MXPA06015171A - Metodos de diagnostico de la osteoporosis. - Google Patents

Abstract

Se proporcionan metodos para diagnosticar enfermedad osea tal como osteoporosis. Los metodos comprenden detectar cambios en la estructura fisica o quimica de un tejido queratinizado como asociacion de la enfermedad. Los metodos incluyen detectar cambios en la resistencia, modulo o nivel de enlace de azufre, particularmente el nivel de enlace de disulfuro, en una muestra de tejido queratinizado tal como una, pelo o piel. Los cambios en estas variables sirven como marcadores de diagnostico de enfermedades oseas que se asocian con cambios en la elasticidad osea y la densidad osea.

Description

MÉTODOS DE DIAGNOSTICO DE LA OSTEOPOROSIS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona a métodos para diagnosticar osteoporosis detectando cambios físicos y químicos en tejidos queratinizados.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La osteoporosis es una enfermedad caracterizada por una deficiencia del hueso que afecta tanto la matriz de la proteína como la fracción mineral, resultando en una disminución en la resistencia de los huesos a la fractura. El método actual de diagnóstico es por medio de absorciometría de rayos x mediante doble energía (DEXA), la cual proporciona una medida cuantitativa de la cantidad de mineral presente en el hueso y permite la determinación de riesgo de fractura en un sitio medido. Una disminución en la densidad mineral ósea (BMD) como se mide por DEXA es el método actual de diagnosticar osteoporosis y predecir fracturas. Véase por ejemplo, Nevltt y Cummings (1993) J. Am. Geriatr. Soc. 41:1226; y Parfitt (1993) Calcif. Tissue Int. 53:S82. Sin embargo, la falta de correlación perfecta entre la densidad mineral ósea y las fracturas del hueso sugieren que la densidad mineral ósea no es la única causa de huesos frágiles (Ott (1993) Calcif. Tissue Int. 53(Suppl.):S7). De este modo, mientras el grado de mlneralización es el patrón actual por el cual la osteoporosls se diagnostica, éste es incapaz de detectar fragilidad ósea debida a deficiencia en la matriz de la proteína. El hueso es un material compuesto, que comprende fases minerales, orgánicas y acuosas (Katz (1971) J. Biomech. 4:455). La fase mineral, principalmente hldroxiapatita (HA), imparte resistencia a la compresión, mientras el colágeno de fase orgánica imparte flexibilidad. Wang et al. (1998) Bone 23:67 ha demostrado que con el aumento de la edad, se reduce la resistencia a la fractura del hueso y su mlcrodureza se incrementa sin cambios notables en la BMD. McCalden eí al., reportó hallazgos similares, Indicando que incluso sin cambios notables en BMD, la resistencia a la tensión de hueso puede disminuirse con la edad debido a la porosidad Incrementada (McCalden eí al. (1993) J. Bone Joint Surg. 75A:1193). Existe ahora una creencia de que la fase orgánica del hueso juega un papel notable en la osteoporosis. Kovach eí al. han demostrado que cambios en las características estructurales de la red de colágeno detectada al utilizar una técnica de fluorescencia láser se correlaciona notablemente con la resistencia a fractura ósea (Kovach eí al. (1997) Proceedings of the 43th Annual Meeting of the Orthopaedic Research Society, San Francisco, CA, 22:37). Este trabajo se sustenta por otros hallazgos que demuestran que la fase orgánica del hueso es responsable por mucho de su capacidad para resistir la fractura (Wang eí al. (1998) Proceedings of the 44th Annual Meeting of the Orthopaedic Research Society, New Orleans, LA; y Wang eí al. (2002) Bone 31:1). Mansell y Bailey encuentran que el colágeno en el hueso osteoporótico no es normal, sino más bien contiene niveles más elevados de hldroxilación de lisina y reticulación modificada (Mansell y Bailey (2003) Int. J. Biochem. Cell Biol. 35:522). Estos y otros estudios han demostrado que la osteoporosls tiene un efecto degenerativo en la producción de proteínas en huesos con reticulación de colágeno inmaduro incrementada, síntesis y degradación de colágeno incrementado (producción incrementada a pesar de la pérdida total del colágeno), así como mlneralización reducida (Oxiund (1996) Bone 19:479; y Bailey (2002) J. Muscoloskel. Neuron Interact.2:529). La hidroxilación incrementada conduce a la formación de fibrillas más finas con reticulaciones alteradas, y calcificación reducida, la cual contribuye además a la fragilidad del hueso. Un estudio examinó los niveles de calcio y magnesio en el hueso y las uñas (Vecht-Hart eí al. (1995) Clin. Chim. Acta 236:1). No se encontró que había correlación entre los dos. Otra investigación examinó la relación entre las concentraciones minerales en las uñas y el hueso, y los resultados han sugerido que las concentraciones minerales existen entre niveles de zinc y BMD (r = 0.399) y entre la relación de Zn/Ca a BMD (r = 0.421) (Karita y Takano (1994) Nipón Koshu Eisei Zasshi 41:759). No obstante, estos ensayos examinan todo el componente Inorgánico del hueso y las uñas, y no correlacionan cambios en la química o estructura de la proteína que pueden presentarse también en el estado de enfermedad. La densitometría ósea es el patrón de oro actual para el diagnóstico de enfermedades óseas tales como osteoporosls. Sin embargo, este método se limita para medir la masa ósea, y no toma en consideración la microarquitectura del hueso, la organización de cristal, el tamaño y la forma, la conectividad de la red trabecular, y la estructura de las proteínas del hueso. Además, la DEXA es un procedimiento de diagnóstico relativamente caro que expone al paciente a rayos x potencialmente dañinos; de tal manera que no puede utilizarse para selecciones de masa, tales como chequeos de rutina. Por lo tanto, el riesgo clínico al diagnosticar a pacientes con riesgo de fractura debido a enfermedad ósea se desconoce con frecuencia hasta que ocurre la fractura, o debido a que la densidad mineral ósea no se correlaciona siempre con un riesgo de huesos frágiles Incluso cuando se utiliza la DEXA. La alternativa para obtener colágeno de los huesos del paciente es un procedimiento incluso más caro y riesgoso. De este modo, los médicos necesitan nuevos métodos de riesgo bajo para diagnosticar a pacientes que están en un riesgo incrementado de fractura de hueso.

ARTE PREVIO Se proporcionan métodos útiles en el diagnóstico y el pronóstico de trastornos relacionados con los huesos tales como osteoporosls. Los métodos comprenden medir cambios físicos y químicos de tejido queratinizado como marcadores para la presencia de enfermedad ósea en un sujeto. Los métodos son especialmente útiles para detectar osteoporosis y monitorear el progreso de la enfermedad ósea. Los métodos descritos en la presente pueden utilizarse también para pronosticar ensayos antes de, durante, y después de la terapia de la enfermedad. Los ensayos de pronóstico descritos son también útiles para identificar sujetos como candidatos para varios medios preferidos de intervención terapéutica. Los métodos de la presente invención comprenden detectar cambios físicos y químicos de tejido queratinizado que son predictivos de la presencia de una enfermedad ósea que se asocia con un cambio en la elasticidad ósea o densidad ósea. Los cambios físicos y químicos incluyen una reducción en la resistencia del tejido queratinlzado, una reducción en el módulo de un tejido queratinizado, o una reducción en el nivel de unión de azufre en un tejido queratinizado. Los métodos que detectan cambios en la resistencia y módulo del tejido queratinizado incluyen medir la presión de nanoindentación y la deformación de un tejido queratlnizado tal como uña, pelo o piel. Los métodos para detectar cambios en el nivel de unión de azufre en tejido queratinizado incluyen análisis espectral tal como espectroscopia Raman para identificar la abundancia relativa de enlaces de disulfuro y enlaces de sulfuro de carbono en un tejido queratinizado tal como uña, pelo o piel. Las ventajas para examinar un tejido queratinizado tal como uña, pelo o piel se basa en la capacidad para evaluar propiedades diferentes de aquellas medidas por densitometría ósea estándar, la facilidad de acceso a tales muestras, y el rápido crecimiento de tejido queratinizado, el cual permite cambios que se monitorean en una base más frecuente.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 muestra una vista esquemática de una uña de la mano humana. Se tomaron fragmentos de uñas utilizados en el Ejemplo 1 descritos en la presente a partir del extremo libre de la placa de la uña, en donde A = próximo, B = extremo libre de la placa de la uña, C = uña lateral, D = lúnula y E = cutícula. La Figura 2 muestra una representación esquemática de una curva de nanoindentación típica que comprende cargar fases (a-b) y descargar (b-c-d), en donde: De = profundidad, Un =descarga y Lo = carga, La Figura 3 muestra un espectro Raman típico de la uña humana de 300 cm"1-1800 cm"1, en donde In = intensidad y Wa = número de ondas. La Figura 4 muestra dos espectros Raman, uno de un individuo no osteoporótico (sano) (superior) y uno de un individuo osteoporótico (fondo), en donde In = intensidad, Wa = número de ondas, He = sano y Os = osteoporótico. La Figura 5 representa la puntuación T como una función de la edad y clasificación de prueba de calidad ósea basada en el ancho de la máxima media (WHM) para el pico S-S desde el espectro Raman para pacientes en el ensayo clínico ciego referido en el Ejemplo 2, en donde Ag = Edad (años) La Figura 6 representa historia por riesgo de fractura como una función de edad y clasificación de prueba de calidad ósea en WHM para el pico S-S a partir del espectro Raman para mujeres sanas y en riesgo, en donde Ag = Edad, F = Clasificación de Calidad ósea y G = Historia de Fractura. La Figura 7 describe los componentes del aparato de espectroscopia Raman para uso en obtener espectro Raman de muestras de tejido queratinizado tales como uñas ya sea in situ o como fragmentos de uñas para un sujeto que experimenta la prueba de una enfermedad ósea tal como osteoporosis, en donde I = fuente de luz láser, II = Sistema de Suministro de Luz, lll = Sistema Espectralmente Selectivo, IV = Sistema de Detección de Luz, V = Sistema de Cuantificación, VI = Sistema de Despliegue, Vil = Uña de la mano DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se dirige a métodos para el diagnóstico y pronóstico de enfermedad ósea en un sujeto, en donde la enfermedad se asocia con un cambio en la elasticidad ósea o densidad ósea. Los métodos se basan en la detección de cambios físicos y químicos en tejido queratinizado como marcadores para la presencia de la enfermedad ósea de Interés en un sujeto. Sin unirse por ningún mecanismo o teoría de acción, se ha encontrado que los cambios físicos y químicos dentro de un tejido queratinizado se correlacionan a la presencia o ausencia de la enfermedad ósea que se asocia con cambios en la elasticidad ósea o densidad ósea, tales como osteoporosis. Por "enfermedad ósea que se asocia con cambios en la elasticidad ósea o densidad ósea", se pretende para significar cualquier enfermedad en donde el riesgo de fractura ósea se incrementa debido a los cambios estructurales y químicos en el hueso. Ejemplos de tales enfermedades incluyen, pero no se limitan a osteoporosis, osteogénesis imperfecta, enfermedad de Pager, y similares. Estos cambios estructurales y químicos en el hueso son medibles por cualesquiera medios conocidos en la técnica incluyendo, pero sin limitarse a la medición de densidad mineral ósea (BMD) y biopsia ósea. Los cambios estructurales y químicos en el hueso se correlacionan a cambios en el nivel de enlace de azufre de un tejido queratinizado o cambios en la resistencia o módulo de tal tejido queratinizado. El término "tejido queratinizado" se pretende para significar cualquier muestra biológica que comprende la queratina de proteína, más particularmente queratina dura. El tejido queratinizado incluye uña (uñas de la mano y uñas de los pies) pelo, piel (es decir, epidermis) y similares. Las mediciones en las muestras de tejido queratinizado pueden hacerse in situ (por ejemplo, mediciones hechas en la muestra de uña, pelo o piel fija, incluyendo, pero sin limitarse a piel en la mano, pie, brazo, pierna, torso o cara) o recolectando la muestra de tejido queratinizado (por ejemplo, como uñas desprendidas (también referidas como fragmentos de uñas), pelo desprendido, piel desprendida (es decir, corteza o raspaduras epidérmicas)) para medición en un tiempo subsecuente. La seguridad para obtener muestras de tejido queratinizado tales como uña, pelo o piel, acopladas con su poder de diagnostico independiente de la densidad mineral ósea y la biopsia ósea hace de los ensayos de diagnóstico con base en tejido queratlnizado una nueva herramienta clínica útil. Los métodos de la presente Invención comprenden generalmente detectar cambios en la estructura física o química de la muestra de tejido queratinizado y se correlaciona un cambio (o falta de cambio) con un diagnóstico de la enfermedad ósea. En algunas modalidades, los cambios en la estructura física o química de una muestra de tejido queratinizado se utilizan para evaluar si el sujeto tiene osteoporosis u otra enfermedad ósea que se asocia con cambios en la elasticidad ósea o la densidad ósea y, de este modo está en un riesgo Incrementado de fracturas óseas. En otras modalidades, los cambios en estructura física o química de una muestra de tejido queratinizado se utilizan para evaluar el pronóstico de un sujeto con osteoporosis u otra enfermedad ósea que se asocia con cambios en elasticidad ósea o densidad ósea. Debido a que la presencia o ausencia de la densidad mineral ósea reducida no está en correlación perfecta con el riesgo de fractura ósea, pueden utilizarse cambios en la estructura física o química de tejido queratinizado para evaluar factores de riesgo adicionales tales como los que se correlacionan al probable progreso de la enfermedad y el pronóstico de un sujeto con riesgo incrementado de fractura. Marcadores físicos y químicos de interés incluyen cambios en la resistencia o módulo de tejido queratinizado o cambios en el nivel de enlace de azufre dentro del tejido queratinizado. Los métodos para detectar cambios en la resistencia o módulo de un tejido queratinlzado son bien conocidos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a nanoindentación y microscopía de fuerza atómica. Los métodos para detectar cambios en el nivel de enlace de azufre dentro de un tejido queratinizado son bien conocidos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a espectroscopia Raman, espectroscopia de resonancia magnética nuclear, espectroscopia infrarroja transformada de Fourier (FT-IR), técnicas quiro-ópticas, espectroscopia de masa, cromatografía, reacción con otros químicos tales como reactivo de Elman, y similares. Véase por ejemplo, Walker (2002) The Protein Protocols Handbook (Humana Press, Totowa). Aquellos expertos en la técnica reconocen que el poder de diagnóstico de las variables descritas en la presente no se limita a un método particular de detección de la variable o cambios de los mismos.

Las moléculas de queratina son helicoidales y fibrosas. Éstas forman filamentos intermediarios que se tuercen alrededor uno al otro que forman hebras. La queratina contiene un porcentaje elevado de aminoácidos que contienen azufre, en mayor grado cisteína. Estas cisteínas forman puentes disulfuro entre las moléculas Individuales. Los puentes reticulan diversas estructuras de queratina secundarias, terciarias y cuaternarias y por consiguiente ayuden a mantener la rigidez estructural de tejido queratinizado. La queratina "dura", tal como aquella en el pelo, uñas y piel (particularmente la capa epidérmica) tiene una cantidad mayor de rigidez estructural debido a más enlaces de disulfuro. Como se describe en la presente, los cambios en la resistencia, módulo o nivel de enlace de azufre de un tejido queratinizado se correlacionan a enfermedad ósea. Por lo tanto, los cambios en estas propiedades físicas y químicas de tejido queratinizado pueden utilizarse como marcadores de diagnóstico para enfermedades óseas que se asocian con cambios en elasticidad ósea y densidad ósea. En una modalidad de la invención, se utiliza un cambio en la resistencia de un tejido queratinizado para diagnosticar a un paciente con enfermedad ósea. En otras modalidades, se utiliza un cambio en el módulo de un tejido queratinizado para diagnosticar enfermedad ósea. En aún otras modalidades, un cambio en el nivel de enlace de azufre en un tejido queratinizado se utiliza para diagnosticar enfermedad osea. Se miden el módulo y la resistencia de la fragilidad de un tejido queratinizado, por ejemplo, uñas, pelo o piel. Por "módulo" se pretende rigidez o resistencia de una muestra de tejido queratinizado a deformación. Por "resistencia" se pretende el grado al cual la muestra de tejido queratinizado es resistente a presión. Por "nivel de enlace de azufre" se pretende el grado de la reducción (o, recíprocamente oxidación) de aminoácidos que contienen azufre tales como cisteína y metionina, más específicamente el grado al cual las proteínas forman puentes disulfuro o enlaces de azufre de carbono. La presencia, ausencia o grado de cambio en la resistencia, módulo o nivel de enlace de azufre de una muestra de tejido queratinizado, tal como uñas, pelo o piel pueden correlacionarse a la presencia, ausencia o grado de enfermedad ósea que utiliza métodos estándares en la técnica. Véase por ejemplo, Zhou eí al. (2002) Statistical Methods in Diagnostic Medicine (Wiley, New York). En una modalidad, la resistencia de un tejido queratinizado tal como uñas, pelo o piel proporciona un criterio de diagnóstico para fragilidad ósea y osteoporosis. En otra modalidad, el módulo de un tejido queratinizado tal como uñas, pelo o piel proporciona un criterio de diagnóstico para fragilidad ósea y osteoporosis. En otras modalidades, el nivel de enlace de azufre dentro de un tejido queratinizado tal como uñas, pelo o piel proporciona un criterio de diagnóstico para fragilidad ósea y osteoporosis. En modalidades adicionales, la resistencia, el módulo o el nivel de enlace de azufre en un tejido queratinizado tal como uñas, pelo o piel se utiliza en combinación con otros criterios de diagnóstico previamente conocidos en la técnica tales como pruebas de densidad mineral ósea (por ejemplo, barridos DEXA) y otros ensayos clínicos previamente conocidos se correlacionan a la enfermedad. Como se observa previamente, las mediciones en las muestras de tejido queratinizado pueden hacerse in situ (por ejemplo, mediciones hechas en la muestra de uña, pelo o piel fija) o recolectando la muestra de tejido queratinizado (por ejemplo, como uñas desprendidas (también referidas como fragmentos de uñas), pelo desprendido, piel desprendida (es decir, cortezas epidérmicas o raspaduras)) para medición en un tiempo subsecuente. En una modalidad, la resistencia o módulo de una muestra de tejido queratinlzado se mide por un método llamado "nanoindentación" utilizando una máquina previamente descrita por Arteaga eí al. (1993) Tribology lnt'1 26:305. En este método, se aplica fuerza a una muestra de tejido queratinizado y se mide la resistencia. En tal modalidad, la muestra de tejido queratinizado es uñas (uñas de la mano o uñas de los pies), ya sea fijas (es decir, medición realizada in situ) o desprendidas. Cuando fragmentos de uñas van a medirse, los fragmentos de uñas se recolectan a partir del extremo libre de la placa de uña como se muestra en la Figura 1. Después de la recolección, se utiliza nanoindentación para detectar la resistencia o módulo de los fragmentos de uñas. De preferencia, los fragmentos de uñas se someten a nanoindentación en el lapso de 1 día o en un mes de recolección, más preferiblemente en el lapso de 1 día a tres semanas de recolección. En algunas modalidades, los fragmentos de uñas se someten a nanoindentación en el lapso de 1 día a dos semanas de recolección, en otras modalidades, los fragmentos de uñas se someten a nanoindentación en el lapso de 1 día a una semana, de preferencia en el lapso de 1 día a 3 días de recolección. Cuando los fragmentos de uñas van a almacenarse para futuro análisis, éstos se recolectan y almacenan en vasijas cerradas que minimizan cambios en hidratación después de la recolección de fragmentos de uñas. Después de la recolección de los fragmentos de uñas, los fragmentos se someten a nanoindentación para evaluar resistencia y módulo de este tejido queratinizado. Más específicamente, se toman lecturas de ciclo de presión y liberación del desplazamiento del dentador d y la carga P, permitiendo la examinación de datos de penetración de fuerza durante las fases de carga y descarga. Una carga que mide la profundidad de penetración a cada nivel de fuerza durante las fases de carga y descarga pueden generarse entonces. De esta manera, el módulo puede definirse como la sección lineal de la curva sin carga de nanoindentación (b-c en la Figura 2).

En algunas modalidades, la resistencia H, se define como H= E (Fórmula 1 ) en donde P es la fuerza aplicada al dentador y A es el área proyectada del contacto. En nanoindentación, el área proyectada de contacto se calcula a partir de la geometría del dentador y la profundidad medida de penetración en contacto con el dentador h, utilizando la máquina descrita por Arteaga eí al. (1993) Tribology Int'l. 26:305, en donde A= kh' (Fórmula 2) y en donde k es una constante dependiente en la geometría y el tipo de dentador utilizado. En algunas modalidades, el dentador es una pirámide de diamante trigonal con una sección cruzada triangular equilateral y un ángulo de 90° entre cada frente y el extremo opuesto (la esquina de un cubo). Para este dentador k = 2.6. Al sustituir (Figura 2) en (Fórmula 1) da: P H= (Fórmula 3) 2.6 • dD2 Aunque el dentador se mueve en el material, la carga P tiene que proporcionar el campo de tensión el cual es necesario para asegurar el flujo plástico de material fuera de la ¡ndentación así como la presión estática igual a la resistencia. Debido a esto, la curva de resistencia dinámica como una función de profundidad derivada de (Fórmula 1) tiene usualmente un valor muy elevado a profundidades pequeñas en donde la velocidad de conformación, la cual es proporcional a 1/d dd/dt, es mayor. En algunas modalidades, un número de resistencia simple se cita a partir de los resultados y éste se toma como la fuerza máxima aplicada en donde la velocidad de conformación es un mínimo. Aunque la discusión anterior de nanoindentación se dirige a fragmentos de uñas, la metodología es también aplicable a uñas fijas, así como a otros tejidos queratlnizados incluyendo pelo y piel, los cuales pueden medirse in situ o en muestras de tejido recolectado que se manejan en una manera similar a aquella descrita anteriormente para fragmentos de uñas. De esta manera, se recolecta tejido queratinizado, por ejemplo, pelo desprendido o tejido de piel desprendido, y la muestra de tejido recolectado se somete a nanoindentación en el lapso de 1 día a un mes de recolección, más preferiblemente en el lapso de 1 día a tres semanas de recolección. En algunas modalidades, el tejido queratinizado se recolecta y la muestra de tejido recolectada se somete a nanoindentación en el lapso de 1 día a dos semanas de recolección; en otras modalidades, el tejido queratinizado en el lapso de 1 día a una semana, de preferencia en el lapso de 1 día a 3 días de recolección. Como se observa previamente en lo anterior para fragmentos de uñas, en donde el tejido queratinizado va a almacenarse para futuro análisis, las muestras de tejido se recolectan y se almacenan en vasijas selladas para minimizar cambios en hidratación después de recolección de tejido. En otra modalidad, el nivel de enlace de azufre dentro de un tejido queratinizado tal como uñas, pelo o piel se mide, ya sea in situ o después de la recolección de la muestra de tejido queratinizado. De interés particular es el grado de formación de puentes disulfuro entre las moléculas de cisteína en el tejido queratinizado. El grado de reticulación de cisteína mediante tioles oxidados (también conocidos como la formación de cisteína) se correlaciona con la resistencia o módulo de tejido queratinizado como se describe supra. En tal modalidad, el grado de formación de puentes disulfuro se mide por medios de análisis espectral, por ejemplo, utilizando espectroscopia Raman, espectrometría de resonancia magnética nuclear, espectroscopia FT-IR , técnicas quiro-ópticas, espectroscopia de masa, cromatografía, reacción con otros químicos tales como reactivo de Elman, y similares. La espectroscopia Raman es una herramienta ampliamente utilizada para análisis cualitativo y cuantitativo de materiales. Ésta se basa en el cambio espectral que ocurre cuando se proyecta luz sobre un material que se prueba y luego se desvía de la superficie del material. En la espectroscopia Raman de láser, la luz láser monocromática que se desvía o dispersa la superficie del material de prueba se detecta por un sistema de detección sensible. La mayoría de la luz desviada de la superficie se dispersa elásticamente a la misma longitud de ondas como la fuente de luz original en un proceso conocido como dispersión de Rayleigh. El resto de la luz desviada se dispersa no elásticamente en una longitud de ondas que difiere de la fuente de luz original en un proceso conocido como dispersión Raman. Los dos tipos de luz diseminada se separan entre sí utilizando cualquier sistema de selección de longitud de ondas, tal como prismas, filtros o mallas ópticas. El espectro Raman resultante puede utilizarse para identificar y cuantificar concentraciones de varias sustancias dentro del material de prueba de interés. Se puede utilizar la dispersión Raman detectada a partir de una muestra de tejido queratinizado para identificar individuos que tienen o están en riesgo de desarrollar una enfermedad ósea tal como osteoporosis. De esta manera, una muestra de tejido queratinizado, tal como una uña (es decir, uña de la mano o uña del pie), pelo o piel (medida in situ o en una muestra de tejido recolectada como se muestra anteriormente) se irradia por una fuente de luz tal como un láser, y luego el número en onda e intensidad de la luz no elásticamente diseminada se mide. En una modalidad, la muestra de tejido queratinizado es uña. El espectro Raman de uñas humanas se conoce (Katar y Edwards (1997) Spectrochimica Acta A53:81, y Edwards eí al. 81998) Spectrochimica Acta A54:745). El espectro Raman refleja las disposiciones de enlace en la construcción molecular de un tejido queratinizado tal como uña, pelo o piel. Aunque el espectro Raman puede cubrir entre 300 cm'1 y 1800 cm"1, picos particulares en este espectro corresponden a estructuras químicas específicas de interés a los métodos de la presente invención. Para enlace de azufre, el área de interés está en general entre 400 cm"1 y 700 cm"1. Por ejemplo, en uñas humanas, tres picos corresponden a enlaces de azufre presentes en queratina, la proteína más abundante en uñas, específicamente el enlace de disulfuro (S-S, confirmación gauche-gauche-gauche) a 510 cm"1 y el enlace de sulfuro de carbono (C-S) a aproximadamente 621 cm"1 y 643 cm"1. Este espectro Raman puede utilizarse solo o en combinación para indicar el grado al cual la cisteína se oxidiza para formar puentes de disulfuro en una muestra de tejido queratinizada. De este modo, en algunas modalidades, se conducen mediciones de espectros Raman en uñas (es decir, uñas de la mano o uñas del pie) in situ o en fragmentos de uñas. Cualquier aparato de espectroscopia Raman conocido en la técnica puede utilizarse para analizar las uñas. Véase por ejemplo, el aparato de espectroscopia Raman no invasivo para mediciones in situ de niveles de carotenoides en tejidos vivos descritos en las Patentes Norteamericanas Nos. 5,873,831 y 6,205,354, en la presente se incorporan para referencia en su totalidad, y una modificación de este aparato como se describe en el Ejemplo 3 en la presente posteriormente. Tal aparato específicamente diseñado para medición no invasiva de niveles de enlace de sulfuro en una muestra de tejido queratinizado tal como uñas, particularmente el nivel de enlace de disulfuro que corresponde al pico que aparece en 510 cm"1 del espectro Raman, comprende los siguientes componentes: (1) un medio para generar luz dentro de una longitud de onda dando un respuesta Raman con un cambio de longitud de onda para el enlace de disulfuro que se detecta; (2) un medio de suministro para dirigir esta luz sobre la uña de la mano, en donde esta luz tiene una intensidad que no daña la uña de la mano y no altera los niveles de enlace de disulfuro; (3) un medio de recolección para recolectar luz esparcida desde la uña de la mano; (4) medio espectralmente selectivo para seleccionar luz alternada Raman a partir de la luz diseminada recolectada por este medio de recolección, (5) medio de detección para barrido y medición de la luz alternada Raman en frecuencias características de enlaces de disulfuro; y (6) cuantificar medios para determinar la intensidad de señal Raman para los enlaces de disulfuro. Ya que el cambio Raman es independiente de la longitud de onda de luz Incidente utilizada, cualquier fuente de luz fuerte y bastante monocromática puede utilizarse en esta técnica. De este modo, por ejemplo, el medio para generar luz puede ser una fuente de luz láser; alternativamente, otros medios incluyen, pero no se limitan a fuentes de luz que generan luz monocromática, y cualquier otro sistema de proyección de luz. Varios medios de suministro y medios de recolección pueden utilizarse, incluyendo por ejemplo, compuestos ópticos para dirigir un haz de luz a partir de la fuente de luz a la uña que se mide, ya sea in situ o como un fragmento de uñas y para recolección de luz diseminada. La luz dispersa recolectada puede seleccionarse espectralmente, por ejemplo, utilizando un espectrómetro Raman que separa la luz diseminada Raman a partir de luz diseminada Rayleigh. De este modo, el sistema espectralmente selectivo puede comprender varios componentes ópticos, incluyendo, pero sin limitarse a, prismas, monocromadores de malla y filtros tales como filtros holográficos, filtros dieléctricos, filtros acusto-ópticos, combinaciones de los mismos y similares. El sistema de detección de luz es capaz de medir la intensidad de luz diseminada Raman como una función de frecuencia en el rango de frecuencia de interés, es decir, a 510 cm'1 para detectar el nivel de enlace de disulfuro en la muestra de uña. Los componentes dentro del sistema de detección de luz Incluyen, pero no se limitan a, un aparato fotomultiplicador, fotodiodos, dispositivos tales como disposición detectora del dispositivo acoplado de carga (CCD), disposición de detector de CCD intensificado y similares. De preferencia, la luz detectada por el sistema de detección de luz se convierte en una señal que puede desplegarse visualmente, por ejemplo, en un monitor de computadora o similares, o se convierte en otros formatos digitales o numéricos. Las intensidades de señal Raman resultantes se analizan de preferencia a través de un medio cuantitativo tal como un sistema cuantitativo, el cual puede calibrarse, por ejemplo, por comparación con espectros obtenidos de otras muestras de interés u otros picos en la misma muestra. En algunas modalidades, el sistema cuantitativo es una computadora que comprende software de adquisición de datos espectrales instalados de manera que el análisis espectral puede manipularse, por ejemplo, para remover ruido de fondo y similares. Para detalles adicionales en componentes ejemplares que pueden incluirse en un aparato de espectroscopia Raman para mediciones de nivel de enlace de azufre, particularmente enlace de disulfuro, en muestras de tejido queratinizado in situ, véase Patentes Norteamericanas Nos. 5,873,831 y 6,205,354, incorporadas en la presente para referencia en su totalidad. En otra modalidad, FT-IR (infrarrojo transformado de Fourier) se utiliza para medir el nivel de enlace de azufre en una muestra de tejido queratinizado tal como uña, pelo o piel, en donde el tejido queratinizado se mide in situ o en una muestra de tejido queratinizado recolectado. Aquellos expertos en la técnica reconocen que el Infrarrojo cubre una región ligeramente diferente del espectro que la espectroscopia Raman. Sin embargo, métodos para configurar el aparato FT-IR para cubrir esta área del espectro son bien conocidos en la técnica. Se conocen varias formas para interpretar datos espectrales en la técnica y son de este modo adecuado para métodos de diagnóstico descritos en la presente. De este modo, por ejemplo, datos obtenidos a partir de espectrometría Raman puede analizarse para diferencias entre control contra muestras biológicas de prueba en cualquier pico espectral dado de interés, por ejemplo, el pico a 510 cm"1 que corresponde a enlaces de disulfuro (S-S, confirmación gauche-gauche-gauche) y los picos a aproximadamente 621 cm"1 y 643 cm"1 que corresponde a enlaces de sulfuro de carbono (C-S). En cualquier pico espectral dado, la diferencia entre un control y la muestra biológica de prueba puede analizarse con base en una comparación del ancho de la altura máxima media del pico, la altura pico relativa, la integración de área (es decir, área bajo el pico), combinaciones de los mismos, y similares. En algunas modalidades, los ensayos de diagnóstico descritos en la presente se basan en comparación del ancho en la altura máxima media (WHM) del pico espectral Raman que corresponde a enlaces de disulfuro de un tejido queratinizado tal como uña, pelo o piel (es decir, el pico a aproximadamente 510 cm"1). Sin embargo, se reconoce que cualquier metodología puede utilizarse para comparar diferencias en espectros Raman obtenidos de muestras de tejido queratinizado, por ejemplo, diferencias que ocurren en el pico espectral que aparecen a aproximadamente 510 cm"1. Aquellos expertos en la técnica reconocen que ensayos de diagnóstico pueden describirse en términos de precisión. El término "precisión" se pretende para significar el número total de resultados de una prueba dada dividida por el número de resultados incorrectos. Los resultados incorrectos son una función de tasa de error presente en el ensayo e incluyen, pero no se limitan a error de medición, error de usuario, error de denuncia, y similares. Los ensayos de diagnóstico pueden describirse además en términos de valores positivos falsos y negativos falsos. Los valores positivos falsos y negativos falsos se generan al comparar los resultados de un ensayo contra un patrón de oro. Por el término "patrón de oro" se pretende un patrón de referencia que es improbable que sea Incorrecto o se ha utilizado tradicionalmente para definir la enfermedad, tal como densidad mineral ósea para osteoporosis. Los valores positivos falsos y negativos falsos afectan la sensibilidad y la especificidad de un ensayo. La sensibilidad de una prueba es la probabilidad que producirá un resultado positivo real cuando se utiliza en una población enferma (cuando se compara a una referencia o "patrón de oro"). La sensibilidad de una prueba de diagnostico se calcula como: (el número de resultados positivos verdaderos)/(el número de resultados positivos verdaderos + el número de resultados negativos falsos). La especificidad de una prueba es la probabilidad de que una prueba producirá un resultado negativo verdadero cuando se utiliza en una población no enferma (como se determina por una referencia o "patrón de oro"). La especificidad de una prueba se calcula como: (el número de resultados negativos verdaderos)/(el número de resultados negativos verdaderos + el número de resultados positivos falsos). La sensibilidad y especificidad de una prueba de diagnóstico indica posibles usos dentro de una población particular. Por ejemplo, son útiles las pruebas de sensibilidad elevada al seleccionar poblaciones en donde la enfermedad que se diagnostica es relativamente seria y el tratamiento es relativamente barato y fácilmente disponible debido a que el costo de un fracaso para detectar a un paciente enfermo es elevado (negativo falso) y el costo para tratar a un paciente no enfermo es bajo (positivo falso). Alternativamente, son útiles las pruebas de especificidad elevada al seleccionar poblaciones en donde la enfermedad no es seria y el tratamiento es relativamente caro debido a los pocos pacientes enfermos no diagnosticados (negativos falsos) dentro de la población que no sufrirá en mayor medida cuando se compara al tratamiento no necesario de muchos pacientes no enfermos (positivos falsos). Es rutina dentro de la técnica ajustar la especificidad y sensibilidad de ensayos o utilizar ensayos variantes con sensibilidad y especificidad diferente para seleccionar poblaciones específicas. La sensibilidad de los métodos descritos para la detección de una enfermedad ósea tal como osteoporosis es al menos aproximadamente 70%, de preferencia al menos aproximadamente 75%, 80%, 85%, más preferiblemente al menos aproximadamente 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% o más, dependiendo del método de diagnóstico utilizado. Además, la especificidad de los presentes métodos para la detección es al menos aproximadamente 50%, de preferencia al menos aproximadamente 60%, 70%, 75%, 80%, más preferiblemente al menos aproximadamente 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% o más, dependiendo del método de diagnóstico utilizado. Las mediciones de resistencia, módulo o nivel de enlace de azufre en una muestra de tejido queratinizado encuentra uso al seleccionar cualquier población con necesidad de valores negativo falso y positivo falso de estos ensayos. También, aquellos expertos en la técnica reconocen que las medidas estadísticas tales como precisión, especificidad y sensibilidad son igualmente aplicables a variables continuas así como nominales. De este modo, el método de diagnóstico descrito en la presente puede utilizarse para evaluar no sólo la presencia o ausencia de la enfermedad (es decir, variable nominal), sino también el grado o severidad de enfermedad (es decir, variable continua). Aquellos expertos en la técnica reconocerán que los resultados de los ensayos de diagnóstico individuales descritos en la presente pueden combinarse con otros ensayos previamente conocidos en la técnica para refinar además la precisión, especificidad y sensibilidad del diagnóstico. De este modo, los ensayos descritos en la presente pueden utilizarse junto con tales otros indicadores tales como presentación clínica, disminución en la densidad mineral ósea, evidencia radiográfica de osteopenia o deformidad vertebral, pérdida de peso, cifosis torácica, fractura previa por fragilidad, terapia prolongada por corticoesteroides, menopausia prematura, amenorrea secundaria prolongada, hipogonadismo primario, trastornos crónicos asociados con osteoporosis (por ejemplo, anorexia nerviosa, síndromes de mala absorción), historia materna de fractura de cadera, prevalencia de suero de C-telopéptido de colágeno del tipo I, variables ultrasónicas calcáneas bajas (BÚA y SOS), índice de masa corporal bajo y similares. Aquellos expertos en la técnica reconocerán que los ensayos de diagnóstico descritos en la presente pueden utilizarse de forma rutinaria para ensayos de pronóstico. Específicamente, los resultados de un ensayo de diagnóstico (por ejemplo cambios en resistencia, módulo o nivel de enlace de azufre en una muestra de tejido queratinizado) puede correlacionarse a otra variable (o combinación de variables) de interés, tales como el tiempo promedio antes de muerte, la velocidad de recuperación, la velocidad de reincidencia, la velocidad del progreso, la severidad de la enfermedad, la velocidad de respuesta al tratamiento, diagnósticos moleculares, y similares, para predecir un resultado clínico. Tanto datos históricos como contemporáneos en pacientes están rutinariamente disponibles. Estos datos pueden correlacionarse positiva o negativamente con cambios en resistencia, módulo o nivel de enlace de azufre de una muestra de tejido queratinizado. Las relaciones estadísticas entre los resultados del ensayo de diagnóstico y un resultado conocido son útiles para generar un coeficiente de correlación, el cual indica la magnitud de una correlación cuando se compara a una asociación aleatoria entre las variables. Véase por ejemplo, Zhou eí al. (2002) Statistical Methods in Diagnostic Medicine (Wiley, New York). Otros métodos para correlacionar relaciones se conocen en la técnica y estos métodos pueden encontrar uso en los métodos descritos en la presente. En algunas modalidades, los ensayos de pronóstico descritos en la presente se utilizan para estratificar pacientes con osteoporosis con riesgo incrementado de fractura de hueso. El término "estratificar" se pretende para significar que un grupo que comparte una característica común, tal como que tiene osteoporosis, se subdivide en una o más subclases. Para determinar cambios en la estructura física o química de una muestra de tejido queratinizada y por consiguiente detecta (por cualquier método en la técnica incluyendo, pero no sin limitarse a los ensayos descritos e Incorporados para referencia en la presente) la presencia de enfermedad ósea, o etapa de enfermedad ósea, tal como osteoporosis, la señal generada a partir de una prueba de la estructura física o química de una muestra de tejido queratinizada se compara generalmente a una señal de umbral que corresponde a un valor de corte predeterminado. En una modalidad, el valor de corte para la detección de un cambio en resistencia, módulo o nivel de enlace de azufre en una muestra de tejido queratinizado es la señal promedio obtenida a partir de muestras de tejido queratinizado recolectadas de sujetos sin enfermedad ósea, por ejemplo, aquellos sin osteoporosis. En general, detectar una disminución (relativa a una muestra control) en la resistencia o módulo de una muestra de tejido queratinizado o una disminución en el nivel de enlace de azufre en una muestra de tejido queratinizado es indicativa de una enfermedad ósea, o más específicamente huesos frágiles, tales como aquellos encontrados en pacientes con osteoporosis. Los médicos pueden utilizar los ensayos descritos en la presente para generar información que puede ayudar en la elección para iniciar, cambiar o incrementar/disminuir regímenes terapéuticos, como se discute supra. Además, un médico puede utilizar información provista por los ensayos descritos en la presente para confirmar o excluir diagnósticos potenciales basados en otros métodos de diagnóstico incluyendo densidad mineral ósea y otros diagnósticos. En algunas modalidades, la muestra de tejido queratinizado es una uña, y se utiliza la espectroscopia Raman para predecir la presencia o ausencia de osteoporosis en un sujeto. De esta manera, se recolecta un espectro Raman en uñas (in situ o fragmentos de uñas) del sujeto que se prueba, y el nivel de enlace de disulfuro se detecta analizando la intensidad del pico a 510 cm"1 del espectro Raman. Como se observa anteriormente, la intensidad de este pico puede determinarse utilizando cualquier método del análisis espectral conocido en la técnica. La intensidad de este pico representa un valor de calidad ósea para el individuo y es indicativo de la presencia o ausencia de, o riesgo de desarrollar osteoporosis. En una modalidad, la intensidad del pico a 510 cm"1 del espectro Raman para uñas se calcula con base en el ancho del valor máximo medio (WHM) de este pico. Un valor VHM promedio en o sobre aproximadamente 35 cm"1 es indicativo de un individuo que tiene una puntuación T de densidad mineral ósea (BMD) de 5.-1.5 (como se mide por DEXA; véase la Figura 5). De acuerdo con la definición y categorización de la Organización Mundial de la Salud de osteoporosis, una puntuación T de BMD de <. -1.5 es indicativo de una masa ósea baja, aunque una puntuación T de BMD <. -2.5 indica la presencia de osteoporosis. La sensibilidad de estas pruebas de diagnóstico para predecir una puntuación T de BMD < -2.5 (y de este modo la presencia de osteoporosis) en una población de 52 mujeres que participan en un ensayo clínico ciego fue 93.3%, mientras la especificidad de la prueba para predecir esta puntuación T de BMD fue 95.5% (véase Ejemplo 2 en la presente posteriormente). En otras modalidades, un valor de WHM promedio en o sobre aproximadamente 35 cm"1 para el pico a 510 cm"1 del espectro Raman para uñas es indicativo de un individuo quien está en riesgo de fractura, por ejemplo, fractura asociada con una enfermedad ósea tal como osteoporosis (véase Figura 6). Cuando un individuo evalúa positivo (por ejemplo, un valor WHM promedio en o sobre aproximadamente 35 cm"1 para el pico a 510 cm"1 del espectro Raman para muestras de uñas), pueden implementarse terapia médica de prevención para disminuir la pérdida de masa ósea, progreso de la enfermedad y para reducir el riesgo de fractura. Alguien de experiencia en la técnica reconocerá que los ensayos de diagnóstico subsecuentes conducidos en una manera similar, por ejemplo, análisis espectral de un tejido queratinizado tal como uñas, para un individuo que experimenta terapia médica para la enfermedad ósea, puede proporcionar un medio para monitorear eficacia del tratamiento. Los siguientes ejemplos se ofrecen a modo de ilustración y no a modo de limitación.

EXPERIMENTAL Los métodos de prueba no invasivos actuales para osteoporosis utilizan exploradores de absorciometría de rayos x de doble energía (DEXA) o barridos basados en ultrasonido que miden la densidad ósea. Estas pruebas requieren equipo de diagnóstico caro y personal entrenado, por lo que limitan su aplicación. Los ensayos de diagnóstico descritos en el Ejemplo 1 posterior representan pruebas de diagnóstico no invasivas novedosas para osteoporosis, las cuales para propósitos de esta invención se refieren como Pruebas de Calidad de Hueso (BQT). Una BQT mide las propiedades químicas (microarquitectura) de un tejido queratinizado tal como la uña cuando se opone a la medición de la densidad ósea. La BQT se basa en el hallazgo que existe una diferencia estadísticamente notable en el estado de las proteínas, particularmente queratina, entre las uñas de una persona sana y aquellas de una persona con osteoporosis. De este modo, la microarquitectura de la uña puede utilizarse como un análogo para calidad ósea. La BQT es una metodología mucho más simple, y es potencialmente más redituable, que otras formas de métodos de detección de osteoporosis no invasiva disponibles hoy día. La BQT puede detectar riesgo de fractura por osteoporosis no invasivamente y barata, y permitirá a los practicantes de cuidado principal manejar con iniciativa diagnóstico y tratamiento de osteoporosis. El Ejemplo 1 demuestra dos medios por los cuales el estado de las proteínas en las uñas puede determinarse, es decir, nanoindentación y análisis de espectroscopia. El último puede monitorearse utilizando cualquier metodología espectroscópica, por ejemplo, espectroscopia Raman, (como se demuestra posteriormente), NIR, y FT-IR, como se observa en otro lado en la presente anteriormente. El Ejemplo 2 describe los resultados de una prueba clínica ciega experimentada para verificar la especificidad y sensibilidad de la BQT basada en análisis de espectro Raman. Ejemplo 1: Cambios Físicos y Químicos en Uñas de la mano Humana como se Correlaciona a Enfermedad Ósea Se identificaron dos grupos de sujetos. El primer grupo (n = 9) se diagnosticó por DEXA (Lunar Prodigy, GE Medical systems), como osteoporótico (puntuación T < -2.5). El segundo grupo (n = 13) se diagnóstico como no osteoporótico (puntuación T > 1.0). Todas las pruebas estadísticas que correlacionan la enfermedad a varias variables dependientes se realizaron utilizando ANCOVA. Se obtuvieron fragmentos de uñas de la mano a partir de todos los sujetos. El mecanismo de la uña se compone del pliegue de la uña, la matriz de la uña, la base de la uña y el hiponiquio, los cuales juntos forman la placa de la uña. Esta placa de la uña se produce principalmente por la matriz y emerge a través del pliegue próximo de la uña, mientras se mantiene en el lugar por el doblez lateral de la uña. Ésta reviste la base de la uña y se separa en el punto llamado el hlponiquio, o en donde el extremo libre de la placa finaliza. Esto es en donde el fragmento se toma (véase Figura 1). Esta área corresponde al área en donde se encuentra la queratina de azufre elevado, típica de queratinas duras. Después de su locallzación, las muestras se almacenaron en vasijas de espécimen sellado antes de la prueba. Notablemente, las propiedades físicas de las uñas de la mano cambian cuando se remojan en agua, ya que se vuelven suaves y flexibles. Se piensa que el grado de hidratación es el factor más importante que influencia las propiedades físicas de las uñas debido a que el agua químicamente enlazada se encuentra en ambas uñas secas y húmedas. La interacción de agua-proteína cambia la estructura de la queratina dándole nuevas características mecánicas (Finlay eí al. (1980) Br J Dermatol. 103:357, y Weseel eí al. (1999) Biochim Biophys Acta. 1433:210). Esto acentúa la necesidad para almacenar muestras de fragmentos de uñas bajo condiciones en donde no se exponen a grandes cantidades de agua o se deshidratan antes de la prueba. Por consiguiente, las uñas se almacenaron en vasijas selladas no más de un mes antes de la prueba. Los experimentos realizados en uñas almacenadas con el tiempo confirmaron que las uñas almacenadas en la manera descrita anteriormente mantuvieron las mismas propiedades durante al menos un periodo de un mes. Específicamente, se probaron muestras de uñas semanalmente durante un periodo de un mes para resistencia y módulo para confirmar que no habían ocurrido cambios detectables. En contraste, las muestras de uñas que se probaron un año después de la recolección exhibieron diferentes propiedades. Nanoindentación Las uñas se recortaron antes de la prueba para exponer la sección central plana de cada uña, y por lo tanto, se reduce la posibilidad de los extremos curvos de la uña habiendo contacto prematuro con el dentador. Las muestras se fijan entonces a soportes de aluminio con un adhesivo epoxi (parte no: 46409, Versachem, FL, USA).

Se condujeron experimentos de nanoindentación utilizando una máquina de construcción de laboratorio previamente descrita por Arteaga eí al. (1993) Tribology Int'l 26:305. Para cada indentación, la punta se puso en contacto con la superficie utilizando una carga de poco µN. La carga se incrementó entonces linealmente a 0.8 mNs"1 hasta su valor máximo de 120 mN, y luego se redujo contra la misma relación a cero. Se tomaron lecturas cada 150 ms durante el ciclo del desplazamiento del dentador d, y la carga P, que permite la examinación de los datos de fuérzapenetración tanto en las fases de carga como de descarga. Consecuentemente, es posible producir curvas de profundidad de penetración en cada nivel de fuerza durante las fases de carga y descarga. Los datos para estos estudios se generaron utilizando las Fórmulas 1-3 supra. Una representación esquemática de una curva de nanoindentación se da en la Figura 2. Los datos recolectados se muestran en la Tabla 1, y el análisis estadístico se muestra en la Tabla 2.

Tabla 1. Mediciones del módulo y resistencia de fragmentos de uñas de la mano. Muestra Módulo Resistensia Máxima Resistensia Mínima BMD A(1) 3.43 0.247 0.236 2 A(2) 3.09 0.186 0.164 2 A(3) 3.88 0.386 0.325 2 A(4) 3.38 0.23 0.201 2 A(5) 3.47 0.298 0.256 2 G G22((11)) 3 3..2255 0.201 0.173 2 G2(2) 3.14 0.202 0.175 2 G2(3) 3.79 0.193 0.171 2 G2(4) 3.64 0.15 0.132 2 G2(5) 3.17 0.194 0.172 2 H2(1) 2.95 0.266 0.234 2 H2(2) 4.51 0.497 0.424 2 H2(3) 4.11 0.415 0.352 2 H2(4) 6.24 0.614 0.522 2 H2(5) 3.62 0.219 0.189 2 D(1) 3.5 0.0693 0.0645 0 D(2) 3.34 0.0626 0.0565 0 D(3) 3.26 0.0578 0.0522 0 D(4) 2.71 0.0407 0.0369 0 E(1) 4.34 0.299 0.268 0 E(2) 5.1 0.41 0.353 0 E(3) 4.62 0.36 0.31 0 E(4) 4.86 0.388 0.337 0 E(5) 4.86 0.388 0.337 0 F(1) 3.51 0.273 0.237 0 F(2) 3.33 0.293 0.253 0 F(3) 3.17 0.134 0.117 0 G(1) 5.12 0.212 0.187 0 G(2) 5.27 0.345 0.3 0 G(3) 4.57 0.243 0.219 0 G(4) 5.27 0.275 0.239 0 G(5) 5.79 0.351 0.302 0 H(1) 4.83 0.394 0.329 0 H(2) 4.12 0.261 0.226 0 H(3) 4.36 0.265 0.224 0 H(4) 4.69 0.293 0.259 0 H(5) 5.4 0.359 0.298 0 D 2.47 0.12 0.109 0 l(2) 2.93 0.0536 0.0506 0 l(3) 3.03 0.0756 0.0698 0 l(4) 2.8 0.135 0.122 0 l(5) 3.15 0.154 0.141 0 J(1) 3.08 0.101 0.0885 0 J(2) 3.4 0.0762 0.0706 0 J(3) 2.82 0.0609 0.056 0 J(4) 2.64 0.0782 0.0714 0 J(5) 3.83 0.125 0.112 0 K(1) 4.95 0.342 0.295 0 K(2) 6.42 0.485 0.416 0 K(3) 5.48 0.415 0.356 0 K(4) 6.36 0.61 0.51 0 K(5) 7.24 0.565 0.491 0 L(1) 3.45 0.309 0.263 0 L(2) 3.5 0.233 0.204 0 L(3) 4.42 0.447 0.376 0 L(4) 3.94 0.31 0.27 0 N(1) 0.967 0.279 0.236 -3 N(2) 1.27 0.275 0.237 -3 N(3) 0.933 0.145 0.131 -3 N(4) 1.49 0.297 0.255 -3 N(5) 1.49 0.236 0.207 -3 0(1) 3.86 0.179 0.158 -3 0(2) 2.88 0.124 0.112 -3 0(3) 2.53 0.073 0.0663 -3 0(4) 2.84 0.0987 0.0903 -3 O(d) 2.82 0.072 0.0672 -3 P(1) 1.83 0.121 0.103 -3 P(2) 1.63 0.148 0.128 -3 P(3) 2.67 0.0898 0.0814 -3 P(4) 0.856 0.0503 0.0472 -3 Qd) 1.41 0.0425 0.0405 -3 0(2) 1.68 0.0768 0.0726 -3 0(3) 1.49 0.133 0.121 -3 0(4) 1.74 0.165 0.148 -3 0(5) 1.97 0.183 0.161 -3 R(2) 5.06 0.376 0.324 -3 R(3) 5.6 0.52 0.439 -3 R(4) 4.61 •"" 0.305 0.261 -3 R(5) 6.12 0.638 0.52 -3 S(1) 3.02 0.0996 0.0908 -3 S(2) 4.47 0.37 0.324 -3 S(3) 3.58 0.21 0.185 -3 S(4) 3.61 0.18 0.155 -3 S(5) 3.81 0.31 0.263 -3 T(1) 3.68 0.198 0.179 -3 T(2) 3.58 0.137 0.125 -3 T(3) 4.01 0.295 0.251 -3 T(4) 2.99 0.148 0.134 -3 T(5) 3.3 0.105 0.0978 -3 U(1) 2.27 0.172 0.153 -3 U(2) 1.21 0.122 0.114 -3 U(3) 3.56 0.263 0.233 -3 U(4) 4.08 0.299 0.262 -3 U(5) 3.2 0.138 0.126 -3 V(1) 4.08 0.144 0.133 -3 V(2) 4.39 0.131 0.116 -3 V(3) 6.23 0.458 0.398 -3 V(4) 4.33 0.142 0.134 -3 V(5) 3.75 0.277 0.242 -3 Tabla 2. Análisis estadístico de datos recolectados.

Grupo BMD Elevado módulo 3.711333333 resistencia 0.267467 promedio promedio desviación 0.81434344 desviación 0.121951 estándar estándar Grupo BMD Normal módulo 4.193414634 resistencia 0.238365 promedio promedio desviación 1.162156637 desviación 0.139288 estándar estándar Grupo MD Bajo módulo 3.044093023 resistencia 0.192416 promedio promedio desviación 1.413736299 desviación 0.117027 estándar estándar Totalmente no osteoporóticos módulo 4.064285714 resistencia 0.24616 promedio promedio desviación 1.094289071 desviación 0.134947 estándar estándar Los resultados del módulo y resistencia elástica promedio para los dos conjuntos de uñas de la mano se incluyen posteriormente en la Tabla 3.

Tabla 3. Módulo y resistencia promedio (y desviaciones estándares) de uñas de la mano originados.

El módulo promedio o uñas de la mano de pacientes con BMD baja son aproximadamente 25% inferior de aquellos con BMD normal. La diferencia en el módulo promedio entre los grupos se encontró que fue 1.1 GPa, el cual sólo aborda significado en nivel de 5% (p = 0.147) debido a la falta de poder (n pequeño) dentro de la prueba.

Espectroscopia Raman Para análisis Raman, cuatro muestras de uñas de la mano de cada grupo se analizaron para evaluar si hubo disparidad entre los grupos y para detectar cambios inducidos osteoporóticos en tejido queratinizado. Se obtuvieron microespectros Raman utilizando un instrumento Dilor Labram 01. La excitación fue por láser rojo operando a 632.81 nm. Se obtuvieron los espectros al realizar 20 barridos, para mejorar la relación de señal a ruido, cada una con un tiempo de exposición al láser de 50 segundos. Se repitió el mismo procedimiento de operación para todas las muestras con el fin de que el espectro resultante demuestre sólo las diferencias entre el tejido osteoporótico y no esteroporótico. Se registraron los espectros de 300cm"1 a 1800 cm"1 para identificación de todos los picos característicos en uña humana. El intervalo de 300 cm'1 a 700 cm"1 se seleccionó para comparación. La normalización de todos los espectros adquiridos se llevó a cabo para facilitar la comparación y para acentuar diferencias entre los grupos. La Figura 3 muestra el espectro Raman típico de la uña humana entre 300 cm"1 y 1800 cm"1. Los picos espectrales mayores de la uña humana incluyen la banda amida a 1677 cm"1 indicando que la queratina de la uña es predominantemente a-helicoidal, la banda de deformación de metileno (CH2) es 1450 cm" 1 y la banda de amida [v(CN)] es 1251 cm"1. En la región de 1000 cm'1 a 1200 cm"1 la banda más resistente ocurre a 1006 cm"1, que corresponde a la vibración de alargamiento C-C del anillo aromático en la cadena lateral de fenilalanina. Sin embargo, es la región más baja del espectro que es de más preocupación en este estudio. El área entre 700 cm"1 y 300 cm'1 contiene la información espectral acerca del enlace de azufre en las uñas de la mano. Las intensidades relativas de las vibraciones de alargamiento S-S y C-S dan una buena indicación de la cantidad de azufre presente y permite la determinación de la configuración estructural del enlace S-S. La Figura 3 muestra el pico a 510 cm"1 que representa el enlace de disulfuro [v(SS)]. Los picos inferiores a 621 cm'1 y 645 cm"1 representan enlace de sulfuro de carbono [v(CS)]. La Figura 4 muestra espectros Raman normalizados para una uña osteoporótica y no osteoporótica en la misma escala. Dos diferencias principales entre uñas osteoporóticas y no osteoporóticas se observaron. El enlace de pico disulfuro (S-S, conformación gauche-gauche-gauche) para la uña sana a 510 cm"1 fue mucho más agudo que para la uña osteoporótica y el ancho del pico S-S en la uña osteoporótica se encontró ser más grande que la uña sana. Por lo tanto, el contenido de enlace de disulfuro de las uñas originado de pacientes osteoporóticos fue más bajo que aquellos de pacientes sanos. La Tabla 4 muestra que esta diferencia en ancho promedio de la máxima media para el pico S-S de dos conjuntos de uñas es estadísticamente notable (ANCOVA).

Tabla 4. Resultados de espectroscopia Raman para uña osteoporótica contra no osteoporótica.

Hubo también un cambio en el pico de enlace de sulfuro de carbono (C-S) a aproximadamente 621 cm'1 y 643 cm'1 como se muestra por los números de onda más elevados detectados para los enlaces C-S en uña osteoporótica. En los espectros de proteínas la banda vibracional C-S se origina de metionina, cisteína y cistina. Ya que el contenido de metionina en uña humana es insignificante, las bandas C-S y S-S mostradas deben haberse originado de cisteína y cistína (Marshall et al. (19969 BMJ 312:1254). Aunque no se una por ningún mecanismo particular o teoría de acción, el cambio en el enlace de sulfuro de carbono puede deberse al cambio del contenido de azufre en las uñas ya que se sabe que la vibración de alargamiento C-S es dependiente de la conformación de sus cadenas laterales.

Ejemplo 2: Verificación de la Prueba de Calidad de Hueso Basada en Análisis Espectral de Uñas La Organización Mundial de la Salud (WHO) define osteoporosis como "un trastorno esquelético caracterizado por resistencia ósea comprometida que predispone a una persona a un riesgo incrementado de fractura". La WHO utiliza la puntuación T de densidad mineral ósea (BMD) como el estándar para identificar la condición osteoporótica. Para obtener la puntuación T, se compara un resultado de BMD del individuo (por ejemplo, de DEXA) con los resultados de BMD de adultos de 25 a 35 años sanos del mismo sexo y raza. La desviación estándar (SD) es la diferencia entre su BMD y aquel de los adultos jóvenes sanos. Este resultado es la "puntuación T". Los valores de puntuación T positivos son indicativos de hueso que es más fuerte que el normal; los valores de puntuación T negativos son indicativos de hueso que es más débil que el normal. De acuerdo a la WHO, la osteoporosis se categoriza con base en los siguientes niveles de densidad mineral ósea: • Una puntuación T dentro de 1 SD (+ 1 o -1) del adulto joven promedio indica densidad ósea normal; • Una puntuación T de 1 a 2.4 SD debajo del promedio de adulto joven (-1 a -2.5 SD) indica masa ósea baja; • Una puntuación T de 2.5 SD o más debajo del promedio de adulto joven (mayor de -2.5 SD) indica la presencia de osteoporosis. En general, el riesgo de fracturas óseas se duplica con cada SD inferior normal. De este modo, por ejemplo, una persona con una puntuación T de -1 tiene dos veces el riesgo de fractura ósea que una persona con BMD normal. Una persona con puntuación T de -2 tiene cuatro veces el riesgo para fractura ósea que una persona con una BMD normal. Cuando esta información se conoce, la gente con riesgo elevado de fractura ósea puede tratarse con la finalidad de evitar fracturas futuras. El presente ejemplo proporciona los resultados de un ensayo clínico ciego que se llevó a cabo para identificar mujeres, con base en la BQT, quienes se definieron como teniendo osteoporosis utilizando la definición de la Organización Mundial de la Salud (WHO) para esta condición (es decir, una puntuación T de BMD de menos de (es decir, más negativa que) o igual a -2.5 (por ejemplo, -3.0). El tamaño de muestra fue 52 pacientes, y los datos de BQT se obtuvieron utilizando espectroscopia Raman de muestras de las uñas de la mano recolectadas a partir de estos pacientes, y analizando diferencias en el pico espectral Raman a 510 cm"1 (es decir, el pico S-S). De esta manera, se examinaron los fragmentos de las uñas de la mano de estos sujetos, utilizando espectroscopia Raman (espectros obtenidos con un instrumento Dilor Labram 01) en una manera similar a aquella descrita en el Ejemplo 1. Para este estudio, el ancho en la máxima media (WHM) para el pico S-S a partir del espectro Raman se determinó para uñas recolectadas de cada individuo, y las relaciones entre la puntuación T y la edad y la puntuación T y el valor VHM con el fin de evaluar la puntuación T como una función de WHM y la edad. Los resultados se muestran en la Figura 5. La Tabla 5 muestra el número de pacientes no osteoporóticos y osteoporóticos que tuvieron un valor de WHM elevado (es decir, 35 cm'1 o mayor) y valor de WHM bajo (es decir, aproximadamente 34 cm"1 o menos).

Tabla 5. Distribución de pacientes no osteoporóticos y osteoporóticos con base en el valor de VHM obtenido de BQT utilizando análisis espectral Raman de las uñas.

La sensibilidad de la BQT (es decir, la proporción de pacientes quienes evaluaron positivo y tienen osteoporosis) fue 93.3% (es decir, 28/30). La especificidad de la BQT (es decir, la proporción de pacientes quienes evaluaron negativo y no tienen osteoporosis) fue 95.5% (es decir, 21/22). La Tabla 6 muestra la sensibilidad y especificidad comparativa de la BQT y otras pruebas de diagnóstico que predicen osteoporosis (es decir, una puntuación T <. -2.5).

Tabla 6. Comparación de BQT con otras pruebas de diagnóstico para predecir puntuación T -2.5 Para información con respecto al uso de estas otras pruebas de diagnóstico como pronosticadores de osteoporosis, véase por ejemplo, Naganathan et al. (1999) Med J. Aust. 171:297-300 (ultrasonido de talón cuantitativo (QUS)); Ross y Simón (1998) J. Bone Miner. Res. 23(suppl):S601 , Rea et al. (2000) Osteoporos Int. 11(8):660-8, y Rea ef al. (2000) J. Bone Miner. Res. 15(3):564-75 (pDXA); Orthopaedic Nursing 24(1):33-39 (SCORE), y Cadarette er al. (2000) C.M. A.J. 162(9):1289-94 (Encuesta). Estos resultados indican que un resultado positivo en la BQT es equivalente a una puntuación T de DEXA de -2.5 o menor, y el tratamiento debe considerarse por consiguiente. En otra evaluación del valor predictivo de la BQT, el riesgo de fractura como una función de la puntuación de la calidad del hueso y la edad se determinó para un subconjunto de las mujeres que participan en esta prueba. Como puede verse a partir de la Figura 6, las mujeres con historias de fractura tienen muy diferentes puntuaciones de calidad de hueso (valor de puntuación de WHM sobre aproximadamente 36 cm"1) a partir de mujeres sin historia de fractura (valor de puntuación de WHM debajo de aproximadamente 34 cm"1). De este modo, la espectroscopia Raman de uñas, ya sea in situ o como fragmentos de uñas, puede evaluar el riesgo de fractura en una manera más rápida y menos cara que evita problemas potenciales asociados con evaluación por radiación. Además, un aparato de espectroscopia Raman de mesa tal como aquel descrito en el Ejemplo 3 posterior, podría estar fácilmente disponible por los practicantes para ayudar a la selección de masa de sujetos para la presencia o ausencia de una enfermedad tal como osteoporosis, para seguir eficacia de tratamiento de individuos que tienen o están en riesgo de desarrollar una enfermedad ósea tal como osteoporosis, y para predecir riesgo de fractura. Una reducción en fracturas basada en más selección y tratamiento preventivo podría tener beneficios de salud y económicos notables alrededor del mundo y podría expandir el fármaco preventivo de osteoporosis considerablemente comercializado. Ejemplo 3: Aparato de Espectroscopia Raman para Evaluar Osteoporosis y Riesgo de Fractura Cualquier sistema de espectroscopia Raman comercialmente disponible puede utilizarse en los ensayos de diagnóstico descritos en la presente. La Figura 7 ilustra los componentes principales que pueden encontrarse sin tal sistema para uso al conducir el análisis espectral Raman de un tejido queratinizado tal como uña, ya sea in situ o como fragmentos de uñas. Los componentes pueden formularse como parte de un paquete individual, o pueden construirse como unidades múltiples que se integran para análisis de operación y espectral. Con el fin de recolectar los datos espectrales, se coloca una sonda contra la uña de un sujeto, por ejemplo, una uña de la mano intacta de un dedo, y un haz de luz a partir de la fuente de luz se suministra a la superficie de la uña, por ejemplo, al presionar un botón en el aparato. El tiempo de suministro de luz puede variar, pero puede ser tan corto como 2-5 segundos. Después de la selección espectral para luz diseminada Raman, la detección de la luz diseminada Raman, y la cuantificación, el resultado espectral se despliega, por ejemplo, en un tamiz, y puede registrarse entonces a un chip con un sello de datos. Muchas modificaciones y otras modalidades de la invención establecidas en la presente vendrán a la mente por un experto en la técnica al cual estas invenciones pertenecen teniendo el beneficio de las enseñanzas presentadas en las descripciones anteriores y los dibujos asociados. Por lo tanto, se entenderá que las invenciones no van a limitarse a las modalidades específicas descritas y que las modificaciones y otras modalidades se pretenden para incluirse dentro del alcance de las reivindicaciones anexas. Aunque se emplean términos específicos en la presente, éstos se utilizan en un sentido genérico y descriptivo solamente y no para propósitos de limitación. Todas las publicaciones y solicitudes de patente mencionadas en la especificación son indicativas del nivel de aquellos expertos en la técnica a los cuales esta invención pertenece. Todas las publicaciones y solicitudes de patente se incorporan en la presente para referencia al mismo grado como si cada publicación individual o solicitud de patente se indicara específica e individualmente para incorporarse para referencia.

Claims (27)

1. REIVINDICACIONES 1. Un método para diagnosticar enfermedad ósea en un sujeto, el método está caracterizado porque comprende: a) obtener una muestra de tejido queratinizado a partir de un sujeto que se diagnostica para enfermedad ósea; b) medir la resistencia de la muestra; y c) correlacionar tal resistencia a la muestra a un diagnóstico positivo o indentador negativo de una enfermedad ósea que se asocia con un cambio en elasticidad ósea o densidad ósea.
2. 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la enfermedad ósea es osteoporosis.
3. 3. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la muestra se selecciona del grupo que consiste de uña, pelo y piel.
4. 4. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque se realiza la medición por medio de nanoindentación.
5. 5. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque la muestra es una uña.
6. 6. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque la uña se recorta del sujeto antes de medir la resistencia de tal uña.
7. 7. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque la medición de la resistencia de la uña se realiza en la uña in situ.
8. 8. Un método para diagnosticar enfermedad ósea en un sujeto, el método está caracterizado porque comprende: a) obtener una muestra de tejido queratinizado a partir de un sujeto que se diagnostica para enfermedad ósea; b) medir el módulo de la muestra; y c) correlacionar el módulo de la muestra a un diagnóstico positivo o negativo de una enfermedad ósea que se asocia con un cambio en la elasticidad ósea o la densidad ósea.
9. 9. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la enfermedad ósea es osteoporosis.
10. 10. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque las muestras se seleccionan del grupo que consiste de uña, pelo o piel.
11. 11. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque se realiza la medición por medio de nanoindentación.
12. 12. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque la muestra es una uña.
13. 13. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque la uña se recorta del sujeto antes de medir el módulo de tal uña.
14. 14. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque la medición del módulo de la uña se realiza en la uña in situ.
15. 15. Un método para diagnosticar enfermedad ósea en un sujeto, el método está caracterizado porque comprende: a) obtener una muestra de tejido queratinizado a partir de un sujeto que se diagnostica para enfermedad ósea; b) medir el nivel de enlace de azufre en la muestra; y c) correlacionar el nivel de enlace de azufre en la muestra a un diagnóstico positivo o negativo de una enfermedad ósea que se asocia con un cambio en elasticidad ósea o densidad ósea.
16. 16. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque la enfermedad ósea es osteoporosis.
17. 17. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque la muestra se selecciona del grupo que consiste de uña, pelo y piel.
18. 18. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque se realiza la medición por medio de espectroscopia Raman.
19. 19. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque se mide un pico a aproximadamente 510 cm"1.
20. 20. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque se mide un pico a aproximadamente 621 cm"1.
21. 21. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque se mide un pico a aproximadamente 643 cm"1.
22. 22. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18 a 21, caracterizado porque la muestra es una uña.
23. 23. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque la uña se recorta del sujeto antes de medir el nivel de enlace de azufre en la uña.
24. 24. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque la medición del nivel de enlace de azufre en la uña se realiza en la uña in situ.
25. 25. Un método para diagnosticar osteoporosis en un sujeto, el método está caracterizado porque comprende: a) proporcionar una uña a partir de un sujeto que se diagnostica para osteoporosis; b) medir por medio de espectroscopia Raman un pico a aproximadamente 510 cm"1 que corresponde al nivel de formación de puente disulfuro en la uña; y c) correlacionar el nivel de formación de puente disulfuro en la uña a un diagnóstico positivo o negativo de osteoporosis.
26. 26. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque se realiza la medición en la uña in situ.
27. 27. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque se realiza la medición en los fragmentos de uñas obtenidos del sujeto.