MXPA96006138A - Una mezcla purificada de colagenasas y otras dosproteasas obtenidas de clostridium histolyticum - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a una mezcla enzimática purificadaútil para aislar células o agregados celulares de tejidos. La mezcla incluye al menos dos enzimas colagenasas, al menos otras dos proteasas, y componentes adicionales diferentes a las proteasas. La mezcla se purifica removiendo al menos algunos de los componentes diferentes a las proteasas. La mezcla purificada puede usarse entonces para aislar células o agregados celulares de tejidos. También se describen los componentes esenciales de la mezcla enzimática purificada asícomo los intervalos y relaciones preferidas de esos componentes esenciales para aislar células agregados celulares de tejidos. Finalmente, se describe un sistema de disociación que puede ser usado con la mezcla enzimática purificada para disociar tejidos y recuperar células o agregados celulares.

Description

UNA MEZCLA PURIFICADA DE COLAGENASAS Y OTRAS DOS PROTEASAS OBTENIDAS DE CLOSTRIDIUM HISTOLYTICUM CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se relaciona con el aislamiento enzimático de células o agregados celulares de tejidos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Se ha logrado el aislamiento enzimático de células y agregados celulares del hígado, páncreas, piel, cartílago, hueso, tejido neural y otros órganos y ha probado ser útil para varios propósitos incluyendo la caracterización e implantación celular, por ejemplo, aislamiento de los islotes de Langerhans (islotes) del páncreas para su implantación en pacientes diabéticos. Puesto que el colágeno es una proteína estructural prominente dentro de los tejidos, frecuentemente se usa la enzima colagenasa como medio para lograr el aislamiento deseado. Varias formas de la colagenasa cruda, por ejemplo, colagenasa bacteriana cruda derivada de Clostridi um histolyticum, se encuentran comercialmente disponibles y han probado ser útiles en el aislamiento de REF: 23523 células y agregados celulares de tejidos. Esas colagenasas crudas son en realidad una mezcla de enzimas proteasas que exhiben actividad colagenolítica y proteolítica y componentes distintos a las proteasas, incluyendo subproductos de fermentación, medio de fermentación, pigmento y otras enzimas (por ejemplo, fosfolipasa) . Esos componentes distintos a las proteasas de la colagenasa cruda son generalmente reconocidos por aquellos expertos en la técnica como inertes, es decir, que no afectan la actividad de las enzimas proteasas. Desafortunadamente, esas colagenasas crudas comercialmente disponibles han mostrado contener cantidades variables de componentes de proteasa y distintos a las proteasas, causando por lo tanto variaciones sustanciales de eficacia entre lotes. Además de los problemas de variabilidad, el uso de esas colagenasas crudas en investigación ha dado como resultado una integridad celular pobre, bajo número de células y racimos o agregados celulares fragmentados. Esos problemas son significativos, especialmente cuando las células o agregados celulares aislados son transplantados posteriormente. Por ejemplo, se ha demostrado que la eficacia de la masa de islotes transplantados, es decir, su capacidad para producir insulina en un huésped, se reduce en gran medida con la reducción del tamaño y número.

La importancia de las enzimas proteasas para el proceso de obtención de un aislamiento celular eficaz, es decir, mantenimiento de la integridad celular, aislamiento de agregados celulares más grandes el aislamiento de más células o agregados celulares, ha sido reconocida por aquellos expertos en la técnica. Específicamente, se ha encontrado que la presencia de las enzimas colagenasa de la Clase I (colagenasa I) y colagenasa de la Clase II (colagenasa II) y la presencia de una proteasa neutra que de influencia sobre la eficacia del aislamiento celular. Se ha reportado que la proteasa de clostripain tiene una influencia negativa sobre ciertos aislamientos celulares (Hefley, J. Bone and Mineral Res . 2:6, 1987, pp. 505-516). Sin embargo, aunque se han definido muchos de los problemas asociados con la obtención de un aislamiento celular puro, ahora siguen sin descubrirse los remedios apropiados.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona una mezcla enzimática purificada y un método para efectuar la purificación. La mezcla enzimática incluye al menos dos enzimas colagenasas, al menos otras dos proteasas y componentes distintos a las proteasas, y se purifica removiendo al menos algunos de los componentes distintos a las proteasas. La remoción de al menos algunos de esos componentes distintos a las proteasas, considerados en la técnica anterior inertes, inesperadamente da como resultado una mezcla enzimática purificada que es capaz de aislar células o agregados celulares de tejidos con mayor eficacia y eficiencia que una mezcla enzimática no purificada que posee el mismo nivel de actividades enzimáticas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 muestra la mejora en el funcionamiento en la disociación pancreática después de la cromatografía de afinidad del ligando del tinte. La Figura 2 muestra la mejora en el funcionamiento en la disociación pancreática después de la purificación por fraccionamiento y final. La Figura 3 muestra el efecto sobre la actividad de la caseinasa de la proteasa neutra sola y adicionada a una relación fija de colagenasa I, colagenasa II y clostripain. La Figura 4 muestra un sistema de disociación de tejidos que puede usarse en la práctica de la presente invención.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención se basa en el descubrimiento de que cuando una mezcla de colagenasa cruda se purifica removiendo al menos algunos de los componentes distintos a las proteasas, los cuales hasta hora habían sido considerados por la técnica anterior, inertes, se observa una mejora inesperada en el funcionamiento en la disociación tisular. La mezcla enzimática purificada de la presente invención es útil para aislar células o agregados celulares de tejidos que tienen tamaño, rendimiento e integridad sorprendentemente superiores en comparación con las células o agregados celulares aislados usando las mezclas de colagenasa cruda de la técnica anterior. Otro aspecto de la presente invención es la identificación de los componentes esenciales de la mezcla enzimática purificada, así como los intervalos y relaciones preferidas de esos componentes esenciales para aislar células o agregados celulares de tejidos. Cuando los componentes esenciales de la mezcla enzimática purificada se combinan con cantidades predeterminadas, la mezcla enzimática - purificada resultante es útil para aislar células o agregados celulares de tejidos de manera reproducible.

De manera más particular, se ha descubierto que, cuando la composición de colagenasa cruda es purificada de modo que comprenda dos enzimas colagenasas, otras dos proteasas y únicamente una parte de los componentes distintos a las proteasas originalmente presentes en la composición cruda, la mezcla enzimática purificada resultante evita los problemas padecidos por la técnica anterior cuando la mezcla purificada se usa para aislar células o agregados celulares de muestras de tejido. Una mezcla enzimática purificada especialmente preferida comprende colagenasa I, colagenasa II, clostripain y una proteasa neutra. Las proteasas neutras preferidas son las proteasas neutras de C. histolyticum, termolisina o dispasa. La actividad preferida fluctúa de aproximadamente 40 hasta aproximadamente 270 unidades de Wunsch por muestra de colagenasa I pancreática, de aproximadamente 1400 hasta aproximadamente 2400 unidades de Wunsch por muestra de colagenasa II, de aproximadamente 4000 hasta aproximadamente 15,000 unidades de AEE por muestra de clostripain, y de aproximadamente 50,000 hasta aproximadamente 100,000 unidades de caseína FITC por muestra de termolisina. Cuando se usa la dispasa para la proteasa neutra, el intervalo preferido es de aproximadamente 50,000 hasta aproximadamente 90,000 unidades de caseína FITC por muestra. La mezcla enzimática purificada parcialmente preferida para aislar células o agregados celulares de un páncreas porcino o humano comprende aproximadamente 100 unidades de Wunsch por muestra de colagenasa I, aproximadamente 1600 unidades de Wunsch por muestra de colagenasa II, aproximadamente 7,000 unidades de BAEE por muestra de clostripain, y aproximadamente 70,000 unidades de caseína FITC por muestra de termolisina o dipasa. El término "colagenasa cruda" como se utiliza aquí se refiere a una mezcla no purificada que contiene enzimas proteasas que exhiben actividad colagenolítica y proteolítica así como componentes distintos a las proteasas. El término "mezcla enzimática purificada" como se utiliza aquí se refiere a una mezcla de colagenasa cruda, en donde algunos de los componentes distintos a la proteasa han sido removidos.

PURIFICACIÓN DE LA COLAGENASA CRUDA En la presente invención se ha descubierto que cuando al menos uno de los componentes distintos a las proteasas en una mezcla de colagenasa cruda son removidos, la mezcla enzimática purificada resultante es capaz de disociar tejidos con un gran número más grande de células o agregados celulares que los removidos con una mezcla de colagenasa cruda que posee el mismo nivel de actividades enzimáticas. La colagenasa cruda puede obtenerse de muchas fuentes incluyendo mamíferos (por ejemplo humanos), crustáceos (por ejemplo cangrejos, camarones) , hongos y bacterias (por ejemplo de la fermentación de Clostrídium, Strepto yces , Pseudomonas, o Vibrio) . La colagenasa también ha sido diseñada genéticamente. Cualquiera de las anteriores deberá funcionar de manera aceptable como una fuente de colagenasa cruda. La fuente preferida de colagenasa cruda es de un proceso de fermentación bacteriana, específicamente la fermentación de C. histolyticum. La colagenasa cruda puede ser de un solo lote crudo o dos o más lotes crudos mezclados para obtener las relaciones de enzima deseadas. El siguiente diagrama de flujo muestra un proceso de purificación de la presente invención.

Remoción de al menos algunos componentes distintos a las Colagenasa proteasas Mezcla enzimática Cruda purificada A El proceso de purificación de la presente invención comprende en un mínimo la remoción de al menos algunos de los componentes distintos a las proteasas de la colagenasa cruda. La mezcla resultante (mezcla enzimática purificada A) exhibe una mejora sorprendente y notable en el funcionamiento sobre la colagenasa cruda. Esta remoción se efectúa preferiblemente usando cromatografía de afinidad del ligando de tinte como se decribe más adelante en el Ejemplo 1, la cual remueve aproximadamente el 85% de los componentes distintos a las proteasas de la colagenasa original. Una medida de la concentración de componentes distintos a las proteasas en la muestra puede determinarse midiendo su absorbancia (A) a 280 nanómetros (nm) y dividiendo este valor por su absorbancia a 360 nm. Se ha encontrado que las muestras de colagenasa cruda no purificada tienen relaciones de A280/A36o de entre aproximadamente 3 y 10, mientras que las muestras de enzimas que han sido purificadas por la cromatografía de afinidad de ligando de tinte apropiada ha mostrado tener relaciones de A28o/A36o de aproximadamente 30 hasta más de 100. La remoción de al menos algunos de los componentes distintos a las proteasas también puede lograrse por varios otros métodos, incluyendo la cromatografía de afinidad con heparina (descrita más adelante en el Ejemplo 2) y precipitación con sulfato de amonio (descrita más adelante en el Ejemplo 3) . Aunque la precipitación por sulfato de amonio remueve solo aproximadamente el 25% de los componentes distintos a las proteasas, las mezclas enzimáticas purificadas resultantes siguen presentando una mejora significativa en su funcionamiento. Se usaron varios soportes de afinidad (arginina y benzamidina) pero no fueron tan efectivos en la separación de los componentes distintos a las proteasas de las enzimas proteasas. Además, se encontró que otros soportes cromatográficos (por ejemplo soportes propil, butil, pentil, hexil, heptil, y octil omega amino, así como soportes de interacción hidrofóbica de fenil sefarose) separan algunas de las enzimas proteasas de los componentes distintos a las proteasas, pero no tan bien como los soportes de ligando de tinte. La Figura 1 muestra la mejora en el funcionamiento en la disociación pancreática cuando se usó la cromatografía de afinidad de ligando de tinte sobre un lote de colagenasa bacterial cruda obtenida de C. histolyticum. ' La medición del funcionamiento (eje y) es el rendimiento EIN por miligrado de páncreas, EIN es el "número de islotes equivalentes", el cual representa la masa de islotes relativa. Como se muestra en la Figura 1, cuando se trató un lote de colagenasa cruda con el proceso anterior solo sin alterar los niveles de actividad enzimática, el rendimiento EIN se mejoró de aproximadamente 4 hasta más de 9. El diagrama de flujo siguiente muestra el proceso de purificación preferido de la presente invención.

Fracción enzimática Mezclado de y puri fi cación los componentes Mezcla enzimática final Componentes enzimáticos Mezcla purificada A enzimáticos enzimática purificados purificada B Como se mostró anteriormente, la mecía enzimática purificada A puede purificarse aún más por fraccionamiento y purificación final para producir componentes enzimáticos purificados, los cuales pueden entonces mezclarse en cantidades conocidas para formar la mezcla enzimática purificada B. Los Ejemplos de fraccionamiento enzimático, purificación final, y mezclado de los componentes enzimáticos se dan más adelante en los Ejemplos 4 y 5. La Figura 2 muestra la mejora en el funcionamiento de la disociación pancreática cuando se usó el proceso de purificación preferido en varios lotes de colagenasa bacteriana cruda obtenida de C. histolyticum. Como se muestra en la Figura 2, la mezcla enzimática B purificada exhibe la misma mejora notable en el funcionamiento de la mezcla enzimática purificada A. Debido a que la mezcla enzimática purificada B contiene cantidades conocidas de los componentes enzimáticos, sin embargo, su funcionamiento es más reproducible. Además, las relaciones de los componentes de la mezcla enzimática B purificada pueden modificarse, permitiendo la disociación de diferentes tipos de tejidos.

COMPONENTES DE LA MEZCLA ENZIMATICA PURIFICADA La mezcla enzimática de la presente invención comprende dos enzimas colagenasas y otras dos proteasas. Como se discutió anteriormente, las enzimas colagenasas pueden obtenerse de muchas fuentes, incluyendo mamíferos, crustáceos, hongos y bacterias. Pueden usarse enzimas colagenasas diseñadas genéticamente. De manera preferible, las dos enzimas colagenasas son la colagenasa I y la colagenasa II de C. histolyticum. Las otras dos proteasas son preferiblemente clostripain (EC 3.4.24.4) y una o más proteasas neutras (por ejemplo proteasa neutra C. histolyticum, dispasa (EC 3.4.24.4), o termolisina (EC 3.4.24.4). (EC se refiere a la clasificación de la Comisión de Enzimas. EC 3.4.24.4 es la clasificación de las metaloproteinasas microbianas) .

Otro aspecto de la presente invención es la identificación de las relaciones de masa enzimática y los intervalos de actividad de las dos enzimas colagenasas y las otras dos proteasas que se prefieren para aislar células o agregados celulares de tejidos. La relación de masa preferida de colagenasa II a la colagenasa total en la mezcla, colagenasa 11/ (colagenasa I + colagenasa II), es de aproximadamente 0.3 hasta aproximadamente 0.6 y es preferiblemente de aproximadamente 0.4 hasta 0.45. El Ejemplo 5 más adelante describe los intervalos de actividad enzimática preferidos para la aplicación específica del aislamiento de islotes de tejido pancreático.

EJEMPLO 1: PURIFICACIÓN DE LA COLAGENASA BACTERIANA CRUDA POR CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD DEL LIGANDO DE TINTE Se uso como material de partida la colagenasa bacteriana cruda comercialmente disponible (colagenasa P, Boehringer Mannheim) . Se encontró que tres soportes de cromatografía de afinidad del ligando de tinte de A icon funcionaban aceptablemente. Esos soportes fueron el Gel Azul A MATREX, Gel Rojo A MATREX, y Gel Verde A MATREX (marca registrada, W. R. Grace & Co.).

La colagenasa bacteriana cruda y el soporte elegido se equilibraron contra un amortiguador que contenía calcio de baja fuerza iónica a un pH de entre 6.0 a 7.0. Para esas cromatografías se usaron ya sea ácido 4- [2-hidroxietil] -1-pioerazin etansulfónico (HEPES) 20 milimolar (mM) o [bis- (2-hidroxietil) -imino] -tris- (hidroximetil) -metano (BIS-Tris) 20 mM, amortiguador de cloruro de calcio 1 mM pH 7.0 para la unión. La colagenasa bacteriana cruda se disolvió suspendiendo el material de partida liofilizado en el amortiguador deseado a una concentración de proteína de aproximadamente 40 miligramos (mg) /mililitro (mi). Las partículas se removieron entonces por centrifugación (rotor Sorvall GSA, 10,000 rpm durante 30 minutos o equivalentes) y/o filtración preferiblemente a través de una membrana de celulosa o nitrato de celulosa. La muestra se aplico a la resina a una velocidad de flujo de 0.5 centímetros (cm) /minuto (min). Se encontró que podían cargarse aproximadamente 20 mg de colagenasa P en cada mililitro de soporte de Gel Rojo A MATREX o Gel Verde A MATREX con retención completa de las actividades enzimáticas. Los materiales no retenidos se eluyeron con amortiguador de equilibrio. Las fracciones enzimáticas se recuperaron usando un gradiente salino. Los amortiguadores de elución que comprenden ya sea (i) HEPES 20 mM, cloruro de calcio 1 mM, y cloruro de sodio 400 mM (pH 7.5), o (ii) tris-(hidroxi etil) -aminometano (Tris) 20 mM, cloruro de calcio 1 mM, y cloruro de sodio 150 mM (pH 9.0) fueron suficientes para recuperar todas las enzimas. Se encontró que la mezcla enzimática purificada A resultante es capaz de disociar tejidos en un período de tiempo más corto con un mayor número de células o agregados celulares recuperados que con la colagenasa cruda no purificada. El funcionamiento de esta mezcla enzimática purificada con un tipo de tejido dado (por ejemplo páncreas), sin embargo, dependerá de las relaciones y concentraciones de las enzimas y la colagenasa cruda usada como material de partida. Para producir una mezcla que tiene una cantidad conocida de cada enzima presente, que recuperará células o agregados celulares de manera reproducible de un tipo de tejido dado, la enzima debe ser separada, purificada adicionalmente y finalmente mezclada en la concentración deseada (descrita más adelante en los Ejemplos 4 y 5) .

EJEMPLO 2; PURIFICACIÓN DE LA COLAGENASA BACTERIANA CRUDA POR CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD CON HEPARINA También puede usarse la cromatografía de afinidad con heparina para remover al menos algunos de los componentes diferentes a las proteasas de la colagenasa cruda. Se encontró que la resina de afinidad de heparina de Pharmacia Fine Chemicals funciona aceptablemente. La columna y la preparación de colagenasa bacteriana cruda (por ejemplo colagenasa P) se equilibraron en un amortiguador neutro de baja fuerza iónica que contenía una sal de calcio (Tris 10 mM, cloruro de calcio 5 mM pH 7.4). La mezcla se aplicó y lavo con amortiguador hasta que el material no retenido se lavo de la columna. Las enzimas se eluyeron con el mismo amortiguador que contenía cloruro de sodio (>200 mM) .

EJEMPLO 3: PURIFICACIÓN DE LA COLAGENASA BACTERIANA CRUDA POR PRECIPITACIÓN CON SULFATO DE AMONIO También se uso la precipitación con sulfato de amonio saturado al 60% para remover al menos algunos de los distintos a las proteasas de la colagenasa cruda. La colagenasa cruda (colagenasa P) se disolvió a una concentración de 10 a 100 mg/ml en agua o amortiguador neutro de baja fuerza iónica. Se removió el material insoluble y las enzimas se precipitaron haciendo la solución saturada al 60% en sulfato de amonio. Esto se logro mediante la adición lenta de 0.37 gramos (g) de sulfato de amonio sólido por mi de solución de colagenasa o mediante la adición de 1.5 mi de una solución de sulfato de amonio saturada por mi de solución de colagenasa. Este proceso se llevo a cabo en un intervalo de temperatura de 2°C a 8°C. Después de completar la adición de sulfato de amonio, la solución se dejo reposar aproximadamente 2 horas para precipitar las enzimas deseadas. A continuación se recuperaron las enzimas precipitadas.

EJEMPLO 4: FRACCIONAMIENTO ENZIMATICO Y PURIFICACIÓN FINAL Fraccionamiento Enzimático Los recursos enzimáticos enriquecidos del proceso de remoción de componentes distintos a las proteasas en el Ejemplo 1 anterior se intercambiaron en un amortiguador de carga de intercambio aniónico. Se usaron dos sistemas amortiguadores para el fraccionamiento de esta mezcla enzimática. Uno usó HEPES 5 mM y cloruro de calcio 1 mM (pH 7.5) como el amortiguador de unión y cualquiera de los soportes de Flujo Rápido de dietil amino etil (DEAE) o Q SEPHAROSE (Pharmacia) para la resina. Después de que se completo el intercambio de amortiguador la solución de enzima se clarificó y aplico a la columna a una velocidad de flujo de 1 c /min. En promedio se cargaron de 20 a 50 mg de proteínas por mi de soporte. Las enzimas se eluyeron con un gradiente salino ya sea de cloruro de sodio de 0 a 400 mM o cloruro de calcio de 1 a 100 mM. En promedio fueron suficientes de 10 a 15 volúmenes de columna de amortiguador para el gradiente. Ambos gradientes tuvieron una resolución, pureza y recuperación de proteína similar entre sí. Se obtuvieron un total de tres colecciones de enzima y se designaron como (i) colagenasa II y clostripain, (ii) colagenasa I, y (iii) proteasa neutra. Una variación del procedimiento anterior uso un paso con gradiente de cloruro de calcio para eluir las enzimas. En esta cromatografía el clostripain se eluyó usando cloruro de calcio 8 mM, la colagenasa II reunida se eluyó con cloruro de calcio 20 mM, la colagenasa I se eluyó con cloruro de calcio 35 mM y la proteasa neutra se eluyó con cloruro de calcio 100 mM. El segundo sistema amortiguador uso Tris 20 mM como agente amortiguador, pH 9.0, y un paso en gradiente de cloruro de calcio para eluir las proteínas. El amortiguador de unión tuvo cloruro de calcio 1 mM, la colagenasa II y el clostripain se eluyeron con cloruro de calcio 25 mM, la colagenasa I se eluyó con cloruro de calcio 35 mM, y la proteasa neutra se eluyó con cloruro de calcio 100 mM.

Purificación Final de la Enzima La colagenasa II/clostrípain reunida se purificó por cromatografía de intercambio catiónico sobre un gel de intercambio iónico de Flujo Rápido SP SEPHAROSE (marca registrada, Pharmacia, Inc.). La resina y la muestra se equilibraron contra un amortiguador de HEPES 5 mM y cloruro de calcio 1 mM (pH 6.5). La muestra se aplicó a una resina de intercambio catiónico de Flujo Rápido SP SEPHAROSE a una velocidad de 0.5 cm/min. Se aplicaron aproximadamente 20 a 50 mg de clostripain a cada mi de soporte. Después de la aplicación, la columna se lavó con amortiguador de carga hasta que el material no retenido (colagenasa II) se lavó del soporte. Los componentes de proteína retenidos se eluyeron ya sea con un gradiente de cloruro de sodio de 0 a 400 mM o un gradiente de cloruro de calcio de 1 a 100 mM (el gradiente total fue de 15 volúmenes de columna) . La colagenasa II se eluyó en la fracción no retenida, las proteínas contaminantes se encontraron en una fracción intermedia y el clostripain eluyó hacia el final del gradiente salino. Esas dos enzimas purificadas se equilibraron contra un amortiguador de HEPES 5 mM y cloruro de calcio 1 mM (pH 7.5) y se almacenaron congeladas a -20°C a una concentración de proteína de 5 mg/ml y 30 mg/ml.

Para producir más cromatografías la colagenasa I reunida no requiere fraccionamiento adicional. Ocasionalmente se observó contaminación con clostripain o pigmento en las mismas colecciones. En esas ocasiones la enzima colagenasa I se purificó por cromatografía de permeación sobre gel usando una resina AC 44 para efectuar la separación (velocidad de flujo 0.25 cm/min) . También pueden usarse las resinas SEPHADEX G-200 y SEPHACRYL S-200 (marcas registradas, Pharmacia, Inc.) para efectuar el mismo proceso. Pueden usarse cualesquier amortiguadores que contengan sales de calcio que sean compatibles con la estabilidad de las enzimas. El Tris 20 mM y cloruro de calcio 1 mM (pH 7.5) o HEPES 5 mM y cloruro de calcio 1 mM (pH 7.5) produjeron ambos buena recuperación de masa y actividad. Usando esos soportes la enzima colagenasa I se separo de cualesquier subproductos de clostripain o fermentación.

EJEMPLO 5: PREPARACIÓN DE LAS MEZCLAS ENZIMATICAS PARA EL AISLAMIENTO DE LOS ISLOTES DE TEJIDO PANCREÁTICO Las mezclas enzimáticas purificadas se prepararon a partir de las enzimas fraccionadas y purificadas mezclando ya sea un número específico de unidades o masas específicas de las enzimas. Las actividades específicas de las enzimas colagenasa I, colagenasa II y clostripain, de manera usual, suficientemente consistentes de modo que tanto las unidades como la masa produjeron la misma relación de masa de enzimas en la mezcla final. La colagenasa I, colagenasa II, y clostripain se mezclaron y mantuvieron en una solución a +4°C y durante periodos de tiempo prolongados a -20°C. A continuación se encuentran los tres ensayos enzimáticos (ensayos para la colagenesa, clostripain, y proteasa neutra) que se usaron para definir las actividades específicas de los componentes de la mezcla enzimática así como la actividad total de la mezcla enzimática. Se encontró que las especificaciones y tolerancias basadas en esos ensayos eran críticas para el funcionamiento de la mezcla enzimática purificada. Aquellos expertos en la técnica reconocerán que también pueden usarse otros ensayos enzimáticos diferentes a aquellos descritos más adelante.

Ensayo de actividad de la colaqenasa La actividad de la colagenesa se midió usando un sustrato peptídico sintético de acuerdo al método de Wunsch y Heidrich (Z. Physiol Chem. 1963; 333:149). Este es un método estándar bien conocido por aquellos expertos en la técnica de la purificación de la colagenasa. La actividad medida de la colagenasa II (intervalo: 7.5-10.0 unidades (U) /mg) fue aproximadamente 20 veces mayor que la de la colagenasa I (intervalo: 0.3-0.7 U/mg) usando el péptido de Wunsch como sustrato. Una unidad (U) de actividad se definió por la hidrólisis de 1 micromol (µ ol) de péptido por minuto a 25°C, pH 7.1.

Ensayo de la actividad del clostripain La actividad del clostripain se midió mediante la esterólisis del éster-N-benzoil-L-arginin etílico (BAEE) de acuerdo a una modificación del método de Whitaker y Bender (J. Am. Chem. Soc. 1965; 87:2728). El clostripain es una proteasa de cisteína activada por agentes reductores tales como el ditiotreitol (DTT) . La actividad del clostripain medida es la diferencia entre la enzima activada con DTT y la enzima no tratada con DTT. Las actividades descritas se generaron usando 1.8 mM de BAEE. El intervalo de actividad específica medida para el clostripain purificado fue de aproximadamente 70 a 120 U/mg, en donde una unidad se definió como la hidrólisis de 1 µmol de BAEE por minuto a °C, pH 7.6. A continuación se da una descripción del procedimiento de prueba usado para el ensayo de la actividad del clostripain. Amortiguador de Fosfato (75 milimol ( mol) /litro (1) ) : Se disolvieron 1.17 g de fosfato de sodio, monobásico (NaHP04) en agua desionizada (DI) . El volumen se ajustó a 100 mi y se marcó como solución "A". Se disolvieron 1.07 g de fosfato de sodio, dibásico (Na2HP04) en agua DI. El volumen se ajustó a 100 mi y se marcó como solución "B". El valor del pH de la solución B se ajustó a 7.6 con la solución A. Solución de DTT (7.5 mmol/l) : Se disolvieron 28.9 mg de ditiotreitol (DTT) en agua DI y el volumen se ajustó a 25 mi. Solución de BAEE (1.8 mmol/l): Se disolvieron .4 mg de BAEE en agua DI y el volumen se ajustó a 25 mi. Solución Activadora 10X (10 mmol/l de acetato de calcio, 25 mmol/l de DTT) : Se disolvieron 17.6 mg de acetato de calcio y 38.6 mg de DTT en agua DI y el volumen se ajustó a 10.0 mi. Solución Blanco 10X (10 mmol/l de acetato de calcio) : Se disolvieron 17.6 mg de acetato de calcio en agua RO/DI y el volumen se ajustó a 10.0 mi.

Preparación de la Muestra: Se pesaron 2 mg de colagenasa P, se reconstituyeron con 0.9 mi de agua DI y 0.1 mi de Solución Activadora 10X, y se incubaron durante 4.5 horas a temperatura ambiente. (Antes de efectuar el ensayo, la muestra se diluyó 10 veces con Solución Activadora IX) . Preparación del Blanco de Tripsina: Los blancos de la tripsina se prepararon repitiendo las diluciones de muestra usando Solución Blanco 10X en lugar de Solución Activadora 10X y Solución Blanco IX en lugar de Solución Activadora IX. Ensayo Espectrofotométrico (longitud de onda 253 nm, volumen final 0.93 mi, temperatura 25°C) : Se prepararon una mezcla de blanco de tripsina y una mezcla de nuestra activada mezclando lo siguiente: Se colocaron cuatro cubetas en el espectrofotómetro. Se pipetearon 0.9 mi de mezcla de blanco de tripsina a cada una de las primeras dos cubetas. Se pipetearon 0.9 mi de muestra de mezcla activada a las dos cubetas restantes. La absorbancia se leyó durante 1.5 minutos para establecer una lectura blanco (la lectura blanco no debía exceder 0.01 delta (?) A253/min) . La reacción se inició entonces pipeteando 0.03 mi de Preparación de Blanco de Tripsina diluido en las cubetas de blanco de tripsina y 0.03 mi de Preparación de Muestra diluida en las dos cubetas de mezcla activada y mezclando perfectamente. Cada cubeta se leyó durante 1.5 minutos para determinar la velocidad de reacción. (La (?)A253/min debe estar entre 0.007 y 0.040). Cálculo: Para cada muestra, la actividad U/ml se calculo como sigue: U/ml = (?A/minuto) x (factor de dilución) x (0.93) x (1000) / (1150) x (0.03) en donde ?A/minuto = ?A253/min de la muestra • ?A253/min del blanco. Simplificada, U/ml = (?A/minuto) x (factor de dilución) x (26.92). La actividad específica en U/mg se calculó para cada muestra siguiendo el cálculo: actividad específica (U/mg) = (U/mg) / (mg/ml) .

Ensayo de la actividad de la proteasa neutra La actividad de la proteasa neutra se midió mediante la liberación de péptidos fluorescentes solubles en ácido tricloroacético (TCA) del sustrato de la FITC-caseína de acuerdo a una versión modificada del método de Twining (Anal. Biochem. 1984; 143:30). Los péptidos fluorescentes se cuantificaron usando una longitud de onda de excitación de 491 nm y una longitud de onda emisión de 525 nm. Los intervalos de las actividades específicas de la FITC-caseína medidas para las proteasas neutras purificadas fueron: proteasa neutra, 200 a 500 U/mg; dispasa, 900 a 1300 U/mg; y termolisina, 2000 a 4500 U/mg. Una unidad de actividad genera 100,000 unidades fluorescentes (cuentas por segundo) corregidas para el ruido de fondo por minuto a 37°C, pH 7.5. Una descripción del procedimiento de prueba usado para el ensayo de la actividad de la proteasa neutra se da a continuación. Amortiguador de Dilución de la Muestra (100 mmol/l de Tris, 10 mmol/L de Cloruro de Calcio (CaCl2) , pH 7.5) : Se disolvieron 6.06 g de Tris y 0.74 g de CaCl2 en agua DI. El pH se ajustó a 7.5 con HCl 5 N y el volumen se ajustó a 500 mi. Solución de Sustrato de FITC-Caseína (0.25% peso/volumen) : Se disolvieron 50.0 mg de TITC-caseína en el Amortiguador de Dilución de Muestra. El volumen se ajustó a 20.0 mi. Solución de Extinción (5.0% peso/volumen): Se disolvieron 5.0 g de ácido tricloroacético en agua DI. El volumen se ajustó a 100 mi. Solución de Neutralización (500 mmol/L de Tris; pH 8.5) : Se disolvieron 30.3 g de Tris en agua DI. El pH se ajustó a 8.5 con HCl 1 N y el volumen se ajustó a 500 mi. Procedimiento del Ensayo: Las muestras se diluyeron con amortiguador de dilución de muestra a una concentración que fluctuó de 5 a 50 microgramos (µg) /mi dependiendo de la actividad de la muestra estimada. 10 microlitros (µl) de las muestras diluidas se adicionaron a 40 µl de Solución de Sustrato de FITC-caseína en un tubo de Eppendorf de 1.5 mi (el Amortiguador de Dilución de la Muestra se uso como control blanco) y se incubaron durante 45 minutos con agitación a 37°C en un baño de agua. Se adicionaron 120 µl de la solución de extinción. La solución se dejó reposar a temperatura ambiente durante al menos 60 minutos. La solución se centrifugó a continuación a toda velocidad (14,000 rpm) durante 2 minutos. Se removieron 50 µl del sobrenadante y se adicionaron a 2 mi de Amortiguador de Neutralización y se mezclaron por inversión. La muestra se decantó a una cubeta y se midió la fluorescencia (longitud de onda de excitación 491 nm, longitud de onda de emisión 525 nm, ancho del paso 0.2 nm) . Cálculos: CPS = fluorescencia promedio de la muestra de enzima - fluorescencia promedio del blanco de amortiguador. Actividad (U/ml) = CPS x 0.17 mi x Factor de Dilución) (0.05 mi x 0.01 mi x 45 min. x 100,000). La fluorescencia del blanco debería estar en un intervalo de 2000 a 3000 CPS usando el montaje sugerido en el fluorímetro SPEX. El intervalo lineal para el fluorímetro SPEX es de 2000 a 100,000 CPS. De manera importante, la caseína sustrato usada en el ensayo para las proteasas neutras descritas anteriormente también actúa como un sustrato general para una amplia variedad de actividades de proteasa, incluyendo la tripsina, clostripain, dispasa, termolisina, y muchas otras. Como resultado, las unidades finales de las proteasas neutras adicionadas (por ejemplo termolisina y dispasa en las Tablas 2 y 3 más adelante) se midieron y definieron como unidades amplificadas en la mezcla enzimática final y no las unidades reales de los componentes de la proteasa neutra medidos solos antes del mezclado. Se había observado una actividad aparente de 2 a 3 veces la amplificación de la proteasa. La Figura 3 y la Tabla 1 a continuación muestran este efecto de amplificación cuando se usó proteasa neutra de C. hi stolyticum en un ensayo de FITC-caseína para evaluar los componentes individuales y mezclados aislados de la colagenasa P.

Tabla I - Ensayo de FITC-caseína para eval uar los componentes indi viduales y mezclados aislados de la colagenasa P *Todas las muestras se adicionaron al ensayo usando la masa equivalente basada sobre A28o. -25 La amplificación de la actividad aparente observada en la Figura 3 y en la Tabla 1 anterior para la proteasa neutra de C. histolytícum también se aplica a otras proteasas neutras (por ejemplo termolisina o dispasa) adicionadas a la mezcla enzimática. Las cantidades óptimas de colagenasa I, colagenasa II, clostripain, y proteasa neutra en la mezcla enzimática purificada variarán dependiendo del tipo de tejido a disociarse. La Tabla 2 más adelante muestra los intervalos y unidades y masas preferidas para cada componente enzimático para la disociación del páncreas humano. Una muestra pancreática humana típica para la cual la composición preferida ha sido definida es un peso de aproximadamente 60 a 100 gramos y relativamente libre de congestión (sangre residual) . De manera importante, los límites superiores de los intervalos de actividad dados para las enzimas colagenasa I, colagenasa II y clostripain no son críticos, es decir, que el funcionamiento de la mezcla enzimática purificada no disminuye cuando las enzamas colagenasa I, colagenasa II y clostripain no están por encima de esos límites superiores. Las actividades específicas listadas en la Tabla son las actividades determinadas para cada componente enzimático purificado. El intervalo de unidades y las unidades preferidas son las actividades medidas de cada componente en la mezcla enzimática final. Para la colagenasa I, colagenasa II, y clostripain, el intervalo de unidades y las unidades preferidas en la mezcla final reflejan la actividad específica de cada componente veces la masa adicionada del componente. Para la termolisina, el intervalo de unidades y las unidades preferidas reflejan la actividad de veces la termolisina la masa adicionada veces un factor de amplificación como se describió anteriormente.

Tabla 2 - Mezcla Enzimática Purificada para la Disociación del Páncreas Humano Después del fraccionamiento enzimático y la purificación final de las enzimas colagenasa I, colagenasa II, y clostripain como se describió anteriormente, las proteínas se concentraron a 10-25 mg/ml. Las enzimas se intercambiaron en amortiguador entonces en un amortiguador de HEPES 5 mM, CaCl2 1 mM (pH 7.5), y se determinó la actividad específica de cada una de las enzimas. Las cantidades deseadas de las enzimas colagenasa I, colagenasa II, y clostripain se mezclaron entonces suavemente para formar una solución homogénea. Si la disociación del tejido se efectúo el mismo día, esta solución se mantuvo en hielo a +4°C hasta que fuese necesario. La cantidad deseada de termolisina se disolvió entonces en 1 a 2 mi de agua o amortiguador y se mezcló suavemente hasta disolverse completamente. La solución de termolisina se adicionó entonces a solución de colagenasa I, colagenasa II, y clostripain y se mezcló hasta ser uniforme. Esta mezcla enzimática purificada se diluyó entonces según se desee para la disociación del páncreas. La Tabla 3 a continuación muestra los intervalos y unidades y masas preferidas para cada componente enzimático para la disociación del páncreas porcino. Una muestra pancreática porcina típica para la cual la composición preferida ha sido definida es una que pesa aproximadamente 60 a 100 gramos y esta relativamente libre de congestión (sangre residual) .

Ta?la 3. Mezcla Enzimática Purificada para la Disociación del Páncreas Porcino La mezcla enzimática purificada para la disociación del páncreas porcino se preparó como se describió anteriormente para la mezcla de disociación de páncreas humano, excepto que se usó dispasa en lugar de termolisina.

Se esperaba que las mezclas enzimáticas purificadas descritas anteriormente para la disociación del páncreas humano y porcino funcionaran aceptablemente para otros tipos de tejido también. Como será evidente a aquellos expertos en las técnica pueden ser necesarias algunas modificaciones para optimizar la mezcla enzimática purificada para disociar tipos específicos del tejido, por ejemplo los tejidos que contienen más colágeno pueden requerir actividad de coiagena incrementada y los tejidos que contienen más proteínas diferentes al colágeno pueden requerir actividad de proteasa incrementada. De manera similar, las muestras de tejido pancreático más pequeñas o más grandes de 60 a 100 gramos pueden necesitar los ajustes correspondientes en la actividad enzimática.

EJEMPLO 6: PROTOCOLO PARA LA DISOCIACIÓN DEL PÁNCREAS PORCINO El siguiente es un ejemplo de como la mezcla enzimática purificada de la presente invención se usó para disociar un páncreas porcino y recuperar células de islote viable. También se usó el mismo procedimiento para el aislamiento de los islotes humanos.

Instalación del Sistema de Disociación El sistema de disociación que se usó de acuerdo con la presente invención se muestra en la Figura 4. La cámara de disociación de 500 mi de Ricordi 1 (C. Ricordi, Instituto de Investigación de la Diabetes, Universidad de Miami, Florida) , incluyó la porción superior 2, la porción inferior 3, el tamiz de alambre de malla 4 (tamaño de poro de 400 micrómetros (µm) x 3.75 pulgadas (") de diámetro), detector de temperatura 5 Mon-a-therm Modelo 6510,y siete (7) esferas de vidrio de 1 cm de diámetro 6. La cámara 1 se conectó al grifo de cierre 7 por medio de una tubería de silicón. El grifo de cierre 7 se conectó al conectador en T 8 por medio de un tubo de silicón. El conectador en T 8 se conectó a un probeta graduada de 100 mi 9 por medio de un tuvo de silicón. La pinza 10 se localizó a lo largo de la tubería entre el conectador en T 8 y la probeta 9. El conectador en T 8 también se conectó al recipiente de recolección 11 (matraz Erlenmeyer de 1 litro) por medio de la tubería de silicón. La pinza 12 se localizó a lo largo de la tubería entre el conectador en T 8 y el recipiente de recolección 11. El recipiente de adición 13 (matraz Erlenmeyer de 1 litro) se conectó al conectador en T 14 por medio de la tubería de silicón. La pinza 15 se localizó a lo largo de la tubería entre el recipiente de adición 13 y el conectador en T 14. El recipiente de adición 13 contenía Solución Salina Balanceada de Han s (HBSS) descrita más adelante) . Las flechas en la Figura 4 indican el flujo de la HBSS a través del sistema. El conectador en T 14 se conectó a la probeta 9 por medio de una tubería de silicón. La pinza 16 se localizó a lo largo de la tubería entre el conectador en T 14 y la probeta 9. El conectador en T 14 también se conectó en el primer extremo del serpentín de acero inoxidable 17 (longitud del serpentín = 80") en un baño de agua 18 (Lauda M20, Biodynamics) por medio de la tubería. El segundo extremo del serpentín de acero inoxidable 17 se conectó al conectador Y 20 por medio de la tubería. La tubería Master Flex 19 (Colé Palmer) se localizó a lo larqo de la tubería entre el serpentín de acero inoxidable 17 y el conectador en Y 20.

El conectador en Y 20 se conectó en la porción inferior 3 de la cámara 1 por medio de dos fragmentos de tubería.

(Nota: únicamente 2 de las pinzas 10, 12, 15, 16, estuvieron en uso en cualquier momento dado) .

Preparación de la Solución de Disociación FBS: Suero Bovino Fetal (FBS) (HyClone, inactivado con calor) se descongeló la temperatura ambiente y se colocó en un baño de agua a 56°C durante 30 minutos, se agitó periódicamente, y se alacenó a 4°C. Amortiguador de Ficoll Patrón: Se preparó 1 L de una solución de Eurocsllins (Fresenius) y se vació en un mezcla 1L. Se pesaron 500 g de Ficoll, 400DL Grado Molecular (Sigma) en un matraz de 4 L con una barra de agitación. El 1 L de solución de Eurocollins se adicionó lentamente (500 mi/10 min) . Se adicionaron 8.94 g de HEPES (Boehringer Mannheim) . La mezcla se cubrió con una envoltura a prueba de humedad PARAFILM (marca registrada por American National Can Co.) y se agitó durante la noche. Al día siguiente, el pH de la solución se llevó a 7.40 con NOH, 10 (Mallinckrodt) . La solución se esterilizó entonces en autoclave a 100°C durante 15 minutos, y después almacenado a 4°C.

Gradiente de Amortiguador de Ficoll/Solución de Eurocollins: Se prepararon cuatro soluciones con amortiguador Ficoll patrón con densidades de 1.125 g /cm"3, 1.080 g/cm"3, 1.060 g/cm"3, y 1.037 g/cm"3 (la densidad del amortiguador de Ficoll patrón fue de 1.134 g/cpf3) , usando solución de Eurocollins como diluyente. Para la solución de 1.125 g/cm"3 se adicionaron 900 mi de amortiguador de Ficoll a 140 mi de solución de Eurocollins. Para la solución de 1.080 g/cm"3 se adicionaron 500 mi de solución 1.125 g/cm"3 a 320 mi de solución de Eurocolins. Para la solución de 1.060 g/cm"3, se adicionaron 400 mi de solución 1.080 g/cm"3 a 200 mi de solución de Eurocollins. Para la solución de 1.037 g/cm"3, se adicionaron 160 mi de solución 1.060 g/cm"3 a 190 mi de solución de Endocollins. La densidad se verificó después de cada dilución (densidad objetivo +/-0.002 g/cm"3) y se ajustó si era necesario usando un densiómetro que PAAR DMA 35 (AntonPaar USA, Inc.). Medios de Cultivo: 500 mi de agua estéril se colocaron en un autoclave a 121°C durante 30 minutos. El antibiótico Anfotericina B FUNGIZONE (marca registrada, E.R. Squibb & Sons, Inc.) (Gibco) se reconstituyó con 20 mi de agua estéril. Se adicionaron 1 mi de FUNGIZONA reconstituido, 500 microlitros (µl) de Pen-Strep (10,000 UP, 10,000 µg S) (Gibco), y 50 mi de FBS a 500 mi de CMRL 1066 (Gibco) . Amortiguador de Extinción: Se adicionaron 100 mi de FBS a 900 mi de Solución Salina Balanceada de Hanks (HBSS) (Sigma) . Solución de DTZ Patrón: se adicionaron 200 mg de Ditizona (DTZ) (Sigma) a 80 mi de Dimetilsulfóxido (DMSO), se mezclaron para agitar, y se dejaron equilibrar. Solución de DTZ de Trabajo: Se adicionaron 80 mi de solución de PTZ patrón a 720 mi de HBSS y se agitó para mezclar. La solución se dividió en tubos cónicos de 50 mi (40 mi cada uno) y se almacenó a 20°C hasta ser usada. Solución de Colagenasa de Trabajo: Antes de perfundir el páncreas, se calentó 1 L de HBSS a 28°-32°C en un baño de agua. Se adicionaron 200 mg de Dnasa I (Boehringer Mannheim) . Se removieron 667 mi menos el volumen de enzima líquida de HBSS/DNasa y se transfirieron a una botella de vidrio. Se adicionó el líquido equivalente de 1.0 g de la mezcla enzimática purificada (descrita anteriromente en el Ejemplo 5 en la Tabla 3) y se agitó hasta mezclar (volumen final = 667 mi) . La solución se esterilizó entonces por filtración usando una unidad de filtración CA de 0.2 µm de Corning. La solución de colagenasa de trabajo se mantuvo a 28-32°C, con el calentamiento necesario en un baño de agua.

Remoción Quirúrgica del Páncreas Preparación: Antes de obtener el páncreas, la solución de DTZ de trabajo, el amortiguador de extinción y los medios de cultivo se calentaron a temperatura ambiente. El baño de agua 18 se encendió y se secó a 45°C. Se adicionó HBSS al sistema de disociación aplicando las pinzas 12 y 16. Una vez que el nivel de HBSS alcanzó 100 mi en la probeta 9, la pinza 16 se removió y la pinza 15 se aplicó. El HBSS se circuló para calentar el sistema de disociación. Se colocó 1 L de HBSS en otro baño de agua y se mantuvo a 30°C. Obtención: Se anotó el tiempo desde el sacrificio del cerdo (pistola de disparo o golpe) hasta el desangrado. Una vez que el cerdo se desangró, se limpió el abdomen con solución de yodo y se abrió con un bisturí estéril. Se retrajeron los intestinos y se levantó el estómago usando esponjas en rollo. El lóbulo esplénico del páncreas se removió usando una disección tosca. La vena porta se cortó hasta el final. El páncreas se colocó en 300 mi de solución de Eurocollins preenfriada (en hielo) . Se anotó el tiempo de isquemia caliente (tiempo desde el desangrado hasta la colocación de la glándula de la solución de Eurocollins preenfriada) . El cronómetro se reactivó para el tiempo de isquemia fría (tiempo para el transporte, limpieza, perfusión y colocación de la glándula en la cámara de disociación) . Se anotaron el peso y sexo del cerdo.

Disección y Perfusión del Páncreas Se colocó DTZ en una jeringa de 60 ce con una punta de filtro de 0.2 µm. El páncreas se enjuagó con HBSS y se colocó en una bandeja pequeña sobre hielo. La grasa se removió usando una disección tosca. El cuello se canuló localizando el ducto, insertando un catéter de cánula, adicionando una aguja, atando el catéter de cánula con sutura y removiendo la aguja. El páncreas limpio y canulado se pesó. El lóbulo se perfundeó entonces llenando la glándula con 180-240 mi se la solución de colagenasa usando una jeringa de 60 ce. La glándula se infló a medida que era perfundida. Se notó el volumen de colagenasa adicionada. Las fugas se apretaron y el cuello se apretó después de la remoción de la cánula.

Disociación del Páncreas Disociación: El sistema de disociación se vació aplicando la pinza 10 y liberando la pinza 12 y el amortiguador de circulación se recolectó en una botella de 1 L. El páncreas prefundido se colocó en la porción inferior 3 de la cámara de disociación 1 con las esferas 6. Se adicionó un exceso de solución de colagenasa de trabajo (caliente) se adicionó tan poca colagenasa con sangre (de la bandeja) como fue posible) . Un tamiz de malla 4 se colocó sobre la porción inferior 3 de la cámara de disociación 1 y la porción superior 2 de la cámara de disociación 1 sobre la parte superior de la porción inferior 3. El sistema de disociación se llenó con solución de colagenasa de trabajo del recipiente de adición 13 mediante la aplicación de las pinzas 12 y 16. Una vez que la solución de colagenasa alcanzó 100 mi en la probeta 9, se removió la pinza 16 y se aplicó la pinza 15. De este modo se estableció un sistema de circulación cerrada. Se anotó el tiempo de isquemia fría (el tiempo desde que el páncreas fue colocada en la solución de Eurocollins hasta que el páncreas fue colocado en la cámara de disociación 1 y comenzó la circulación) . El cronómetro se reinició para el tiempo de disociación. La velocidad de la bomba 19 se ajustó a 85 ml/min. La cámara 1 se hizo oscilar suavemente con la mano (pero no se invirtió) . La cámara 1 se agitó una vez por minuto comenzando a los 5 minutos de la disociación. Una vez que la cámara de disociación 1 alcanzó 37°C, la temperatura del baño de agua 13 se fijó a 40.5°C y se ajustó con hielo. Se anotó el tiempo de disociación. Muéstreo: La solución circulante se inspeccionó colocando DTZ en una caja de petri Costar de 35 milímetros (mm) recolectandao aproximadamente 1 mi de la solución circulante del grifo de cierre 7, y observando la solución bajo un microscópico para ver si estaba libre de islotes. La disociación se detuvo cuando estuvo libre de islotes > 60% (no se observaron islotes fragmentados pequeños y el tejido exócrino comenzó a verse "flojo") . A continuación se recolectaron 2 mi de la solución circulante del grifo de cierre 7 en un tubo cónico de 15 mi. Se removieron 150 µl para el conteo, se colocaron en una caja de petri de 35 mm con DTZ y se vieron bajo un microscopio de luz (amplificación 100X, ocular 10X, objetivo 10X) . Los conteos de islotes se correlacionaron con EIN usando el método de conversión de Ricordi ("Transplante de Células de Islotes Pancreáticos", C. Ricordi MD, 1992, R.G. Landes Company, página 133) . Se notó el volumen restante en la probeta 9 después de la disociación para calcular de nuevo los factores de dilución (se asumió un volumen inicial de 667 mi) . Se recolectaron 2 mi de solución circulante del grifo de cierre 7 en un tubo de Nalgene de 4.5 mi y se almacenaron en hielo para un ensayo enzimático. Recolección: Se adicionó amortiguador de extinción al sistema de disociación para la dilución removiendo las pinzas 12 y 15 y aplicando unas pinzas 10 y 16. La velocidad de flujo de la bomba 19 se incrementó a 160 ml/min. Se removió el serpentín de acero inoxidable 17 del baño de agua 18. La cámara 1 se hizo oscilar suavemente con la mano. Se colocaron 500 mi de amortiguador de extinción en dos botellas de centrifuga de 1 L. La probeta 9 se vació en la primer botella de 1 L. Se recolectaron 6 litros y se centrifugaron en una centrífuga de Beckman (rotor JS4.2) a 284xG (1000 rpm), 3 minutos, sin freno. Se aplicó el freno únicamente a la frecuencia vibracional (aproximadamente 600 rpm) . Se aspiraron los sobrenadantes dejando aproximadamente 150 mi en cada botella. Los sedimentos se resuspendieron agitando y combinando los sedimentos de todas las botellas. El sedimento se lavó entonces con 1L de amortiguador de extinción y se centrifugaron a 284 x G (1000 rpm), 3 min, sin freno, (excepto a 600 rpm) . Se reaspiró el sobrenadante. Los sedimentos se resuspendieron agitando y triturando suavemente. Se adicionó amortiguador de extinción hasta un volumen total de 150 mi (cuenta preFicoll) . La solución se dividió entonces en tubos cónicos de 50 mi y se centrifugó en una centrífuga Sorvall RT600B 400 x G (1400 rpm), 3 min, sin freno. Se aspiraron los sobrenadantes. El sedimento se resuspendió en solución de Eurocollins a un volumen final de 70 mi. Gradiente de Purificación: Los componentes del gradiente se calentaron a temperatura ambiente durante 10 minutos antes de su uso. Los gradientes de cargaron por el fondo y se estratificaron en tubos cónicos de fondo esféricos de vidrio de 150 mi (7.7 mi de suspensión celular + 42.3 mi 1.125, 25 mi 1.080, 25 mi 1.060, 25 mi 1.037). Los tubos se centrifugaron en una centrífuga de Beckman (rotor JS4.2) 400 X G (1200 rpm) a 10°C durante 25 minutos, sin freno. (Interfaces de recolección: interface 1 1.037/1.060, interface 2 - 1.060/1.080, interface 3 - 1.080/1.125). Las capas se lavaron dos veces llevando el volumen total a 250 mi con amortiguador de extinción, centrifugando en una centrífuga de Sorvall (RT600B) , 400 X G (1200 rpm) a 10°C sin freno, aspirando el sobrenadante y resuspendiendo el sedimento y repitiendo para un segundo lavado o resuspendiendo el sedimento en 10 mi de medio de cultivo. Cada cada se observó y contó si fuese justificable (cuenta post Ficoll) . El aparato y protocolo anteriores sirven como un ejemplo de como puede llevarse a cabo la disociación usando la mezcla enzimática purificada de la presente invención. Será evidente a aquellos expertos en la técnica que pueden usarse otros métodos de acuerdo con la presente invención para efectuar la disociación. La presente invención ha sido descrita en las enseñanzas y dibujos anteriores con suficiente claridad y consistencia para permitir a un experto en la técnica hacer y usar la invención, para conocer el mejor modo de llevar a cabo la invención, y para distinguirla de otras invenciones de lo que es viejo. Muchas de las variaciones y adaptaciones obvias de la invención que pueden venirse a la mente, se pretende que estén contenidas dentro del alcance de la invención como se reivindica a continuación. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención. Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes:

Claims (30)

REIVINDICACIONES

1. Una composición que comprende dos enzimas colagenasas, otras dos proteasas, y componentes distintos a las proteasas, caracterizada porque la composición se purifica de modo que algunos de los componentes diferentes a las proteasas sean removidos.

2. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque las dos enzimas colagenasas son la colagenasa I y la colagenasa II.

3. La composición de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque las otras dos proteasas son clostripain y una proteasa neutra.

4. La composición de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque al menos aproximadamente un 25% de los componentes diferentes a las proteasas son removidos.

5. La composición de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque al menos aproximadamente el 85% de los componentes diferentes a las proteasas son removidos.

6. La composición de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque la proteasa neutra se seleciona del grupo que consiste de proteasa neutra de C. histoli tycum, dispasa y termolisina.

7. La composición de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque los componentes distintos a las proteasas removidos se removieron usando la cromatografía de afinidad de ligando de tinte.

8. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque las dos enzimas colagenasas, las otras dos proteasas y los componentes distintos a las proteasas se obtienen por medio de un proceso de fermentación bacteriana.

9. La composición de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque el proceso de fermentación bacteriana es la fermentación de C. histolyticum.

10. La composición de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque las dos enzimas colagenasas son la colagenasa I y la colagenasa II y las otras dos proteasas son clostripain y una proteasa neutra.

11. La composición de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada porque la proteasa neutra se selecciona del grupo que consiste de proteasa neutra de C. histolyticum, dispasa y termolisina.

12. La composición de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada porque los componentes distintos a las proteasas removidos se removieron usando la cromatografía de afinidad de ligando de tinte.

13. La composición de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque tiene de aproximadamente 40 hasta aproximadamente 270 unidades de Wunsch por muestra pancreática de colagenasa I, de aproximadamente 1400 a aproximadamente 2400 unidades de Wunsch por muestra pancreática de colagenasa II, de aproximadamente 4,000 hasta aproximadamente 15,000 unidades de BAEE por muestra pancreática de clostripain, y de aproximadamente 50,000 hasta aproximadamente 100,000 unidades de FITC caseína por muestra pancreática de termolisina.

14. La composición de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque tiene de aproximadamente 40 hasta aproximadamente 270 unidades de Wunsch por muestra pancreática de colagenasa I, de aproximadamente 1400 a aproximadamente 2400 unidades de Wunsch por muestra pancreática de colagenasa II, de aproximadamente 4,000 hasta aproximadamente 15,000 unidades de BAEE por muestra pancreática de clostripain, y de aproximadamente 50,000 hasta aproximadamente 90,000 unidades de FITC caseína por muestra pancreática de dispasa.

15. La composición de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque tiene aproximadamente 100 unidades de Wunsch por muestra pancreática de colagenasa I, de aproximadamente 1600 unidades de Wunsch por muestra pancreática de colagenasa II, aproximadamente 7,000 unidades de BAEE por muestra pancreática de clostripain, y aproximadamente 70,000 unidades de FITC caseína por muestra pancreática de una enzima seleccionada del grupo que consiste de termolisina y dispasa.

16. Un método de purifiación de una composición, la cual incluye dos enzimas colagenasas, otras dos proteasas y componentes distintos a las proteasas, caracterizado porque comprende remover algunos de los componentes distintos a las proteasas de la composición.

17. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque las dos enzimas colagenasas, las otras dos proteasas y los componentes distintos a las proteasas se obtienen por medio de un proceso de fermentación bacteriana.

18. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el proceso de fermentación bacteriana es la fermentación de C. histolyticum.

19. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque las dos enzimas colagenasas son la colagenasa I y la colagenasa II.

20. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque las otras dos proteasas son clostripain y una proteasa neutra.

21. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque la proteasa neutra se selecciona del grupo que consiste de proteasa neutra de C. histolyticum, dispasa y termolisina.

22. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque los componentes distintos a las proteasas removidos se removieron de la composición usando la cromatografía de afinidad de ligando de tinte.

23. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque las dos enzimas colagenasas son la colagenasa I y la colagenasa II y las otras dos proteasas son clostripain y una proteasa neutra.

24. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque comprende además el fracionamiento de la colagenasa I, colagenasa II y clostripain de la composición, y combinar la colagenasa I, colagenasa II y clostripain fraccionadas con una proteasa neutra.

25. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque el paso del fraccionamiento de la colagenasa I, colagenasa II y clostripain de la mezcla enzimática purificada se efectúa usando la cromatografía de intercambio aniónico.

26. Un método para aislar células o agregados celulares de tejidos caracterizado porque comprende: (a) obtener una muestra de tejido; (b) disociar las células o agregados celulares de la muestra de tejido con la composición de conformidad con la reivindicación 1, y (c) aislar las células o agregados celulares.

27. El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque las dos enzimas colagenasas son la colagenasa I y la colagenasa II de C. histolyticum, y las otras dos proteasas son clostripain y una proteasa neutra.

28. El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque las células o agregados celulares son los islotes y el tejido es el tejido pancreático.

29. Un método para aislar los islotes del tejido pancreático, caracterizado porque comprende: (a) obtener una muestra de tejido pancreático; (b) disociar los islotes de la muestra de tejido pancreático con la composición de conformidad con la reivindicación 13, y (c) aislar los islotes.

30. Una composición de colagenasa purificada preparada a partir de una composición de colagenasa cruda que contiene proteasa y componentes diferentes de las proteasas, caracterizada porque la composición purificada comprende colagenasa I, colagenasa II, clostripain, una proteasa neutra, y únicamente parte de los componentes distintos a las proteasas originalmente presentes en la composición cruda, y en donde la relación de la masa de colagenasa II a la masa de colagenasa I más la masa de la colagenasa II en la composición es de aproximadamente 0.3 hasta aproximadamente 0.6.