para la enzima, ya que, en condiciones de licuefacción, esa enzima es relativamente inestable en pHs inferiores a 6. Sin embargo, el incremento del pH de la mezcla de almidón en la licuefacción tiene desventajas. Estas desventajas incluyen un incremento de formación de color, el riesgo de generar problemas de filtración y la formación espontánea de maltulosa, la cual, debido a que no puede hidrolizarse para dextrosa en la sacarificación (subsecuente) , conduce a una pérdida en la producción. De esta manera, aunque el llevar a cabo la licuefacción al mayor pH es generalmente considerado como ventajoso para la a-amilasa, esto es , no obstante, considerado desventajoso para el proceso. El segundo ajuste necesario para permitir el uso de las a-amilasas convencionales en la licuefacción es el uso de iones de calcio para estabilizar la enzima.

Realmente, la a-amilasa de B-licheniformis requiere que se utilicen al menos cincuenta (50) ppm (partes por millón) de calcio para la estabilización de la misma en condiciones de licuefacción. A medida que se incrementa la concentración del ion de calcio, se incrementa la estabilidad de la a-amilasa, permitiendo mediante esto que el medio de licuefacción tenga un pH inferior. Sin embargo, desafortunadamente, la presencia de estos iones de calcio interfiere con la etapa de refinación en la producción de jarabes altos en fructosa. Por consiguiente, se prefiere una concentración baja de iones de calcio en la licuefacción. Una desventaja adicional presentada por el uso de las a-amilasas convencionales es que, a temperaturas mayores de aproximadamente 110 °C, en condiciones de licuefacción, las a-amilasas convencionales se desnaturalizan (destruyen) . A este respecto, las a-amilasas convencionales limitan las temperaturas utilizadas en la licuefacción para el rango de entre aproximadamente 90 y aproximadamente 110 °C. Sin embargo, el uso, en la licuefacción, de temperaturas mayores de (mayores de aproximadamente 100 °C) hasta aproximadamente 120 °C permitirían que se incrementara la concentración de sólidos disueltos . En la sacarificación (la segunda etapa en la elaboración de jarabes de dextrosa) , las maltodextrinas obtenidas de la licuefacción se convierten en glucosa mediante una glucoamilasa fungal, tal como aquellas derivadas de especies de Aspergillus, tal como Optidex R suministrado por SOLVAY, y Rhizopus . Es importante que la sacarificación sea conducida bajo condiciones de pH y temperatura que sean óptimas para la glucoamilasa utilizada. Además es importante que, durante la sacarificación, la a-amilasa utilizada en la licuefacción exprese un nivel de actividad enzimática el cual (al ser tan bajo) no interfiera con ese proceso. Ya que el pH óptimo de las glucoamilasas convencionalmente utilizadas, tal como las derivadas de las especies de Aspergillus. es altamente acídico (alrededor de pH 4.0), la sacarificación se lleva a cabo de manera óptima bajo condiciones altamente acídicas (pH de 4.0 a 4.5). Además, ya que la temperatura óptima de las glucoamilasas convencionalmente utilizadas es de aproximadamente 60 °C, la sacarificación se lleva a cabo de manera óptima a aproximadamente 60 °C. De esta manera, para obtener condiciones óptimas, el pH de la suspensión de almidón licuada necesita ajustarse una vez más, esta vez con objeto de volver a disminuir el pH de desde aproximadamente 6.0 hasta por debajo de 4.5 después de la licuefacción, estableciéndose la temperatura a aproximadamente 60 °C. Desafortunadamente, tal ajuste de pH adicional da como resultado un incremento en la concentración de sales, incluyendo las sales que pueden ser añadida durante la licuefacción para estabilizar la a-amilasa, en la suspensión de almidón por sacarificarse. Este incremento en la concentración de sales incrementa, a su vez, la resistencia iónica de la suspensión de almidón. Tal incremento en la resistencia iónica es indeseable ya que interfiere con la subsecuente retención durante la elaboración de jarabes de fructosa. A partir de lo anterior, puede observarse fácilmente que sería deseable eliminar la necesidad del ajuste de pH intermedio en la licuefacción enzimática mediante la proporción de una enzima que tiene una actividad a-1,4 hidrolítica en el almidón y la cual, en condiciones de licuefacción, es tanto ácido-estable como capaz de expresar la actividad a-1,4 hidrolítica máxima de la misma a un pH altamente acídico, tal como aquel encontrado en la licuefacción. También puede observarse que sería deseable además que tal enzima también sea, en condiciones de licuefacción, tanto termoestable como capaz de expresar la actividad a-1,4 hidrolítica (enzimática) máxima de la misma a temperaturas, tales como aquellas que se encuentran en licuefacción, y preferentemente, también aquellas temperaturas que son mayores que las temperaturas encontradas en licuefacción. Todavía puede observarse además que sería más ventajoso para tal enzima, en condiciones de licuefacción, ser capaz de expresar la actividad a-1,4 hidrolítica (enzimática) de la misma esencialmente de manera independiente a la concentración de ion de calcio. Finalmente, todavía puede observarse además que también sería más deseable que tal enzima, en condiciones de sacarificación (temperaturas de aproximadamente 60 °C y pH de aproximadamente 3.5-4.5) expresara niveles de actividad a-1,4 hidrolítica (enzimática) que (sean tan bajos que) no interfieren con el proceso de sacarificación, Finalmente, también puede observarse que la proporción de tal enzima sería útil para otras aplicaciones donde las a-amilasas son actualmente utilizadas de manera común y/o en otras aplicaciones donde tales enzimas que tienen actividad a-1,4 hidrolítica no se emplean actualmente de manera común, sino donde tal actividad sería no obstante deseable, especialmente donde se involucran el pH altamente acídico y/o las condiciones de temperatura elevada . A pesar de las ventajas que proporcionaría tal enzima, especialmente en la producción de azúcares de almidón, hasta donde sabemos, ninguna a-amilasa tal ha sido previamente identificada, aislada y/o purificada. Esto es a pesar del hecho de que las especies del género Sulfolobus y, en particular, la especie a partir de la cual se deriva la enzima de la presente invención, Sulfolobus acidocaldarius DSM 639, se han conocido, depositada en una colección de cultivos aprobada y se han encontrado disponibles para el público en general durante varios años. Aunque se conocen a-amilasas derivadas de otras especies de Sulfolobus. no se sabe que estas a-amilasas posean las propiedades (especialmente las propiedades ácido-estables deseadas) arriba descritas. Un ejemplo de tales otras a-amilasas conocidas derivadas de otras especies de Sulfolobus incluyen esa a-amilasa que se deriva de las especies Sulfolobus solfataricus (ver Lama y Cois., Biotechnology Letters, 1990, 12:431-432 y Lama y Cois., Biotech Forum Europe, 1991, 8:201-203). Esa a-amilasa (la cual es muy diferente de la a-amilasa de la presente invención) posee un pH óptimo de 5.5 y una temperatura óptima de 70 °C. Desafortunadamente, ambas de estas propiedades restringirían el uso de las a-amilasas de tales especies de Sulfolobus, ya que también restringen el uso de las a-amilasas convencionales, en varias aplicaciones industriales, incluyendo licuefacción en la degradación enzimática de almidón a azúcares. Problemas adicionales presentados por el uso de la a-amilasa derivada del S . solfataricus en la licuefacción es que ésta es producida de manera intracelular y que cataliza la síntesis de trehalosa. De hecho, no estamos enterados de ninguna a-amilasa ácido-estable que sea segregada de manera extracelular por cualquier especie de Sulfolobus . También estamos conscientes de la existencia de a-amilasas ácido-estables derivadas de especies del género Pyrococcus (Solicitud de Patente Internacional WO 90/11357) . Desafortunadamente, aunque la actividad enzimática de esa a-amilasa es esencialmente independiente de iones de calcio, no obstante, ésta tiene una actividad máxima en el rango de pH de entre 5.2 y 5.8 y en el rango de temperatura de entre 90 y 105 °C. De esta manera, esa enzima no funcionaría bajo sus condiciones óptimas en un proceso de licuefacción ejecutado en el pH arriba tratado. Además, esa enzima no funcionaría bajo sus condiciones óptimas en un proceso de licuefacción ejecutado a temperaturas mayores a la de 95°C-110°C típicamente encontrada en tales procesos. Las pululanasas (E.C.3.2.1.41) son enzimas hidrolizantes bien conocidas que tienen actividad a-1, 6 hidrolítica en pululano y almidón. Las pululanasas también se utilizan para una amplia variedad de aplicaciones industriales, incluyendo la sacarificación. Desafortunadamente, el ajuste del pH de la suspensión (a aquel que es óptimo para glucoamilasas convencionales) durante la sacarificación da como resultado una suspensión que tiene un pH que se encuentra por debajo de aquel que es óptimo para las pululanasas convencionales (pH de aproximadamente 6.0). Aunque sería deseable el uso de pululanasas en la licuefacción, las pululanasas convencionales no poseen buena actividad enzimática en las condiciones de proceso encontradas en la licuefacción, incluyendo los pH's inferiores (naturalmente ocurrentes) arriba tratados. De esta manera, las pululanasas no se emplean convencionalmente en la licuefacción a pesar de la deseabilidad de las mismas. De acuerdo con lo anterior, puede observarse que sería más ventajoso proporcionar una enzima que tenga una actividad a-1,6 hidrolítica en almidón que sea capaz de expresar una buena (y preferentemente máxima) actividad a- 1,6 hidrolítica en almidón a pH's altamente acídicos (y, preferentemente, en el rango de entre 2.5 y 4.5) en las temperaturas que pueden encontrarse en la licuefacción (entre aproximadamente 90 °C y aproximadamente 110 CC) y/o sacarificación (aproximadamente 60°C) , a fin de ser capaz de expresar una buena actividad a-1,6 hidrolítica (enzimática) en tales pH's altamente acídicos que pueden encontrarse durante la licuefacción y/o sacarificación. Las amilopululanasas son enzimas hidrolizantes menos conocidas que tienen actividad a-1,4 hidrolizante en amilosa y almidón así como actividad a-1,6 hidrolizante en pululano y almidón. Se sabe que las amilopululanasas son producidas de manera natural mediante especies del género Bacillus. Thermus , Clostridium, Thermoanaerobium, Thermoanaerobacter, Pyrococcus y Thermococcus . Sin embargo, no estamos conscientes de ninguna amilopululanasa que se derive de especies o cepas del género Sulfolobus . De acuerdo con lo anterior, todavía puede observarse además que sería aún más ventajoso proporcionar unas amilopululanasas que tiene actividad a-1,4 hidrolizante en almidón,, así como actividad a-1,6 hidrolizante en almidón, cuya amilopululanasa es capaz de expresar una buena (y preferentemente máxima) actividad a-1,4 hidrolítica y/o actividad a-1,6 hidrolítica en almidón a pH's altamente acídicos (y, preferentemente, en el rango de entre 2.5 y 4.5) y a temperatura que pueden encontrarse en la licuefacción (entre aproximadamente 90 °C y aproximadamente 110 °C) y/o sacarificación (aproximadamente 60°C), a fin de ser capaz de expresar buena actividad a-1,4 hidrolítica y/o actividad a-1,6 hidrolítica (enzimática) en tales pH's altamente acídicos, que pueden encontrarse durante la licuefacción y/o sacarificación. Sumario de la Invención Un objeto básico de la presente invención es proporcionar una enzima y, en particular, una enzima que tiene actividad a-1,4 hidrolítica en almidón, la cual es capaz de hidrolizar almidón para la producción de azúcares, tales como glucosa, y la cual, en las temperaturas que pueden encontrarse en la licuefacción (entre aproximadamente 90 °C y aproximadamente 110 °C) , es tanto ácido-estables y tiene un pH óptimo en el rango de entre 2.5 y 4.5, a fin de ser capaz de expresar actividad a-1,4 hidrolítica máxima (enzimática) en tal pH altamente acídico, incluyendo el pH que puede encontrarse durante la licuefacción. Otro objeto básico de la presente invención es proporcionar una enzima tal, y en particular, una enzima tal que tenga actividad a-1,4 hidrolítica en almidón, la cual, al pH que puede encontrarse en licuefacción, sea también termoestable y tenga una temperatura óptima en el rango de entre aproximadamente 90 °C y aproximadamente 110°C, a fin de ser capaz de expresar una actividad a-1,4 hidrolítica máxima (enzimática) en tales temperaturas elevadas, incluyendo aquellas temperaturas encontradas durante la licuefacción. Todavía otro objeto básico de la presente invención es proporcionar tal enzima hidrolizante de almidón, la cual, al pH que puede ser encontrado en la licuefacción, es también tanto termoestable como tiene una temperatura óptima a temperaturas que son mayores que aquellas encontradas típicamente durante la licuefacción (temperaturas de entre aproximadamente 110 °C y aproximadamente 120°C) , a fin de ser capaz de expresar una actividad a-1,4 hidrolítica máxima (enzimática) en tales temperaturas mayores, a fin de que la concentración de sólidos disueltos que están siendo licuados pueda incrementarse . Todavía otro objeto de la presente invención es proporcionar una enzima hidrolizante de almidón, y en particular una enzima tal que tenga actividad a-1,4 hidrolítica en almidón, la cual, al pH y temperaturas que se encuentran típicamente durante la sacarificación (pH de entre aproximadamente 4.0 y aproximadamente 4.5 y temperaturas de aproximadamente 60 °C) , expresa un nivel de actividad enzimática el cual (es tan bajo que) no interfiere con ese proceso. Todavía un objeto adicional de la presente invención es proporcionar una enzima hidrolizante de almidón, y en particular una enzima tal cuya expresión de actividad a-1,4 hidrolítica (enzimática), en las condiciones de pH y temperatura que se encuentran típicamente en licuefacción, sea esencialmente independiente de la presencia de iones de calcio, a fin de que no necesiten añadirse iones de calcio durante la licuefacción, y además a fin de que ningún ion de calcio que pueda haber sido añadido no reduzcan la capacidad de la enzima para expresar la actividad a-1,4 hidrolítica (enzimática) de la misma. Un objeto básico adicional de la presente invención es proporcionar una enzima que tenga actividad a-1,4 hidrolítica en almidón, la cual sea tanto estable como capaz de expresar altos niveles de actividad a-1,4 (enzimática) en pH altamente acídico y/o temperaturas elevadas, a fin de proporcionar los tan requeridos medios para eliminar el ajuste de pH intermedio en la licuefacción enzimática que es necesaria con las a-amilasas convencionalmente utilizadas. Un objeto adicional es identificar y proporcionar tal enzima hidrolizante de almidón, la cual se produzca de manera extracelular. Todavía un objeto adicional es proporcionar una enzima tal que también tenga actividad a-1,6 hidrolítica en almidó . En otro aspecto de la presente invención, un objeto adicional es proporcionar una composición enzimática, que incluya las enzimas de la presente invención, capaz de hidrolizar almidón para la producción de azúcares, tales como glucosa. En todavía otro aspecto de la presente invención, un objeto básico adicional de la presente invención es proporcionar un proceso mejorado para la licuefacción de almidón con la ayuda de hidrólisis enzimática, en donde la licuefacción puede llevarse a cabo al pH naturalmente acídico de la mezcla que está siendo licuada, a fin de que se elimine la necesidad de un ajuste de pH intermedio de dicha mezcla. En todavía otro aspecto de la presente invención, un objeto básico adicional es proporcionar un proceso mejorado para la degradación de almidón en azúcares, tal como glucosa, en etapas consecutivas de licuefacción y sacarificación, en donde la licuefacción se lleva a cabo con una enzima que tiene actividad a-1,4 hidrolítica en almidón y sin necesidad de ajustar ya sea el pH y/o la concentración de ion de calcio de ya sea la mezcla de almidón y/o la suspensión de almidón licuado durante ya sea la licuefacción y/o sacarificación para acomodar dicha enzima en detrimento del proceso. En este aspecto, es todavía un objeto adicional de la presente invención proporcionar un proceso para la licuefacción de almidón, en donde la licuefacción puede llevarse a cabo a temperaturas que son mayores a las temperaturas (90 °C hasta 110 °C) arriba mencionadas, a fin de que pueda proporcionarse una concentración mayor de sólidos disueltos en la mezcla de almidón por licuarse.

Otro objeto básico de la presente invención es proporcionar un proceso tal que utiliza una enzima que tiene actividad a-1,4 hidrolítica en almidón, la cual es capaz de expresar altos niveles de actividad a-1,4 hidrolítica (enzimática) , y preferentemente la actividad a-1,4 hidrolítica máxima (enzimática) de la misma, en el rango de pH y/o el rango de temperatura que la mezcla de almidón pueda encontrar en la licuefacción. De esta manera, se evita la necesidad de ya sea ajustar el pH y/o añadir iones de calcio a la mezcla de almidón, mediante lo cual la concentración de sólidos disueltos de la suspensión de almidón licuada obtenida a partir de lo mismo se incrementa y además mediante lo cual la interferencia con la etapa de refinación subsecuente (para producir jarabes de fructosa) debido al hecho de que la resistencia iónica de la suspensión de almidón licuado obtenido se reduce y/o elimina. De acuerdo con las enseñanzas de la presente invención, se exponen en la presente enzimas novedosas que tienen actividad a-1,4 hidrolítica en almidón, la cual se deriva de especies del género Sulfolobus incluyendo, en particular, las especies Sulfolobus acidocaldarius . Específicamente expuesta en la presente, como un ejemplo de tales enzimas, es la enzima que tiene tal actividad a-1,4 hidrolítica que se deriva de la cepa Sulfolobus acidocaldarius DSM 639. Según se utiliza en la presente al referirse a cepas de enzimas, nucleótidos y microbios (es decir, Sulfolobus) , el término "derivado de" significa que las enzimas y nucleótidos de los que se está hablando son nativos de (se originan de) la cepa microbiana particular de la cual se dice se "derivan" . En este aspecto, las enzimas y nucleótidos derivados del S . acidocaldarius DSM 639 se refieren a aquellas enzimas y nucleótidos que son nativos de (se originan de) S . acidocaldarius DSM 639. Esta definición incluye secuencias de enzimas y nucleótidos que son idénticas a aquellas secuencias de enzimas y nucleótidos mencionados pero los cuales han sido (en el caso de los nucleótidos) ya sea insertados en (utilizados para transformar) un organismo huésped adecuado, y (en el caso de la enzima) que ha sido segregada por un huésped transformado. Esta definición también incluye mutantes, variantes y derivados de las enzimas y nucleótidos así referidos . Según se utiliza en la presente, el término "mutantes y variantes", cuando se refiere a enzimas, se refiere a enzimas obtenidas por la alteración de la secuencia y/o estructura aminoácida nativa (original) de la misma mediante aquellos medios bien conocidos por aquellos expertos en la materia, tal como por alteración de la secuencia nucleótida de ADN de la codificación de gel estructural por consiguiente y/o mediante substitución directa y/o alteración de la secuencia aminoácida y/o la estructura de la enzima. Según se utiliza en la presente, el término "mutantes y variantes" cuando se refiere a los nucleótidos se refiere a nucleótidos y secuencias nucleótidas obtenidas por la alteración del estado nativo (original) (nucleótidos) y/u orden (secuencia) de los mismos mediante aquellos medios bien conocidos por aquellos expertos en la materia, tal como mutagénesis química y de UV. Según se utiliza en la presente, el término "mutantes y variantes" cuando se refiere a cepas microbianas (tal como S . acidocaldarius DSM 639) , se refiere a células obtenidas mediante la alteración de la secuencia nucleótida de ADN de, por ejemplo, la codificación de gen estructural para la enzima de la misma que tiene actividad a-l;4 hidrolítica. La enzima es una enzima hidrolizante capaz de hidrolizar almidón para la producción de azúcares, tales como glucosa. Posee una estabilidad térmica y acídica extraordinaria así como exhibe pH favorable y temperatura óptima . Preferentemente, esta enzima tiene además actividad a-1,6 hidrolítica en almidón.

Según se utiliza en la presente, el término "actividad a-1,4 hidrolítica" cuando se refiere a la enzima de la presente invención significa que la actividad enzimática resultante en la división hidrolítica de las uniones a-1,4 glicocídicas en almidón y/o amilopectina y/o amilosa. Según se utiliza en la presente, el término "actividad a-1,6 hidrolítica" cuando se refiere a la enzima de la presente invención significa esa actividad enzimática resultante en la división hidrolítica de las uniones a-1,6 glicocílicas en almidón y/o amilopectina y/o amilosa. De acuerdo además con las enseñanzas de la presente invención, se expone en la presente una enzima novedosa que tiene actividad a-1,4 hidrolítica en almidón la cual, a temperaturas de entre aproximadamente 90 °C y aproximadamente 110 °C (las temperaturas que pueden encontrarse en licuefacción) , es capaz de expresar la actividad a-1,4 máxima hidrolítica (enzimática) a un pH altamente acídico de entre aproximadamente 2.5 y aproximadamente 4.5. A este respecto, el uso de las enzimas de la presente invención permitiría, en licuefacción, la tan anhelada eliminación del ajuste de pH intermedio de la mezcla que está siendo licuada, la cual es requerida con las a-amilasas convencionalmente utilizadas. Preferentemente, esta enzima tiene además una actividad a-1,6 hidrolítica en almidón. Aún de acuerdo con las enseñanzas de la presente invención, esta enzima novedosa que tiene actividad a-1,4 hidrolítica en almidón es capaz además de expresar, en un pH de entre aproximadamente pH 2.5 y aproximadamente pH 4.5 (el pH que puede encontrarse en la licuefacción) , la máxima actividad a-1,4 hidrolítica (enzimática) a temperaturas elevadas de entre aproximadamente 90 CC y 110 °C. Todavía además de acuerdo con las enseñanzas de la presente invención, esta enzima novedosa es aún además capaz de expresar, en pH de entre aproximadamente pH 2.5 y aproximadamente pH 4.5 (el pH que puede encontrarse en la licuefacción), la actividad a-1,4 hidrolítica máxima (enzimática) a temperaturas de entre aproximadamente 110 °C y aproximadamente 120 °C (temperaturas que son típicamente mayores a aquellas que pueden encontrarse en la licuefacción) . A este respecto, el uso de la enzima de la presente invención permitiría, en el pH que puede encontrarse en la licuefacción, que la licuefacción se lleve a cabo a temperaturas que son mayores a las temperaturas arriba mencionadas, a fin de que pueda proporcionarse una mayor concentración de sólidos disueltos en la mezcla de almidón por licuarse. Todavía además de acuerdo con las enseñanzas de la presente invención, esta enzima novedosa, a un pH de aproximadamente 4.5 (el pH que puede encontrarse en la sacarificación) es capaz de expresar un nivel de actividad a-1,4 hidrolítica (ensímatica) en temperaturas de aproximadamente 60 °C (cuyas temperaturas se encuentran típicamente durante la sacarificación) que son tan bajas que no interfieren con ese proceso. Se prefiere además que esta enzima sea capaz de expresar, en el pH y las temperaturas que puedan encontrarse en la licuefacción, una actividad a-1,4 hidrolítica (enzimática) ya sea en la presencia o en la ausencia de iones de calcio en la mezcla de almidón, de tal manera que la actividad a-1,4 hidrolítica (enzimática) de esta enzima durante la licuefacción sea esencialmente independiente de la concentración de ion de calcio de la mezcla de almidón. Todavía aún además de acuerdo con las enseñanzas de la presente invención, se expone en la presente una enzima que tiene actividad a-1,4 hidrolítica en almidón, la cual se deriva de una especie de Sulfolobus, y cuyas enzimas tienen un peso molecular estimado de aproximadamente 95 kDa y/o un pH óptimo de entre aproximadamente 3.0 y aproximadamente 4.0 (aproximadamente 3.5) y/o una temperatura óptima de entre aproximadamente 110 °C y aproximadamente 115 °C. Preferentemente, esta enzima tiene además actividad a-1,6 hidrolítica en almidón. Aún además de acuerdo con las enseñanzas de la presente invención, se exponen en la presente novedosas enzimas que tienen actividad a-1,4 hidrolítica en almidón, cuya enzima se deriva de las especies del género Sulfolobus, tal como cepas de las especies S . acidocaldarius , (incluyendo, en particular Sulfolobus acidocaldarius DSM 639) , cuyas enzimas son capaces de expresar la actividad a-1,4 hidrolítica máxima (enzimática) de la misma en el rango de pH que puede encontrarse en la licuefacción, de tal manera que se evite la necesidad de ajustar el pH de, y/o de incrementar la concentración de iones de calcio de, la mezcla de almidón durante la licuefacción. Preferentemente, esta enzima tiene además una actividad a-1,6 hidrolítica en almidón. Todavía aún además de acuerdo con las enseñanzas de la presente invención, se exponen en la presente enzimas novedosas que tienen actividad a-1,4 hidrolítica en almidón, las cuales se derivan de especies del género Sulfolobus. tal como cepas de las especies Sulfolobus acidocaldarius (incluyendo, en particular, Sulfolobus acidocaldarius DSM 639) , y cuyas enzimas son capaces de expresar la actividad a-1,4 hidrolítica máxima (enzimática) en el rango de temperatura (entre aproximadamente 90 °C y aproximadamente 110°C) que pueda encontrarse en licuefacción. Preferentemente, esta enzima tiene además una actividad a-1,6 hidrolítica en almidón. Todavía aún además de acuerdo con las enseñanzas de la presente invención, se exponen en la presente enzimas novedosas que tienen una actividad a-1,4 hidrolítica en almidón, las cuales se derivan de especies del género Sulfolobus, tal como cepas de las especies Sulfolobus acidocaldarius (que incluyen, en particular Sulfolobus acidocaldarius DSM 639) , cuyas enzimas son capaces de expresar la actividad a-1,4 hidrolítica máxima (enzimática) de la misma en ambos rangos de pH y rangos de temperatura que pueden encontrarse en la etapa de licuefacción, de tal manera que se evita la necesidad de ya sea ajustar el pH de, y/o de disminuir la concentración de iones de calcio de, la mezcla de almidón durante la licuefacción. En otro aspecto de la presente invención, se expone en la presente una composición enzimática que incluye las enzimas de la presente invención que tienen actividad a-1,4 y/o a-1,6 hidrolítica en un vehículo apropiado. Preferentemente, esta composición es útil en la licuefacción de almidón. En otro aspecto de la presente invención, se expone en la presente un proceso mejorado para la licuefacción enzimática de almidón, en donde tal licuefacción enzimática puede llevarse a cabo sin ningún ajuste de pH intermedio de la mezcla que está siendo licuada. En todavía otro aspecto de la presente invención, se expone en la presente un proceso mejorado para la degradación de almidón a azúcares, tal como glucosa, en donde tal degradación se lleva a cabo en etapas consecutivas de licuefacción y sacarificación sin necesidad de ajustar el pH de la mezcla de almidón durante ya sea la licuefacción y/o sacarificación. Aún además de acuerdo con las enseñanzas de la presente invención, se expone en la presente un proceso mejorado para la degradación de almidón a azúcares, tal como glucosa, en donde tal degradación se lleva a cabo en etapas consecutivas de licuefacción y sacarificación sin necesidad de incrementar (o de otro modo ajustar) la concentración de iones de calcio de la mezcla de almidón durante ya sea la licuefacción y/o sacarificación. Todavía aún además de acuerdo con las enseñanzas de la presente invención, se expone en la presente un proceso mejorado para la degradación de almidón en azúcares, tal como glucosa, en donde tal degradación se lleva a cabo en etapas consecutivas de licuefacción y sacarificación sin necesidad de ya sea ajustar el pH de, y/o incrementar la concentración de iones de calcio de, la mezcla de almidón durante ya sea la licuefacción y/o sacarificación . Todavía además de acuerdo con las enseñanzas de la presente invención, se expone en la presente un proceso mejorado para la licuefacción enzimática de almidón, en donde la licuefacción puede llevarse a cabo a temperaturas (de entre aproximadamente 110 °C y aproximadamente 120 °C) que son mayores a las típicamente encontradas (temperaturas de 90-110 °C) en la licuefacción, a fin de que pueda proporcionarse una mayor concentración de sólidos disueltos en la mezcla de almidón por licuarse. Estos y otros objetos y ventajas de la presente invención se volverán aparentes después de una lectura de la siguiente descripción, tomada en conjunto con las siguientes figuras y ejemplos. Breve Descripción de los Dibujos La figura 1 es un cromatograma de las fracciones que contienen actividad a-1,4 hidrolítica de la Solución A. La figura 2 es un cromatograma que ilustra la distribución de oligosacáridos obtenidos del almidón que han sido incubados durante 20 horas en la ausencia de una enzima (control negativo) . La figura 3 es un cromatograma que ilustra la distribución de oligosacáridos obtenidos del almidón habiendo sido incubados durante 1 hora con la enzima de la presente invención. La figura 4 es un cromatograma que ilustra la distribución de oligosacáridos obtenidos del almidón que han sido incubados durante 5 horas con la enzima de la presente invención. La figura 5 es un cromatograma que ilustra la distribución de oligosacáridos obtenidos del almidón que han sido incubados durante 20 horas con la enzima de la presente invención. Descripción Detallada de la Invención Las enzimas hidrolizantes de la presente invención son enzimas novedosas que tienen actividad a-1,4 hidrolítica en almidón y actividad a-1,6 hidrolítica en almidón, las cuales se derivan de cepas (y aislados naturales) del género Sulfolobus . tal como cepas de las especies S . acidocaldarius , S .brierleyi (Acidianus brierleyi) , S .metallicus, S . shibatae y S .solfataricus . Las enzimas de la presente invención incluyen esa enzima que tiene actividad a-1,4 hidrolítica en almidón que se deriva de la cepa Sulfolobus acidocaldarius DSM 639. La cepa Sulfolobus acidocladarius se depositó en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen (DSM) localizada en Mascheroder Weg lb Braunschweig, República Federal de Alemania bajo el número de acceso DSM 639. Esta cepa es públicamente accesible. Estas enzimas novedosas también pueden derivarse de cepas microbianas que son capaces de desarrollarse bajo condiciones aeróbicas a un pH acídico de entre aproximadamente pH 3.0 y aproximadamente pH 3.5 a aproximadamente 75 °C. Estas enzimas se segregan de manera extracelular mediante las cepas del género Sulfolobus (tal como la cepa S . acidocaldarius DSM 639 y otras cepas de S . acidocaldarius , S .brierleyi, S .metallicus, S . shibatae y S . solfataricus) en el caldo de fermentación. Estas enzimas pueden designarse como EC 3.2.1.1 que son capaces de hidrolizar almidón para la producción de azúcares, tales como glucosa. De manera alternativa, estas enzimas pueden designarse como E.C.3.2.1.41, las cuales son capaces de hidrolizar almidón para la producción de azúcares, tales como glucosa. Estas enzimas pueden designarse además como "amilopululanasas" y/o pululanasas de tipo (II) . Estas enzimas novedosas tienen un peso molecular estimado de aproximadamente 95 kilodaltones (kDa's) según se determinó mediante un método de análisis de SDS-PAGE como se definió en el Ejemplo 3. Las propiedades particularmente importantes de las enzimas de la presente invención son su estabilidad acida y térmica y su expresión de altos niveles de actividad a-1,4 hidrolítica (enzimática) a temperaturas elevadas y/o pH altamente acídico. Estas propiedades son 5 especialmente notables en el pH y temperaturas que pueden encontrarse durante la licuefacción. Para propósitos de ilustración de las enzimas de la presente invención, las propiedades de las mismas se tratarán de aquí en adelante con referencia a aquellas propiedades y características de esa enzima derivada de S . acidocaldarius DSM 639, la cual se cree es representativa de estas enzimas de ácido y calor estables que tienen actividad a-1,4 hidrolítica en almidón, las cuales se expone en la presente que son naturalmente segregadas (de manera extracelular) mediante otras cepas del género „¿_ Sulfolobus. incluyendo otras cepas de las especies S . acidocaldarius . a aproximadamente 110 °C (en aproximadamente el rango superior de temperaturas que pueden encontrarse actualmente en la licuefacción) , las enzimas novedosas de la presente invención exhiben un óptimo pH (para la actividad a-1,4 hidrolítica de la misma) al pH extremadamente acídico de entre aproximadamente 2.5 y aproximadamente 4.0 (lo cual incluye aquel pH que puede encontrarse en la licuefacción) , y más preferentemente de aproximadamente 3.0 hasta aproximadamente 3.5. A pHs tan bajos como aproximadamente 2.5, las enzimas de la presente invención exhibirán aún aproximadamente el 97% de la actividad relativa (de dicha actividad a-1,4 hidrolítica). Aún a un pH tan bajo como aproximadamente 2.0, estas enzimas novedosas aún exhibirán una considerable actividad a-1,4 hidrolítica (enzimática) (aproximadamente 25% de actividad relativa) . [Según se utiliza en la presente, "Actividad Relativa" es aquella actividad a-1,4 hidrolítica (enzimática) según se mide por el método definido en los Ejemplos 4 y 5]. Además, y de manera más importante para el uso de las enzimas de la presente invención en la licuefacción, a aproximadamente 110 °C, estas enzimas exhiben aproximadamente el 95% de actividad relativa (de una actividad a-1,4 hidrolítica) a un pH de aproximadamente 4.0 y aproximadamente un 84% de actividad relativa (de actividad a-1,4 hidrolítica) a un pH de aproximadamente 4.5. No obstante, y demostrando además la flexibilidad de estas enzimas, aún exhiben una porción substancial de su actividad a-1,4 hidrolítica (enzimática) (según se utiliza en la presente, "una porción substancial de su actividad a- 1,4 hidrolítica (enzimática)" se refiere a una actividad a-1,4 hidrolítica relativa de al menos aproximadamente 50%) a un pH tan elevado como aproximadamente 5.1. A aproximadamente un pH de 3.5 (a aproximadamente el rango inferior de pH que puede encontrarse en la licuefacción) , las enzimas novedosas de la presente invención exhiben una temperatura óptima a las temperaturas extremadamente elevadas de desde aproximadamente 110 °C hasta aproximadamente 115 °C (lo cual incluye aquellas temperaturas que pueden encontrarse en la licuefacción) . A temperatura tan bajas como aproximadamente 90 °C, estas enzimas aún exhibirán aproximadamente el 48% de actividad relativa (a-1,4 hidrolítica) . Aún a temperaturas tan bajas como aproximadamente 80 °C, estas enzimas novedosas exhibirán todavía una considerable actividad a-1,4 hidrolítica (enzimática) (de aproximadamente 28% de actividad relativa) . Además, y de manera más importante para el uso de las enzimas de la presente invención en la licuefacción, a aproximadamente un pH 3.5, se observa que, en las temperaturas que pueden encontrarse en la licuefacción (de aproximadamente 90 °C hasta aproximadamente 110 °C) las enzimas de la presente invención expresan al menos aproximadamente el cuarenta y ocho porciento (48%) de su actividad a-1,4 hidrolítica máxima y son capaces de expresar su actividad a-1,4 hidrolítica máxima (enzimática) . De manera más específica, en tales condiciones, estas enzimas exhiben aproximadamente el 48% de actividad relativa (a-1,4 hidrolítica) a aproximadamente 90 °C, aproximadamente el 81% de actividad relativa (a-1,4 hidrolítica) a aproximadamente 100 °C, a aproximadamente 93% de actividad relativa (a-1,4 hidrolítica) a aproximadamente 105°C y aproximadamente el 99% de actividad relativa (a-1,4 hidrolítica) a aproximadamente 110 °C. También, a aproximadamente un pH 3.5 (en el pH que puede encontrarse durante la licuefacción) , las enzimas de la presente invención son capaces además de expresar una actividad a-1,4 hidrolítica máxima (enzimática) a temperaturas elevadas de entre aproximadamente 110 °C y aproximadamente 120 °C. En particular, a aproximadamente 110 °C las enzimas de la presente invención exhiben aproximadamente el 99% de actividad relativa (a-1,4 hidrolítica) , a aproximadamente 115 °C estas enzimas exhiben aproximadamente 100% de actividad relativa (a-1,4 hidrolítica) y aproximadamente 120 °C estas enzcimas se exhiben aproximadamente el 70% de actividad relativa (a-1,4 hidrolítica) . Como tal, estas enzimas novedosas son capaces de expresar la actividad a-1,4 hidrolítica (enzimática) máxima a temperaturas que son mayores a aquellas temperaturas que se encuentran comúnmente en la licuefacción con el uso de las a-amilasas convencionalmente utilizadas. Tal nivel elevado de expresión a-1,4 hidrolítica (enzimática) a tales temperaturas elevadas permite que la mezcla de almidón se licúe para tener una mayor concentración de sólidos disueltos a la típicamente posible. Finalmente, se observa que, a aproximadamente un pH 3.5, las enzimas de la presente invención son capaces de expresar sólo aproximadamente el 5% de actividad (a-1,4 hidrolítica) relativa a aproximadamente 70 °C y aproximadamente el 4% de actividad (a-1,4 hidrolítica) relativa a aproximadamente 60 °C. A este respecto, a las temperaturas y pH mencionados, estas enzimas expresan niveles de actividad a-1,4 hidrolítica (enzimática) que son tan bajos (que son negligibles) que no interfieren con la actividad enzimática de la sacarificación. A este respecto, las enzimas de la presente invención son además adaptables para utilizarse en un proceso continuo de licuefacción/sacarificación. Se observa además que las enzimas de la presente invención son extremadamente estables en las condiciones altamente acídica y altamente térmica que pueden encontrarse durante las condiciones de licuefacción. Esta estabilidad es fácilmente aparente no sólo en la presencia de un substrato (maltodextrinas solubles) , sino también en las condiciones más demandantes donde no se presenta ningún substrato para proteger la enzima de las condiciones ásperas . En particular, a aproximadamente pH 3.5 y aproximadamente 110°C en la presencia de un substrato (maltodextrinas solubles) , se ha determinado que las enzimas expuestas en la presente exhiben aproximadamente 94% de actividad (a-1,4 hidrolítica) relativa después de aproximadamente veinte minutos y aproximadamente el 91% de actividad (a-1,4 hidrolítica) relativa después de aproximadamente 30 minutos. En estas mismas condiciones, estas enzimas aún exhibirán aproximadamente el 74% de actividad (a-1,4 hidrolítica) relativa después de aproximadamente 40 minutos y 70% de actividad (a-1,4 hidrolítica) relativa después de aproximadamente cincuenta minutos. Realmente, estas enzimas son tan estables de ácido y de calor que aún exhiben aproximadamente el 72% de actividad (a-1,4 hidrolítica) relativa después de aproximadamente sesenta minutos en estas mismas condiciones. La estabilidad acida y térmica de las enzimas de la presente invención es tal vez aún más notable cuando se estudia en la ausencia de un substrato que pueda proteger a la enzima de aquellas condiciones severas de ácido y de calor que puedan afectar negativamente su capacidad para expresar la actividad a-1,4 hidrolítica (enzimática) de la misma. A este aspecto, se observa que, a aproximadamente un pH 3.5 y aproximadamente 110°C, en la ausencia de substrato, las enzimas expuestas en la presente exhiben aún una porción substancial de su expresión a-1,4 hidrolítica (enzimática) máxima después de aproximadamente 30 minutos. En particular, estas enzimas exhiben aún aproximadamente el 79% de actividad (a-1,4 hidrolítica) relativa después de aproximadamente 10 minutos, aproximadamente el 65% de actividad (a-1,4 hidrolítica) relativa después de 20 minutos y aproximadamente el 54% de actividad (a-1,4 hidrolítica) relativa después de aproximadamente 30 minutos. Se observa además que las enzimas de la presente invención expresan aún un nivel notable de actividad a-1,4 hidrolítica (enzimática) en tales condiciones aún después de aproximadamente cincuenta minutos. A este respecto, estas enzimas exhiben aún aproximadamente 28% de actividad (a-1,4 hidrolítica) relativa después de aproximadamente 40 minutos y aproximadamente 22% de actividad (a-1,4 hidrolítica) relativa después de aproximadamente cincuenta minutos . Además, durante la licuefacción, estas enzimas son capaces de expresar su actividad a-1,4 hidrolítica (enzimática) , esencialmente de manera independiente de la presencia (o ausencia) de iones de calcio en la mezcla de almidón . Finalmente, se observa que estas enzimas son capaces de expresar la actividad a-1,4 hidrolítica (enzimática) de la misma, durante la licuefacción, esencialmente de manera independiente a la presencia de Cu++, Zn++, Ni++, Co++, Ca++ y/o Mg++ . A este respecto, se observa que estos cationes exhiben solamente una afectación insignificante en la capacidad de las enzimas de la presente invención para exhibir la actividad a-1,4 hidrolítica (enzimática) de la misma y aún solamente en la presencia de 10 mM del catión. A concentraciones menores de aproximadamente 10 mM, virtualmente no se observó ningún efecto en la capacidad de las enzimas para exhibir la actividad a-1,4 hidrolítica (enzimática) de las mismas. Finalmente, se observa que las enzimas de la presente invención tienen además una actividad a-1,6 hidrolítica en almidón. Como tal, estas son candidato a utilizarse en la licuefacción y/o sacarificación. Las enzimas de la presente invención pueden expresarse de manera homologa y segregarse de manera extracelular en el caldo de cultivo mediante cepas del género Sulfolobus, tal como S . acidocaldarius DSM 639, en su forma nativa, normal. Las enzimas expuestas en la presente también pueden obtenerse con el uso de métodos de tecnología de ADN recombinante bien conocidos por aquellos expertos en la materia, tal como mediante aislamiento de un fragmento de ADN que codifica la enzima; la combinación del fragmento de ADN con una señal de expresión apropiada en un vector plásmido apropiado; introduciendo el vector plásmido en un huésped apropiado (ya sea como un plásmido de replica autónoma o integrado en el cromosoma) ; cultivando el organismo huésped bajo condiciones que conducen a la expresión de la enzima; y la recuperación de la enzima del caldo de cultivo. Tales técnicas se describen en Molecular Cloning, Laboratory Manual, (Sambrook, Fritsch, Maniatis) 2da. Edición (1989) y Molecular Cloning, A. Laboratory Manual, (Maniatis, T., Fritsch, E.F., y Sambrook, J.). Cold Spring Harbor Laboratory (1982) . Tal expresión recombinante puede ser homologa mediante otro cultivo de la misma cepa de Sulfolobus (tal como S . acidocaldarius DSM 639) . De manera alternativa, tal expresión recombinante puede ser heteróloga por otra cepa de la misma especie Sulfolobus (tal como otra cepa de S . acidocaldarius) y/o una cepa de una especie diferente del género Sulfolobus (tal como otra cepa de las especies S.brierleyi. S .metallicus, S . shibatae y S . solfataricus) y/o una cepa de otro género por entero, tal como cepas de Bacillus (por ejemplo, cepas de Bacillus licheniformis.

B. subtilis, B . alkalophilus . B.lentus . B.pumilus y B . amyloliquefaciens) y cepas fúngales, tales como cepas de Aspergillus (tales como Aspergillus niger) y Rhizous por nombrar solo dos . Sin tomar en cuenta cual enfoque se tome, las enzimas de los varios huéspedes diferentes tendrán propiedades inmunoquímicas idénticas o parcialmente idénticas según puede determinarse inmunológicamente mediante el uso de diversas pruebas de identidad de reacción cruzada bien conocidas (ver Axelsen, N.H., Handbook of Immunoprecipitation-in-Gel Techniques, Blackwell Scientific Publications (1983) , Capítulos 5 y 14) . Por ejemplo, la reactividad cruzada inmunológica de una variante de la enzima de la presente invención puede ensayarse utilizando un anticuerpo elevado contra o reactivo con al menos un epítope de la enzima de la presente invención, la cual puede ser de origen nativo o recombinante. El anticuerpo, el cual puede ser ya sea monoclonal o policlonal, puede producirse mediante métodos bien conocidos en la materia, tal como aquel descrito por Hudson, y cois., 1989, Practical Immunology, Tercera Edición (1989), Blackwell Scientific Publications. La reactividad cruzada inmunológica puede determinarse utilizando ensayos conocidos en la materia, ejemplos de los cuales son el Manchado Western o ensayo de inmunodifusión radial, por ejemplo, como se describe por Hudson arriba. Las enzimas novedosas de la presente invención pueden producirse mediante el cultivo de cepas de Sulfolobus (tal como S . acidocaldarius DSM 639) bajo condiciones aeróbicas en un medio nutriente que contiene carbono y nitrógeno asimilables, junto con otro(s) nutriente (s) esencial (es) . El medio puede estar compuesto de acuerdo con los principios bien conocidos en la materia. Durante el cultivo, las cepas segregan la enzima de la presente invención de manera extracelular. Esto permite el aislamiento y purificación (recuperación) de las enzimas, a ser logrados mediante, por ejemplo, la separación de la masa celular de un caldo de cultivo (por ejemplo, mediante filtración o centrifugación) mientras se evita la lísis. El caldo de cultivo libre de células resultante puede utilizarse como tal o, si se desea, puede concentrase primero (por ejemplo, mediante evaporación o ultrafiltración) . Si se desea, la enzima puede separarse entonces del caldo libre de células y purificarse hasta el grado deseado mediante métodos convencionales, por ejemplo mediante cromatografía de columna, o incluso cristalizarse. Preferentemente, las enzimas de la presente invención pueden aislarse y purificarse del caldo de cultivo en el cual se segregan de manera extracelular mediante: (1) concentración del sobrenadante del cultivo huésped; (2) pasar el sobrenadante concentrado sobre una columna de intercambio iónico; y (3) pasar el sobrenadante concentrado sobre una columna de interacción hidrofóbica. Las enzimas de la presente invención pueden formularse y utilizarse de acuerdo a su aplicación propuesta. A este respecto, si se utiliza en una composición detergente, las enzimas pueden formularse, directamente a partir del caldo de fermentación, como un sólido cubierto que utiliza el procedimiento descrito en los Documentos Estadounidenses de Patente No. 4,689,297. Además, si se desea, las enzimas pueden formularse en una forma líquida con un vehículo adecuado. Las enzimas también pueden inmovilizarse, si se desea. Las enzimas de la presente invención pueden emplearse para diversas aplicaciones industriales, en donde se involucran la actividad amilótica en condiciones altamente acídicas y/o de temperatura elevada. Tales aplicaciones incluye a aquellos para los cuales tal actividad se emplea actualmente (por ejemplo, en la licuefacción) o en los procesos en donde las a-amilasas acídicas no se emplean actualmente, pero que podrían modificarse ventajosamente según lo que fuera evidente para un experto en la materia. Tales procesos varían de aquellos en la industria alimenticia (por ejemplo, cocimiento) en la industria textil para el desencolado de las fibras, en la fermentación de alcohol (para propósitos de fábricas de cerveza y producción de alcohol) . Estas enzimas también pueden utilizarse en detergentes, plásticos biodegradables a base de almidón y en la síntesis de polisacáridos de glucosa u oligosacáridos. Las enzimas de la presente invención permiten el uso de procesos para la degradación de almidón en glucosa en etapas consecutivas de licuefacción y sacarificación sin necesidad de ya sea, ajustar el pH de, y/o incrementar la concentración de iones de calcio de, la suspensión de mezcla de almidón/almidón licuado durante ya sea la licuefacción y/o sacarificación. A este respecto, las enzimas de la presente invención permiten la implementación de un proceso para la degradación (hidrólisis) de almidón en sus productos de degradación, tal como, por ejemplo, glucosa, en donde ni el pH ni el contenido de iones de calcio de la suspensión de mezcla de almidón/almidón licuado empleada ya sea en la licuefacción y/o sacarificación necesitan ajustarse para acomodar la enzima. Las enzimas de la presente invención permiten la implementación de un proceso para la degradación (hidrólisis) de almidón en azúcares, tal como glucosa, con el uso de mayores temperaturas en la licuefacción a aquellas actualmente empleadas, de tal manera que pueda incrementarse la concentración de sólidos disueltos de la mezcla de almidón por licuarse. En la manera anterior, el uso de las enzimas de la presente invención incrementa la eficiencia de la producción de glucosa lograda mediante el proceso de la presente invención al eliminar la necesidad de ya sea ajustar el pH de, y/o incrementar el contenido de iones de calcio, de, la mezcla de almidón empleada en ya sea la licuefacción y/o sacarificación, incrementando mediante esto la eficiencia del proceso. Además, el uso de estas enzimas reduce los costos al reducir la necesidad de químicos necesarios para ajustar el pH y/o la concentración de iones de calcio de la mezcla de almidón durante ya sea la licuefacción y/o sacarificación. La presente invención se refiere además a un proceso mejorado para la degradación (hidrólisis) de almidón en azúcares, tales como glucosa, en etapas consecutivas de proceso de licuefacción y sacarificación sin la necesidad de ya sea ajustar el pH de, y/o la concentración de ion de calcio de, la mezcla de almidón durante ya sea la licuefacción y/o sacarificación. El proceso de degradación del almidón puede ser un proceso estándar de licuefacción/sacarificación en donde los granulos de almidón se mezclan con agua en la presencia de la enzima, tal como aquellos procesos descritos por Shetty y Alien en Cereal Foods World, 33:929-933 (1988). El pH de la mezcla es naturalmente acídico, siendo posible encontrarse un pH de entre aproximadamente 3.5 y aproximadamente 4.5. Los granulos de la mezcla se gelatinizan entonces con calor al pasar a través de un cocedor a chorro, el cual eleva rápidamente la temperatura de la mezcla a entre aproximadamente 105 °C y aproximadamente 110 °C. La mezcla se mantiene entonces a esa temperatura durante unos cuantos minutos antes de disminuirse hasta entre aproximadamente 90 °C y aproximadamente 95 °C. La mezcla se mantiene entonces a esa temperatura durante aproximadamente una hora. Mientras el pH puede ajustarse y/o los estabilizadores (tales como iones de calcio) pueden añadirse a la mezcla para estabilizar la enzima, se observa que este procedimiento entero de licuefacción puede ser conducido sin ningún ajuste del pH y/o la adición de cualquier ion de calcio de ninguna clase. Un ejemplo de tales licuaciones de tal proceso de cocción a chorro puede encontrarse para referencia en los Documentos de Patente Estadounidense No. 3,912,950. Después, puede añadirse una glucoamilasa fungal (derivada de, por ejemplo, cepas de Aspergillus) a la suspensión de almidón licuada. La temperatura de la suspensión también se reduce hasta aproximadamente 60 °C. La sacarificación se conduce entonces (a un pH de entre aproximadamente 4.0 y aproximadamente 4.5). Se observa que este procedimiento entero de sacarificación puede conducirse sin ningún ajuste de ninguna clase del pH. Se describen ejemplos de procesos estándares de sacarificación por Shetty y Alien en Cereal Foods World, 33:929-933 (1988) . Si se desea, la enzima también puede utilizarse (para la actividad a-1,6 hidrolítica) en la sacarificación. La presente invención se refiere además a un proceso mejorado para la degradación (hidrólisis) de almidón a glucosa, en donde la licuefacción puede llevarse a cabo a temperaturas que son mayores a las actualmente empleadas, de tal manera que puede incrementarse la concentración de sólidos disueltos de la mezcla de almidón por licuarse. A este respecto, si se desea, la temperatura del cocedor térmico de la mezcla por licuarse puede incrementarse hasta entre aproximadamente 110 °C y aproximadamente 120 °C en los cuales se mantiene la temperatura durante unos cuantos minutos antes de disminuirse . Las dilusiones, cantidades, etc. que se expresan en la presente en términos de porcentajes son, a menos que se especifique de otro modo, porcentajes dados en términos de peso porcentual por volumen (w/v) . Según se utilizan en la presente, las dilusiones, cantidades, etc., que se expresan en términos de % (v/v) , se refieren al porcentaje en términos de volumen por volumen. Las temperaturas referidas en la presente se dan en grados centígrados (°C) . Habiendo descrito así las enzimas de la presente invención y las etapas de licuefacción y sacarificación y otros procesos en los cuales pueden emplearse tales enzimas, se presentan ahora los siguientes ejemplos para los propósitos de ilustración y no significa que sean, ni que deban ser, leídos como restrictivos. Ejemplo l; Producción de Enzima Mediante Sulfolobus acidocaldarius DSM 639 Se obtuvo un cultivo secado en frío de Sulfolobus acidocaldarius DSM 639 de la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen (Alemania) , el cual se había depositado en la misma bajo el número de acceso DSM 639. Se preparó un medio de cultivo que contiene los siguientes ingredientes: KH2P04 2.0 M Maldex 15 (AMYLUM) 0.2% (w/v) (NH4)2S04 10.0 mM Extracto de levadura (DIFCO) 0.2% (w/v) MgS04-7H20 1.0 mM CaCl2-2H20 0.5 mM FeCl3-6H20 0.07 mM El pH de este medio fue entonces ajustado a 3.0 con H2S04 y esterilizado. (El Maldex 15, un substrato de maltodextrina soluble, se esterilizó por separado a un pH neutral) . Este cultivo secado en frío se suspendió en 1 ml del medio de cultivo. Se inocularon después cinco (5) botellas estériles de tapa atornillada de 100 ml, que contienen cada una 40 ml del medio de cultivo con cantidades respectivas de 200 µl de la suspensión de cultivo S . acidocaldarius DSM 639. Las botellas de tapa atornillada, inoculadas se almacenaron después en una posición inclinada, en una incubadora sin agitación, durante 2 días a 75°C. Las cinco muestras se utilizaron entonces, a su vez, para inocular cinco (5) muestras respectivas de 400 ml de medio localizado en una de las botellas respectivas de tapa atornillada de un (1) litro. Las muestras inoculadas de 400 ml se almacenaron entonces en una posición inclinada, en una incubadora sin agitación, durante 2 días a 75 °C. Las cinco muestras fueron entonces reunidas, formando una sola muestra de cultivo de dos (2) litros de S . acidocaldarius DSM 639. Se prepararon después sesenta litros más del medio de cultivo arriba descrito y se colocaron en un fermentador . El fermentador se inoculó después con los dos litros de cultivo de S . acidocaldarius DSM 639, obtenidos como se describió arriba. La fermentación del cultivo en el fermentador de 80 litros se condujo a 75 °C, bajo agitación constante a 50 rpm. La proporción del flujo de aire fue de 5 litros/minuto (1/m) , y la sobrepresión interna se mantuvo constante a 0.1 bario. Después de 90 horas de tal cultivo, el caldo de fermentación se enfrió entonces a temperatura ambiente . La fermentación anterior dio como resultado, entre otros, la producción extracelular de la enzima de la presente invención en el caldo de fermentación. La presencia de tal enzima se examinó después para el ensayo específico del caldo de fermentación para la actividad a-1,4 hidrolítica (enzimática) según se establece abajo en el Ejemplo 2. Ejemplo 2: Recuperación y Purificación de la Enzima El caldo de fermentación del cultivo, obtenido como se describió en el Ejemplo l, fue entonces sujeto a microfiltración usando un módulo de fibras huecas Microgon KrosFlow II (diámetro 0.6 mm, 1 m2, 0.22 micrones) con objeto de retirar la biomasa del mismo. Esta microfiltración produjo 40 litros de una solución libre de células . Se añadió entonces un volumen de 15 litros de agua desmineralizada al retenido en tres etapas para enjuagar las células, produciendo 55 litros de solución libre de células. Esta solución libre de células se concentró después en 3 litros mediante ultrafiltración a través de una membrana Amicon S10Y10. La solución concentrada se sujetó después a una etapa de diafiltración en donde se añadió un volumen de 10 litros de regulador de acetato de sodio de 5 mM (pH 3.5) a la solución concentrada en una manera escalonada. La solución resultante se concentró nuevamente en un volumen final de 3 litros por ultrafiltración con la misma membrana Amicon S10Y10. Se llevó a cabo una etapa subsecuente de concentración mediante ultrafiltración utilizando fibras de acetato de celulosa SGI (1.5 m2, 15 kD de corte), hasta un volumen de 250 ml . Se llevó a cabo después una etapa de concentración adicional mediante ultrafiltración utilizando una membrana Amicon YM10. Esta concentración adicional dio como resultado la obtención de una solución final de 60 ml (solución A) que contiene la enzima de la presente invención. Se aplicó un volumen de 10 ml de solución A, obtenida como se describió arriba, a una proporción de flujo de 5 ml/minuto sobre una columna (Pharmacia) de Alta-Carga de Q- sefarosa 16/10, previamente equilibrada con un regulador de acetato de sodio de 50 mM (pH 3.5). La columna se levigó con una gradiente de NaCl desde 0 hasta 500 mM. Se recolectaron fracciones de 1 ml , y la actividad a-1,4 hidrolítica de las mismas se midió como se describe abajo. Las fracciones que contienen la actividad a-1,4 hidrolítica se reunieron después y se llevó a cabo un cromatograma (figura 1) . La purificación se repitió después, como se describe arriba, con los 50 ml restantes de solución A (5 x 10 ml) . Todas las fracciones que contienen actividad a-1,4 hidrolítica, provenientes de las seis columnas independientes desplazadas y purificadas de la misma manera según se describió arriba, fueron después reunidas, generando la solución B. La actividad a-1,4 hidrolítica de las fracciones obtenidas de las diversas etapas de purificación se muestran en la Tabla 1, y se midieron de acuerdo al siguiente procedimiento. En un tubo herméticamente sellado, se añadieron 50 µl de la muestra de enzima (o una dilución apropiada) a 250 µl de una solución que contiene 0.1% (w/v) de almidón Lintner (Baker) , regulador de citrato/fosfato (100 mM/200 mM) a un pH 3.5. La mezcla se incubó durante 15 minutos a 110 ± 2°C. La incubación se terminó después al transferir el tubo hacia un baño de hielo/agua de 0°C. Se separó entonces un volumen de 100 µl de esta mezcla y se añadió a 800 µl de una solución de I2/ I compuesta de 0.004% (w/v) de I2, 0.04% (w/v) de Kl , y 0.25 M de HCl. La absorbencia se midió a 620 nm. Se ejecutó un espacio en blanco al reemplazar la solución de enzima con agua. La actividad en las unidades arbitrarias, se calculó como sigue: [(0Db-0Ds)/0Db] x 100 en la cual ODb es la densidad óptica medida del espacio en blanco y ODB es la densidad óptica medida de la muestra. TABLA 1 Ejemplo 3: Determinación del Peso Molecular de la Enzima Mediante Análisis SDS-PAGE Una muestra de la enzima purificada (solución B) , obtenida como se describió arriba en el Ejemplo 2 se utilizó entonces para la determinación del peso molecular mediante el uso del análisis SDS PAGE. Este análisis SDS-PAGE fue efectuado en condiciones desnaturalizantes sobre un gel de poliacrilamida que utiliza geles al 10-15% (w/v) de Pharma PhastGel . La muestra se precipitó mediante la adición de ácido dicloroacético [concentración final del 10% (w/v) ] y se incubó durante 1 hora a 0°C. Las proteínas precipitadas se recolectaron después mediante centrifugación a 10,000 g durante 10 minutos. La bolita resultante se disolvió entonces en un regulador muestra de 10 mM Tris/IICl (pH 8.0), 1 mM de EDTA, 2.5% (w/v) de dodecilsulfato de sodio (SDS), 5% (v/v) de ß-mercaptoetanol y 0.001% (w/v) de azul de bromofenol . La suspensión resultante se desnaturalizó entonces a 98 °C durante 15 minutos. Los materiales insolubles se retiraron después mediante centrifugación a 10000 g durante 5 minutos. La suspensión resultante se analizó entonces mediante electroforesis de gel de poliacrilamida (PAGE) , Phast System adquirido de Pharmacia LKB Biotechnology, bajo las condiciones especificadas en, y siguiendo los procedimientos descritos por Pharmacia en el archivo No. 110 de la Técnica de Separación y utilizando un gel gradiente de poliacrilamida al 10-15% que contiene SDS (dodecil sulfato de sodio) . Los geles se ejecutaron bajo condiciones estándares. Los siguientes marcadores de Pharmacia LMW se utilizaron como estándares de peso molecular: 94 kDa de fosforilasa b (músculo canino) ; 67 kDa de albúmina (suero bovino) ; 43 kDa de albúmina de huevo (huevo blanco de pollo) ; 30 kDa de carboanhidrasa (eritrocitos bovinos); 20.1 kDa de inhibidor de tripsina (frijol de soya); y 14.4 kDa de alfa lactalbumina (leche de vaca) . Después de la separación de los polipéptidos, se llevó a cabo un teñido de azul Coomassie del gel según se describió en el Archivo de Técnicas de Desarrollo No. 200 de Pharmacia . Los resultados del análisis de SDS-PAGE revelaron una sola banda de aproximadamente 95 kilodaltones . De esta manera, el peso molecular estimado de esta enzima se determinó ser de aproximadamente 95 kilodaltones (kDa's). Ejemplo 4: Medición de la Actividad Relativa de la Enzima 1. Establecimiento de una curva estándar Ya que la correlación entre el valor de la actividad medida [ (ODb-OD /0Db] x 100, y la cantidad de enzima no fue lineal, una curva estándar fue establecida a fin de determinar la actividad de a-1,4 hidrolítica (enzimática) relativa de la enzima de la presente invención. La enzima purificada de la solución B (obtenida como se describió arriba en el Ejemplo 2) fue entonces obtenida y diluida con agua por medio del factor 100, generando la solución C. Unas series de diluciones de la solución C, que contienen la enzima purificada, fueron entonces preparadas como se anota abajo en la Tabla 2. Se observa aquí que los volúmenes indicados (µl) en la Tabla 2 fueron diluidos con agua para un volumen final de 200 µl . Se llevó a cabo entonces un ensayo enzimático utilizando estas diversas dilusiones, de acuerdo al siguiente procedimiento: En tubos herméticamente sellados respectivos, se añadieron 50 µl de las diversas soluciones diluidas C a 250 µl de una solución que contiene 0.1% (w/v) de almidón de Lintner (Baker) y el regulador de citrato/fosfato (100 mM/200 mM) a un pH de 3.5. Las mezclas resultantes respectivas se incubaron después durante 15 minutos a 110 ± 2°C. La incubación se terminó al transferir los tubos hacia un baño de hielo/agua (0°C) .

Se separaron los volúmenes respectivos de 100 µl de cada una de estas mezclas y se añadieron después a 800 µl de una solución de I2/KI compuesta de 0.004% (w/v) de I2, 0.04% (w/v) de Kl y 0.25 M de HCl. La absorbencia se midió a 620 nm (Pharmacia LKB Ultraspec Plus) . Se ejecutó después un ensayo en blanco al reemplazar la solución de enzima por agua. El valor [ (0Db-0Ds) /0Db] x 100 se calculó entonces, y se gráfico versus el volumen de la solución C el cual se utilizó en las diluciones. Los resultados se indicaron abajo en la Tabla 2. TABLA 2 2. Ensayo estándar para la determinación de la actividad relativa En un tubo herméticamente sellado, se mezclaron µl de solución C con 25 µl de agua y después se añadieron 250 µl de una solución que contiene 0.1% (w/v) de almidón Lintner (Baker) , regulador de citrato/fosfato (100 mM/200 mM) a diversos valores de pH (según se describe en detalle abajo) . La mezcla se incubó después durante 15 minutos a diversas temperaturas (ver abajo) . La incubación se terminó al transferir el tubo hacia un baño de hielo/agua (0°C) . Se separó entonces un volumen de 100 µl de esta mezcla y se añadió a 800 µl de una solución de I2/KI compuesta de 0.004% (w/v) de I2, 0.04% (w/v) de Kl, y 0.25 M de HCl. La absorbencia se midió a 620 nm (Pharmacia LKB Ultraspec Plus) . Se ejecutó un ensayo en blanco al reemplazar la solución C de enzima de 50 µl con agua. La actividad relativa (unidades relativas) se calculó a partir de la curva estándar mediante el cálculo del valor [ (0Db-0De) /0Db] x 100, y después se extrapoló de manera lineal el volumen correspondiente (µl) de los dos puntos más cercanos de la curva estándar. La actividad (a-1,4 hidrolítica) relativa (%) se define como el valor de volumen extrapolado (µl) , deducido de la curva estándar.

Ejemplo 5: Caracterización de la Enzima 1. Determinación del pH Óptimo Las muestras respectivas de la solución C fueron obtenidas y preparadas como se describió arriba en el Ejemplo 4 para realizar el ensayo estándar. El pH óptimo de la enzima de la presente invención se determinó entonces al ejecutar el ensayo estándar arriba descrito en el Ejemplo 4 sobre cada uno de los tubos (muestras) a una temperatura de 110 ± 2°C y a diversos valores de pH que varían desde 2.0 hasta 6.0. Los resultados de tales ensayos se analizaron después en la manera que también fue descrita arriba en el Ejemplo 4 para el ensayo estándar. Los resultados de estos ensayos se muestran abajo en la Tabla 3. TABLA 3 De acuerdo a los resultados de este ensayo, el pH óptimo de la enzima que se deriva de Sulfolobus acidocaldarius DSM 639 (para la expresión de la actividad a-1,4 hidrolítica de la misma) es de aproximadamente pH 3.5. 2. Determinación de la Temperatura Óptima Las muestras respectivas de la solución C se obtuvieron y prepararon como se describió arriba en el Ejemplo 4 para llevar a cabo el ensayo estándar. La temperatura óptima de la enzima derivada de Sulfolobus acidocaldarius DSM 639 se determinó al ejecutar el ensayo estándar arriba descrito en el Ejemplo 4 sobre cada uno de los tubos (muestras) a un pH constante de 3.5, y a diversas temperaturas que varían de 60 a 120 °C (± 2°C) . Los resultados de tales ensayos se analizaron después en la manera que también fue descrita arriba en el Ejemplo 4 para el ensayo estándar. Los resultados de estos ensayos se muestran abajo en la Tabla 4. TABLA 4 De acuerdo a esta Tabla, la temperatura óptima de la enzima derivada de Sulfolobus acidocaldarius DSM 639 (para la expresión de la actividad a-1,4 hidrolítica de la misma) es de aproximadamente 115 °C. 3. Estabilidad a 110 °C ? ?H de 3.5 Un volumen de 10 µl de la solución B obtenida como se describió arriba en el Ejemplo 2 que contiene la enzima purificada de la presente invención fue primero diluida a 200 µl en regulador de citrato/fosfato de 100 mM/200 mM a un pH de 3.5, en la presencia (o en la ausencia) de 0.5% (w/v) de Maldex 15 (Amylum) , en tubos herméticamente sellados. Los tubos fueron entonces incubados a 110°C ± 2°C para diversos periodos de tiempo que varían de 0, 10, 20, 30, 40, 50 y 60 minutos. Después de esta incubación, las mezclas de reacción respectivas fueron entonces diluidas 5 veces en agua, y las actividades a-1,4 hidrolíticas (enzimáticas) fueron medidas bajo las condiciones estándar descritas arriba en el Ejemplo 4. Los resultados se muestran en la Tabla 5. TABLA 5 De acuerdo a la Tabla 5, después de la incubación de las muestras durante 30 minutos a pH 3.5 y 110 °C sin substrato, más del 50% de la actividad a-1,4 hidrolítica está todavía presente. Un efecto de estabilización mediante maltodextrinas puede también ser observado. 4. Influencia de los cationes de metal y EDTA Las muestras respectivas de la Solución C se obtuvieron y prepararon como se describió arriba en el Ejemplo 4 para realizar el ensayo estándar. La influencia de varios cationes de metal y de EDTA sobre la actividad a-1,4 hidrolítica de la enzima derivada de Sulfolobus acidocaldarius DSM 639 fue determinada al ejecutar el ensayo estándar descrito arriba en el Ejemplo 4 sobre cada uno de los tubos (muestras) en la presencia de varios cationes de metal adicionales a una concentración final de 2 , 5 y 10 mM. Los resultados de tales ensayos fueron analizados entonces en la forma que también se describió arriba en el Ejemplo 4 para el ensayo estándar. Los resultados de esos Ensayos fueron mostrados en la Tabla 6.

TABLA 6 En la ausencia de calcio (con EDTA) , la enzima es completamente activa. No se observó ningún efecto inhibidor sobre la actividad a-1,4 hidrolítica para los diversos cationes añadidos. Ejemplo 6: Licuefacción de Almidón a Escala-Pequeña Un volumen inicial de la solución B, que tiene la enzima de la presente invención, fue obtenido como se describió arriba en el Ejemplo 2. La solución B fue entonces concentrada mediante precipitación de acetona al añadir acetona hasta que se obtuvo una solución que tiene una concentración final del 70% (v/v) de acetona y se permitió a la enzima precipitarse hacia afuera. La enzima precipitada resultante fue colectada mediante centrifugación a 4000 g durante 15 minutos. La bolita resultante se recuperó y disolvió en 20 mM de regulador de acetato de sodio (pH 3.5) a la mitad del volumen de inicio, para producir la solución D de enzima, en donde la enzima se concentró por un factor de dos.

Las a-amilasas naturalmente producidas por una B . licheniformis [y vendido bajo la marca comercial OPTITHERM R LT420 por SOLVAY ENZIMES, Inc., EUA] y por una B. stearothermophilius [y vendido bajo la marca comercial G-zyme R G995 por Enzyme Bio Systems)] se obtuvieron y diluyeron, respectivamente, mediante factores de 1250 (v/v) y 1000 (v/v) con soluciones E y F, respectivamente, de enzimas, generadoras de agua purificada. Tales mezclas, las cuales fueron reguladas a diversos valores de pH enumerados en la Tabla 7, se prepararon como sigue: 2 ml de 1 M de regulador de ácido acético (ajustado a los diversos valores de pH enumerados abajo en la Tabla 7 con hidróxido de sodio) se añadieron a 3.3 gramos de muestra respectivos de almidón de maíz nativo (Meritena A de AMYLUM) , y los volúmenes finales respectivos de los mismos se ajustaron a 7 ml con agua purificada. Después se añadió cloruro de calcio a aquellas muestras de mezcla por incubarse con soluciones de enzima E y F (como se indicó en la Tabla 7) , para dar una concentración final de calcio de 0.75 M (30 ppm de calcio) . En tubos herméticamente sellados respectivos, se combinaron después muestras respectivas de 350 µl de la mezcla de almidón con muestras respectivas de 150 µl de soluciones de encima D, E y F. Los controles que se llevaron a cabo en la ausencia de enzima se prepararon al reemplazar las soluciones de enzima respectivas con agua purificada. Las muestras herméticamente selladas se transfirieron después a un baño de glicerol termoestizado a 110 °C, en donde se agitaron vigorosamente durante 10 minutos. La temperatura del baño se redujo entonces a 95 °C mientras mantenía la agitación y la incubación continuó durante otro periodo de 80 minutos. La licuefacción se terminó entonces al transferir los tubos a un baño de agua a temperatura ambiente . Las mezclas de reacción licuadas respectivas se diluyeron entonces con agua purificada por un factor de 40 (v/v) . Se separó entonces un volumen de 60 µl de cada muestra y se mezcló con 3 ml de una solución de yodina que tiene 0.004% de I2 (w/v), 0.04% de Kl (w/v) y 0.25 M de HCl . Las densidades ópticas de las soluciones resultantes se midieron después a una longitud de onda de 620 nm, utilizando la solución de yodina como la referencia en blanco. Los resultados se indican abajo en la Tabla 7.

TABLA 7 n.d. = Resultado No Determinado Los controles negativos que se ejecutaron en la ausencia de la enzima permanecieron sólidos a todos los valores de pH. Los resultados de arriba demostraron que la enzima de la presente invención es capaz de licuar almidón bajo condiciones en donde existe una alta concentración de sólidos disueltos de aproximadamente 33% (w/v) y altas temperaturas de 110 °C para una licuefacción primaria y 95 °C para una licuefacción secundaria. Ejemplo 7: Hidrólisis de Almidón Extensiva La licuefacción fue conducida a 110 °C durante diversos periodos de tiempo. Las mezclas de licuefacción fueron preparadas mediante la adición de muestras de 150 µl respectivas de la solución D (obtenidas como se describió arriba en el Ejemplo 6) a muestras respectivas de 350 µl de mezclas de almidón preparadas como se describió arriba en el Ejemplo 6, las cuales habían sido reguladas a pH 3.5 con un regulador de ácido acético de 1 M, según se describió también arriba en el Ejemplo 6, pero sin la adición de ningún calcio a las mismas. Se preparó un control negativo al reemplazar la solución de enzima con agua durante 20 horas de incubación. Las muestras herméticamente selladas se transfirieron después a un baño de glicerol termoestablecido a 110°C y vigorosamente agitadas durante ya sea 1, 5 o 20 horas como se anota abajo en la Tabla 8. Las incubaciones se terminaron al transferir los tubos hacia un baño de agua como se describió arriba en el Ejemplo 6. Las reacciones de yodina se midieron entonces como se describe arriba en el Ejemplo 6. Los resultados se indican abajo en la Tabla 8. TABLA 8 Estos resultados demostraron que la enzima de la presente invención es activa y estable bajo condiciones de licuefacción a pH 3.5, aún durante incubación a 110 °C y, como tal, es capaz de hidrólisis extensiva de almidón bajo condiciones acídicas, haciéndola candidato para otras aplicaciones, tales como sacarificación o la producción de jarabes DE intermedios. Ejemplo 8: Análisis por HPLC Las composiciones oligosacáridas de las muestras del Ejemplo 7 se determinaron después por HPLC utilizando una resina Aminex HPX-87N en dos columnas (BIORAD) de 300 mm x 7.8 mm (de diámetro interno), las cuales se levigaron con agua purificada a 85 °C y a una proporción de flujo de 0.4 ml/min. La detección se llevó a cabo mediante la medición del índice refractivo. Los perfiles del cromatograma por HPLC obtenidos mediante esto pueden observarse con relación a las figuras 2-5. Las figuras 2-5 muestran que los oligosacáridos principales que se forman después de una hidrólisis prolongada de 20 horas son DPI, DP2 y DP3 (donde DP es el grado de polimerización) . Después de tiempos de incubación más cortos, los cromatogramas muestran la presencia de diversos oligisacáridos más grandes (DP4, DP5 y DPn) , pero los oligosacáridos más pequeños (como DPI y DP2) ya están presentes, aún en la primer etapa (1 hora) . El oligosacárido DP4 parece ser un producto transitorio ya que se acumula de 1 a 5 horas y después se degrada (posiblemente a DPI y DP3) a 20 horas, indicando que el oligosacárido DP4 es un substrato para la actividad a-1,4 hidrolítica . Ejemplo 9: Hidrólisis de Pululano Se preparó una solución de pululano que contuvo 3% (w/v) de pululano (SIGMA) y 200 mM de ácido acético, ajustado a un pH de 3.5 con NaOH. En tubos herméticamente sellados respectivos, se mezclaron 1 ml de muestras de la solución de pululano respectivo con 27 µl muestras respectivas de solución de enzima D, obtenida como se describió arriba en el Ejemplo 6. Los tubos sellados se transfirieron después durante 6 horas a un baño de glicerol termoestablecido a 110 °C. La incubación se terminó al transferir los tubos a un baño de agua a 0 °C . Se ejecutó en paralelo un control negativo, bajo las mismas condiciones, excepto en que la solución de enzima D se reemplazó con agua purificada. Las muestras se sometieron a dos análisis por HPLC separados con objeto de determinar el tipo de oligosacárido formado después de la hidrólisis de pululano mediante la enzima. El primer análisis por HPLC al cual se sometieron las muestras fue una cromatografía de intercambio catiónico. Esto se logró al conectar en serie dos columnas de intercambio catiónico (ION 300 que tiene un diámetro de 300/7.8 mm seguido por una columna HPX87H de 300/7.8 mm (BIORAD) ] , y se protegió mediante una precolumna (BIORAD) .

La levigación se llevó a cabo a 60 °C con 10 mM de H3P04 en una proporción de flujo de 0.4 ml/min y la detección se llevó a cabo mediante refractometría. Los diversos picos identificados se cuantificaron al comparar directamente las áreas pico (administrador de HPLC HITACHI-MERCK D-6000) . Los resultados del análisis por HPLC se establecen abajo en la Tabla 9. TABLA 9 Estos resultados demostraron que el principal componente generado por la hidrólisis de pululano con la enzima de la presente invención es un oligosacárido DP3. Con objeto de determinar la naturaleza del oligosacárido DP3 obtenido (maltotriosa, panosa o isopanosa) , un segundo análisis por HPLC (una cromatografía de intercambio aniónico) de la muestra obtenido a partir de la hidrólisis de pululano mediante la enzima de la presente invención (como se describe arriba en este ejemplo) se llevó a cabo utilizando una columna por HPLC DIONEX CARBOPAC PA1 de 10 µm 250/4 mm protegida por una precolumna de DIONEX. Se prepararon reguladores A, B y C. El regulador A se preparó conteniendo 100 mM de NaOH. El regulador B se preparó conteniendo 100 mM de NaOH y 30 mM de acetato de sodio. El regulador C se preparó teniendo 100 mM de NaOH y 100 mM de acetato de sodio.

La levigación se llevó a cabo en una proporción de flujo de 0.7 ml/min con gradientes isocráticos o lineales como sigue: La columna se preequilibró con Regulador A. De 0 a 4 minutos, se estableció una gradiente de 0-100% de Regulador A. De 4 a 20 minutos, se estableció una gradiente de 0-100% de Regulador B. De 20 a 50 minutos, se estableció una gradiente de Regulador C. De 50 a 60 minutos, se estableció una levigación isocrática de 100% de Regulador C. De 60 a 80 minutos, se estableció una levigación isocrática de 100% de Regulador A. La levigación se detuvo a 80 minutos. La detección se llevó a cabo mediante amperometría de impulso, bajo un potencial de 100 mV en donde pueden separarse claramente maltotriosa, panosa e isopanosa. Se obtuvieron estándares de maltosa, panosa y maltotriosa a partir de SIGMA. El valor para el tiempo de retención de la isopanosa se extrapoló por referencia a los datos de la literatura (Swallow, K. W., J. Agrie. Food Chem., 1990, 38: 1828-1832) en los cuales se emplea el mismo sistema cromatográfico . Los tiempos de retención fueron los siguientes: maltosa 23.8 minutos, isopanosa 28 minutos, panosa 29.5 minutos, y maltotriosa 31.3 minutos. El análisis por HPLC mostró que el componente oligosacárido principal DP3 obtenido como se describió arriba exhibe un tiempo de retención de 31.28 minutos, identificándolo claramente mediante esto como maltotriosa y demostrando la capacidad de la enzima de la presente invención para la separación de enlaces a-1,6 glicosídicos . Pueden hacerse modificaciones sin apartarse del espíritu básico de la presente invención. De acuerdo con lo anterior, se apreciará por aquellos expertos en la materia que dentro del alcance de las reivindicaciones anexas, la invención puede practicarse de manera diferente a lo específicamente descrito en la presente.

Claims (9)

1. NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito la presente invención se considera como novedad y por lo tanto se reclama como propiedad lo descrito en las siguientes reivindicaciones. 1. Una enzima que tiene actividad a-1,4 hidrolítica, caracterizada porque la enzima se deriva de una cepa de las especies Sulfolobus y es capaz, a pHs de 4.5 y menores, de expresar la máxima actividad a-1,4 hidrolítica de la misma. 2. Una enzima que tiene actividad a-1,4 hidrolítica, caracterizada porque la enzima se deriva de Sulfolobus acidocaldarius DSM 639. 3. Una enzima que tiene actividad a-1,4 hidrolítica, caracterizada porque la enzima es, a aproximadamente 110 °C, capaz de expresar altos niveles de actividad a-1,4 hidrolítica a pHs altamente acídicos de entre aproximadamente 2.5 y aproximadamente 4.5. 4. La enzima según la reivindicación 3, caracterizada además porque tiene un pH óptimo para la actividad a-1,4 hidrolítica de la misma de entre aproximadamente 3.0 y aproximadamente 3.5. 5. La enzima según la reivindicación 3, caracterizada además porque tiene, a un pH de aproximadamente
2. 2.5, una actividad relativa que es al menos el noventa y cinco porciento de la actividad a-1,4 hidrolítica máxima de la misma. 6. La enzima según la reivindicación 3, caracterizada además porque tiene, a un pH de aproximadamente 4.5, una actividad relativa que es al menos el ochenta porciento de la actividad a-1,4 hidrolítica máxima de la misma. 7. La enzima según la reivindicación 3, caracterizada además porque tiene, a un pH de aproximadamente 5.1, una actividad relativa que es de al menos el cincuenta porciento de la actividad a-1,4 hidrolítica máxima de la misma. 8. Una enzima que tiene actividad a-1,4 hidrolítica, caracterizada porque la enzima es, a aproximadamente un pH de 3.5, capaz de expresar altos niveles de actividad a-1,4 hidrolítica a temperaturas elevadas de entre aproximadamente 90 °C y aproximadamente 120°C. 9. La enzima según la reivindicación 8, caracterizada además porque tiene una temperatura óptima para la actividad a-1,4 hidrolítica de la misma de entre aproximadamente 110°C y aproximadamente 115 °C. 10. La enzima según la reivindicación 8, caracterizada además porque tiene, a aproximadamente 90 °C, una actividad relativa que es de al menos el cuarenta y cinco porciento de la actividad a-1,4 hidrolítica máxima de la misma. 11. La enzima según la reivindicación 8, caracterizada además porque tiene, a aproximadamente 100 °C, una actividad relativa que es al menos el ochenta porciento de la actividad a-1,4 hidrolítica máxima de la misma. 12. La enzima según la reivindicación 8, caracterizada además porque tiene, a aproximadamente 120 °C, una actividad relativa que es de al menos el setenta porciento de la actividad a-1,4 hidrolítica máxima de la misma. 13. Una enzima que tiene actividad a-1,4 hidrolítica, caracterizada porque la enzima tiene la capacidad de expresar la actividad a-1,4 hidrolítica de la misma esencialmente de manera independiente a la presencia de iones de calcio. 14. Una enzima que tiene actividad a-1,4 hidrolítica, caracterizada porque la enzima tiene la capacidad de expresar, después de aproximadamente 60 minutos en la presencia de un substrato, al menos setenta porciento de la actividad máxima de la misma. 15. Una enzima que tiene actividad a-1,4 hidrolítica, caracterizada porque la enzima tiene la capacidad de expresar, después de aproximadamente 60 minutos en la ausencia de un substrato, aproximadamente el veinte porciento de la actividad máxima de la misma. 16. Una enzima que tiene actividad a-1,4 hidrolítica, caracterizada porque la enzima se deriva de una cepa del género Sulfolobus, tiene un peso molecular estimado de 95 kDa, tiene un pH óptimo de aproximadamente
3. 3.5 para la expresión de la actividad a-1,4 hidrolítica de la misma y tiene una temperatura óptima de aproximadamente 110-115 °C para la expresión de la actividad a-1,4 hidrolítica de la misma. 17. La enzima según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la enzima se caracteriza en que tiene además una actividad a-1,6 hidrolítica. 18. Un proceso mejorado para la hidrólisis de almidón, caracterizado porque la hidrólisis se lleva a cabo sin ajustar el pH de la mezcla de almidón/suspensión de almidón licuado durante la licuefacción. 19. Un proceso mejorado para la hidrólisis de almidón a glucosa, caracterizado porque la hidrólisis se lleva a cabo en etapas consecutivas de licuefacción y sacarificación sin ajustar el pH de la mezcla de almidón/suspensión de almidón licuado durante las etapas de licuefacción y/o sacarificación. 20. Un proceso mejorado para la hidrólisis de almidón, caracterizado porque la hidrólisis se lleva a cabo sin la necesidad de incrementar la concentración de iones de calcio de la mezcla de almidón durante la licuefacción. 21. Un proceso mejorado para la hidrólisis de almidón a glucosa, caracterizado porque la hidrólisis se lleva a cabo en etapas consecutivas de licuefacción y sacarificación sin la necesidad de ajustar el pH y/o incrementar la concentración de iones de calcio de la mezcla de almidón/suspensión de almidón licuado durante cualquiera de las etapas de licuefacción y/o sacarificación . 22. Un proceso mejorado para la hidrólisis de almidón, caracterizado porque la hidrólisis se lleva a cabo durante la licuefacción con una mezcla de almidón/suspensión de almidón licuado que tiene un pH no mayor a 5. 23. El proceso mejorado según la reivindicación 22, caracterizado además porque el pH de la mezcla de almidón/suspensión de almidón licuado durante la licuefacción no es mayor a
4. 4. 24. El proceso mejorado según la reivindicación 22, caracterizado además porque el pH de la mezcla de almidón/suspensión de almidón licuado durante la licuefacción no es mayor a 3.
5. 5. 25. Un proceso mejorado para la hidrólisis de almidón, caracterizado porque la licuefacción se lleva a cabo a temperaturas mayores a 110 °C, a fin de que pueda proporcionarse una mayor concentración de sólidos disueltos en la mezcla de almidón que está siendo licuada. 2
6. 6. El proceso mejorado según la reivindicación 25, caracterizado además porque la licuefacción se lleva a cabo a aproximadamente 120 °C. 2
7. 7. Un proceso mejorado para la hidrólisis de almidón, caracterizado porque la licuefacción se lleva a cabo a un pH no mayor a 5 y a temperaturas mayores de 110°C. 2
8. 8. El proceso mejorado según la reivindicación 27, caracterizado además porque la licuefacción se lleva a cabo a un pH no mayor a 4. 2
9. 9. El proceso mejorado según la reivindicación 27, caracterizado además porque la licuefacción se lleva a cabo a un pH no mayor a 3.5. 30. Un proceso mejorado para la hidrólisis enzimática de almidón, caracterizado porque la hidrólisis enzimática se lleva a cabo sobre una mezcla de almidón que tiene un pH no mayor a 5.