MXPA06014046A - La importancia del gen hoxb13 para cancer. - Google Patents

La importancia del gen hoxb13 para cancer.

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Abstract

Esta invencion se relaciona a la deteccion de la expresion incrementada del gen HoxB13 (homeobox B13) como indicativa de un fenotipo de cancer invasivo o metastatico. La invencion proporciona metodos para detectar el nivel de expresion del gen HoxB13, opcionalmente en combinacion con el estado nodal, como un indicador del fenotipo invasivo o metastatico asi como la migracion y/o la movilidad celular incrementada. La invencion tambien proporciona la medicion de la expresion del gen HoxB13 para asistir en la determinacion de la prognosis del paciente asi como la diagnosis clinica y el tratamiento.

Description

LA IMPORTANCIA DEL GEN HOXB13 PARA C NCER CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se relaciona a la detección de la expresión de gen como indicativa de un fenotipo de cáncer. En particular, la expresión incrementada de gen HoxB13 (homeobox B13) es indicativa de un fenotipo de cáncer invasivo. La -invención proporciona métodos para detectar el nivel de expresión del gen HoxB13 como un indicador del fenotipo invasivo así como la migración y/o movilidad celular incrementada. La invención también proporciona la medición de la expresión del gen HoxBl3 para asistir en la diagnosis clínica y el tratamiento, así como la determinación de la prognosis del paciente. BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención proporciona la determinación del nivel de la expresión de gen como un indicador de fenotipos de cáncer particulares. La invención está basada en parte en el descubrimiento de que la expresión incrementada del gen HoxB13 es indicativa de un fenotipo de cáncer invasivo así como la migración y/o movilidad celular incrementada. La invención también proporciona la determinación de Ja expresión no incrementada del gen HoxB13 como un indicador de la ausencia de un fenotipo invasivo. La correspondencia entre la expresión de las secuencias HoxB13 y la presencia o ausencia de un fenotipo invasivo también puede ser aplicado para diagnosticar y seleccionar el tratamiento para un sujeto. Adicionalmente, la correspondencia puede ser utilizada para determinar probablemente el efecto de prognosis o de enfermedad para un sujeto. Ejemplos no limitativos de un fenotipo invasivo incluyen la expansión de una masa de tumor primario en los tejidos circundantes y la invasión de células como parte de la metástasis a un tipo de tejido deferente. En algunas modalidades, la invención se aplica a sujetos humanos, tales como aquellos afligidos con, o que se sospechan de ser afligidos con cáncer. En algunas modalidades particulares, la invención se aplica a casos de cáncer de seno en pacientes humanos. Los orígenes de la invención incluyen la detección de la expresión de HOXB13 en células normales de la unidad lobular del ducto terminal, la subestructura anatómica del seno humano del cual surge el cáncer de seno. Esto sugirió que la proteína homeobox puede desempeñar una función en el desarrollo y la fisiología del seno. El nivel de expresión del gen HoxB13 en tales células normales puede ser analizado mediante cualquier técnica apropiada. El nivel de expresión en tales células se puede visualizar como normal, utilizado como una referencia para la comparación a nivel de expresión en células no normales o anormales (por ejemplo, células de cáncer) del mismo tipo y/o tejido como es descrito en la presente. Alternativamente, la expresión en células normales de un tipo o tejido particular se puede utilizar como una referencia para la comparación de las células no normales o anormales heterólogas en la determinación de la adaptabilidad para tal uso. La invención también está basada en parte en el descubrimiento de que la expresión ectópica de H0XB13 en células potencia la invasión y migración celular in vitro, indicando que H0XB13 contribuye a la invasión y metástasis del tumor in vivo. El potencial incrementado para las características de invasión ' y/o migración puede ser estimulado por EGF en células responsivas o por la presencia de colágeno. En un primer aspecto, la invención proporciona un método para identificar o clasificar una o más células que tienen un potencial incrementado para la invasión y/o migración al determinar el nivel de expresión del gen HoxB13 por ser incrementado o arriba de lo normal. Esto incluye el potencial para la metástasis a una parte deferente y/o tejido diferente en un sujeto en el cual se encuentra la(s) célula (s). La determinación de un incremento o nivel arriba de lo normal se puede hacer mediante la comparación relativa al nivel de expresión en células normales del mimo tipo y/o tejido. La una o más células pueden estar en una muestra biológica de células obtenidas de un sujeto afligido con, o que se sospecha de ser afligido con, cáncer. En algunas modalidades de la invención, el cáncer es cáncer de seno. En algunas modalidades, la expresión del gen HoxB13 en células de cáncer se compara con células normales del mismo tipo o del mismo tejido; como un ejemplo no limitativo, la expresión en células de cáncer de seno se compara con aquellas de las células de seno normales. La determinación de un incremento en la expresión de HoxB13 puede ser relativa a otras mediciones apropiadas de la expresión de HoxB13. Estas incluyen comparaciones a la expresión de HoxB13 de células de cáncer del mismo tipo en otros sujetos, o una población de tales sujetos. En algunas modalidades, los sujetos son de una población con el mismo cáncer pero que no experimentan metástasis o recurrencia del cáncer. Esto puede ser fácilmente realizado mediante el análisis de retrospectivo de muestras, tales como muestras fijadas, de tales sujetos en una población de tales sujetos. La comparación también puede ser a una base de datos de los niveles de expresión de HoxB13 que comprende niveles de expresión de muestras de células de sujetos sin metástasis o recurrencia de cáncer subsecuente. Otra comparación puede ser a un nivel de umbral de la expresión de HoxB13 en o arriba de la cual una probabilidad incrementada de metástasis, invasividad, y/o migración es indicada. La invención así puede ser utilizada para identificar o clasificar una o más células como pre-invasivas, y/o por tener un potencial incrementado para la invasión y/o migración, tal como la metástasis a un sitio diferente. El sujeto del cual las células se obtuvieron de esta manera se puede identificar por tener células de cáncer pre-invasivas con este potencial incrementado. Alternativamente, la invención puede ser utilizada para identificar una o más células como invasivas. En algunas modalidades, las una o más células son células de cáncer primario, tales como células de cáncer de seno primario, de un sujeto. Este aspecto de la invención se puede utilizar como un predictor o indicador temprano del potencial invasivo o metastático de células de cáncer primario en el sujeto. Este también se puede utilizar como un predictor o indicador del potencial para la recurrencia de cáncer, tal como en sujetos donde el cáncer todavía tiene que recurrir. La recurrencia puede ser el resultado de las micrometástasis no detectadas que son después identificadas como recurrencia de cáncer, ya sea locales, regionales o distantes. En otro aspecto, la estimación de la expresión de HoxB13 puede ser utilizada en combinación con el estado nodal como un predictor combinado del potencial invasivo o metastático. Así la invención proporciona la determinación de 1) sí un sujeto con por lo menos un cáncer primario tiene cáncer que se ha dispersado a uno o más nodos de linfa y 2) el nivel de expresión de HoxBl3 en una o más célula del cáncer primario. Donde el sujeto es de "nodo negativo" (donde no se detecta cáncer en un nodo de linfa) y la(s) célula (s) de cáncer tiene un nivel alto o arriba de lo normal de la expresión de HoxB13, las células de cáncer se identifican por tener un potencial incrementado para la invasión, migración, y/o metástasis. La invención, sin embargo, no está limitada a tal combinación debido a que una determinación de "nodo positivo" en combinación con la expresión de HoxB13 incrementada todavía podría indicar un potencial para la invasión, y/o metástasis. Como se explicó en lo anterior y en la presente, la identificación de un nivel incrementado o arriba de lo normal de la expresión del gen HoxB13 en una o más células de una muestra puede ser utilizada para identificar la(s) célula (s) y/o la muestra por tener un fenotipo invasivo. La muestra puede ser una muestra biológica que contiene células obtenida de un sujeto afligido con, o que se sospecha de ser afligido con, cáncer, tal como cáncer de seno. La(s) célula (s) también puede ser aquella que es identificada como atípica o pre-cancerosa . En algunas modalidades, la muestra es de un sujeto afligido con, o que se sospecha de tener cáncer, tal como cáncer de seno. En algunos caso, la presencia de cáncer es ya conocida, y la invención se utiliza para determinar sí el cáncer, tal como el cáncer de seno tiene un fenotipo invasivo. En otras modalidades, los métodos de la invención pueden ser utilizados con muestras que contienen células de la intervención quirúrgica, tales como aquellas que ocurren en algunos pacientes de cáncer de seno, para determinar sí el cáncer de seno tiene - un fenotipo invasivo tal que la probabilidad de, o potencial para, metástasis (local, regional o distante) es incrementada. Los métodos de la invención pueden ser aplicados ventajosamente a células que son responsivas al factor de crecimiento epidérmico (EGF) , insulina, glucocorticoides, y endotoxina de cólera tal que las características de invasión y/o migración de las células son aumentadas en la presencia de EGF y estos otros factores. La determinación de la responsividad de EGF se puede hacer mediante cualquier método apropiado, incluyendo la detección de la expresión de un receptor para EGF en las células. Los métodos para la detección de la expresión del receptor de EGF, la expresión del receptor de EGF mutante, así como la amplificación del gen receptor de EGF son conocidos e incluyen, pero no están limitados a, métodos tal como la detección de la expresión de mRNA de receptor, detección de la expresión de proteína de receptor, detección de la amplificación del gen de receptor, y la detección de la expresión de uno o más genes que son expresados en relación con el receptor de EGF. Tales métodos pueden ser utilizados en combinación con los métodos divulgados en la presente para identificar células que son aumentadas en invasividad en la presencia de EGF debido a tanto un nivel incrementado de expresión del gen HoxB13 y la expresión del receptor EGF positivo. Los métodos de la invención pueden comprender la determinación del nivel de expresión del gen HoxB13 al analizar las moléculas de ácido nucleico expresado o las moléculas de polipéptido expresadas correspondientes al gen HoxB13. Así los análisis basados en la detección de los niveles de transcripción o de traducción, así como la estabilidad de las moléculas de ácido nucleico o de polipéptido pueden ser utilizados en la práctica de la invención. La invención puede ser practicada al detectar la expresión de cualquier secuencia transcripta del gen HoxBl3. También se pueden utilizar ensayos para la desmetilación del gen HoxB13, como un indicador del estado de DNA para la expresión de HoxB13. Así la invención puede ser practicada mediante la detección de una porción de las moléculas de ácido nucleico o de polipéptido expresadas del gen HoxB13. Varios métodos para la detección de la expresión de gen, y la expresión de las secuencias HoxBl3 expresadas en transcriptos del gen HoxB13 se divulgan en las solicitudes norteamericanas 06/504,087, presentada el 19 de septiembre del 2003, 10/727,100, presentada el 2 de diciembre del 2003, y 10/773,761, presentada el 6 de febrero del 2004 (todas las tres de las cuales son incorporadas en la presente por referencia como sí se expusieran completamente) y e puede utilizar en la práctica de la presente invención. Brevemente, la expresión de toda o parte de un trascripto de HoxB13 se puede detectar mediante el uso de la detección mediada por hibridación (tal como, pero no limitada a la tecnología basada en microarreglo, cuenta o partícula) o la detección mediada por PCR cuantitativa (tal como, pero no limitada a, la PCR de tiempo real y la PCR de transcriptasa inversa) como ejemplos no limitativos. La expresión de todo o parte del polipéptido HOXB13 puede ser detectada mediante el uso de técnicas de inmunohistoquímica u otra detección mediata por anticuerpo (tal como, pero no limitada a, el uso de anticuerpos marcados que enlazan específicamente por lo menos parte de un polipéptido HOXB13 con relación a otros polipéptidos) como ejemplos no limitativos. Por consiguiente, la invención puede ser practicada al detectar la expresión de todo o parte de las secuencias de ácido nucleico y/o polipéptido de HoxB13 divulgadas en lo anterior en las tres solicitudes anteriores así como secuencias conocidas en la técnica o que entran dentro del conocimiento en la técnica. Se debe observar que como se proporciona en esas solicitudes, la expresión de HoxBl3 es disminuida en las células de cáncer de seno que son responsivas o sensibles al tratamiento con tamoxifen mientras que se incrementa en células de cáncer de seno que son resistentes o insensibles al tratamiento con tamoxifen. En un aspecto adicional de la invención, los métodos divulgados en la presente pueden ser utilizados para identificar o clasificar una o más células de una muestra que no tienen un potencial incrementado de características de invasión y/o migración basado en la carencia de un incremento del nivel de expresión del gen HoxB13 o la ausencia de tal incremento en comparación al nivel de expresión en células normales del mismo tipo y/o tejido. Tales métodos también se pueden utilizar para identificar uno o más células que no son invasivas o que son pre-invasivas sin un potencial incrementado para la invasión y/o migración. En todavía otro aspecto, los métodos de la invasión se pueden aplicar para asistir en la diagnosis y el tratamiento de un sujeto con cáncer. Los métodos divulgados en la presente se pueden utilizar para establecer una diagnosis del cáncer invasivo o no invasivo, tal como el cáncer de seno invasivo o no invasivo, en un sujeto del cual se obtiene una muestra que contiene células y se analiza para los niveles de expresión de HoxBl3. Dentro de la categoría de cáncer de seno no invasivo, los métodos se pueden utilizar para establecer una diagnosis el cáncer per-invasivo, tal como el cáncer de seno pre-invasivo, con un potencial incrementado para la invasión y/o migración. Utilizando el cáncer de seno como un ejemplo no limitativo, la invención se puede utilizar con células que son identificadas como ADH o DCIS para identificarlas como pre-invasivas, pero con potencial incrementado para la invasión y/o migración, tal como se observa en el caso de IDC. Más generalmente, los métodos de la invención se pueden utilizar para diagnosticar o identificar células, incluyendo células de cáncer o pre-cáncer que no son conocidas que tienen un potencial incrementado para la metástasis, como pre-metastáticas y/o que tienen un potencial incrementado para metástasis. El análisis para los niveles de expresión de HoxB13 se pueden realizar como parte de las técnicas de inmunohistoquímica (y/o la hibridación in situ de fluorescencia) utilizado en protocolos de patología clínica estándares para analizar una muestra o espécimen que contiene células . Los tratamientos apropiados, basados en la diagnosis, de esta manera se pueden seleccionar y aplicar en base al uso de las determinaciones de los niveles de expresión de HoxB13. Los métodos de la invención también se pueden utilizar para confirmar o rechazar una diagnosis de cáncer invasivo, tal como el cáncer de seno invasivo o el cáncer de seno con un potencial incrementado para metástasis, para un sujeto basado en el análisis de los niveles de expresión de HoxBl3 en una muestra que contiene células como es divulgado en la presente. La confirmación o rechazo puede ser de una diagnosis inicial basado en el uso de las técnicas de patología clínica estándares (sin la detección de expresión de HoxB13) , tal como la inmunohistoquímica y la inspección visual de muestras que contienen células de un sujeto. La presente invención de esta manera proporciona una mejora en la habilidad para obtener una diagnosis más precisa con referencia a la invasividad de cáncer sobre los protocolos previos . La selección del tratamiento basado en una diagnosis, que depende por completo o en parte sobre el nivel de expresión del gen HoxB13, incluye la evitación o eliminación de ciertos tratamientos que son menos probable que sean de beneficio. Como un ejemplo no limitativo, la diagnosis precisa de un sujeto que tiene cáncer invasivo o cáncer con potencial metastático, como es opuesto al cáncer no invasivo, proporciona el soporte para seleccionar un tratamiento más agresivo antes que el riesgo de la utilización de un tratamiento menos agresivo que permite que el cáncer avance en severidad. Alternativamente, la diagnosis precisa del cáncer no invasivo puede ser utilizada para soportar la selección del tratamiento menos agresivo que ocasiona a un paciente la incomodidad y efectos secundarios indeseables de un tratamiento más agresivo. En un aspecto todavía adicional, la invención proporciona un método para determinar la prognosis de un sujeto basado en el nivel de expresión del gen HoxB13 como es s descrito en la presente. En este aspecto, la correspondencia de la expresión de HoxB13 a la invasividad de cáncer es enlazada a la información que considera la invasividad de cáncer y la prognosis o efecto de la enfermedad del paciente tal que la expresión de HoxB13 es indicativa de la prognosis y/o efecto de la enfermedad. En ejemplos no limitativos, la prognosis y/o efecto de la enfermedad incluye la esperanza de vida, la probabilidad de recurrencia de cáncer sobre varios intervalos de tiempo, y la probabilidad de invasión del cáncer y/o metástasis en otros tejidos, u en otras partes del paciente . La invención además proporciona su uso como parte del cuidado clínico o médico de un paciente. Otros métodos clínicos incluyen aquellos involucrados en la provisión del cuidado médico a un paciente basado en las determinaciones de la expresión de HoxBl3 como es descrito en la presente. En algunas modalidades, los métodos se relacionan a la provisión de servicios de diagnóstico basados en los niveles de expresión de HoxB13 con o sin inclusión de una interpretación del significado o implicación de los niveles. En algunas modalidades, el método para proporcionar un servicio de diagnóstico de la invención está precedido por una determinación de una necesidad por el servicio. En otras modalidades, el método incluye actos en el monitoreo del desempeño del servicio así como actos en la petición o recibo del reembolso para el desempeño del servicio. Los detalles de una o más modalidades de la invención se exponen en los dibujos acompañantes y la descripción siguiente. Otras ventajas y características de la invención serán evidentes a partir de los dibujos y • descripción detallada, y de las reivindicaciones. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 muestra los valores de expresión del gen HOXB13 cuantitativos, relativos en casos normales (N, n=45), DCIS (n=42), y IDC (n=29) de células de cáncer.
Las barras de error denotan intervalos de confidencia del 95%. La Figura 2 muestra los resultados de la hibridación ín si tu del mRNA de HOXB13. Las sondas de RNA marcadas con DIG11UTP con hibridación anti-sentido al epitelio de seno humano de (i) la unidad lobular de cuto terminal normal (aumento de 20?x) , (ii) carcinoma ductal in situ (aumento de 40Ox) y (iii) carcinoma ductal invasivo (aumento de 40?x) , y la hibridación de sonda de sentido a (iv) carcinoma ductal invasivo (aumento de 400X) . Los inserto representan regiones seleccionadas de cada campo en el aumento de lOOOx. L, S, y T denotan lóbulo, estroma y tumor, respectivamente . La Figura 3 muestra los resultados de un ensayo de migración con células que expresan H0XB13 ectópicamente . Los números medios de células que emigraron a través del filtro de transcavidad por campo de 20X son mostrados (+/-desviación estándar de cavidades por triplicado) . EGF se refiere a la presencia del factor de crecimiento epidérmico. El inserto representa la expresión ectópica de H0XB13 en las células MCF10; el análisis de PCR de transcripción inversa de H0XB13 de las construcciones de expresión con el vector pBABE solo (granja 1) o H0XB13 (granja 2) . Las barras de error indican una desviación estándar. El asterisco * indica P<0.05 comparado con las células de control. La Figura 4 muestra los resultados de un ensayo de invasión con células que expresan HOXB13 ectópicamente. El número medio de células que invadieron es mostrado. EGF se refiere a la presencia del factor de crecimiento epidérmico.
Las barras de error indican una desviación estándar. El asterisco * indica P<0.05 comparado a las células de control. La Figura 5 muestra la morfología 2D de las células MCF10A con las células MCF10A que expresan HOXB13 ectópicamente. La Figure 6 muestra la expresión de HoxB13 ectópica en células MCF10A que aumenta la migración estimulada por EGF a través de los componentes de matriz extracelular del sarcoma de EHS (Engelbroth-Holm-Swarm) . La Figura 7 muestra la expresión de HoxB13 ectópica en células MCF10A que aumenta la invasión estimulada de EGF a través de los componentes de la matriz extracelular del sarcoma de EHS (Engelbroth-Holm-Swarm) . La Figura 8 muestra la expresión de HoxB13 en células AN10 que aumenta la migración con y sin un dimerizador sintético (AP1510) . AM denota el medio de ensayo; coll se refiere a colágeno. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE MODOS PARA PRACTICAR LA INVENCIÓN La invención proporciona métodos relacionados con la expresión de HoxB13 incrementado en células para el fenotipo de características de invasión y/o migración, incluyendo el fenotipo de potencial metastático para el desarrollo de cáncer en otros tejidos o partes de un sujeto afligido con un cáncer primario. Ejemplos no limitativos de tales características incluye la movilidad celular incrementada y/o migración y la habilidad para invadir y/o migrar a través de una matriz extracelular o la membrana de basamento, tal como aquellos in vivo o en la presencia de colágeno. Las características también pueden ser consideradas en una _ probabilidad incrementada de invasividad y/o metástasis, o la capacidad de ser invasivas y/o metastáticas. La invención de esta manera proporciona un primer método para identificar o clasificar una o más células de muestra que tienen un potencial incrementado para las características de invasión y/o migración al determinar el nivel de expresión del gen HoxB13 en una o más células, en donde un nivel relativamente incrementado o arriba de lo normal de la expresión indica un potencial incrementado . para las características metastáticas, de invasión y/o migración en una o más células. La determinación de un incremento relativo en la expresión de HoxBl3 puede ser mediante- la comparación a otro nivel de expresión de HoxB13, tal como aquellos en células de otro sujeto o población de sujetos. Las células pueden ser aquellas que no son cancerosas así como células de cáncer, incluyendo aquellas que condujeron o no condujeron a la metástasis de cáncer o invasión. Por supuesto la preparación se puede hacer entre tipos de tejido idénticos, tal como cáncer de seno a tejido de seno, o cáncer de seno a cáncer de seno. En algunas modalidades, la comparación es para la expresión de HoxBl3 en células de cáncer de algún tipo de otro sujeto, o una población de tales sujetos, donde el mismo cáncer no tuvo el mismo fenotipo de características metastáticas, de invasión y/o migración como es descrito en la presente. Tales comparaciones fácilmente se hacen mediante el uso de muestras fijadas de cáncer de sujetos de quienes el curso subsecuente de defectos de la enfermedad y clínicos son conocidos. Ejemplos no limitativos de tal historia clínica subsecuente incluye la metástasis o recurrencia de cáncer. Los niveles de expresión en tales muestras se puede considerar los niveles de referencia al cual el nivel de expresión de HoxB13 en una muestra nueva, de prueba o no conocido es comparado. Estos niveles de expresión de referencia puede estar en la forma de un base de datos a la cual se compara el nivel de expresión en una muestra nueva, de prueba o no conocida. La base de datos también puede incluir niveles de expresión de referencia de muestras de sujetos quienes experimentaron subsecuentemente metástasis de cáncer o recurrencia. Estos niveles también pueden ser utilizados en comparación con el nivel de expresión de HoxB13 en una muestra nueva, de prueba o no conocida en la práctica de la invención, en la cual niveles similares indican la probabilidad de efectos similares. En otras modalidades no limitativas, los niveles de expresión de referencia, ya sea con sujetos con o sin metástasis subsecuente o recurrencia de cáncer, pueden ser utilizados, para derivar un nivel de umbral de los niveles de expresión de HoxBl3 arriba del cual está presente una probabilidad incrementada de metástasis, invasividad, y/o migración. La invención proporciona un segundo método para identificar o clasificar una o más células de muestra por ser invasivas al determinar el nivel de expresión del gen HoxB13 en una o más células, en donde un nivel arriba de lo normal de la expresión indica que una o más células son invasivas. Se proporciona un tercer método para identificar o clasificar una o más células de muestra por ser invasivas al determinar el nivel de expresión de HoxB13 en una o más células, en donde las células son responsivas a EGF y un nivel arriba de lo normal de la expresión indica que una o más son invasivas en la presencia de EGF. En algunas modalidades, la célula (s) expresa un receptor proteinaceo para EGF, y los métodos de la invención pueden comprender la detección de receptor proteinaceo en las células analizadas para la expresión de HoxB13. La invención proporciona un cuarto método para identificar o clasificar una o más células de muestra que no tienen un potencial incrementado para características de invasión y/o migración, incluyendo el fenotipo del potencial metastático para el desarrollo de cáncer en otros tejidos o partes de un sujeto afligido con un cáncer primario, al determinar el nivel de expresión del gen HoxB13 en una o más células, en donde un nivel normal o por debajo del normal de la expresión indica la ausencia de un potencial incrementado para las características metastáticas, de invasión y/o de migración en una o más células . En combinación con el primer método anterior, la invención de esta manera proporciona un método para identificar o clasificar el potencial de una o más células de muestra para metastasizarse en otro tejidos. Tal método puede comprender la determinación del nivel de expresión del gen HoxB13 en una o más células, en donde un nivel arriba de lo normal de expresión indica un potencial incrementado para la metástasis en una o más células y un nivel normal o por debajo del normal de la expresión indica la ausencia de un potencial incrementado, o un potencial disminuido, para metástasis. Se proporciona un quinto método para determinar la prognosis de un sujeto en determinar el nivel de expresión del gen HoxB13 en una o más células de una muestra biológica obtenida del sujeto, en donde un nivel arriba de lo normal de la expresión de indica un potencial incrementado para cáncer invasivo en el sujeto y un nivel normal o por debajo del normal de la expresión de HoxB13 indica la ausencia de un potencial incrementado para el cáncer invasivo. De una manera relacionada, la invención proporciona un método para predecir la prognosis o efecto de enfermedad del sujeto. Tal método puede comprender determinar el nivel de expresión del gen HoxB13 en una o más células de una muestra biológica obtenida del sujeto, en donde un nivel arriba de lo normal de expresión indica un potencial incrementado para la metástasis de cáncer, probabilidad incrementada de recurrencia de cáncer, o esperanza de vida disminuida en el sujeto y un nivel normal o debajo del normal de la expresión de HoxBl3 indica la ausencia de un potencial incrementado para la metástasis de cáncer, probabilidad incrementada de recurrencia de cáncer, o esperanza de vida disminuida.
La invención también proporciona el uso de la prognosis o el efecto en la determinación del tratamiento de un sujeto. Tal método puede comprender la determinación de la prognosis o efecto de un sujeto como es descrito en lo anterior en la determinación del tratamiento para el sujeto basado en la prognosis o el efecto. La elección del tratamiento puede incluir la evitación o eliminación de ciertos tratamientos que sean menos probables de ser beneficiosos. En algunos casos, esto puede significar la selección de un tratamiento más agresivo donde un sujeto tiene cáncer con potencial metastático como es opuesto al cáncer no invasivo. En otros casos, esto puede significar la selección de un tratamiento menos agresivo que ocasiona a un paciente la incomodidad y los efectos secundarios indeseables debido a que un sujeto tiene cáncer no invasivo. En modalidades adicionales de la invención, el estado nodal de un sujeto puede ser determinado y utilizado en combinación con el nivel de expresión de HoxB13 en los métodos divulgados. Así, la invención incluye métodos que comprenden evaluar el estado nodal del sujeto, en donde la ausencia del cáncer en los nodos de linfa en combinación con un nivel arriba del normal de la expresión HoxB13 se utiliza para indicar el potencial incrementado para la metástasis y/o invasión o migración. Tales métodos se pueden aplicar ventajosamente para reducir la probabilidad de una determinación de nodo negativo que da por resultado el tratamiento inadecuado de un paciente. La habilidad de la invención para determinar sí tales sujetos de nodo negativo puede estar en riesgo incrementado de cáncer invasivo o metastático, basado en la expresión de HoxB13, permite a una persona experta determinar sí un estado de nodo negativo incluye un potencial incrementado para la metástasis. Como es reconocido por la persona experta, un ejemplo de un fenotipo invasivo es la expansión de una masa de tumor primario (u original) en el tejido circundante, sin un requerimiento para que las células se desunan y una masa de un tumor invadan un diferente o una parte diferente de un organismo. Otro ejemplo está en la difusión, o metástasis, de células de cáncer de una parte de un organismo a otra parte (o tejido diferente) . Esto requiere que las células de cáncer sean localizadas desde su localización inicial y luego dan origen a uno o más tumores secundarios (o metastáticos) como parte del proceso metastático. Así las células del carcinoma ductal invasivo no son necesariamente metastáticas, debido a que meramente tienen la habilidad para expandirse más allá del medio ambiente ductal en el tejido de seno circundante sin necesariamente tener potencial metastático. Sin embargo, la invención proporciona la habilidad para identificar tales células por tener potencial metastático basado en la expresión de HoxB13. También como es conocido para la persona experta, las células que se han metastasizado pueden, o no pueden retener el potencial para metastasizarse adicionalmente. Como tales las células de un tumor secundario o metastático pueden o no pueden tener expresión de HoxB13 elevada como es descrito en 'la presente. En algunas modalidades, la expresión de HoxB13 se miden en células de un cáncer seleccionado del Adenocarcinoma de Seno, Adenocarcinoma de Cerviz, Adenocarcinoma de Esófago, Adenocarcinoma de Vesícula Biliar, Adenocarcinoma de Pulmón, Adenocarcinoma de Páncreas, Adenocarcinoma de Intestino Delgado-Grueso, Adenocarcinoma de Estómago, Astrocitoma, Carcinoma de Célula Basal de la Piel, Colangiocarcinoma del Hígado, Adenocarcinoma de Célula Clara de Ovario, Linfoma de Célula-B Difuso, Carcinoma Embrional de Testículo, Carcinoma Endometrioide de Útero, Sarcoma de Ewings, Carcinoma Folicular de Tiroides, Tumor Estromal Gastrointestinal, Tumor de Célula Germinal de Ovario, Tumor de Célula Germinal de Testículo, Glioblastoma Multiforme, Carcinoma Hepatocelular de Hígado, Linfoma de Hodgkin, Carcinoma de Célula Grane de Pulmón, Leiomiosarcoma, Liposarcoma, Carcinoma Lobular de Seno, Histiocitoma Fibroso Maligno, Carcinoma Medular de Tiroides, Melanoma, Meningioma, Mesotelioma de Pulmón, Adenocarcinoma Mucinoso de Ovario, Miofibrosarcoma, Tumor Neuroendocrino de Intestino, Oligodendroglioma, Osteosarcoma, Carcinoma Papilar de Tiroides, Feocromocitoma, Carcinoma de Célula Renal de Riñon, Rabdomiosarcoma, Seminoma de Testículo, Adenocarcinoma Seroso de Ovario, Carcinoma de Célula Pequeña de Pulmón, Carcinoma de Célula Escamosa de Cerviz, Carcinoma de Célula Escamosa de Esófago, Carcinoma de Célula Escamosa de Laringe, Carcinoma de Célula Escamosa de Pulmón, Carcinoma de Célula Escamosa de la Piel, .Sarcoma Sinovial, Linfoma de Célula T, o Carcinoma de- Célula Transicional de Vejiga. En otras modalidades, la expresión de HoxBl3 se mide en células, o células de cáncer, de un tejido seleccionado de Adrenal, Vejiga, Hueso, Cerebro, Seno, Cerviz, Endometrio, Esófago, Vesícula Biliar, Riñon, Laringe, Hígado, Pulmón, Nodo de Linfa, Ovario, Páncreas, Próstata, Piel, Tejido Blando, Intestino Delgado/Grueso, Estómago, Testículo, Tiroides, o Útero. La invención está basada en parte en dos descubrimientos. El primero es que la expresión de HoxB13 se incrementa en cánceres primarios pre-invasivos e invasivos, tal como el cáncer de seno y melanoma. El segundo es que la expresión ectópica de HOXB13 en células MCF10A y AN10 potencia la migración e invasión celular, indicando que la expresión HOXB13 contribuye a la invasión del tumor y metástasis. Las células MCF10A están disponibles del ATCC (Colección Americana de Cultivos Tipo) bajo el número CRL-10317. MCF10A es una línea de células epiteliales mamarias, no tumorigénicas, no transformadas que responde a la insulina, glucocorticoides, y EGF. El nivel incrementado de invasión y/o migración es aumentado por la presencia de EGF, colágeno, o AP1510, un dimerizador sintético que incrementa las interacciones de proteína-proteína (ver Amara y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci, USA 94:10618-10623, (1997) para una discusión de AP1510) . Sin que sea relacionada por la teoría, y ofrecida en el interés de mejora en el entendimiento de la invención, se observa que la cooperación funcional entre las rutas de señalización de HOXB13 y EGFR puede ser relevante en el contexto de la resistencia a tamoxifen debido a que la activación de la ruta dé señalización del factor de crecimiento - (EGFR, ERBB2) pueden causar el crecimiento del tumor resistente a tamoxifen (ver Nicholson y colaboradores, "Epidermal growth factor receptor expression in . breast cáncer: association with response to endocrine therapy". Breast Cáncer Res. Treat. 29:117-25 (1994) y Dowsett "Overexpression of HER-2 as a resistance mechanism to hormonal therapy for seno cáncer". Endocr. Relat. Cáncer 8:191-5 (2001)). Dada la función conocida de la sobreexpresión de ERBB2 en el cáncer de seno humano, la aparente interacción in vi tro entre la expresión HOXB13 y las rutas de señalización de EGF pueden indicar a posibles opciones terapéuticas en humores con alta expresión de HOXB13. De hecho, la dirección de la ruta de ERBB2 a través de los anticuerpos de bloqueo (Herceptin) se han sugerido en el contexto de la resistencia a tamoxifen basado entre el enlace entre la activación de las rutas de señalización del factor de crecimiento o el crecimiento del tumor independiente de estrógeno. H0XB13 también puede tener un efecto directo en la señalización de ER, puesto que las proteínas homeobox se han mostrado que inhiben la actividad de histona acetiltransferase de CBP/p300 (ver Shen y colaboradores, "The HOX homeodomain proteins block CBP histone acetyltransferase activity". Mol Cell Biol 21:7509-22 (2001) ) , un co-activador clave para la regulación transcripcional dependiente de ER (ver Chakravarti y colaboradores, "Role of CBP/P300 in nuclear receptor signaling". Nature 383:99-103 (1996) y Hanstein y colaboradores, "p300 is a component of an estrogen receptor coactivator complex". Proc Nati Acad Sci. USA 93:11540-5 (1996) ) . Por lo tanto, HOXB13 puede estar involucrado directa o indirectamente en la modulación de las rutas de señalización de ER, una posibilidad que es de interés particular dada su correlación clínica con la resistencia a tamoxifen. Así, la invención también proporciona métodos para predecir el efecto de tratamiento de las terapias dirigidas en sensibilidad o responsividad de un cáncer, tal como el cáncer de seno o melanoma, al estrógeno o EGF. En alunas modalidades, el método comprende determinar el nivel de expresión de HoxB13 en donde una expresión arriba de lo normal predeciría la carencia de sensibilidad o responsividad a terapias dirigidas en el receptor de estrógeno (por ejemplo, el uso de un agente "antiestrógeno") para prevenir o reducir la invasión, migración, y/o metástasis por las células. Tales terapias incluyen el tratamiento con uno o más (o una combinación de) moduladores de receptor de estrógeno específico '(SERMs) , similar a Tamoxifen; reguladores hacia abajo del receptor de estrógeno específico (SERDs) ; Inhibidores de aromatasa (Ais) , incluyendo agente no esteroidales o esteroidales; e inhibidores irreversibles del receptor de estrógeno. A la inversa, la carencia de la expresión de HoxBl3 incrementada predeciría la eficacia de tales terapias para prevenir o reducir la invasión, migración, y/o metástasis por las células. La aromatasa es una enzima que proporciona una fuente mayor de estrógeno en los tejidos del cuerpo incluyendo el seno, hígado, músculo y grasa. Ejemplos de Ais no esteroidales, que inhiben la aromatasa por la vía del grupo protésico heme, incluyen, pro no están limitados a, anastrozol (arimidex) , letrozol (femara) , y vorozol (rivisor) . Ejemplos de Ais esteroidales, que inactivan la aromatasa, incluye, pero no están limitados a, exemestano (aro asin) , androstenediona, y formestano (lentaron) . Otras formas de terapia para reducir los niveles de estrógeno incluyen la ablación ovárica quirúrgica (remoción física de los ovarios) o química (uso de agentes para bloquear la producción ovárica de estrógeno). Un ejemplo no limitativo de estos últimos son los agonistas de la hormona de liberación de gonadotropina (GnRH), tal como goserelin (zoladex). De manera similar, las modalidades de la invención incluye un método que comprende determinar el nivel de HoxBl3 en donde una expresión arriba de lo normal la sensibilidad o responsividad. a las terapias dirigidas en la ruta de transducción de señal de EGF para prevenir o reducir la invasión, migración y/o metástasis por las células. Tales terapias incluyen el tratamiento con agentes que interactúan directamente con la familia del receptor EGF, similar a erbitux, e inhibidores de tirosina quinasa, similar a Iressa y Tarceva. Otras terapias incluyen aquellas que dirigen o inhiben otros factores (tales como proteínas y enzimas como ejemplos no limitativos) en la ruta del receptor EGF. A la inversa, la carencia de la expresión de HoxB13 incrementada predeciría la carencia de eficacia de tales terapias para prevenir o' reducir la invasión, migración y/o metástasis por las células. Los tratamientos similares a aquellos descritos en lo anterior se pueden proporcionar pre-operativamente, tal como parte del tratamiento neoadyuvante, o post- operativamente, tal como el tratamiento de adyuvante. En casos de tratamientos pre-operativos, ejemplos no limitativos de los efectos del tratamiento incluyen la respuesta completa, intermediaria o sin respuesta, tal como aquellos basados en la "respuesta clínica" o "respuesta patológica". Alternativamente, los efectos pueden ser la regresión de la enfermedad o la enfermedad estable (tal como la carencia de metástasis o invasión) , o progresión de la enfermedad (tal como la metástasis subsecuente o recurrencia de cáncer) . En casos de tratamientos post-operativos, ejemplos no limitativos de efectos de tratamiento incluye la metástasis de cáncer o invasión que dan por resultado la recurrencia local, recurrencia regional, recurrencia contralateral, recurrencia distante, primaria secundaria, y muerte o supervivencia debido al cáncer. Otros efectos incluyen, en relación a la metástasis o invasión, supervivencia libre de recaída, supervivencia libre de enfermedad, y supervivencia total. En algunas modalidades la presente invención de esta manera puede ser ventajosamente utilizada en combinación con la intervención quirúrgica (Por ejemplo, remoción quirúrgica de un tumor completo o en partes) en donde el tejido quirúrgicamente removido es probado para- la expresión de HoxB13 como es descrito en la presente. El nivel de expresión puede ser utilizado como un indicador o predictor de la probabilidad de recurrencia de cáncer local, regional, distante, o contralateral; la ocurrencia de uno o más tumores metastasizados, tal como aquel que resulta de la micrometástasis; una primaria secundaria; o muerte o supervivencia, tal como la supervivencia libre de recaída o recurrencia, supervivencia libre de enfermedad y supervivencia total . Volviendo ahora a varios modos no limitativos para practicar la invención, se debe observar que mientras que la invención puede ser practicada basada en la entidad de homeobox B13 (HOXB13) humano, que se ha mapeado al cromosoma 17 humano en 17q21.2, y contrapartes de animales del mismo para la determinación de células invasivas en animales no humanos, la invención también puede ser practicada con otra secuencia de la expresión de la cual es correlacionada con la expresión de la secuencias HoxB13. Los niveles de expresión de las secuencias HoxB13 pueden ser utilizados solos o en combinación con otras secuencias capaces de determinar varios fenotipos o características de células de cáncer en comparación a las células no de cáncer o normales. Como un ejemplo no limitativo, la invención puede ser practicada tal que los niveles de expresión de ambos receptores de HoxB13 y EGF sean analizados. Las células utilizadas en la práctica de la invención pueden expresar una cantidad detectable de un receptor proteináceo para el factor de crecimiento epidérmico (EGF) . En algunas modalidades, tales células are responsivas del factor de crecimiento epidérmico (EGF) o son estimuladas para proliferar en la presencia de EGF. Alternativamente, la invención puede ser practicada tal que los niveles de la expresión de HoxB13 son evaluados en combinación con el estado nodal. En algunas modalidades, la expresión de las secuencias de HoxB13 se utiliza en combinación con la expresión de otro gene (tal como, pero no limitado a un gen de referencia que es expresado a los mismos niveles en tanto células de cáncer como no de cáncer o normales) en la misma, muestra que contiene células, tal como en el formato de una relación de niveles de expresión que pueden fácilmente indicar la expresión de HoxB13 como incrementada o no incrementada. Alternativamente, la invención proporciona relaciones del nivel de expresión de una secuencia de HoxB13 al nivel de expresión de una secuencia que es subexpresada en una célula invasiva como un indicador- de la invasividad o potencial invasivo; la migración incrementada o el potencial por migración incrementada; o el potencial metastático incrementado. Ejemplo no limitativos incluye una relación de la expresión de Hoxbl3 a la expresión a IL17br en una relación de la expresión de Hoxbl3 a Chdh como se expone en la solicitud norteamericana 10/773,761, presentada el 6 de febrero del 2004. Por supuesto una relación de la expresión de HoxB13 a la expresión de otros genes con la expresión similar a IL17br y Chdh en células de cáncer también puede ser utilizada. La persona experta fácilmente reconocerá que la medición de los niveles de expresión. de HoxB13 pueden ser utilizados ya sea como el numerador o denominador en tales relaciones sin complicación dada la relación entre la expresión de HoxB13 y los fenotipos de cáncer como es descrito en la presente. El foco en la expresión de la secuencia de expresión de HoxBl3 proporciona una manera para diagnosticar y/o determinar el tratamiento para un sujeto afligido con cáncer basado en un criterio molecular, objetivo. Esta metodología también puede ser utilizada la prognosis del paciente y el efecto de enfermedad probable. Los métodos de la invención son un adelanto sobre el uso de la citomorfología y para identificar el riesgo al paciente. En algunas modalidades, los métodos pueden ser utilizados en combinación con estimaciones del riesgo relativo de cáncer de seno tal como es discutido por Tan-Chiu y colaboradores (J Nati Cáncer Inst. 95 (4) : 302-307, 2003). Ejemplos no limitativos incluyen el análisis del muestreo mínimamente invasivo, tal como aspirados de aguja fina aleatoria (periareolar) o muestras de lavado ductal (y opcionalmente en combinación con o como una adición a un mamógrafo positivo para el cáncer de seno benigno o maligno) , de células de seno para los niveles de expresión de las secuencias de HoxB13 como es descrito en la presente. Otras aplicaciones de la invención incluyen el análisis de cáncer de seno por adelantado, 'incluyendo el cáncer que se sospecha de ser de naturaliza metastática. Un método de análisis de la invención puede utilizar un medio relacionado con el nivel de expresión de una secuencia HoxB13 mientras que en ensayo refleje, cuantitativamente o cualitativamente, la expresión de la secuencia. En algunas modalidades, se utiliza un medio de ensayo cuantitativo. La habilidad para detectar las características metastáticas, de invasividad y/o migración es proporcionada por el reconocimiento de la relevancia del nivel de expresión de HoxB13 y no por la forma del ensayo utilizado para determinar el nivel de real de expresión. Las características de identificación de las secuencias incluyen, pero no están limitadas a, secuencias de ácido nucleico únicas utilizadas para codificar (DNA) , o expresar (RNA) , una secuencia de HoxB13 o epítopes específicas o actividades de, las proteínas codificadas por una secuencia HoxB13. Otro medio es mediante la desmetilación del DNA que codifica HoxB13, que es normalmente metilado en muchos tejidos, como un indicador de la expresión incrementada. Los medios alternativos incluyen la detección de la amplificación de ácido nucleico como indicativa de los niveles de expresión incrementados y la inactivación de ácido nucleico, supresión o metilación> como indicativo de los niveles de expresión disminuidos . Mencionado de manera diferente, la invención puede ser practicada al analizar uno o más aspectos de la(s) plantilla (s) de DNA que implican la expresión de la(s) secuencia (s) de HoxB13, del RNA utilizado como intermediario para expresar la(s) secuenci (s) , del producto proteináceo expresado por la(s) secuencia (s) , así como fragmento proteolíticos de tales productos. Como tal, la detección de la presencia de, cantidad de, estabilidad de, o degradación (incluyendo la proporción) de, tal DNA, RNA y moléculas proteináceas pueden ser utilizadas en la práctica de la invención. Por supuesto una medición de cualquier molécula de ácido nucleico de HoxB13 puede ser conducida mediante el uso de hibridación a una secuencia de sonda como un ejemplo no limitativo. Además, la función, o modificación post-traduccional, de un producto codificado de HoxB13 puede ser analizada como un indicador de expresión. Ejemplos no limitativos incluyen medición de la interacción de la proteína HOXB13 con uno o más asociados de enlace o de modificación covalente de un polipéptido HOXB13, como tal, pero no limitado a, fosforilación, glicosilación o acilación. Como será apreciado por la persona experta, la medición del nivel de expresión de HoxBl3 puede ser utilizada para definir una población de sujetos o pacientes en por lo menos dos poblaciones, tales como arriba y por debajo de un nivel de expresión, tal como aquel de una célula normal. La práctica de la presente invención no es afectada por la presencia de desigualaciones menores entre una secuencia HoxB13 particular y aquella expresada por las células de una muestra del sujeto. Un ejemplo no limitativo de la existencia de tales desigualaciones se observa en el caso de los polimorfismos de secuencia entre individuos de una especie, tal como pacientes humanos individuales dentro de Homo sapiens . El conocimiento de que la expresión de una secuencia HoxB13 (y secuencias que varían debido a desigualaciones menores) está correlacionado con la invasividad, y/o el fenotipo de migración es suficiente para la práctica de la invención con una muestra que contiene células apropiadas por la vía de un ensayo para la expresión. En algunas modalidades, una muestra que contiene células utilizada en la presente invención contiene células individuales o poblaciones de células homogéneas que se han disectado, o de otra manera aislado o purificado de, las células contaminantes más allá de lo posible por una biopsia posible. Las células pueden ser de cualquier fuente, tal como, pero no limitado a una muestra que contiene fluido, que contiene células o que contiene tejidos de un organismo tal como un ser humano. Otros ejemplos no limitativos incluyen biopsias, tal. como una biopsia pre-cancerosa o una biopsia diagnosticada de cáncer. La(s) célula (s) también puede ser aquella identificada como atípica o pre-cancerosa, pero que el uso con la presente invención permite la identificación de un fenotipo invasivo como es descrito en la presente. Los métodos para aislar células son conocidos en la técnica e incluyen microdisección, microdisección de captura de láser (LCM) , o microdisección de láser (LMD) . Alternativamente, las células no disectadas dentro de una "sección" de tejido puede ser utilizada. Múltiples medios para tal análisis están disponibles, incluyendo la detección de la expresión dentro de un ensayo para la expresión de gen global o casi global en una muestra (por ejemplo, como parte de un análisis de perfilamiento de expresión de gen tal como en un microarreglo) o mediante la detección específica, tal como la PCR cuantitativa (Q-PCR) , o PCR cuantitativa en tiempo real. Otras técnicas de medición no limitativas incluyen aquellas basadas en la espectroscopia de masas. En modalidades . adicionales, la muestra se aisla por la vía de un medio no invasivo o mínimamente invasivo. En algunas modalidades de la invención, la muestra contiene una o más células de cáncer de seno seleccionadas de hiperplasia ductal atípica (ADH) , carcinoma ductal in situ (DCIS) y carcinoma ductal invasivo (IDC) . La expresión de una(s) secuencia (s) HoxB13 en la muestra puede ser determinada y comparada con la expresión de la(s) secuencia (s) en los datos de referencia de células normales o no de cáncer. En algunos casos, los datos de referencia se obtienen de la misma muestra o sujeto. En modalidades de la invención que utilizan Q-PCR, el nivel de expresión puede ser comparado a niveles de expresión de uno o más genes de referencia en la misma muestra o una relación de niveles de expresión (tal como uno basado en ?Ct como un ejemplo no limitativo) puede ser utilizado. Así, la invención fácilmente puede ser utilizada para identificar células de ADH, DCIS y/o IDC que tienen un fenotipo de cáncer, tal como el potencial metastático, como es descrito en la presente. Esto también permite ventajosamente la identificación de células ADH o DCIS como que tienen potencial o propensidad invasiva. Cuando las células de seno o de cáncer individuales se aislan en la práctica de la invención, un beneficio es que la células no de seno o no de cáncer contaminantes (tales como linfocitos de infiltración u otras células del sistema inmune) no están presentes para afectar posiblemente la detección de la expresión de la(s) secuencia (as) de HoxB13. Mientras que la presente invención se describe principalmente en el contexto de cáncer de seno humano, esta se puede practicar en el contexto de cualquier cáncer humano o el cáncer de cualquier animal. Los animales preferidos para la aplicación de la presente invención son mamíferos, particularmente aquellos importantes para aplicaciones de la agricultura (tales como, pero no limitados a, ganado vacuno, ovejas, caballos y otros "animales de granja"), y animales para la compañía humana (tales como, pro no limitados a, perros y gatos) . Como se utiliza en la presente, un "gen" es un polinucleótido que codifica un producto discreto, ya sea RNA o de naturaleza proteinasea. Se aprecia que más de un polinucleótido puede ser capaz de codificar un producto discreto. El término incluye alelos y polimorfismos de un gen que codifica el mismo producto, o un análogo funcionalmente asociado (incluyendo ganancia, pérdida o modulación de la función) del mismo, basado en la localización cromosómica en la habilidad para recombinarse durante la mitosis normal. Una "secuencia" o "secuencia de gen" como se utiliza en la presente es una molécula de ácido nucleico o polinucleótido compuesta de un orden discreto de bases de nucleótido. El término incluye el ordenamiento de bases que codifica un producto discreto (es decir, "región de codificación"), ya sea RNA o de naturaleza proteinasea. Se aprecia que más de un polinucleótido puede ser capaz de codificar un producto discreto. También se aprecia que los alelos y polimorfismos de la secuencia HoxB13 divulgadas pueden existir o pueden ser utilizadas en la práctica de la inyención para identificar el (los) nivel (es) de expresión de las secuencias HoxB13 divulgadas o un alelo o polimorfismo de las mismas. La identificación de un alelo o polimorfismo depende en parte de la localización cromosómica y la habilidad para recombinarse durante la mitosis. Los términos "correlacionar" o "correlación" o equivalentes de los mismos se refieren a una asociación entre la expresión de uno o más genes y un fenotipo o característica fisiológica. Un "polinucleótido" es una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, ya sea ribonucleótidos o desoxiribonucleótidos . Este término se refiere solamente a la estructura primaria de la molécula. Así, este término incluye DNA de doble y de una sola hebra y RNA. Este también incluye tipos conocidos de modificaciones incluyendo marcas conocidas en la técnica, metilación, "terminaciones", sustitución de uno o más de los nucleótidos que ocurren naturalmente con un análogo y modificaciones de internucleótido tales como enlaces sin carga (por ejemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), así como formas no modificadas del polinucleótido . El término "amplificar" se utiliza en el sentido amplio para dar a entender la creación de un producto de amplificación que se puede hacer enzimáticamente con DNA o RNA polimerasas. La "amplificación" como se utiliza en la presente, se refiere generalmente al proceso de producir múltiples copias de una secuencia deseada, particularmente aquella de una muestra. "Múltiples copias" significa por lo menos 2 copias. Una "copia" no necesariamente significa la complementariedad de secuencia perfecta o identidad de la secuencia de plantilla. Los métodos para amplificar mRNA son generalmente conocidos en la técnica, e incluye la PCR de transcripción inversa (RT-PCR) y aquellos descritos en la solicitud de patente norteamericana 10/062,857 (presentada el 25 de octubre de 2001) , así como las solicitudes de patentes provisionales norteamericanas 60/298,847 (presentada el 15 de junio de 2001) y 60/257,801 (presentada el 22 de diciembre del 2000) , todas las cuales son incorporadas en la presente por referencia en sus totalidades como sí se expusieran completamente. Otro método que puede ser utilizado es la PCR cuantitativa (o Q-PCR) . Alternativamente, RNA puede ser marcado directamente como el cDNA correspondiente por métodos conocidos en la técnica. Por "correspondiente" se propone que una molécula de ácido nucleico comparte una cantidad sustancial de identidad de secuencia con otra molécula de ácido nucleico. Cantidad sustancial significa por lo menos 95%, usualmente por lo menos 98%, y más usualmente por lo menos 99%, y la identidad de secuencia se determina utilizando el algoritmo BLAST, como es descrito en Altschul y colaboradores, (1990), J. Mol. Biol. 215:403-410 (utilizando el conjunto de errores publicados, es decir, parámetros w=4, t=17) . Un "microarreglo" es un arreglo lineal o bidimensional o tridimensional (y en fase sólida) de preferencia de regiones discretas, cada una que tiene un área definida, formada en la superficie de un soporte sólido tal como, pero no limitado a, vidrio, plástico, o membrana sintética. La densidad de las regiones discretas en un microarreglo se determinan por los números totales de polinucleótidos inmovilizados que son detectados en la superficie de un solo soporte de fase sólida, de preferencia por lo menos aproximadamente 50/cm2, más de preferencia por lo menos aproximadamente 100/cm2, aún más de preferencia por lo menos aproximadamente 500/cm2, pero de preferencia por debajo de aproximadamente 1,000/cm2. De preferencia, el arreglo contiene menos de aproximadamente 500, aproximadamente 1000, aproximadamente 1500, aproximadamente 2000, aproximadamente 2500, o aproximadamente 3000 polinucleótidos inmovilizados en total. Como se utiliza en la presente, un microarreglo de DNA es un arreglo de sondas de oligonucleótido o polinucleótido colocadas sobre un chip u otras superficies utilizadas para hibridar a polinucleótidos amplificados o clonados de una muestra. Puesto que la posición de cada grupo particular de sondas en el arreglo es conocida, las identidades de una muestra de polinucleótidos puede ser determinada basada en su enlace en una posición particular en el microarreglo. Como una alternativa al uso de un microarreglo, un arreglo de cualquier tamaño puede ser utilizado en la práctica de la invención, incluyendo un arreglo de una o más posiciones de un arreglo bidimensional o tridimensional en una fase sólida para detectar la expresión de una sola secuencia de gen. En algunas modalidades, un microarreglo para el uso con la presente invención se puede preparar mediante técnicas fotolitográficas (tal como la síntesis de sondas de ácido nucleico sobre la superficie del extremo 3 ' ) o mediante síntesis nucleica seguido por la deposición sobre una superficie sólida. Debido a que la invención depende de la identificación de la expresión de gen, una modalidad de la invención involucra determinar la expresión mediante la hibridación de mRNA, o una versión amplificada o clonada del mismo, de una célula de muestra a un polinucleótido que es único a una secuencia de HoxB13 particular. Los polinucleótidos preferidos de este tipo contienen por lo menos aproximadamente 16,- por lo menos aproximadamente 18, por lo menos aproximadamente 20, por lo menos aproximadamente 22, por lo menos aproximadamente 24, por lo menos aproximadamente 26, por lo menos aproximadamente 28, por lo menos aproximadamente 30, o por lo menos aproximadamente 32 pares de bases consecutivas de una secuencia HoxB13 que no se encuentra en otras secuencias de gen. El término "aproximadamente" como se utiliza en la oración previa se refiere a un incremento o disminución de 1 del valor numérico establecido. Aún más preferidos son los polinucleótidos de por lo menos o aproximadamente 50, por lo menos aproximadamente 100, por lo menos aproximadamente 150, por lo menos aproximadamente 200, por lo menos aproximadamente 250, por lo menos aproximadamente 300, por lo menos aproximadamente 350, por lo menos aproximadamente 400, por lo menos aproximadamente 450, o por lo menos aproximadamente 500 de bases consecutivas de una secuencia que no se encuentra en otras secuencias de gen. El término "aproximadamente" como se utiliza en la oración precedente se refiere a un incremento o disminución de 10% del valor numérico establecido. Los polinucleótidos más largos por supuesto pueden contener desigualaciones menores (por ejemplo, por la vía de la presencia de mutaciones) que no afectan la hibridación a los ácidos nucleicos de una muestra. Tales polinucleótidos también pueden ser referidos como sondas de polinucleótidos que son capaces de hibridar la secuencia de los genes, o porciones únicas de los mismos, descritos en la presente. Tales polinucleótidos pueden ser marcados para asistir en su detección. De preferencia, las secuencias son aquellas de mRNA codificado por los genes, el cDNA correspondiente a tales mRNAs, y/o versiones amplificadas de tales secuencias.
En modalidades preferidas de la invención, las sondas de polinucleótido se inmovilizan sobre un arreglo, otros dispositivos de soporte sólido, o en puntos individuales que localizan las sondas. En otra modalidad de la invención, todo o parte de una secuencia HoxB13 puede ser amplificada y detectada por métodos tal como la reacción en cadena de polimerasa (PCR) y variaciones de la misma, tales como, pero no limitadas a, PCR cuantitativa (Q-PCR) , PCR de transcripción inversa (RT-PCR) y PCR de tiempo real (incluyendo como un medio para medir las cantidades iniciales de copias de mRNA para cada secuencia de una muestra) , opcionalmente RT-PCR en tiempo real o Q-PCR en tiempo real. Tales métodos utilizarían uno o dos cebadores que son complementarios a las porciones de una secuencia HoxB13, donde los cebadores se utilizan para cebar la síntesis de ácido nucleico. Los ácidos nucleicos recientemente sintetizados son opcionalmente marcados y pueden ser detectados directamente o mediante hibridación a un polinucleótido de la invención. Los ácidos nucleicos recientemente sintetizados se pueden poner en contacto con polinucleótidos (que contienen secuencias) de la invención bajo condiciones que permiten su hibridación. Los métodos adicionales para detectar la expresión de los ácidos nucleicos expresados incluyen los ensayos de protección de RNAsa, - incluyendo las hibridaciones en fase líquida, y la hibridación de células in situ . Alternativamente, y en todavía otra modalidad de la invención, la expresión de HoxB13 se puede determinar mediante el análisis de la proteína expresada en una muestra de .células de interés mediante el uso de uno o más anticuerpos específicos para uno o más epítopes de productos de gen HoxB13 individuales (proteínas), o fragmentos proteolíticos de los mismos. La muestra de células o en un fluido corporal de un sujeto. La muestra de células puede ser una de células epiteliales de cáncer de seno enriquecidas de las células de un sujeto, tal como mediante el uso de anticuerpos marcados contra marcadores de superficie celular seguido por la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) . Tales anticuerpos de preferencia son marcados para permitir su detección fácil después del enlace al producto de gen. Las metodologías de detección adecuadas para el uso en la práctica de la invención incluyen, pero no están limitados a, inmunohistoquímica de muestras que contienen células o tejido, ensayos inmunosorbentes enlazados a enzimas (ELISAs) incluyendo ensayos de intercalación de anticuerpo de muestras de tejido sobre sangre que contienen células, espectroscopia de masas e inmuno-PCR. Los términos "marca" o "marcado" se refieren a una composición capaces de producir una señal detectable indicativa de la presencia de la molécula marcada. En marcas adecuadas incluyen radioisótopos, cromóforos de nucleótido, enzimas, sustratos, moléculas fluorescentes, porciones quimioluminiscentes, partículas magnéticas, porciones bioluminiscentes y los similares. Como tal, una marca es cualquier composición detectable mediante medios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos, eléctricos, ópticos o químicos. El término "soporte" se refiere a soportes convencionales tales como cuentas, partículas, adherentes, fibras, filtros, membranas y soportes de silano o de silicato tales como platinas de vidrio. El concepto de una muestra que contiene células del seno se refiere a una muestra de tejido fluido de seno aislada de un individuo afligido con, o que se sospecha de ser afligido con, o el riesgo de desarrollar cáncer de seno. Tales muestras son aislados primarios (en contraste a células cultivadas) y se pueden recolectar mediante cualquier medio y no invasivo o mínimamente invasivo, incluyendo, pero no limitado a, el lavado ductal, aspiración de aguja fina, biopsia de aguja, dispositivos y métodos descritos en la patente norteamericana 6,328,709, o cualquier otro medio adecuado reconocido en la técnica. Alternativamente, la "muestra" puede ser recolectada mediante un método invasivo, incluyendo, pero no limitado a, la biopsia quirúrgica. • Ejemplos no limitativos de muestras que contienen células para uso de la invención incluyen muestras de fluido, tales como sangre, suero o plasma; muestras enriquecidas para células epiteliales, células endoteliales, células de tumor en circulación o cualquier célula de interés; fluidos que contienen células y/o proteínas, DNA o RNA, tal como orina o lavados de vejiga, o una pelotilla o dispersión de células de los mismos; raspaduras cervicales (por ejemplo, envaramientos de PAP); raspaduras endometriales; evacuación; células bucales; aspirados que contienen células, tales como de aquellos de cualquier masa corporal, incluyendo una masa de tumor; exfoliados que contienen células; y muestras de tejido, tales como aspirados de aguja fina de tejidos, biopsias con aguja, biopsia excisionales y TrinPrep de Cytyc. En algunas- modalidades, la muestra es de un cáncer primario (original) o tumor en un sujeto o paciente. El tumor puede ser opcionalmente positivo de receptor de estrógeno. "Expresión" y "expresión de gen" incluye la transcripción y/o traducción de material de ácido nucleico. Como se utiliza en la presente, el término "que comprende" y su semejante se utilizan en su sentido inclusivo; esto es, equivalente al término "que incluye" y sus semejantes correspondientes. Las condiciones que "permite" que un evento ocurra o condiciones que son "adecuadas" para que un evento ocurra, tal como la hibridación, extensión de hebra y los similares, o condiciones "adecuadas" son condiciones que no previenen tales eventos de que ocurran. Así, estas condiciones permiten, aumentan, facilitan y/o son conducentes al evento. Tales condiciones, conocidos en la técnica y descritas en la presente, dependen de, por ejemplo, la naturaleza de la secuencia de nucleótidos, temperatura y condiciones de solución reguladora. Estas condiciones también dependen de qué evento es deseado, tal como la hibridación, segmentación, extensión de hebra o transcripción. "Mutación" de secuencia, como se utiliza en la presente, se refiere a cualquier alteración de la secuencia en la secuencia de un gen divulgado en la presente de interés en comparación a una secuencia de referencia. Una mutación de secuencia incluye cambios de nucleótidos individuales, o alteraciones de más de un nucleótido en una secuencia, debido a mecanismos tales como sustitución, supresión o inserción. El polimorfismo de nucleótido individual (SNP) también es una mutación de secuencia como se utiliza en la presente. Debido a que la presente invención está basada en el nivel relativo de la expresión de gen, las mutaciones en las regiones de no codificación de genes como es divulgado en la presente también pueden ser analizadas en la práctica de la invención. "Detección" o "detectando" incluye cualquier medio de detección, incluyendo la detección directa e indirecta de la expresión de genes y cambios en la misma. Por ejemplo, un "incremento detectable" de un producto puede ser observado directamente o indirectamente, y el término indica cualquier incremento. Un "incremento detectable" de un producto puede ser observado directamente o indirectamente, y el término indica cualquier disminución (incluyendo la ausencia de señal detectable) . Los incrementos y disminuciones en la expresión de una secuencia HoxB13 se define en los siguientes términos basados en el por ciento o los cambios en veces sobre la expresión en células normales. Los incrementos pueden ser de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180 o 200% con relación a los niveles de expresión en células normales. Alternativamente, los incrementos en veces pueden ser de 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5 o 10 veces sobre los niveles de expresión en células normales. Las disminuciones pueden ser de 10, 20, 30, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 99 o 100% con relación a los niveles de expresión en células normales . Un "modulador de receptor de estrógenos selectivo" o SERM es un agente "antiestrógeno" que en algunos tejidos actúa similar a estrógeno (agonista) pero bloquea la acción del estrógeno en otros tejidos (antagonista) . Un "regulador hacia abajo del receptor de estrógeno selectivo" (o "SERD"s) o antiestrógeno "puro" incluyen agentes que bloquean la actividad de estrógeno en todos los tejidos. Ver Howell y colaboradores (Best Bractice & Res. Clin. Endocrinol. Metab. 18(l):47-66, 2004). Los SERMs preferidos de la invención son aquellos que son antagonistas de estrógeno en tejidos y células de seno, incluyendo aquellos de cáncer de seno. Ejemplos no limitativos de tales incluyen TAM, raloxifen, GW5638, e ICI 182,780. Los mecanismos posibles de acción por varios SERMs han sido revisados (ver, por ejemplo Jordán y colaboradores, 2003, Breast Cáncer Res. 5:281-283; Hall y colaboradores, 2001, J. Biol. Chem. 276 (40) : 36869-36872; Dutertre y colaboradores, 2000, J. Pharmacol. Exp. Therap. 295(2) : 431-437; y ijayaratne y colaboradores, 1999, Endocrinology 140 (12) : 5828-5840) . Otros ejemplos no limitativos ya sea SERMs en el contexto de la invención incluyen trifeniletilenos, tales como tamoxifen, G 5638, TAT-59, clomifeno, toremifen, droloxifen e idoxifen; benzotiofenos, tal como arzosifeno (LY353381 o LY353381-HC1) ; benzopiranos, tal como EM-800; naftalenos, tal como CP-336,156; y ERA-923. Ejemplos no limitativos de SERD o antiestrógenos "puro" incluyen agentes tales como ICI 182,780 (fulvestrant o faslodex) o el análogo oral SR16243 y ZK 191703 así como inhibidores de aromatasa y agentes de ablación ováricos químicos como es descrito en la presente. Otros agentes comprendidos por SERM como se utiliza en la presente incluyen el inhibidor de receptor de progesterona y fármacos relacionados, tales como progestomiméticos similares a acetato de medroxiprogesterona, megace y RU-486; e inhibidores basados en péptido de acción ER, tales como análogos de LH-RH (leuprolide, zoladex, [D-Trp6] LH-RH) , análogos de somatostatina e imitaciones de la porción LXXLL de ER así como tibolona y resveratrol. Como es mencionado en lo anterior, los SERMs preferidos de la invención son aquellos que son antagonistas de estrógeno en tejidos y células sensibles, incluyendo aquellos de cáncer de seno. Ejemplos no limitativos de SERMs preferidos incluyen los metabolitos actuales o contemplados { in vivo) de cualquier SERM, tal como, pero no limitados a, 4-hidroxitamoxifen (metabolito de tamoxifen) , EM652 (o SCH 57068 donde EM-800 es un profármaco de EM-652), y GW7604 (metabolito de G 5638). Ver Willson y colaboradores (1997, Endocrinology 138 (9) : 3901-3911) y Dauvois y colaboradores, (1992, Proc. Nat'l. Acad. Sci., USA 89:4037-4041) para discusiones de algunos SERMs específicos. Otros SERMs preferidos son aquellos que producen el mismo perfil de expresión de gen relevante como tamoxifen o 4-hidroxitamoxifen. Un ejemplo del medio para identificar tales SERMs es proporcionado por Levenson y colaboradores (2002, Cáncer Res. 62:4419-4426). A menos que se defina de otra manera todos los 52 términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado como es entendido comúnmente para un experto ordinario en la técnica a la cual esta invención pertenece . 5 Para determinar los niveles de expresión (incrementados o disminuidos) de HoxB13 en la práctica de la presente invención, se puede utilizar cualquier método conocido en la técnica. En una modalidad preferida de la invención, se utiliza la expresión basada en la detección de 10 RNA que híbrida los genes identificados y divulgados en la presente. Esto es fácilmente realizado mediante cualquier método de detección de RNA o de amplificación+detección como es descrito en la presente o conocido o reconocido como equivalente en la técnica tal como, pero no limitado a, 15 métodos para detectar la presencia, o ausencia, de secuencias estabilizantes o desestabilizantes de RNA. Alternativamente, la expresión basada en la detección del estado de DNA puede ser utilizado. La detección del gen HoxB13 como es metilado o suprimida puede ser 20 utilizada para detectar la expresión disminuida. El estado de las regiones promotoras de H0XB13 se puede analizar como una indigestión de la expresión disminuida de la secuencia HOXB13. Un ejemplo no limitativo es el estado de metilación de las secuencias encontradas en la región del promotor. A la 25 inversa, la descripción del gen HoxB13 como amplificado se puede utilizar para genes que tienen expresión incrementada en correlación con un efecto de cáncer de seno particular.
Estos métodos pueden ser fácilmente realizados mediante PCR basada, en la hibridación fluorescente in situ (FISH) y la 5 hibridación de cromosomas in situ (CISH) métodos que son conocidos en la técnica. La expresión basada en la detección de una presencia, incremento, o disminución en los niveles o la actividad de la proteína H0XB13 también pude ser utilizada. 10 La detección se puede realizar mediante cualquier método basado en la inmunohistoquímica (IHC) , basado en el fluido corporal (donde un polipéptido HOXB13 o fragmento del mismo se encuentra en un fluido corporal, tal como pero no limitado a sangre) , basado en anticuerpo (incluyendo autoanticúerpos 15 contra la proteína de donde estuvieron presentes) , basado en célula exfoliada (del cáncer) basado, en la espectroscopia de masas y basado en imágenes (incluyendo el uso del ligando marcado) conocidos en la técnica y reconocidos como apropiados para la detección de la proteína. Los métodos 20 basados en anticuerpo e imagen son adicionalmente útiles para la localización de tumores después de la determinación del cáncer mediante el uso de células obtenidas mediante el procedimiento no invasivo (tal como el lavado ductal o la aspiración de aguja fina) , donde la fuente de las células 25 cancerosas no es conocido. El anticuerpo o ligando marcado puede ser utilizado para localizar el (los) carcinoma (s) dentro de un paciente o para ayudar en el enriquecimiento de las células de cáncer exfoliadas de un fluido corporal. Los anticuerpos para el uso en tales métodos de 5 detección incluyen anticuerpos policlonales, opcionalmente aislados de fuentes que ocurren naturalmente donde es disponible, y anticuerpos monoclonales, incluyendo aquellos preparados mediante el uso de polipéptido H0XB13 o fragmentos de los mismos como antígenos. Tales anticuerpos, así como 10 fragmentos de los mismos (incluyendo pero no limitados a fragmentos Fab) funcionan para detectar o diagnosticar células no normales o de cáncer en virtud de su habilidad para enlazar específicamente polipéptidos HOXB13 para la extrusión de otros polipéptidos para producir una señal 15 detectable. Los anticuerpos recombinantes, - sintéticos e híbridos con la misma habilidad también pueden ser utilizados en la práctica de la invención. Los anticuerpos pueden ser fácilmente generados mediante la inmunización con un polipéptido HOXB13 o fragmento del mismo, y el suero 20 policlonal también puede ser utilizado en la práctica de la i.nvenci.ó.n. Los métodos de detección basados en anticuerpo son bien conocidos en la técnica e incluyen los ensayos de intercalaciones de ELISA así como el manchado de Western y 25 los ensayos basados en citometría de flujo como ejemplos no limitativos. Muestras para el análisis de tales métodos incluyen aquellas que contienen polipéptidos H0XB13. Ejemplos no imitativos incluyen aquellos que contienen células de seno y contenidos de células así como fluidos corporales (incluyendo sangre, suero, saliva, fluido linfático, así como secreciones de la mucosa u otras secreciones celulares como ejemplos no limitativos) que contienen los polipéptidos. Una modalidad preferida que utiliza un arreglo basado en ácido nucleico para determinar la expresión es mediante la inmovilización de una o más secuencias HoxB13 sobre un soporte sólido, incluyendo, pero no limitado a, un sustrato sólido como un arreglo o a cuentas o la tecnología basada en cuentas como es conocido en la técnica. Alternativamente, los ensayos de expresión basados en la solución conocidos en la técnica también pueden ser utilizados. El (los) gen (es) HoxBl3 inmovilizado puede estar en la forma de polinucleótidos que son únicos o de otra manera específicos a HoxB13 tal que el polinucleótido será capaz de hibpdar a un DNA o RNA de HoxB13. Estos polinucleótidos pueden ser la longitud completa del (los) gen (es) HoxBl3 o ser secuencias cortas de los genes (hasta un nucleótido más corto que la secuencia de longitud completa conocido en la técnica por la supresión del extremo 5' o 3' de la secuencia) que son de manera opcional mínimamente interrumpidas (tales como mediante desigualaciones o pares de bases no complementarias insertadas) tal que la hibridación con un DNA o RNA correspondiente a HoxB13 no es afectada. De preferencia, los polinucleótidos utilizados son del extremo 3' del gen, tal como dentro de aproximadamente 350, 5 aproximadamente 300, aproximadamente 250, aproximadamente 200, aproximadamente 150, aproximadamente 100 o aproximadamente 50 nucleótidos de la señal de poliadenilación o sitio de poliadenilación de un gen o secuencia expresada. Los polinucleótidos que contienen mutaciones relativas a las 10 secuencias de los genes divulgados también se puede utilizar mientras que la presencia de las mutaciones todavía permite la hibridación que produzca una señal detectable. El (los) gen (es) HoxB13 inmovilizado se puede utilizar para determinar el estado de las muestras de ácido 15 nucleico preparadas de la(s) célula (s) de seno de muestra para la cual el efecto del sujeto de la muestra (por ejemplo, el paciente de quién se obtiene la muestra) no es conocido para la confirmación de un efecto que es ya asignado al sujeto de la muestra. Sin limitar la invención, tal célula 20 puede ser de un paciente con cáncer de seno ER+ o ER- . El (los) polinucleótido (s) inmovilizado necesita solamente ser suficiente para hibridar específicamente las moléculas de ácido nucleico correspondientes derivados de las muestras bajo condiciones adecuadas. 25 Como será apreciado por aquellos expertos en la técnica, algunas secuencias HoxB13 incluyen estiramientos 3' poli A (o poli T en la hebra complementaria) que no contribuyen a la unicidad de las secuencias divulgadas . La invención de esta manera puede ser practicada con secuencias HoxB13 que carecen de los estiramientos 3' poli A (o poli T) . La unicidad de las secuencias divulgadas se refiere a las porciones o totalidades de la secuencias que se encuentran solamente en ácidos nucleicos, incluyendo secuencias únicas encontradas en la porción no traducida 3' de la misma. Las secuencias únicas preferidas para la práctica de la invención son aquellas que contribuyen a las secuencias consensúales para HoxB13 tal que las secuencias únicas serán útiles en detectar la expresión en una variedad de individuos antes de que sea específica para un polimorfismo presente en algunos individuos. Alternativamente, las secuencias únicas a un individuo o una subpoblación pueden ser utilizadas. Las secuencias únicas preferidas de preferencia son de la longitud de polinucleótidos de la invención como es discutido en la presente. En modalidades particularmente preferidas de la invención, los polinucleótidos que tienen secuencias presentes en las regiones no traducidas 3' y/o de no codificación de las secuencias HoxB13 se utilizan para detectar los niveles de expresión en células de cáncer o células de cáncer de seno en la práctica de la invención.
Tales polinucleótidos opcionalmente pueden contener secuencias encontradas en las porciones 3' de las regiones de codificación de las secuencias HoxB13. Los polinucleótidos que contienen una combinación de secuencias de las regiones de codificación y de no codificación 3' de preferencia tienen las secuencias arregladas contiguamente, sin secuencia (s) heteróloga (s) de intervención. Alternativamente, la invención puede ser practicada con polinucleótidos que tienen secuencias presentes en las regiones no traducidas 5' y/o de no codificación de las secuencias H0XB13 al detectar el nivel de expresión en células de cáncer o células de cáncer de seno. Tales polinucleótidos opcionalmente pueden contener secuencias encontradas en las porciones 5' de las regiones de codificación. Los polinucleótidos que contienen una combinación de secuencias de las regiones de codificación y de no codificación 5' de preferencia tienen las secuencias arregladas contiguamente, sin la(s) secuencia (s) heteróloga de intervención. La invención también puede ser practicada con secuencias presentes en las regiones de codificación de la secuencia HOXB13. Los polinucleótidos preferidos contienen secuencias de las regiones no traducidas 3' o 5' y/o de no codificación de por lo menos aproximadamente 16, por lo menos aproximadamente 18, por lo menos aproximadamente 20, por lo menos aproximadamente 22, por lo menos aproximadamente 24, por lo menos aproximadamente 26, por lo menos aproximadamente 28, por lo menos aproximadamente 30, por lo menos aproximadamente 32, por lo menos aproximadamente 34, por lo 5 menos aproximadamente 36, por lo menos aproximadamente 38, por lo menos aproximadamente 40, por lo menos aproximadamente 42, por lo menos aproximadamente 44, o por lo menos aproximadamente 46 nucleótidos consecutivos. El término "aproximadamente" como se utiliza en la oración previa se 10 refiere a un incremento o disminución de 1 del valor numérico establecido. Aún más preferidos son los polinucleótidos que contienen secuencias de por lo menos o aproximadamente 50, por lo menos o aproximadamente 100, por lo menos o aproximadamente 150, por lo menos o aproximadamente 200, por 15 lo menos o aproximadamente 250, por lo menos o aproximadamente 300, por lo menos o aproximadamente 350, o por lo menos o aproximadamente 400 nucleótidos consecutivos. El término "aproximadamente" como se utiliza en la oración precedente se refiere a un incremento o disminución de 10% 20 del valor numérico establecido. Las secuencias del extremo 3' o 5' de las regiones de codificación de HoxB13 como se encuentran en polinucleótidos de la invención son de las mismas longitudes, como aquellas descritas en lo anterior, excepto que ellos 25 naturalmente serían limitados por la longitud de la región de codificación. El extremo 3' de una región de codificación puede incluir secuencias de hasta la mitad de 3' de la región de codificación. A la inversa, el extremo 5' de una región de codificación puede incluir secuencias de hasta la mitad de 5' 5 de la región de codificación. Por supuesto, las secuencias descritas en lo anterior, las regiones de codificación y polinucleótidos que contienen porciones de las mismas, pueden ser utilizadas en sus totalidades. En otra modalidad de la invención, los 10 polmucleótidos que contienen supresiones de nucleótidos del extremo 5' y/o 3' de las secuencias HoxB13 pueden ser utilizados. Las supresiones son de preferencia de 1-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-25, 25-30, 30-35, 35-40, 40-45, 45-50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-100, 100-125, 125-150, 150-175 15 o 175-200 nucleótidos desde el extremo 5' y/o 3 ' , aunque el grado de las supresiones naturalmente sería limitado por la longitud de las secuencias y la necesidad para ser capaz de utilizar los polinucleótidos para la detección de niveles de expresión. 20 Otros polinucleótidos de la invención del extremo 3' de la secuencia HoxB13 incluyen aquellos de cebadores y sondas opcionales para la PCR cuantitativa. De preferencia, los cebadores y las sondas son aquellos que amplifican una región menor que aproximadamente 350, menor que 25 aproximadamente 300, menor que aproximadamente 250, menor que aproximadamente 200, menor que aproximadamente 150, menor que aproximadamente 100, o menor que aproximadamente 50 nucleótidos desde la señal de poliadenilación o sitio de poliadenilación de un gen o secuencia expresada. 5 Otros polinucleótidos para uso en la práctica de la invención incluyen aquellos que tienen suficiente homología a las secuencias HoxB13 para detectar su expresión mediante el uso de técnicas de hibridación. Tales polinucleótidos de preferencia tienen aproximadamente 95%, aproximadamente 96%, 10 aproximadamente 97%, aproximadamente 98% o aproximadamente 99% de identidad con las secuencias HOXB13 como es descrito en la presente. La identidad se determina utilizando el algoritmo BLAST, como es descrito en lo anterior. Los otros polinucleótidos para el uso en la práctica de la invención 15 también pueden ser descritos en la base de la habilidad para hibridar a los polinucleotidos de la invención bajo condiciones severas de aproximadamente 30% v/v a aproximadamente 50% de formamida y de aproximadamente 0.01 M a aproximadamente 0.15 M de sal para hibridación y de 20 aproximadamente 0.01 a aproximadamente 0.15 M de sal para condiciones de lavado en aproximadamente 55 a aproximadamente 65°C o más alto, o condiciones equivalentes a los mismos. En una modalidad adicional de la invención, una población de moléculas de ácido nucleico de una sola hebra 25 que comprende una o ambas células de una secuencia HoxB13 humana se proporciona como una sonda tal que por lo menos una porción de la población se puede hibridar a una o ambas hebras de una molécula de ácido nucleico cuantitativamente amplificado de RNA de una célula de cáncer, tal como cáncer de seno. La población puede ser solamente la hebra de antisentido de una secuencia HoxB13 humana tal que una hebra de sentido de una molécula de, o amplificada de, una célula de cáncer o de cáncer de seno se puede hibridar a una porción de la población. La población de preferencia comprende una cantidad suficientemente en exceso de una o ambas hebras de una secuencia de HoxB13 en comparación a la cantidad de moléculas de ácido nucleico expresadas (o amplificada) que contiene una secuencia de HoxB13 complementarias de una célula normal. Esta condición de exceso permite que la cantidad incrementada de expresión de ácido nucleico en una célula de cáncer o cáncer de seno sea fácilmente detectable como un incremento. Alternativamente, la población de moléculas de una sola hebra es igual a o por arriba de cualquiera de una o ambas hebras de las moléculas de ácido nucleico amplificadas de un cáncer o célula de cáncer de seno tal que la población es suficiente para hibridar a todas de una o ambas hebras. Las células preferidas son aquellas de un paciente de cáncer de seno que es ER+ o para quién el tratamiento con tamoxifen o uno o más de otro agente "antiestrógeno" contra el cáncer de seno es contemplado. Las moléculas de una sola hebra por supuesto puede ser de forma desnaturalizada de cualquier secuencia HoxB13 que contiene molécula de ácido nucleico de doble hebra o polinucleótido como es descrito en la presente. La población también puede ser descrita por ser hibridada a las moléculas de ácido nucleico que contienen secuencia de HoxBl3 a un nivel de por lo menos dos veces tanto como aquel por las moléculas de ácido nucleico de una célula normal. Como en las modalidades descritas en lo anterior, las moléculas de ácido nucleico pueden ser aquellas amplificadas cuantitativamente de un cáncer o célula de cáncer de seno tal que refleja la cantidad de expresión en la célula. La población de preferencia es inmovilizada por un soporte sólido, opcionalmente en la forma de una localización sobre un microarreglo. Una porción de la población es de preferencia hibridada a moléculas de ácido nucleico cuantitativamente amplificadas de una célula no normal o anormal (seno) mediante la amplificación de RNA. El RNA amplificado puede ser que el derivado de un cáncer o célula de cáncer de seno, mientras que la amplificación utilizada sea cuantitativa con respecto a las secuencias que contienen HoxB13. En otras modalidades, el ácido nucleico derivado de una(s) célula (s) de cáncer de muestra puede ser preferencialmente amplificado mediante el uso de cebadores apropiados tal que solamente la secuencia HoxB13 son amplificadas para reducir las señales de fondo contaminante de otros genes expresados en la célula. Alternativamente, y 5 donde la expresión de otros genes también es analizada o donde muy pocas células (o una célula) es utilizada, el ácido nucleico de la muestra puede ser amplificado globalmente antes de la hibridación a los polinucleótidos inmovilizados.
Por supuesto, el RNA, o la contraparte de cDNA del mismo, 10 puede ser directamente marcado y utilizado, sin amplificación, por métodos conocidos en la técnica. Las modalidades de ensayos descritas en la presente se pueden utilizar en un número de maneras diferentes para identificar o detectar cánceres invasivos. En algunos casos, 15 esto reflejaría una clasificación secundaria para el paciente, quien puede ya haberse sometido a un examen de mamografía o físico, como una clasificación primaria. Sí es positivo de la clasificación primaria, la biopsia de aguja subsecuente, lavado ductal o aspiración de aguja fina u otro 20 método mínimamente invasivo análogo puede proporcionar la muestra para el uso en las modalidades de ensayo. La presente invención es particularmente útil en combinación con protocolos no invasivos, tal como el lavado ductal o la aspiración de aguja fina para preparar una muestra de célula 25 de seno.
La presente invención proporciona un conjunto de criterios más objetivo, en la forma del nivel de expresión de HoxB13, para discriminar (o delinear) entre los efectos del cáncer (seno) . En modalidades particularmente preferidas de la invención, los ensayos se utilizan para discriminar entre efectos buenos y pobres basados en sí un cáncer es invasivo. Las comparaciones que discriminan entre los efectos después de aproximadamente 10, aproximadamente 20, aproximadamente 30, aproximadamente 40, aproximadamente 50, aproximadamente 60, aproximadamente 70, aproximadamente 80, aproximadamente 90, aproximadamente 100 o aproximadamente 150 meses puede ser realizada. Mientras que los efectos de supervivencia buenos y pobres pueden ser definidos relativamente en comparación entre sí, un efecto "bueno" puede ser visualizado como uno mejor que 50% de proporción de supervivencia después de aproximadamente 60 meses de intervención posquirúrgica para remover el (los) tumor (es) de cáncer de seno. Un efecto "bueno" también puede ser mejor que aproximadamente 60%, aproximadamente 70%, aproximadamente 80% o aproximadamente 90% de proporción de supervivencia después de aproximadamente 60 meses de la intervención posquirúrgica. Un efecto "pobre" puede ser visualizado como 50% menos de proporción de supervivencia después de aproximadamente 60 meses de la intervención posquirúrgica para remover el (los) tumor (es) de cáncer de seno. Un efecto "pobre" también puede ser de aproximadamente un 70% o menos proporción de supervivencia después de aproximadamente 40 meses, o aproximadamente 80% o menos proporción de supervivencia después de aproximadamente 5 20 meses, de intervención posquirúrgica. En una modalidad, el aislamiento y análisis de una muestra de célula de cáncer de seno puede ser realizada como sigue: (1) El lavado ductal u otro procedimiento no 10 invasivo o mínimamente invasivo se realiza en un paciente para obtener una muestra. (2) La muestra se prepara y se recubre sobre una platina de microscopio. Observar que el lavado ductal da por resultado agrupaciones de células que pueden ser 15 citológicamente examinadas . (3) El patólogo o el software de análisis de imagen explora la muestra para la presencia de células atípicas . (4) Sí se observan células atípicas, esas células 20 son recolectadas (por ejemplo, mediante microdisección tal como LCM) . (5) El RNA se extrae de las células recolectadas. (6) El RNA se analiza, directamente después de la conversión a cDNA o amplificación del mismo, para la 25 expresión de las secuencias HoxB13.
Con el uso de la presente invención, los médicos expertos pueden prescribir o detener el tratamiento con tamoxifen u otro agente terapéutico contra el cáncer de seno basado en la prognosis determinado por las vías de la 5 práctica de la presente invención. La discusión anterior también es aplicable donde se detecta una lesión palpable seguido por la aspiración de aguja fina o la biopsia con aguja de células del seno. Las células se colocan en placas y se revisan por un patólogo o 10 sistema de formación de imagen automatizado que selecciona células para el análisis como es descrito en lo anterior. La presente invención también puede ser utilizada, sin embargo, con biopsias de tejido sólido, incluyendo aquellas almacenadas como una muestra congelada o FEPE 15 (fijada en formalina, incrustada en parafina) .
Alternativamente, se puede obtener o utilizar una muestra fresca o fijada. Como un ejemplo no limitativo como una biopsia sólida pude ser recolectada y preparada para la visualización y seguido por la determinación de la expresión 20 de uno o más genes identificados en la presente para determinar el efecto del cáncer (seno) . Como otro ejemplo no limitativo, una biopsia sólida puede ser recolectada y preparada para la visualización seguido por la determinación de la expresión de HoxB13. Un medio preferido es mediante el 25 uso de la hibridación in situ con sonda (s) que identifican polinucleótido o proteína para el análisis de la expresión de HoxB13. Ejemplos no limitativos de muestras fijadas incluyen aquellas que son fijadas son formalina o formaldehído (incluyendo muestras FEPP) , con Boudin's, glutaldehído, acetona, alcoholes o cualquier otro fijador, tales como aquellos utilizados para fijar muestras de células o de tejido para inmunohistoquímicas (IHC) . Otros ejemplos incluyen fijadores que precipitan los ácidos nucleicos y/o proteínas asociadas a la célula. En algunas aplicaciones de la invención, la nuestra no se ha clasificado utilizando técnicas de patología estándares, tales como, pero no limitadas a, ensayos basados en inmunohistoquímica. En un método alternativo, la biopsia de tejido sólido puede ser utilizada para extraer moléculas seguida por el análisis para HoxB13. Esto proporciona la posibilidad de dejar la necesidad para visualización y recolección de solamente células de cáncer o células que se sospechan de ser cancerosas. Este método por supuesto puede ser modificado tal que solamente células que se han seleccionado positivamente son recolectadas y utilizadas para extraer moléculas para el análisis. Esto requeriría la visualización y selección como un prerrequisito para el análisis de la expresión de gen. En el caso de una muestra FEPP, las células se pueden obtener seguido por la extracción de RNA, amplificación y detección como es descrito en la presente.
Los métodos proporcionados por la presente invención . también pueden ser automatizados por completo o en parte . Un aspecto adicional de la invención proporciona el uso de la presente invención en relación a actividades clínicas. En algunas modalidades, la determinación o medición de la expresión de HoxB13 como es descrito en la presente se realiza como parte de la provisión del cuidado médico a un paciente, incluyendo la provisión de servicios de diagnóstico en soporte de provisión de cuidado médico. Así la invención incluye un método en el cuidado médico de un paciente, el método que comprende determinar o medir los niveles de expresión de HoxBl3 en una muestra que contiene células obtenida de un paciente como es descrito en la presente. El método además puede comprender la interpretación de, o significado de, la determinación/medición, como es indicado o pred ctivo de la presencia de un fenotipo de cáncer de una manera como es descrito en la presente. La determinación o medición de los niveles de expresión puede ser precedida por una variedad de acciones relacionadas. En algunas modalidades, la medición es precedida por una determinación o diagnosis de un sujeto humano como en necesidad de tal medición. La medición puede ser precedida por una determinación de una necesidad para la medición, tal como por un doctor médico, enfermera u otro proveedor del cuidado de la salud o profesional, o aquellos que trabajan bajo su instrucción, o personal de una instalación de salud u organización de mantenimiento en aprobación del desempeño de la medición como una base para 5 pedir el reembolso o pago para el desempeño. La medición también puede ser precedida por los actos de preparación necesarios para la medición actual. Ejemplos no limitativos incluyen la obtención actual de una muestra que contiene células de un sujeto humano; o el recibo 10 de una muestra que contiene células; o el seccionamiento de una muestra que contiene células; o el aislamiento de células de una muestra que contiene células; o la obtención de RNA de las células de una muestra que contiene células; o el RNA de transcripción inversa de las células de una muestra que 15 contiene células. La muestra puede ser cualquiera como es descrito en la presente para la práctica de la invención. En modalidades adicionales, la invención proporciona un método de ordenación, o recepción de una orden, para el desempeño de un método en el cuidado médico de 20 un paciente u otro método de la invención. La orden se puede hacer por un doctor médico, una enfermera u otro proveedor del cuidado de la salud, o aquellos que trabajan bajo su instrucción, mientras que la recepción, directamente e indirectamente se puede hacer por cualquier persona que 25 realiza el (los) método (s). La orden puede ser por cualquier medio de comunicación, incluyendo la comunicación que es escrita, oral, electrónica, digital, analógica, telefónica, por persona, por facsímil, por correo, u otros pasos a través de la jurisdicción dentro de los Estados Unidos. 5 La invención además proporciona métodos en el procesamiento del reembolso o pago para una prueba, tal como el método anterior en el cuidado médico de un paciente u otro método de la invención. Un método en el procesamiento de reembolso o pago puede comprender indicar que 1) el pago sea 10 recibido, o 2) el pago será hecho por otro abonado, o 3) el pago permanece sin pago en documento o en una base de datos después del desempeño de una detección del nivel de expresión, determinación o método de medición de la invención. La base de datos puede estar en cualquier forma, 15 con formas electrónicas tal como la base de datos implementada en computadora incluida dentro del alcance de la invención. La indicación puede estar en la forma de un código (tal como un código de CPT) sobre papel o en la base de datos. El "otro abonado" puede ser cualquier persona o 20 entidad más allá de lo cual una petición previa para el reembolso o pago se hizo. Alternativo, el método puede comprender el recibo del reembolso o pago para el desempeño técnico o actual de un método divulgado en el cuidado médico de un paciente; para la 25 interpretación del resultado del método; o para cualquier otro método de la invención. Por supuesto la invención también incluye modalidades que comprenden la instrucción de otra persona o parte para recibir el reembolso o pago. La orden pueden ser cualquier medio de comunicación, incluyendo 5 aquellos descritos en lo anterior. El recibo puede ser de cualquier entidad, incluyendo una compañía aseguradora, organización de mantenimiento de la salud, agencia de la salud gubernamental o un paciente como ejemplo no limitativo. El pago puede ser por completo o en parte. En el caso de un 10 paciente, el pago puede estar en la forma de un pago parcial conocido como un co-pago. En todavía otra modalidad, el método puede comprender adelantar o tener adelantado una petición de reembolso o pago a una compañía aseguradora, organización de 15 mantenimiento de la salud, agencia de la salud gubernamental, o un paciente para el desempeño del método anterior en el cuidado médico de un paciente u otro método de la invención. La petición puede ser por cualquier medio de comunicación, incluyendo aquellos descritos en lo anterior. 20 En una modalidad adicional, el método puede comprender recibir la indicación de la aprobación para el pago, o soporte del pago, para el desempeño del método anterior en el cuidado médico de un paciente u otro método de la invención. Tal indicación puede prevenir de cualquier 25 persona o parte a quién se hizo una petición para el reembolso o pago. Ejemplos no limitativos incluyen una compañía aseguradora, organización de mantenimiento de la salud, o una agente de la salud gubernamental, similar a Medicare o Medicaid como ejemplos no limitativos. La 5 indicación puede ser por cualquier medio de comunicación, incluyendo aquellos descritos en lo anterior. Una modalidad adicional es donde el método comprende enviar una petición para el reembolso para el desempeño del método anterior en el cuidado médico de un 10 paciente u otro método de la invención. Tal petición se puede hacer por cualquier medio de comunicación, incluyendo aquellos descritos en lo anterior. La petición se puede hacer a una compañía aseguradora, organización de mantenimiento de la salud, agencia de la salud federal o al paciente para 15 quien se realizó el método. Un método adicional comprende indicar la necesidad para el reembolso o pago en una forma o en una base de datos para el desempeño del método anterior en el cuidado médico de un paciente u otro método de la invención. Alternativamente, 20 el método simplemente puede indicar el desempeño del método. a base de datos puede estar en cualquier forma, con formas electrónicas tal como la base de datos implementada en computadora incluida dentro del alcance de la invención. La indicación puede estar en la forma de un código sobre papel o 25 en la base de datos.
En los métodos anteriores en el cuidado médico de un paciente u otro método de la invención, el método puede comprender el reporte de resultados del método, opcionalmente una instalación para el cuidado de la salud, un proveedor o profesional del cuidado de la salud, un doctor, una enfermera o personal que trabaja para el mismo. El reporte también puede ser directamente o indirectamente al paciente. El reporte puede ser cualquier medio de comunicación, incluyendo aquellos descritos en lo anterior. Los materiales y métodos de la presente invención son idealmente adecuados para la preparación de equipos producidos de acuerdo con procedimientos bien conocidos. La invención así proporciona equipos que comprenden agentes (similares a los polinucleótidos y/o anticuerpos descritos en la presente como ejemplos no limitativos) para la detección de la expresión de las secuencias HoxB13. Tales equipos, que comprenden opcionalmente el agente con una descripción de identificación o etiqueta o instrucciones relacionada con su uso en los métodos de la presente invención, son proporcionados. Tal equipo puede comprender contenedores, cada uno con uno o más de los diversos reactivos (típicamente en forma concentrada) utilizados en los métodos, incluyendo, por ejemplo, microarreglos pre-fabricados, soluciones reguladoras, los trifosfatos de nucleótido apropiados (por ejemplo, dATP, dCTP, dGTP y dTTP; o rATP, rCTP, rGTP y UTP), 75 transcriptasa inversa, DNA polimerasa, RNA polimerasa y uno o más complejos de cebadores de la presente invención (por ejemplo, cebadores poli(T) o aleatorios de longitud apropiada enlazados a un promotor reactivo con RNA polimerasa) . Un 5 conjunto de instrucciones también será incluido típicamente. Habiéndose ahora descrito generalmente la invención, la misma será más fácilmente entendida a través de la referencia de los siguientes ejemplos que se proporcionan a manera de ilustración, y no se proponen para ser 10 limitativos de la presente invención, a menos que sea especificado. EJEMPLOS Ejemplo 1: Construcción del cultivo de células y de la línea de células. 15 Las células MCF-10A (ATCC; ver Soule y colaboradores, "Isolation and characterization of a spontaneously immortalized human breast epithelial cell line, MCF-10". Cáncer Res 50:6075-86 (1990)) se mantuvieron en el medio de crecimiento como es descrito (ver Debnath y 20 colaboradores, "Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures", Methods 30:256-68 (2003)) en DMEM/F12 (Invitrogen) con suero • de caballo al 5% (Invitrogen) , 20 ng/ml de EGF (Peprotech) , 10 µg/ml de insulina (Sigma) , 25 100 ng/ml de toxina de cólera, 0.5 µg/ml de hidrocortisona, 50 U/ml de penicilina y 50 µg/ml de estreptomicina. El medio de ensayo (AM) es idéntico al medio de crecimiento excepto que se utilizó 2% en lugar de 5% de suero de caballo. El cDNA humano para HOXB13 en el plásmido pDNR se proporcionó generosamente por Joshua LaBaer (Harvard Medical School) . HOXB13 se subclonó en el sitio SnaBl del vector de expresión retroviral pBabe-puro (ver Morgenstern y colaboradores, "Advanced mammalian gene transfer: high titre retroviral vectors with múltiple drug selection markers and a complementary helper-free packaging cell lined'Y Nucleic Acids Res 18:3587-96 (1990) y la orientación apropiada determinada mediante el mapeo de restricción. El virus incompetente de replicación con la Envoltura de Virµs de Estomatitis Vesicular (VSV) se generó de células empacadas de VSV-GPG como es descrito (ver Ory y colaboradores, "A stable human-derived packaging cell line for production of high titer retrovirus/vesicular stomatitis virus G pseudotypes", Proc Nati Acad Sci., USA 93:11400-6 (1996), y acumulaciones estables de células MCF-10A se generaron mediante la infección retroviral como es descrito (ver Debnath y colaboradores) utilizando 2 µg/ml de puromicina para la selección. Ejemplo 2: Ensayo de migración e invasión en Transwell Los ensayos de migración y la invasión in vitro se realizaron utilizando Transwell de cámara Boyden modificada de 24 cavidades con membranas de PET (polietilen tereftalato) que contienen poros de 8 mieras (BD BioCoat) . Las membranas no recubiertas se utilizaron para los ensayos de migración y 5 membranas recubiertas con Matrigel (una mezcla compleja de componentes de matriz extracelular derivados del sarcoma Engelbroth-Holm-Swarm (EHS) ) se utilizaron para la invasión (ver Repesh y colaboradores, "A new in vitro assay for quantitating tumor cell invasión", Invasión Metástasis 9:192- 10 208 (1989) ) . Acumulaciones estables de células MCF-10A infectadas con construcciones retrovirales se mantuvieron en el medio de crecimiento hasta el día del ensayo. 5 X 104 célula's en 100 µg de medio del ensayo se sembraron en la 15 cámara superior y 500 µL del medio de ensayo con o sin 20 ng/ml EGF se adicionó a la cámara inferior. Las células se incubaron a 37 °C durante 24 horas, luego se fijaron en etanol al 70% durante 20 minutos, se enjuagaron con PBS y se mancharon con DAPI (500 ng/ml) . Las células que permanecieron 20 en la superficie superior se removieron mecánicamente con una torunda de algodón. Las células que permanecen en el lado de abajo se contaron (5 campos en aumento de 20x por • trans-well) . Las trans-wells se colocaron por placas por triplicado y los resultados se promediaron. 25 La invasión a través de una cámara Boyden modificada recubierta con Matrigel se analizó como es descrito (ver Albini y colaboradores, "A rapid in vitro assay for quantitatmg the mvasive potential of tumor cells". Cáncer Res 47:3239-45 (1987) y Repesh y colaboradores). Ejemplo 3: Resultados HoxB13 estimula la migración e invasión de célula epitelial mamaria. Como se muestra en la Figura 1, el análisis de RT-QPCR de células epiteliales de seno normales y malignas procuradas con LCM de un grupo previamente publicado (n=45, ver Ma y colaboradores, "Gene expresión profiles of human breast cáncer progression", Proc Nati Acad Sci., USA 100:5974-9 (2003)) demostró que comparada a las células epiteliales de seno normales, los niveles de expresión medios de HOXB13 fueron significativamente más altos en tanto el carcinoma ductal in situ (DCIS, =0.002) y el carcinoma ductal invasivo (IDC, P=0.006). Comparado con los pacientes igualados a los normales, 56% de casos DCIS o IDC sobreexpresaron HOXB13 por >2 veces. La Figura 2 muestra la confirmación de hibridación in situ de RNA de la expresión específica de célula de tumor de HOXB13. A manera interesante, un subconjunto de muestras de seno normales demostraron la expresión de HOXB13 en la unidad lobular del ducto terminal, elevando la posibilidad de que puede desempeñar una función en la fisiología mamaria normal .
La función biológica potencial de H0XB13 se estudió al expresar una construcción inducida de CMV en células MCF-10A. La expresión ectópica de HOB1313 en MCF10A se confirmó mediante RT-QPCR (Figura 3, inserto) . Las células 5 que expresan HOXB13 exhibieron cambios morfológicos distintos, caracterizados por una reducción en las uniones de tipo epitelial (datos no mostrados) . Comparados con las células infectadas de control, las células MCF10A que expresan H0XB13 tuvieron un incremento de 5 veces en la 10 motilidad celular en los ensayos de migración de trans-well en la presencia de EGF (Figura 3) . Las células que expresan HOXB13 también mostraron un incremento en la migración en la ausencia de EGF exógenamente suministrado. La invasión a través de una cámara Boyden 15 modificada recubierta con Matrigel, un ensayo bien establecido correlacionado con el potencial metastático in vivo, también se aumentó 5 veces por la expresión de HOXB13 en la presencia de EGF (Figura 4) . Sin que sea relacionado por la teoría, estas observaciones sugieren que 20 HOXB13 puede regular una ruta que funciona sinergísticamente con la señalización dependiente de EGF para estimular la motilidad celular y la invasión in vitro . La Figura 5 muestra la morfología 2D de las células MCF10A con células MCF10A que expresan HOXB13 ectópicamente. 25 La Figura 6 muestra que la expresión de HoxB13 ectópica en las células MCF10A aumenta la migración estimulada por EGF a través de los componentes de matriz extracelular del sarcoma de EHS (Engelbroth-Holm-Swarm) . La inserción es como es descrita para la Figura 3. La migración 5 de células que expresan HOXB13 es incrementada además en la presencia ya sea colágeno o EGF. La Figura 7 muestra que la expresión de HoxB13 ectópica en las células MCF10A aumenta la invasión estimulada por EGF a través de un sustrato de EHS. 10 La Figura 8 muestra que la expresión de HoxB13 en células AN10 aumenta la migración con y sin un dimerizador sintético (AP1510) . AM denota el medio de ensayo; coll se refiere a colágeno. Todas las referencias citadas en la presente, 15 incluyendo patentes, solicitudes de patente y publicaciones, son incorporadas en la presente por referencia en sus totalidades, ya sea de manera previa específicamente incorporadas o no incorporadas. Sin embargo, la cita de documentos en la presente no se propone como una admisión de 20 que cualquiera sea la técnica previa pertinente. Todas las declaraciones en cuanto a la fecha o representación en cuanto a los contenidos de documento está basado en la información disponible para el solicitante y no constituye ninguna admisión para la corrección de las fechas o contenidos de los 25 documentos.
Habiéndose ahora descrito completamente esta invención, será apreciado por aquellos expertos en la técnica que la misma se puede realizar dentro de un amplio intervalo de parámetros equivalentes, concentraciones y condiciones sin apartarse del espíritu y alcance de la invención y sin experimentación indebida. Mientras que esta invención se ha descrito en relación con modalidades específicas de la misma, será entendido que es capaz de modificaciones adicionales. Esta solicitud se propone para cubrir cualquiera de las variaciones, usos o adaptaciones de la invención siguiendo, en general, los principios de la invención e incluyendo tales desviaciones de la presente invención como entran dentro de la práctica conocida usual dentro de la técnica a la cual la invención pertenece y como puede ser aplicada a las características esenciales anteriormente expuestas.

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES 1. Un método para identificar o clasificar el potencial de una o más células de muestra para metastasizarse en otros tejidos, el método caracterizado porque comprende 5 determinar el nivel de expresión del gen HoxB13 en la una o más células, en donde un nivel relativamente incrementado de expresión indica un potencial incrementado para metástasis en la una o más células. 2. Un método para identificar o clasificar el 10 potencial de una o más células de muestra para invadir otros tejidos, el método caracterizado porque comprende determinar el nivel de expresión del gen HoxB13 en la una o más células, en donde un nivel relativamente incrementado de expresión indica un potencial incrementado 15 para invasividad en una o más células. 3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la una o más células de muestra es de un cáncer primario, opcionalmente cáncer positivo de receptor de estrógeno, de un sujeto o paciente. 20 4. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el cáncer se selecciona de Adenocarcinoma de Seno, Adenocarcinoma de Cerviz, Adenocarcinoma de Esófago, Adenocarcinoma de Vesícula Biliar, Adenocarcinoma de Pulmón, Adenocarcinoma de Páncreas, 25 Adenocarcmoma de Intestino Delgado-Grueso, Adenocarcinoma de Estómago, Astrocitoma, Carcinoma de Célula Basal de la Piel, Colangiocarcinoma de Hígado, Adenocarcinoma de Célula Clara de Ovario, Linfoma de Célula B Grande Difusa, Carcinoma Embrional de Testículo, Carcinoma Endometrioide de Útero, 5 Sarcoma de Ewings, Carcinoma Folicular de Tiroides, Tumor Estromal Gastrointestinal, Tumor de Célula Germinal de Ovario, Tumor de Célula Germinal de Testículo, Gliobastroma Multiforme, Carcinoma Hepatocelular de Hígado, Linfoma de Hodgkin, Carcinoma de Célula Grande de Pulmón, 10 Leiomiosarcoma, Liposarcoma, Carcinoma Lobular de Seno, Histiocitoma Fibroso Maligno, Carcinoma Medular de Tiroides, Melanoma, Meningioma, Mesotelioma de Pulmón, Adenocarcinoma Mucinoso de Ovario, Miofibrosarcoma, Tumor Neuroendocrino de Intestino, Oligodendroglioma, Osteosarcoma, Carcinoma Papilar 15 de Tiroides, Feocromocitoma, Carcinoma de Célula Renal de Riñon, Rabdomiosarcoma, Seminoma de Testículo, Adenocarcinoma Seroso de Ovario, Carcinoma de Célula Pequeña de Pulmón, Carcinoma de Célula Escamosa de Cerviz, Carcinoma de Célula Escamosa de Esófago, Carcinoma de Célula Escamosa de Laringe, 20 Carcinoma de Célula Escamosa de Pulmón, Carcinoma de Célula Escamosa de Piel, Sarcoma Sinovial, Linfoma de Célula T y Carcinoma de Célula Transicional de Vejiga. 5. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el cáncer es de un tejido 25 seleccionado de Adrenal, Vejiga, Hueso, Cerebro, Seno, Cerviz, Endometrio, Esófago, Vesícula Biliar, Riñon, Laringe, Hígado, Pulmón, Nodo de Linfa, Ovario, Páncreas, Próstata, Piel, Tejido Blando, Intestino Delgado/Grueso, Estómago, Testículos, Tiroides y Útero. 5 6. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque además comprende determinar el estado nodal del sujeto, en donde la ausencia de cáncer en los nodos de linfa en combinación con un nivel arriba de lo normal de la expresión de HoxB13 se utiliza para indicar el potencial 10 incrementado para metástasis. 7. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la una o más células están en una muestra biológica de células obtenidas de un sujeto. 8. El método de conformidad con la reivindicación 15 7, caracterizado porque la muestra es una muestra fresca, una muestra congelada o una muestra fijada. 9. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la determinación comprende analizar el nivel de expresión de mRNA de HoxB13, desmetilación de DNA 20 de HoxB13 o el nivel de expresión de proteína HOXB13. 10. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la determinación comprende analizar la expresión de mRNA mediante el uso de la PCR cuantitativa, incluyendo la PCR de transcriptasa inversa y la PCR en tiempo 25 real . 11. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la determinación comprende analizar la expresión de mRNA mediante el uso de un microarreglo. 12. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la determinación comprende analizar la expresión de proteína mediante la detección de un fragmento epítope de una secuencia HoxB13 expresada. 13. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque un nivel de expresión normal o por debajo del normal indica la ausencia de un potencial incrementado o un potencial disminuido, para metástasis. 14. Un método para predecir la prognosis o efecto de enfermedad de un sujeto, el método caracterizado porque comprende determinar el nivel de expresión del gen HoxB13 en una o más células de una muestra biológica obtenida del sujeto, en donde un nivel arriba de lo normal de expresión indica un potencial incrementado para metástasis de cáncer, probabilidad incrementada de recurrencia de cáncer o esperanza de vida disminuida en el sujeto y un nivel normal o por debajo de lo normal de la expresión de HoxB13 indica la ausencia de un potencial incrementado para metástasis de cáncer, probabilidad incrementada de recurrencia de cáncer o esperanza de vida disminuida. 15. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque la recurrencia de cáncer se selecciona de recurrencia local, recurrencia regional, recurrencia distante o recurrencia contralateral. 16. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque la muestra es una muestra precancerosa o biopsia, o una muestra de cáncer diagnosticado o biopsia. 17. Un método para determinar el tratamiento de un sujeto, el método caracterizado porque comprende determinar la prognosis o el efecto del sujeto por el método de la reivindicación 14; y determinar el tratamiento del sujeto basado en la prognosis o el efecto. 18. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque la recurrencia de cáncer se selecciona de recurrencia local, recurrencia regional, recurrencia distante o recurrencia contralateral. 19. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque una o más células son de un cáncer, opcionalmente cáncer primario o positivo de receptor de estrógeno. 20. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque las células son células de seno, opcionalmente células ADH o DCIS.
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