MXPA06007848A

MXPA06007848A - Conjugados de antagonistas del receptor de hormona del crecimiento humana modificados quimicamente.

Info

Publication number: MXPA06007848A
Application number: MXPA06007848A
Authority: MX
Inventors: Thomas J Girard
Original assignee: Pharmacia Corp
Priority date: 2004-02-09
Filing date: 2005-01-31
Publication date: 2006-09-04
Also published as: US20090203589A1; BRPI0507436A; EP1715895A2; WO2005075021A2; JP2007522198A; CA2553899A1; WO2005075021A3

Abstract

La presente invencion proporciona antagonistas del receptor de la hormona del crecimiento humana (hGH) modificados quimicamente preparados uniendo un unico resto de polietilenglicol al extremo N; la proteina modificada quimicamente de acuerdo con la presente invencion tiene una menor heterogenicidad de PEGilacion y tambien pueden tener una afinidad de union mayor.

Description

For two-letter codes and other abbreviations, referto the "Guidance Notes on Codes andAbbreviations" appearing at the beginning ofeach regular issue ofthe PCT Gazjette.

CONJUGADOS DE ANTAGONISTAS DEL RECEPTOR DE HORMONA DEL CRECIMIENTO HUMANA MODIFICADOS QUÍMICAMENTE CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a una modificación química de un antagonista del receptor de la hormona del crecimiento humana por la que es posible cambiar las propiedades químicas y/o fisiológicas del antagonista del receptor de la hormona del crecimiento humana. El antagonista del receptor de la hormona del crecimiento humana modificado tiene una heterogeneicidad de PEGilación menor y también puede tener un tiempo de permanencia en plasma menor, una velocidad de eliminación menor, una estabilidad mejorada, una antigenicidad menor, una afinidad de unión mayor, una potencia mayor o una combinación de los mismos. La presente invención también se refiere a procesos para la generación y modificación de un antagonista del receptor de la hormona del crecimiento. Además, la presente invención se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden el antagonista del receptor de la hormona del crecimiento modificado. Una modalidad adicional es el uso del antagonista del receptor de la hormona del crecimiento modificado para el tratamiento de trastornos del crecimiento y desarrollo.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La hormona del crecimiento humana (hGH) es una proteína que comprende una sola cadena de 191 aminoácidos entrecruzados por dos puentes disulfuro y la forma monomérica tiene un peso molecular de 22 kDa.

Anteriormente se ha demostrado que puede . usarse la presentación en macrófagos monovalentes (Bass y cois., Proteins, 8: 309-314

[1990]) para mejorar la afinidad del Sitio 1 en hGH por el hGHbp. Lowman y cois., Biochemistry, 30: 10832- 10838 (1991). Se produjeron mejoras modestas de la afinidad de unión (de 3 a 8 veces mas fuerte que hGH natural) seleccionando tres genotecas independientes cada una mutada en cuatro codones diferentes del Sitio 1. Una hGH mutante que mejoró ligeramente la afinidad de unión por el Sitio 1 y bloqueó su capacidad de unión al Sitio 2 era mejor antagonista del receptor de hGH que el mutante del Sitip 2 solo. Fuh y cois., Science, 256: 1677-1680 (1992). Se ha descrito que los residuos de lisina de hGH y bGH están implicados en la interacción de hGH y bGH con los receptores somatotrópicos, con la relación entre estructura y función que ¡mplica en particular a los residuos de lisina o arginina de las posiciones 41, 64, 70, y 115. Martal y cois., FEBS Lett., 180: 295-299 (1985). Los residuos de lisina fueron modificados químicamente mediante metilación, etilación, guanidinación y acetimidinación, produciendo una actividad reducida en un ensayo de radiorreceptores. Se obtuvieron mejoras adicionales en la afinidad del Sitio 1 mutando más residuos por genoteca obteniendo un antagonista incluso mejor que puede tener utilidad en el tratamiento de afecciones de exceso de GH tales como la acromegalia. Modificaciones del Sitio II pueden generar antagonistas, sin embargo, estas moléculas son de utilidad limitada debido a sus cortas semividas en circulación. Generalmente se observa que proteínas fisiológicamente activas administradas a un cuerpo pueden mostrar su actividad farmacológica sólo durante un corto periodo de tiempo debido a su alta velocidad de eliminación del cuerpo. Además, la hidrofobicidad relativa de estas proteínas puede limitar su estabilidad y/o solubilidad. Con el fin de reducir la velocidad de eliminación, mejorar la estabilidad o suprimir la antigenicidad de proteínas terapéuticas, se han propuesto algunos métodos en los que las proteínas se modifican químicamente con polímeros solubles en agua. Una modificación química de este tipo puede bloquear eficazmente una enzima proteolítica para que no entre en contacto físico con el propio esqueleto de la proteína, previniendo de esta manera la degradación. La unión química de ciertos polímeros solubles en agua puede reducir eficazmente la eliminación renal debido a un mayor volumen hidrodinámico de la molécula. Ventajas adicionales incluyen, en ciertas circunstancias, aumentar la estabilidad y el tiempo en circulación de la proteína terapéutica, aumentar la solubilidad y reducir la inmunogenicidad. El poli(óxido de alquileno), notablemente el poli(etilenglicol) (PEG), es uno de tales restos químicos que se ha usado en la preparación de productos proteínicos terapéuticos (significando el verbo "pegilar" unir al menos una molécula de PEG). Se ha demostrado que la unión de poli(etilenglicol) protege contra la proteólisis, Sada, y cois., J. Fermentation Bioengineering 71: 137- 139 (1991), y se dispone de métodos para unir ciertos restos de poli(etilenglicol). Véase la patente de Estados Unidos N° 4.179.337, Davis y cois., "Non-lmmunogenic Polypeptides" (Polipéptidos no ¡nmunógenos), expedida el 18 de diciembre de 1979; y la patente de Estados Unidos N° 4.002.531, Royer, "Modifying Enzymes with Polyethylene Glycol and Product Produced Thereby" (Modificación de enzimas con polietilenglicol y producto producido por esa modificación), expedida el 11 de enero de 1977. Como revisión, véase Abuchowski y cois., en Enzvmes as Drugs. (J. S. Holcerberg y J. Roberts, editores, páginas 367-383 (1981)). Se han usado otros polímeros solubles en agua, tales como copolímeros de etilenglicol/propilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano, poli(alcohol vinílico), poli(vinilpirrolidona), poli(-1,3-dioxolano), poli(-1,3,6-trioxano), copolímero de etileno/anhídrido maleico o poli-aminoácidos (homopolímeros o copolímeros aleatorios). Se han descrito varios ejemplos de proteínas terapéuticas pegiladas. ADAGEN®, una formulación pegilada de adenosina desaminasa, está aprobado para el tratamiento de la enfermedad de inmunodeficiencia combinada grave. ONCASPAR®, una L-asparraginasa pegilada, ha sido aprobado para tratar pacientes de ALL hipersensibles. La superóxido dismutasa pegilada ha estado en ensayos clínicos para el tratamiento de lesiones craneales. El a-interferón pegilado (documentos U.S. 5.738.846, 5.382.657) se ha aprobado para el tratamiento de la hepatitis; se ha informado que la glucocerebrosidasa pegilada y la hemoglobina pegilada han estado en ensayos preclínicos. Otro ejemplo es la IL-6 pegilada, documento EF 0 442 724, titulado, "Modified hlL-6" ("hlL-6 modificada") que describe moléculas de poli(etilenglicol) añadidas a la IL-6. Otra proteína terapéutica específica que se ha modificado químicamente es el factor estimulador de colonias de granulocitos (G-CSF). El G-CSF induce la rápida proliferación y liberación de granulocitos neutrófilos en la corriente sanguínea, y por lo tanto proporciona un efecto terapéutico en la lucha contra las infecciones. La publicación de patente europea EP 0401 384, publicada el 12 de diciembre de 1990, titulada "Chemically Modified Granulocyte Colony Stimulating Factor" ("Factor estimulador de colonias de granulocitos modificado químicamente") describe materiales y métodos para preparar G-CSF al que están unidas moléculas de poli(etilenglicol). También se presentan G-CSF modificado y análogos del mismo en el documento EP 0 473 268, publicado el 4 de marzo de 1992, titulado "Continuous Reléase Pharmaceutical Compositions Comprising a Polypeptide Covalently Conjugated To A Water Soluble Polymer" ("Composiciones farmacéuticas de liberación continua que comprenden un polipéptido conjugado covalentemente a un polímero soluble en agua") que expone el uso de diversos G-CSF y derivados conjugados covalentemente a un polímero soluble en agua en forma de partículas, tal como poli(etiienglicol). En el documento EP 0 335 423 publicado el 4 de octubre de 1989, se presenta un polipéptido modificado que tiene actividad de factor estimulador de colonias de granulocitos humano. En el documento U.S. 5.824.784 se proporcionan métodos para modificar proteínas o análogos de las mismas en el extremo N, y las composiciones resultantes, incluyendo nuevas composiciones de G-CSF modificado químicamente en el extremo N. El documento U.S. 5.824.778 describe G-CSF modificado químicamente. Para el poli(etilenglicol), se han usado diversos medios para unir las moléculas de poli(etilenglicol) a la proteína. Generalmente, las moléculas de poli(etilenglicol) se conectan a la proteína a través de un grupo reactivo que se encuentra en la proteína. Los grupos amino, tales como los presentes en residuos de lisina o en el extremo N, son convenientes para tal unión. Por ejemplo, Royer (patente de Estados Unidos N° 4.002.531 , anteriormente) indica que se usó alquilación reductora para unir moléculas de poli(etilenglicol) a una enzima. El documento EP 0 539 167, publicado el 28 de abril de 1993, Wright, "Peg Imidates y Protein Derivatives Thereof (Peg-imidatos y sus derivados proteínicos) refiere que péptidos y compuestos orgánicos con grupo(s) amino libre(s) se modifican con un derivado imidato derivado de PEG o polímeros orgánicos solubles eh agua relacionados. Chamow y cois., Bioconjugate Chem. 5: 133-140 (1994) presenta la modificación de inmunoadhesina de CD4 con monometoxipoli(etilenglicol) aldehido a través de alquilación reductora. Los autores indican que 50% de la Ig de CD4 se modificó con MePEG en condiciones que permitían un control sobre el grado de pegilación. Id. en la página 137. Los autores también informan que la capacidad de unión in vitro de la Ig de CD4 modificada (a la proteína gp 120) se reducía en una proporción correlacionada con el grado de MePEGilación Ibid. La patente de Estados Unidos N° 4.904.584, Shaw, expedida el 27 de febrero de 1990, se refiere a la modificación de un número de residuos de lisina en proteínas para la unión de moléculas de poli(etilenglicol) a través de grupos amina reactivos. Muchos métodos para unir un polímero a una proteína implican el uso de un resto que actúa como grupo de unión. Tales restos, sin embargo, pueden ser antigénicos. Hay disponible un método con cloruro de tresilo que no implica ningún grupo de enlace, pero este método puede ser difícil de usar para producir productos terapéuticos ya que el uso de cloruro de tresilo puede producir productos secundarios tóxicos. Véase Francis y cois., En: Stabilitv of protein pharmaceuticals: in vivo pathwavs of degradation and strategies for protein stabilization (Estabilidad de fármacos proteínicos: rutas de degradación in vivo y estrategias para la estabilización de proteínas) (Editores Ahern, T. y Manning, M. C.) Plenum, Nueva York, 1991) También, Delgado y cois., "Coupling of PEG to Protein By Activation With Tresyl Chioride, Applications In Immunoaffinity Cell Preparation" (Acoplamiento de PEG a proteínas mediante activación con cloruro de tresilo, aplicaciones en la preparación celular para inmunoafinidad), en Separations Using Aqueous Phase Systems. Applications In Cell Biology and Biotechnology (Separaciones usando sistemas en fase acuosa, aplicaciones en biología celular y biotecnología), Fisher y cois., editores Plenum Press, Nueva York, N.Y., 1989 páginas 211-213. Véase también, Rose y cois., Bioconjugate Chemistry 2: 154-159 (1991) que refiere la unión selectiva del grupo de unión carbohidrazida al grupo carboxilo del extremo C de un sustrato proteínico (insulina). El documento WO 97/11178 se refiere a antagonistas del receptor de hGH que han sido modificados con PEG en múltiples sitios (2-7) a grupos amino primarios. Uno de tales antagonistas del receptor de hGH, Pegvisomant® contiene de media 5 uniones de restos PEG de 5K unidos al antagonista del receptor de la hormona del crecimiento humana B2036 (B2036 es GH que está modificada en ocho residuos para potenciar la unión al sitio I y que está modificada en el residuo 120 a lisina) tal como describen Olson y cois. Poly(ethylene glycol) Chemistry and Biological Applications (Química del poli(etilenglicol) y aplicaciones biológicas), editores, Harris y Zalipsky, 1997. Sin embargo, todavía es deseable tener un conjugado de antagonista del receptor de la hormona del crecimiento humana mono-PEGilado con menor heterogenicidad de PEGilación y que pueda también tener mayor afinidad por el receptor. La presente invención proporciona conjugados de antagonista del receptor de la hormona del crecimiento humana y PEG que tienen una única modificación química en el extremo N que también puede tener una afinidad mayor por su receptor y que también puede tener una velocidad de eliminación menor, un tiempo de permanencia en plasma mayor, una solubilidad mejorada, una estabilidad mayor, una antigenicidad menor, una potencia mayor o sus combinaciones.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a antagonistas del receptor de la hormona del crecimiento humana químicamente modificados que tienen una heterogenicidad de PEGilación menor que también pueden tener una afinidad de unión mayor, y que pueden tener propiedades químicas o fisiológicas mejoradas que se seleccionan, pero sin limitación, de velocidad de eliminación menor, un tiempo de permanencia en plasma mayor, una estabilidad mayor, solubilidad mejorada, y antigenicidad menor. Así, tal como se describe en más detalle más adelante, la presente invención tiene un número de aspectos que se refieren a la modificación química de antagonistas del receptor de la hormona del crecimiento humana así como a las modificaciones específicas usando una variedad de restos de butiraldehído poli(etilenglicol). La presente invención también se refiere a métodos de producir los antagonistas del receptor de la hormona del crecimiento humana químicamente modificados. La presente invención también se refiere a composiciones que comprenden los antagonistas del receptor de la hormona del crecimiento humana químicamente modificados.

Los antagonistas del receptor de la hormona del crecimiento humana químicamente modificados de la presente invención, son útiles en el tratamiento de afecciones en las que es deseable la inhibición de la acción de la GH. Las afecciones en las que una reducción de los niveles de GH o de un mediador de la acción de GH en circulación, tal como IGF-I, proporciona un beneficio terapéutico son particularmente susceptibles de tratamiento con antagonistas del receptor de la hormona del crecimiento humana químicamente modificados. Tales afecciones incluyen afecciones de exceso de GH tales como, por ejemplo, gigantismo y acromegalia. El gigantismo se produce por un exceso de GH antes de la pubertad, cuando el crecimiento óseo todavía es posible. La acromegalia se produce por un exceso de GH después de la pubertad, cuando los huesos largos se han unido. La acromegalia se caracteriza por excrecencias óseas e hinchazón de los tejidos blandos así como hipertrofia de los órganos internos, en especial el corazón. La acromegalia típicamente está provocada por un tumor en la pituitaria que segrega GH. Los indicadores de la enfermedad son niveles altos de GH y IGF-I en circulación. Actualmente se cree que los antagonistas del receptor de la hormona del crecimiento humana químicamente modificados de la presente invención ofrecen un beneficio terapéutico significativo al inhibir la acción de GH. Los antagonistas del receptor de la hormona del crecimiento humana químicamente modificados también son útiles para tratar las otras afecciones en las que la inhibición de la acción de GH proporciona un beneficio terapéutico. Ejemplos incluyen diabetes y sus complicaciones, tales como por ejemplo retinopatía diabética y nefropatía diabética. La retinopatía diabética se caracteriza por proliferación de las células que forman los vasos sanguíneos retiñíanos, crecimiento de nuevos vasos sobre la retina (neovascularización), desarrollo de microaneurismas, y filtración de fluido al tejido retiniano que lo rodea. Los indicadores tempranos de la nefropatía diabética son hipertrofia renal e hiperfiltración. Al ir progresando la enfermedad, se observa engrosamiento difuso de las células mesangiales (que dan soporte al aparato de filtración del riñon), acompañado de un aumento absoluto del número de células mesangiales. También se cree que las enfermedades oculares vasculares que, como la retinopatía diabética, implican neovascularización proliferativa pueden ser susceptibles de tratamiento con un antagonista del receptor de la hormona del crecimiento humana. Ejemplos incluyen retinopatía en prematuros, retinopatía asociada a la anemia falciforme, y degeneración macular asociada a la edad, que es la causa más común de pérdida de visión en las personas mayores de 55. Otras afecciones en las que actualmente se cree que la reducción de los niveles de GH proporciona un beneficio terapéutico incluyen neoplasias malignas que responden a GH, o un mediador de la acción de GH (tal como IGF-1), (en lo sucesivo "neoplasias malignas que responden a GH"). Ejemplos de neoplasias malignas que responden a GH incluyen tumor de Wilm, diversos sarcomas (por ejemplo, sarcoma osteógeno), cáncer de mama, colon, próstata y tiroides. Los antagonistas del receptor de la hormona del crecimiento humana químicamente modificados de la presente invención inhiben el crecimiento de células que expresan receptores a los que se unen las variantes. Una amplia variedad de tejidos expresan tales receptores. Por ejemplo, ARNm del receptor de GH es expresado en líneas celulares de placenta, timo, cerebro, glándula salivar, próstata, médula ósea, músculo esquelético, tráquea, médula espinal, retina, nodulo linfático normales y en linfoma de Burkitt, carcinoma colorrectal, carcinoma de pulmón, leucemia linfoblástica, y melanoma. Así, actualmente se cree que los antagonistas del receptor de la hormona del crecimiento humana químicamente modificados de la presente invención son generalmente útiles en el tratamiento de los cánceres que expresan receptores a los que se unen las variantes.

DESCRIPCIÓN BREVE DE LOS DIBUJOS La figura 1 es la secuencia de aminoácidos (SEC. ID. N.°: 1) del antagonista del receptor de hGH B2036. La figura 2 es un cromatograma de exclusión por tamaño del conjugado de ALD de 40k ramificado y B2036. El panel a es el cromatograma de la mezcla de reacción. El pico 2 con un tiempo de retención de 19,883 es el producto di-PEGilado. El pico 4 con un tiempo de retención de 33,883 es la proteína B2036 sin reaccionar. El panel b es el cromatograma del producto mono-PEGilado purificado que muestra un pico único con un tiempo de retención de 22,700. La figura 3 muestra los niveles de IGF-1 en macacos de Java tras una única dosis subcutánea (0,3 mpk o 1,0 mpk) de conjugado de ALD de 30K y B2036 monopegilado en el extremo N.

DESCRIPCIÓN DETALLADA Los antagonistas del receptor de la hormona del crecimiento humana son miembros de una familia de proteínas recombinantes, que se describen en los documentos US 5.849.535, US 5.534.617, US 6.143.523, US 6.022.711, US 5.834.598, y 5.688.666, que también describen su producción recombinante y métodos de uso. En la presente invención, puede usarse cualquier antagonista purificado y aislado del receptor de la hormona del crecimiento humana, que es producido por células hospedadoras tales como E. coli y células animales transformadas o transfectadas usando técnicas genéticas recombinantes.. Antagonistas adicionales del receptor de la hormona del crecimiento humana se describen en el documento US 4.871.835. Entre ellos, son particularmente preferidos los antagonistas del receptor de la hormona del crecimiento humana, que son producidos por las E. coli transformadas. Tales antagonistas del receptor de la hormona del crecimiento humana pueden obtenerse en grandes cantidades y con pureza y homogeneidad elevadas. Por ejemplo, los anteriores antagonistas del receptor de la hormona del crecimiento humana pueden prepararse de acuerdo con un método que se describe en los documentos US 4.342.832, 4.601.980; US 4.898.830; US 5.424.199; US 5.795.745, 5.849.535, US 5.534.617, US 6.143.523, US 6.022.711, US 5.834.598, y 5.688.666. La frase "sustancialmente tiene la siguiente secuencia de aminoácidos" quiere decir que la secuencia de aminoácidos anterior puede incluir uno o más cambios de aminoácidos (deleción, adición, inserción o sustitución) en tanto en cuanto tales cambios no provoquen ninguna falta de similitud no ventajosa en la función de los antagonistas del receptor de la hormona del crecimiento humana. Es más preferible usar los antagonistas del receptor de la hormona del crecimiento humana que sustancialmente tiene una secuencia de aminoácidos, en la que se incluya al menos un residuo de lisina, ácido aspártico, ácido glutámico, cisteína no pareada, un grupo a-amino libre en el extremo N o un grupo carboxilo libre en el extremo C. La frase "antagonista del receptor de hGH". cuando se usa en la presente memoria, engloba todos los antagonistas del receptor de la hormona del crecimiento humana, así como sus variantes, derivados y fragmentos y que se caracterizan porque son antagonistas del receptor de hGH. Ejemplos ilustrativos pero no limitantes de las secuencias de aminoácidos de tal antagonista del receptor de hGH se describen más adelante y en las bases de datos de secuencias tales como Genseq, Swissprot, Genbank, Embl, y PIR. Preferiblemente, la frase "antagonista del receptor de hGH" se refiere al antagonista del receptor de hGH de la SEC. ID. N.°:1 así como a sus variantes, homólogos y derivados que muestran esencialmente la misma actividad biológica. Más preferiblemente, la frase "antagonista del receptor de hGH" se refiere al polipéptido de la SEC. ID. N.° 1. La frase "variantes de antagonistas del receptor de hGH", tal como se usa en la presente memoria, se refiere a polipéptidos de la misma especie pero que difieren de un antagonista del receptor de hGH de referencia. Generalmente, las diferencias están limitadas de forma que las secuencias de aminoácidos de la referencia y la variante son muy similares en general y, en muchas regiones, son idénticas. Preferiblemente, los antagonistas del receptor de hGH son idénticas en al menos 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% a un antagonista del receptor de hGH de referencia, preferiblemente el antagonista del receptor de hGH de la SEC. ID. N.°:1. Por un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos con una "identidad" de al menos, por ejemplo, 95% con una secuencia de aminoácidos problema, se pretende significar que la secuencia de aminoácidos del polipéptido objeto es idéntica a la secuencia problema con la excepción de que la secuencia del polipéptido objeto puede incluir hasta cinco alteraciones de aminoácidos por cada 100 aminoácidos de la secuencia de aminoácidos problema. Estas alteraciones de la secuencia de referencia pueden producirse en las posiciones del extremo amino o carboxi de la secuencia de aminoácidos de referencia o en cualquier sitio entre esas posiciones de los extremos, entremezcladas o individualmente entre residuos de la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia. La secuencia problema puede ser una secuencia de aminoácidos entera de la secuencia de referencia o cualquier fragmento especificado tal como se describe en la presente memoria. Es sabido en la técnica que pueden eliminarse uno o más aminoácidos del extremo N o C de un péptido o proteína bioactivos sin que se produzca una pérdida sustancial de la función biológica (véase, por ejemplo, Ron y cois., (1993), Biol Chem., 268 2984-2988; cuya descripción se incorpora por la presente por referencia en su totalidad). También una persona de experiencia ordinaria en la técnica reconocerá que algunas secuencias de aminoácidos de antagonistas del receptor de hGH pueden variarse sin efectos significativos sobre la estructura o la función de la proteína. Tales mutantes incluyen deleciones, inserciones, inversiones, repeticiones y sustituciones seleccionadas de acuerdo con regias generales conocidas en la técnica para que tengan poco efecto sobre la actividad. Por ejemplo, se proporcionan directrices de cómo preparar sustituciones de aminoácidos fenotípicamente silenciosas en Bowie y cois. (1990), Science 247:1306-1310, que se incorpora por la presente por referencia en su totalidad, en el que los autores indican que existen dos estrategias principales para estudiar la tolerancia de una secuencia de aminoácidos al cambio. Típicamente, se ven como sustituciones conservadoras las sustituciones, entre sí, de los aminoácidos alifáticos Ala, Val, Leu y Phe; el intercambio de los residuos hidroxílicos Ser y Thr, el intercambio de los restos ácidos Asp y Glu, la sustitución entre los residuos amídicos Asn y Gln, el intercambio de los residuos básicos Lys y Arg y las sustituciones entre los residuos aromáticos Phe y Tyr. Además, los siguientes grupos de aminoácidos generalmente representan cambios equivalentes: (1) Ala, Pro, Gly, Glu, Asp, Gln, Asn, Ser, Thr; (2) Cys, Ser, Tyr, Thr; (3) Val, lie, Leu, Met, Ala, Phe; (4) Lys, Arg, His; (5) Phe, Tyr, Trp, His. Tal como se usa en la presente memoria, la frase "fragmento de antagonista del receptor de hGH" se refiere a cualquier péptido o polipéptido que comprende un tramo contiguo de una parte de la secuencia de aminoácidos de un antagonista del receptor de hGH, preferiblemente el polipéptido de la SEC. ID. N.°:1. Más específicamente, un fragmento de antagonista del receptor de hGH que comprende al menos 6, preferiblemente al menos 8 a 10, más preferiblemente 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 75, 100, 125, 150, 175 ó 191 aminoácidos consecutivos de un antagonista del receptor de hGH de acuerdo con la presente invención, fragmento de antagonista del receptor de hGH puede describirse además como subgéneros de antagonistas del receptor de hGH que comprenden al menos 6 aminoácidos, en el que "al menos 6" se define como cualquier número entero entre 6 y el número entero que representa el aminoácido del extremo C de un antagonista del receptor de hGH que incluye el polipéptido de la SEC. ID. N.°:1. Además se incluyen especies de fragmentos de antagonista del receptor de hGH de al menos 6 aminoácidos de longitud, tal como se describen anteriormente, que se especifican adicionalmente en términos de sus posiciones con respecto al extremo N y al extremo C. También comprendidos en la frase "fragmento de antagonista del receptor de hGH" como especies individuales se encuentran todos los fragmentos de antagonista del receptor de hGH, de al menos 6 aminoácidos de longitud, tal como se describe anteriormente, que puedan especificarse de forma particular por una posición del extremo N y del extremo C. Es decir, en la presente invención se incluyen todas las combinaciones de una posición del extremo N y del extremo C que podría ocupar un fragmento con una longitud de al menos 6 residuos aminoacídicos contiguos, en cualquier secuencia de aminoácidos dada de la lista de secuencias o de la presente invención. También comprendidos en la frase "fragmento de antagonista del receptor de hGH" están los dominios de antagonistas del receptor de hGH. Tales dominios pueden comprender eventualmente motivos lineales o estructurales y distintivos que incluyen, pero sin limitación, cremalleras de leucina, motivos de hélice-giro-hélice, sitios de modificación postranslational tales como sitios de glucosilación, sitios de ubicuitinación, hélices alfa, y láminas beta, secuencias de señalización, péptidos de señalización codificantes que dirigen la secreción de las proteínas codificadas, secuencias implicadas en la regulación de la transcripción tales como homeosecuencias, tramos ácidos, sitios de actividad enzimáíica, sitios de unión de sustratos, y sitios de escisión enzimática. Tales dominios pueden presentar una actividad biológica particular tal como unión al ADN o al ARN, secreción de proteínas, regulación de la transcripción, actividad enzimática, actividad de unión al sustrato, etc...

Un dominio tiene un tamaño comprendido generalmente entre 3 y 191 aminoácidos. En una modalidad preferida, los dominios comprenden un número de aminoácidos que es cualquier número entero comprendido entre 6 y 191. Los dominios pueden sintetizarse usando cualesquiera métodos conocidos por los expertos en la técnica, que incluyen los que se describen en la presente memoria para la preparación de antagonistas del receptor de hGH para producir anticuerpos. Los métodos para determinar los aminoácidos que constituyen un dominio con una actividad biológica particular incluyen estudios de mutagénesis y ensayos para determinar la actividad biológica a ensayar. El porcentaje de identidad se determina después de la alineación óptima de dos secuencias polinucleotídicas o polipeptídicas en un intervalo de comparación, en el que ciertas porciones de las secuencias polinucleotídicas o polipeptídicas del ¡ntervalo de comparación pueden comprender adiciones o deleciones de uno o más residuos para optimizar la alineación de las secuencias. El intervalo de comparación contiene un cierto número de posiciones (un resto o un hueco que corresponde a una inserción/deleción de un resto), correspondiendo este número de posiciones al tamaño del ¡ntervalo.

Cada posición del intervalo puede presentar una de las siguientes situaciones: 1a Hay un residuo (nucleótido o aminoácido) en esta posición en la primera secuencia alineada y un residuo diferente en la misma posición de la segunda secuencia alineada, en otras palabras, la segunda secuencia tiene un residuo sustituido en esta posición comparada con la primera secuencia. 2a Hay un residuo (nucleótido o aminoácido) en esta posición en la primera secuencia alineada y el mismo residuo en la misma posición en la segunda secuencia alineada. 3a Hay un residuo (nucleótido o aminoácido) en esta posición en la primera secuencia alineada y no hay ningún residuo en la misma posición en la segunda secuencia alineada, en otras palabras, la segunda secuencia presenta una deleción en esta posición comparada con la primera secuencia. El número de posiciones dentro del intervalo de comparación que pertenece a la primera categoría definida anteriormente se denomina R1. El número de posiciones dentro del intervalo de comparación que pertenece a la segunda categoría definida anteriormente se denomina R2. El número de posiciones dentro del intervalo de comparación que pertenece a la tercera categoría definida anteriormente se denomina R3. El porcentaje de identidad (%id) puede calcularse por cualquiera de las siguientes fórmulas: %¡d=R2/(R1+R2+R3)x100, o %id=(R2+R3)/(R1 +R2+R3)x100 La alineación de las secuencias a comparar puede realizarse usando cualquiera de la diversidad de algoritmos y programas de comparación de secuencias conocidos en la técnica. Tales algoritmos y programas incluyen, pero en modo alguno se limitan a, TBLASTN, BLASTP, FASTA, TFASTA, FASTDB, WU-BLAST, Gapped-BLAST, PSI-BLAST (Pearson y Lipman, (1988), Proc. Nati. Acad. Sci. USA-85:2444-2448; Altschul y cois., (1990), J. Mol. Biol. 215:403-410; Altschul y cois., (1993), Nature Genetics 3:266-272; Altschul y cois., (1997), Nuc. Acids Res-25:3389-3402; Thompson y cois., (1994), Nuc. Acids Res.. 22:4673-4680; Higgins y cois., (1996), Meth. Enzymol. 266:383-402; Brutlag y cois. (1990) Comp. App. Biosci. 6:237-245; Jones y Swindells, (2002) Trends Biochem Sci 27:161-4; Olsen y cois. (1999) Pac Symp Biocomput; 302-13), cuyas descripciones se incorporan por referencia en su totalidad. En una modalidad particular, el método de Smith-Waterman se usa con una matriz de puntuación tal como PAM, PAM 250 o preferiblemente con matrices BLOSUM tales como BLOSUM60 o BLOSUM62 y con parámetros por defecto (Penalización de apertura de hueco = 10 y Penalización de extensión de hueco = 1 ) o con parámetros especificados por el usuario preferiblemente superiores a los parámetros por defecto. En otra modalidad particular, las secuencias de proteínas y de ácidos nucleicos se alinean usando los programas Basic Local Alignment Search Tool ("BLAST") con los parámetros por defecto o con parámetros modificados proporcionados por el usuario. Preferiblemente, la matriz de puntuación usada es la matriz BLOSUM62 (Gonnet y cois., (1992), Science 256:1443-1445; Henikoff y Henikoff, (1993), Proteins 17:49-61, cuyas descripciones se incorporan por la presente por referencia en su totalidad). Menos preferiblemente, también pueden usarse las matrices PAM o PAM250 (véase, por ejemplo, Schwartz y Dayhoff, (1978), editores., Matrices for Detecting Distance Relationships: Atlas of Protein Sequence an Structure, Washington: National Biomedical Research Foundation, cuya descripción se incorpora por la presente por referencia en su totalidad). Todavía en otra modalidad particular, las secuencias de polinucleótidos o polipéptidos se alinean usando el programa de ordenador FASTDB basado en el algoritmo de Brutlag y cois. (1990), referencia anterior. Parámetros preferidos que se usan en una alineación FASTDB de secuencias de ADN son: Matriz = Unitaria, k-tuple = 4, Penalización de desacoplamiento = 1, Penalización de unión = 30, Longitud de grupo de aleatorización = 0, Puntuación límite = 1, Penalización de hueco = 5, Penalización de tamaño de hueco = 0,05, Tamaño del intervalo = 500 o la longitud de la secuencia de nucleótidos objeto, la que sea más corta. Parámetros preferidos que se usan en una alineación FASTDB de aminoácidos son: Matriz = PAM 0, k-tuple = 2, Penalización de desacoplamiento = 1, Penalización de unión = 20, Longitud de grupo de aleatorización = 0, Puntuación límite = 1, Tamaño del intervalo = longitud de secuencia, Penalización de hueco = 5, Penalización de tamaño de hueco = 0,05, Tamaño del intervalo = 500 o la longitud de la secuencia de nucleótidos objeto, la que sea más corta. Antagonistas del receptor de la hormona del crecimiento humana ejemplares son variantes de la hormona del crecimiento humana que tienen al menos una sustitución del aminoácido lisina de la posición 41 y de la leucina de la posición 45, y en particular isoleucina o arginina en la posición 41 y triptófano en la posición 45 (documento US 5.534.617). Antagonistas del receptor de la hormona del crecimiento humana ejemplares adicionales son variantes de la hormona del crecimiento humana que tienen al menos dos sustituciones de aminoácidos en las posiciones 54, 56, 58, 64, y en particular 54P 56D, 58T 64K, 54P 56W 58T 64K, y 54P 64K (documento US 5.534.617). Antagonistas del receptor de la hormona del crecimiento humana ejemplares adicionales son las variantes de la hormona del crecimiento humana que tienen una mayor afinidad por el receptor de la hormona del crecimiento en el Sitio I (documento US-6.022.711). Antagonistas del receptor de la hormona del crecimiento humana ejemplares particulares son las variantes de la hormona del crecimiento humana que tienen las sustituciones de aminoácidos: H18D, H21N, R167N, K168A, D171S, K172R, E174S, I179T; H18D, Q22A, F25A, D26A, Q29A, E65A, K168A, E174S; H18A, Q22A, F25A, D26A, Q29A, E65A, K168A, E174S; H18D, 522A, F25A, D26A, Q29A, E65A, K168A, E174A (documento US 6.022.711). Antagonistas del receptor de la hormona del crecimiento humana ejemplares adicionales son variantes de la hormona del crecimiento humana que tienen sustituciones de aminoácidos en las posiciones 10, 14, 18, y 21. Antagonistas del receptor de la hormona del crecimiento humana ejemplares particulares son las variantes de la hormona del crecimiento humana que tienen las sustituciones de aminoácidos 10H, 14G, 18N, 21 N; 10A, 14W, 18D, 21N; 10Y, 14T, 18V, 21N; y 101, 14N, 181, 21N (documento US 5.834.598). Antagonistas del receptor de la hormona del crecimiento humana ejemplares adicionales son las variantes de la hormona del crecimiento humana que tienen las sustituciones de aminoácidos 174S y 176Y y una o más sustituciones de aminoácidos en las posiciones 10, 14, 18, 21 , 167, 171, 175, y 179. Antagonistas del receptor de la hormona del crecimiento humana ejemplares adicionales son las variantes de la hormona del crecimiento humana en las que ocho aminoácidos de hGH natural F10, M14, H18, H21 , R167, D171, T175 y T179 son sustituidos en grupo respectivamente con un aminoácido correspondiente que se selecciona secuencialmente del grupo que consiste en: H, G, N, N, N, S, T, T; H, G, N, N, E, S, T, I; H, G, N, N, N, N, T, T; A, W, D, N, N, S, T, T; A, W, D, N, E, S, T, I; A, W, D, N, N, T, T, T; F, S, F, L, N, S, T, T; F, S, F, L, E, S, T, I; F, S, F, L, N, N, T, T. H, G, N, N, N, S, T, N; A, N, D, A, N, N, T, N; F, S, F, G, H, S, T, T; H, Q, T, S, A, D, N, S; H, G, N, N, N, A, T, T; F, S, F, L, S, D, T, T; A, S, T, N, R, D, T, I; Q, Y, N, N, H, S, T, T; W, G, S, S, R, D, T, I; F, L, S, S, K, N, T, V; W, N, N, S, H, S, T, T; A, N, A, S, N, S, T, T; P, S, D, N, R, D, T, I; H, G, N, N, N, N, T, S; F, S, T, G, R, D, T, I; M, T, S, N, Q, S, T, T; F, S, F, L, T, S, T, S; A,W,D, N,R, D,T, I; A, W, D, N, H, S, T, N; M, Q, M, N, N, S,T,T; H, Y, D, H, R, D, T, T; L, N, S, H, R, D, T, I; L, N, S, H, T, S, T, T; A, W, D, N, N, A, T, T; F, S, T, G, R, D, T, I; A,W,D, N,R,D,T,I; I, Q, E, H, N, S, T, T; F,S,L,A,N,S,T,V; F, S, F, L, K, D, T, T; M, A, D, N, N, S, T, T; A, W, D, N, S, S, V, T; y H, Q, Y, S, R, D, T, I (documento US 5.834. 598) La sustitución de un aminoácido diferente en G120 es una modificación que altera la unión del Sitio 2. Por lo tanto, una variante de hGH que incluye una sustitución del aminoácido en G120 actúa como un antagonista de hGH. El antagonista del receptor de la hormona del crecimiento humana podría ser modificado en el residuo 120 de una glicina a cualquier aminoácido más voluminoso. Sustituciones específicas en el residuo 120 son lisina y cisteína. Modalidades específicas son antagonistas del receptor de la hormona del crecimiento humana en los que una sustitución del aminoácido G120 se combina con conjuntos de sustituciones de aminoácidos del Sitio 1 (documento US 5.845.535). Así, en una modalidad, un antagonista del receptor de la hormona del crecimiento humana incluye los siguientes conjuntos de sustituciones de aminoácidos: H18D, H21N, G120K, R167N, K168A, D171S. K172R, E174S, I179T (en lo sucesivo la "variante B2036"). En otra modalidad, el antagonista del receptor de la hormona del crecimiento humana incluye el siguiente conjunto de sustituciones de aminoácidos: H18A, Q22A, F25A, D26A, Q29A, E65A, G120K, K168A, E174A (en lo sucesivo la "variante B2024"). De acuerdo con la presente invención, poli(etilenglicol) se une covalentemente a través de residuos aminoacídicos de antagonistas del receptor de la hormona del crecimiento humana. El residuo aminoacídico puede ser cual(es)quiera que sea(n) reactivo(s) que tenga(n), por ejemplo, grupos amino, carboxilo, sulfhidrilo (tiol), hidroxilo, guanidinilo o imidizoilo libres, a los que pueda unirse un grupo reactivo del extremo de un poli(etilenglicol) activado. Los residuos aminoacídicos que tienen los grupos amino libres pueden incluir residuos de lisina y/o residuos aminoacídicos en el extremo N, los que tienen un grupo carboxilo libre pueden incluir ácido aspártico, ácido glutámico y/o residuos aminoacídicos en el extremo C, los que tienen un grupo sulfhidrilo (tiol) libre tal como cisteína, los que tienen un hidroxilo libre tales como serina o tirosina, los que tienen un guanidinilo libre tal como arginina, y los que tienen un imidizoilo libre tal como histidina. En otra modalidad, se usan las reacciones químicas de la oxima (Lemieux y Bertozzi Tib Tech 16:506-513, 1998) dirigidas a restos de serina en el extremo N. El poli(etilenglicol) que se usa en la presente invención no se restringe a ninguna forma particular ni a ningún intervalo de pesos moleculares. El peso molecular del poli(etilenglicol) puede estar comprendido entre aproximadamente 500 y aproximadamente 100.000 Dalton. El término "aproximadamente" indica que en las preparaciones de polietilenglicol, algunas moléculas pesarán más, algunas menos, del peso molecular reseñado y el peso molecular reseñado se refiere al peso molecular medio. Se entiende que hay algún grado de polidispersión asociada a polímeros tales como poli(etilenglicol). Es preferible usar PEG con baja polidispersión. Normalmente, se usa un PEG con un peso molecular de aproximadamente 500 a aproximadamente 60. OOO. Un intervalo de pesos moleculares específicos de PEG de la presente invención es de aproximadamente 1.000 a aproximadamente 40.000. En otra modalidad específica el peso molecular del PEG es mayor de aproximadamente 5.000 a aproximadamente 40.000. En otra modalidad específica, el peso molecular de PEG es de aproximadamente 20.000 a aproximadamente 40.000. Pueden usarse otros tamaños dependiendo del perfil terapéutico deseado (por ejemplo, la duración de la liberación sostenida deseada, los efectos, si los hay, sobre la actividad biológica, el grado o ausencia de antigenicidad y otros efectos conocidos del polietileno sobre una proteína terapéutica. Por ejemplo, el polietilenglicol puede tener un peso molecular medio de aproximadamente 200, 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 8500, 9000, 9500, 10.000, 10.500, 11.000, 11.500, 12.000, 12.500, 13.000, 13.500, 14.000, 14.500, 15.000, 15.500, 16.000, 16.500, 17.000, 17.500, 18.000, 18.500, 19.000, 19.500, 20.000; 25.000, 30.000, 35.000, 40.000, 45.000, 50.000, 55.000, 60.000, 65.000, 70.000, 75.000, 80.000, 85.000, 90.000, 95.000 o 100.000 Dalton. El poli(etilenglicol) también puede ser un PEG ramificado tal como se describe en los documentos U.S. 5.932.462, U.S. 5.342.940, U.S. 5.643.575, U.S. 5.919.455, U.S. 6.113.906, y U.S. 5.183.660. Los poli(óxidos de alquileno), de forma notable los poli(etilenglicol)es, están unidos a antagonistas del receptor de la hormona del crecimiento humana mediante un grupo reactivo en el extremo, que puede o no dejar un resto de enlace (espaciador) entre el PEG y la proteína. Para formar los conjugados de antagonistas del receptor hormona del crecimiento humana de la presente invención, los polímeros tales como poli(óxido de alquileno) se convierten en formas activadas, tal como es conocido dicho término por las personas de experiencia ordinaria en la técnica. El grupo reactivo, por ejemplo, es un grupo reactivo en el extremo, que media un enlace entre los restos químicos de la proteína, tales como los grupos amino, carboxilo o tiol, y poli(etilenglicol). Típicamente, uno o ambos de los grupos hidroxilo finales del polímero del extremo (es decir los grupos hidroxilo de los extremos alfa y omega) se convierten en grupos funcionales reactivos, que permiten la conjugación covalente. Este proceso a menudo se denomina "activación" y el producto de polí(etilenglicol) que tiene el grupo reactivo se denomina en lo sucesivo un "poli(etilenglicol) activado". Los polímeros que contienen grupos de enlace tanto a como ? se denominan "poli(óxidos de alquileno) biactivados" y se denominan "bifuncionales". Los polímeros que contienen el mismo grupo reactivo en los hidroxilos de los extremos a y ? se denominan algunas veces "homobifuncionales" o "homobiactivados". Los polímeros que contienen grupos reactivos diferentes en los hidroxilos de los extremos a y ? se denominan algunas veces "heterobifuncionales" o "heterobiactivados". Los polímeros que contienen un solo grupo reactivo se denominan poli(óxidos de alquileno) "monoactivados" o "monofuncionales".

Otros polímeros sustancialmente no antigénicos se "activan" o "funcionalizan" de manera similar. Los polímeros activados son así adecuados para mediar un enlace entre restos químicos de la proteína, tales como grupos a- o e-amino, carboxilo o tiol, y poli(etilenglicol). En otra modalidad, los polímeros biactivados pueden reaccionar de esta manera con dos moléculas de proteína o una molécula de proteína y una molécula pequeña reactiva formando eficazmente polímeros de proteínas o conjugados de proteína y molécula pequeña a través de enlaces cruzados. Grupos funcionales capaces de reaccionar con el grupo a-amino del extremo amino o grupos e-amino de las usinas que se encuentran en los antagonistas del receptor de la hormona del crecimiento humana incluyen: esteres de N-hidroxisuccinimidilo, carbonatos tales como el p-nitrofenilo, o succinimidilo; carbonilimidazol; azlactonas; imidationas cíclicas; isocianatos o isotiocianatos; cloruro de tresilo (documentos EP 714 402, EP 439 508); y aldehidos. Grupos funcionales capaces de reaccionar con grupos ácido carboxílico, grupos carbonilo reactivos y restos carbohidrato oxidados de los antagonistas del receptor de la hormona del crecimiento humana incluyen; aminas primarias; y grupos funcionales de hidrazina e hidrazida tales como las acilhidrazidas, carbazatos, semicarbamatos, tiocarbazatos, etc. Los grupos mercapto, si están disponibles en los antagonistas del receptor de la hormona del crecimiento humana, pueden usarse también como sitios de unión para los polímeros activados de forma adecuada con grupos reactivos tales como tioles; maleimidas, sulfonas y fenilglioxales; véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos N° 5.093.531, cuya descripción se incorpora por la presente por referencia. Otros nucleófilos capaces de reaccionar con un centro electrófilo incluyen, pero sin limitación, por ejemplo, hidroxilo, amino, carboxilo, tiol, metileno activo y similares. También se incluyen polímeros que incluyen restos lipófilos e hidrófilos que se describen en los documentos US 5.359.030 y US 5.681.811 ; US 5.438.040; y US 5.359.030. En una modalidad preferida de la invención se forman enlaces de amina o amida secundaria usando el grupo a-amino del extremo N o los grupos e-amino de lisina de los antagonistas del receptor de la hormona del crecimiento humana y el PEG activado. En otro aspecto preferido de la invención, se forma un enlace de amina secundaria entre el grupo a- o e-amino primario del extremo N de los antagonistas del receptor de la hormona del crecimiento humana y PEG aldehido de cadena única o ramificada mediante reducción con un agente reductor adecuado tal como NaCNBH3, NaBH3, piridina y borano etc. tal como se describe en Chamow y cois., Bioconjugate Chem. 5: 133-140 (1994) y la patente de Estados Unidos n.° 5.824.784. En otra modalidad preferida de la invención, se usan polímeros activados con grupos de enlace que forman amidas tales como esteres de succinimidilo, imidationas cíclicas, o similares para efectuar el enlace entre los antagonistas del receptor de la hormona del crecimiento humana y el polímero, véase por ejemplo, la patente de Estados Unidos n.° 5.349.001 ; la patente de Estados Unidos n.° 5.405.877; y Greenwald, y cois., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 17:101-161, 2000, que se incorporan por la presente por referencia. Un poli(etilenglicol) activado preferido, que puede unirse a los grupos amino libre de los antagonistas del receptor de la hormona del crecimiento humana incluye N-hidroxisuccinilimida poli(etilenglicol) de cadena única o ramificada, puede prepararse activando esteres de ácido succínico de poli(etilenglicol) con N-hidroxisuccinilimida. Otras modalidades preferidas de la invención incluyen el uso de otros polímeros activados para formar enlaces covalentes del polímero con los antagonistas del receptor de la hormona del crecimiento humana mediante grupos e-amino u otros. Por ejemplo, pueden usarse formas isocianato o isotiocianato de polímeros activados en el extremo para formar enlaces con base de urea o tiourea con los grupos amino de lisina. En otro aspecto preferido de la invención, se forman enlaces de carbamato (uretano) con grupos amino de las proteínas tal como se describe en las patentes de Estados Unidos n.° 5.122.614, 5.324.844, y 5.612.640, que se incorporan por la presente por referencia. Ejemplos incluyen polímeros activados de carbonato de N-succinimidilo, carbonato de para-nitrofenilo, y carbonilimidazol. En otra modalidad preferida de esta invención, se enlaza un derivado de carbonato de benzotriazol de PEG con grupos amino de los antagonistas del receptor de la hormona del crecimiento humana. Otro aspecto de la invención representa un profármaco o forma de liberación mantenida de antagonistas del receptor de la hormona del crecimiento humana, compuestas por un polímero soluble en agua, tal como poli(etilenglicol), unido a una molécula del antagonista del receptor de la hormona del crecimiento humana mediante un grupo de enlace funcional que puede descomponerse de forma predecible por hidrólisis enzimática o dirigida por pH liberando antagonistas del receptor de la hormona del crecimiento humana libres u otro derivado de los antagonistas del receptor de la hormona del crecimiento humana. El profármaco también puede ser un "doble profármaco" (Bundgaard en Advanced Drug Delivery Reviews 3:39-65, 1989) que comprende el uso de una latencia en cascada. En tales sistemas, la reacción hidrolítica implica una etapa inicial que limita la velocidad (lenta) enzimática o dirigida por pH y una segunda etapa que implica una hidrólisis no enzimática rápida que se produce sólo después de que se haya producido la primera. Un polímero liberable de ese tipo proporciona conjugados de proteínas, que son impermanentes y podrían actuar como reservorio, que continuamente descarga antagonistas del receptor de la hormona del crecimiento humana. Grupos de enlace funcionales de ese tipo se describen en los documentos US 5.614.549; US 5.840.900; US 5.880.131; US 5.965.119; US 6.011.042; US 6.180.095 B1; Greenwald R.B. y cois., J. Med. Chem. 42; 3657-3667, 1999; Lee, S. y cois., Bioconjugado Chem. 12:163-169, 2001; Garman A.J. y cois., FEBS Lett. 223:361-365, 1987; Woghiren C. y cois., Bioconjugate Chem. 4:314-318, 1993; Roberts M.J. y cois., J. Pharm. Sci. 87;1440-1445, 1998; Zhao X., en Ninth Int. Symp. Recent Adv. Drug Delivery Syst. 199; Greenwald R.B. y cois., J. Med. Chem. 43:475-487, 2000; y Greenwald R.B. Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 17:101-161, 2000. La presente invención se refiere a un método de usar química de los aldehidos para dirigir la selectividad del resto PEG al extremo N usando un resto de enlace de butirilaldehído. Una modalidad de la presente invención es un conjugado del antagonista del receptor de la hormona del crecimiento humana y PEG que tiene la estructura de ia Fórmula I o la Fórmula II Fórmula I mPEG-O(CH2CH2O)n(CH2)mCH2-NH-R Fórmula II en la que n es un número entero entre 1 y 10; m es un número entero entre 1 y 10; R es un antagonista del receptor de la hormona del crecimiento humana. En una modalidad particular n es entre 1 y 5 y m es entre 1 y 5. En una modalidad particular de la Fórmula I: n es 1 y m es 1; n es 1 y m es 2; n es 1 y m es 3; n es 1 y m es 4; n es 1 y m es 5; n es 1 y m es 1 ; n es 1 y m es 7; n es 1 y m es 8; n es 1 y m es 9; n es 1 y m es 10; n es 2 y m es 1; n es 2 y m es 2; n es 2 y m es 3; n es 2 y m es 4; n es 2 y m es 5; n es 2 y m es 6; n es 2 y m es 7; n es 2 y m es 8; n es 2 y m es 9; n es 2 y m es 10; n es 3 y m es 1; n es 3 y m es 2; n es 3 y m es 3; n es 3 y m es 4; n es 3 y m es 5; n es 3 y m es 6; n es 3 y m es 7; n es 3 y m es 8; n es 3 y m es 9; n es 3 y m es 10; n es 4 y m es 1 ; n es 4 y m es 2; n es 4 y m es 3; n es 4 y m es 4; n es 4 y m es 5; n es 4 y m es 6; n es 4 y m es 7; n es 4 y m es 8; n es 4 y m es 9; n es 4 y m es 10; n es 5 y m es 1 ; n es 5 y m es 2; n es 5 y m es 3; n es 5 y m es 4; n es 5 y m es 5; n es 5 y m es 6; n es 5 y m es 7; n es 5 y m es 8; n es 5 y m es 9; n es 5 y m es 10; n es 6 y m es 1; n es 6 y m es 2; n es 6 y m es 3; n es 6 y m es 4; n es 6 y m es 5; n es 6 y m es 6; n es 6 y m es 7; n es 6 y m es 8; n es 6 y m es 9; n es 7 y m es 10; n es 7 y m es 1; n es 7 y m es 2; n es 7 y m es 3; n es 7 y m es 4; n es 7 y m es 5; n es 7 y m es 6; n es 7 y m es 7; n es 7 y m es 8; n es 7 y m es-9; n es 7 y m es 10; n es 8 y m es 1; n es 8 y m es 2; n es 8 y m es 3; n es 8 y m es 4; n es 8 y m es 5; n es 8 y m es 6; n es 8 y m es 7; n es 8 y m es 8; n es 8 y m es 9; n es 8 y m es 10; n es 9 y m es 1; n es 9 y m es 2; n es 9 y m es 3; n es 9 y m es 4; n es 9 y m es 5; n es 9 y m es 6; n es 9 y m es 7; n es 9 y m es 8; n es 9 y m es 9; n es 9 y m es 10; n es 10 y m es 1; n es 10 y m es 2; n es 10 y m es 3; n es 10 y m es 4; n es 10 y m es 5; n es 10 y m es 6; n es 10 y m es 7; n es 10 y m es 8; n es 10 y m es 9; n es 10 y m es 10; Una modalidad específica es un conjugado del antagonista del receptor de la hormona del crecimiento humana y PEG que tiene la estructura de la fórmula: mPEG-O(CH2CH2O)4CH2CH2CH2CH2-NH-R en el que R es el antagonista del receptor de la hormona del crecimiento humana. En una modalidad específica, los antagonistas del receptor de la hormona del crecimiento humana es la variante B2036 (SEC. ID. N.°:1). Una modalidad específica de la presente invención es un conjugado de hormona del crecimiento humana y PEG, en el que más de 80%, más preferiblemente 81%, más preferiblemente 82%, más preferiblemente 83%, más preferiblemente 84%, más preferiblemente 85%, más preferiblemente 86%, más preferiblemente 87%, más preferiblemente 88%, más preferiblemente 89%, más preferiblemente 90%, más preferiblemente 91%, más preferiblemente 92%, más preferiblemente 93%, más preferiblemente 94%, más preferiblemente 95%, más preferiblemente 96%, más preferiblemente 97%, y más preferiblemente 98% del polietilenglicol está conjugado con la fenilalanina en el extremo amino de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°:1. Otra modalidad específica de la presente invención es un conjugado de hormona del crecimiento humana y PEG, en el que más de 90% del polietilenglicol está conjugado con la fenilalanina del extremo amino de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°:1. Otra modalidad específica de la presente invención es un conjugado de hormona del crecimiento humana y PEG, en el que más de 95% del polietilenglicol está conjugado con la fenilalanina del extremo amino de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°:1. Otra modalidad específica de la presente invención es un conjugado de hormona del crecimiento humana y PEG, en el que más de 98% del polietilenglicol está conjugado con la fenilalanina del extremo amino de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°:1. Las reacciones de conjugación, denominadas reacciones de PEGilación, históricamente se realizaban en solución con un exceso molar de polímero y sin tener en cuenta donde se unía el polímero a la proteína. Sin embargo, estas técnicas generales típicamente han resultado inadecuadas para conjugar proteínas bioactivas a polímeros no antigénicos conservando a la vez una bioactividad suficiente. Una forma de mantener la bioactividad del antagonista del receptor de la hormona del crecimiento humana es evitar sustancialmente la conjugación de los grupos reactivos de los antagonistas del receptor de la hormona del crecimiento humana asociados a los sitio(s) de unión de los receptores en el proceso de acoplamiento del polímero. Otro aspecto de la presente invención es proporcionar un proceso de conjugar poli(etilenglicol) a antagonistas del receptor de la hormona del crecimiento humana manteniendo niveles altos de actividad retenida. La modificación química a través de un enlace covalente puede realizarse en cualquier condición adecuada que generalmente se adopta en una reacción de una sustancia biológicamente activa con el poli(etilenglicol) activado. La reacción de conjugación se lleva a cabo en condiciones relativamente suaves para evitar inactivar los antagonistas del receptor de la hormona del crecimiento humana. Las condiciones suaves incluyen mantener el pH de la solución de reacción en el ¡ntervalo de 3 a 10 y las temperaturas de reacción dentro del intervalo de aproximadamente 0°-37°C. En los casos en los que los residuos aminoacídicos reactivos de los antagonistas del receptor de la hormona del crecimiento humana tienen grupos amino libres, la modificación anterior preferiblemente se lleva a cabo en una lista no limitante de tampones adecuados (pH 3 a 10), que incluye fosfato, MES, citrato, acetato, succinato o HEPES, durante 1-48 horas a 4°-37°C. Para dirigirse a grupos amino del extremo N con reactivos tales como PEG aldehidos, preferiblemente se mantiene pH 4-7. El poli(etilenglicol) activado puede usarse en aproximadamente 0,05-100 veces, preferiblemente aproximadamente 0,05-2,5 veces, la cantidad molar del número de los grupos amino libres de los antagonistas del receptor de la hormona del crecimiento humana. Por otra parte, cuando los residuos aminoacídicos reactivos de los antagonistas del receptor de la hormona del crecimiento humana tienen los grupos carboxilo libres, la modificación anterior preferiblemente se realiza a pH de aproximadamente 3,5 a aproximadamente 5,5, por ejemplo, la modificación con poli(oxietilendiamina) se realiza en presencia de carbodiimida (pH 4-5) durante 1-24 horas a 4°-37° C. El poli(etilenglicol) activado puede usarse en 0,05-300 veces la cantidad molar del número de grupos carboxilo libres de antagonistas del receptor de la hormona del crecimiento humana. En modalidades separadas, el límite superior para la cantidad de polímero que se incluye en las reacciones de conjugación supera aproximadamente 1:1 en un grado tal que sea posible hacer reaccionar el polímero activado y los antagonistas del receptor de la hormona del crecimiento humana sin formar una cantidad sustancial de especies de alto peso molecular, es decir que más de aproximadamente 20% de los conjugados contengan más de aproximadamente una cadena de polímero por molécula de antagonistas del receptor de la hormona del crecimiento humana. Por ejemplo, en este aspecto de la invención se contempla que pueden emplearse relaciones de hasta aproximadamente 6:1 para formar cantidades significativas de los conjugados deseados que posteriormente pueden aislarse separándolos de cualquier especie de alto peso molecular. En otro aspecto de esta invención, los derivados de PEG activados bifuncionalmente pueden usarse para generar moléculas poliméricas de antagonistas del receptor de la hormona del crecimiento humana y PEG en las que múltiples moléculas de los antagonistas del receptor de la hormona del crecimiento humana se entrecrucen mediante PEG. Aunque las condiciones de reacción que se describen en la presente memoria pueden producir cantidades significativas de antagonistas del receptor de la hormona del crecimiento humana no modificados, los antagonistas del receptor de la hormona del crecimiento humana no modificados pueden reciclarse fácilmente en lotes futuros para reacciones de conjugación adicionales. Los procesos de la presente invención generan sorprendentemente muy pocas, es decir menos de aproximadamente 30% y más preferiblemente, menos de aproximadamente 10%, especies de alto peso molecular y especies que contienen más de una cadena de polímero por cada antagonista del receptor de la hormona del crecimiento humana. Estas condiciones de reacción deben contrastarse con las que se usan típicamente para reacciones de conjugación poliméricas en las que el polímero activado está presente en excesos molares de varias veces con respecto a la diana. En otros aspectos de la invención, el polímero está presente en cantidades desde aproximadamente 0,1 a aproximadamente 50 equivalentes por equivalente de los antagonistas del receptor de la hormona del crecimiento humana. En otros aspectos de la invención, el polímero está presente en cantidades desde aproximadamente 1 a aproximadamente 10 equivalentes por equivalente de los antagonistas del receptor de la hormona del crecimiento humana. Las reacciones de conjugación de la presente invención ¡nicialmente proporcionan una mezcla de reacción o pool que contiene conjugados de mono-y di-PEG y antagonistas del receptor de la hormona del crecimiento humana, antagonista del receptor de la hormona del crecimiento humana sin reaccionar, polímero sin reaccionar, y habitualmente menos de aproximadamente 20% de especies de alto peso molecular. Las especies de alto peso molecular incluyen conjugados que contienen más de una cadena de polímero y/o especies polimerizadas de PEG y antagonista del receptor de la hormona del crecimiento humana. Después de que se han eliminado las especies que no han reaccionado y las especies de alto peso molecular, se recuperan las composiciones que contienen principalmente conjugados de mono- y di-polímero y antagonistas del receptor de la hormona del crecimiento humana. Dado el hecho de que los conjugados en su mayor parte incluyen una sola cadena de polímero, los conjugados son sustancialmente homogéneos. Estos antagonistas del receptor de la hormona del crecimiento humana modificados tienen al menos aproximadamente 0,1% de la actividad biológica in vitro asociada a los antagonistas del receptor de la hormona del crecimiento humana naturales o no modificados medida usando ensayos de proliferación celular FDC-P1 estándar, (Clark y cois. Journal of Biological Chemistry 271:21969-21977, 1996), ensayo de unión de receptores (documento US 5.057.417), o crecimiento de ratas hipofisectomizadas (Clark y cois. Journal of Biológica! Chemistry 271:21969-21977, 1996). En aspectos preferidos de la invención, sin embargo, los antagonistas del receptor de la hormona del crecimiento humana modificados tienen aproximadamente 25% de la actividad biológica in vitro, más preferiblemente, los antagonistas del receptor de la hormona del crecimiento humana modificados tienen aproximadameníe 50% de la aclividad biológica in vitro, más preferiblemeníe, los aníagonistas del receptor de la hormona del crecimiento humana modificados íienen aproximadameníe 75% de la actividad biológica in vitro, y lo más preferiblemente los antagonistas del receptor de la hormona del crecimiento humana modificados tienen actividad biológica in vitro equivalente o mejorada. Los procesos de la presente invención preferiblemente incluyen relaciones bastante limitadas entre el polímero y los anlagonistas del receptor de la hormona del crecimienío humana. Así, se ha enconfrado que los conjugados de aníagonisías del recepíor de la hormona del crecimienío humana eslán predominanlemenle limifados a especies que coníienen sólo una cadena de polímero. Además, la unión del polímero a los grupos reaclivos de los aníagonisías del recepíor de la hormona del crecimienío humana es suslancialmenle menos aleatoria que cuando se usan excesos molares más alíos del polímero de enlace. Los anlagonisfas del receplor de la hormona del crecimienío humana no modificados preseníes en la mezcla de reacción, después de que la reacción de conjugación ha sido ¡nactivada, puede reciclarse en reacciones futuras usando cromatografía de intercambio iónico o de exclusión por lamaño o íécnicas de separación similares. Un antagonista del receptor de la hormona del crecimiento humana modificado con poli(etilenglicol), en concreto una proteína modificada químicamente de acuerdo con la presente invención, puede purificarse a partir de una mezcla de reacción por métodos convencionales que se usan para la purificación de proteínas, tales como diálisis, precipitación por gradiente salino, ultrafiltración, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de interacciones hidrófobas (HIC), cromatografía en gel y eleclroforesis. La cromaíografía de iníercambio iónico es particularmenle eficaz para eliminar poli(etilenglicol) y antagonistas del receptor de la hormona del crecimiento humana que no han reaccionado. En una modalidad adicional de la invención, las especies de mono- y di-polímero y antagonisía del receptor de la hormona del crecimiento humana se aislan de la mezcla de reacción eliminando las especies de alto peso molecular, y los antagonistas del receptor de la hormona del crecimiento humana no modificados. La separación se efectúa introduciendo las especies mezcladas en una solución tamponada que contiene de aproximadameníe 0,5-10 mg/ml de los conjugados de antagonistas del receptor de la hormona del crecimiento humana y polímero. Las soluciones adecuadas tienen un pH de aproximadamente 4 a aproximadamente 10. Las soluciones preferiblemente contienen una o más sales tampón, que se seleccionan entre KCl, NaCI, K2HPO , KH2PO , Na2HPO4, NaH2PO4, NaHCO3, NaBO4, CH3CO2H y NaOH. Dependiendo del tampón de reacción, primero puede ser necesario someter la solución de conjugado de antagonista del receptor de la hormona del crecimiento humana y polímero a intercambio de tampones/ulírafiltración para eliminar el polímero que no ha reaccionado. Por ejemplo, la solución de conjugado de PEG y antagonistas del receptor de la hormona del crecimiento humana puede someterse a ultrafiltración a través de una membrana con un peso molecular de corte bajo (10.000 a 30.000 Dalton) para eliminar los materiales no deseados, tales como polímero no reaccionado, tensioactivos, si los hay, o similares. El fraccionamiento de los conjugados en una mezcla que contiene las especies deseadas preferiblemente se realiza usando un medio de cromatografía de intercambio iónico. Tales medios son capaces de unirse selectivamente a conjugados de PEG y antagonistas del receptor de la hormona del crecimiento humana mediante diferencias de carga, que varían de un modo un tanto predecible. Por ejemplo, el número de grupos cargados disponibles en la superficie de la proteína determina la carga superficial del antagonista del receptor de la hormona del crecimiento humana. Estos grupos cargados típicamenfe sirven como punto de unión potencial de polímeros de poli(óxido de alquileno). Por lo lanío, los conjugados de aníagonistas del receptor de la hormona del crecimienío humana tendrán una carga diferente a las de las otras especies permitiendo el aislamiento selectivo. Para el método de la presente invención se usan resinas de intercambio aniónico o catiónico muy polares tales como resinas de aminas cuaternarias o de sulfopropilo, respectivamente. Se prefieren especialmente las resinas de intercambio iónico. Una lista no limitante de resinas de intercambio catiónico disponibles en el mercado incluidas adecuadas para usar con la presente invención son SP-hitrap®, SP Sepharose HP® y SP Sepharose® fasf flow. También pueden usarse oíras resinas de intercambio caíiónico adecuadas, por ejemplo, resinas S y CM. Una lisia no limifaníe de resinas de iníercambio aniónico, que incluye resinas de intercambio aniónico disponibles en el mercado, adecuadas para usar con la presenfe invención son Q-hilrap®, Q Sepharose HP® y Q sepharose® fasí flow. También pueden usarse oíras resinas de iníercambio aniónico adecuadas, por ejemplo, resinas DEAE. Por ejemplo, la resina de intercambio aniónico o caíiónico preferiblemenle se empaquete en una columna y se equilibra por medios convencionales. Se usa un tampón que tiene el mismo pH y osmolalidad que la solución de antagonistas del receptor de la hormona del crecimiento humana conjugado con polímero. El tampón de elución preferiblemenle contiene una o más sales que se seleccionan de KCl, NaCI, K2HPO4, KH2PO , Na2HPO , NaH2PO4, NaHCO3, NaBO4, y (NH4)2CO3. La solución que contiene el conjugado después se adsorbe en la columna, sin que queden retenidos ni el polímero sin reaccionar ni algunas especies de alto peso molecular. Al completar la carga, se aplica a la columna un flujo en gradiente de un tampón de elución con concentraciones crecientes de sales para eluir la fracción deseada de antagonistas del receptor de la hormona del crecimiento humana conjugados con polióxido de alquileno. Las fracciones eluidas reunidas preferiblemente se limiían a conjugados uniformes de polímeros después de la eíapa de separación por intercambio caíiónico o aniónico. Cualquier especie no conjugada de anlagonislas del receptor de la hormona del crecimiento humana puede después lavarse de la columna mediante íécnicas convencionales. Si se desea, pueden separarse además las especies de aníagonisfas del recepíor de la hormona del crecimienío humana mono y mulli-pegiladas unas de las oirás medianie una cromatografía de intercambio iónico o una cromatografía de exclusión por tamaño adicional. También pueden usarse técnicas que utilizan múltiples elapas isocráíicas de concenlración crecieníe. Las eíapas múlíiples de elución isocráíica de conceníración crecieníe producirán la elución secuencial de conjugados de di- y después mono- aníagonisfas del receplor de la hormona del crecimiento humana y polímero. El intervalo de temperaturas para la elución está entre aproximadamente 4°C y aproximadameníe 25°C. Preferiblemenle, la elución se realiza a una temperatura de aproximadamente 4°C a aproximadamente 22°C. Por ejemplo, la elución de la fracción de PEG y antagonista del receptor de la hormona del crecimiento humana se detecta por absorbancia UV a 280 nm. La recogida de las fracciones puede conseguirse por medio de perfiles sencillos de elución en función del tiempo. Puede usarse un tensioactivo en los procesos de conjugar el polímero de poli(etilenglicol) con el resto antagonisía del recepíor de la hormona del crecimiento humana. Los íensioaclivos adecuados incluyen ageníes de íipo iónico íales como dodecilsulfaío sódico (SDS). También pueden usarse oíros íensioacfivos iónicos íales como dodecilsulfaío de litio, compuestos de amonio cuaternario, ácido taurocólico, ácido caprílico, ácido decanosulfónico, eíc. También pueden usarse íensioaclivos no iónicos. Por ejemplo, pueden usarse materiales tales como poli(oxietileno)sorbiíanos (Tweens) y éíeres de poii(oxieíileno) (Trifons). Véase fambién Neugebauer, A Guide ío íhe Properties and Uses of Delergenís in Biology and Biochemislry (1992) Calbiochem Corp. Las únicas limiíaciones de los lensioacíivos que se usan en los procesos de la invención es que se usen en condiciones y a conceníraciones que no provoquen una desnaluralización irreversible susíancial de los aníagonislas del recepíor de la hormona del crecimienío humana y no inhiban compleíamente la conjugación con el polímero. Los tensioacíivos están preseníes en las mezclas de reacción en canlidades de aproximadamente 0,01-0,5%; preferiblemente de 0,05-0,5%; y aún más preferiblemeníe de aproximadameníe 0,075-0,25%. También se contemplan mezclas de los íensioacíivos. Se cree que los íensioaclivos proporcionan un sisíema de proíección reversible temporal durante el proceso de conjugación con el polímero. Se ha demostrado que los tensioactivos son eficaces en la inhibición selectiva de la conjugación del polímero mientras que permiten que tenga lugar una conjugación basada en lisina o basada en grupos amino del exíremo. Los presentes aníagonislas del receplor de la hormona del crecimienío humana modificados con poli(elilenglicol) tienen un efecto farmacológico más perdurable, que puede atribuirse posiblemente a su semivida prolongada in vivo. Los antagonísías del recepíor de la hormona del crecimienío humana químicamente modificados de la presente invención, son útiles en el tratamiento de afecciones en las que es deseable la inhibición de la acción de la GH. Las afecciones en las que una reducción de los niveles de GH o de un mediador de la acción de GH en circulación, tal como IGF-I, proporciona un beneficio terapéutico son particularmente susceptibles a tratamiento con antagonistas del receptor de la hormona del crecimiento humana químicamente modificados. Tales afecciones incluyen afecciones de exceso de GH tales como, por ejemplo, gigantismo y acromegalia. El gigantismo se produce por un exceso de GH antes de la pubertad, cuando el crecimienío óseo todavía es posible. La acromegalia se produce por un exceso de GH después de la pubertad, cuando los huesos largos se han unido. La acromegalia se caracteriza por excrecencias óseas e hinchazón de los tejidos blandos así como hipertrofia de los órganos internos, en especial el corazón. La acromegalia lípicameníe eslá provocada por un íumor en la piíuitaria que segrega GH. Los indicadores de la enfermedad son niveles altos de GH y IGF-l en circulación. Actualmente se cree que los antagonisías del recepíor de la hormona del crecimiento humana químicamente modificados de la presenfe invención ofrecen un beneficio ferapéufico significaíivo al inhibir la acción de GH. Los aníagonisías del recepíor de la hormona del crecimienío humana químicamente modificados fambién son úfiles para frafar las ofras afecciones en las que la inhibición de la acción de GH proporciona un beneficio terapéutico. Ejemplos incluyen diabetes y sus complicaciones, tales como por ejemplo reíinopaíía diabéíica y nefropalía diabéíica. La retinopatía diabéfica se caracteriza por proliferación de las células que forman los vasos sanguíneos reíinianos, crecimiento de nuevos vasos sobre la refina (neovascularización), desarrollo de microaneurismas, y filíración de fluido al tejido retiniano que lo rodea. Los indicadores tempranos de la nefropafía diabólica son hipertrofia renal e hiperfiltración. Al ir progresando la enfermedad, se observa engrasamiento difuso de las células mesangiales (que dan soporíe al aparato de fillración del riñon), acompañado de un aumento absoluío del número de células mesangiales. También se cree que las enfermedades oculares vasculares que, como la reíinopaíía diabólica, implican neovascularización proliferaíiva pueden ser susceptibles de tratamiento con un antagonista del receptor de la hormona del crecimienío humana. Ejemplos incluyen refinopafía en premaluros, reíinopalía asociada a la anemia falciforme, y degeneración macular asociada a la edad, que es la causa más común de pérdida de visión en las personas mayores de 55. Oíras afecciones en las que la reducción de los niveles de GH levéis se cree acfualmeníe que proporciona un beneficio ferapéuíico incluyen neoplasias malignas que responden a GH, o un mediador de la acción de GH (íal como IGF-1), (en lo sucesivo "neoplasias malignas que responden a GH"). Ejemplos de neoplasias malignas que responden a GH incluyen lumor de Wilm, diversos sarcomas (por ejemplo, sarcoma osleógeno), cáncer de mama, colon, próstata y tiroides. Los antagonisías del recepíor de la hormona del crecimienío humana químicamente modificados de la preseníe invención inhiben el crecimienío de células que expresan recepíores a los que se unen las variantes. Una amplia variedad de tejidos expresan íales receptores. Por ejemplo, ARNm del receptor de GH es expresado en líneas celulares de placenta, timo, cerebro, glándula salivar, próstaía, médula ósea, músculo esqueléíico, íráquea, médula espinal, refina, nodulo linfáíico normales y en linfoma de Burkilí, carcinoma colorrectal, carcinoma de pulmón, leucemia linfoblástica, y melanoma. Así, acíualmeníe se cree que los aníagonisías del recepíor de la hormona del crecimiento humana químicamente modificados de la presenfe invención son generalmenle úíiles en el íratamiento de los cánceres que expresan receptores a los que se unen las varianíes. Los presentes aníagonisías del recepíor de la hormona del crecimienío humana modificados con poli(eíilenglicol) pueden formularse en fármacos que coníienen íambién un diluyente farmacéuíicameníe aceptable, un agente para preparar una solución ¡sotónica, un acondicionador del pH y similares para adminislrarlos a un pacieníe. Los agentes farmacéuíicos anteriores pueden adminislrarse por vía subcufánea, intramuscular, intravenosa, pulmonar, inlradérmica u oral, dependiendo del objeíivo del fralamienlo. Una dosis lambién puede basarse en el íipo y esíado del írastorno de un paciente a traíar, estando normalmente entre 0,1 mg y 5 mg por inyección y entre 0,1 mg y 50 mg en una administración oral para un adulto. Las susíancias poliméricas incluidas también son preferiblemente solubles en agua a temperatura ambiente. Una lista no limitante de tales polímeros incluyen homopolímeros de poli(óxido de alquileno) lales como poli(elilenglicol) o poli(propilenglicoles), poli(polioles oxieíilenados), sus copolímeros y sus copolímeros de bloque, con la condición de que se mantenga la solubilidad en agua de los copolímeros de bloque. Como alíernaíiva a los polímeros basados en PEG, pueden usarse materiales que no son anfigénicos eficazmente íales como dexírano, poli(vinilpirrolidonas), poli(acrilamidas), poli(alcoholes vinílicos) polímeros basados en carbohidratos, y similares. De hecho, la activación de grupos a- y ?-de los exíremos de esías suslancias poliméricas puede realizarse de formas similares a las que se usan para convertir los poli(óxidos de alquileno) y así serán obvios para las personas de experiencia ordinaria. Las personas de experiencia ordinaria en la técnica se darán cuenfa de que la lisia anterior es simplemente ilusíraliva y que se contemplan iodos los maíeriales poliméricos que íienen las cualidades descriías en la preseníe memoria. Para los fines de la preseníe invención, "no eficazmente antigénico" se refiere a todos los materiales que en la técnica se consideran no tóxicos y que no inducen una respuesta inmunógena apreciable en los mamíferos. Definiciones A continuación se proporciona una lista de abreviaturas y los correspondientes significados que se usan indislintamente en la presente memoria: g gramo(s) mg miligramo(s) ml o mL mililifros (s) TA íemperaíura ambiente PEG poli(eíilenglicol) El contenido completo de todas las publicaciones, patentes y soliciíudes de paíeníe ciladas en esía descripción se incorpora en la preseníe memoria por referencia como si se indicara específica e individualmente que se incorpora por referencia cada publicación, patente o solicitud de pateníe individual. Aunque la invención anterior se ha descriío con algún detalle a modo de ilustración y ejemplo para aclarar la comprensión, será evidente para una persona de experiencia en la técnica a la luz de las enseñanzas de esta invención que pueden realizarse cambios y modificaciones sin apartarse del espíritu y alcance de la presente invención. Los siguientes ejemplos se proporcionan sólo con fines de ejemplificación y no pretenden limiíar el alcance de la invención, que se ha descriío en términos amplios anteriormente. En los siguieníes ejemplos, el aníagonisía del receptor de la hormona del crecimienío humana es el de la SEC. ID. N.°:1. Se enliende que oíros miembros de la familia de polipépfidos de los aníagonisías del receplor de la hormona del crecimiento humana podrían pegilarse también de forma similar tal como se ejemplifica en los ejemplos subsiguientes. Todas las referencias, patentes o soliciludes ciladas en la preseníe memoria se incorporan por referencia en su lofalidad, como si se hubieran escrito la presente memoria. La presente invención se ilusírará adicionalmenle haciendo referencia a los siguientes ejemplos que, sin embargo, no deben iníerprefarse como limilaciones del alcance de la presente invención. EJEMPLOS EJEMPLO 1 PEG-ALD Anlagonislas del recepíor de la hormona del crecimienío humana de PM 40.000 y cadena ramificada Esíe ejemplo demuesíra un méíodo para la generación de preparaciones suslancialmeníe homogéneas de un aníagonisía del recepíor de la hormona del crecimienío humana monopegilado en el exíremo N por alquilación reducíora. Un reacíivo de PEG-aldehído (PEG2 ALD) de PM 40.000 con ramificaciones meloxi (Shearwaler Corp.) se acopló seleclivameníe medianíe aminación reducíora al exíremo N de un anlagonisía del recepíor de la hormona del crecimiento humana aprovechando la diferencia eníre el valor de la pKa relativa de la amina primaria en el extremo N y los valores de las pKa de las aminas primarias en la posición e-amino de los residuos de lisina. La proteina del antagonista del receptor de la hormona del crecimiento humana disuelta a 10 mg/ml en HEPES 25 mM (Sigma Chemical St. Louis, MO) a pH 7,1 se hizo reaccionar con PEG-aldehído (PEG2 ALD) de PM 40.000 con ramificaciones metoxi mediante la adición de PEG-aldehído de PM 40.000 con ramificaciones metoxi proporcionando una relación molar relativa entre PEG y el antagonista del receptor de la hormona del crecimiento humana de 4:1. Las reacciones se catalizaron mediante la adición de solución madre 1 M de NaCNBH4 (Sigma Chemical, St. Louis, MO), disuelto en H20, o complejo de piridina y borano hasta una concentración final de 10-50 mM. Las reacciones se realizaron a 25°C durante 18-48 horas. EJEMPLO 2 PEG aldehido de PM 20.000 con metoxi PEG aldehido de PM 20.000 con metoxi (Shearwater) se acopló al antagonista del receptor de la hormona de crecimiento humano usando el procedimiento que se describe para el Ejemplo 1. EJEMPLO 3 PEG aldehido de PM 30.000 con metoxi PEG aldehido de PM 30.000 con metoxi (Shearwater) se acopló al antagonista del receptor de la hormona de crecimiento humano usando el procedimiento que se describe para el Ejemplo 1. EJEMPLO 4 PEG-Butyraldehído de MW 40,000 con ramificaciones metoxl (PEG2-But ALD) PEG-Buíiraldehído de PM 40.000 con ramificaciones metoxi (PEG2-But-ALD) . Reacíivo PEG-Buíiraldehído de PM 40.000 con ramificaciones meíoxi (PEG2-Buí ALD) (Shearwaíer Corp.) se acopla al exíremo N del anfagonisía del receptor de la hormona del crecimiento humana usando el procedimiento que se describe para el Ejemplo 1. EJEMPLO 5 PEG2 NHS-PEG de PM 40.000 ramificado-aníagonista del receptor de la hormona del crecimiento humana PEG2 NHS de PM 40.000 ramificado (Shearwaíer Corp.) se acopló al aníagonista del receptor de la hormona de crecimiento humano usando el procedimiento que se describe para el Ejemplo 1. EJEMPLO 6 Purificación de aníagonisfas del recepíor de hGH PEGilados Especies de anfagonisías del recepfor de hGH PEGiladas se purificaron a partir de la mezcla de reacción a >95% (análisis por SEC) usando una única eíapa de cromaíografía de iníercambio iónico. Como ejemplo, PEG-aldehído de PM 40.000 con ramificaciones metoxi se acopló a B2036. Las reacciones se llevaron a cabo a 25 grados C duraníe 60 minuíos en HEPES 25 mM, a pH 7,1 a una concenlración de proíeína de 10 mg/ml usando una relación molar eníre PEG y profeína de 4:1. El anfagonista del recepíor de la hormona del crecimienío humana monoPEGilado se purificó a partir de la mezcla de reacción usando una columna Q Sepharose HP equilibrada en íampón HEPES 25 mM a pH 7,3 y un gradienfe lineal de NaCl. Cromatografía de intercambio aniónico Especies de anlagonisías del receplor de hGH mono-pegiladas con PEG-aldehído de 30K, PEG aldehido de 20K, PEG NHS de 40K, y PEG aldehido de 40K ramificado se purificaron a partir de la mezcla de reacción a >95% (análisis por SEC) usando una única etapa de cromatografía de intercambio aniónico. Antagonista del receptor de hGH mono-pegilado se purificó separándolo de especies de antagonista del receptor no modificado y antagonistas del receptor de hGH multi-pegiladas usando cromaíografía de iníercambio aniónico. Una mezcla de reacción típica de PEG-aldehído de PM 40.000 con ramificaciones metoxi y antagonista del receptor de hGH (5-100 mg de proteína), tal como se describe anteriormente, se purificó en una columna Q-Sepharose Hitrap (1 ó 5 ml) (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) o una columna Q-Sepharose fast flow (26/20, 70 ml de volumen del lecho) (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) equilibrada en HEPES .25 mM, a pH 7,1 (Tampón A). La mezcla de reacción se diluyó 5-10 veces con Tampón A y se cargó en la columna con un caudal de 2,5 ml/min. La columna se lavó con 8 volúmenes de columna de Tampón A. Subsiguientemente, las diversas especies de hGH se eluyeron de la columna con 80-100 volúmenes de columna de Tampón A y un gradiente lineal de NaCI de 0-200 mM. El eluyeníe se coníroló por la absorbancia a 280 nm (A28o) y se recogieron las fracciones. Las fracciones se agruparon de acuerdo con el grado de PEGilación, por ejemplo, mono, di. Después el conjunto se conceníró a 0,5-5 mg/ml en una conceníradora Ceníriprep YM10 (Amicon, Technology Corporafion, Northborough, MA). La concentración proíeínica del conjunto se determinó por A2so usando un coeficiente de exfinción de 0,78. El rendimienío íoíal de PEG-aldehído de PM 40.000 monorram ificado de esíe proceso fue de 44%. Cromatografía de intercambio caíiónico La cromatografía de intercambio caíiónico se realiza en una columna de alio rendimienío SP Sepharose (Pharmacia XK 26/20, 70 ml de volumen del lecho) equilibrada en acetato sódico 10 mM a pH 4,0 (Tampón B). La mezcla de reacción se diluye 10 veces con Tampón B y se carga en la columna con un caudal de 5 ml/min. Después la columna se lava con 5 volúmenes de columna de Tampón B, seguido de 5 volúmenes de columna de Tampón C al 12% (acetato 10 mM a pH 4,5, NaCI 1 M). Subsiguientemente, las especies PEG-hGH se eluyen de la columna con un gradiente lineal de 12 a 27% de Tampón C en 20 volúmenes de columna. El eluyeníe se conírola a 280 nm y se recogen fracciones de 10 ml. Las fracciones se agruparon de acuerdo con el grado de PEGilación (mono, di, íri ele), se intercambiaron en íampón de aceíato 10 mM a pH 4,5 y se concentraron a 1-5 mg/ml en una cubeta en agitación provisla de una membrana Amicon YM10. La concentración de proteína del conjunto se determina por A280 nm usando un coeficiente de extinción de 0,78. EJEMPLO 7 Caracterización Bioquímica Los conjugados de antagonistas del receptor de hGH pegilados purificados se caracterizaron por SDS-PAGE reductora y no reductora, cromatografía de exclusión por tamaño no desnaíuralizaníe, cromaíografía de intercambio aniónico analífica, secuenciación desde el exíremo N, cromatografía de interacciones hidrófobas, y HPLC de fase inversa. Cromatografía líquida de exclusión por tamaño de alta resolución (SEC-HPLC) SEC-HPLC no desnaturalizante La reacción de diversos tamaños y geometrías con aníagonisías del recepíor de hGH, las mezclas de purificación por intercambio ¡ónico y los producios purificados finales se evaluaron usando SEC-HPLC no desnaíuralizante. SEC-HPLC no desnaiuralizante analíiica se realizó usando una columna Tosohaas G4000PWXL, de 7,8 mm X 30 cm, (Tosohaas Pharmacia Biotech, Piscaíaway, NJ) en fosfato 20 mM a pH 7,2, NaC1 150 mM con un caudal de 0,5 ml/minuto. La PEGilación aumenta en gran medida el volumen hidrodinámico de la proíeína dando como resultado un desplazamiento a un íiempo de retención aníerior. Se observaron especies nuevas en las mezclas de reacción de PEG-Buíiraldehído de PM 40.000 con ramificaciones metoxi y anlagonisfa del receptor de hGH junio con el anfagonisfa del receptor de hGH no modificado. Estas especies PEGiladas y no PEGiladas se separaron por cromatografía en Q-Sepharose, y subsiguientemente se demostró que las especies de PEG-Buliraldehído de PM 40.000 monorramíficadas resultantes modificadas y antagonista del recepíor de hGH no modificado eluían en forma de un único pico en SEC no desnafuralizaníe (pureza >95% ) (Figura 2b). La eíapa de cromaíografía en Q-Sepharose separó de forma eficaz el PEG libre, el aníagonisía del recepíor de hGH, y las especies de aníagonisía del receplor de hGH di-PEGiladas de los aníagonistas del receptor de hGH mono-Pegilados (Figura 2a). La SEC-HPLC no desnaturalizante demostró que el tamaño effectivo de los diversos antagonisfas del recepíor de hGH PEGilados era mucho mayor que sus pesos moleculares teóricos relativos. SDS PAGE Se usó SDS-PAGE para evaluar la reacción de PEG-aldehído de PM 40.000 ramificado con antagonisía del receptor de hGH y los producios finales purificados (no se mueslran datos). La SDS-PAGE se realizó en geles de Tris tricina al 10-20% de 1 mm de grueso (Invilrogen, Carlsbad, CA) en condiciones reducloras y no reducloras y se finó usando un kií de tinción Novex Colloidal Coomassie™ G-250 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Las especies de PEG-aldehído hGH monorramificadas purificadas migran en forma de una única banda en SDS-PAGE. HPLC de intercambio iónico analílica La reacción de PEG-aldehído de PM 40.000 con ramificaciones metoxi con anlagonisfas del receptor de hGH, las fracciones de la purificación por intercambio aniónico y los producios purificados finales se evaluaron usando HPLC de iníercambio aniónico analííica. La HPLC de intercambio aniónico analítica se realizó usando una columna de intercambio aniónico Tosahaas Q5PW o DEAE-PW, de 7,5 mm x 75 mm (Tosohaas Pharmacia Biofech, Piscafaway, NJ) en Tris 50 mM a pH 8,6 con un caudal de 1 ml/min. Las muesíras se eluyeron con un gradieníe lineal de NaCI de 5-200 mM. Mapeo de la secuencia y péptidos desde el extremo N Se usaron reacciones de degradación de Edman aulomaíizada para deíerminar la secuencia proíeínica desde el exíremo NH2. Se empleó un secuenciador de Applied Biosystems Modelo 494 Procise (Perkin-Elmer, Wellesley, MA) para la degradación. Los derivados de PTH-AA respectivos se ideníificaron mediante análisis por RP-HPLC en un modo en línea empleando un analizador de Applied Biosystems Modelo 140C PTH provisto con una columna Perkin Elmer/Brownlee PTH-C18 de 2,1 mm de d.i. Se secuenciaron bandas de PEG-Butiraldehído de PM 40.000 ramificado y aníagonisía del recepíor de la hormona del crecimiento humana transferidas a membranas de PVDF o soluciones de conjugado de PEG-Butiraldehído de 20K lineal purificado y de PM 40.000 ramificado y antagonisías del recepfor de hGH.

Claims

REIVINDICACIONES

1.- Un conjugado de aníagonisla del recepíor de la hormona del crecimiento humana monoPEGilado en el extremo amino.

2.- El conjugado monoPEGilado en el exfremo amino de la reivindicación 1 que íiene la esírucfura de la Fórmula en el que n es un número entero eníre 1 y 10; m es un número eníero entre 1 y 10; R es un antagonisla del receptor de la hormona del crecimiento humana.

3.- El conjugado de PEG de la reivindicación 2 que tiene la estrucíura de la Fórmula en el que R es un antagonista del receptor de la hormona del crecimiento humana.

4.- El conjugado de la reivindicación 1 , 2 ó 3, en el que dicho antagonista del receptor de la hormona del crecimiento humana comprende una secuencia de aminoácidos de la SEC. ID. N.°:1.

5.- El conjugado de la reivindicación 1 , 2 ó 3, en el que dicho antagonista del receptor de la hormona del crecimiento humana consiste en una secuencia de aminoácidos de la SEC. ID. N.°:1.

6.- El conjugado de antagonista del receptor de la hormona del crecimiento humana y PEG de la reivindicación 4, en el que más del 90% de dicho polietilenglicol está conjugado con una fenilalanina en el extremo amino de la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID. N.°:1.

7.- El conjugado de antagonista del receptor de la hormona del crecimiento humana y PEG de la reivindicación 4, en el que más del 95% de dicho polietilenglicol está conjugado con una fenilalanina en el exlremo amino de la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID. N.°:1.

8.- Una composición que comprende el conjugado de antagonista del receptor de la hormona del crecimiento humana y PEG de la reivindicación 1, 2, 3, 4, 5, 6 ó 7, y al menos un vehículo farmacéuticameníe acepfable.

9.- Un método de tratar a un paciente que tiene un trastorno del crecimiento o del desarrollo que comprende administrar a dicho paciente una cantidad terapéuticamente eficaz del conjugado de antagonista del receptor de la hormona del crecimiento humana y PEG de la reivindicación 1 , 2, 3, 4, 5, 6, ó 7.

10.- El método de la reivindicación 9, en el que dicho trasíorno del crecimienío o del desarrollo es giganíismo.

11.- El método de la reivindicación 9, en el que dicho trastorno del crecimienío o del desarrollo es acromegalia.

12.- El método de la reivindicación 9, en el que dicho trasíorno del crecimiento o del desarrollo es retinopaíía diabética.

13.- El método de la reivindicación 9, en el que dicho trasíorno del crecimiento o del desarrollo es nefropalía diabéíica.

14.- Un méfodo de íralar un pacieníe que fiene una neoplasia maligna que responde a GH que comprende adminisírar a dicho pacieníe una caníidad lerapéuíicamente eficaz del conjugado de antagonista del receptor de la hormona del crecimienío humana y PEG de la reivindicación 1 , 2, 3, 4, 5, 6 ó 7

15.- Un méíodo de inhibir el crecimienío de células que expresan receptores a los que se unen las varianíes que comprende adminisírar a un pacieníe que lo necesite una caníidad lerapéuíicamenfe eficaz del conjugado de antagonisía del recepíor de la hormona del crecimienío humana y PEG de la reivindicación 1, 2, 3, 4, 5, 6 ó 7.