MXPA06015106A - Metodo para aumentar la susceptibilidad de los inhibidores de la peptidil-desformilasa mediante la utilizacion de inhibidores de la bomba de eflujo. - Google Patents

Abstract

(ver formulas) La presente invencion proporciona metodos y composiciones para aumentar la susceptiblidad de los inhibidores de PDF contra los organismos Gram-negativos, mediante la utilizacion de inhibidores de la bomba de eflujo.

Description

MÉTODO PARA AUMENTAR LA SUSCEPTIBILIDAD DE LOS INHIBIDORES DE LA PEPTIDIL-DESFORMILASA MEDIANTE LA UTILIZACIÓN DE INHIBIDORES DE LA BOMBA DE EFLUJO Campo de la Invención La presente invención se refiere a inhibidores de la peptidil-desformilasa (PDF), y en particular a métodos para mejorar la efectividad de los inhibidores de peptidil-desformilasa contra las bacterias Gram-negativas, mediante la utilización de inhibidores de la bomba de eflujo. Antecedentes de la Invención El continuo surgimiento y extensión de la resistencia basada en el objetivo al armamento actual de antibióticos hace obvia la necesidad de modificaciones de compuestos con el fin de circunvenir estos mecanismos, o mejor, el descubrimiento de compuestos dirigidos hacia funciones celulares novedosas para las cuales no se esperaría que la resistencia basada en el objetivo previamente existente confiriera resistencia cruzada. Una clase novedosa de compuestos de hidroxilamina que inhiben la función no explotada hasta ahora de la peptidil-desformilasa, muestran una gran promesa en este aspecto, particularmente hacia las bacterias Gram-positivas, incluyendo aquéllas con mecanismos de resistencia bien caracterizados para los antibióticos comúnmente utilizados. Ver la Publicación Internacional Número WO 02/102790A1. La peptidil-desformilasa es una metalopeptidasa encontrada en los organismos procarióticos, tales como bacterias. La síntesis de proteína en los organismos procarióticos empieza con la N-formil-metionina (fMet). Después de iniciarse la síntesis de la proteína, el grupo formilo es removido por la peptidil-desformilasa. Esta actividad es esencial para la maduración de las proteínas. Se ha demostrado que se requiere la peptidil-desformilasa para el crecimiento bacteriano. Debido a que la síntesis en los organismos eucarióticos no depende de la fMet para su inicio, los agentes que inhiban la peptidil-desformilasa son candidatos atractivos para el desarrollo de nuevos fármacos antimicrobianos y antibacterianos. Sin embargo, un enorme potencial en el desarrollo de estos agentes novedosos está en los mecanismos generales responsables de la resistencia intrínseca a un amplio número de compuestos estructuralmente no relacionados. Éstos incluyen la impermeabilidad de membrana y el eflujo, que se manifiestan más agudamente en el caso de las bacterias Gram-negativas, en donde se ha demostrado que la membrana externa y las bombas de eflujo actúan sinérgicamente para minimizar la acumulación intracelular de una variedad de compuestos estructuralmente no relacionados. Ver Nikaido, J. Bacteriol. Volumen 178, Número 20, páginas 5853-5859 (1996); Nikaido, Curr. Opin. Microbiol. Volumen 1, Número 5, páginas 516-523 (1998); y Nikaido y Zgurskaya, J. Mol. Microbiol. Biotechnol. Volumen 3, Número 2, páginas 215-218 (2001). Las bombas de eflujo Gram-negativas de la familia de resistencia-nodulación-división celular (RND), parecen tener el número de sustratos más amplio, y por consigu iente, son m ás generalm ente releva ntes vis a vis la resistencia a los fármacos en las bacterias Gram-negativas. Arquitectónicamente, consisten en un anti-portador de protón-fármaco de la membrana interna, un canal de la membrana externa , y una denomi nada proteína de fusión de membrana que se piensa que funciona para facilitar la interacción entre los componentes de la membrana interna y la membrana externa en el periplasma . La extrusión del sustrato es impulsada por la fuerza motriz de protones, y los datos recientes indican que se pueden bombear los sustratos desde el periplasma o desde la hoja interna de la membrana citoplásmica . Ver Elkins y Nikaido, J. Bacteriol. Volumen 1 84, N úmero 23, páginas 6490-6498 (2002) ; Li , Ma, Livermore y N ikaido, Antimicrob. Agents Chemother. , Volumen 38, N úmero 8, páginas 1 742- 1 752 ( 1 994) ; y Yu y colaboradores, Science, Volumen 300, N úmero 5621 , pági nas 976-980 (2003) . El amplio número de sustratos acomodad o por las bombas de eflujo, en particular aquéllas de la familia RND, es tal que se debe anticipar y considerar su potencial para hacer menos efectivos los antimicrobianos novedosos inclusive altamente activos en el objetivo, en los programas de desarrollo de fármacos, esforzándose por tener un amplio intervalo o cubrimiento de las bacterias Gram-negativas. Más aún , las mutaciones reguladoras que activan o aumenta la expresión de la bomba de eflujo, presumiblemente seleccionadas por la exposición a los agentes antimicrobianos o biocidas, pueden conferir una resistencia adicional a varios o todos los sustratos para una bom ba dada. Ver C huanchuen y colaboradores , Antimicrob Agents Chemother. , Volumen 45, N úmero 2, páginas 428-432 (2001 ). Se han aislado cl ínicamente los sobre-expresores de la bomba de eflujo [ver Beinlich , Chuanchuen y Schweizer, FEMS Microbiol. Lett., Volumen 1 98, N úmero 2 , páginas 1 29-1 34 (2001 ) ; Mazzariol y colaboradores, Antimicrob. Agents Chemother., Volumen 44, Número 1 2, pág inas 3441 -3443 (2000) ; y Ziha-Zarifi y colaboradores, Antimicrob. Agents Chemother., Volumen 43, N úmero 2, páginas 287-291 ( 1 999)]; y la sobre-expresión de la bomba puede contribuir de una manera significativa a una mayor resistencia a los fármacos. Por consig uiente, aunq ue puede no existir previamente la resistencia cruzada a los agentes novedosos en la forma de mutaciones basadas en el objetivo seleccionadas por otros antibióticos, las exposiciones antimicrobianas pueden seleccionar los mutantes de bomba con una menor susceptibilidad a los nuevos agentes. Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) , un patógeno oportu nista importante que está surgiendo, representa un extremo del espectro de la resistencia basada en el eflujo, que tiene múltiples bombas de la familia RN D de un intervalo de sustratos traslapado, y una membrana externa notoriamente impermeable , que se ha demostrado que aumenta de una manera sig nificativa la eficiencia de las bombas limitando el influjo. Ver Poole, J. Mol. Microbiol. Biotechnol. Volumen 3, N úmero 2, páginas 255-264 (2001 ) . Tal vez representando el otro extremo está Haemophilus influenzae (H. influenzae), un patógeno respiratorio importante [ver Dagan y colaboradores, Pediatr. Infecí. Dis. J. Volumen 19, Número 2, páginas 95-104 (2000); Gotfriend, Am. J. Med. Volumen 111, Suplemento 9A, páginas 25S-29S (2001); Pfaller, Ehrhardt y Jones, Am. J. Med. Volumen 111, Suplemento 9A, páginas 4S-12S (2001); y Sokol, Am. J. Med. Volumen 111, Suplemento 9A, páginas 19S-24S (2001)], que tiene solamente una bomba conocida de la familia RND (homólogo acrAB) [ver Fleischmann y colaboradores, Science, Volumen 269, Número 5223, páginas 496-512 (1995); y Sánchez, Pan, Vinas y Nikaido, J. Bacteriol. Volumen 179, Número 21, páginas 6855-6857 (1997)], y se caracteriza por una membrana externa relativamente permeable. La mayor permeabilidad de la membrana externa se ha implicado en la limitación de la eficiencia de la bomba de eflujo, inclusive para los sustratos relativamente grandes, tales como la eritromicina. Ver Sánchez, Pan, Vinas, y Nikaido (1997), supra. Por consiguiente, H. influenzae puede representar un ejemplo de un patógeno Gram-negativo, en donde se puede esperar que la resistencia intrínseca y adquirida basada en el eflujo presente menos de un problema. A pesar de esto, y de una manera consistente con que la eritromicina sea un sustrato del homólogo acrAB de H. influenzae [ver Sánchez, Pan, Vinas, y Nikaido (1997), supra], se han asociado niveles moderados de resistencia intrínseca a los macrólidos en los aislados clínicos de H. influenzae con el eflujo. Ver Peric, Bozdogan, Jacobs y Appelbaum, Antimicrob. Agents Chemother., Volumen 47, Número 3, páginas 1017-1022 (2003). También se ha observado que las cepas clínicas de H. influenzae muestran en general una susceptibilidad reducida a diferentes inhibidores de peptidil-desformilasa novedosos. En resumen, la discusión anterior indica que el eflujo activo de los agentes antibacterianos mediante las bombas de eflujo presentes en las bacterias, en particular en las bacterias Gram-negativas, puede ser un factor importante que contribuye a la resistencia de las bacterias a estos agentes. De conformidad con lo anterior, el desarrollo y uso de inhibidores de las bombas de eflujo bacterianas en combinación con los agentes antibacterianos, pueden mejorar la susceptibilidad de las bacterias, en particular de las bacterias Gram-negativas, a diferentes agentes antibacterianos para los cuales las bacterias han reducido la susceptibilidad debido al eflujo de los agentes desde las bacterias. Breve Descripción de la Invención En un aspecto, la presente invención proporciona un método para el tratamiento de una infección bacteriana Gram-negativa en un mamífero, el cual comprende administrar una cantidad efectiva de un compuesto de la Fórmula (I): en donde: X es -CH2-, -S-, -CH(OH)-, -CH(OR)-, -CH(SH)-, -CH(SR)-, -CF2-, -C = N(OR)- ó -CH(F)-, en donde R es alquilo; R i es arilo o heteroarilo; cada uno de R2, R3, R4, y R5 es independientemente hidrógeno o alq uilo, o R2 ó R3, y R4 ó R5, colectivamente, forman un cicloalquilo de 4 a 7 átomos de carbono; y n es de 0 a 3, en el entendido de que, cuando n es 0, X es -CH2-, o una sal del mismo, o un pro-fármaco del mismo; y un inhibidor de la bomba de eflujo. En una modalidad útil, la presente invención proporciona un método para el tratamiento de una infección por bacterias Gram-negativas en un mamífero, la cual sea causada por una bacteria Gram-negativa q ue posea una bomba de eflujo RN D. El método comprende administrar una cantidad efectiva del compuesto: y un inhibidor de eflujo que inhiba a la bomba de eflujo RN D en las bacterias Gram-neg atívas. En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para aumentar la susceptibilidad de las bacterias Gram-negativas a un compuesto de la Fórmula (I): en donde: X es -CH2-, -S-, -C H(OH)-, -C H (OR)-, -CH(SH)-, -C H (S R)-, -CF2-, -C = N(OR)- ó -CH(F)-, en donde R es alquilo; Ri es arilo o heteroarilo; cada uno de R , R3, R , y s es independientemente hidrógeno o alq uilo, o R2 ó R3, y R4 ó R5, colectivamente, forman un cicloalquilo de 4 a 7 átomos de carbono; y n es de 0 a 3, en el entend ido de q ue, cuando n es 0, X es -CH2-, o una sal del mismo, o un pro-fármaco del mismo. El método comprende poner en contacto las bacterias con el compuesto de la Fórmula (I) y un inhibidor de la bomba de eflujo, en una cantidad efectiva para inhibir una bomba de eflujo en las bacterias Gram-negativas. En una modalidad , la presente invención proporciona un método para aumentar la susceptibilidad de las bacterias Gram-negativas que posean una bomba de eflujo RN D, al compuesto: El método comprende poner en contacto las bacterias Gram-negativas con el compuesto y un inhibidor de la bomba de eflujo, en una cantidad efectiva para inhibir la bomba RND en las bacterias Gram-negativas. En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición farmacéutica, la cual comprende un compuesto de la Fórmula (I): en donde: X es -CH2-, -S-, -CH(OH)-, -CH(OR)-, -CH(SH)-, -CH(SR)-, -CF2-, -C = N(OR)- ó -CH(F)-, en donde R es alquilo; RT es arilo o heteroarilo; cada uno de R2, R3, R , y Rs es independientemente hidrógeno o alquilo, o R2 ó R3, y R ó Rs, colectivamente, forman un cicloalquilo de 4 a 7 átomos de carbono; y n es de 0 a 3, en el entendido de que, cuando n es 0, X es -CH2-, o una sal del mismo, o un pro-fármaco del mismo, un inhibidor de la bomba de eflujo, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Breve Descripción de los Dibujos Figura 1. Estructuras de los inhibidores de peptidil-desformilasa novedosos LBM415 y LBK611. Figura 2. Configuración genética de los genes de la bomba de eflujo acrAB en H. influenzae, que muestra las posiciones y orientaciones de los marcadores de la resistencia a la kanamicina (flechas), utilizados para la inactivación de inserción. También se muestra la posición y orientación del marcador de resistencia a la kanamicina insertado en el marco de lectura abierta HI1462 (tolC). Figura 3. Región del acrAB que falta en el aislado clínico NB65062 (barra negra). Se indican las posiciones de los cebadores utilizados para la reacción en cadena de la polimerasa. El par de cebadores acrAHIF/acrAHIR no genera un producto, debido a que falta el sitio para acrAHIF en el NB65062. Figura 4. Comparación de los genes acrR truncados de cuatro aislados clínicos de H. influenzae, con una susceptibilidad reducida a LBM415 y LBK611, y al acrR de tipo silvestre. Las mutaciones son como siguen: NB65016, inserción de 1 base (C) después del nucleótido 442 (cambio de marco); NB65027, supresión de 8 pares de bases - inserción de GTT después del nucleótido 366 (cambio de m arco) , inserción ad iciona l de 1 base corriente abajo ; N B65051 , supresión de 4 pares de bases después del nucleótido 322 (cam bio de m arco) ; N B65063 , sustitució n de C252T (paro) . Descripción Detallada de la Invención Todas las solicitudes de patente, patentes, y referencias de la literatura citadas en la presente, se incorporan a la presente como referencia en su totalidad . A menos q ue se informe de otra manera, los siguientes términos se utilizan en la memoria descri ptiva , y tienen los siguientes sig nificados. El término "cicloalcano" o "cicloalquilo" contiene de 3 a 7 átomos de carbono del anillo, y es, por ejemplo, ciclopropilo, ciclobutilo , ciclopentilo, y ciciohexilo. El término "alquilo" se refiere a los grupos alifáticos saturados o insaturados , tales como alquenilo o alquinilo, cicloalquilo, o alq uilo sustituido, incluyendo los grupos de cadena recta, de cadena ramificada , y cíclicos que tienen de 1 a 10 átomos de carbono. De preferencia, "alquilo" o "alk" , siempre que se presente, es un grupo alifático saturado o cicloalquilo, más preferiblemente alquilo de 1 a 7 átomos de carbono, en particular alquilo de 1 a 4 átomos de carbono. Los ejemplos de "alquilo" o "alk" incluyen, pero no se limitan a, metilo, etilo, propilo normal, isopropilo, butilo normal , isobutilo, butilo secundario, butilo terciario, pentilo normal , neopentilo, hexilo normal , o heptilo normal , ciclopropilo, y en especial butilo normal . El término "alquilo sustituido" se refiere a un grupo alquilo q ue está sustituido con uno o más sustituyentes, de preferencia 1 a 3 sustituyentes, incluyendo, pero no limitándose a, sustituyentes tales como halógeno, alcoxilo inferior, hidroxilo, mercapto, carboxilo, cicloalquilo, arilo, heteroarilo, y similares. Los ejemplos de los grupos alquilo sustituidos incluyen, pero no se limitan a, -CF3, -CF2-CF3, hidroxí-metilo, 1- ó 2-hidroxi-etilo, metoxi-metilo, 1- ó 2-etoxi-etilo, carboxi-metilo,1- ó 2-carboxi-etilo, y similares. El término "arilo" o "Ar", se refiere a un grupo carbocíclico aromático de 6 a 14 átomos de carbono, que tiene un solo anillo, incluyendo, pero no limitándose a, los grupos tales como fenilo; o anillos condensados múltiples, incluyendo, pero no limitándose a, los grupos tales como naftilo o antrilo; y es especialmente fenilo. El término "heteroarilo" o "HetAr" se refiere a un heterociclo aromático monocíclico de 4 a 7 miembros, o a un biciclo que está compuesto de 4 a 7 miembros, heterociclo aromático monocíclico, y un anillo de benceno fusionado. El heteroarilo tiene cuando menos un heteroátomo, de preferencia 1 ó 2 heteroátomos, incluyendo, pero no limitándose a, los heteroátomos tales como N, O, y S, dentro del anillo. Un grupo heteroarilo preferido es piridinilo, pirimidinilo, o benzodioxolanilo. El arilo o heteroarilo puede estar insustituido o sustituido por uno o más sustituyentes, incluyendo, pero no limitándose a, alquilo de 1 a 7 átomos de carbono, en particular alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, tal como metilo, hidroxilo, alcoxilo, acilo, aciloxilo, SCN, halógeno, ciano, nitro, tioalcoxilo, fenilo, hetero-alquil-arilo, alquil- sulfonilo, y formilo. El término "carbonil-amina", como se utiliza en la presente, se refiere a un grupo -NHC(O)-, en donde la porción de amino del grupo está enlazada al arilo/heteroarilo, y la porción de carbonilo del grupo está enlazada al azaciclo4-7alcano, tiazaciclo4.7alcano, ó imidazaciclo -7alcano. El término "hetero-alquilo" se refiere a alquilo de 1 a 10 átomos de carbono saturado o insaturado como se define anteriormente, y en especial heteroalquilo de 1 a 4 átomos de carbono, el cual contiene uno o más heteroátomos, como parte de las cadenas principales, ramificadas, o cíclicas del grupo. Los heteroátomos se pueden seleccionar independientemente a partir del grupo que consiste en -NR-, en donde R es hidrógeno o alquilo, -S-, -O-, y -P-; de preferencia -NR-, en donde R es hidrógeno o alquilo; y/u -O-. Los grupos heteroalquilo pueden estar unidos al resto de la molécula, ya sea en un heteroátomo (si está disponible una valencia), o bien en un átomo de carbono. Los ejemplos de los grupos heteroalquilo incluyen, pero no se limitan a, los grupos tales como -O-CH3, -CH2-O-CH3, -CH2-CH2-O-CH3, -S-CH2-CH2-CH3-, -CH2-CH(CH3)-S-CH3, y -CH2-CH2-NH-CH2-CH2-. El grupo heteroaralquilo puede estar insustituido o sustituido con uno o más sustituyentes, de preferencia de 1 a 3 sustituyentes, incluyendo, pero no limitándose a, alquilo, halógeno, alcoxilo, hidroxilo, mercapto, carboxilo, y en especial fenilo. Los heteroátomos, así como los átomos de carbono del grupo, pueden estar sustituidos. Los heteroátomos también pueden estar en una forma oxidada. El término "alcoxilo", como se utiliza en la presente, se refiere a un alquilo de 1 a 10 átomos de carbono enlazado con un átomo de oxígeno, o de preferencia alcoxilo de 1 a 7 átomos de carbono, más preferiblemente alcoxilo de 1 a 4 átomos de carbono. Los ejemplos de los grupos alcoxilo incluyen, pero no se limitan a, los grupos tales como metoxilo, etoxilo, butoxilo normal, butoxilo terciario, y aliloxilo.

El término "acilo", como se utiliza en la presente, se refiere al grupo -(O)-CR, en donde R es alquilo, en especial alquilo de 1 a 7 átomos de carbono, tal como metilo. Los ejemplos de los grupos acilo incluyen, pero no se limitan a, acetilo, propanoílo, y butanoílo.

El término "aciloxilo", como se utiliza en la presente, se refiere al grupo -OC(O)R, en donde R es hidrógeno o alquilo, en especial alquilo de 1 a 7 átomos de carbono, tal como metilo o etilo; o fenilo o alquilo sustituido, como se definen anteriormente. El término "alcoxi-carbonilo", como se utiliza en la presente, se refiere al grupo -COOR, en donde R es alquilo, en especial alquilo de 1 a 7 átomos de carbono, tal como metilo o etilo. El término "halógeno" o "halo", como se utiliza en la presente, se refiere a cloro, bromo, flúor, yodo, y es en especial flúor. El término "tioalcoxilo", como se utiliza en la presente, significa un grupo -SR, en donde R es un alquilo, como se define anteriormente, por ejemplo tiometilo, tioetilo, tiopropilo, tiobutilo, y similares.

E l térm ino "hetero-alq u il-a rilo", com o se utiliza en la presente, sig n ifica u n g rupo heteroalq uilo , por ejem plo -O-C H 2- sustituido con un grupo arílo, en especial fenilo. El grupo fenilo mismo también puede estar sustituido con uno o más sustituyentes, tales como halógeno, en especial flúor y cloro; y alcoxilo, tal como metoxilo. El térmi no "alquil-sulfonilo" , como se utiliza en la presente, significa un grupo -SO2R, en donde R es alquilo, en especial alquilo de 1 a 7 átomos de carbono, tal como metil-sulfonilo. El término "susceptibilidad" , se refiere a la sensibilidad de una bacteria Gra m-positiva o Gram-negativa para la presencia de un inhi bidor de peptidil-desformilasa , dado a conocer en la presente. "Aumentar la susceptibilidad" de una bacteria al i nhibidor de peptidil-desformilasa, significa que la bacteria será inhibida por una concentración más baja del inhibidor de peptidil-desformilasa en el medio circundante a la bacteria . El término "bomba de eflujo" , como se utiliza en la presente, significa una bomba hecha de uno o más componentes de proteína localizados en la membrana celular de la bacteria , q ue transportan las moléculas de sustrato, por ejemplo antibióticos , hacia afuera de la bacteria. Algunas bombas de efl ujo en las bacterias Gram-negativas, as í como todas las bombas de eflujo de múltiples fármacos de las bacterias Gram-positivas, exportan los sustratos a través de una sola capa de membrana citoplásmica, y se componen de un componente, una prote ína transportadora localizada en la membrana citoplásmica. En las bacterias Gram-negativas, la mayoría de las bombas de eflujo de múltiples fármacos contienen tres componentes: una proteína transportadora localizada en la membrana citoplásmica (membrana interna), un canal de membrana externa, y una proteína enlazadora periplásmica que conecta a las dos. En esta configuración, la bomba de eflujo atraviesa las membranas interna y externa, y por lo tanto, exporta el sustrato desde el citoplasma o la membrana citoplásmica hacia el medio externo. Las proteínas transportadoras de las bombas de eflujo de tres componentes utilizan la fuerza motriz de protones para los sustratos de eflujo en intercambio por protones, y pertenecen a la superfamilia facilitadora mayor (MF), o a la familia de resistencia-nodulación-división (RND). El término "bomba de eflujo RND", como se utiliza en la presente, se refiere a una bomba de eflujo que posee una proteína transportadora que pertenece a la familia RND. La estructura predicha de la proteína transportadora RND contiene doce hélices transmembrana, pero también contiene dos dominios periplásmicos grandes entre las hélices transmembrana 1 y 2, y 7 y 8. Las bombas de eflujo RND son capaces de bombear hacia afuera un amplio intervalo de sustratos, incluyendo casi todos los antibióticos lipofílicos y anfifílicos; agentes quimioterapéuticos, inhibidores metabólicos, tales como cerulenina; tintes; detergentes, tales como SDS, Tritón X-100, y sales biliares; y solventes. Las bombas de eflujo RND homologas se encuentran, por ejemplo, en E. coli, P. aeruginosa, H. influenzae, y Neisseria gonorrhoeae.

El término "inhibidor de la bomba de eflujo", como se utiliza en la presente, se refiere a un compuesto que interfiere específicamente con la capacidad de una bomba de eflujo para transportar los sustratos, por ejemplo antibióticos. El término "tratamiento", como se utiliza en la presente, incluye, pero no se limita a, la prevención, reducción, y/o eliminación de los síntomas clínicos causados por una infección de un animal por una bacteria; la prevención, reducción, y/o eliminación de una infección de un animal por una bacteria; o la prevención, reducción, y/o eliminación de la contaminación de un animal por una bacteria. La bacteria involucrada es de preferencia una bacteria Gram-negativa, y el animal es de preferencia un mamífero. El término "mamífero", como se utiliza en la presente, incluye seres humanos y otros primates, ratones, ratas, ovejas, reses, caballos, perros, cerdos, gatos, y otras especies. El término "cantidad efectiva", como se utiliza en la presente, significa las cantidades individuales de un inhibidor de la peptidil-desformilasa y un inhibidor de la bomba de eflujo, que, cuando se utilizan en combinación, para tratar una infección bacteriana en un animal, o para mejorarla susceptibilidad de la bacteria al inhibidor de la peptidil-desformilasa, es suficiente para inhibir la peptidil-desformilasa. La cantidad efectiva variará dependiendo del inhibidor de peptidil-desformilasa particular y del inhibidor de la bomba de eflujo utilizados, de la bacteria particular involucrada, de la edad, peso, sexo, y condición médica del animal, del tipo y severidad de la infección, y de la vía de administración, pero, no obstante, puede ser fácilmente determinada por un experto en la materia. La cantidad efectiva de un inhibidor de la peptidil-desformilasa necesaria para ser completamente eficaz en el tratamiento de una infección bacteriana, o para aumentar la susceptibilidad de la bacteria, es mucho más baja que la que se necesitaría si se administrara el inhibidor de la peptidil-desformilasa sin el inhibidor de la bomba de eflujo. El término "vehículo farmacéuticamente aceptable", como se utiliza en la presente, significa un excipiente que es útil en la preparación de una composición farmacéutica que es en general seguro, no tóxico, y no es biológicamente ni de otra manera indeseable, e incluye un excipiente que sea aceptable para uso veterinario y para uso humano. Un "vehículo farmacéuticamente aceptable", como se utiliza en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones, incluye tanto uno como más de uno de estos vehículos. La presente invención se refiere en general a los inhibidores de la peptidil-desformilasa, y al descubrimiento de que, en las bacterias, particularmente en las bacterias Gram-negativas, tales como H. influenzae, E. coli, Bacillus subtilus, Klebsiella pneumoniae, P. aeruginosa, y Neisseria gonorrhoeae, la inactivación de los genes que codifican para los componentes de una bomba de eflujo RND, aumenta de una manera significativa la susceptibilidad de las bacterias a los inhibidores de peptidil-desformilasa. También se ha observad o q ue la inactivació n del gen q ue cod ifiq ue u na proteína represora q ue in h iba la expresión de una bom ba de eflujo R N D en las bacterias G ram-neg ativas, tales co m o H. influenzae, disminuye la susceptibilidad de las bacterias a los inhibidores de peptidil-desformilasa dados a conocer. Estos descubrimientos, combinados con otra evidencia q ue se encuentra más adelante (ver los Ejemplos) , indican que las bombas de eflujo, en particular las bombas de eflujo RN D, tienen un importante papel en la creación de la resistencia intrínseca de las bacterias, particularmente las bacterias Gra m-negativas, a los inhibidores de la peptidil-desformilasa . Estos descubrimientos ind ican además que la inhibición de una bomba de eflujo en las bacterias, puede mejorar la susceptibilidad de las bacterias, en particular de las bacterias Gram-negativas, a los inhibidores de la peptidil-desformilasa . Para este fin, la presente invención se refiere al uso de un inhibidor de la peptidil-desformilasa como se describe más adelante, en combinación con un inhibidor de la bomba de eflujo, con el objeto de tratar infecciones bacterianas en animales, en particular en seres humanos y otros mamíferos, y para aumentar la susceptibilidad de las bacterias a un inhibidor de la peptidil-desformilasa. La presente invención también se refiere a composiciones farmacéuticas q ue comprenden la combinación de u n inhibidor de la peptidil-desformilasa y un i nhibidor de la bomba de eflujo. El término "inhibidores de peptidil-desformilasa" , como se utiliza en la presente, se refiere a los compuestos de la Fórmula (I): en donde: X es -CH2-, -S-, -CH(OH)-, -CH(OR)-, -CH (SH)-, -CH(SR)-, -CF2-, -C=N (OR)- ó -CH(F)-, en donde R es alquilo; Ri es arilo o heteroarilo; cada uno de R2, R3, R4, y Rs es independientemente hidrógeno o alquilo, o R2 ó R3, y R4 ó R5, colectivamente, forman un cicloalquilo de 4 a 7 átomos de carbono; y n es de 0 a 3, en el entendido de q ue, cuando n es 0, X es -CH2-, o una sal de los mismos, o un pro-fármaco de los mismos. En una modalidad , R, es un heteroarilo de la Fórmula (I I) : en donde cada uno de R6, R7 l R8, y R9 es independ ientemente hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, hidroxilo, alcoxilo, acilo, aciloxilo, SCN , halógeno, ciano, nitro, tioalcoxilo, fenilo, heteroalquil-arilo, alquil-sulfonilo, o formilo. En otra modalidad, Ri es de preferencia un heteroarilo de la Fórm u la (11.1 ) : en donde R6, R7, Re, y R. son como se describen anteriormente para la Fórmula (I I) , por ejemplo, en donde: a) R6 es nitro, alquilo, alquilo sustituido, fenilo, hidroxilo, formilo, heteroalquil-arilo, alcoxilo, acilo, o aciloxilo, de preferencia alquilo, en especial alquilo de 1 a 7 átomos de carbono, hidroxilo, o alcoxilo, especial mente un alcoxilo de 1 a 7 átomos de carbono; y R7, Re, y Rs son hid rógeno, b) Re, Re, y Rg son hidrógeno; y R7 es alquilo, alquilo sustituido, fenilo, halógeno, alcoxilo, o ciano (de preferencia alq uilo, en especial alquilo de 1 a 7 átomos de carbono) , alq uilo sustituido (en especial alq uilo de 1 a 7 átomos de carbono sustituido, tal como -CF3) , o alcoxi lo (especialmente alcoxilo de 1 a 7 átomos de carbono) , ó c) R6, R7, y R9 son hidrógeno; y R8 es alquilo, alquilo sustituido, halógeno, nitro, ciano, tioalcoxilo , aciloxilo, fenilo, alq uil-sulfonilo, o carboxi-alquilo (de preferencia alquilo, en especial alquilo de 1 a 7 átomos de carbono) , alquilo sustituido (en especial -CF3), halógeno, o carboxi-alquilo, o d) Re, R7, y Re son hidrógeno; y R9 es alqui lo, halógeno, o hidroxilo , o e) R7 y R9 son hidrógeno; y cada uno de R6 y R8 es independientemente halógeno, alquilo, alquilo sustituido, fenilo, o ciano, o f) cada uno de R7 y R9 es alq uilo o alqui lo sustituido; y R6 y R8 son hidrógeno, o g) R6 y R9 son hidrógeno; R7 es alquilo o alquilo sustituido; y R8 es nitro, o h) R8 y R9 son hidrógeno; Re es ciano; y R7 es alcoxilo, o i) R7 y Re son hidrógeno; y R6 es alquilo, alquilo sustituido, alcoxilo, ó SCN ; y R9 es alquilo o alquilo sustituido, o j) Re y R7 son hidrógeno; R8 es nitro o halógeno; y R9 es alquilo o alquilo sustituido, o k) R6, R7, Re, y R9 son hidrógeno, o I) R6 y R7, junto con los átomos de carbono con los q ue están unidos, forman un grupo fenilo, de preferencia sustituido con hidroxilo; y R8 y R9 son hidrógeno, o m) R6 y R7 son hidrógeno; y R8 y R9, junto con los átomos de carbono con los que están unidos, forman un grupo fenilo, o n) n es 0, ó o) n es 0; y cada uno de R6, R7, Re, y Rg es independientemente hidrógeno, alquilo, o halógeno, y más particularmente R6, R7, R8, y R9 son hidrógeno, o p) n es 0; Re, Re, y R9 son hidrógeno; y R7 es alquilo, o q) n es 0; Re, R7, y R9 son hidrógeno; y R8 es alquilo o halógeno. En otra modalidad, R, es de la Fórmula (II.2): en donde: Re, R7, Re, y R9 son como se definen anteriormente para la Fórmula (II), en particular R7 y R8, junto con los átomos de carbono con los que están unidos, forman un grupo fenilo; y R6 y Rg son hidrógeno. En todavía otra modalidad, R, es de la Fórmula (lll): en d onde: cada uno de R6, R7, Re, y R9 es independientemente hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido , fenilo, halógeno, hidroxilo, o alcoxilo, por ejemplo, en donde: a) Re y Re son hidrógeno; R9 es hidrógeno o alquilo; y R7 es alquilo, alquilo sustituido, o fenilo, o b) R6, R7, y R9 son hid rógeno; y R8 es halógeno, alq uilo, o alquilo sustituido, o c) R7, R8, y Rg son hid rógeno; y R6 es hidroxilo. En una modalidad particularmente útil , el heteroarilo es de la Fórmula (111.1 ): en donde R6, R7, R8, y Rg son como se definen anteriormente para la Fórmula (l l l ). En otra modalidad , R1 es un fenilo insustituido, o el fenilo está sustituido con alcoxilo, por ejemplo metoxi lo; o ariloxilo, por ejemplo fenoxilo. En una modalidad particularmente útil , el compuesto de la Fórmula (111. 1 ) es: E n otra m odalid ad , R es de la Fórmula (IV) : £Üí ( IV) en donde cada uno de R10 y Rn es independientemente hidrógeno o halógeno, en particular R10 y Rn son ambos hidrógeno o son ambos halógeno. Se apreciará que los compuestos de la Fórmula (I) pueden existir en la forma de isómeros ópticos, racematos, o diaestereoisómeros . Por ejemplo, un compuesto de la Fórmula (I) , en donde R2 y R3 son residuos diferentes, o en donde R4 y R5 son residuos diferentes, es asimétrico, y puede tener la configuración R ó S. Se debe entender que los compuestos de la Fórmula (I) abarcan todos los enantiómeros y sus mezclas. Se apl ican consideraciones similares en relación a los materiales de partida que exhiban átomos de carbono asimétricos como se mencionan . Los compuestos de la Fórmula (I ) pueden existir en forma libre o en forma de sal , por ejemplo en la forma de una sal farmacéuticamente aceptable. U na "sal farmacéuticamente aceptable" de un compuesto, significa una sal fisiológicamente y farmacéuticamente aceptable que posea la actividad farmacológica deseada del compuesto progenitor, y que no imparta efectos toxicológicos indeseados. Estas sales incluyen: (1) Sales de adición de ácido formadas con ácidos inorgánicos, tales como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico, y similares; o formadas con ácidos orgánicos, tales como ácido acético, ácido propiónico, ácido hexanoico, ácido ciclopentan-propiónico, ácido glicólico, ácido pirúvico, ácido láctico, ácido malónico, ácido succínico, ácido málico, ácido maleico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido benzoico, ácido 3-(4-hidroxi-benzoil)-benzoico, ácido cinámico, ácido mandélico, ácido metan-sulfónico, ácido etan-sulfónico, ácido 1,2-etan-disulfónico, ácido 2-hidroxi-etan-sulfónico, ácido bencen-sulfónico, ácido 4-cloro-bencen-sulfónico, ácido 2-naftalen-sulfónico, ácido 4-toluen-sulfónico, ácido canfor-sulfónico, ácido 3-fenil-propíónico, ácido trimetil-acético, ácido ter-butil-acético, ácido la u ri I-sulfúrico, ácido glucónico, ácido glutámico, ácido hidroxi-naftoico, ácido salicílico, ácido esteárico, ácido mucónico, y similares; y (2) Sales formadas cuando un protón ácido presente en el compuesto progenitor es reemplazado por un ion de metal, por ejemplo un ion de metal alcalino, un ¡on alcalinotérreo, o un ion de aluminio; o bien se coordina con una base orgánica, tal como etanolamina, dietanol-amina, trietanol-amina, trometamina, N-metil-glucamina, y similares.

Los compuestos de la Fórmula (I) pueden actuar como un profármaco. Un "pro-fármaco" significa cualquier compuesto que libere un fármaco progenitor activo de acuerdo con la Fórmula (I) in vivo, cuando este pro-fármaco se administre a un sujeto mamífero. Los pro-fármacos de un compuesto de la Fórmula (I) se preparan mediante la modificación de los grupos funcionales presentes en el compuesto de la Fórmula (I), de tal manera que las modificaciones se puedan disociar in vivo para liberar el compuesto progenitor. Los pro-fármacos incluyen los compuestos de la Fórmula (I), en donde un grupo hidroxilo, amíno, o sulfhidrilo está enlazado a cualquier grupo que se pueda disociar in vivo para regenerar el grupo hidroxilo, amino, o sulfhidrilo libre, respectivamente. Los ejemplos de los profármacos incluyen, pero no se limitan a, esteres, por ejemplo derivados de acetato, formato, y benzoato; carbamatos, por ejemplo N,N-dimetil-amino-carbonilo; de grupos hidroxi-funcionales en los compuestos de la Fórmula (I), y similares. Los compuestos de la Fórmula (I) se pueden obtener mediante los métodos de química sintética conocidos por los expertos en este campo, y como se describen, por ejemplo, en la Publicación Internacional Número WO02/102790 A1. En un aspecto, la presente invención proporciona un método para el tratamiento de infecciones bacterianas, en particular infecciones bacterianas Gram-negativas, en un animal, de preferencia un mamífero. El método incluye administrar una cantidad efectiva de un inhibidor de peptidil-desformilasa, es decir, un compuesto abarcado por la Fórmula (I), o una sal del mismo o un pro-fármaco del mismo, y un inhibidor de la bomba de eflujo. La combinación de un inhibidor de peptidil-desformilasa y un inhibidor de eflujo, aumenta la susceptibilidad de la bacteria Gram-negativa para el inhibidor de la peptidil-desformilasa. De conformidad con lo anterior, en la utilización de la combinación del inhibidor de la peptidil-desformilasa y el inhibidor de la bomba de eflujo, una infección Gram-negatíva causada por un bacterias que sean resistentes, es decir, que tengan una menor susceptibilidad, a un inhibidor de peptidíl-desformilasa particular, en ausencia del inhibidor de la bomba de eflujo, se puede tratar con ese inhibidor de peptidil-desformilasa particular. En adición, las infecciones Gram-negativas en donde las bacterias sean susceptibles a los inhibidores de peptidil-desformilasa en ausencia de un inhibidor de eflujo, se pueden tratar utilizando dosificaciones más bajas del inhibidor de peptidil-desformilasa, mitigando de esta manera el riesgo de los efectos secundarios que puedan presentarse por la utilización de altas dosificaciones del inhibidor de peptidil-desformilasa. Como se mencionó anteriormente, la mayoría de las bacterias Gram-negativas poseen una bomba de eflujo de tres componentes que consiste en una proteína transportadora localizada en la membrana citoplásmica (membrana interna), un canal de la membrana externa, y una proteína enlazadora periplásmica que conecta a las dos. Ver Nikaido (1996), supra; Nikaido, Clin. Infecí. Dis., Volumen 27 (Suplemento 1), páginas S32-S41 (1998); y Zgurskaya y Nikaido, Mol. Microbiol. Volumen 37, Número 2, páginas 219-225 (2000). En esta configuración, la bomba de eflujo atraviesa las membranas interna y externa, y por consiguiente, exporta el sustrato, tal como un antibiótico, desde el citoplasma o la membrana citoplásmica hacia el medio externo. Ver Zgurskaya y Nikaido (2000), supra. Las proteínas transportadoras de las bombas de eflujo de tres componentes utilizan la fuerza motriz de protones para los sustratos de eflujo en intercambio por protones, y pertenecen a la superfamilia MF o a la familia RND. Ver Nikaido (1998), supra. En una modalidad, la infección bacteriana Gram-negativa que se vaya a tratar, es causada por bacterias Gram-negativas que poseen una bomba de eflujo RND. Como se mencionó anteriormente, el término "bomba de eflujo RND" se refiere a una bomba de eflujo que posee una proteína transportadora que pertenece a la familia RND, la cual incluye, en adición, un transportador supuesto de moléculas de señales de nodulación en Rhizobium. Ver Saier y colaboradores, FASEB J., Volumen 12, páginas 265-274 (1998); y Saier y colaboradores, Mol. Microbiol. Volumen 11, páginas 841-847 (1994). Todos los miembros de la familia de la bomba de eflujo RND tienen estructuras similares. Su estructura propuesta contiene 12 hélices transmembrana, y también contiene dos dominios periplásmicos grandes entre las hélices transmembrana 1 y 2, y 7 y 8. Ver Nikaido (1998), supra; y Zgurskaya y Nikaido (2000), supra. Las bombas de eflujo RND son capaces de bombear hacia afuera un gran número de sustratos, incluyendo casi todos los antibióticos lipofílicos y anfífílicos; agentes quimioterapéuticos; inhibidores metabólicos, tales como cerulenina; tintes; detergentes, tales como SDS, Tritón X-100, y sales biliares; y solventes. Ver Nikaido, Curr. Opin Microbiol. (1998), supra; y Nikaido (1996), supra. La mayor parte de los transportadores de eflujo que median la resistencia a los antibióticos clínicamente relevantes, son miembros de la familia RND. Ver Saier y colaboradores, FASEB J. (1998), supra. Las bacterias Gram-negativas que poseen una bomba de eflujo RND incluyen, pero no se limitan a, Serraíia marcescens, E. coli, Moraxella cafarrhalis, Bacillus subíilus, Klebsiella pneumoniae, P. aeruginosa, H. influenzae, Neisseria gonorrhoeae, Burholderia cepacia, Burkholderia pseudomallei, Stenotrophomonas malfophilia, Acinetobacter baumannii (A. baumannii) y Pseudomonas putida. Las bombas de eflujo RND homologas se pueden encontrar en las bacterias Gram-negativas, tales como E. coli, P. aeruginosa, H. influenzae, y Neisseria gonorrhoeae. Ver Nikaido, Curr. Opin. Microbiol. (1998), supra. En una modalidad útil particular, las bacterias Gram-negativas que poseen una bomba RND son H. influenzae. En las modalidades particularmente útiles del método para el tratamiento de una infección por bacterias Gram-negativas, el compuesto de la Fórmula (I) es: Los inhibidores de la bomba de eflujo específicos para bombas de eflujo, en particular bombas de eflujo RN D, en las bacterias Gram-negativas, son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, la Patente de los Estados U nidos de Norteamérica Número 6, 1 14, 310 describe una clase genérica de inhibidores dipeptíd icos de bomba de eflujo que potencian la actividad de un amplio rango de antibióticos contra una variedad de bacterias Gram-negativas. U n ejemplo de un inhibidor de la bomba de eflujo dipeptídico dentro de esta clase genérica es MC-04, 124, que tiene la estructura: que se ha demostrado que inhibe las bombas de eflujo RN D, y que potencia la actividad de varios antibióticos contra una variedad de bacterias Gram-negativas, tales como E. coli, Klebsiella pneumoniae, P. aeruginosa, H. influenzae, y A. Baumannii. Ver Cho y colaboradores, 40th ICAAC (2000) y Watkins y colaboradores, Bioorgan. Med. Chem. Lett., Volumen 13, páginas 4241-4244 (2003). Otros ejemplos de inhibidores de la bomba de eflujo RND que potencian la actividad de los antibióticos contra las bacterias Gram-negativas incluyen al inhibidor dipeptídico, MC-207,110, que tiene la estructura: como se describe en Renau y colaboradores, J. Med. Chem. Volumen 42, páginas 4928-4931 (1999); y Lomovskaya y colaboradores, Antimicrob. Agents Chem., Volumen 45, Número 1, páginas 105-116 (1991), y el inhibidor dipeptídico, MC-002,595, que tiene la estructura: como se describe en Lomovskaya y colaboradores, Antimicrob. Agents Chem. (1991), supra. Otro ejemplo de inhibidores de la bomba de eflujo RND que potencian la actividad de los agentes antibacterianos de oxazolídinona contra las bacterias Gram-negativas, son los derivados de arginina descrito en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 6,251,869. Todavía otro ejemplo de inhibidores de la bomba de eflujo específicos para la bomba de eflujo RND en las bacterias Gram-negativas, tales como P. aeruginosa, son los sulfatos de las toenastatinas A y B producidos por un actinomiceto, por ejemplo MF-EA-371a que tiene la estructura: y MF-EA-3715 que tiene la estructura: com o se d escribe en Lee y colaboradores (2000) , 40th ICAA C (2000) . Para el tratamiento de una infección bacteriana Gram-negativa en seres humanos y otros animales, en particular en seres humanos y otros mamíferos, que hayan sido diagnosticados por tener una infección bacteriana Gram-negativa, se puede administrar un inhi bidor de la peptidil-desformilasa y un inhibidor de la bomba de eflujo, o composiciones farmacéuticas de los mismos, mediante cualquier vía convencional , por ejemplo localmente o sistémicamente, por ejemplo oral mente, tópicamente, parenteralmente, subdérmicamente, o medíante inhalación . La vía seleccionada dependerá del tipo, severidad , y localización de la infección , y del tipo de bacteria que esté causando la infección. La dosificación req uerida del inhi bidor de peptid il-desformilasa para alcanzar una "cantidad efectiva" , por supuesto, dependerá de diferentes factores, como se describe anteriormente, por ejemplo del modo de administración, del tipo y severidad de la infección que se vaya a tratar, y del efecto deseado. En general, una cantidad de dosificación efectiva, por ejemplo para tratamiento humano, estará en el intervalo, por ejemplo, de aproximadamente 1 a 3,000 miligramos al d ía , por ejemplo 1 , 500 miligramos al d ía, dependiendo de la vía y de la frecuencia de administración . Esta dosificación corresponde a de aproximadamente 0.01 5 a 50 miligramos/kilogramo de peso corporal al d ía. Adecuadamente, la dosificación es, por ejemplo, de aproximadamente 5 a 20 miligramos/kilog ramo de peso corporal al d ía.

La cantidad de un inhibidor de la bomba de eflujo particular que se vaya a utilizar dependerá de diferentes factores, por ejemplo del tipo de bacteria Gram-negativa, de la susceptibilidad de la bacteria Gram-negativa al inhibidor de peptidil-desformilasa particular, y de la absorción por parte del animal que se esté tratando. Se deben emplear cantidades suficientes del inhibidor de la bomba de eflujo para hacer que la bacteria Gram-negativa sea susceptible a un nivel farmacéuticamente aceptable del inhibidor de peptidil-desformilasa en el animal tratado. La cantidad suficiente de un inhibidor de la bomba de eflujo particular puede ser fácilmente determinada mediante la prueba de la concentración inhibidora mínima (MIC) del inhibidor de peptidil-desformilasa, y comparando la concentración inhibidora mínima de ese inhibidor de peptidil-desformilasa solo, con la concentración inhibidora mínima de ese inhibidor de peptidil-desformilasa utilizado en combinación con el inhibidor de la bomba de eflujo. En términos generales, la proporción molar de un inhibidor de la bomba de eflujo a un inhibidor de peptidil-desformilasa que se administre es de aproximadamente 0.01 a 10. Adecuadamente, la proporción molar es de aproximadamente 0.1 a 1.0. De conformidad con lo anterior, la dosificación diaria de un inhibidor de la bomba de eflujo para el tratamiento de una infección bacteriana Gram-negativa en un animal puede estar en el intervalo de aproximadamente 0.0015 a 5 miligramos/kilogramo de peso corporal al día. De una manera adecuada, la dosificación diaria es de aproximadamente 0.5 a 2 miligramos/kilogramo de peso corporal al día. El inhibidor de la bomba de eflujo se puede administrar antes de que se administre el inhibidor de la peptidil-desformilasa, o se puede administrar simultáneamente con el inhibidor de la peptidil-desformilasa. En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para aumentar la susceptibilidad de las bacterias Gram-negativas a un inhibidor de la peptidíl-desformilasa, el cual comprende poner en contacto las bacterias con un inhibidor de la peptidil-desformilasa y un inhibidor de la bomba de eflujo, en una cantidad efectiva para inhibir una bomba de eflujo en las bacterias Gram-negativas. El método mejora la efectividad del inhibidor de la peptidil-desformilasa contra las células bacterianas Gram-negativas que expresen una bomba de eflujo cuando sean tratadas con la combinación de un inhibidor de la peptidil-desformilasa y un inhibidor de la bomba de eflujo. En una modalidad del método para aumentar la susceptibilidad de una bacteria Gram-negativa a un inhibidor de la peptidil-desformilasa, la infección bacteriana Gram-negativa es causada por una bacteria Gram-negativa que posea una bomba de eflujo RND, por ejemplo Serrada marcescens, E. coli, Moraxella catarrhalis, Bacillus subtilus, Klebsiella pneumoniae, P. aeruginosa, H. influenzae, Neisseria gonorrhoeae, Burholderia cepacia, Burkholderia pseudomallei, Stenotrophomonas maltophilia, Acinetobacter baumannii y Pseudomonas putida. En una modalidad adicional, la bacteria Gram-negativa que posea una bomba de eflujo RND, incluye E. coli, P. aeruginosa, H. influenzae, y Neisseria gonorrhoeae. En u na m odalid ad particu la rmente útil , la bacteria G ram-neg ativa q ue posee u na bom ba d e eflujo R N D , es H. influenzae. Los inhibidores de la peptidil-desformilasa y los inhibidores de la bomba de eflujo particularmente útiles que se pueden utilizar en este método, son como se describen anteriormente. Se puede evaluar la eficacia de un in hibidor de la bomba de eflujo particular para aumentar la susceptibilidad de las bacterias Gram-negativas a un inhibidor de la peptid il-desformilasa particular, por ejemplo, in vitro, utilizando el método de tablero de ajedrez descrito en Lorian , editor, Antibiotics in Laboratory Medicine, 3a Edición, página 432, Williams & Wilkins, Baltimore, M D. En un aspecto adicional, la presente i nvención proporciona composiciones farmacéuticas efectivas para el tratamiento de una infección bacteriana, en particular una infección bacteriana Gram-negativa, en un animal, por ejemplo en un mam ífero. La composición incluye un inhibidor de la peptidil-desformilasa y un inhibidor de la bomba de eflujo, como se describen anteriormente, y un veh ículo farmacéuticamente aceptable. Las composiciones pueden estar en cualquier forma conocida en la técnica , incluyendo, pero no limitándose a, tabletas, cápsulas, obleas , fusiones rápidas (sin obleas) , polvos, granulos, grageas, cremas, o preparaciones l íquidas, tales como sol uciones o suspensiones orales o parenterales estériles. El inhibidor de la peptidil-desformilasa y el inhibidor de la bomba de eflujo también se pueden administrar en formulaciones liposomales, micelares, o en microemulsión. El inhibidor de la peptidil-desformilasa presente en la composición, también se puede administrar como pro-fármaco, en donde el pro-fármaco administrado sufra biotransformación en el mamífero tratado hasta una forma que sea biológicamente activa. Las formulaciones tópicas de la presente invención se pueden presentar como, es decir, ungüentos, cremas o lociones; soluciones; pócimas; emulsiones; emplastes, ungüentos para los ojos o gotas para los ojos o para los oídos; parches impregnados; parches transdérmicos; rocíos y aerosoles; y pueden contener aditivos convencionales apropiados, tales como conservadores; solventes para ayudar a la penetración del fármaco; y emolientes en los ungüentos y cremas. Las formulaciones también pueden contener vehículos convencionales compatibles, tales como bases de crema o de ungüento, y etanol; o alcohol oleílico para las lociones. Estos vehículos pueden estar presentes, por ejemplo, de aproximadamente el 1 por ciento hasta aproximadamente el 99 por ciento de la formulación. Por ejemplo, pueden formar hasta aproximadamente el 80 por ciento de la formulación. Las tabletas y cápsulas para administración oral pueden estar en una forma de presentación de dosis unitaria, y pueden contener excipientes convencionales, tales como agentes aglutinantes, por ejemplo jarabe, acacia, gelatina, sorbitol, tragacanto, o polivinilpirrolidona; rellenos, por ejemplo lactosa, azúcar, almidón de maíz, fosfato de calcio, sorbitol, o glicina; lubricantes para la formación de tabletas, por ejemplo estearato de magnesio, talco, polietilenglicol, o sílice, desintegrantes, por ejemplo almidón de papa; o agentes humectantes aceptables, tales como lauril-sulfato de sodio. Las tabletas se pueden recubrir de acuerdo con los métodos bien conocidos en la práctica farmacéutica convencional. Las preparaciones líquidas orales pueden estar en la forma de, por ejemplo, suspensiones acuosas y oleosas, soluciones, emulsiones, jarabes, o elíxires, y se pueden presentar como un producto seco para reconstituirse con agua u otro vehículo adecuado antes de usarse. Estas preparaciones líquidas pueden contener aditivos convencionales, tales como agentes de suspensión, por ejemplo sorbitol, metil-celulosa, jarabe de glucosa, gelatina, hidroxi-etil-celulosa, carboxi-metil-celulosa, gel de estearato de aluminio o grasas comestibles hidrogenadas; agentes emulsionantes, por ejemplo lecitina, mono-oleato de sorbitán, o acacia; vehículos no acuosos (los cuales pueden incluir aceites comestibles), por ejemplo, aceite de almendra; esteres oleosos, tales como glicerina, propilenglicol, o alcohol etílico; conservadores, por ejemplo p-hidroxi-benzoato de metilo o de propilo, o ácido sórbico, y si se desea, agentes saborizantes o colorantes convencionales. Para la administración parenteral, las formas de dosificación unitaria fluidas se preparan utilizando el compuesto y un vehículo estéril, prefiriéndose agua. El inhibidor de la peptidil-desformilasa y el inhibidor de la bomba de eflujo, dependiendo del vehículo y de la concentración utilizada, se pueden suspender o disolver en el vehículo u otro solvente adecuado. En la preparación de soluciones, los inhibidores de la peptidil-desformilasa y de la bomba de eflujo se pueden disolver en agua para inyección, y se pueden esterilizar en filtro antes de rellenarse en un frasco o ampolleta adecuados, y de sellarse. De una manera conveniente, se pueden disolver en el vehículo agentes tales como agentes anestésicos locales, conservadores, y reguladores del pH. Con el fin de mejorar la estabilidad, la composición se puede congelar después de rellenarse en el frasco, y de removerse el agua al vacío. Entonces se sella en el frasco el polvo liofilizado seco, y se puede suministrar un frasco acompañante de agua para inyección con el fin de reconstituir el líquido antes de usarse. Las suspensiones parenterales se preparan sustancialmente de la misma manera, excepto que el inhibidor de la peptidil-desformilasa y el inhibidor de la bomba de eflujo se suspenden en el vehículo en lugar de disolverse, y no se puede llevar a cabo la esterilización mediante filtración. El inhibidor de la peptidil-desformilasa y de la bomba de eflujo se puede esterilizar mediante su exposición a óxido de etileno antes de suspenderse en el vehículo estéril. De una manera conveniente, se incluye un tensoactivo o agente humectante en la composición, para facilitar la distribución uniforme del compuesto. El inhibidor de la peptidil-desformilasa se puede administrar en forma libre o en forma de sal farmacéuticamente aceptable, por ejemplo como se indica anteriormente. Estas sales se pueden preparar de una manera convencional, y exhiben el mismo orden de actividad q ue los com puestos libres . Los sig uientes ejem plos sirven para ilustrar la invención , pero no limitan su alcance de ning una ma nera . EJEMPLOS Métodos y Materiales Cepas Bacterianas, Plásmidos, y Medios de Cultivo. Las cepas bacterianas y plásmidos utilizados en este estudio, se enlistan en la Tabla 1 que se encuentra más adela nte . Se utiliza caldo-L y ágar-L (Difco) para el crecim iento de rutina de Escherichia coli (E. coli). Se utilizan placas de ágar de chocolate (Remel) para el crecimiento de rutina de H. influenzae. Se utiliza caldo de infusión de cerebro-corazón (Remel) complementado con 10 microgramos/mililitro de ß-NAD (Fluka) y 1 0 microgramos/milMitro de solución de hemina/vitamína K (sBH I) (Remel) , para el cultivo en caldo l íquido de H. influenzae. Para la inducción de la competencia natural en H. influenzae, se induce un cambio nutricional hacia abajo utilizando un medio M-IV como se describe anteriormente. Ver Poke y Redfield , Methods Mol. Med. Volumen 71 , páginas 57-70 (2003). Se agrega kanamicina al medio de cultivo a 50 microgramos/mililitro (E. coli) , o a 5 microgramos/mililitro (H. influenzae).

Tabla 1. Cepas bacterianas y plásmidos utilizados en este estudio.

*Ver Fleschmann y colaboradores (1995), supra. **Ver Hoang, Karkhoff-Schweizer, Kutchma y Schweizer, Gene., Volumen 212, Número 1, páginas 77-86 (1998). Prueba de Susceptibilidad Antimicrobiana Las concentraciones inhibidoras mínimas del antibiótico y del sustrato se determinan mediante microdílución del caldo utilizando una dilución doble en HTM de acuerdo con el procedimiento establecido por el National Commíttee for Clinícal Laboratory Standards (NCCLS) (Comité Nacional para Normas de Laboratorios Clínicos). Ver NCCLS, la norma aprobada M7-A5, Wayne, PA (2003). Los inhibidores de la peptidíl-desformilasa se sintetizan en los Novartis Institutes para BioMedical Research, Cambridge, MA. Todos los antibióticos restantes se obtienen en Sigma (St. Louís, MO). Manipulaciones de ADN. Se aisla el ADN genómico de H. influenzae utilizando el kit de tejido Puregene de Gentra Systems Inc. (Minneapolis, MN), de acuerdo con las instrucciones. Se obtiene oligonucleótídos para la reacción en cadena de la polimerasa y la secuenciación en Genelink (Hawthome, NY), y se llevan a cabo las reacciones en cadena de la polimerasa utilizando el sistema de mezcla en un tubo Easystart de Molecular Bio-Products Inc. (San Diego, CA), de acuerdo con las instrucciones suministradas. El ADN genómico preparado o las células de las colonias aisladas, se utilizan como plantilla en las reacciones en cadena de la polimerasa. Se utilizan endonucleasas de restricción y enzimas modificadoras de acuerdo con las instrucciones suministradas con las enzimas. Los fragmentos de ADN se purifican o se aislan siguiendo la electroforesis en gel de agarosa, utilizando los kits de limpieza de reacción en cadena de la polimerasa o de extracción de gel QIAquick de Qiagen Inc. (Valencia, CA), como se especifica en las instrucciones. La secuencia de nucleótidos es realizada por Agencourt Inc. (Waltham, MA). Mutagénesis in vitro y Reemplazo Genético Con el fin de construir una eliminación genética de inserción del homólogo acrB en H. influenzae, se utilizan los cebadores acrBHIF (5'-CCACTTTAATGTATGAGGAAATCCG-3') (SEQ ID NO:1), y acrBHIR3 (5'-CGAATTACGTAAGATAACCTAAGTGCG-3') (SEQ ID NO:2), para generar un fragmento de reacción en cadena de la polimerasa de 3.1 kb que abarca al gen acrB, utilizando el ADN de plantilla genómico NB65001 de H. influenzae. Los productos de reacción en cadena de la polimerasa de acrB se ligan en PCR 2.1-Topo por Invitrogen (Carlsbad, CA), de acuerdo con las instrucciones proporcionadas con el kit, y luego se separa el fragmento de acrB utilizando EcoRI, y se liga en pEX18Tc. Entonces esta construcción se lineariza en el sitio Mfel único dentro del fragmento de acrB, con extremos romos con polimerasa de ADN T4, y se liga a un fragmento de reacción en cadena de la polimerasa romo de 1.2 kb que abarca al determinante de resistencia a la kanamicina TN903 generado a partir de pACYC177, utilizando los cebadores TN903KanF (5'-GCCACGTTGTGTCTCAAAATCTCTG-3') (SEQ ID NO:3) y TN903KanR (5'-CCAGTGTTACAACCAATTAACCAA-3') (SEQ ID NO:4), para dar el plásmido pCDBKm. Un fragmento de ADN de 177 pares de bases que contiene a la secuencia de absorción de ADN de H. influenzae, se amplifica mediante reacción en cadena de la polimerasa a partir del ADN genómico de NB65044, utilizando los cebadores anteriormente descritos. Ver Akerley y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, Volumen 99, Número 2, páginas 966-971 (2002). El producto se clona en PCR2.1-Topo por Invitrogen, de acuerdo con las instrucciones, y luego se separa con Kpnl, y se liga en el sitio Kpnl dentro del sitio de clonación múltiple de pCDBKm, para dar el pCDBKmUS. Se ha demostrado que la inclusión de la secuencia de absorción facilita el tener niveles mucho mayores de transformación, lo cual la hace útil para introducir el ADN en diferentes aislados que pueden no absorber de una manera eficiente el ADN lineal mediante la transformación natural. Ver Akerley y colaboradores (2002), supra. Con el fin de construir una eliminación genética de inserción del marco de lectura abierta (ORF) HI1462 (tolC) [ver Trepod y Mott, Antimicrob. Agents Chemother., Volumen 48, Número 4, páginas 1416-1418 (2004)], se utilizan los cebadores HI1462IF (5'-CACGCTTGCTTTGTTGATGTCTGGTGC-3') (SEQ ID NO:5), y HI1462IR (5'-TCCCGCCATTGAGCTATATACCGCA-3') (SEQ ID NO:6), para generar un fragmento de reacción en cadena de la polimerasa de 1.3 kb, que abarca la mayor parte del HI1462 a partir de la plantilla de ADN genómico de NB65001, y se liga directamente en PCR2.1-Topo, por Invitrogen, de acuerdo con las instrucciones. Entonces se recupera el inserto como un fragmento EcoRI, y se ligan en el sitio EcoRI de pBluescriptSK. Entonces se liga un determinan de resistencia a la kanamicina TN903, aislado a partir de pBAD18Tc como un fragmento Haell de 1.8 kb y de extremos romos con la polimerasa de ADN T4, en el sitio Mlul único dentro de HI1462, que se ha hecho de extremos romos, para generar el pCD14Km. Esta construcción tiene el determinan de resistencia a la kanamicina en la misma orientación que HI1462. Ver la Figura 1. Con el fin de construir una eliminación genética de inserción del ORF HI0893, un homólogo de acrR y un represor supuesto de la expresión de acrAB, se utilizan los cebadores acrRHIF2 (5'-TAATGATGAAAAGTGCGGTTAATT-3') (SEQ ID NO:7), y acrRHIR (5'-TTTCTGAATCGCACGCCAAGAGCGT) (SEQ ID NO:8), para generar un fragmento de reacción en cadena de la polimerasa de 752 pares de bases que abarca el ORF HI0893 a partir del ADN genómico de NB65001. Este fragmento de reacción en cadena de la polimerasa se liga en PCR 2.1-Topo, por Invitrogen, de acuerdo con las instrucciones proporcionadas con el kit, luego se separa como un fragmento EcoRI, y se clona en el pBluescriptSK cortado con EcoRl. Entonces la construcción se lineariza con Sful, y se liga a un fragmento de reacción en cadena de la polimerasa romo de 1.2 kb, que abarca al determinante de resistencia a la kanamicina TN903, generado a partir de CACYC177, utilizando los cebadores descritos anteriormente, para dar el plásmido pCDRKm. Con el fin de introducir las inserciones acrB::Km y acrR::Km en el genoma, se cultivan cepas de H. influenzae hasta la fase logarítmica temprana (OD6oo de aproximadamente 0.2) en sBHI, y se induce la competencia natural mediante el cambio nutricional hacia abajo en el medio M-IV, como es descrito por Poje y Redfield (2003), supra. Las células competentes se transforman con pCDBKmUS (linearizado con Xbal) ó pCDRKm (linearizado con Seal), como fue previamente descrito [ver Poje y Redfield (2003), supra], y se aplican sobre ágar de chocolate que contiene 5 microgramos/mililitro de kanamicina, para seleccionar las células que contengan el marcador de resistencia a la kanamicina sobre su genoma. Con el fin de introducir la inserción HI1462::Km en el genoma de la cepa NB65044, las células competentes se transforman con pCD14Km (linearizado con Seal), y se seleccionan sobre placas de ágar de chocolate, como se describe anteriormente. Con el objeto de introducir esta inserción en las cepas NB65027 y NB65051, las células receptoras se hacen competentes como se describe anteriormente, se transforman con el ADN genómico aislado a partir de la cepa NB65044-CDS0001 , y se seleccionan sobre placas de ágar de chocolate que contienen 5 microgramos/milílitro de kanamicina. Las inserciones se confirman mediante reacción en cadena de la polimerasa, y secuenciación de los fragmentos generados utilizando los cebadores que flanquean el sitio de inserción. Análisis de Reacción en Cadena de la Polimerasa de la Cepa Hiper-susceptible NB65062, y complementación de la supresión de acrA. Con el fin de obtener la región que abarca el gen acrA en la cepa NB65062, se utilizan los cebadores acrRHIFI (5'-GTGCGGTGCCACCGCAAGGACATA-3') (SEQ ID NO:9), y acrAHIR (5"-TGCAGGCTCTATTGCACCCACAATG-3') (SEQ ID NO:10), para generar un fragmento de reacción en cadena de la polimerasa a partir del ADN genómico de NB65062. Ver la Figura 2. El fragmento de purifica en gel, y se determina la secuencia de nucleótidos. Para la complementación del defecto de acrA, se utiliza el ADN genómico de NB65044, que contiene una bomba de acrAB funcional, con el fin de transformar el NB65062, utilizando el método de cambio nutricional hacia abajo descrito anteriormente. Las células transformadas se aplican sobre ágar de chocolate que contiene ya sea 4 microgramos/mililitro de LBM415, o bien 2 microgramos/mililitro de eritromicina, ambos sustratos de la bomba de eflujo de acrAB.

Ejemplo 1 Papel de la Bomba de acrAB en la Dism inución de la S usceptibi lidad I ntrínseca a LB M41 5. La inactivación por inserción de acrB en la cepa de laboratorio N B65044 (ver la Figura 1 ) , aumenta de una manera sig nificativa la susceptibilidad a LBM41 5, y se refleja en la concentración inhibidora m ínima de LBM41 5 que cae desde 4 mícrogramos/mililitro contra la cepa progenitora hasta 0.25 microgramos/mililitro contra el derivado deficiente en acrB, N B65044-CDS0001 . Ver la Tabla 2 más adelante. La inserción también aumenta la susceptibilidad a LBK61 1 , y al sustrato de bomba conocido de eritromicina [ver Sánchez, Pan, Vinas, y Nikaido (1997), supra], y más dramáticamente a otro macrólido (clindamici na) , mientras que no afecta de una manera significativa a la susceptibilidad al q ue no es sustrato de bomba [ver Sánchez, Pan, Vinas, y Níkaido ( 1 997) , supra], la tetraciclina. Ver la Tabla 2. Otro q ue no es sustrato de bomba conocido, el cloranfenicol, tampoco es afectado por la pérdida de acrB (no se muestran los datos) . Esto confirma que la bomba de acrAB de H. influenzae es un impulsor mayor de la susceptibilidad reducida a LBM415.

Tabla 2. Contribución de la bomba de eflujo de acrAB a la resistencia intrínseca a LBM415, LBK61 1 , y macrólidos en H. influenzae.

ERM = Eritromicina. CLD = Clindamicina. TET = Tetraciclina. N D = No se hizo. Anteriormente el eflujo se ha implicado en la mediación de niveles moderados de resistencia a macrólidos en aislados cl ínicos de H. influenzae, basándose en una falta relativa de acumulación de eritromicina radiomarcada en las cepas resistentes, comparándose con las cepas susceptibles, mientras que está asociado un alto nivel de resistencia a macrólidos con las mutaciones objetivas. Ver Peric, Bozdogan , Jacobs y Appelbaum (2003) , supra. Una pequeña proporción de cepas clínicas previamente exam in adas [ver Peric, Bozdogan , J acobs y Appelbaum (2003) , supra] tienen hiper-susceptibilídad a los macrólidos, y no acumulan la eritromicina radiomarcada , sugiriendo que carecen de una bomba de eflujo. También se observa que un peq ueño porcentaje de aislados son hiper-susceptibles tanto a los macrólidos como a los inhibidores de peptidil-desformilasa. Empleando el diagnóstico de reacción en cadena de la polimerasa , se obtienen fragmentos derivados de acrR, acrA, ó acrB, para varias de estas cepas (no se muestran los datos), sugiriendo que los genes de bomba están ampliamente distribuidos, inclusive en las cepas hiper-susceptibles. Sin embargo, para la cepa hiper-susceptíble N B65062 (ver la Tabla 2) , no se obtiene ningún producto de acrA, indicando que podría haber una supresión genómica. La generación de un frag mento de reacción en cadena de la polimerasa que abarq ue la región acrA utilizando cebadores de flanq ueo (ver la Figura 3), da como resultado un fragmento de un tamaño sustancialmente más pequeño que los 2 kb predichos. La secuenciación de nucleótidos del fragmento revela una supresión de 873 pares de bases (ver la Figura 3) , q ue da como resultado la pérdida de la mayor parte del acrA. La transformación de N B65062 con el ADN genómico de N B65044, q ue posee un locus de acrAB intacto, y la solución sobre ágar de chocolate q ue contiene LBM41 5 (4 microgramos/mililitro) o eritromicina (2 microgramos/mililitro), dan como resultado aislados con una menor susceptibilidad a a mbas clases de antibiótico, y ningún cambio en la susceptibilidad a las cepas que no son sustratos de bomba NB65062-CDS0038 y NB65044-CDS0039. Ver la Tabla 2. El análisis de electroforesis en gel de campo de impulso de los transformantes da patrones de restricción idénticos al de NB65062, mientras que la reacción en cadena de la polimerasa y la secuenciación revelan la restauración del acrA de longitud completa, confirmando que la hiper-susceptibilidad es en realidad el resultado de una falta de la bomba de acrAB en la cepa NB65062. Esto es consistente con el papel de la bomba de acrAB en la provisión de resistencia intrínseca a los inhibidores de peptidil-desformilasa y a los macrólidos, e implica que más que fracasar para adquirir la bomba de eflujo, como fue sugerido previamente [ver Peric, Mozdogan, Jacobs u Appelbaum (2003), supra], las cepas hiper-susceptibles a macrólidos y a LBM415 pueden resultar de la pérdida mutacional de los componentes de la bomba de eflujo. La secuenciación de los genes acrR a partir de estas cepas tampoco revela diferencia alguna de la cepa progenitora, indicando que tampoco se selecciona una mutación acrR durante la exposición ya sea a LBM415 ó a la eritromicina en las placas selectivas. Las cepas hiper-susceptibles restantes que dan los productos predichos de la reacción en cadena de la polimerasa para diferentes genes acr, pueden tener otras mutaciones obvias que comprometan la función de la bomba, pero esto todavía está por confirmarse. Dada la identificación de solamente una bomba de la familia RND en H. influenzae hasta la fecha, se podría esperar que sirve para una función importante en la sobrevivencia en la huésped humano, el único medio ambiente natural conocido para H. influenzae. La pérdida de esta bomba en ciertos aislados clínicos es curiosa, porque la bomba generalmente se mantiene en H. influenzae, pero aparentemente se puede perder en ciertos casos, sugiriendo que su papel no es indispensable. Ejemplo 2 Identificación del Componente de Membrana Externa de la Bomba de Eflujo del Homólogo acrAB. Habiendo confirmado que la bomba de acrAB es un importante contribuyente a la resistencia intrínseca tanto a los inhibidores de peptidil-desformilasa como a los macrólidos en H. influenzae, fue interesante identificar el componente de canal de membrana externo de la bomba para completar la arquitectura tripartita de las bombas. Las búsquedas de homologías de proteínas del genoma de H. influenzae utilizando el canal de membrana externa TolC que se asocia con acrAB en E. coli, revela una similitud significativa con el marco de lectura abierta HI1462 (valor de expectativa de 2.9 x 10"6). Es interesante que el componente oprM de la bomba de mexAB-oprM de P. aeruginosa produce un acoplamiento todavía más cercano a HI1462, con un valor de expectativa de 2.8 x 10"22, indicando que HI1462 es un buen candidato para el canal de membrana externa. De una manera consistente con esto, la inactivación de HI1462 (ver la Figura 1) en NB65044 de H. influenzae, aumenta la susceptibilidad a la eritromicina, a la clindamicina, y al LBM415, todos sustratos de la bomba de acrAB, mientras que no afecta a la susceptibilidad al que no es sustrato de bomba, tetraciclina, NB65044-CDS0022. Ver la Tabla 2. Recientemente, otro grupo [ver Trepod y Mott (2004), supra] también ha reportado la identificación de HI1462 como el canal de membrana externa para esta bomba. Los datos incluidos aquí, por consiguiente, apoyan este descubrimiento, y extiende el papel de este componente de canal en la mediación de la resistencia a LBM415. Es interesante que HI1462 muestra una identidad total sobre su codificación C-terminal hasta la mitad de otro marco de lectura abierta HI1340. A pesar de esta similitud, el claro impacto de perder HI1462 sobre la susceptibilidad específica a los sustratos de bomba, confirma su papel como el canal, tal vez con poca contribución clínicamente relevante de HI1340. Las diferencias entre HI1462 y HI1340 sobre sus porciones N-terminales pueden especificar las interacciones con diferentes bombas, cuando menos en NB65044. En realidad, hay un homólogo de bomba emrAB, HI0898 y HI0899, respectivamente, separado de la bomba acrAB solamente por un gen, ftsN, que podría funcionar con HI1340. La inactivación de la bomba emrAB en H. influenzae no afecta a la susceptibilidad a un amplio número de compuestos [Trepod y Mott (2004), supra], sugiriendo que esta bomba podría no extruir de una manera eficiente los antibióticos, lo cual es típico de las bombas de esa familia. Sin embargo, se inactiva en la presencia de la bomba acrAB, que puede extruir los compuestos preferencialmente sobre la bomba emrAB, y de esta manera, la ausencia de la bomba en este contexto podría no revelar su capacidad para bombear algunos o todos los sustratos probados. De una manera alternativa, HI1340 puede ser capaz de funcionar con la bomba acrAB, pero puede no expresarse de una manera significativa. El papel potencial de HI1340 como un componente de bomba de eflujo todavía está por determinarse. Ejemplo 3 acrAB y Susceptibilidad Reducida a los Inhibidores de Peptidil-desformilasa en Cepas Clínicas de H. influenzae La menor susceptibilidad a los antibióticos en los aislados clínicos de un número de bacterias se ha asociado con la sobre-expresión de las bombas de eflujo. Históricamente, la identificación de las mutaciones represoras y/o de la sobre-expresión del gen de bomba en los aislados clínicos, se ha tomado como suficiente para atribuir una menor resistencia al eflujo, lo cual probablemente es con frecuencia el caso; sin embargo, no siempre hay una clara asociación entre las mutaciones del gen represor y/o el estado de expresión de bomba y la resistencia a antibióticos específicos. Ver Sobel, McKay, y Poole, Antimicrob. Agents Chemother., Volumen 47, Número 10, página 3202-3207 (2003). Por consiguiente, con el fin de resolver directamente si la bomba acrAB tiene un papel significativo en la mediación de la menor susceptibilidad en las cepas clínicas con las susceptibilidades más bajas a los inhibidores de peptidil-desformilasa, se inactiva acrB (ver la Figura 1) en las cepas NB65016, NB65027, NB65051, NB65063, NB65069 y NB65076, todas las cuales exhiben una menor susceptibilidad a LBM415, LBK611, y clindamicina. La pérdida de la bomba aumenta de una manera sustancial la susceptibilidad a ambas clases de antimicrobianos en todos los casos, mientras que no tiene impacto alguno sobre los que no son sustratos de bomba (ver la Tabla 3 más adelante), proporcionando una confirmación directa de que la bomba acrAB está ampliamente distribuida, y es un importante contribuyente a la menor susceptibilidad exhibida por estas cepas. Más aún, la inactivación de HI1462 (ver la Figura 1) en las cepas NB65027 y NB65051, aumenta de una manera similar la susceptibilidad específicamente a los sustratos de bomba (ver la Tabla 3), confirmando adicionalmente el papel de este canal de membrana externa en la acción de la bomba acrAB en los aislados clínicos. Tabla 3. Contribución de la bomba de eflujo de acrAB a la disminución de la susceptibilidad a LBM415 y LBK611 en diferentes aislados clínicos de H. influenzae, y papel de acrR en la modulación de la resistencia.

CLD = Clindamicina. TET = Tetraciclina. Nota: • Cepas NB65044-CDS0011 y NB65044-CDS0014 son mutantes acrR seleccionados sobre placas de ágar de chocolate que contienen 8 microgramos/mililitro de LBM415. • NB65044-CDS0011 acrR tiene un cambio de nucleótidos C-?T en la posición 253, que introduce un codón de paro. • NB65044-CDS0014 acrR tiene un cambio de nucleótidos T-?C en la posición 164, que da como resultado una sustitución de aminoácidos L?P.

Ejem plo 4 acrR es un Represor de la Expresión de la Bom ba de acrAB. La demostración de que la bomba de eflujo de acrAB es el principal contribuyente a la menor susceptibilidad a LBM415 y a los macrólidos en los aislados cl ínicos de H. influenzae, con una susceptibilidad red ucida a estos agentes, sugiere que la mayor expresión de la bomba conduce a disminuciones en la susceptibilidad . Aunque el cuadro emergente de la regulación de la bomba de eflujo está llegando a ser cada vez más complejo, existen muchos casos en donde la sobre-expresión de la bomba es el resultado de simples mutaciones en los genes reguladores. Por ejemplo, las cepas anI B de P. aeruginosa sobre-expresan mexAB-oprM debido a las mutaciones en el gen mexR que codifica un represor, localizado inmediatamente corriente arriba de los genes mexAB-oprM. Ver Poole y colaboradores, Antimicrob. Agents Chemother. , Volumen 40, Número 9, páginas 2021 -2028 ( 1 996) . En H. influenzae, el marco de lectura abierta H I0983, localizado inmediatamente corriente de acrAB (ver la Figura 1 ) codifica un represor de la familia acrR/tetR que puede estar involucrado en el control de la expresión de acrAB. La secuenciación de nucleótidos de H I0893 a partir de N B6501 6, N B65027 , N B65051 , y N B65063, revela la presencia de inserción/supresiones o mutaciones puntuales q ue conducen ya sea a cambios de marco o a la introducción de codones de paro. Ver la Fig ura 4. La secuenciación de los genes acrR a partir de N B65069 y N B65076 revela mutaciones puntuales que cond ucen a cam bios de am inoácidos en relación con la secuencia pu blicada para el gen acrR (no se m uestra n los datos) . Esta preponderancia de m utaciones de acrR sugiere fuertemente que la bom ba de eflujo de acrAB se está sobre-expresando en estas cepas, debido a la pérd ida de la fu nción represora de acrR . Ejem plo 5 Papel de acrR de H. influenzae en la Modulación de la Suscepti bilidad a LBM41 5 y a los Macrólidos. Con el fin de examinar adicionalmente si acrR es un regulador negativo de la expresión de la bomba de acrAB, y en consecuencia , si la pérdida de la función de acrR da como resultado una menor susceptibilidad a LBM41 5 y a los macrólidos, se inactiva por inserción el gen acrR en la cepa de laboratorio N B65044. Ver la Figura 1 . Esto da como resultado una disminución del doble en la susceptibilidad a LBM41 5, y una disminución de cuatro veces en la susceptibilidad a LBK61 1 y a la clindamicina, mientras que no altera la susceptibilidad al q ue no es sustrato de bomba de tetraciclina N B65044-C DS0008. Ver la Tabla 3. Esto sugiere que acrR está actuando como un represor negativo de la expresión del gen acrAB. Sin embargo, el cartucho de cana micina reside en acrR en la misma orientación que el locus de acrAB corriente abajo (ver la Figura 1 ), y no se puede descartar una mayor expresión de acrAB que resulta de los efectos polares. Por consiguiente, para aclarar adicionalmente el papel de la mutación acrR en la disminución de la susceptibilidad a LBM41 5 y a los macrólidos, se prueba si la exposición de N B65044 a LBM415 a 8 microgramos/mililitro seleccionará los mutantes con los genes acrR alterados. Los mutantes de la cepa NB65044 se seleccionan sobre ágar de chocolate que contiene 8 microgramos/mililitro de LBM415 (frecuencia; 10"8-10"9), y el examen de los genes acrR a partir de 10 mutantes aislados revela mutaciones acrR en los 10 aislados (no se muestran los datos). La prueba de susceptibilidad de dos de estos mutantes, NB65044-CDS0011 y NB65044-CDS0014, que poseen un codón de paro introducido y un cambio de aminoácidos, respectivamente (ver la leyenda de la Tabla 3), revela una disminución de 8 veces en la susceptibilidad a LBM415 y a LBK611, y una disminución de 4 veces en la susceptibilidad a la clindamicina, nuevamente sin cambio alguno en la susceptibilidad a la tetraciclina. Ver la Tabla 3. Adicionalmente, la perfilación de la expresión revela una mayor abundancia de transcripciones acrAB (aproximadamente 2.5 veces) en ambos mutantes, así como la cepa inactivada de acrR, NB65044-CDS0008, apoyando la mayor expresión de la bomba (no se muestran los datos). También se observa un incremento similar en la abundancia de transcripciones acrR, sugiriendo una auto-regulación de acrR, un fenómeno observado para muchos genes reguladores de la bomba de eflujo, tales como mexZ y mexR en P. aeruginosa. La similitud en los perfiles de resistencia a fármacos entre los mutantes acrR seleccionados NB65044-CDS0011 y NB65044-CDS0014, y la cepa NB65044-CDS0008, en donde acrR se inactiva mediante la inserción de un determinante de resistencia a la kanamicina TN903 en la m ism a orientación q ue el locus de acrAB corriente abajo, sugiere que la sobre-expresión de la bomba en la cepa N B65044-CDS0008 no resulta de los efectos polares desde el promotor del cartucho TN903. Tomados juntos, estos datos mostrarán que la menor susceptibilidad a LBM41 5 se puede adquirir mutacionalmente en la forma de la sobre-expresión de la bomba de eflujo de acrAB resultante de las mutaciones acrR. Esto contrasta con los reportes anteriores de inactivación de acrR en H. influenzae, en donde no se observa alteración alg una de la susceptibilidad a un amplio número de compuestos en la cepa con eliminación genética acrR. Ver Trepod y Mott (2004) , supra. La mayor expresión de la bomba no siempre afecta a todos los sustratos de bomba igualmente, en particular en el caso de los modestos incrementos en la expresión de bombas, tales como mexAB-oprM ó acrAB, que ya se expresan en niveles significativos . Debido a que la eficiencia de la bomba probablemente está específicamente relacionada con las propiedades individuales del sustrato, solamente se podrían observar cambios significativos en la susceptibilidad resultantes de una modesta sobre-expresión de la bomba para ciertos subconjuntos de sustratos de bomba que se extruyen eficientemente en los niveles típicos de expresión de la bomba, incluyendo en este caso, LBM41 5, LBK61 1 , y clindamicina. Ejem plo Potenciación de LBM415 mediante PABN y Reserpina en H. influenzae y E. coli. Se utiliza N B65044-CDS001 1 de H. influenzae para la prueba de H. influenzae. Esta cepa ha aumentado la expresión de la bomba q ue se piensa que da como resultado una detección más sensible de la inhibición de la bomba. Para la prueba en E. coli, se utiliza la cepa N B27006. Esta cepa es deficiente en su bomba nativa acrAB (descrita en H . Okusu y colaboradores, J. Bacteriol. 1 996, 1 78: 306-308), y es un huésped adecuado para la clonación de los genes de bomba acrAB de H. influenzae. H. influenzae: Se conducen determinaciones de la concentración inhibidora m ínima en placas estériles de 96 pozos con un rango de LBM41 5 a lo largo de un eje, y un rango del inhibidor de la bomba de eflujo a lo largo del otro eje. El medio utilizado es HTM (Remel). El inoculo se establece en aproximadamente 10-5 bacterias por pozo, utilizando el sistema BBL Prompt. E. coli: Se conducen determinaciones de la concentración inhibidora mínima como se describe anteriormente, excepto que se utiliza el medio de prueba de Mueller-Hinton. Los genes que codifican los componentes de bomba de acrAB de H. influenzae se amplifican con reacción en cadena de la polimerasa a partir del ADN genómico de N B65044 utilizando los cebadores acrA prom F 1 (5'-AATTACGTAAGATAACCTAAGTGCG-3') (SEQ I D NO: 1 1 ) y la potenciación de acrBR3 de LBM41 5 mediante MC-207, 1 1 0 y Reserpina en H. influenzae y E. coli (5'-TATTAGCGGAATTATCTGAAG-3') (S EQ I D N O: 1 2) . El producto que contiene acrAB se clona en Topo PC R2.1 (I nvitrogen), y se transforma en células competentes Top10 (Invitrogen). Se aisla un plásmido que tiene el inserto, y se secuencia para asegurar que no se introduzcan mutaciones durante la reacción en cadena de la polimerasa y la clonación. Entonces se transforma este plásmido en la cepa NB27006 de E. coli, la cual carece de su función de bomba nativa AcrAB-TolC. Debido a que se sabe que LBM415 es bombeado por AcrAB-TolC, la potenciación de la actividad mediante MC-207,110 es consistente con la capacidad reportada de este compuesto para interferir con la función de la bomba de la familia RND. También se ha observado que MC-207,110 potencia la clindamicina, otro sustrato que se extruye de una manera relativamente eficiente mediante AcrAB-TolC en H. influenzae. No hay potenciación del sustrato que no es de bomba tetraciclína observada en la potenciación de LBM415 mediante MC-207,110. Tomados juntos, los datos (no mostrados) sugieren que el efecto sobre LBM415 realmente es el resultado de la capacidad general de MC-207,110 para interferir con la extrusión por parte de la bomba de eflujo AcrAB-TolC. Sin embargo, la reserpina no potenció ni LBM415 ni la clindamicina (no se muestran los datos). La reserpina es un inhibidor bien caracterizado, por ejemplo, del eflujo basado en el transportador ABC, pero ha demostrado poca actividad contra las bombas de la familia RND. Ejemplo 7 Actividad de MC-207,110 Contra los Componentes de Eflujo de acrAB de H. influenzae en E. coli.

La actividad de M C-207 , 1 1 0 en la poten ciación de dos sustratos de bom ba, clindam icina y LB M 41 5 , au nq ue no im pacta al q ue no es sustrato de bom ba tetraciclina , en H. influenzae que sobre-expresa los componentes de bomba de acrAB, sugiere que MC-207, 1 1 0 funciona débilmente como un inhibidor de bomba de AcrAB-TolC en H. influenzae. Para examinar adicionalmente esto, se clonan los genes acrAB de H. influenzae, y se utilizan para complementar, en trans, una deficiencia de bomba de AcrAB en la cepa N B27006 de E. coli. Se ha demostrado que la bomba nativa de AcrAB-TolC de E. coli confiere una resistencia intrínseca significativa a LBM41 5 (concentración inhibidora mínima típicamente de 1 28 microgramos/mililitro y más alta) . De una manera correspondiente, las cepas deficientes en la función de bomba de AcrAB-TolC son sensibles (concentración inhibidora m ínima típicamente de aproximadamente 1 microgramo/mililitro) . La complementación del defecto de bomba en la cepa N B27006 de E. coli utilizando los genes acrAB de H. influenzae, da como resultado una resistencia significativamente aumentada a LBM415 (concentración inhibidora m ínima de 32 microgramos/mililitro). Esto indica que los genes acrAB son funcionales en E. coli, y que son capaces de formar una unidad funcional con el canal de membrana externa TolC de E. coli. Debido a que las bombas de eflujo son impactadas por factores tales como la permeabilidad de la membrana externa, y a que se piensa que E. coli tiene una membrana externa menos permeable que H. influenzae (posiblemente contando para el mayor impacto de eflujo sobre la resistencia al fárm aco) , se ha razonado que la detección de la in hibición de la bom ba d e acrA B de H. influenzae podría ser más sensible en un fondo de E. coli. De una manera consistente con esto, se observa la actividad potencíadora de MC-207, 1 1 0 para tanto LBM41 5 como clindamicina en N B2007 de E. coli complementado en trans con los genes acrAB de H. influenzae. Adicionalmente, no se detecta potenciación alguna de la tetraciclína. Esto es interesante porq ue la bomba de AcrAB-TolC nativa de E. coli sí extruye la tetraciclina. Esto sugiere que se está conservando el perfil del sustrato antibiótico de la bomba de H. influenzae en la cepa de E. coli. Estos datos apoyan además la noción de que MC-207, 1 1 0 es capaz de interferir con la extrusión de LBM41 5 mediante la bomba de AcrAB-TolC de H. influenzae.

Claims (1)

1. REIVI N DICACION ES 1 . U n método para el tratamiento de una infección bacteriana Gram-negativa en un mamífero, el cual comprende administrar una cantidad efectiva de un compuesto de la Fórmula (I): en donde: X es -C H2-, -S-, -CH(OH)-, -C H (OR)-, -CH(SH)-, -CH(SR)-, -CF2-, -C = N(OR)- ó -C H (F)-, en donde R es alquilo; R T es arilo o heteroarilo; cada uno de R2, R3, R4, y R5 es independientemente hidrógeno o alquilo, o R2 ó R3, y R4 ó R5, colectivamente, forman u n cicloalquilo de 4 a 7 átomos de carbono; y n es de 0 a 3, en el entendido de que, cuando n es 0, X es -CH2-, o una sal del mismo, o un pro-fármaco del mismo; y un inhibidor de la bomba de eflujo. 2. El método de la reivindicación 1 , en donde el heteroarilo es un residuo de la Fórmula (l l l): en donde: cada uno de R6, R7, R8, y Rg es independientemente hid rógeno, alquilo, alquilo sustituido, fenilo, halógeno, hidroxilo, o alcoxilo. 3. El método de la reivindicación 1 1 , en donde el compuesto de la Fórmula (l l l) es: 4. El método de la reivindicación 2, en donde la infección bacteriana es causada por bacterias Gram-negativas que poseen una bomba de eflujo R N D. 5. El método de la reivindicación 4, en donde la bacteria Gram-negativa se selecciona a partir del grupo q ue consiste en E. coli, P. aeruginosa, H. influenzae, y Neisseria gonorrhoeae. 6. El método de la reivindicación 5, en donde la bacteria Gram-negatíva es H. influenzae. 7. Un método para el tratamiento de una infección bacteriana Gram-negativa en un mam ífero, la cual es causada por bacterias Gram-negativas que poseen una bomba de eflujo RND, comprendiendo el método administrar una cantidad efectiva del compuesto: y un inhibidor de eflujo que inhiba a la bomba de eflujo RND en las bacterias Gram-negativas. 8. El método de la reivindicación 7, en donde la bacteria Gram-negativa se selecciona a partir del grupo que consiste en E. coli, P. aeruginosa, H. influenzae, y Neisseria gonorrhoeae. 9. El método de la reivindicación 8, en donde la bacteria Gram-negativa es H. influenzae. 10. Un método para aumentar la susceptibilidad de las bacterias Gram-negativas a un compuesto de la Fórmula (I): en donde: X es -CH2-, -S-, -CH(OH)-, -CH(OR)-, -CH(SH)-, -CH(SR)-, -C F2-, -C = N(OR)- ó -CH(F)-, en donde R es alquilo; R, es arílo o heteroarilo; cada uno de R2, R3, R4, y R5 es independientemente hidrógeno o alquilo, o R2 ó R3, y R4 ó R5, colectivamente, forman un cicloalq uilo de 4 a 7 átomos de carbono; y n es de 0 a 3, en el entendido de q ue, cuando n es 0, X es -CH2-, o una sal del mismo, o un pro-fármaco del mismo, comprendiendo el método: poner en contacto las bacterias con el compuesto de la Fórmula (I) y un inhibidor de la bomba de eflujo, en una cantidad efectiva para inhibir una bomba de eflujo en las bacterias Gram-negativas. 1 1 . El método de la reivindicación 1 0, en donde el heteroarilo es un residuo de la Fórmula (l l l ): en donde: cada uno de R6, R , R8, y R9 es independientemente hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, fenilo, halógeno, hidroxilo, o alcoxilo. 12. El método de la reivindicación 1 2, en donde el compuesto de la Fórmula (l l l) es: 13. El método de la reivindicación 10, en donde la bomba de eflujo en la bacteria Gram-negativa es una bomba de eflujo RND. 14. El método de la reivindicación 13, en donde la bacteria Gram-negativa se selecciona a partir del grupo que consiste en E. coli, P. aeruginosa, H. influenzae, y Neisseria gonorrhoeae. 15. El método de la reivindicación 14, en donde la bacteria Gram-negativa es H. influenzae. 16. Un método para aumentar la susceptibilidad de las bacterias Gram-negativas que poseen una bomba de eflujo RND, al compuesto: el cual comprende poner en contacto las bacterias Gram-negatívas con el compuesto y un inhibidor de la bomba de eflujo, en una cantidad efectiva para inhibir la bomba RND en las bacterias Gram- negativas. 17. El método de la reivindicación 16, en donde la bacteria Gram-negativa se selecciona a partir del grupo que consiste en E. coli, P. aeruginosa, H. influenzae, y Neisseria gonorrhoeae. 18. El método de la reivindicación 17, en donde la bacteria Gram-negativa es H. influenzae. 19. Una composición farmacéutica, la cual comprende un compuesto de la Fórmula (I): en donde: X es -CH2-, -S-, -CH(OH)-, -CH(OR)-, -CH(SH)-, -CH(SR)-, -CF2-, -C = N(OR)- ó -CH(F)-, en donde R es alquilo; R, es arilo o heteroarílo; cada uno de R2, R3, R4, y R5 es independientemente hidrógeno o alquilo, o R2 ó R3, y R ó R5, colectivamente, forman un cicloalquilo de 4 a 7 átomos de carbono; y n es de 0 a 3, en el entendido de que, cuando n es 0, X es -CH2-, o una sal del mismo, o un pro-fármaco del mismo, un inhibidor de la bomba de eflujo, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. 20. La composición farmacéutica de la reivindicación 19, en donde el heteroarilo del compuesto de la Fórmula (I) es un residuo de la Fórmula (lll): en donde: cada uno de R6, R7, R8, y Rg es independientemente hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, fenilo, halógeno, hidroxilo, o alcoxilo. 21. La composición farmacéutica de la reivindicación 20, en donde el compuesto de la Fórmula (lll) es: 22. La composición farmacéutica de la reivindicación 19, en donde el inhibidor de eflujo inhibe una bomba de eflujo RND en bacterias Gram-negativas. 23. La composición farmacéutica de la reivindicación 22, en donde la bacteria Gram-negativa se selecciona a partir del grupo que consiste en E. coli, P. aeruginosa, H. influenzae, y Neisseria gonorrhoeae. 24. La composición farmacéutica de la reivindicación 23, en donde la bacteria Gram-negativa es H. influenzae.