KR20070057132A - 암에 대한 유전자 ｈｏｘｂ１３의 중요성 - Google Patents

Abstract

본 발명은 침습적 또는 전이적 암 표현형의 지표로서의 HoxB13(호메오박스 B13)으로부터의 발현 증가의 검출에 관련된 것이다. 본 발명은 침습적 또는 전이적 표현형 및 세포 이동 및/또는 이동성 증가의 지표로서, 임의로는 결절 상태와 조합된 HoxB13 유전자로부터의 발현 수준을 검출하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 환자 예후의 결정 및 임상적 진단 및 치료를 돕기 위한 HoxB13 유전자로부터의 발현 측정 방법을 제공한다.

HoxB13 유전자, 발현 수준, 전이, 침습 잠재력

Description

암에 대한 유전자 ＨＯＸＢ１３의 중요성{THE IMPORTANCE OF THE GENE HOXB13 FOR CANCER}

관련 출원

본 출원은 전체가 기재된 것 처럼 전문이 본원에 참조로 인용되어 있는 미국 가출원 제60/577,085호의 우선권의 이익을 주장한다.

본 발명은 암 표현형의 지표로서의 유전자 발현의 검출에 관한 것이다. 특히, HoxB13{호메오박스(homeobox) B13}으로부터의 증가한 발현은 침습적 암 표현형을 나타낸다. 본 발명은 침습적 표현형 및 세포 이동 및/또는 이동성 증가의 지표로서의 HoxB13 유전자로부터의 발현 수준을 검출하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 임상적 진단 및 치료, 및 환자 예후 결정을 돕기 위해 HoxB13 유전자로부터의 발현을 측정하는 방법을 제공한다.

발명의 요약

본 발명은 특정 암 표현형의 지표로서의 유전자 발현 수준을 측정하는 방법을 제공한다. 본 발명은 HoxB13 유전자로부터의 발현 증가가 침습성 암 표현형 및 세포 이동 및/또는 이동성 증가를 나타낸다는 발견에 일부 기초한다. 본 발명은 또한 침습성 표현형의 부재의 지표로서의 HoxB13 유전자로부터의 발현 증가 부재를 결정하기 위한 방법을 제공한다. HoXB13 서열의 발현과 침습성 표현형의 유무 사이의 대응을 또한 피검체 진단 및 치료 선택에 적용할 수 있다. 추가로, 당해 대응을 피검체의 유망한 예후 또는 질병 결과를 결정하는 데 사용할 수 있다. 침습성 표현형의 비제한적 예에는 원발 종양 집단의 주위 조직으로의 확장 및 전이의 일부로서의 세포의 상이한 조직형으로의 침습이 포함된다. 일부 양태에서는, 본 발명을 암으로 투병중이거나 암을 앓게 될 것으로 의심되는 사람 피검체에 적용한다. 일부 특정 양태에서는, 본 발명은 사람 환자에게서 유방암의 경우에 적용한다.

본 발명의 기원은 유방암이 발생하는 사람 유방의 해부학적 하위조직인 종말세관유세엽단위의 정상 세포에서의 HOXB13 발현의 검출을 포함한다. 이는 호메오박스 단백질이 유방 발달 및 생리학에서 역할을 수행할 수 있음을 제시하였다. 이러한 정상 세포에서의 HoxB13 유전자로부터의 발현 수준은 임의의 적합한 기법으로 검정할 수 있다. 이러한 세포내에서의 발현 수준은 동일한 유형의 비정상 또는 이상 세포(예를 들면, 암 세포) 및/또는 본원에 기술한 조직에서의 발현 수준과의 비교를 위한 참조로 사용되는 정상 세포로 볼 수 있다. 대안적으로, 특정 유형의 정상 세포 또는 조직 내에서의 발현을 이러한 사용에 대한 적합성 결정에 따라 이종성 비-정상 또는 이상 세포의 비교를 위한 참조로 사용할 수 있다.

본 발명은 또한 세포 내에서의 HOXB13의 전위적 발현이 시험관 내에서 세포 침습 및 이동을 강화한다는 발견에 일부 근거하며, 이는 HOXB13이 생체 내에서 종양 침습 및 전이에 기여함을 나타낸다. 침습 및/또는 이동 특성의 잠재력 증가는 감응 세포 내의 EGF 또는 콜라겐의 존재에 의해 자극될 수 있다.

첫째 측면에서, 본 발명은 침습 및/또는 이동에 대한 증가한 잠재력을 갖는 하나 이상의 세포를 증가하거나 정상 이상인 HoxB13 유전자로부터의 발현 수준을 측정함으로써 확인 또는 분류하는 방법을 제공한다. 이는 세포(들)을 발견한 피검체의 상이한 부위 및/또는 상이한 조직으로의 전이에 대한 잠재력을 포함한다. 증가 또는 정상 이상의 수준의 측정은 동일한 유형의 정상 세포 및/또는 조직에서의 발현 수준을 상대적으로 비교함으로써 할 수 있다. 하나 이상의 세포를 암으로 투병중이거나, 암을 앓게 될 것으로 의심되는 피검체로부터 수득한 세포의 생물학적 샘플에 있을 수 있다. 본 발명의 일부 양태에서, 암은 유방암이다. 일부 양태에서, 암 세포에서의 HoxB13 유전자로부터의 발현을 동일한 유형의 정상 세포 또는 동일한 조직으로부터의 정상 세포와 비교하며; 비-제한적 예로서, 유방암 세포에서의 발현은 정상 유방암 세포 내에서의 발현과 비교한다.

HoxB13 발현 증가의 측정을 HoxB13 발현의 다른 적합한 측정과 비교할 수 있다. 이들은 기타 피검체, 또는 이러함 피검체 집단의 동일한 유형의 암 세포에서의 HoxB13 발현과의 비교를 포함한다. 일부 양태에서, 당해 피검체들은 동일한 암을 갖지만, 암의 전이 또는 재발을 경험하지 않은 집단의 피검체이다. 이는 이러한 피검체 또는 이러한 피검체 집단으로부터의 샘플(예를 들면, 고정된 샘플)을 회고분석하여 용이하게 수행할 수 있다. 당해 비교는 또한 이후의 전이 또는 재발을 겪지 않은 피검체의 세포 샘플로부터의 발현 수준을 포함하는 HoxB13 발현 수준의 데이타베이스에 대한 것일 수 있다. 기타 비교는 HoxB13 발현의 역치 수준(이 또는 이 이상은 전이, 침습, 및/또는 이동의 증가한 가능성을 나타낸다)에 대한 것일 수 있다.

따라서 본 발명을 전침습적, 및/또는 침습 및/또는 이동에 대한 증가한 잠재력(예를 들면, 다른 위치로의 전이)을 갖는 하나 이상의 세포를 확인 또는 분류하는 데 사용할 수 있다. 따라서 당해 세포(들)을 수득한 피검체는 이러한 증가한 잠재력을 갖는 전침습적 암세포를 갖는 것으로 확인될 수 있다. 대안적으로, 본 발명은 침습적 세포로서의 하나 이상의 세포를 확인하는 데 사용할 수 있다. 일부 양태에서, 하나 이상의 세포는 피검체로부터의 원발암 세포(예를 들면, 원발 유방암 세포)일 수 있다. 본 발명의 이러한 측면을 당해 피검체에서 원발암 세포의 침습적 또는 전이적 잠재력의 조기 지시자 또는 지표로 사용할 수 있다. 또한 암이 아직 재발하지 않은 피검체에서와 같이, 암 재발 잠재력에 대한 지시자 또는 지표로도 사용할 수 있다. 재발은 국소적, 지엽적 또는 원위 재발에 상관없이, 후일 암 재발로 확인되는 미검출 또는 미세전이의 결과일 수 있다.

또 다른 국면에서, HoxB 13 발현의 평가를 침습 또는 전이 잠재력의 조합된 예측자로서의 결절 상태와 함께 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명은 1) 적어도 원발성 암을 앓고 있는 환자가 하나 이상의 림프 결절로 전개되어야 하는 암을 갖는지의 여부 및 2) 하나 이상의 원발성 암 세포 중에서 HoxB13 발현 수준의 측정법을 제공한다. 환자가 "결절 음성"인 경우(어떠한 암도 림프 결절에 관련되지 않는 경 우) 및 암 세포(들)가 높은 수준 또는 정상 수준 이상의 HoxB13 발현을 갖는 경우, 암 세포는 침습, 이동 및/또는 전이에 대한 증가된 잠재력을 갖는 것으로 동정된다. 그러나, 본 발명은 이러한 조합 평가에 제한되지 않는데, 이는 증가된 HoxB13 발현과 함께 "결절 양성" 측정이 여전히 침습, 이동 및/또는 전이에 대해 잠재력을 나타낼 수 있기 때문이다.

상기 및 본원에서 설명한 바와 같이, 하나 이상의 샘플 세포 중의 HoxB13 유전자로부터 증가되거나 정상 수준 이상의 발현의 동정은 침습성 표현형을 갖는 세포(들) 및/또는 샘플을 동정하는데 사용될 수 있다. 당해 샘플은 유방암과 같은 암으로 고통받거나, 고통받는 것으로 의심되는 환자로부터 수득된 생물학적 샘플을 함유하는 세포일 수 있다.

일부 양태에서, 당해 샘플은 유방암과 같은 암을 앓고 있거나, 앓고 있을 것으로 의심되는 환자로부터 취한다. 몇몇 경우에, 암의 존재는 이미 공지되어 있고, 당해 발명은 유방암과 같은 암이 침습성 표현형을 갖는지의 여부를 측정하는데 사용된다. 다른 양태에서, 본 발명의 방법은 일부 유방암 환자에게서 발생할 수 있는 바와 같은 수술적 중재로부터의 샘플을 함유하는 세포와 함께 유방암이 침습성 표현형을 가져 전이(국소, 지엽적 또는 원위적) 가능성 또는 잠재력이 증가되는지의 여부를 측정하는데 사용될 수 있다.

본 발명의 방법은 유리하게는 상피 성장 인자(EGF), 인슐린, 글루코코르티코이드 및 콜레라 내독소에 반응하여 세포의 침습 및/또는 이동 특성을 EGF 및 이들 기타 인자의 존재하에 증가시키는 세포에 적용할 수 있다. EGF에 대한 반응성의 측정은 상기한 세포 중의 EGF에 대한 수용체의 발현 검출을 포함하는 임의의 적합한 방법에 의해 수행될 수 있다. EGF 수용체 발현, 돌연변이체 EGF 수용체 발현 및 EFG 수용체 유전자 확대 검출 방법은 공지되어 있고, 수용체 mRNA 발현 검출, 수용체 단백질 발현의 검출, 수용체 유전자 확대의 검출, 및 EGF 수용체와 관련되어 발현되는 하나 이상의 유전자 발현의 검출을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 이러한 방법들은 본원에 기술된 방법과 함께 사용되어 HoxB13 유전자로부터의 증가된 발현 수준 및 양성 EGF 수용체 발현 둘 다로 인해 EGF의 존재하에 침습성이 증가되는 세포를 동정할 수 있다.

본 발명의 방법은 HoxB13 유전자에 상응하는 발현된 핵산 분자 또는 발현된 폴리펩티드 분자를 검정함으로써 HoxB13 유전자로부터의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함할 수 있다. 따라서, 전사 또는 번역 수준의 검출 및 핵산 또는 폴리펩티드 분자의 안정성에 기초하는 검정이 본 발명을 수행하는데 사용될 수 있다. 당해 발명은 HoxB13 유전자로부터 전사된 서열의 발현을 검출함으로써 수행될 수 있다. HoxB13 발현에 대한 DNA 상태의 지표로서 HoxB13 유전자의 탈메틸화에 대한 검정이 또한 사용될 수 있다.

따라서, 본 발명은 HoxB13 유전자로부터 발현되는 일부 핵산 또는 폴리펩티드 분자를 검출함으로써 수행될 수 있다. 유전자 발현, 및 HoxB13 유전자로부터의 전사에서 발현된 HoxB13 서열의 발현을 검출하는 다양한 방법이 전문이 본원에 참조로 인용된 미국 특허원 제06/504,087호(2003년 9월 19일 출원), 제10/727,100호(2003년 13월 2일 출원) 및 제10/773,761호(2004년 2월 6일 출원)에 기재되어 있 고, 본 발명을 수행하는데 사용될 수 있다. 간단하게, HoxB13 전사 모두 또는 일부는 비제한적 예로서 부합화 매개된 검출(예: 마이크로어레이, 비드 또는 입자계 기술, 이에 제한되지 않음) 또는 정량적 PCR 매개된 검출(예: 실시간 PCR 및 역전사효소 PCR, 이에 제한되지 않음)의 사용으로 검출될 수 있다. HOXB13 폴리펩티드 모두 또는 일부의 발현은 비제한적인 예로서 면역조직화학 기술 또는 기타 항체 매개된 검출(예: 기타 폴리펩티드에 대하여 HOXB13 폴리펩티드의 적어도 일부에 구체적으로 결합하는 표지된 항체의 사용, 이에 제한되지 않음)의 사용으로 검출될 수 있다. 따라서, 본 발명은 상기 3개의 특허문헌에 기술된 HoxB13 핵산 및/또는 폴리펩티드 서열 모두 또는 일부 뿐만 아니라 당해 기술 분야에 공지된 서열의 발현을 검출하여 수행될 수 있거나, 당해 기술 분야의 지식 내에서 수행될 수 있다. 상기한 특허문헌에 제공된 바와 같이, HoxB13 발현은 타목시펜 치료에 반응하거나 민감한 유방암 세포에서는 감소되지만, 타목시펜 치료에 내성이거나 민감하지 않은 유방암 세포에서는 증가됨을 주시해야 한다.

본 발명의 추가의 국면에서, 본원에 기술된 방법은 동일한 형태 및/또는 조직의 정상 세포 중에서의 발현 수준에 비해 HoxB13 유전자로부터의 발현 수준의 증가 부족 또는 증가 부재에 기초하는 침습 및/또는 이동 특성에 대한 증가된 잠재력을 갖지 않는 것으로서 샘플의 하나 이상의 세포를 동정하거나 분류하는데 사용될 수 있다. 이러한 방법은 또한 침습 및/또는 이동에 대한 증가된 잠재력 없이 침습적이지 않거나 예비 침습적이지 않는 것으로서 하나 이상의 세포를 동정하는데 사용될 수 있다.

또다른 국면에서, 본 발명의 방법은 암을 앓고 있는 환자의 진단 및 치료에 원조하기 위해 적용될 수 있다. 본원에 기술된 방법은 세포 함유 샘플이 수득되어 HoxB13 발현 수준에 대해 검정되는 환자의 침습적 또는 비침습적 유방암과 같은 침습적 또는 비침습적 암 진단을 확증하는데 사용될 수 있다. 비침습적 유방암의 카테고리 내에서, 당해 방법은 침습 및/또는 이동에 대한 증가된 잠재력을 갖는 예비침습적 암, 예를 들어, 예비침습적 유방암 진단을 확증하는데 사용될 수 있다. 비제한적인 예로서 유방암을 사용하여, 당해 발명은 ADH 또는 DCIS로서 확인되는 세포를 사용하여 이들이 IDC의 경우에서 알 수 있는 바와 같이 침습 및/또는 이동에 대해 증가된 잠재력을 가지면서 예비침습성임을 동정할 수 있다. 보다 일반적으로, 본 발명의 방법은 전이에 대해 증가된 잠재력을 갖는 것으로 공지되지 않은 암 또는 예비암 세포를 포함하는 세포를 예비전이적이고/이거나 전이에 대해 증가된 잠재력을 갖는 것으로 진단하거나 동정하는데 사용될 수 있다. HoxB13 발현 수준의 검정은 세포 함유 샘플 또는 시험편을 분석하기 위한 표준 임상 병리학 프로토콜에 사용되는 면역조직화학(및/또는 동일반응계 부합화 중의 형광) 기술의 일부로서 수행될 수 있다. 따라서, 진단에 기초하는 적합한 치료법을 선택하여 HoxB13 발현 수준의 측정의 사용에 기초하여 적용할 수 있다.

본 발명의 방법은 또한 본원에 기술된 세포 함유 샘플에서 HoxB13 발현 수준의 검정에 기초하는 환자에게서 침습성 암, 예를 들어, 침습성 유방암 또는 전이에 대한 증가된 잠재력을 갖는 유방암의 진단을 확신하거나 거부하는데 사용될 수 있다. 확신 또는 거부는 표준 임상 병리학 기술(HoxB13 발현의 검출 없이), 예를 들 어, 면역조직화학 및 환자로부터 세포 함유 샘플의 시각적 검사의 사용에 기초하는 초기 진단일 수 있다. 따라서, 본 발명은 이전의 프로토콜에 비해 암 침습성과 관련하여 보다 정확한 진단을 수득하는 능력을 향상시킨다.

전적으로 또는 일부가 HoxB13 유전자로부터의 발현 수준에 따르는, 진단에 기초하는 치료법의 선택은 이로울 것 같지 않은 특정 치료법을 피하거나 배제한다. 비제한적인 예로서, 비침습성 암과 대조적으로 침습성 암 또는 전이 잠재력이 있는 암을 앓고 있는 환자의 정확한 진단은 암이 보다 중증으로 되게 하는 보다 덜 공격적인 치료법을 사용하는 위험 대신 보다 공격적인 치료법의 선택을 지지한다. 또는, 비침습성 암의 정확한 진단을 사용하여 환자로부터 불편함과 보다 공격적인 치료법의 바람직하지 않은 부작용을 감소시키는 보다 덜 공격적인 치료법의 선택을 지지할 수 있다.

추가의 국면에서, 당해 발명은 본원에 기술된 바와 같이 HoxB13 유전자로부터의 발현 수준에 기초하는 환자의 예후를 측정하는 방법을 제공한다. 당해 국면에서, 암 침습성에 대한 HoxB13 발현의 상응은 암 침습성 및 환자 예후 또는 질병 결과에 관한 정보에 연관되어 HoxB13 발현이 예후 및/또는 질병 결과를 암시하도록 한다. 비제한적 예에서, 예후 및/또는 질병 결과는 기대 여명, 여러 시간 간격에 대한 암 재발 가능성, 및 환자의 다른 조직 또는 다른 부분으로의 암 침습 및/또는 전이 가능성을 포함한다.

본 발명은 또한 환자의 임상적 또는 의학적 보호의 일부로서 이의 용도를 제공한다. 다른 임상적 방법은 본원에서 기술된 바와 같은 HoxB13 발현의 측정에 기 초하는 환자에게 의학적 보호를 제공하는데 관련되는 것들을 포함한다. 일부 양태에서, 당해 방법은 수준의 중요함 또는 함축성에 대한 해석을 포함하거나 포함하지 않고 HoxB13 발현 수준에 기초하는 진단적 서비스를 제공하는 것과 관련된다. 일부 양태에서, 본 발명의 진단적 서비스를 제공하는 방법은 서비스의 필요성 측정에 우선한다. 다른 양태에서, 당해 방법은 서비스 성능의 모니터링에서의 작용 뿐만 아니라 서비스 성능에 대한 변제의 요청 또는 수령에서의 작용을 포함한다.

본 발명의 하나 이상의 양태는 하기 첨부되는 도면 및 상세한 설명에서 상세히 기재된다. 본 발명의 기타 특징 및 이점은 도면 및 상세한 설명, 및 청구범위로부터 자명해질 것이다.

도 1은 유방 세포의 정상 (N, n=45), DCIS (n-42) 및 IDC (n-29)에서 상대량의 HOXB13 유전자 발현값을 나타낸다. 에러 바는 95% 신뢰구간을 나타낸다.

도 2는 HOXB13 mRNA의 제자리 (in situ) 하이브리드화를 나타낸다. DIG11UTP-표지된 RNA는 안티-센스 하이브리드화로 (i) 정상적인 말단 선관 소엽 유닛 (200x 확대), (ii) 제자리 선관성 암종 (400x 확대) 및 (iii) 침습성 선관성 암종 (400x 확대)의 사람 유방 상피에 대해 탐침하고, 센스 탐침 하이브리화로 (iv) 침습 선관성 암종 (400x 확대)에 대해 탐침한다. 삽입물은 각각의 영역에 대한 선택 부위의 1000x 확대를 나타낸다. L, S 및 T는 각각 소엽, 기질 및 종양을 나타낸다.

도 3은 전위적으로 HOXB13을 발현하는 세포를 사용한 이동 검정의 결과를 나타낸다. 트랜스웰 필터/20X-필드를 통해 이동된 세포의 평균 수가 나타나 있다 (삼중 웰의 +/- 표준편차). EGF는 표피 성장 인자의 존재를 말한다. 삽입물은 MCFlOA 세포에서 HOXB13의 전위적 발현을 나타낸다; pBABE 벡터 단독 (레인 1) 또는 HOXB13 (레인 2)를 갖는 발현 작제물로부터 HOXB13의 역전사 PCR 분석. 에러 바는 하나의 표준 편차를 나타낸다. 별표 *는 대조군 세포와 비교되는 P< 0.05를 나타낸다.

도 4는 HOXB13을 전위적으로 발현하는 세포를 사용한 침습 검정의 겨로가를 나타낸다. 침습된 세포의 평균 수가 나타나 있다. EGF는 표피 성장 인자의 존재를 말한다. 에러 바는 하나의 표준 편차를 나타낸다. 별표 *는 대조군 세포와 비교되는 P< 0.05를 나타낸다.

도 5는 HOXB13을 전위적으로 발현하는 MCFlOA 세포를 갖는 MCFlOA 세포의 2D 형태를 나타낸다.

도 6은, MCFlOA 세포에서 전위적 HoxB13 발현이 EHS (Engelbroth-Holm-Swarm) 육종으로부터의 세포외 매트릭스 성분을 통해 EGF-자극된 이동을 향상시킨다는 것을 나타낸다.

도 7은, MCFlOA 세포에서 전위적 HoxB13 발현이 EHS (Engelbroth-Holm-Swarm) 육종으로부터의 세포외 매트릭스 성분을 통해 EGF-자극된 침습을 향상시킨다는 것을 나타낸다.

도 8은 AN10 세포에서 HoxB13 발현이 합성적 다이머라이저 (AP1510)의 존재 및 부재 하에 이동을 향상시킨다는 것을 나타낸다. AM은 검정 배지를 나타내며, coll은 콜라겐을 말한다.

본 발명은, 원발성 암에 걸린 환자의 다른 조직 또는 부분에서 암의 전개에 대한 전이 잠재력의 표현형을 포함하여, 침습 및/또는 이동 특성의 표현형에 대한 세포에서의 증가된 HoxB13 발현과 관련된 방법을 제공한다. 이러한 특성에 대한 비제한적 예는, 증가된 세포 이동성 및/또는 이동 및 세포외 매트릭스 또는 기저막을 통해 침습 및/또는 이동하는 능력, 예를 들어 생체 내에서 또는 콜라겐의 존재하에서의 능력을 포함한다. 또한, 이러한 특성은 침습 및/또는 전이의 증가된 가능성, 또는 침습 및/또는 전이능으로 간주될 수 있다. 따라서, 본 발명은 하나 이상의 세포에서 HoxB13 유전자로부터의 발현 수준을 측정함으로써 침습 및/또는 이동 특성에 대해 증가된 잠재력을 갖는 것으로 하나 이상의 샘플 세포를 확인 또는 분류하기 위한 제1 방법을 제공하며, 여기서 상대적으로 증가된 발현 수준 또는 평균 이상의 발현 수준은 하나 이상의 세포에서 전이, 침습 및/또는 이동 특성에 대한 증가된 잠재력을 나타낸다.

HoxB13 발현에 있어 상대적 증가의 측정은 HoxB13 발현의 또 다른 수준, 예를 들어 또 다른 환자 또는 환자군의 세포에서의 수준과 비교함으로써 이루어질 수 있다. 상기 세포는 암 전이 또는 침습을 이끌거나 이끌지 않는 세포를 포함하여, 암 세포 및 암 세포가 아닌 세포일 수 있다. 물론, 상기 비교는 동일한 조직 유형, 예를 들어 유방암 대 유방 조직 또는 유방암 대 유방암 사이에 이루어질 수 있다. 일부 양태에서, 상기 비교는 또 다른 환자 또는 이러한 환자군의 동일한 유형의 암 세포에서의 HoxB13 발현에 대한 것이며, 이 때 동일한 암은 본원에 기술된 바와 같이 전이, 침습 및/또는 이동 특성에 대한 동일한 표현형을 갖지 않는다. 이러한 비교는 질환 및 임상적 결과의 후속적 과정이 알려진 환자로부터의 확정된 샘플의 암을 사용하여 쉽게 이루어진다. 이러한 후속적 임상력에 대한 비제한적 예는, 전이 및 암 재발을 포함한다. 이러한 샘플에서의 발현 수준은 새로운 샘플, 테스트 샘플 또는 미지 샘플 중의 HoxB13 발현 수준이 비교되는 참조 수준으로 간주될 수 있다. 이들 참조 발현 수준은, 새로운 샘플, 테스트 샘플 또는 미지 샘플이 비교되는 데이터베이스의 형태일 수 있다. 데이터베이스는 또한 후속적으로 암 전이 또는 재발을 경험하지 않은 환자로부터의 샘플의 참조 발현 수준을 포함할 수 있다. 이러한 수준은 또한 본 발명에서 실시 중인 새로운 샘플, 테스트 샘플 또는 미지 샘플에서의 HoxB13 발현 수준과 비교될 수 있으며, 유사한 수준은 유사한 결과의 가능성을 나타낸다. 다른 비제한적 양태에서, 후속적인 전이 또는 암 재발을 갖거나 갖지 않는 환자로부터의 참조 발현 수준은, HoxB13 발현 수준의 역치 (역치 수준 이상에서 전이, 침습 및/또는 이동의 증가 가능성이 존재한다)를 유도하기 위해 이용될 수 있다.

본 발명은, 하나 이상의 세포에서 HoxB13 유전자로부터의 발현 수준을 측정함으로써 하나 이상의 샘플 세포가 침습성인지를 확인 또는 분류하기 위한 제2 방법을 제공하며, 이 때 정상 수준 이상은 하나 이상의 세포가 침습성임을 나타낸다. 제3 방법은 하나 이상의 세포에서 HoxB13 세포로부터의 발현 수준을 측정함으로써 하나 이상의 샘플 세포가 침습성인지를 확인 또는 분류하기 위는 방법이며, 이 때 상기 세포는 EGFd 대해 반응성이고, 정상 이상의 발현 수준은 상기 하나 이상의 세포가 EGF의 존재 하에서 침습성임을 나타낸다. 일부 양태에서, 세포(들)은 EGF에 대한 단백질성 수용체를 발현하며, 본 발명의 방법은 HoxB13 발현에 대해 검정되는 세포에서 단백질성 수용체의 검출을 포함할 수 있다.

본 발명은, 하나 이상의 세포에서 HoxB13 유전자로부터의 발현 수준을 측정함으로써, 하나 이상의 샘플 세포를, 원발성 암을 앓는 환자의 다른 조직 또는 부분에서 암의 전개에 대한 전이 잠재력의 표현형을 포함하여, 침습 및/또는 이동 특성에 대한 증가된 잠재력을 갖지 않는 것으로 확인 또는 분류하기 위한 제4 방법을 제공하며, 여기서 정상 또는 정상 이하의 발현 수준은 상기한 하나 이상의 세포에서 전이, 침습 및/또는 이동 특성에 대한 증가된 잠재력의 부재를 나타낸다. 따라서, 본 발명은, 상기한 제1 방법과 함께, 다른 조직으로 전이할 하나 이상의 샘플 세포의 잠재력을 확인 또는 분류하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 하나 이상의 세포에서 HoxB13 유전자로부터의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함할 수 있으며, 여기서 정상 이상의 발현 수준은 하나 이상의 세포에서 전이의 증가된 잠재력을 나타내고, 정상 이하의 발현 수준은 전이에 대한 증가된 잠재력의 부재 또는 감소된 잠재력을 나타낸다.

제5 방법은 환자로부터 수득된 생물학적 샘플의 하나 이상의 세포에서 HoxB13 유전자로부터의 발현 수준을 측정함으로써 환자의 예후를 측정하는 방법이며, 여기서 정상 이상의 발현 수준은 상기 환자에서 침습성 암의 증가된 잠재력을 나타내고, 정상 이하의 발현 수준은 침습성 암에 대한 증가된 잠재력의 부재를 나타낸다. 이와 관련하여, 본 발명은 환자의 예후 또는 질환 결과를 예측하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 환자로부터 수득된 생물학적 샘플의 하나 이상의 세포에서 HoxB13 유전자로부터의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하며, 여기서 정상 이상의 발현 수준은 상기 환자에서 암 전이, 암 재발의 증가된 가능성 또는 감소된 기대 수명에 대한 증가된 잠재력 나타내고, 정상 이하의 발현 수준은 암 전이, 암 재발의 증가된 가능성 또는 감소된 기대 수명에 대한 증가된 잠재력의 부재를 나타낸다.

또한, 본 발명은 환자에서 치료를 결정하는데 있어 예후 또는 결과의 이용을 제공한다. 이러한 방법은 상술된 바와 같이 환자의 예후 또는 결과를 결정하고 그러한 예후 또는 결과에 기초하여 환자를 치료하는 것을 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 치료의 선택은 유리할거 같지 않은 치료를 피하거나 제거하는 것을 포함할 수 있다. 일부의 경우, 이는 환자가 비-침습성 암과는 반대로 전이 잠재력을 갖는 암을 갖는 경우, 보다 공격적인 치료의 선택을 의미할 수 있다. 다른 경우, 이는 환자가 비-침습성 암을 갖기 때문에 불쾌하고 바람직하지 않은 부작용을 피하는 덜 공격적인 치료의 선택을 의미한다.

본 발명의 추가의 양태에서, 상술된 방법에서의 HoxB13 발현의 수준과 조합하여 환자의 결절 상태가 측정될 수 있다. 따라서, 본 발명은 환자의 결절 상태를 평가하는 단계를 포함하는 방법을 포함하며, 여기서 정상 이상의 HoxB13 발현 수준과 조합된 림프절에서의 암의 부재는 전이 및/또는 침습 또는 이동에 대한 증가된 잠재력을 나타내는데 이용된다. 이러한 방법은 환자를 부적절하게 치료하게 하는 결절 음성 측정의 가능성을 감소시키는데 유리하게 적용될 수 있다. HoxB13 발현에 기초하여 이러한 결절 음성 환자가 침습성 또는 전이성 암의 증가된 위험에 놓여 있는지의 여부를 결정하는 본 발명의 능력으로, 당업자는 결절 음성 상태가 전이에 대한 증가된 잠재력을 포함하는지의 여부를 결정할 수 있다.

당업자에 의해 인지되는 바와 같이, 침습성 표현형의 예는, 세포가 종양 매쓰로부터 탈착되어 유기체의 상이한 조직 또는 부분으로 침습할 필요 없이, 원발성 (또는 최초) 종양 매쓰의 주변 조직으로의 확장을 포함한다. 또 다른 예는, 유기체의 한 부분으로부터 다른 부분 (또는 상이한 조직)으로의 암 세포의 확산 또는 전이이다. 이는 암 세포가 이들의 초기 위치로부터 재위치된 후 전이 과정의 일부로서 하나 이상의 2차 (또는 전이) 종양을 일으키는 것이 필요하다. 따라서, 침습성 선관성 암종의 세포는, 반드시 전이 잠재력을 가질 필요 없이, 선관성 환경 너머 주위 유방 조직으로 확장하는 능력을 가질 수 있기 때문에, 세포가 반드시 전이성인 것은 아니다. 그러나, 본 발명은 HoxB13 발현에 기초하여 전이 잠재력을 갖는 세포를 확인할 수 있는 능력을 제공한다. 또한, 당업자에게 공지된 바와 같이, 전이된 세포는 추가로 전이될 잠재력을 보유하거나 보유하지 않을 수 있다. 이러한 것으로서, 2차 또는 전이 종양의 세포는 본원에 기술된 바와 같이 증가된 HoxB13 발현을 갖거나 갖지 않을 수 있다.

특정 양태에서, HoxB13 발현은 유방 선암종, 자궁경부 선암종, 식도 선암종, 담낭 선암종, 폐 선암종, 췌장 선암종, 소장-대장 선암종, 위장 선암종, 성상세포종, 피부의 기저세포 암종, 간내 담관암종, 난소의 투명세포선암종, 미만성 대세포 B 림프종, 고환 태아암종, 자궁 내막양 암종, 유잉 육종(Ewings Sarcoma), 갑상선 소포암종, 위장관 간질 종양, 난소의 배아 세포종, 고환의 배아 세포종, 다형성 교모세포종, 간의 간세포 암종, 호지킨 림프종, 폐의 대세포 암종, 평활근육종, 지방육종, 유방의 소엽암종, 악성 섬유성조직구종, 갑상선 수질성 암종, 흑색종, 수막종, 폐의 중피종, 난소의 점액성 선암종, 근섬유육종, 장의 신경내분비 종양, 핍지교종, 골육종, 갑상선의 유두상 암종, 갈색세포종, 신장의 신세포암종, 횡문근육종, 고환의 정상피종, 난소의 장액성 선암종, 폐의 소세포 암종, 자궁경부의 편평세포 암종, 식도의 편평세포 암종, 후두의 편평세포 암종, 폐의 편평세포 암종, 피부의 편평세포 암종, 활막육종, T-세포 림프종 또는 방광의 이행세포 암종으로부터 선택된 암 세포에서 측정한다. 다른 양태에서, HoxB13 발현은 부신, 방광, 뼈, 뇌, 유방, 자궁경부, 자궁내막, 식도, 담낭, 신장, 후두, 간, 폐, 림프절, 난소, 췌장, 전립선, 피부, 연조직, 소장/대장, 위장, 고환, 갑상선 또는 자궁으로부터 선택된 조직의 세포 또는 암 세포에서 측정한다.

본 발명은 부분적으로 2가지 발견에 기초한다. 첫번째는 침습 전 및 침습 원발 암, 예를 들면, 유방암 및 흑색종에서 HoxB13 발현이 증가하는 것이다. 두번째는 MCFlOA 및 ANlO 세포에서 HOXB 13의 전위 발현이 세포 이동 및 침습의 유효성을 높이는 것이고, 이는 HOXB 13 발현이 종양 침습 및 전이에 기여한다는 것을 지시한다. MCFlOA 세포은 번호 CRL-10317로 ATCC(American Type Culture Collection: 미국 미생물 보존센터)에서 입수할 수 있다. MCFlOA는 인슐인, 글루코르티코이드 및 EGF에 대해 반응하는 비변형성 비-종양성 포유동물 상피세포주이다. 침습 및/또는 이동이 증가된 수치는 EGF, 콜라겐 또는 API 510, 단백질-단백질 상호작용을 증가시키는 합성 이량체화제의 존재에 의해 강화된다[참조: Amara et al., Proc. Natl. Acad. ScL, USA 94:10618-10623, (1997), AP1510에 대한 논의].

이론으로 보호되지 않고, 본 발명에 대한 이해를 향상시키기 위하여, 성장 인자 시그날링 경로(EGFR, ERBB2)가 타목시펜 내성 종양 성장을 유발할 수 있기 때문에 HOXB 13 및 EGFR 시그날링 경로 사이의 기능적 협동은 타목시펜 내성의 함량과 관련이 있을 수 있음을 참고한다[참조: Nicholson et al. "Epidermal growth factor receptor expression in breast cancer: association with response to endocrine therapy." Breast Cancer Res. Treat. 29:117-25 (1994) and Dowsett "Overexpression of HER-2 as a resistance mechanism to hormonal therapy for breast cancer." Endocr. Relat. Cancer 8:191-5 (2001)]. 사람 유방암에서 ERBB2 과잉발현의 알려진 역할이 제공되어, 명백한 생체 내 HOXB 13 발현 및 EGF 시그날링 경로 사이의 상호작용은 높은 HOXB13 발현으로 종양에서 치료학적 선택의 가능성을 나타낼 수 있다. 사실, 항체(헤르셉틴)의 차단에 의한 ERBB2 경로의 표적화는 타목시펜 내성의 함량이 성장 인자 시그날링 경로의 활성화와 에스트로겐-의존 종양 성장 사이의 연결에 기초함을 제시하였다. 호메오박스(homeobox) 단백질이 CBP/p300의 히스톤 아세틸트랜스퍼라제 활성을 억제하고[참조: Shen et al. "The HOX homeodomain proteins block CBP histone acetyltransferase activity." MoI Cell Biol 21:7509-22 (2001)], ER-의존 전사성 조절의 중요 활성화제[참조: Chakravarti et al. "Role of CBP/P300 in nuclear receptor signaling." Nature 383:99-103 (1996) and Hanstein et al. "p300 is a component of an estrogen receptor coactivator complex." Proc Natl Acad Sci. USA 93:11540-5 (1996)]인 것으로 나타났기 때문에, HOXB 13은 또한 ER 시그날링 상에 직접적으로 작용할 수 있다. 따라서, HOXB 13은 ER 시그날링 경로의 개질에서 직접적으로 또는 간적접으로 관여하고, 특히 타목시펜 내성에 대한 임상 상관관계의 가능성이 존재한다.

따라서, 본 발명은 또한 에스트로겐 또는 EGF에 대한 암, 예를 들면, 유방암 또는 흑생종의 선택성 또는 반응성과 관련된 치료법의 치료 결과를 예상하는 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 당해 방법은 HoxB13 발현의 수치를 측정함을 포함하고, 여기서 상기 정상 발현은 세포에 의한 침습, 이동 및/또는 전이를 방지하거나 감소시키는 에스트로겐 수용체와 직접적으로 관련이 있는 치료법(예를 들면, "항에스트로겐" 제제의 사용)에 대한 선택성 또는 반응성의 부족을 예상한다. 이러한 치료법은 하나 이상의 특정한 에스트로겐 수용제 조절제(SERMs), 유사 타목시펜; 특이적인 에스트로겐 수용체 하향조절제(SERDs); 비스테로이드계 또는 스테로이드계 제제를 포함하는 아로마타제 억제제(AIs) 및 에스트로겐 수용체의 가역성 억제제, 또는 이의 배합물에 의한 치료를 포함한다. 대조적으로, 증가된 HoxB13 발현의 부족은 세포의 침습, 이동 및/또는 전이를 방지하거나 감소시키는 당해 치료법의 효능을 예상할 수 있다.

아로마타제는 유방, 간, 근육 및 지방을 포함하는 신체 조직에서 에스트로겐의 주요 공급원을 제공하는 효소이다. 헴(heme) 보형 그룹을 경유하여 아로마타제를 억제하는 비스테로이드계 AIs의 예는, 이로써 제한되지는 않지만, 아나스트로졸(anastrozole)[아리미덱스(arimidex)], 렉트로졸(letrozole)[페마라(femara)] 및 보로졸(vorozole)[리비소르(rivisor)]를 포함한다. 아로마타제를 불활성화시키는 스테로이드계 AIs의 예는, 이로써 제한되지는 않지만, 엑세메스탄(exemestane)[아로마신(aromasin)], 안드로스텐디온(androstenedione) 및 포르메스탄(formestane)[레타론(lentaron)]을 포함한다. 에스트로겐 수치를 감소시키는 치료법의 기타 형태는 수술(난소의 외과적 제거) 또는 화학적 난소 제거(에스트로겐의 난소 생성을 차단시키기 위한 제제의 사용)를 포함한다. 후자의 비제한적 예 중 하나는 고나도트로핀 방출 호르몬(GnRH)의 길항제, 예를 들면, 고세렐린(goserelin)[졸라덱스(zoladex)]이다.

유사하게, 본 발명의 양태는 HoxB13 발현의 수치를 측정함을 포함하는 방법을 포함하고, 여기서 상기 정상 발현은 세포의 침습, 이동 및/또는 전이를 방지하거나 감소시키는 EGF 신호 전달 경로와 연관된 치료법에 대한 선택성 또는 반응성을 예상할 수 있다. 이러한 치료법은 EGF 수용체 패밀리와 직접적으로 상호작용하는 제제, 예를 들면, 에르비툭스(erbitux) 및 티로신 키나제 억제제, 예를 들면, 이레싸(Iressa) 및 타르세바(Tarceva)에 의한 치료를 포함한다. 기타 치료법은 EGF 수용체 경로에서 기타 인자(예를 들면, 비제한 예로서 단백질 및 효소)를 표적화하거나 억제하는 것들을 포함한다. 대조적으로, 증가된 HoxB13 발현의 무족은 세포에 의한 침습, 이동 및/또는 전이를 방지하거나 감소시키는 당해 치료법의 효능의 부족을 예상할 수 있다.

상기 기재된 것들과 같은 치료는 수술 전, 예를 들면, 선행 치료의 부분 또는 수술 후, 예를 들면, 보조 치료로 제공될 수 있다. 수술 전 치료의 경우, 치료 결과의 비제학적 예는 완료, 중간 또는, 예를 들면, "임상 반응" 또는 "병리학적 반응"에 기초한 반응이 없음, 것들을 포함한다. 대안적으로, 결과는 질병 퇴화 또는 안정한 질병(예를 들면, 전이 또는 침습의 부족, 또는 질병의 진행(예를 들면, 후속적인 전이 또는 암의 재발생)일 수 있다. 수술 후 치료의 경우, 치료 결과의 비제한적 예는 국소적인 재발, 지역적인 재발, 감소되지 않은 재발, 거리가 있는 재발, 2차 원종 및 암에 의한 사망 또는 생존을 야기하는 암 전이 또는 침습을 포함한다. 기타 결과는, 전이 또는 침습과 관련하여, 퇴화가 없는 생존, 질병이 없는 생존 및 전체 생존을 포함한다.

일부 양태에서, 본 발명은 따라서 수술 개입(예를 들면, 종양 전체 또는 부분의 수술적 제거)와 배합되어 사용되는 것이 유리할 수 있고, 여기서 수술적으로 제거된 조직은 본원에 기재된 HoxB13 발현을 위해 시험된다. 발현 수치는 국소적, 지역적, 거리가 있는 또는 감소되지 않은 암 재발; 및 미세전이로부터 유래된 바와 같은 하나 이상의 전이된 종양; 2차 원종 또는 사망 또는 생존, 예를 들면, 퇴화 또는 재발이 없는 생존, 질병이 없는 생존 및 전체 생톤의 발생을 지시하거나 예측하기 위해 사용될 수 있다.

본 발명의 실시의 다양한 비제한적 방식에 대하여, 본 발명은 17q21.2에서 사람 염색체 17으로 맵핑(mapping)된 사람 호메오박스 B13(HOXB 13)의 확인 및 사람이 아닌 동물에서 침습 세포의 확인을 위한 이의 동물 상대부분을 기초로 실시될 수 있고, 또한 본 발명은 HoxB13 서열의 발현으로 감소되는 발현의 기타 서열로 수행될 수 있다.

HoxB13 서열의 발현 수치는 단독으로 또는 암이 아니거나 정상인 세포와 비교하여 암 세포의 다양한 표현형 또는 특성을 결정할 수 있는 기타 서열과 배합되어 사용될 수 있다. 이로써 제한되지는 않지만, 예를 들면, 본 발명은 HoxB13 및 EGF 수용체의 발현 수치를 모두 분석하여 수행할 수 있다. 본 발명의 실시에서 사용되는 세포는 표피 성장 인자(EGF)를 위한 프로테이나스오스(proteinaceous) 수용체의 검출양을 발현할 수 있다. 일부 양태에서, 이러한 세포는 표피 성장 인자(EGF)에 반응성이거나 EGF의 존재하에 증식을 자극한다. 대안적으로, 본 발명은 HoxB13 발현 수치가 중심 위치와 배합되어 증가되며 수행될 수 있다.

일부 양태에서, HoxB13 서열의 발현은, 예를 들면, HoxB13 발현이 증가되거나 증가되지 않음을 용이하게 지시할 수 있는 발현 수치의 비율로 설정한 동일한 세포 함유 시료, 기타 유전자(예를 들면, 이로써 제한되지는 않지만, 암과 암이 아닌 세포 또는 정상 세포 둘 다에서 동일한 수치로 발현되는 참조 유전자)로부터의 발현과 배합되어 사용될 수 있다. 대안적으로, 본 발명은 HoxB13 서열의 발현 수치 대 침습성 또는 침습 가능성의 지시자로서 침습 세포; 증가된 이동 또는 증가된 이동 가능성; 또는 증가된 전이 가능성에서 발현되지 않는 서열의 발현 수치의 비율을 제공한다. 예를 들면, 이로써 제한되지는 않지만, 2004년 2월 6일자로 제출된 미국 특허원 제10/773,761호에 기재된 바와 같은 Hoxbl3 발현 대 IL l7br 발현의 비율 또는 Hoxbl3 대 Chdh 발현의 비율이 포함된다. 물론 HoxB13 발현 대 암 세포의 IL 17br 및 Chdh와 유사하게 발현되는 기타 유전자의 발현 비율이 또한 사용될 수 있다. 당업자는 HoxB13 발현 수치의 측정이 또한 HoxB13 발현 및 본원에 기재된 암의 표현형 사이의 관계에 주어진 복잡화없이 이러한 수치로 분자 또는 분모로서 사용될 수 있음을 인식할 것이다.

HoxB13 서열의 발현의 초점은 목적에 근거하여 분자적인 제한하에 암으로 고통받는 대상체를 위한 치료를 진단하고/거나 결정하는 방법을 제공한다. 당해 방법은 또한 환자의 징후 및 유사 질환 결과를 결정하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 방법은 또한 세포형태학의 사용 및 환자에 대한 확인 위험성에 대해 유리하다. 일부 양태에서, 당해 방법은 문헌[참조: Tan-Chiu et al. (J Natl Cancer Inst. 95(4):302-307, 2003)]에서 논의된 바와 같이 유방암의 관련 위험성의 평과와 배합하여 사용될 수 있다. 예를 들면, 이로써 제한되지는 않지만, 본원에 기재된 바와 같은 HoxB13 서열의 발현 수치를 위한 유방 세포의 최소 침습성 샘플링의 분석, 예를 들면, 무작위(유륜주위) 미세한 바늘 흡입 또는 도관 세척 시료(및 임의로 양성 또는 음성 유방암에 대한 유방 X선 사진 양성없이 또는 이와 병행하여)를 포함한다. 본 발명의 기타 적용은 자연적으로 전이될 가능성이 있는 암을 포함하여 향상된 유방암의 분석을 포함한다.

본 발명의 검정 방법은 검정이 서열의 발현을 정량적으로 또는 점성적으로 반영하는 한, HoxB 13 서열의 발현 수준에 관련된 수단을 이용할 수 있다. 몇몇 양태에서, 정량 검정 수단이 사용된다. 전이, 침습 및/또는 이동 특징을 결정하는 능력은 HoxB 13의 발현의 수준의 관련성의 인지에 의해 제공되나 발현의 실제 수준을 결정하기 위해 사용된 검정 형태에 의해 제공되지 않는다. 서열의 동정 특징은 HoxB 13 서열을 암호화(DNA)하거나 발현(RNA)하기 위해 사용된 독특한 핵산 서열 또는 HoxB 13 서열에 의해 암호화된 단백질에 특이적인 또는 단백질의 활성에 특이적인 에피토프를 포함하나 이로 한정되는 것은 아니다. 또 다른 수단은 증가된 발현의 지시제로서 많은 조직에서 통상 메틸화된 HoxB 13 암호화 DNA의 탈메틸화에 의한 것이다.

또 다른 수단은 증가된 발현 수준을 지시하는 핵산 증폭 및 감소된 발현 수준을 지시하는 핵산 불활성화, 결실 또는 메틸화의 검출을 포함한다. 달리, 본 발명은 HoxB 13 서열(들)의 발현을 기초하는 DNA 주형(들), 서열(들)을 발현시키는 중간체로서 사용된 RNA 또는 서열(들)에 의해 발현된 단백질성 생성물 뿐만 아니라 이러한 생성물의 단백질 가수분해 단편의 하나 이상의 측면을 검정함으로써 수행할 수 있다. 그 자체로, 이러한 DNA, RNA 및 단백질성 분자의 존재, 양, 안정성 또는 분해(속도 포함)의 검출은 본 발명의 실시에서 사용될 수 있다. 물론, 임의의 HoxB 13 핵산 분자의 측정은 비제한적인 예로서 프로브 서열에 대한 하이브리드화를 사용하여 수행할 수 있다.

또한, HoxB 13 암호화 생성물의 기능 또는 후-변환 개질은 발현의 지시제로서 검정될 수있다. 비제한적인 예는 하나 이상의 결합 파트너와의 HoxB 13 단백질 상호반응 또는 HoxB 13 폴리펩티드의 공유 개질, 예를 들면, 이로 한정되지 않은 포스포릴화, 글리코실화 또는 아실화의 측정을 포함한다. 당해 분야의 숙련가에게 자명한 바와 같이, HoxB 13의 발현 수준 측정은 개체 또는 환자의 집단를 2개 이상의 집단, 예를 들면, 정상 세포의 발현 수준의 이상 및 이하로 한정하기 위해 사용될 수 있다.

본 발명의 실시는 특정 HoxB 13 서열 및 개체 샘플의 세포에 의해 발현된 것 사이의 최소 불일치의 존재에 영향받지 않는다. 이러한 불일치의 존재의 비제한적인 예는 개개의 종, 예를 들면, 호모 사피엔스 내의 사람 환자 상이의 서열 다형성의 경우에 보여진다. HoxB 13 서열(및 최소 불일치에 기인하여 다양한 서열)의 발현이 침습 및/또는 이동 표현형과 관련되어 있다는 것은 발현 검정을 통해 적절한 세포 함유 샘플을 사용하는 본 발명의 실시에 충분하다.

몇몇 양태에서, 본 발명에 사용되는 세포 함유 샘플은 간단한 조직 검사에 의해 가능한 것 이상으로 오염 세포로부터 분리되거나 정제 또는 절단된 단일 세포 또는 동질 세포 집단을 함유한다. 세포는 임의의 공급원, 예를 들면, 이로 한정되지 않는 사람과 같은 유기체로부터의 유체 함유, 세포 함유 또는 조직 함유 샘플로부터 얻을 수 있다. 기타 비제한적인 예는 조직 검사, 예를 들면, 전암 조직 검사 또는 암진단 조직 검사를 포함한다. 세포(들)는 또한, 부정형 또는 전암으로서 동정될 수 있으나, 본 발명에서의 사용은 상기 기술한 침습 표현형의 동정을 허락한다.

세포의 분리 방법은 당해 분야에 공지되어 있으며, 미세 절단, 레이저 포착 미세 절단(LCM) 또는 레이저 미세절단(LMD)를 포함한다. 또는, 조직의 "섹션" 내의 절단되지 않은 세포를 사용할 수 있다. 샘플에서 세계적인 유전자 발현용 검정(예: 마이크로어레이 상에서 유전자 발현 프로파일링 분석의 일부로서) 또는 특정 검출, 예를 들면, 정량 PCR(Q-PCR) 또는 실시간 정량 PCR에 의한 발현 검출을 포함하는 이러한 분석의 복합 수단을 이용할 수 있다. 기타 비제한적인 측정 기술은 질량 분광을 기본으로 하는 것을 포함한다.

추가의 양태에서, 샘플을 비침습 또는 최소 침습 수단을 통해 분리한다. 몇몇 양태에서, 샘플은 부정형 관상피 증식(ADH), 동일 반응계내 관상피 암종(DCIS) 및 침습 관상피 암종(IDC)로부터 선택된 하나 이상의 유방암 세포를 함유한다. 샘플에서 HoxB 13 서열(들)의 발현을 측정하고, 정상 또는 비-암 세포의 참조 데이타와 상기 서열(들)의 발현을 비교할 수 있다. 몇몇 경우에서, 참조 데이타는 동일 샘플 또는 개체로부터 수득한다. Q-PCR을 이용하는 본 발명의 양태에서, 발현 수준을 동일한 샘플에서 하나 이상의 참조 유전자의 발현 수준과 비교하거나 발현 수준 비(예: 비제한적인 예로서 △Ct를 기본으로 한 것)를 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명은 암 표현형, 예를 들면, 본원에 기술된 전이 포텐셜을 갖는 ADH, DCIS 및/또는 IDC 세포를 동정하기 위해 용이하게 사용될 수 있다. 이는 또한 유익하게는 침습 포텐셜 또는 경향을 갖는 ADH 또는 DCIS 세포의 동정을 허락한다.

개개 유방 또는 암 세포를 본 발명의 실시에서 분리하는 경우, 오염 비-유방 또는 비-암 세포(예: 침윤 임파구 또는 기타 면역 시스템 세포)는 아마 HoxB 13 서열(들)의 발현 검출에 영향을 미치지 않는다.

본 발명은 주로 사람 유방암과 관련하여 기술되며, 임의의 사람 암 또는 임의의 동물의 암과 관련하여 실시될 수 있다. 본 발명의 적용에 바람직한 동물은 포유동물, 특히 농업에 중요한 동물(예: 이로 한정되지 않은 소, 양, 말 및 기타 "농장 동물") 및 사람과 교유관계의 동물(예: 이로 한정되지 않은 개 및 고양이)이다.

본원에서 사용된 "유전자"는 사실상 RNA 또는 단백질성인 이산 생성물을 암호화하는 폴리뉴클레오티드이다. 하나 이상의 폴리뉴클레오티드가 이산 생성물을 암호화할 수 있다. 이러한 용어는 동일한 생성물 또는 염색체 위치 및 통상의 유사분열 동안 재조합 능력을 기본으로 하여 기능적으로 연합된(기능의 획득, 손실 또는 조정을 포함) 이의 동족체를 암호화하는 유전자의 대립 유전자 및 다형을 포함한다.

본원에서 사용된 "서열" 또는 "유전자 서열"은 핵산 분자 또는 뉴클레오티드 염기의 별개 순서로 구성된 폴리뉴클레오티드이다. 이러한 용어는 사실상 RNA 또는 단백질성인 이산 생성물(즉. "암호화 영역")을 암호화하는 염기의 순서를 포함한다. 하나 이상의 폴리뉴클레오티드가 이산 생성물을 암호화할 수 있다. 기술된 HoxB 13 서열의 대립 유전자 및 다형이 존재할 수 있고, 기술된 HoxB 13 서열 또는 이의 대립 유전자 또는 다형의 발현 수준(들)을 동정하기 위해 본 발명의 실시에서 사용될 수 있다. 대립 유전자 또는 다형의 동정은 부분적으로는 염색체 위치 및 유사분열 동안 재조합 능력에 좌우된다.

용어 "상관되는" 또는 "상관" 또는 이의 등가 표현은 하나 이상의 유전자 및 생물학적 표현형 또는 특징의 발현 사이의 회합을 언급한다.

"폴리뉴클레오티드"는 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드인 임의 길이의 뉴클레오티드의 중합체성 형태이다. 이러한 용어는 분자의 제1 구조만을 언급한다. 따라서, 이러한 용어는 이중 및 단일 스트랜드 DNA 및 RNA를 포함한다. 또한, 당해 분야에 공지된 표지를 포함하는 공정된 형태의 개질, 메틸화, "캡(cap)", 하나 이상의 천연 뉴클레오티드의 동족체 치환 및 하전되지 않은 결합과 같은 인터뉴클레오티드 개질(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등) 및 폴리뉴클레오티드의 개질되지 않은 형태를 포함한다.

용어 "증폭하는"는 광의로 효소적으로 DNA 또는 RNA 폴리머라제를 사용하여 제조할 수 있는 증폭 생성물을 생성시킴을 나타내기 위해 사용된다. 본원에서 사용된 "증폭"은 일반적으로 목적하는 서열, 특히 샘플의 서열의 복합 복제물을 생성시키는 방법을 언급한다. "복제물"은 반드시 주형 서열에 상보적이거나 동일한 완전한 서열을 의미하지 않는다. mRNA를 증폭시키는 방법은 일반적으로 당해 분야에 공지되어 있고, 역전사 PCR(RT-PCR) 및 미국 특허원 제10/062,857(2001.10.25.출원) 및 미국 가특허원 제60/298,847(2001.06.15.출원) 및 제60/257,801(2000.12.22.출원)에 기술된 것을 포함하며, 이들 전분은 본 명세서 내에서 참고문헌으로 포함된다. 사용할 수 있는 또 다른 방법은 정량 PCR(또는 Q-PCR)이다. 또는, RNA를 당해 분야에 공지된 방법에 의해 상응하는 cDNA로서 직접 표지할 수 있다.

"상응하는"은 핵산 분자가 또 다른 핵산 분자와 상당량의 서열 동일성을 공유함을 의미한다. 상당량은 95% 이상, 통상적으로는 98% 이상, 보다 통상적으로는 99% 이상을 의미하고, 서열 동일성은 문헌[참조: Altschul et al. (1990), J. Mol. Biol. 215:403-410]에 기술된 BLAST 알로리즘(공개된 디폴트 세팅, 즉 파라미터 w=4, t=17 사용)을 사용하여 측정한다.

"마이크로어레이"는 각각 이로 한정되지 않는 유리, 플라스틱 도는 합성 막과 같은 고체 지지체의 표면에 형성된 한정된 영역을 갖는 바람직하게는 이산 영역의 1차 또는 2차 또는 3차(및 고체 상) 어레이이다. 마이크로어레이 상의 이산 영역의 밀도는 단일 고체 상 지지체의 표면 상에서 검출된 부동화 폴리뉴클레오티드의 전체 수에 의해 측정되며, 바람직하게는 약 50/cm² 이상, 보다 바람직하게는 약 100/cm² 이상, 더욱 바람직하게는 약 500/cm² 이상이나, 바람직하게는 약 1,000/cm² 이하이다. 바람직하게는 어레이는 총 약 500 미만, 약 1000 미만, 약 1500 미만, 약 2000 미만, 약 2500 미만 또는 약 3000 미만의 부동화 폴리뉴클레오티드를 함유한다. 본원에서 사용된 DNA 마이크로어레이는 샘플로부터 증폭 또는 클로닝된 폴리뉴클레오티드로 하이브리드화하기 위해 사용된 기타 표면 또는 칩에 위치하는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드의 어레이이다. 어레이에서 프로브의 각각의 특정 그룹의 위치가 공지되어 있으므로, 샘플 폴리뉴클레오티드의 동질성은 마이크로어레이에서 특정 위치에 대한 이들의 결합을 기준으로 하여 측정할 수 있다. 마이크로어레이 사용의 대안으로서, 단일 유전자 서열의 발현을 검출하기 위해 고체 상에서 2차 또는 3차 배열의 하나 이상의 위치의 배열을 포함하는 임의 크기의 어레이를 본 발명의 실시에서 사용할 수 있다. 몇몇 양태에서, 본 발명에서 사용되는 마이크로어레이는 사진 석판 기술(예: 3' 말단으로부터 표면 상에 핵산 프로브의 합성) 또는 핵산 합성에 이어 고체 표면 상에 침착시켜 제조할 수 있다.

본 발명은 유전자 발현의 확인에 의존하기 때문에, 본 발명의 한 양태는 특정 HoxB13 서열에 유일한 폴리뉴클레오티드에 대한 샘플 세포의 mRNA 또는 이의 증폭된 또는 클로닝된 버젼의 하이브리드화에 의한 발현을 측정함을 포함한다. 이러한 유형의 바람직한 폴리뉴클레오티드는 다른 유전자 서열에서는 나타나지 않는 HoxB13 서열의, 적어도 약 16, 적어도 약 18, 적어도 약 20, 적어도 약 22, 적어도 약 24, 적어도 약 26, 적어도 약 28, 적어도 약 30, 또는 적어도 약 32개의 연속적 염기쌍을 함유한다. 앞 문장에 사용된 용어 "약"은 언급한 수치로부터 1 증가 또는 감소를 의미한다. 보다 더욱 바람직한 것은 다른 유전자 서열에서는 나타나지 않는 서열의, 적어도 또는 약 50, 적어도 또는 약 100, 적어도 또는 약 150, 적어도 또는 약 200, 적어도 또는 약 250, 적어도 또는 약 300, 적어도 또는 약 350, 적어도 또는 약 400, 적어도 또는 약 450, 또는 적어도 또는 약 500개의 연속적 염기의 폴리뉴클레오티드이다. 앞 문장에 사용된 용어 "약"은 언급한 수치로부터 10% 증가 또는 감소를 의미한다. 보다 긴 폴리뉴클레오티드는 물론 샘플의 핵산에 대한 하이브리드화에 영향을 미치지 않는 소량의 미스매치(mismatch) (예를 들면, 돌연변이의 존재를 통해)를 함유할 수 있다. 또한, 이러한 폴리뉴클레오티드는 본원에 기재된 유전자의 서열 또는 이의 특징적 부분에 하이브리드화될 수 있는 폴리뉴클레오티드 프로브라고 할 수 있다. 이러한 폴리뉴클레오티드는 이의 검출을 돕기 위해 표지시킬 수 있다. 바람직하게는, 서열은 유전에 의해 암호화된 mRNA의 서열, 이러한 mRNA에 상응하는 cDNA의 서열, 및/또는 이러한 서열의 증폭된 버젼이다. 본 발명의 바람직한 양태에서, 폴리뉴클레오티드 프로브는 어레이, 다른 고체 지지체 장치, 또는 프로브를 국지화하는 개별 스팟에 고정된다.

본 발명의 또 다른 양태에서, HoxB13 서열의 전체 또는 일부는 폴리머라제 쇄 반응(PCR) 및 이의 변형법, 예를 들면, 이들로 제한되는 것은 아니나, 정량적 PCR (Q-PCR), 역전사 PCR (RT-PCR), 및 실시간 PCR (샘플 내 각 서열에 대한 mRNA 복제물의 초기량을 측정하는 수단으로서 포함), 임의로 실시간 RT-PCR 또는 실시간 Q-PCR과 같은 방법으로 증폭 및 검출할 수 있다. 당해 방법은 HoxB13 서열의 일부와 상보적인 하나 또는 두개의 프라이머를 사용하고 여기서 프라이머는 핵산 합성을 프라이밍하는데 사용된다. 새롭게 합성된 핵산은 임의로 표지되고 직접적으로 검출되거나 본 발명의 폴리뉴클레오티드와 하이브리드화시켜 검출될 수 있다. 새롭게 합성된 핵산은 하이브리드화를 허용하는 조건하에서 본 발명의 폴리뉴클레오티드(서열 포함)와 접촉시킬 수 있다. 발현된 핵산의 발현을 검출하기 위한 추가의 방법은 액상 하이브리드화 및 세포의 동일계 하이브리드화를 포함하는 RNAse 보호 분석을 포함한다.

또한 본 발명의 또 다른 양태에서, HoxB13 발현은 대상 세포 샘플내 또는 피검체의 체액에서 개별적 HoxB13 유전자 생성물(단백질) 또는 이의 단백질 분해 단편의 하나 이상의 에피토프에 특이적인 하나 이상의 항체를 사용하여 당해 당해 세포 샘플내에서 발현되는 단백질을 분석함으로써 측정될 수 있다. 세포 샘플은 유방암 상피 세포중 하나일 수 있고 세포 표면 마커에 대해 표지된 항체를 사용함에 이어서 형광 활성화된 세포 분류(FACS)를 사용하여 피검체의 혈액으로부터 집적시킬 수 있다. 당해 항체는 바람직하게 유전자 생성물에 결합한 후의 검출이 용이해지도록 표지된다. 본 발명에 적합한 검출 방법은 세포 함유 샘플 또는 조직의 면역조직화학분석법, 세포 함유 조직 또는 혈액 샘플의 항체 샌드위치 분석법을 포함하는 면역흡착 분석법(ELISA), 질량 분광기 및 면역-PCR법을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

용어 "표지" 또는 "표지된"은 표지된 분자의 존재를 암시하는 검출가능한 시그날을 발생시킬 수 있는 조성물을 언급한다. 적합한 표지는 방사성동위원소, 뉴클레오티드 발색단, 효소, 기질, 형광 분자, 화학발광 잔기, 자기 입자, 생발광 잔기등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 이와 같이, 표지는 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적, 전기적, 광학적 또는 화학적 수단에 의해 검출될 수 있는 임의의 조성물이다.

용어 "지지체"는 비드, 입자, 깊이 가늠 막대, 섬유, 필터, 막 및 실란과 같은 통상적인 지지체 또는 유리 슬라이드와 같은 실리케이트 지지체를 언급한다.

유방 기원의 세포 함유 샘플의 개념은 유방암으로 의심되거나 유방암이 발병할 위험에 처한 환자로부터 분리된 유방 조직 또는 체액의 샘플을 언급한다. 당해 샘플은 원발성 분리물(배양된 세포와는 대조적으로)이고 도관 세척기, 미세 바늘 흡입기, 바늘 생검기, 미국 특허 제6,328,709호에 기재된 장치 및 방법 또는 당업계에 인지된 기타 적합한 수단을 포함하지만 이에 제한되지 않는 비침입성 또는 최소 침입성 수단에 의해 수거될 수 있다. 또한, "샘플"은 외과용 생검기를 포함하지만 이에 제한되지 않는 침입성 방법에 의해 수거될 수 있다.

본 발명에 사용하기 위한 세포 함유 샘플의 비제한적인 예는 혈액, 혈청 또는 혈장과 같은 체액 샘플; 상피 세포, 내피 세포, 순환 종양 세포 또는 임의의 대상 세포가 풍부한 샘플; 세포 및/또는 단백질, DNA, 또는 RNA를 함유하는 체액, 예를 들어, 뇨 또는 방광 세척액 또는 세포 펠렛 또는 이의 스프레드; 자궁 스크랩(예를 들어, PAP 스미어); 자궁내막 스크랩; 스툴, 협측 세포; 세포 함유 흡입물, 예를 들어, 종양을 함유하는 임의의 체액으로부터 분리된 것들; 세포 함유 박피; 및 조직 샘플, 예를들어, 조직의 미세 바늘 흡입물, 바늘 생검기, 적출 생검기 및 제조원(Cytyc)의 ThinPrep을 포함한다. 몇몇 양태에서, 샘플은 피검체 또는 환자의 원발성(최초의) 암 또는 종양이다. 종양은 임의로 에스트로겐 수용체 양성일 수있다.

"발현" 및 "유전자 발현"은 핵산 물질의 전사 및/또는 해독을 포함한다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "포함하는" 및 이의 어족은 이의 포괄적 의미로 사용되는데, 즉 용어 "함유하는" 및 이에 상응하는 어족과 동등하다.

특정 반응이 일어나도록 하는 조건 또는 반응이 일어나기에 적합한 조건, 예를 들어, 하이브리드화, 쇄 확장 등 또는 "적합한' 조건은 당해 반응이 일어나는 것을 방해하지 않는 조건이다. 따라서, 이들 조건은 반응을 허용하고, 증진시키고, 촉진시키고/거나 유도한다. 당업계에 공지되고 본원에 기재된 당해 조건은 예를 들어, 뉴클레오티드 서열의 특성, 온도 및 완충액 조건에 의존한다. 이들 조건은 또한 하이브리드화, 절단, 쇄 확장 또는 전사와 같은 목적하는 반응에 좌우된다.

본원에 사용된 바와 같은 서열 "돌연변이"는 표준 서열과 비교하여 본원에서 목적하는 유전자의 서열이 임의로 변화된 서열을 언급한다. 서열 돌연변이는 치환, 결실 또는 삽입으로 인한 단일 뉴클레오티드 변화 또는 서열내 하나 이상의 뉴클레오티드의 변화를 포함한다. 단일 뉴클레오티드 다형태(SNP)는 또한 본원에 언급된 바와 같은 서열 돌연변이이다. 본 발명은 유전자 발현의 상대적 수준을 기초로 하기 때문에 본원에 기재된 바와 같은 유전자의 비암호화 영역에서의 돌연변이는 또한 본 발명에서 분석될 수 있다.

"결실" 또는 "검출"은 유전자 발현 및 이의 변화에 대한 직간접적인 검출을 포함하는 임의의 검출 수단을 포함한다. 예를 들어, 생성물의 "검출가능한 증가"는 직간접적으로 관찰될 수 있고 당해 용어는 임의의 증가를 지적한다. 생성물의 "검출 가능한 감소"는 직간접적으로 관찰될 수 있고 당해 용어는 임의의 감소(검출가능한 시그날의 부재를 포함)를 지적한다.

HoxB13 서열의 발현 증가 및 감소는 정상 세포 발현 이상으로 백분율 또는 배수가 변화를 기준으로 하는 하기의 용어로 정의된다. 증가는 정상 세포에서의 발현과 비교하여 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140,160, 180 또는 200%일 수 있다. 또한 배수 변화는 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5 또는 10배일 수 있다. 감소는 정상 세포에서 발현 수준과 비교하여 10, 20, 30, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 99 또는 100%일 수 있다.

"선택적 에스트로겐 수용체 조절제" 또는 SERM은 몇몇 조직에서는 에스트로겐처럼 작용(효능제)하지만 또 다른 조직에서는 에스트로겐 작용을 차단(길항제)하는 "항에스트로겐" 제제이다. "선택적 에스트로겐 수용체 하향조절제(또는 "SERD") 또는 "순수한" 항에스트로겐은 모든 조직에서 에스트로겐 활성을 차단하는 제제를 포함한다[문헌참조: Howel et al.(Best Bractice & Res. Clin. Endocrinol. Metab.18(1):47-66, 2004]. 본 발명의 바람직한 SERM은 유방암 세포를 포함하는유방 조직 및 세포내 에스트로겐의 길항제이다. 이의 비제한적인 예는 TAM, 랄록시펜, GW5638 및 ICI 182,780을 포함한다. 다양한 SERM에 의한 가능한 작용 기작은 문헌[참조: Jordan et al., 2003, Breast Cancer Res. 5:281-283; Hall et al., 2001, J. Biol. Chem. 276(40):36869-36872; Dutertre et al. 2000, J. Pharmacol. Exp. Therap. 295(2):431-437; and Wijayaratne et al., 1999, Endocrinology 140(12):5828-5840]에서 검토되었다. 본 발명에서 SERM의 기타 비제한적인 예는 타목시펜, GW5638, TAT-59, 클로미펜, 토레미펜, 드롤록시펜 및 요독시펜과 같은 트리페닐에틸렌; 아르족시펜(LY353381 또는 LY353381-HCl)과 같은 벤조티오펜; EM-800과 같은 벤조피란; CP-336,156 및 ERA-923과 같은 나프탈렌을 포함한다.

SERD 또는 "순수한" 항에스트로겐의 비제한적인 예는 ICI 182,780(풀베스트란트 또는 파슬로덱스) 또는 경구용 유사체인 SR16243 및 ZK 191703과 같은 제제 뿐만 아니라 본원에 기재된 바와 같은 아로마타제 억제제 및 화학적 난소 제거제를 포함한다.

본원에 사용된 바와 같은 SERM이 포함하는 기타 제제는 프로게스테론 수용체 억제제 및 관련 약물, 예를 들어, 프로게스테론모사체(메드록시프로게스테론 아세테이트, 메가스 및 RU-486과 같은) 및 ER 작용을 갖는 펩타이드 계열 억제제, 예를 들어, LH-RH 유사체(류프롤리드, 졸라덱스, [D-Trp6]LH-RH), 소마토스타틴 유사체 및 ER의 LXXLL 잔기 모사체 뿐만 아니라 티볼론 및 레스베라트롤을 포함한다. 상기된 바와 같이, 본 발명의 바람직한 SERM은 유방암 세포를 포함하는 민감한 조직 및 세포에서 에스트로겐의 길항제이다. 바람직한 SERM의 비제한적인 예는 임의의 SERM의 실제 또는 추정 대사물, 예를 들어, 4-하이드록시타목시펜(타목시펜의 대사물), EM652(또는 EM-800이 EM-652의 프로드럭인 SCH57068) 및 GW7604(GW5638의 대사물)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 몇몇 특정 SERM의 논의를 위해 문헌[참조: Willson et al. (1997, Endocrinology 138(9):3901-3911) and Dauvois et al. (1992, Proc. Nat'l. Acad. Sci., USA 89:4037-4041)]을 참조한다.

다른 바람직한 SERM은 타목시펜 또는 4-리이드록시타목시펜과 동일한 관련 유전자 발현 프로필을 나타내는 것들이다. 이러한 SERM을 동정하는데 사용되는 수단의 일례는 문헌[Levenson et al., 2002, Cancer Res. 62:4419-4426]에 제공된다.

달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 과학 기술 용어는 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 기술을 가진 자가 통상적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다.

본 발명의 수행에서, HoxB13의 (증가되거나 감소된) 발현 수준을 측정하기 위하여, 당업계에 공지된 모든 방법을 사용할 수 있다. 본 발명의 바람직한 양태에서, 본원에서 동정되고 기재된 유전자에 하이브리드화하는 RNA의 검출을 기반으로 하는 발현이 사용된다. 이는 본원에 기재되거나 당업계에서 균등한 것으로 공지되거나 인식된 모든 RNA 검출 또는 증폭+검출 방법, 예를 들어 이에 제한되는 것은 아니지만, RNA 안정화 또는 불안정화 서열의 존재 또는 부재를 검출하는 방법에 의해 쉽세 수행된다.

대안적으로, DNA 상태의 검출을 기반으로 하는 발현이 사용될 수 있다. 메틸화되거나 결실된 HoxB13 유전자의 검출을 사용하여 발현의 감소를 검출할 수 있다. HoxB13의 프로모터 영역의 상태는 HoxB13 서열의 감소된 발현의 표시로서 평가할 수 있다. 비-제한적 예는 프로모터 영역에서 발견된 서열의 메틸화 상태이다. 반대로, 증폭된 HoxB13 유전자의 검출은, 특정 유방암 결과와 관련하여 발현이 증가된 유전자에 대해 사용될 수 있다. 이들 방법은 당업계에 공지된 PCR-기반 방법, 형광성 원위치(in situ) 하이브리드화 (FISH) 방법 및 염색체 원위치 하이브리드화 (CISH) 방법에 의해 쉽게 수행될 수 있다.

HoxB13 단백질 수준 또는 활성의 존재, 증가 또는 감소를 기반으로 하는 발현이 또한 사용될 수 있다. 검출은, 단백질의 검출에 적당한 것으로 당업계에 공지되고 인정된 모든 면역조직화학 (IHC)-기반 방법, 체액-기반 방법 (HoxB13 폴리펩타이드 또는 이의 단편이 혈액 등과 같은 체액에서 발견되는 경우), 항체 (존재하는 단백질에 대한 자가항체 포함)-기반 방법, 박탈(exfoliate) 세포 (암 유래)-기반 방법, 질량 분광법-기반 방법, 및 영상 (표지된 리간의 사용 포함)-기반 방법에 의해 수행될 수 있다. 추가적으로, 항체 및 영상-기반 방법은, 암 세포의 공급원이 알려지지 않은 경우에, 비-침습 방법 (예를 들어, 관 세척 또는 미세침 흡인)에 의해 수득된 세포를 사용하여 암을 판정한 후, 종양의 위치결정에 유용하다. 표지된 항체 또는 리간드는 환자 내의 암종(들)의 위치를 결정하거나, 또는 체액으로부터 박탈된 암 세포들의 농축을 조장하는데 사용될 수 있다.

이러한 검출 방법에 사용하기 위한 항체로는, 이용가능한 경우에 천연의 공급원으로부터 임의적으로 분리된 폴리클로날 항체, 및 HoxB13 폴리펩타이드 또는 이의 단편을 항원으로서 사용하여 제조된 항체를 포함한 모노클로날 항체가 포함된다. 이러한 항체 및 이의 단편 (Fab 단편을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아님)은, 다른 폴리펩타이드를 제외하고, 검출가능한 시그날을 나타내는 HoxB13 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 이의 능력에 의해 비-정상 세포 또는 암 세포를 검출하거나 진단하는 작용을 한다. 동일한 능력을 가진 재조합, 합성 및 하이브리드 항체가 또한 본 발명의 수행에 사용될 수 있다. 항체는 HoxB13 폴리펩타이드 또는 이의 단편으로 면역화시킴으로써 쉽게 생성될 수 있고, 폴리클로날 혈청이 또한 본 발명의 수행에 사용될 수 있다.

항체-기반 검출 방법은 당업계에 익히 공지되었으며, 샌드위치 및 ELISA 검정뿐만 아니라 웨스턴 블롯 및 유동 세포계측-기반 검정을 비-제한적인 예로서 포함한다. 이러한 방법에서 분석을 위한 샘플은 HoxB13 폴리펩타이드를 함유하는 모든 것을 포함한다. 비-제한적 예로는, 상기 폴리펩타이드를 함유하는 유방 세포 및 세포 내용물뿐만 아니라 체액 (혈액, 혈청, 타액, 림프액뿐만 아니라 점막 및 기타 세포 분비물을 비-제한적 예로서 포함)이 포함된다.

발현을 판정하는 핵산-기반 검정을 사용하는 바람직한 양태는, 어레이(array)로서 고체 기질을 포함하나 이에 제한되지 않는 고체 지지체 상에 또는 비이드(bead)에 하나 이상의 HoxB13 서열을 고정시키거나, 또는 당업계에 공지된 비이드-기반 기법에 의한다. 달리, 당업계에 공지된 용액-기반 발현 검정이 또한 사용될 수 있다. 고정된 HoxB13 유전자(들)은, 폴리뉴클레오티드가 HoxB13 DNA 또는 RNA에 하이브리드화할 수 있도록, HoxB13에 특유하거나 또는 특이적인 폴리뉴클레타이드의 형태일 수 있다. 이들 폴리뉴클레오티드는 HoxB13 유전자(들)의 전체 길이이거나, 또는 당해 유전자의 단축 서열 (당해 서열의 5' 또는 3' 말단으로부터의 결실에 의해 당업계에 공지된 전체 길이 서열보다 최대 하나의 뉴클레오티드가 짧음)일 수 있으며, 이는 HoxB13에 상응하는 DNA 또는 RNA와의 하이브리드화가 영향받지 않도록 임의적으로 최소한으로 개입중단 (예를 들어, 부정합 또는 비-상보성 염기쌍의 삽입에 의함)될 수 있다. 바람직하게는, 사용된 폴리뉴클레오티드는 당해 유전자의 3' 말단으로부터 유래된 것, 예를 들어 유전자 또는 발현된 서열의 폴리아데닐화 시그날 또는 폴리아데닐화 부위로부터 약 350, 약 300, 약 250, 약 200, 약 150, 약 100, 또는 약 50 뉴클레오티드 내의 것들이다. 개시된 유전자의 서열에 대해 돌연변이를 함유하는 폴리뉴클레오티드는, 당해 돌연변이의 존재가 여전히 검출가능한 시그날을 나타내는 하이브리드화를 허용하는 한, 사용될 수 있다.

고정된 HoxB13 유전자(들)은, 샘플 피험자 (예를 들어, 샘플을 수득한 환자)의 결과가 알려지지 않았거나 또는 샘플 피험자에게 이미 고지된 결과를 확인하기 위하여, 샘플 유방 세포(들)로부터 수득된 핵산 샘플의 상태를 판정하는데 사용될 수 있다. 본 발명을 제한하지 않으면서, 이러한 세포는 ER+ 또는 ER- 유방 암을 가진 환자로부터 유래될 수 있다. 고정된 폴리뉴클레오티드(들)은, 적당한 조건하에서 샘플로부터 유래된 상응하는 핵산 분자에 특이적으로 하이브리드화하기에 충분하기만 하면 된다.

당업자가 고려하는 바와 같이, 일부 HoxB13 서열은, 개시된 서열의 특유성에 관여하지 않는 3' 폴리 A (또는 상보적 쇄의 폴리 T) 서열을 포함한다. 따라서, 본 발명은 3' 폴리 A (또는 폴리 T) 서열이 결여된 HoxB13 서열을 사용하여 수행될 수 있다. 개시된 서열의 특유성은, 3' 미해독 부분에서 발견되는 특유 서열을 포함한, 핵산에서만 발견되는 서열의 일부 또는 전부에 있다. 본 발명의 수행에 바람직한 특유 서열은, 일부 개체에 존재하는 다형성에 대해 특이적인 것 보다는, 차라리 각종 개체에서의 발현을 검출하는데 특유 서열이 유용할 수 있도록, HoxB13에 대한 컨센서스(consensus) 서열을 제공하는 것들이다. 달리, 개체 또는 소집단에 특유한 서열이 사용될 수 있다. 바람직한 특유 서열은 바람직하게는 본원에 기재된 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 길이의 서열이다.

본 발명의 특히 바람직한 양태에서, HoxB13 서열의 3' 미해독 및/또는 비-암호화 영역에 존재하는 서열을 가진 폴리뉴클레오티드가, 본 발명의 수행에서 암 세포 또는 유방암 세포 중의 발현 수준을 검출하는데 사용된다. 이러한 폴리뉴클레오티드는 HoxB13 서열의 암호 영역의 3' 부분에서 발견되는 서열을 임의로 함유할 수 있다. 암호화 영역 및 3' 비-암호화 영역으로부터의 서열의 조합을 함유하는 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는, 이종 서열(들)이 개재되지 않은, 연속적으로 배열된 서열을 가진다.

달리, 본 발명은 HoxB13 서열의 5' 미해독 영역 및/또는 비-암호화 영역에 존재하는 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 사용하여 수행하여, 암 세포 또는 유방암 세포 중의 발현 수준을 검출할 수 있다. 이러한 폴리뉴클레오티드는 암호화 영역의 5' 부분에서 발견되는 서열을 임의로 함유할 수 있다. 암호화 영역 및 5' 비-암호화 영역의 조합을 함유하는 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 이종성 서열(들)이 개재되지 않은, 연속적으로 배열된 서열을 가진다. 본 발명은 또한 HoxB13 서열의 암호화 영역 중에 존재하는 서열을 사용하여 수행할 수 있다.

바람직한 폴리뉴클레오티드는 약 16개 이상, 약 18개 이상, 약 20개 이상, 약 22개 이상, 약 24개 이상, 약 26개 이상, 약 28개 이상, 약 30개 이상, 약 32개 이상, 약 34개 이상, 36개 이상, 약 38개 이상, 약 40개 이상, 약 42개 이상, 약 44개 이상, 또는 약 46개 이상의 연속 뉴클레오티드의 3' 또는 5' 미해독 영역 및/또는 비-암호화 영역으로부터의 서열을 함유한다. 앞의 문장에서 사용된 "약"이란 용어는 언급된 수치로부터 1이 증가하거나 감소하는 것을 말한다. 보다 더욱 바람직한 것은, 적어도 또는 약 50개, 적어도 또는 약 100개, 적어도 또는 약 150개, 적어도 또는 약 200개, 적어도 또는 약 250개, 적어도 또는 약 300개, 적어도 또는 약 350개, 또는 적어도 또는 약 400개의 연속 뉴클레오티드의 서열을 함유하는 뉴클레오티드가다. 앞 문장에서 사용된 "약"이란 용어는 언급된 수치의 10%가 증가하거나 감소하는 것을 말한다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드에서 발견된 HoxB13 암호화 영역의 3' 또는 5' 말단으로부터의 서열은, 암호 영역의 길이에 의해 본래 제한되는 것을 제외하고는, 상기한 것들과 동일한 길이를 가진다. 암호화 영역의 3' 말단은 암호화 영역의 3' 절반 이하의 서열을 포함할 수 있다. 역으로, 암호화 영역의 5' 말단은 암호화 영역의 5' 절반 이하의 서열을 포함할 수 있다. 물론, 상기 서열 또는 암호화 영역 및 이의 부분을 함유하는 폴리뉴클레오티드가 그대로 사용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에서, HoxB13 서열의 5' 및/또는 3' 말단으로부터 뉴클레오티드 결실을 함유하는 폴리뉴클레오티드가 사용될 수 있다. 결실은 바람직하게는, 5' 및/또는 3' 말단으로부터의 1-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-25, 25-30, 30-35, 35-40, 40-45, 45- 50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-100, 100-125, 125-150, 150-175, 또는 175-200 뉴클레오티드이지만, 결실의 정도는 서열의 길이 및 발현 수준의 검출에 폴리뉴클레오티드를 사용할 필요에 의해 당연히 제한될 것이다.

HoxB13 서열의 3'말단으로부터 본 발명의 기타 폴리뉴클레오티드는 프라이머의 폴리뉴클레오티드 및 정량적 PCR을 위한 임의 프로브를 포함한다. 바람직하게, 당해 프라이머 및 프로브는, 폴리아데닐화 시그날 또는 유전자의 폴리아데닐화 부위 또는 발현된 서열로부터 약 350미만, 약 300미만, 약 250미만, 약 200미만, 약 150미만, 약 100미만 또는 약 50미만의 뉴클레오티드 부위가 증폭된 것이다.

본 발명의 실시에 사용되는 기타 폴리뉴클레오티드는 하이브리드화 기술을 사용하여 이의 발현을 감지하기에 충분한 HoxB13 서열과 상동성을 갖는 것을 포함한다. 이러한 폴리뉴클레오티드는 바람직하게 전술한 바와 같이 HOXB13 서열과 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99%의 상동성을 갖는다. 상동성은 전술한 바와 같이 BLAST 알고리즘을 사용하여 측정된다. 본 발명의 실시에 사용되는 기타 폴리뉴클레오티드는, 포름아미드 약 30% 내지 약 50%v/v, 및 하이브리드화를 위한 염 약 0.01M 내지 약 0.15M, 및 약 55 내지 약 65℃이상의 온도의 세척 조건에서 염 약 0.01M 내지 약 0.15M의 엄격한 조건, 또는 이와 동등한 조건하에서 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 하이브리드화되는 정도를 기준으로 기술될 수 있다.

본 발명의 추가 양태에서, 단일 또는 이중 가닥의 사람 HoxB13 서열을 포함하는 단일쇄 핵산 분자의 군집은 당해 군집의 일부분 이상이, 유방암 세포와 같은 암의 RNA로부터 정량적으로 증폭된, 단일 또는 이중 가닥의 핵산으로 하이브리드화될 수 있다. 당해 군집은 암 또는 유방암 세포로부터 분자의 센스 가닥 또는 증폭된 가닥는 군집의 일부분으로 하이브리드화되도록 하는, 사람의 HoxB13 서열의 안티센스 가닥만일 수 있다. 군집은 바람직하게 정상 세포로부터 상보적 HoxB13 서열을 포함하는, 발현된(또는 증폭된) 핵산 분자의 양과 비교해 충분히 과량의 사람 HoxB13 서열의 단일 또는 이중 가닥을 포함한다. 과량인 당해 조건은 암 또는 유방암 세포에서 핵산 발현을 증가시켜 증가분으로서 용이하게 감지할 수 있도록 한다.

또는, 단일 가락 분자의 군집은 단일 또는 이중 가락 모두와 충분히 하이브리드화될 수 있도록, 암 또는 유방암 세포로부터 증폭된, 단일 또는 이중 가닥의 핵산 분자의 양과 동등하거나 더 과량이다. 바람직한 세포는, ER+이거나 타목시펜 또는 유방암에 대한 하나 이상의 기타 "항에스트로겐"제로 치료받은 유방암 환자의 세포이다. 물론, 단일 가락 분자는 전술한 바와 같이 이중 가닥 핵산 분자 또는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 임의 HoxB13 서열의 변성된 형태일 수 있다.

군집은 또한 정상 세포의 핵산 분자의 2배 이상의 수준으로 핵산 분자를 함유하는 HoxB13 서열로 하이브리드화되는 것으로 기술될 수 있다. 상기 기술된 양태에서, 핵산 분자는 이들이 암 또는 유방암 세포의 발현 양을 반영하도록 암 또는 유방암 세포로부터 정량적으로 증폭된 것을 수 있다.

군집은 바람직하게 임의로 마이크로어레이(microarray) 상 임의 위치 형태에서 고체 지지체 상 부동화될 수 있다. 군집의 일부분은 바람직하게 RNA 증폭에 의해 비정상 또는 이상(유방) 세포로부터 정량적으로 증폭된 핵산 분자로 하이브리드화된다. 증폭된 RNA는, 사용된 증폭이 HoxB13 함유 서열에 대해 정량적인 한, 암 또는 유방암 세포로부터 유도된 것일 수 있다.

기타 양태에서, 샘플 암세포로부터 유도된 핵산은 바람직하게 오직 HoxB13 서열만이 증폭되어 세포로부터 발현된 기타 유전자로부터의 오염 백그라운드 시그날을 감소시키도록, 적합한 프라이머의 사용에 의해 증폭될 수 있다. 또는, 기타 유전자의 발현이 또한 분석되거나 매우 적은 세포(또는 1개의 세포)가 사용된 경우, 샘플로부터의 핵산은 부동화된 폴리뉴클레오티드로 하이브리드화되기 전에 전체적으로 증폭될 수 있다. 물론, RNA 또는 이의 상보적 cDNA는 당업자에게 공지된 방법에 의해 증폭없이 직접 표지화 또는 사용될 수 있다.

본원에 기술된 검사 양태는 침해 암을 동정하거나 진단하기 위해 많은 상이한 방법으로 사용될 수 있다. 특정 경우, 이는 이미 일차 스트린으로서 유방 X-선 촬영 또는 신체 검사를 했었을 수 있는 환자의 이차 스트린으로 고려될 수 있다. 일차 스크린이 긍정적인 경우, 후속의 바늘 검사, 관내 세척, 미세바늘 흡인, 또는 기타 유사한 최소한으로 침해적 방법이 검사 양태에서 사용을 위한 샘플로 제공될 수 있다. 본 발명은, 유방 세포 샘플을 제조하기 위한 관내 세척 또는 미세바늘 흡인과 같은 비침해적 프로토콜과 병용시 특히 유용하다.

본 발명은 (유방) 암 결과를 식별하는 데(또는 기술하는 데) 있어, HoxB13 발현 수준의 형태로 더욱 객관적인 기준 세트를 제공한다. 특히 본 발명의 바람직한 양태에서, 당해 검사는, 암이 침해적인 지 여부를 기준으로 한, 양호하거나 나쁜 결과를 식별하는 데 사용된다. 약 10, 약 20, 약 30, 약 40, 약 50, 약 60, 약 70, 약 80, 약 90, 약 100, 또는 약 150개월 후 결과를 식별하는 비교가 수행될 수 있다.

양호하거나 나쁜 생존 결과는 서로 비교해 상대적으로 정의될 수 있으며, "양호한" 결과는 유방암 종양을 제거하는 수술 개입 후 약 60개월 후 50% 초과의 생존율을 의미할 수 있다. "양호한" 결과는 또한 수술 개입 후 약 60개월 후 약 60% 초과, 약 70% 초과, 약 80% 초과 또는 약 90% 초과의 생존율을 의미할 수 있다. "나쁜" 결과는 유방암 종양을 제거하는 수술 개입 후 약 60개월 후 50% 이하의 생존율을 의미할 수 있다. "나쁜" 결과는 또한 수술 개입 후 약 40개월 후 70% 이하의 생존율 또는 약 20개월 후 80% 이하의 생존율일 수 있다.

한 양태에서, 유방암 세포 샘플의 분리 및 분석은 다음과 같이 실시할 수 있다:

(1) 관내 세척 또는 기타 비침해적 또는 최소한으로 침해적인 공정을 샘플을 수득하는 환자에게 실시한다.

(2) 샘플을 제조하고 현미경 슬라이드로 피복시킨다. 관내 세척으로 세포학적으로 관찰될 수 있는 세포 군집이 형성될 수 있음을 주의한다.

(3) 병리학자나 이미지 분석 소프트웨어는 비전형적 세포의 존재를 확인하기 위해 샘플을 스캔한다.

(4) 비전형적 세포가 관찰된 경우, 당해 세포를 채취한다(예: LCM과 같은 현미해부).

(5) RNA를 채취된 세포로부터 추출한다.

(6) RNA를 HoxB13 서열의 발현을 위해 직접 또는 cDNA 또는 이의 증폭형으로 전환 후 검사한다.

본 발명의 용도에서, 의사는 본 발명의 실시를 통해 측정된 진단 결과에 근거하여 유방암 치료를 위한 타목시펜 또는 기타 치료제로의 치료를 처방하거나 중단시킬 수 있다.

상기 논의는 감지할 수 있는 상해가 유방의 세포의 미세바늘 흡인 또는 바늘 생검으로 관찰된 경우 적용할 수 있다. 세포는 이식되고 전술한 바와 같이 병리학자 또는 분석용 세포를 선택하는 자동화된 이미지 시스템에 의해 관찰된다.

본 발명은 또한 냉동된 또는 FFPE(포름말린으로 고정되고, 파라핀에 삽입된) 검체로 저장된 것을 포함하여 고체 조직 생검으로 사용될 수 있다. 또는, 신선하거나 고정된 샘플이 수득되고 사용될 수 있다. 비제한적 예로서, (유방) 암 결과를 측정하기 위해 동정된 하나 이상의 유전자 발현의 측정이 수반되는 가시화를 위해, 고체 생검이 수집되고 제조될 수 있다. 다른 비제한적 예로, 고체 생검은, HoxB13 발현 측정이 수반되는 가시화를 위해 수집되고 제조될 수 있다. 한 바람직한 방법은 HoxB13 발현을 검사하기 위한 프로브를 동정하는 폴리뉴클레오티드 또는 단백질로 동일반응계에서 하이브리드를 사용하는 것이다. 고정 샘플의 비제한적 예는, 포르말린 또는 포름알데히드(FFPE 샘플을 포함)로 고정된 것이나, 면역조직화학(IHC)에서 세포 또는 조직 샘플을 고정하기 위해 사용되는 것과 같은, 임의의 기타 고정제, 부딘, 글루탈데히드, 아세톤, 알코올로 고정된 것을 포함한다. 기타 예는 핵산 및 /또는 단백질과 관련된 세포를 침전시키는 고정물을 포함한다. 본 발명의 특정 적용에서, 샘플은 이에 제한되는 것은 아니지만, 면역조직화학계 검사와 같은 표준 병리 기술을 사용하여 분류되지 않는다.

선택적 방법에서, 고체 조직 생검은 분자 추출 후 HoxB13의 분석을 위해 사용될 수 있다. 이는 종양세포 또는 암성으로 의심되는 세포만을 가시화하고 수집하기 위한 요구를 해소시킬 가능성을 제공한다. 물론, 당해 방법은 양성으로 선택된 세포만이 수집되고 분석용 분자를 추출하는 데 사용되도록 개질될 수 있다. 이는 유전자 발현 분석의 필요조건으로 가시화 및 선택이 필요할 수 있다. FFPE 샘플의 경우, 세포는 전술한 바와 같이 RNA 추출, 증폭 및 감지로 수득될 수 있다.

본 발명에 의해 제공되는 방법은 또한 전체 또는 부분이 자동화될 수 있다.

본 발명의 추가 측면은 임상 작용과 관련된 본 발명의 용도를 제공한다. 특정 양태에서, 전술한 바와 같은 HoxB13 발현의 감지 또는 측정은 환자에게 제공되는, 제공되는 메디칼 케어와 함께 제공되는 진단 서비스를 포함하는, 메디칼 케어의 일부로서 실시될 수 있다. 따라서, 본 발명은 환자의 메디칼 케어 방법을 포함하며, 당해 방법은 전술한 바와 같이 환자로부터 수득된 샘플을 포함하는 세포에서 HoxB13 발현 수준을 감지 또는 측정함을 포함한다. 당해 방법은 추가로 전술한 바와 같은 방식으로 암 페노타입의 존재를 나타내거나 암시하는, 감지/측정의 해석 또는 의미를 포함한다.

표현 정도를 결정 또는 측량하기 전에 다양한 관련 작업을 한다. 몇몇 양태에서, 측량하기 전에 이러한 측량이 필요한 사람을 결정 또는 진단한다. 측량하기 전에 작업에 대한 상환 또는 지불을 요구하는 근거로서 측정 작업을 승인하는 의사, 간호사, 기타 보건 관리자나 전문가, 이들의 지시하에서 일하는 사람, 건강 보험 또는 건강 유지 기구의 직원이 측량이 필요한 것을 결정한다.

측량 전에 또한 실제 측량에 필요한 예비작업을 한다. 비제한적 예로 사람으로부터의 세포 함유 샘플의 실제 채취, 세포 함유 샘플의 수령, 세포 함유 샘플의 분류, 세포 함유 샘플로부터의 세포 분리, 세포 함유 샘플의 세포로부터의 RNA 채취 또는 세포 함유 샘플의 세포로부터의 RNA의 역전사가 포함된다. 샘플은 본 발명의 실시를 위해 본원에 기재된 어떠한 것이라도 가능하다.

추가 양태에서, 본 발명은 환자의 의학적 관리 방법 또는 본 발명의 다른 방법의 수행에 대한 오더(order) 또는 오더의 수령 방법을 제공한다. 오더는 의사, 간호사, 기타 보건 관리자나 이들의 지시하에서 일하는 사람이 내리고 본 발명의 방법을 수행하는 사람들이 그 지시를 직접 또는 간접적으로 받는다. 오더링(ordering)은 커뮤니케이션의 수단으로서 필기, 구두, 전자, 디지털, 아날로그, 전화, 사람, 팩스, 우편 또는 기타 미국 관할내의 방법을 포함한다.

본 발명은 또한 상기한 환자의 의학적 관리 방법 또는 본 발명의 다른 방법과 같은 테스트에 대한 상환 또는 지불의 프로세싱 방법을 제공한다. 상환 또는 지불의 프로세싱 방법은 본 발명의 표현 정도의 검정, 결정 또는 측량 작업 후 1) 지불되었거나 2) 다른 지불자가 지불하였거나 3) 서류 또는 데이터 베이스상에 미지불로 남아 있는 것을 나타내는 표지(indicating)를 포함한다. 데이터 베이스는 본 발명의 범위 내에 포함되는 컴퓨터 데이터 베이스와 같은 전자 형태를 포함하여 어떠한 것이라도 된다. 표지는 서류 또는 데이터 베이스상의 코드(예를 들면, CPT 코드) 형태일 수 있다. "다른 지불자"는 상환 또는 지불이 사전에 요구된 사람이나 실체일 수 있다.

또는, 당해 방법은 환자의 의학적 관리에 대한 상기한 방법의 기술적 또는 실제적 수행, 이러한 방법의 결과의 판단, 또는 본 발명의 다른 방법에 대한 상환 또는 지불 수령을 포함할 수 있다. 물론 본 발명은 또한 상환 또는 지불을 수령하는 사람이나 집단에 대한 지시를 포함하는 양태를 포함한다. 오더링은 상기한 것을 포함하여 임의의 커뮤니케이션 수단일 수 있다. 비제한적 예로서 보험사, 보건 유지 기구, 정부 보건부 또는 환자를 포함하는 실체로부터 수령할 수 있다. 지불은 전액을 또는 나누어서 할 수 있다. 환자의 경우, 공동 지불(co-pay)로서 알려진 부분 지불 형태일 수 있다.

다른 양태에서, 당해 방법은 상기한 환자의 의학적 관리 방법이나 본 발명의 다른 방법의 수행에 대해 보험사, 보건 유지 기구, 정부 보건부 또는 환자에게 상환 또는 지불 요구를 추진함을 포함한다. 이러한 요구는 상기한 것을 포함하여 임의의 커뮤니케이션 수단일 수 있다.

추가의 양태에서, 당해 방법은 상기한 환자의 의학적 관리 방법이나 본 발명의 다른 방법의 수행에 대해 지불 승인 또는 지불 거부의 수령 표지를 포함한다. 이러한 표지는 상환 또는 지불이 요구되는 사람이나 실체가 한다. 비제한적 예로 메디케어(Medicare) 또는 메디칼(Medical)과 같은 보험사, 보건 유지 기구, 정부 보건부가 포함된다. 표지는 상기한 것을 포함하여 임의의 커뮤니케이션 수단일 수 있다.

추가의 양태는 상기한 환자의 의학적 관리 방법이나 본 발명의 다른 방법의 수행에 대해 상환 요구를 전송함을 포함하는 방법이다. 이러한 요구는 상기한 것을 포함하여 임의의 커뮤니케이션 수단일 수 있다. 이러한 요구는 당해 방법이 수행되는 보험사, 보건 유지 기구, 정부 보건부 또는 환자에 대해 이루어진다.

추가의 방법은 상기한 환자의 의학적 관리 방법이나 본 발명의 다른 방법의 수행에 대해 서식으로 또는 데이터 베이스로 상환 또는 지불 필요성의 표지를 포함한다. 또는, 당해 방법은 간단히 방법의 수행을 표지할 수 있다. 데이터 베이스는 본 발명의 범위 내에 포함되는 컴퓨터 데이터 베이스와 같은 전자 형태를 포함하여 어떠한 것이라도 된다. 표지는 서류 또는 데이터 베이스상의 코드 형태일 수 있다.

상기한 환자의 의학적 관리 방법이나 본 발명의 다른 방법에서, 당해 방법은 임의로 보건 관리 기관, 보건 관리자나 전문가, 의사 간호사 또는 이를 위한 개인 작업자에 당해 방법의 결과를 보고함을 포함한다. 보고는 또한 환자에게 직접 또는 간접적으로 이루어질 수 있다. 보고는 상기한 것을 포함하여 임의의 커뮤니케이션 수단일 수 있다.

본 발명의 물질 및 방법은 이상적으로 널리 공지된 방법에 따라 제조되는 키트의 제조에 적합하다. 이에 따라, 본 발명은 HoxB13 서열의 발현을 검출하기 위한 제제를 포함하는 키트를 제공한다(폴리뉴클레오티드 및/또는 제한되지 않은 예로서 본원에 기재된 항체와 같은). 본 발명의 방법의 사용과 관련된 동일한 명세 또는 표지 또는 지시를 갖는 제제를 임의로 포함하는 이러한 키트가 제공된다. 이러한 키트는 용기를 포함할 수 있고, 하나 이상의 다양한 시약(통상적으로 농축된 형태), 예를 들면, 미리-가공된 마이크로어레이, 완충액, 적합한 뉴클레오티드 트리포스페이트(예를 들면, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP; 또는 rATP, rCTP, rGTP 및 UTP), 역 전사효소, DNA 폴리머라제, RNA 폴리머라제, 및 하나 이상의 본 발명의 1차 착체(예를 들면, 적합한 길이 폴리(T) 또는 RNA 폴리머라제와 반응성인 촉진제에 연결된 랜덤 프라이머)를 갖는 각각을 당해 방법에 사용한다.

이러한 세트의 지시는 또한 통상적으로 포함될 수 있다. 현재 일반적으로 본 발명에 기재한 바와 같은 동일한 내용을 예시로 제공하는 다음 실시예를 참조하여 보다 용이하게 이해할 수 있지만, 이는 본 발명을 설명하려는 것이며 제한하려는 의도가 아니다.

실시예 1 : 세포 배양 및 세포 주 작제

MCF-10A 세포[ATCC; 참조: Soule et al. "Isolation and characterization of a spontaneously immortalized human breast epithelial cell line, MCF-10." Cancer Res 50:6075-86 (1990)]를 성장 매질에 5% 말 혈청(Invitrogen), 20ng/ml EGF(Peprotech), lOμg/ml 인슐린 (Sigma), 100ng/ml 콜레라 톡신, 0.5μg/ml 하이드로코르티손, 50U/ml 페니실린 및 50μg/ml 스트렙토마이신을 갖는 DMEM/F12(Invitrogen)에 문헌에 기재된 바와 같이 유지하였다[참조: Debnath et al. "Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three- dimensional basement membrane cultures." Methods 30:256-68 (2003)]. 검정 매질(AM)은 말 혈청 5% 대신에 2%를 사용하는 것을 제외하고는 성장 매질과 동일하다.

pDNR 플라스미드 중 HOXB 13에 대한 사람 cDNA는 일반적으로 Joshua LaBaer(Harvard Medical School)에 의해 제공된다. HOXB 13은 레트로바이러스 발현 벡터 pBabe-puro의 SnaBl 부위로 서브클로닝되고[참조: Morgenstern et al. "Advanced mammalian gene transfer: high titre retroviral vectors with multiple drug selection markers and a complementary helper-free packaging cell line." Nucleic Acids Res 18:3587-96 (1990)], 적합한 배위를 엄격한 맵핑으로 결정하였다. Vesicular Stomatitis Virus(VSV) 외피를 갖는 모사가 불가능한 바이러스를 문헌에 기재된 VSV-GPG 패키징 세포로부터 재생하고[참조: Ory et al. "A stable human-derived packaging cell line for production of high titer retro virus/vesicular stomatitis virus G pseudotypes." Proc Natl Acad ScL USA 93:11400-6 (1996)], MCF-10A 세포의 안정한 풀을 문헌에 기재된 바와 같이 분류하기 위해 2 μg/ml 푸로마이신을 사용하여 레트로바이러스 감염으로 생성하였다[참조: Debnath et al.].

실시예 2: 트랜스웰 이동 및 침습 검정

시험관내 이동 및 침습 검정을 8마이크론 공극(BD BioCoat)을 포함하는 PET(polyethylene terephthalate) 막을 갖는 24 웰 개질된 보이덴 챔버 트랜스웰을 사용하여 수행하였다. 피복되지 않는 막을 이동 검정을 위해 사용하고, 마트리겔(Engelbroth-Holm-Swarm(EHS) 육종으로부터 유도된 세포외 매트릭스 성분의 착체 혼합물) 피복된 막을 침습을 위해 사용하였다[참조: Repesh et al. "A new in vitro assay for quantitating tumor cell invasion." Invasion Metastasis 9:192-208 (1989)].

레트로바이러스 작제로 MCF-10A 세포 감염된 안정한 풀을 검정일까지 성장 매질에 유지시켰다. 검정 매질 100μl 중 5 X 10⁴ 세포를 상부 챔버에 시딩하고, 20ng/ml EGF를 포함하거나 포함하지 않는 500μL 검정 매질을 하부 챔버에 가하였다. 세포를 37℃에서 24시간 동안 배양하고, 70% 에탄올에 20분 동안 고정시키고, PBS로 세척하고, DAPI(500ng/ml)로 오염시켰다. 상부표면에 잔류하는 세포를 기계적으로 면봉으로 제거하였다. 하부에 잔류하는 세포를 계수하였다(트랜스웰당 2Ox배 확대 5개 영역). 트랜스웰을 3번 플레이팅하고, 결과를 평균하였다.

마트리겔 피복된 개질된 보이덴 챔버를 통한 침습을 문헌에 기재된 바와 같이 검정하였다[참조: Albini et al. "A rapid in vitro assay for quantitating the invasive potential of tumor cells." Cancer Res 47:3239-45 (1987) and Repesh et al.].

실시예 3: 결과

HoxB13은 유방 상피 세포 이동 및 침습을 자극한다. 도 1에서 볼 수 있는 바와 같이, 이전 공지된 코호트[n=45, 참조: Ma et al. "Gene expression profiles of human breast cancer progression." Proc Natl Acad Sci, USA 100:5974-9 (2003)]로부터 LCM-생성된 정상 및 악성 유방 상피 세포의 RT-QPCR 분석은 나타내었다. 정상 유방 상피 세포와 비교하여, HOXB 13의 평균적인 발현 수준은 유관상피내암(ductal carcinoma in situ: DCIS, P=O.002) 및 침윤성 유관암(invasive ductal carcinoma; IDC, P=O.006) 둘 다에서 상당히 높은 것으로 나타났다. 환자-상대 정상인과 비교하여, 56% DCIS 또는 IDC 경우는 HOXB 13이 2-배 초과로 과발현되었다.

도 2는 HOXB 13의 종양 세포-특이 발현의 동일계내 RNA 하이드브리화 증거를 나타낸다. 흥미롭게도, 정상 유방 표본의 아집합은 말단 관 소염 단위에서 HOXB 13의 발현을 나타내고, 정상 유방 생리학에서 역할을 할 수 있는 가능성을 증가시켰다.

HOXB 13의 잠재적 생물학적 작용은 MCF-10A 세포에서 CMV-구동된 작제의 발 현으로 연구된다. MCFlOA 중 HOXB13의 딴곳 발현은 RT-QPCR에 의해 확인되었다(도 3, 삽입됨). HOXB 13을 발현하는 세포는 상피-타입 이음부(데이타에는 나타내지 않음)에서 감소되는 것을 특징으로 하는 고유한 형태학적 변화를 나타낸다. 조절-감염됨 세포와 비교하여, HOXB 13을 발현하는 MCFlOA 세포는 EGF의 존재하에 트랜스-웰 이동 검정에서 세포 이동성이 5-배 증가된다(도 3). HOXB 13을 발현하는 세포는 또한 외인 공급된 EGF의 부재하에 이동성이 증가됨을 나타낸다.

생체내 전이 잠재력과 연관된 잘-발달된 검정인 마트리겔(Matrigel) 피복된 개질된 보이덴(Boyden) 챔버를 통한 침습은 또한 EGF의 존재하에 HOXB 13 발현에서 5-배 증진된다(도 4). 이론에 결부시키지 않고, 이러한 관찰은 HOXB 13이 시험관내 세포 이동성 및 침습을 자극하는 EGF-의존 신호화로 상승 작용하는 경로를 조절할 수 있다는 것을 제시한다.

도 5는 HOXB13을 전위적으로 발현하는 MCFlOA 세포를 갖는 MCFlOA 세포의 2D 형태를 나타낸다.

도 6은, MCFlOA 세포에서 전위적 HoxB13 발현이 EHS (Engelbroth-Holm-Swarm) 육종으로부터의 세포외 매트릭스 성분을 통해 EGF-자극된 이동을 향상시킨다는 것을 나타낸다. 삽입물은 도 3에 기재된 바와 같다. HOXB 13을 발현하는 세포의 이동은 콜라겐 또는 EGF의 존재하에 추가로 증가된다.

도 7은, MCFlOA 세포에서 전위적 HoxB13 발현이 EHS 기질을 통해 EGF-자극된 침습을 향상시킨다는 것을 나타낸다.

도 8은 AN10 세포에서 HoxB13 발현이 합성적 다이머라이저 (AP1510)의 존재 및 부재 하에 이동을 향상시킨다는 것을 나타낸다. AM은 검정 배지를 나타내며, coll은 콜라겐을 말한다.

특허, 특허출원 및 특허공보를 포함하는 본원에 기재된 모든 참조는 미리 명시하는 것에 상관없이 이에 참조로서 전문이 본원에 혼입된다. 그러나, 본원 문서의 인용은 모든 문헌을 적합한 선행 기술로 허가하는 것을 의도하는 것은 아니다. 문헌의 내용에 대한 날짜 또는 교시에 관한 모든 진술은 출원인에게 허용되는 정보를 기준으로 하고, 문헌의 날짜 또는 내용의 정확함에 대해 허용되지는 않았다.

본 발명에서 충분히 기술한 바와 같이, 동일한 내용이 동등한 파라미터, 농도 및 상태의 다양한 범위내에서 본 발명의 정신 및 범위를 벗어나지 않고 과도한 실험 없이 수행할 수 있다는 것은 당해 기술분야의 숙련가들에게 명백하다.

본 발명이 이의 특정 양태와 관련하여 기재되어 있지만, 추가로의 변형이 가능한 것으로 이해된다. 이 출원은 일반적으로 본 발명이 포함되는 기술내에 공지되거나 통상적인 수행내에 포함되고, 상기된 주요한 특징에 적용될 수 있는 본 발명의 원리를 후속하고, 본 명세로부터 이러한 변형을 포함하는 본 발명의 변형, 용도 또는 개조를 포함하는 것을 의도한다.

Claims (20)

1. 하나 이상의 샘플 세포 내에서 HoxB13 유전자의 발현 수준을 측정함을 포함하며, 이때 상대적으로 증가된 발현 수준이 당해 하나 이상의 샘플 세포 내에서의 증가된 전이 잠재력을 나타내는 것인, 하나 이상의 샘플 세포의 다른 조직으로의 전이 잠재력을 확인하거나 분류하는 방법.
2. 하나 이상의 샘플 세포 내에서 HoxB13 유전자의 발현 수준을 측정함을 포함하며, 이때 상대적으로 증가된 발현 수준이 당해 하나 이상의 샘플 세포 내에서의 증가된 침습 잠재력을 나타내는 것인, 하나 이상의 샘플 세포의 다른 조직으로의 침습 잠재력을 확인하거나 분류하는 방법.
3. 제1항에 있어서, 하나 이상의 샘플 세포가 피험체 또는 환자의 원발암, 임의로 에스트로겐 수용체 양성 암의 세포인 방법.
4. 제3항에 있어서, 암이 유방 선암종, 자궁경부 선암종, 식도 선암종, 담낭 선암종, 폐 선암종, 췌장 선암종, 소장-대장 선암종, 위장 선암종, 성상세포종, 피부의 기저세포 암종, 간내 담관암종, 난소의 투명세포선암종, 미만성 대세포 B 림프종, 고환 태아암종, 자궁 내막양 암종, 유잉 육종(Ewings Sarcoma), 갑상선 소포암종, 위장관 간질 종양, 난소의 배아 세포종, 고환의 배아 세포종, 다형성 교모세포 종, 간의 간세포 암종, 호지킨 림프종, 폐의 대세포 암종, 평활근육종, 지방육종, 유방의 소엽암종, 악성 섬유성조직구종, 갑상선 수질성 암종, 흑색종, 수막종, 폐의 중피종, 난소의 점액성 선암종, 근섬유육종, 장의 신경내분비 종양, 핍지교종, 골육종, 갑상선의 유두상 암종, 갈색세포종, 신장의 신세포암종, 횡문근육종, 고환의 정상피종, 난소의 장액성 선암종, 폐의 소세포 암종, 자궁경부의 편평세포 암종, 식도의 편평세포 암종, 후두의 편평세포 암종, 폐의 편평세포 암종, 피부의 편평세포 암종, 활막육종, T-세포 림프종 및 방광의 이행세포 암종으로부터 선택되는 방법.
5. 제4항에 있어서, 암이 부신, 방광, 뼈, 뇌, 유방, 자궁경부, 자궁내막, 식도, 담낭, 신장, 후두, 간, 폐, 림프절, 난소, 췌장, 전립선, 피부, 연조직, 소장/대장, 위장, 고환, 갑상선 및 자궁으로부터 선택된 조직의 암인 방법.
6. 제1항에 있어서, 피험체의 결절 상태를 측정함을 추가로 포함하며, 이때 림프절에서의 암의 부재와 조합된 HoxB13의 정상 수준 이상의 발현이 전이의 증가된 잠재력을 나타내는데 사용되는 방법.
7. 제1항에 있어서, 하나 이상의 세포가 피험체로부터 수득된 세포의 생물학적 샘플내에 존재하는 방법.
8. 제7항에 있어서, 샘플이 신선한 샘플, 동결 샘플 또는 고정된 샘플인 방법.
9. 제1항에 있어서, 측정이 HoxB13 mRNA 발현수준, HoxB13 DNA의 탈메틸화 또는 HoxB13 단백질 발현 수준을 검정함을 포함하는 방법.
10. 제9항에 있어서, 측정이 역전사효소-PCR 및 실시간 PCR을 포함한 정량적 PCR을 사용함으로써 mRNA 발현을 검정함을 포함하는 방법.
11. 제9항에 있어서, 측정이 마이크로어레이(microarray)를 사용함으로써 mRNA 발현을 검정함을 포함하는 방법.
12. 제1항에 있어서, 측정이 발현된 HoxB13 서열의 단편 또는 에피토프를 검출함으로써 단백질 발현을 검정함을 포함하는 방법.
13. 제1항에 있어서, 정상 수준 또는 정상 수준 이하의 발현이 전이의 증가된 잠재력의 부재 또는 감소된 잠재력을 나타내는 것인 방법.
14. 피험체로부터 수득한 생물학적 샘플의 하나 이상의 세포에서 HoxB13 유전자의 발현 수준을 측정함을 포함하며,

    이때 정상 수준 이상의 발현이 당해 피험체의 암 전이의 증가된 잠재력, 암 재발의 증가된 가능성 또는 감소된 기대 수명을 나타내고 HoxB13의 정상 수준 또는 정상 수준 이하의 발현이 암전이의 증가된 잠재력 부재, 암 재발의 증가된 가능성 부재 또는 감소된 기대 수명의 부재를 나타내는 것인, 피험체의 예후 또는 질환의 결과를 예측하는 방법.
15. 제14항에 있어서, 암 재발이 국소성 재발, 지엽적 재발, 원위 재발 또는 반대측(contralateral) 재발 중에서 선택되는 방법.
16. 제14항에 있어서, 샘플이 전암성(pre-cancerous) 샘플 또는 생검, 또는 암 진단된 샘플 또는 생검인 방법.
17. 제14항의 방법에 의해 피험체의 예후 또는 결과를 결정하고, 당해 예후 또는 결과에 근거하여 피험체의 치료를 결정함을 포함하는, 피험체의 치료를 결정하는 방법.
18. 제14항에 있어서, 암 재발이 국소성 재발, 지엽적 재발, 원위 재발 또는 반대측 재발 중에서 선택되는 방법.
19. 제14항에 있어서, 하나 이상의 세포가 암, 임의로 원발성 암 또는 에스트로겐 수용체 양성 암의 세포인 방법.
20. 제2항에 있어서, 세포가 유방 세포, 임의로 ADH 또는 DCIS 세포인 방법.

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