ENOXAPARINA PARA EL TRATAMIENTO DE CÁNCER
La presente invención se refiere al uso de enoxaparina para tratar una enfermedad asociada a la modulación de la actividad de la hepáranasa. La enoxaparina (Lovenox™, Clexane™) es una heparina de bajo peso molecular, que se comercializa para el tratamiento profiláctico de la enfermedad tromboembólica venosa en cirugía de riesgo moderado o elevado, la prevención de la coagulación en el sistema circulatorio extracorporal durante la hemodiálisis, el tratamiento de trombosis venosa profunda constituida y, en combinación con aspirina, para el tratamiento de angina inestable y de infarto de miocardio agudo sin onda Q. La enoxaparina también es útil en la prevención y/o el tratamiento del trauma del sistema nervioso central (WO 98/53833) y de edema cerebral (WO 98/53834). La enoxaparina también es útil en la prevención y/o tratamiento de enfermedades motoneuronales (WO 00/35462), y para el tratamiento de la isquemia cerebral (WO 01/49298). Los pacientes con cáncer tienen riesgo elevado de tromboembolia venosa (VTE), similar al riesgo después de cirugía ortopédica mayor. La trombosis en la segunda causa principal de muerte en pacientes con cáncer (Green K. B.et al. , Hematol. Oncol. Clin. North Am . 10:499-530, 1996). Los pacientes con cáncer están incluidos a menudo en estudios clínicos con heparinas (heparina sin fraccionar (UFH) y heparina de bajo peso molecular (LMWH)) para el tratamiento o prevención de trombosis venosa profunda (DVT) o embolismo pulmonar (PE). Varios estudios clínicos han descrito una supervivencia mejorada en pacientes de cáncer con UFH (Lebeau B. et al., Cáncer 74:38-45, 1994; Zacharski L. et al. , Thromb. Haemost. 80: 10-23, 1 998), y con LMWH (Bergqvist D. et al. , N. Engl . J. Med. 346:975-980, 2002; von Tempelhoff G. , Int. J. Oncol. 10:815-824, 2000). En el estudio pequeño de Fase I I en 15 pacientes de docetaxel más enoxaparina en pacientes sin experiencia previa en quimioterapia con cáncer de pulmón de célula no pequeña avanzado metastático, la enoxaparina se usa para prevenir eventos de trombosis en pacientes de cáncer cuando se les trata con docetaxel y se describe que disminuyen significativamente los niveles de proteína angiogénica TGF-12.1 en los pacientes (Robert F. et al. , Lung Cáncer 42:237-245, 2003). Así, estos estudios sugerían un papel de las heparinas en la terapia del cáncer con relación a la prevención y/o tratamiento de la trombosis venosa y embolia pulmonar. La patofisiología de la malignidad es compleja y multifactorial. Entre los procesos implicados, se reconocen como componentes principales de la enfermedad la inflamación, formación de trombina y fibrina, proliferación de células cancerígenas, angiogénesís, migración de células cancerígenas (metástasis). La migración de células cancerígenas (metástasis) depende especialmente de la degradación de la matriz extra celular. Las heparanasas, una familia de las endoglicosidasas, provoca la degradación de la matriz promoviendo la invasión celular. La actividad de la heparanasa está implicada en diferentes procesos biológicos como la extravasación de células inflamatorias y también de células tumorales durante la metástasis. La actividad de la heparanasa se encuentra en una variedad de tejidos y células normales y malignas, entre los cuales se pueden citar células endoteliales, plaquetas, mastocitos, neutrófilos, macrófagos, linfocitos T y B, células de linfoma, melanoma y carcinoma. Se describen distintas heparanasas de plaquetas humanas, células de melanoma y macrófagos de ratón, que representan el producto de un solo gen (Vlodavsky I. et al. , Nat. Med. 7:793-802, 1 999). El sustrato habitual de esta enzima es sulfato de heparán, con especificidad de sustrato elevada. El sulfato de heparán es escindido por la heparanasa y esta degradación tiene múltiples consecuencias patológicas. En realidad, el sulfato de heparán juega un papel central en los procesos normales y patológicos entre los que se encuentran la reparación de tejidos, inflamación, autoinmunidad, crecimiento de tumores y metástasis. La degradación enzimática del sulfato de heparán parece que está implicada en el desarrollo de la inflamación y metástasis del cáncer (Hulette M. D. et al. , Nat. Med. 7: 803-809, 1999). Algunos documentos discuten la inhibición de la actividad de la heparanasa en presencia de diferentes especies de heparina (Vlodavski I . et al. , Adv. Exp. Med. Biol. 313:31 7-27, 1992; Parish C. R. et al. , Int. J. Cáncer 40: 51 1 -518, 1987; Bitan. M. et al, Isr. J. Med Sci. 31 : 106-1 1 8, 1 995). La heparina se considera como un inhibidor de la heparanasa y su actividad inhibidora está asociada a una acción inmunomoduladora (Gorski A et al. , FASEB J. 5: 2287-2291 , 1991 ). Esto no fomenta el uso de enoxaparina como un inhibidor de heparanasa. Se conoce bien, en comparación con la heparina sin fraccionar, que la enoxaparina tiene diferente actividad. La enoxaparina es una mezcla de fragmentos que oscilan de 600 a 14.000 daltones, mientras que la heparina sin fraccionar es una mezcla de fragmentos que oscilan de 5.000 a 30.000 daltones. Los fragmentos entre 600 y 5.000 daltones son insignificantes en la heparina sin fraccionar. Estos fragmentos entre 600 y 5.000 daltones representan más del 60 % de enoxaparina. En el artículo de Pacheco (J. Dermatol. Treat. 12: 123-126, 2001 ), se destaca que una "Heparina de bajo peso molecular (enoxaparina) ha mostrado que inhibe la expresión de la heparanasa" para el tratamiento del Liquen plano. Sin embargo, esta información debe interpetarse en relación con el hecho de que dicha inhibición se cree que se produce porque los línfocitos CD4+ producen endoglicosidasa (heparanasa), que les permite penetrar en la lámina basal endotelial. Además, los autores solo demuestran que el Liquen plano se trata de forma eficaz cuando la enoxaparina se administra al paciente que lo necesita. Los autores no demuestran tampoco las causas de este efecto, p. ej. si los linfocitos CD4+ no pueden atacar la epidermis, si los linfocitos CD4+ ya no están "activados", si los linfocitos CD4+ producen heparanasa que es inhibida por la enoxaparina.
En otro aspecto, en el artículo de Amirkhosravi et al. (J. Thromb. Haemostasis 1 :1972-1976, 2003) se describe que la tinzaparina (una heparina de bajo peso molecular) inhibe la metástasis en el tumor de pulmón en el ratón en el modelo de melanoma B16, debido a su liberación eficaz de Inhibidor de la Vía del Factor Tisular (TFPI) endotelial. Además, la enoxaparina tiene una gran variabilidad de actividad en comparación a otras LMWHs. Como la mayor parte de las LMWHs, la enoxaparina procede de una fuente de material de heparina sin fraccionar. La LMWH se obtiene por rotura de cadenas más largas de heparina sin fraccionar en otras más pequeñas a través de procesos variables de despolimerización química o enzimátíca. Cada fabricante de LMWH utiliza un procedimiento distinto de despolimerización. Esto da como resultado LMWH con estructuras químicas distintas y, por tanto, diferente actividad farmacológica. Un artículo de Fareed J. et al. (Annals New York Academy Sciences 556, 1989) muestra que todas las LMWH no son equivalentes, tanto desde el punto de vista bioquímico como farmacológico. Los pacientes con cáncer tienen opciones de tratamiento limitadas y la respuesta a estos tratamientos limitados es menor que óptima, especialmente para la inhibición de la aparición de metástasis. Hay una necesidad todavía de proporcionar un nuevo fármaco que pueda potenciar la respuesta a los tratamientos del cáncer, la inhibición de la metástasis, y mejorar la penetración del agente citotóxico dentro de las células tumorales. Esto se espera que de como resultado una supervivencia mejorada y una mejor calidad de vida de estos pacientes. Se ha encontrado ahora sorprendentemente que la enoxaparina modula la actividad de la heparanasa implicada en enfermedades. En particular, se ha encontrado que la enoxaparina inhibe la actividad de la heparanasa. En una modalidad, la presente invención se refiere al uso de enoxaparina para tratar una enfermedad asociada a la modulación de la actividad de la heparanasa, excepto cuando dicha enfermedad es el Liquen plano. En otra modalidad, la invención se refiere al uso de enoxaparina para tratar una enfermedad en un mamífero en la que la actividad de la heparanasa contribuye a la patología y/o síntomas de la enfermedad, excepto cuando dicha enfermedad es Liquen plano. En otra modalidad, la invención se refiere al uso de enoxaparina para tratar una enfermedad en un mam ífero en la que la actividad de la heparanasa contribuye a la patolog ía y/o síntomas de la enfermedad, excepto cuando dicha enfermedad es una enfermedad autoinmune. La presente invención se refiere también al uso de enoxaparina para tratar una enfermedad asociada a la modulación de la actividad de la heparanasa, excepto cuando dicha enfermedad es una enfermedad autoinmune. Por ejemplo, dicha enfermedad autoinmune se selecciona del grupo que incluye, pero no se limita a, esclerosis múltiple, encefalomielitis autoinmune y Liquen plano. En particular, dicha enfermedad autoinmune es Liquen plano. La invención también se refiere al uso de enoxaparina para tratar una enfermedad en un mamífero en la que la actividad de la heparanasa contribuye a la patología y/o síntomas de la enfermedad, excepto cuando dicha enfermedad está asociada principalmente a la inflamación del sistema nervioso central. En otra modalidad, la presente invención se refiere al uso de enoxaparina para fabricar un medicamento para tratar una enfermedad asociada a la modulación de la actividad de la heparanasa, excepto cuando dicha enfermedad es Liquen plano. En otra modalidad, la presente invención se refiere al uso de enoxaparina para fabricar un medicamento para tratar una enfermedad asociada a la modulación de la actividad de la heparanasa, excepto cuando dicha enfermedad es una enfermedad autoinmune. En otra modalidad, la presente invención se refiere más particularmente al uso anteriormente mencionado de enoxaparina, en el que la enfermedad está asociada a la inhibición de la heparanasa. La enfermedad anteriormente mencionada es preferiblemente cáncer. Dicho cáncer se selecciona del grupo que incluye, pero no se limita a, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de próstata, cáncer de colon o cáncer de páncreas. Un cáncer particularmente preferido es cáncer de mama.
En otra modalidad, la presente invención se refiere más preferiblemente al uso anteriormente mencionado, en el que la enoxaparina está en combinación con uno o más agentes quimioterapéuticos. Dicho agente quimioterapéutico se selecciona del grupo que incluye, pero no se limita a, docetaxel (I NN), paclitaxel (INN), ciclofosfamida (INN) o antraciclinas. Una antraciclina preferida es particularmente doxorrubicina (I NN). Una antraciclina preferida es particularmente epirrubicina
(INN). Un agente quimioterapéutico particularmente preferido es docetaxel. En otra modalidad, la presente invención se refiere más preferiblemente al uso anteriormente mencionado, en el que la enoxaparina está en combinación con docetaxel o doxorrubicina. Por ejemplo, la presente invención se refiere también al uso de enoxaparina en combinación con docetaxel, doxorrubicina y ciclofosfamida. La referencia a las modalidades preferidas que se hace antes incluye todas las combinaciones de grupos particulares y preferidos. En otra modalidad, la presente invención se refiere más particularmente al uso anteriormente mencionado, en el que la enoxaparina está en combinación con uno o más agentes quimioterapéuticos, en la que dicha combinación es una preparación combinada para uso simultáneo, separado o secuencial. En otra modalidad particular, la presente invención se refiere al uso anteriormente mencionado de la enoxaparina, en el que la enoxaparina reduce la aparición de metástasis. En otra modalidad, la invención se refiere a un método para tratar una enfermedad asociada a la modulación de la actividad de la heparanasa, excepto cuando dicha enfermedad es Liquen plano, método que comprende administrar a un animal una cantidad terapéuticamente eficaz de enoxaparina o una combinación de enoxaparina y uno o más agentes quimioterapéuticos o una de sus sales farmacéuticamente aceptables, bien simultáneamente o separadamente o secuencialmente en el tiempo En otra modalidad, la invención se refiere a un método para tratar una enfermedad asociada a la modulación de la actividad de la heparanasa, excepto cuando dicha enfermedad es una enfermedad autoinmune, método que comprende administrar a un animal una cantidad terapéuticamente eficaz de enoxaparina y uno o más agentes quimioterapéuticos o una de sus sales farmacéuticamente aceptables, bien simultáneamente o separadamente o secuencialmente en el tiempo En otra modalidad, la presente invención se refiere más particularmente al uso anteriormente mencionado, en el que la enfermedad está asociada a la inhibición de la heparanasa. En otra modalidad, la invención se refiere a un método para potenciar la acción de uno o más agentes quimioterapéuticos, que comprende la administración simultánea, separada o secuencial de enoxaparina. El agente quimioterapéutico anteriormente mencionado se selecciona del grupo que incluye, pero no se limita a, docetaxel, paclitaxel, ciclofosfamida o antraciclinas. Una antraciclina preferida es particularmente doxorrubicina. Una antraciclina preferida es particularmente epirrubicina. Un agente quimioterapéutico particularmente preferido es docetaxel. La presente invención se refiere más preferiblemente al método anteriormente mencionado, en el que la enoxaparina está en combinación con docetaxel y doxorrubicina. Por ejemplo, la presente invención se refiere también al método anteriormente mencionado, en el que la enoxaparina está en combinación con docetaxel, doxorrubicina y ciclofosfamida. La referencia a las modalidades preferidas que se hace antes incluye todas las combinaciones de grupos particulares y preferidos. La enfermedad anteriormente mencionada es preferiblemente cáncer. Dicho cáncer se selecciona del grupo que incluye, pero no se limita a, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de próstata, cáncer de colon o cáncer de páncreas.
Un cáncer particularmente preferido es cáncer de mama. La evaluación de la enoxaparina con relación a su capacidad para inhibir las heparanasas se realizó como se indica a continuación. La heparina/sulfato de heparán (HS) radiomarcado es degradado por las heparanasas, dando como resultado fragmentos de bajo peso molecular de HS que pueden medirse mediante cromatografía de permeación en gel (FPLC) y recuento de fracciones por centelleo líquido. La heparina sin fraccionar (sal de sodio) de mucosa porcina intestinal (calidad la, 183 USP/mg) se obtuvo de Sigma Biochemicals (Deisenhofen, Alemania). La heparitinasa (HP lyase (EC 4.2.2.8)) se compró en Seikagaku, (Tokyo, Japón). El TSK 4000 era de Toso Haas y las columnas Sepharose Q equipadas con precolumnas se obtuvieron de Pharmacia/LKB (Freiburg, Alemania). Se usó una estirpe celular de fibroblasto del cuello del útero humano para preparar el sulfato de heparán marcado con 35-S (proteoglicanos) mediante marcación metabólica. Esta estirpe celular ha mostrado que produce cantidades relativamente grandes de sulfato de heparán-proteoglicanos (HS-PG), tales como sindecanos y glipican (Drzeniek et al. , Blood 93:2884-2897, 1999). La marcación se consigue mediante incubación de las células a una densidad celular de aprox. 1 x10-6 células/ mi con 33µCi/ml de sulfato-35-S en medio de cultivo de tejido durante 24 horas. A continuación , se recogieron los sobrenadantes y se añadió inhibidor de proteasa PMSF (fluoruro de fenilmetilsulfonilo) (1 mmol/L). Se purificó el sulfato de heparán-proteoglicanos (HS-PG) mediante cromatografía de intercambio aniónico en Sepharose Q, eliminación del sulfato de condroitina/sulfato de dermatan-proteoglicanos que no era necesario, ya que la muestra contenía una cantidad relativamente grande de sulfato de heparán-proteoglicanos y debido a la especificidad de la enzima heparanasa. La heparanasa se preparó a partir de leucocitos de sangre humana periférica (PBL, célula mononuclear de cultivo) y se enriqueció a células polimorfonucleares (PMN) mediante procedimientos de gradiente de ficoll. Las PMN aisladas se ajustaron a 2,5 x 1 0-7 células/ml y se incubaron durante 1 hora a 4°C. A continuación se recogieron los sobrenadantes que contienen la heparanasa, se ajustó el pH a 6,2 (20 mM tampón citrato-fosfato) y se usó inmediatamente o se almacenó en frío en alícuotas a -20°C. 200 µl de sulfato de heparán marcado con 35-S (proteoglicanos) ajustado a aproximadamente 2200 dpm/ml se incubaron a 37°C durante 1 8 horas, con 1 µl del sobrenandante de PMN que contenía heparanasa. A continuación, se aplicaron 200 µl de la muestra a una columna de cromatografía de permeación de gel (FPLC) TSK 4000, se recogieron las fracciones y se analizaron mediante recuento por centelleo líquido. Se calculó la degradación de acuerdo con la siguiente fórmula: % degradación=[[? cuentas (dpm) fracc. 20-33 (HEP) - S
cuentas (dpm) fracc. 20-33 (CONT)] / [ cuentas totales (dpm) fracc.
12-33 (CONT)]] x 100 p.ej. la suma de las cuentas (dpm) en fracciones 20-33 de la muestra después del tratamiento de heparanasa, a partir de esta suma se sustrajeron las cuentas de fondo (dpm) (fracciones 20-33) de la muestra de control. Esta suma de dividió por las cuentas totales (fracciones 12-33) aplicadas a la columna, para calcular el % de degradación. Se usaron factores de corrección para normalizar las cuentas totales de cromatografías diferentes a 2200 cuentas/dpm. Los resultados se dan en porcentaje de degradación. En los experimentos de inhibición, la degradación de la muestra de control (con heparanasa) se estableció a 100 % (degradación) y los valores de % de inhibición se calcularon de acuerdo con ello. No es necesaria una corrección de la actividad de la sulfatasa, ya que no se detectó actividad de sulfatasa. En el ensayo descrito anteriormente se ensayaron los siguientes inhibidores de heparanasa, heparina sin fraccionar (UF-H) y enoxaparina (WSD 3014), a tres concentraciones diferentes. La comparación se realizó en base al peso. Los datos se expresan en porcentaje de inhibición de actividad de heparanasa. Los resultados obtenidos fueron como sigue. Primero, el ensayo de heparanasa se optimizó para los propósitos de este estudio. Por razones prácticas, se estableció el tiempo de incubación del ensayo de degradación en 18 horas. De acuerdo con la eficacia de marcación y el contenido de sulfato de heparán (proteoglicano), las cuentas totales de sulfato de heparán (proteoglicanos) se establecieron a aproximadamente 2200 dpm por muestra, para permitir realizar todos los ensayos con un lote de sulfato de heparán marcado (proteoglicano). La figura 1 a muestra una cromatografía de permeación en gel TSK 4000 de la muestra nativa. La figura 1 b muestra el cambio en la distribución de peso molecular de la muestra que es inducido por la heparanasa. A continuación, se determinó la cantidad de heparanasa que permitía una degradación de aproximadamente el 80 % del sulfato de heparán-proteoglicano (la muestra contenía aproximadamente 35% de sulfato de heparán-proteoglicanos y aproximadamente 65 % de sulfato de condroitina-/dermatan proteoglicanos). Por lo tanto, el intervalo de aproximadamente 1 0-80 % de degradación sería relativamente lineal y sería adecuado para medir el efecto de los inhibidores. La figura 1 c muestra el efecto de 1 µg/ml de heparina sin fraccionar (UFH) en la actividad de la heparanasa con una inhibición de 97,3 %. Después de establecer el ensayo, se ensayó el efecto de la heparina sin fraccionar (U FH) de la mucosa intestinal porcina. La figura 2 muestra la inhibición que depende de la dosis. A la concentración de 1 µg/ml de heparina sin fraccionar (UFH) (concentración final), se observó una inhibición casi completa de la actividad de la heparanasa. La figura 3 muestra la inhibición dependiente de la dosis de la enoxaparina (WSD 3014). A partir de estos datos podría concluirse que la enoxaparina muestra una actividad fuerte de inhibición de la heparanasa. En general, un experto en la técnica, actuando conjuntamente con sus conocimientos personales y la descripción de esta solicitud, será capaz de establecer la formulación adecuada para dicho agente quimioterapéutico, y en particular para el docetaxel, paclitaxel, doxorrubicina, ciclofosfamida y epirrubicína. Las formulaciones adecuadas son preferiblemente las formulaciones comercializadas de dichos agentes quimioterapéuticos. En general, un experto normal en la técnica, actuando conjuntamente con sus conocimientos personales y la descripción de esta solicitud, será también capaz de encontrar la formulación adecuada para la enoxaparina. Por ejemplo, el medicamento consiste en una sal (preferiblemente de sodio o de calcio) o enoxaparina en forma de una composición en la que la sal está combinada con cualquier otro producto farmacéuticamente compatible, que puede ser inerte o fisiológicamente activo. El medicamento según la invención puede usarse de forma intravenosa, subcutánea y oral. Las composiciones estériles para administración intravenosa o subcutánea son generalmente disoluciones acuosas. Estas composiciones también pueden contener adyuvantes, en concreto agentes humectantes, isotonizantes, emulsionantes, agentes dispersantes y estabilizantes. La esterilización puede realizarse de varias maneras, por ejemplo mediante una filtración aséptica, mediante la incorporación de agentes esterilizantes en la composición o mediante irradiación. También pueden prepararse en forma de composiciones sólidas estériles que pueden disolverse en el momento del uso en agua estéril, o en cualquier otro medio estéril para inyección. Como composiciones líquidas para administración oral, es posible usar disoluciones, suspensiones, emulsiones, jarabes y elixires que son aceptables desde un punto de vista farmacéutico, que contienen diluyentes inertes tales como agua, etanol, glicerol, aceites vegetales o aceite de parafina. Estas composiciones pueden comprender sustancias distintas a los diluyentes, por ejemplo productos humectantes, edulcorantes, espesantes, agentes de sabor o estabilizantes. En general, la enoxaparina será administrada en cantidades terapéuticamente eficaces por cualquiera de los modos usuales y aceptables conocidos en la técnica, ya sea sola o en combinación con uno o más agentes quimioterapéuticos. En general, el agente quimioterapéutico será administrado en cantidades terapéuticamente eficaces por cualquiera de los modos usuales y aceptables conocidos en la técnica, ya sea solo o en combinación con uno o más agentes quimioterapéuticos. Una cantidad terapéuticamente eficaz puede variar ampliamente dependiendo de la gravedad de la enfermedad, la edad y salud relativa del sujeto, la potencia del compuesto usado y otros factores. En general, un experto normal en la técnica, actuando conjuntamente con sus conocimientos personales y la descripción de esta solicitud, será capaz de encontrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto para tratar una enfermedad dada. Por ejemplo, la dosis de docetaxel sería de 75 mg/m2/día, 1 hora de infusión intravenosa (iv) repetida 4 veces con 3 semanas de intervalo. La dosis de epurribicina sería de 50 mg/m2/día por infusión iv repetida 4 veces con 3 semanas de intervalo. Por ejemplo, la dosis posible de enoxaparina puede oscilar de 10 a 40 mg de inyección por día, la primera inyección iv seguida de inyecciones subcutáneas (se) repetidas una vez al día durante todo el período de tratamiento. En general, el médico determinará la dosis adecuada en función de la edad, del peso y de todos los demás factores específicos del sujeto que se ha de tratar. Preferiblemente, las dosis adecuadas son las dosis comerciales de enoxaparina y las dosis comerciales de dichos agentes quimioterapéuticos.