MXPA96006072A - Metodo para la deteccion de pseudomonas aeruginosa usando una reaccion de cadena de polimerasa - Google Patents

Abstract

la presente invención se refiere a un método para detectar la presencia de P. aeruginosa en una muestra de fluido. El método usa PCR para amplificar la expresión de un segmento de la secuencia de gen exotocina A. El método incluye el tratar capas de fragmentos de nucleótido con un primer imprimador de oligonucleótido y un segundo imprimador de oligonucleótido. Los imprimadores son suficientemente complementarios al fragmento para hibridizar una región teniendo de desde alrededor de 400 a 1200 pares de base. Deseablemente, el primer imprimador de oligonucleótido incluye la secuencia 5'- ACAACG CCC TCA GCA TCA CCA-3'y el segundo imprimador de oligonucleótido incluye la secuencia 5'-CGG GTC GAG CAG GCA CAA C-3'.

Description

MÉTODO PARA LA DETECCIÓN DB PSEÜDOMON?S ?ERÜGINOSA OSANDO UNA REACCIÓN DE CADENA DE POLIMBRASA Antecedentes de la Invención La presente invención se refiere a un método mejorado para detectar la presencia de pseudonomas aeruginosa (P. aeruginosa) en una muestra de fluido. Más específicamente, ésta se refiere a un método para usar imprimadores específicos en un proceso de reacción de cadena de polimerasa (PCR) para clonar un segmento de un gen P. aeruginosa exotoxin A (ETA) teniendo por lo menos 400 pares de base.

La P. aeruginosa es un patógeno oportunístico capaz de producir dos toxinas diferenes ADP-ribosiltransferasa: ETA y exoenzima S. La exoenzima S puede causar un daño significativo en el tejido del pulmón, en las infecciones de quemadas y heridas en ambos humanos y animales. La exotoxina A es altamente tóxica y se produce por una mayoría de las cepas P. aeruginosa. La toxina se conoce porque inhibe la biosíntesis de proteína eucariótica en el nivel del alargamiento de cadena de péptido, lo cual es similar a la toxina de difteria. Se ha observado que tan pocas como de 10 a 100 celdas de P. aeruginosa pueden llevar a la colonización intestinal en pacientes los cuales están con una inmunidad suprimida. Unas pocas causas ilustrativas de la inmunosupresión incluyen los pacientes de trasplantes, los pacientes de sida, los recipientes de quimioterapia, y similares.

Dado que la P. aeruginosa es médicamente importante, se han desarrollado varios métodos para identificar las especies P. aeruginosa. Tales métodos incluyen, pero no se limitan a, usar anticuerpos monoclonales, anticuerpos inmunofluorescentes, métodos microbiológicos convencionales y duplicación en secuencia de DNA o RNA. Cada uno de estos métodos tiene a una extensión limitada una desventaja. La prueba de anticuerpo-inmunofluorescente no es confiable debido a que produce un color amarillo o verde oliva apagado el cual es difícil de distinguir de la autofluorescencia. Los métodos microbiológicos convencionales, aún cuando exactos, son muy intensivos de tiempo ya que los organismos activos deben ser cultivados y aislados. Esto usualmente requiere varios días bajo condiciones ideales. Usando técnicas de secuencia DNA o RNA se requiere una cantidad medible de DNA o RNA para trabajar. Además, el examen escogido debe ser suficientemente específico como para excluir otros organismos que puedan tener una secuencia de ácido nucleico similar. Para superar estas desventajas, los imprimadores y sondas DNA/RNA tienen que tener un número sustancial de nucleótidos que sean específicos a un fragmento de gen dentro del organismo.

Para superar las desventajas asociadas con la cantidad baja de DNA/RNA presente en una muestra de prueba puede ser usado el PCR, bajo condiciones hibridizantes, para multiplicar el fragmento de núcleo de gen de objetivo. El PCR sintéticamente aumenta el material nucledtido presente sin necesariamente tener un gran número de organismos inicialmente para derivar el material genético de inicio.

Brevemente, el PCR involucra el tratar una muestra DNA, bajo condiciones hibridizantes, con un imprimador oligonucleótido para cada cepa de cada secuencia específica diferente sospechada de estar presente en la muestra. Usando los imprimadores y agentes para la polimerización, un producto de extensión de cada imprimador se sintetiza el cual es complementario a cada cepa de ácido nucleico. El imprimador o imprimadores son seleccionados para ser virtualmente complementarios a cada cepa de objetivo de cada secuencia específica de manera que el producto de extensión sintetizado de un imprimador, cuando éste es separado de su complemento, puede servir como un templado para la síntesis del producto de extensión. El fragmento de núcleo hibridizado es entonces desnaturalizado, generalmente usando calor, para separar los productos de extensión de imprimador. Estos productos son de nuevo sometidos a imprimadores de nucléotido complementarios de manera que un producto de extensión de imprimador es sintetizado usando cada una de las cepas únicas producidas como un templado, resultando en una amplificación de la secuencia o secuencias de ácido nucleico específicas si están presentes. Este proceso es suficientemente ciclado para aumentar la cantidad de DNA de objetivo de manera que es posible la detección.

Una desventaja del uso del PCR es la de que los imprimadores de oligonucledtido deben ser suficientemente largos para hibridizar específicamente un segmento de objetivo del fragmento de nucleótido el cual en sí mismo debe ser único al organismo de objetivo. Si los imprimadores de oligonucleótido son muy grandes, hay una posibilidad de que los imprimadores se autopolimericen reduciendo la eficacia de los imprimadores seleccionados. Si los imprimadores de oligonucleótido no son suficientemente grandes entonces éstos pueden no ser específicos a el organismo o fragmento de objetivo no llevando a una diferenciación entre el organismo de objetivo y un organismo sin objetivo. Por tanto, hay una necesidad para un imprimador para detectar la P. aeruginosa el cual reduce o elimina la autopoli erización y tiene una sensibilidad alta para el organismo de objetivo P. aeruginosa.

Síntesis de la Invención Brevemente la invención se refiere a un método para detectar las Pseudomonas aeruginosa en una muestra de fluido. El método incluye el usar técnicas PCR para aumentar la expresión -de un segmento de un fragmento de secuencia de gen de exotocina A (ETA) . El método incluye el tratar cepas únicas de fragmentos de nucleótido con un imprimador de oligonucleótido primero y segundo. Los imprimadores son suficientemente complementarios al fragmento de nucleótido de manera que el proceso PCR hibridizará una región del fragmento teniendo de desde alrededor de 400 pares de base a alrededor de 1200 pares de base. En una modalidad preferida el primer imprimador de oligonucleótido incluye la secuencia 5' - ACA ACG CCC TCA GCA TCA CCA - 3' e hibridiza la región 1002 a alrededor de 1023 de la secuencia de gen ETA. El segundo imprimador de oligonucleótido incluye la secuencia 5' - CGG GTC GAG CAG GCA CAÁ C - 3' e hibriza la región 1404 a alrededor de la región 1424 de la secuencia de gen ETA.

Es un objeto general de la invención el proporcionar un método para detectar la presencia de P. aeruginosa en una muestra de fluido. Un objeto más específico de la invención es el de proporcionar un método para detectar la P. aeruginosa usando técnicas PCR en conjunción con imprimadores de oligonucleótido específicos para hibridizar una región de la ETA teniendo de desde alrededor de 400 a alrededor de 1200 pares de base.

Es otro objeto de la invención el proporcionar un método el cual es altamente sensible para detectar la presencia de P. aeruginosa en una muestra de fluido usando imprimadores específicos.

Descripción Detallada de la Invención El término "oligonucleótido" como se usó aquí cuando se refiere a imprimadores, sondas, fragmentos de oligómero que van a ser detectados, y similares se define como una molécula compuesta de dos o más de oxiribunucledtidos o ribonucleótidos, preferiblemente más de tres. Su tamaño exacto dependerá de muchos factores, lo cual a su vez depende de la función final o uso del oligonucleótido.

El término "imprimador" como se usa aquí se refiere a un oligonucleótido, ya sea que ocurra naturalmente como en una recopilación de restricción purificada o se produzca sintéticamente, el cual es capaz de actuar como un punto de iniciación de síntesis cuando se coloca bajo condiciones en las cuales se induce la síntesis de un producto de extensión imprimador el cual es complementario a un ácido nucleico, per ejemplo, en la presencia de nucleótidos y un agente de inducción tal como polimerasa DNA y a una temperatura y pH adecuados. Se entenderá que la palabra imprimador como se usa aquí puede referirse a más de un imprimador. El imprimador preferiblemente es de cepa única para una eficiencia máxima en la amplificación, pero alternativamente puede ser de doble cepa. Si es de doble cepa, el imprimador es primero tratado para separar sus cepas antes de usarse para preparar los productos de extensión. Preferiblemente, el imprimador es un oligo de oxiribonucleótido. El imprimador debe ser suficientemente largo para imprimar la síntesis de los productos de extensión en la presencia del agente de inducción. Los imprimadores son aquí seleccionados como siendo "virtualmente complementarios" a las diferentes cepas de cada secuencia específica que va a ser amplificada. Esto significa que los imprimadores deben ser suficientemente complementarios para hibridizarse con sus cepas respectivas. Por tanto, la secuencia de imprimador no requiere reflejar la secuencia exacta del templado. Por ejemplo, un fragmento de nucleótido no complementario puede unirse al extremo 5' del imprimador, con el resto de la secuencia de imprimador siendo complementaria a la cepa.

La hibridización tradicionalmente se entiende como el proceso mediante el cual, bajo condiciones de reacción predeterminadas, dos ácidos nucleicos de cepa única parcial o completamente complementarios se deja que se junten en una forma antiparalela para formar un ácido nucleico de cepa doble con enlaces de hidrógeno estables y específicos.

La presente invención se dirige a un método para detectar la P. aeruginosa en una muestra de fluido. El método usa el PCR para amplificar la por lo menos una secuencia de ácido nucleico en el gen de exotocina A del organismo. El método incluye el tratar las cepas de los fragmentos de nucleótido con un primero y un segundo imprimador de oligonucleótido. La región del gen que está siendo amplificada por el proceso PCR tiene un segmento izquierdo en el extremo 5' del gen, un segmento de núcleo y un segmento derecho en el extremo 3' del gen. El segmento izquiero y los segmentos derechos del gen ETA son virtualmente complementarios al primer imprimador de oligonucleótido y a los segundos imprimadores de oligonucleótido, respectivamente. El segmento de núcleo está compuesto de nucleótidos entre los imprimadores primero y segundo que corresponden a los extremos 5' y 3' del gen ETA.

El ácido nucleico o el ácido que constituye los nucleótidos de núcleo pueden obtenerse de cualesquier fuente, por ejemplo, DNA o RNA clonada o DNA o RNA naturales de bacterias, levadura, viruses u otros organismos tal como de plantas o animales. El proceso PCR está descrito en mayor detalle en las patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Nos. 4,683,202; 4,683,195; y 4,965,188 cuyos contenidos completos de cada una se incorporan aquí y se hacen una parte de lo mismo.

Los imprimadores de oligonucleótido son suficientemente complementarios a el fragmento de nucleótido de gen ETA para hibridizar una región teniendo de desde alrededor de 400 a alrededor de 1200 nucleótidos de pares de base.

Deseablemente, los imprimadores de oligonucleótido- son » suficientemente complementarios para hibridizar de desde alrededor de 400 a alrededor de 800 nucleótidos de pares de base y más deseablemente, los imprimadores de oligonucleótido hibridizan de desde alrededor de 400 a alrededor de 600 nucleótidos de par de base. Los imprimadores de oligonucleótidos se han encontrado que tienen alrededor de 15 nucleótidos a alrededor de 25 nucleótidos cada uno. Los imprimadores de oligonucleótido pueden ser comparados usando métodos muy conocidos en el arte. Por ejemplo, un método para sintetizar los oligonucleótidos sobre un soporte de sólidos modificado está descrito en la patente de los Estados Unidos de Norteamérica No. 4,458,066, cuyos contenidos completos son incorporados aquí y se hacen una parte de lo mismo. También es posible el usar un imprimador el cual sea aislado de una fuente biológica (tal como una codificación de endonucleasa de restricción) .

En una modalidad preferida los imprimadores de oligonucleótido primero y segundo son complementarios e hibridizan en el fragmento dentro de la región de secuencia de gen ETA de 1002 a alrededor de 2200. Preferiblemente, los imprimadores de oligonucleótido primero y segundo complementarios a e hibridizan al fragmento dentro de la región de secuencia de gen ETA de 1002 a alrededor de 1500 y más preferiblemente, son complementarios a e hibridizan al fragmento dentro de la región de secuencia de gen ETA de 1002 a alrededor de 1424. Más preferiblemente el primer imprimador de oligonucleótido incluye la secuencia de nucleótido 5' - ACA ACG CCC TCA GCA TCA CCA - 3' y el segundo imprimador de oligonucleótido incluye la secuencia de nucleótido 5' - CGG GTC GAG CAG GCA CAÁ C - 3' las cuales son complementarias a y se enfilan a las regiones de secuencia de gen ETA de 1002 a 1023 y de 1405 a 1424, respectivamente.

Los siguientes ejemplos se ofrecen por vía de ilustración y no se intenta que limiten la invención en ninguna manera. En estos ejemplos, todos los porcentajes son por peso si son para sólidos y por volumen si son para líquidos. Todas las temperaturas están en grados Celsius a menos que se indique de otra manera.

EJEMPLOS COMPARATIVOS Se llevó a cabo una reacción de cadena polimerasa para amplificar una región de el gen de exotocina A de P. aeruginosa. La secuencia de los imprimadores de izquierda (5') y de derecha (3') fueron secuencia ID número 1 y secuencia ID número 2 respectivamente. Estos imprimadores se conocen en el arte previo respecto del objetivo de apuntar al fragmento de gen ETA en las posiciones 1001-1024 y 1373-1396 respectivamente.

El DNA purificado, usando como templado, fue aislado del cultuvo de P. aeruginosa ATCC 15442 durante la noche en un caldo Luria-Bertaini- a 37°C usando el estuche de aislamiento genómico QIAGEN ("Chatsworth, California) con 20/G columnas. El DNA purificado se volvió a suspender en TE8 (lOmM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8) . La concentración se determinó espectrofotométricamente a una longitud de onda de 260 nm.

La mezcla de reacción PCR se puso a 50 µl por reacción por tubo, ocho tubos (0.2 ml de domo tubos de reacción PCR roscados) . La mezcla de reacción para cada tubo consistió de: 35.75 µl de amortiguador de reacción ddH20, 5 µl 10X estéril (Perkin-Elmer estándar 10X amortiguador: lOOmM Tris-HCl [pH 8.3], 500 mM KCl, 15mM MgCl2, 0.1% de gelatina), 5 µl deoxinucleótido trifosfatos (2.0 mM cada dATP, dTTP, dGTP, y dCTP) l µl de cada imprimador (concentración de suministro 50 µM) , y 0.25 µl (0.5 ® U/µl) polimerasa AmpliTaq (Perkin-Elmer). Iniciando con 200, 000 pg, 2 µl de diluciones en serie de 10 veces de el DNA gendmico purificado se agregaron a cada tubo (200,000 pg al tubo 1, 20,000 pg al tubo 2, etcétera) . El tubo 8 no contuvo DNA, más bien, 2 µl de TE8 estéril se agregó como el "control no templado". Las muestras fueron apretadamente roscadas y colocadas en la termosección cíclica (Perkin-Elmer modelo 2400) sin sobrecapa de aceite (no requerida para el modelo 2400) . Un ciclo pre-PCR se corrió (94° por tres minutos seguido por 68°C por dos minutos) . Cuarenta ciclos PCR regulares se corrieron (72°C por un minuto, 94°C por un minuto, y 68°C por un minuto) , seguido por un final de 72°C por 8 minutos y entonces se mantuvo a 4°C hasta que se cargó sobre el gel. El gel (2% de agarrosa de derretido bajo, 10 x 17 cm, conteniendo 0.5 µg/ml etidiobromuro) se cargó mediante el agregar 25 µl desde cada tubo de la reacción PCR a 5 µl de 6X amortiguador de carga (0.25% azul bromofenol, 0.25% de xileno cianol FF, 30% de glicerol en agua) y los 30 µl completos se cargaron dentro de un pozo (ruta) del gel. La ruta 1 del gel contuvo una carga de 2X de 100-bp DNA escala (Boehringer Mannheim DNA peso molecular estándar XI) . El gel se corrió por 10 minutos a 30 voltios y 90 minutos a 125 voltios. El gel fue entonces fotografiado bajo UV, usando una película de blanco y negro Polaroid 660 instantánea. La fotografía se evaluó visualmente respecto de la presencia de la banda deseada.

Los resultados están tabulados en la Tabla 1 dada abajo. Tabla 1 Tubo Número Cantidad de Templado Amplificación vista DNA en Tufto visualmente sobre el ael 1 200,000 pg + 2 20,000 pg 3 2,000 pg 4 200 pg 5 20 pg 6 2 pg 7 0.2 pg sin control de templado EJEMPLOS El DNA purificado de la P. aeruginosa ATCC 15442 aislada como se discutió arriba se usó en los ejemplos que siguen.

De acuerdo con la presente invención, se llevó a cabo una reacción en cadena de polimerasa de acuerdo a los siguientes procedimientos. Los imprimadores izquierdo (5') y derecho (3') fueron la secuencia ID número 4 y la secuencia ID número 5 respectivamente. Estos implicadores amplificaron una región de par de base 422 de la secuencia de gen ETA (secuencia de identificación número 3) en las posiciones 1002-1023 y 1405-1424 respectivamente.

La mezcla de reacción PCR se puso como una reacción PCR "inicio caliente". Las reacciones PCR de inicio caliente mantienen a los componentes de la mezcla de reacción separados mediante una capa de cera hasta la desnaturalización incial (94°C) en la sección de ciclo térmico. Por tanto, cada tubo de reacción PCR, antes de ir a la sección de ciclo térmica, contiene una "mezcla de reacción superior" y una "mezcla de reacción inferior" separadas por la capa de cera. La reacción general se puso hasta por un volumen de 50 µl total por tubo (0.2 ml domo-tapa tubo de reacción PCR), ocho tubos totales. La mezcla de reacción inferior (abajo de la capa de cera) consistió de (por tubo) : 4.91 µl de ddH20 estéril, 1.25 µl de amortiguador 10X PCR (100 mM Tris-HCl pH 9.2, 35 mM MgCl2, 250 mM KCl), 5 µl de mezcla deoxinucleótido tri-fosfato (2 mM cada uno de dATP, dCTP, dGTP, dTTP) 0.67 µl de imprimador ETA3 (50 µM suministro), y 0.67 µl de imprimador ETA4 (50 µM suministro). Una cama de cera (Perkin-Elmer PCR Gem 50) se colocó en cada tubo y todos los tubos se calentaron a 80°C brevemente para derretir la cera y sellar la capa inferior. La capa superior (colocada sobre la capa inferior) consistió de (por tubo) : 29 µl de ddH20 estéril, 3.75 µl de amortiguador 10X PCR (misma composición que en la capa inferior), 2.5 µl de dimetilsulfóxido, 0.25 µl de polimerasa AmpliTaq (Perkin-Elmer) y 2 µl de la dilución en serie del DNA genómico P. aeruginosa purificado. El DNA se controló como se describió arriba (200,000 pg al tubo 1, 20,000 pg al tubo 2, etcétera) . No se incluyó ningún "templado" de control (tubo 8) el cual contuvo solo el amortiguador TE8 en lugar de la DNA. Las muestras se colocaron en la sección de ciclo térmico (Perkin-Elmer modelo 2400) sin sobrecapa de aceite (no requerida para el modelo 2400) . Un ciclo pre-PCR se corrió (94°C por tres minutos seguido por 65°C por dos minutos) . Cuarenta ciclos PCR regulares se corrieron (72°C por un minuto, 94°C por un minuto, y 65°C por un minuto) , seguido por un final de 72°C por 5 minutos y entonces se mantuvo a 4°C hasta que se cargó sobre el gel. El gel (2% de agarrosa de derretido bajo, 10 x 17 cm, conteniendo 0.5 µg/ml de etidiobromuro) se cargó mediante el agregar 25 µl desde cada tubo de la reacción PCR a 5 µl del amortiguador de carga 6X (0.25% de azul bromofenol, 0.25% de xileno cianol FF, 30% de glicerol en agua) y los 30 µl completos se cargaron dentro de un pozo (ruta) del gel. La ruta 1 del gel contuvo una carga de 2X de 100-bp de DNA escala (Boehringer Mannheim DNA peso molecular estándar XI) . El gel se corrió por 10 minutos a 30 voltios y 90 minutos a 125 voltios. El gel fue entonces fotografiado bajo UV, usando una película de blanco y negro Polaroid 660 instantánea. La fotografía se evaluó visualmente respecto de la presencia de la banda deseada.

Los resultados aparecen en la Tabla 2 dada abajo.

Tabla 2 Tubo Número Cantidad de Templado Amplificación vista DNA en Tubo visualmente sobre el ael 1 200,000 pg + 2 20,000 pg + 3 2,000 pg + 4 200 pg + 5 20 pg + 6 2 pg 7 0.2 pg 8 sin control de templado Comparando los resultados en la Tabla 1 con aquellos de la Tabla 2 se muestra que los imprimadores ETA3 y ETA4 son 10,000 veces más sensibles para detectar la presión de P. aeruginosa. La comparación entre los imprimadores del arte previo y los imprimadores de acuerdo con la invención se hizo mediante el examinar los productos de amplificación sobre un 2% de gel agarrosa, conteniendo el bromuro de etidio de mancha DNA. El gel se examinó bajo luz ultravioleta.

LISTADO DE SECUENCIA (I) INFORMACIÓN GENERAL: (i) SOLICITANTES: Kevin G. Korth, Sarah E. Heathcock, Linda S. Huard (ii) TITULO DE LA INVENCIÓN: MÉTODO PARA DETECTAR PSEUDOMONAS AEUROGINOSA USANDO UNA REACCIÓN DE CADENA DE POLIMERASA. (iii) NUMERO DE SECUENCIAS: 5 (iv) DIRECCIÓN PARA CORRESPONDENCIA: (A) DESTINATARIO: Kimberly-Clark Corporation (B) CALLE: 401 North Lake Street (C) CIUDAD: Neenah (D) ESTADO: Wisconsin (E) PAÍS: Estados Unidos de Norteamérica (F) CÓDIGO POSTAL: 54956 (v) FORMA LEÍBLE DE COMPUTADORA: (A) TIPO MEDIO: Diskette, 3.5 pulgadas, 5 almacenamiento de 800 Kb (B) COMPUTADORA: IBM PC (C) SISTEMA DE OPERACIÓN: Windows DOS (D) PROGRAMA: WORD (vi) DATOS DE SOLICITUD ACTUAL: (A) SOLICITUD NUMERO: (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: (C) CLASIFICACIÓN: (vii) DATOS DE SOLICITUD PREVIA: (A) SOLICITUD NUMERO: U.S. 60/008,697 (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: 15-12-1995 (viii) INFORMACIÓN DE AGENTE/ABOGADO: 20 (A) NOMBRE: Mark L. Davis (B) REGISTRO NUMERO: 34,574 (C) NUMERO DE REFERENCIA/CASO: 12,496 (ix) INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN: 25 (A) TELEFONO: (414) 721-2985 (B) TELEFAX: (414) 721-3129 (C) TELEX: NO APLICABLE (2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NUMERO: 1 (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 24 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CEPA: cepa única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA gendmico (A) DESCRIPCIÓN: imprimadores DNA para iniciar la amplifacidn PCR-mediada de una región del gen exotocin A de Pseudomonas aeruginosa. (iii) HIPOTÉTICO: No (iv) CONTRASENTIDO: No (v) TIPO DE FRAGMENTO: N/A (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Pseudomonas Aeruginosa (B) - CEPA: N/A (información de secuencia recuperada de NCBI GenBank (Institutos Nacionales de Salud) (C) AISLADO INDIVIDUAL : Aislados ambientales (vii ) FUENTE INMEDIATA: (A) BIBLIOTECA : Gendmica (B) CLON: N/A (secuencias están sintetizadas como se requiere) 10 (viii) POSICIÓN EN GENOMA: (A) CROMOSOMA/SEGMENTO: gen P. Aeruginosa Exotocin A, número de acceso GenBank K01397, NCBI secuencia ID: 151215 15 (B) POSICIÓN DE MAPA: 1001-1024 (cepa positiva) (C) UNIDADES: Número nucleótido (ix) CARACTERÍSTICA: Secuencias inician amplificación PCR solo en P. Aeruginosa 20 (A) NOMBRE/CLAVE: ETA1 (B) UBICACIÓN: encontrada dentro de la secuencia publicada de gen P. Aeruginosa exotocin A, número de acceso GenBank K01397, NCBI secuencia ID: 151215 25 ETA1: (cepa positiva) (C) OTRA INFORMACIÓN: Estas secuencias aglutinan a secuencias complementarias dentro del gen P. Aeruginosa exotocin A y actúan como imprimadores para la amplificación PCR-mediada. (x) INFORMACIÓN DE PUBLICACIÓN: (A) AUTORES: Ashraf A. Khan Cari E. Cerniglia 10 (B) TITULO: Detección de Pseudomonas Aeruginosa para muestras clínica y ambiental mediante la amplificación del gen exotocin A usando PCR (C) DIARIO: Microbiología Aplicada y Ambiental 15 (D) VOLUMEN: 60 (E) NUMERO: 10 (F) PAGINAS: 3739-3745 (G) FECHA: 24 de junio de 1994 (H) DOCUMENTO NUMERO: 20 (I) FECHA DE PRESENTACIÓN: (J) FECHA DE PUBLICACIÓN: Octubre de 1994 (K) RESIDUOS RELEVANTES EN LA SECUENCIA ID No: (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SECUENCIA ID NO: 1 25 5' - GAC AAC GCC CTC AGC ATC ACC AGC - 3' (2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NUMERO: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 24 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CEPA: cepa única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA gendmico (A) DESCRIPCIÓN: imprimadores DNA para iniciar la amplifación PCR-mediada de una región del gen exotocin A de Pseudomonas aeruginosa . (iii) HIPOTÉTICO: No (iv) CONTRASENTIDO: No (v) TIPO DE FRAGMENTO: N/A (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Pseudomonas Aeruginosa (B) CEPA: N/A (información de secuencia recuperada de NCBI GenBank (Institutos Nacionales de Salud) (C) AISLADO INDIVIDUAL: Aislados ambientales (vii) FUENTE INMEDIATA: (A) BIBLIOTECA: Genómica (B) CLON: N/A (secuencias están sintetizadas como se requiere) 5 (viii) POSICIÓN EN GENOMA: (A) CROMOSOMA/SEGMENTO: gen P. Aeruginosa Exotocin A, número de acceso GenBank K01397, NCBI secuencia ID: 151215 10 (B) POSICIÓN DE MAPA: 1373-1396 (cepa negativa) (C) UNIDADES: Número nucleótido (ix) CARACTERÍSTICA: Secuencias inician amplificación PCR solo en P. Aeruginosa 15 (A) NOMBRE/CLAVE: ETA2 (B) UBICACIÓN: encontrada dentro de la secuencia publicada de gen P. Aeruginosa exotocin A, número de acceso GenBank K01397, NCBI secuencia ID: 151215 20 ETA2 : (cepa negativa) (D) OTRA INFORMACIÓN: Estas secuencias aglutinan a secuencias complementarias dentro del gen P. Aeruginosa exotocin A y actúan como imprimadores para la amplificación PCR-mediada. (x) INFORMACIÓN DE PUBLICACIÓN: (A) AUTORES : Ashraf A. Khan Cari E. Cerniglia (B) TITULO: Detección de Pseudomonas Aeruginosa para muestras clínica y ambiental mediante la amplificación del gen exotocin A usando PCR (C) DIARIO: Microbiología Aplicada y Ambiental (D) VOLUMEN: 60 (E) NUMERO: 10 (F) PAGINAS: 3739-3745 (G) FECHA: 24 de junio de 1994 (H) DOCUMENTO NUMERO: (I) FECHA DE PRESENTACIÓN: (J) FECHA DE PUBLICACIÓN: Octubre de 1994 (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SECUENCIA ID NO: 2 5' - CGC TGG CCC ATT CGC TCC AGC GCT - 3' (2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NUMERO: 3: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 2751 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CEPA: cepa única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA genómico (A) DESCRIPCIÓN: secuencia DNA para Pseudomonas Aeruginosa Gen Exotocin A 5 (iii) HIPOTÉTICO: No (iv) CONTRASENTIDO: No (v) TIPO DE FRAGMENTO: N/A (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Pseudomonas Aeruginosa (B) CEPA: N/A (información de secuencia 15 recuperada de NCBI GenBank (Institutos Nacionales de Salud) (C) AISLADO INDIVIDUAL: N/A (D) FASE DE DESARROLLO: N/A (E) HAPLOTIPO: N/A 20 (F) TIPO DE TEJIDO: N/A (G) TIPO DE CÉLULA: N/A (H) LINEA DE CÉLULA: N/A (I) ORGANELLE: N/A (vii) FUENTE INMEDIATA: (A) BIBLIOTECA: Genómica (B) CLON: N/A (secuencias están sintetizadas como se requiere) (viii) POSICIÓN EN GENOMA: (A) CROMOSOMA/SEGMENTO: gen P. Aeruginosa Exotocin A, número de acceso GenBank K01397, NCBI secuencia ID: 151215 (B) POSICIÓN DE MAPA: (C) UNIDADES: Número de nucleótido (ix) CARACTERÍSTICA: N/A (A) NOMBRE/CLAVE : (B) UBICACIÓN: encontrada dentro de la secuencia publicada de gen P. Aeruginosa exotocin A, número de acceso GenBank K01397, NCBI secuencia ID: 151215 (D) OTRA INFORMACIÓN: N/A (x) INFORMACIÓN DE PUBLICACIÓN: (A) AUTORES: N/A (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SECUENCIA ID NO: 3: DESDE 1 A 2751 ctgcagctgg tcaggccgtt tccgc acgc ttgaagtcct ggcegatata 1 ccggcagggc cagccatcgt tcgacgaata aagccacctc agccatgatg 51 ccctttccat ccccagcgga accccgacat ggacgccaaa gccctgctcc 101 tcggcagcct ctgcctggcc gccccattcg ccgacgcggc gacgctcgac 151 aatgctctct ccgcctgcct cgccgcccgg ctcggtgcac cgcacacggc 201 ggagggceag ttgcacctgc cactcaccct tgaggcccgg cgctccaccg 251 gcgaatgcgg ctgtacctcg gcgctggtgc gatatcggct gctggccagg 301 ggcgccagcg ccgacagcct cgtgcttcaa ?agggctgct cgatagtcgc 351 caggacacgc cgcgcacgct gaccctggcg gcggacgccg gcttggcgag 401 cggccgcgaa ctggtcgtca ccctgggttg tcaggcgcct gactgacagg 451 ccgggctgcc accaccaggc cgagatggac gccctgcatg tatcctccga 501 tcggcaagcc tcccgttcgc acattcacca ctctgcaatc cagttcataa 551 atcccataaa agccctcttc cgctccccgc cagcctcccc gcatcccgca 601 ccctagacgc cccgccgctc tccgccggct cgcccgacaa gaaaaaccaa 651 ccgctcgatc agcctcatcc ttcacccatc acaggagcca tcgcgatgca 701 ectgataccc cattggatcc ccctggtcgc cagcctcggc ctgctcgccg 751 gcggctcgtc cgcgtccgcc gccgaggaag ccttcgacct ctggaacgaa 801 tgcgccaaag cctgcgtgct cgacctcaag gacggcgtgc gttccagccg 8S1 catgagcgtc gacccggcca tcgccgacac caacggccag ggcgtgctgc actactccat ggtcctggag ggcggcaacg acgcgctcaa gctggccatc gacaacgccc tcagcatcac cagcgacggc ctgaccatcc gcctcgaagg cggcgtcgag ccgaacaagc cggtgcgcta cagctacacg c?ccaggcgc gcggcagttg gtcgctgaac tggctggtac cgatcggcca cgagaagccc tcgaacatca aggtgttcat ccacgaactg aacgccggca accagctcag ccacatgtcg ccgatctaca ccatcgagat gggcgacgag ttgctggcga agctggcgcg cgatgccacc ttcttcgtca gggcgcacga gagcaacgag atgcagccga cgctcgccat cagccatgcc ggggtcagcg tggtcatggc ccagacccag ccgcgccggg aaaagcgctg gagcgaatgg gccagcggca aggtgttgtg cctgctcgac ccgctggacg gggtctacaa ctacctcgcc cagcaacgct gcaacctcga cgatacctgg gaaggcaaga tctaccgggt gctcgccggc aacccggcga agcatgacct ggacatcaaa cccacggtca tcagtcatcg cctgcacttt cccgagggcg gcagcctggc cgcgctgacc gcgcaccagg cttgccacct gccgctggag actttcaccc gtcatcgcca gccgcgcggc tgggaacaac tggagcagtg cggctatccg gtgcagcggc tggtcgccct ctacctggcg gcgcggctgt cgtggaacca ggtcgaccag gtgatccgca acgccctggc cagccccggc agcggcggcg acctgggcga 1751 agcgatccgc gagcagccgg agcaggcccg tctggccctg accctggccg 1801 ccgccgagag cgagcgcttc gtccggcagg gcaccggcaa cgacgaggcc 1851 ggcgcggcca acgccgacgt ggtgagcctg acctgcccgg tcgccgccgg 1901 tgaatgcgc? ggcccggcgg acagcggcga cgccctgctg gagcgcaact 1951 atcccactgg cgcggagttc ctcggcgacg gcggcgacgt cagcttcagc 2001 acccgcggca cgcagaactg gacggtggag cggctgctcc aggcgcaccg 2051 ccaactggag gagcgcggct atgtgttcgt cggctaccac ggcaccttcc 2101 tcgaagcggc gcaaagcatc gtcttcggcg gggtgcgcgc gcgcagccag 2151 gacctcgacg cgatctggcg cggtttctat atcgccggcg atccggcgct 2201 ggcctacggc tacgcccagg accaggaacc cgacgcacgc ggccggatcc 2251 gcaacggtgc cctgctgcgg gtctatgtgc cgcgctcgag cctgccgggc 2301 ttctaccgca ccagcctgac cctggccgc? ccggaggcgg cgggcgaggt 23S1 cgaacggctg atcggccatc cgctgccgct gcgcctggac gccatcaccg 2401 gccccgagga ggaaggcggg cgcctggaga ccattctcgg ctggccgctg 2451 gccgagcgca ccgtggtgat tccctcggcg atccccaccg acccgcgcaa 2501 cgtcggcggc gacctcgacc cgtccagcat ccccgacaag gaacaggcga 2551 tcagcgccct gccggactac gccagccagc ccggcaaacc gccgcgcgag 2601 gacctgaagt aactgccgcg accggccggc tcccttcgca ggagccggcc 2651 ttctcggggc ctggccatac atcaggtttt cctgatgcca gcccaatcga 2701 atatgaattc 2751 (2 ) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NUMERO : 4 (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD : 21 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CEPA: cepa única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA genómico (A) DESCRIPCIÓN: imprimadores DNA para iniciar la amplifación PCR-mediada de una región del gen exotocin A de Pseudomonas aeruginosa. (iii) HIPOTÉTICO: No (iv) CONTRASENTIDO: No (v) TIPO DE FRAGMENTO: N/A (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Pseudomonas Aeruginosa (B) CEPA: N/A (información de secuencia recuperada de NCBI GenBank (Institutos Nacionales de Salud) (vii) FUENTE INMEDIATA: (A) BIBLIOTECA: N/A (las secuencias son sintetizadas como se requiere) (B) CLON: N/A (secuencias están sintetizadas como se requiere) (viii) POSICIÓN EN GENOMA: (A) CROMOSOMA/SEGMENTO: gen P. Aeruginosa Exotocin A, número de acceso GenBank K01397, NCBI secuencia ID: 151215 (B) POSICIÓN DE MAPA: 1002-1023 (cepa positiva) (C) UNIDADES: Número nucleótido (ix) CARACTERÍSTICA: Secuencias inician amplificación PCR solo en P. Aeruginosa (A) NOMBRE/CLAVE: ETA3 (B) UBICACIÓN: encontrada dentro de la secuencia publicada de gen P. Aeruginosa exotocin A, número de acceso GenBank K01397, NCBI secuencia ID: 151215 ETA3: 1002-1023 (cepa positiva) (C) MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: identificado mediante similitud a secuencias conocidas y con la ayuda de el paquete de programa ® Oligo v. 5 para Windows (NBI) . (D) OTRA INFORMACIÓN: Estas secuencias aglutinan a secuencias complementarias dentro del gen P. Aeruginosa exotocin A y actúan como imprimadores para la amplificación PCR-mediada. (x) INFORMACIÓN DE PUBLICACIÓN : NO PUBLICADA (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SECUENCIA ID NO: 4 5' - ACÁ ACG CCC TGA GCA TCA CCA - 3' (3) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NUMERO: 5: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 19 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CEPA: cepa única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA gendmico (A) DESCRIPCIÓN: imprimadores DNA para iniciar la amplifación PCR-mediada de una región del gen exotocin A de Pseudomonas aeruginosa . (iii) HIPOTÉTICO: No (iv) CONTRASENTIDO: No (v) TIPO DE FRAGMENTO: N/A (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Pseudomonas Aeruginosa (B) CEPA: N/A (información de secuencia recuperada de NCBI GenBank (Institutos Nacionales de Salud) (vii) FUENTE INMEDIATA: (A) BIBLIOTECA: N/A (las secuencias son sintetizadas como se requiera) (B) CLON: N/A (secuencias están sintetizadas como se requiere) 10 (viii) POSICIÓN EN GENOMA: (A) CROMOSOMA/SEGMENTO: gen P. Aeruginosa Exotocin A, número de acceso GenBank K01397, NCBI secuencia ID: 151215 15 (B) POSICIÓN DE MAPA: 1405-1424 (cepa negativa) (C) UNIDADES: Número nucleótido (ix) CARACTERÍSTICA: Secuencias terminan para amplificación PCR solo en P. Aeruginosa 20 (A) NOMBRE/CLAVE: ETA4 (B) UBICACIÓN: encontrada dentro de la secuencia publicada de gen P. Aeruginosa exotocin A, número de acceso GenBank K01397, NCBI secuencia ID: 151215 25 (C) MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: identificado por similaridad a secuencias conocidas y con la ayuda del paquete de programa Oligo® para Windows (NBI) (D) OTRA INFORMACIÓN: Estas secuencias aglutinan a secuencias complementarias dentro del gen P. Aeruginosa exotocin A y actúan como imprimadores para la amplificación PCR-mediada. (x) INFORMACIÓN DE PUBLICACIÓN: No publicada aún (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SECUENCIA ID NO: 5 5' - CGG GTC GAG CAG GCA CAÁ C - 3'

Claims (20)

R E I V I ND I CAC I ONE S

1. Un método para detectar la presencia de Pseudomonas Aeruginosa en la muestra de fluido usando un proceso PCR para aumentar la expresión de un segmento de la secuencia de gen exotocin A, dicho método comprende el tratar las cepas de fragmentos de nucleótido con un primero y un segundo imprimador de oligonucleótido que son suficientemente complementarios para hibridizar una región de dichos fragmentos de nucledtido en donde dicha región tiene de desde alrededor de 400 a alrededor de 1200 pares de base.

2. El método, tal y como se reivindica en la cláusula 1, caracterizado porque dicha región tiene de desde 400 pares de base a alrededor de 800 pares de base.

3. El método, tal y como se reivindica en la cláusula 1, caracterizado porque dicha región tiene de desde alrededor de 400 pares de base a alrededor de 600 pares de base.

4. El método, tal y como se reivindica en la cláusula 1, caracterizado porque dicha región de gen que es sintetizada comprende un segmento izquierdo, un segmento de núcleo y un segmento derecho, dicho segmento de núcleo representa por lo menos virtualmente la secuencia de nucleótido de dicha región y dicho primer imprimador y un segundo imprimador representan el nucledtido de secuencia complementaria presente en los extremos 5' y 3' de dicha región, respectivamente.

5. El método, tal y como se reivindica en la cláusula 4, caracterizado porque dichos imprimadores son de desde alrededor de 15 nucleótidos a alrededor de 25 nucledtidos de longitud.

6. El método, tal y como se reivindica en la cláusula 5, caracterizado porque dichos imprimadores hibridizan dicho fragmento dentro de la región de 1002 a alrededor de 2200 del gen P. aeruginosa exotocin A.

7. El método, tal y como se reivindica en la cláusula 5, caracterizado porque dichos imprimadores hibridizan dicho fragmento de nucleótido dentro de la región de 1002 a alrededor de 1500 del gen P. aeruginosa exotocin A.

8. El método, tal y como se reivindica en la cláusula 5, caracterizado porque dichos imprimadores hibridizan dicho fragmento nucleótido dentro de la región de 1002 y 1424 del gen P. aeruginosa exotocin A.

9. El método, tal y como se reivindica en la cláusula 1, caracterizado porque dicho primer imprimador es complementario a la región de 1002 a 1023 de el gen P. aeruginosa exotocin A.

10. El método, tal y como se reivindica en la cláusula 1, caracterizado porque dicho segundo imprimador es complementario a la región de 1405 a 1424 del gen de P. aeruginosa exotocin A.

11. El método, tal y como se reivindica en la cláusula 1, caracterizado porque dicho primer imprimador comprende la secuencia 5' - ACA ACG CCC TCA GCA TCA CCA - 3' y el segundo imprimador comprende la secuencia 5' - CGG GTC GAG CAG GCA CAÁ C - 3 ' .

12. Un método para detectar la presencia de Pseudomonas aeruginosa en una muestra de fluido usando un proceso PCR para aumentar la expresión de un segmento de la secuencia de gen exotocin A, dicho método comprende el tratar las cepas de fragmentos de nucleótido con un primer imprimador de oligonucleótido y un segundo imprimador de oligonucleótido, cada uno de los imprimadores de oligonucleótido teniendo de desde alrededor de 15 nucleótidos a alrededor de 25 nucleótidos, dichos imprimadores siendo suficientemente complementarios para hibridizar una región de dichos fragmentos de nucleótido en donde dicha región tiene de desde alrededor de 400 pares de base a alrededor de 800 pares de base.

13. El método, tal y como se reivindica en la cláusula 12, caracterizado porque dicho primer imprimador de oligonucleótido es complementario a la región de 1002 a alrededor de 1100 y dicho segundo imprimador de oligonucleótido es complementario a la región de 1404 a alrededor de 1500 de el gen P. aeruginosa exotocin A. *

14. El método, tal y como se reivindica en la cláusula 12, caracterizado porque dicho primer imprimador de oligonucleótido es complementario a la región de 1002 a alrededor de 1023 y dicho segundo imprimador de oligonucleótido es complementario a la región de 1404 a alrededor de 1424 de el gen P. aeruginosa exotocin A.

15. El método, tal y como se reivindica en la cláusula 14, caracterizado porque dicho primer imprimador de oligonucleótido comprende la secuencia de 5' - ACA ACG CCC TCA GCA TCA CCA - 3 ' .

16. El método, tal y como se reivindica en la cláusula 14, caracterizado porque dicho segundo imprimador de oligonucleótido comprende la secuencia de 5' - CGG GTC GAG CAG GCA CAÁ C - 3 ' .

17. Un método para detectar la presencia de Pseudomonas aeruginosa en una muestra de fluido usando un proceso PCR para aumentar la expresión de un segmento de la secuencia de gen exotocin A, dicho método comprende el tratar las cepas de fragmentos de nucleótido con un primer y un segundo imprimador de oligonucleótido teniendo de desde alrededor de 15 nucleótidos a alrededor de 25 nucleótidos que son suficientemente complementarios para hibridizar una región de dichos fragmentos de nucleótido en donde dicha región tiene de desde alrededor de 400 a alrededor de 600 pares de base y dichos imprimadores de oligonucleótido primero y segundo hibridizan dicho fragmento de nucleótido dentro de la región de 1002 a alrededor de 1500 del gen P. aeruginosa exotocin A.

18. El método, tal y como se reivindica en la cláusula 17, caracterizado porque dicho primer imprimador es complementario a la región de 1002 a 1023 y dicho segundo imprimador es complementario a la región de 1405 a alrededor de 1424 del gen P. aeruginosa exotocin A.

19. El método, tal y como se reivindica en la cláusula 17, caracterizado porque dicho primer imprimador de oligonucleótido comprende la secuencia 5' - ACA ACG CCC TCA GCA TCA CCA - 3 ' .

20. El método, tal y como se reivindica en la cláusula 17, caracterizado porque dicho segundo imprimador de oligonucleótido comprende la secuencia de 5' - CGG GTC GAG CAG GCA CAÁ C - 3 ' . R E S UM E N La presente invención se refiere a un método para detectar la presencia de P. aeruginosa en una muestra de fluido. El método usa PCR para amplificar la expresión de un segmento de la secuencia de gen exotocin A. El método incluye el tratar cepas de fragmentos de nucleótido con un primer imprimador de oligonucleótido y un segundo imprimador de oligonucleótido. Los imprimadores son suficientemente complementarios al fragmento para hibridizar una región teniendo de desde alrededor de 400 a 1200 pares de base. Deseablemente, el primer imprimador de oligonucledtido incluye la secuencia 5' - ACA ACG CCC TCA GCA TCA CCA - 3' y el segundo imprimador de oligonucleótido incluye la secuencia 5 ' - CGG GTC GAG CAG GCA CAÁ C - 3 ' .