MXPA06002871A - Vacuna de piroplasmido - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a una proteína de Piroplásmido o un fragmento inmunogénico de dicha proteína, y a unácido nucleico que codifica dicha proteína de Piroplásmido o dicho fragmento inmunogénico. Además, la invención se refiere a fragmentos de cADN, moléculas de ADN recombinantes y vehículos recombinantes vivos comprendiendo dichoácido nucleico. También la invención se refiere a células huésped comprendiendo dichos fragmentos de cADN, moléculas de ADN recombinantes y vehículos recombinantes vivos. Finalmente, la invención se refiere a vacunas comprendiendo una proteína de Piroplásmido o un fragmento inmunogénico de dicha proteína, a métodos para la preparación de tales vacunas, al uso de tales proteínas o fragmentos para propósitos de vacuna, y a pruebas de diagnóstico.

Description

VACUNA DE PIROPLAS IDO La invención se refiere a una proteína de piroplásmido o un fragmento inmunogénico de dicha proteína, a un ácido nucleico que codifica dicha proteína de piroplásmido o dicho fragmento inmunogénico, a fragmentos de cADN, moléculas de ADN recombinante y vehículos recombinantes vivos que comprenden dicho ácido nucleico, a células huésped que comprenden dichos fragmentos de cADN, moléculas de ADN recombinante y vehículos recombinantes vivos, a vacunas que comprenden una proteína de Piroplásmido o un fragmento inmunogénico de dicha proteína, a métodos para la preparación de tales vacunas, al uso de tales proteínas o fragmentos, y a pruebas de diagnóstico. Babesiosis es una enfermedad, que tiene una ocurrencia geográficamente focal. La razón de esto es que el patógeno se transmite por garrapatas que se alimentan en un cierto receptor de parásitos presentes en una población vertebrada. Solamente cuando los garrapatas están presentes, puede ocurrir Babesiosis. En equilibrio, particularmente en animales indigenosos, el parásito coexiste con el huésped sin causar enfermedad significativa. En muchos casos, la Babesiosis se vuelve un problema debido a las actividades del hombre a través de endogamia de rasgos genéticos y/o transporte de animales a ambientes no familiares donde la Babesiosis es endémica (Callow, L. L. and Dalgliesh, R. J. , 1982, en:"l mmunology of Parasitic Infections", Cohén, S. and Warren, K. S. eds. , p. 475- 526, Blackwell Scientific). La babesiosis también conserva una amenaza como agente zoonótico para humanos, no solamente para humanos inmunocomprometidos (Gray eí al. , 2002, Int. J. Med. Microbiol. , vol. 291 , p. 108-1 1 ). Las señales de enfermedad en Babesiosis naturalmente adquirida usualmente comienzan 7-21 días después de infección. Estos síntomas incluyen, fiebre, anorexia, depresión, anemia, hemoglobinuria y debilidad que se desarrolla rápidamente. Lagrimación incrementada, salivación y temblor muscular comúnmente ocurren. Señales nerviosas pueden desarrollarse en infecciones terminales, y puede ocurrir la muerte cuando la enfermedad no se trata. Las perturbaciones de coagulación conducen a adhesión de eritrocito incrementada. Como un resultado, el paso de sangre a través de la microvasculatura se dificulta, resultando en congestión de órganos internos y volúmenes celulares empacados, disminuidos (PCV). También la ruptura de eritrocitos infectados causa la pérdida de grandes números de eritrocitos. Estos efectos deterioran el suministro de oxígeno a varios tejidos y subsecuentemente conducen al daño del tejido como un resultado de anoxia. Las especies de Babesiidae se han ahora detectado como infectando la mayoría de las especies mamíferas de importancia veterinaria (Kuttler, K. L. , en M. Ristic ed. :"Babesiosis of domestic animáis and man". CRC Press, Inc. , Boca Ratón, FL, 1988): Vaca (B. divergens, B. Bovis, B. bigemina), Puerco (B. trautmanni, B. perroncitoi), Oveja (B. ovis, B. motasi), Caballo (B. equi, B. cabalai), Perro (B. canis, B. rossi, B. vogeli), y Gato (B. felis, B. caty. En todas estas especies la muerte o más o menos pérdidas económicas severas (reducción en calidad o cantidad de carne, leche, lana o descendencia) o reducción severa en el bienestar se causan ya sea como un resultado de la infección por Babesia directamente, o través de la facilitación de infecciones secundarias. Cercanamente relacionados con Babesia se encuentran los parásitos Theileria parasites. Estos también pertenecen al grupo taxonómico de Piroplásmida, y muestran muchas relaciones biológicas y epidemiológicas con Babesia. Las especies Theileria bien conocidas de importancia veterinaria son T. parva, T. annulata, y T. sergent. Existen medicaciones para curar una infección por Babesia o Theileria establecida, por ejemplo, perros, caballos y vacas pueden tratarse con dipropionato de imidocarb. Sin embargo, tal inyección es dolorosa debido a la irritación del tejido. Además sufre las desventajas comunes para tales anti-parásitos: la prevención de una formación de memoria inmunológica, toxicidad potencial, y posible formación de resistencia. Se ha mostrado que Babesiosis y Theileriosis pueden controlarse por vacunación con vacunas vivas (revisada en: Jenkins, M. 2001 , Vet Parasitol. , vol. 101 , p. 291 -31 0). Tales vacunas se producen al recolectar eritrocitos de animales infectados. Para algunas pero no todas las especies babesia los cultivos de eritrocito in Vitro se han desarrollado para incrementar el número de parásitos. Los eritrocitos infectados del animal o los cultivos, también conocidos como "estabilatos", se utilizan entonces para vacunar animales. Los estabilatos para Theileria se producen en una manera similar. De hecho, debido a que la necesidad de una vacuna efectiva es muy alta, los estabilatos de Theileria se han producido de las glándulas salivales de garrapatas infectados. Las desventajas generales de tales vacunas parásitas vivas son que el material de inoculación es grandemente incontrolado, altamente variable en su composición, biológicamente inseguro, y en general el proceso no es ético a través del uso de un gran número de animales experimentales. Adicionalmente, los parásitos de piroplásmido son muy inestables, deben mantenerse lejos de oxígeno libre o se morirán rápidamente. Alternativamente, ni los eritrocitos infectados por parásitos se utilizan para vacunación, pero si el suero del huésped infectado, o el sobrenadante de un cultivo in Vitro. Tales líquidos circundantes de eritrocitos infectados contienen los así llamados Antígenos de Parásito Solubles (SPA). Poco se sabe acerca de la composición de estas preparaciones. Se ha sugerido que la actividad protectora se debe a la capacidad inmunizante de antígenos de la cubierta de superficie de merozoito en el suero o medio, una estructura que se deja detrás durante el proceso de invasión del eritrocito (Ristic, M. and Montenegro-James, S. , 1988, en: "Babesiosis of Domestic Animáis and Man", Ristic, M. ed. , p. 163-190, CRC Press). Además, durante cultivo in vitro un número de parásitos muere, así los antígenos parásitos (internos) se liberan en el medio de cultivo. Tales preparaciones SPA son capaces de inducir una respuesta inmune que, aunque no afecta necesariamente al parásito, reduce suficientemente las manifestaciones clínicas de infección (Schetters and Montenegro-James, S. , 1995, Parasitology Today, vol. 1 1 , p. 456-462). Por ejemplo, SPA de sobrenadante de cultivo de un cultivo in vitro de eritrocitos infectados por parásito Babesia canis parasite (PiroperroO) induce la inmunidad contra infección por cambio homólogo (pero no heterólogo). En general, las vacunas a base de SPA comparten las mismas desventajas que las vacunas parásitas vivas, en que no son grandemente caracterizadas, altamente variables y requieren muchas precauciones para ser biológicamente seguras. Adicionalmente, la producción de tales vacunas es muy difícil de escalar, ya que requiere la infección, alojamiento y recolección de las muestras de animales experimentales para proporcionar parásitos, eritrocitos y/o suero. Es un objeto de la invención proporcionar proteínas y fragmentos de los mismos que pueden servir en vacunas efectivas para la prevención o mejora de infección con un organismo de piroplásmido, que se definen bien, son seguras, estables y con una producción que es fácil de escalar. Se encontró sorprendentemente ahora que una vacuna comprendiendo una o más de cinco proteínas de Piroplásmido, o un fragmento inmunogénico de una o más de dichas proteínas incorpora todas estas características ventajosas. Muchas desventajas de las vacunas SPA y de parásito vivo pueden ahora superarse por el uso de tal proteína de Piroplásmido o de un fragmento inmunogénico de dicha proteína en vacunas. Tal proteína se define altamente, es biológicamente segura, el producto puede estabilizarse mucho mejor que todos los parásitos vivos, y su producción puede escalarse fácilmente. Se encontró sorprendentemente que los antisueros se originaron contra proteínas de piroplásmido o fragmentos inmunogénicos de dichas proteínas, inhibieron efectivamente la invasión de parásitos en células huésped, e interfirieron así con el ciclo de infección de los parásitos. Las proteínas son por lo tanto llamadas, antígeno inhibidor de invasión (HA). El proceso de la invención por un parásito de piroplásmido de su célula huésped es uno de las etapas críticas en el establecimiento de infección parásita. Al interferir en este nivel a través de la inducción de anticuerpos que interfieren con esta etapa, la entrada inicial de parásitos en las células del huésped se inhibe. Esto previene, o al menos disminuye, el nivel de infección o las señales clínicas de enfermedad en un huésped, y consecuentemente la severidad de enfermedad. También la difusión adicional de la enfermedad en el ambiente se para o disminuye debido a que menos garrapatas se vuelven portadores cuando se alimentan en huéspedes vacunados, ergo la presión de infección en el ambiente se disminuye. I IA's de piroplásmido, que pueden inducir respuestas inmunes protectoras que conducen a anticuerpos que inhiben la invasión por parásito de Piroplásmido, pueden detectarse en parásitos de Piroplásmido, en cultivos de parásitos proliferantes, y en células infectadas por antisueros específicos. Estos antisueros específicos reconocen estos HA también en Western blots 1 -D y 2-D (2 dimensiones) de listados de células infectadas, de parásitos o sus cultivos. IIA's de piroplásmido pueden expresarse en un sistema de expresión. Proteínas, o sus fragmentos, expresados en esta manera pueden utilizarse para formular una vacuna que protege a los mamíferos de enfermedades o sus señales clínicas en la infección por un organismo de Piroplásmido, a través de la inducción de linfocitos específicos de antígeno o anticuerpos específicos. Por lo tanto la invención proporciona una proteína de Piroplásmido caracterizada porque dicha proteína comprende una secuencia de aminoácidos teniendo una similitud de al menos 70% , preferentemente 75%, más preferentemente 80, 85, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, 99, o 100% de similitud en ese orden de preferencia, con la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 2 o 4, o un fragmento ¡nmunogénico de dicha proteína. La invención también proporciona una proteína de Piroplásmido caracterizada porque dicha proteína comprende una secuencia de aminoácidos teniendo una similitud de al menos 70%, preferentemente 75%, más preferentemente 80, 85, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, 99, o 1 00% de similitud en ese orden de preferencia, con la secuencia de aminoácidos representada en SEQ I D NO: 6 o 8, o un fragmento inmunogénico de dicha proteína. La invención proporciona adicionalmente una proteína de Piroplásmido caracterizada porque dicha proteína comprende una secuencia de aminoácidos teniendo una similitud de al menos 70%, preferentemente 75%, más preferentemente 80, 85, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, 99, o 100% de similitud en ese orden de preferencia, con la secuencia de aminoácidos representada en SEQ I D NO: 1 0, o un fragmento inmunogénico de dicha proteína. Los ejemplos típicos de las proteínas de Piroplásmido de la ¡nvención son: - Piroplásmido HA número 1 de Babesia bovis (BIIA1 ) la secuencia de aminoácidos del cual se presenta en SEQ ID NO:2; - Piroplásmido HA número 1 de Theileria annulata (TI IA1 ) la secuencia de aminoácidos del cual se presenta en SEQ I D NO:4; - Piroplásmido HA número 2 de B. Bovis (BI IA2) la secuencia de aminoácidos del cual se presenta en SEQ ID NO:6; - Piroplásmido HA número 2 de T. annulata (TI IA2) la secuencia de aminoácidos del cual se presenta en SEQ ID NO:8; - Piroplásmido HA número 3 de ß. Bovis (BI IA3) la secuencia de aminoácidos del cual se presenta en SEQ ID NO: 10. El término "proteína" se entiende que incorpora una cadena molecular de aminoácidos. Una proteína no es de una longitud específica o forma y puede, si se requiere, modificarse in vivo o in vitro, por ejemplo, por glicosilación, amidación, carboxilación, fosforilación o cambios en doblado espacial. Entre otros, los péptidos, oligopéptidos y polipéptidos se incluyen dentro de la definición de proteína. Una proteína puede ser de origen biológico y/o sintético. Una "proteína de Piroplásmido" de acuerdo a la invención es una proteína, que se obtiene de un organismo de los Piroplásmidos. Preferentemente, la proteína de piroplásmido se obtiene de un organismo seleccionado del grupo que consiste de las especies Babesia divergens, B. Bovis, B. motasi, B. caballi, B. equi, B. canis, B. rossi, B. vogeli, B. felis, B. cati, B. ovis, B. trautmanni, B. bigemina, B microti, B. gibsoni, Theileria annulata, T. parva, T. equi, T. felis, T. canis y T. sergenti. Más preferentemente, la proteina de Piroplásmido se obtiene de un organismo seleccionado del grupo que consiste de las especies Babesia bovis,, B. caballi, B. equi, B. canis, B. rossi, B. bigemina, Theileria annulata, T. parva y T. equi. Aún más preferentemente, la proteína de Piroplásmido se obtiene de un organismo seleccionado del grupo que consiste de las especies Babesia bovis y Theileria annulata. Más preferentemente, la proteína de Piroplásmido se obtiene de Babesia bovis. Con respecto a la clasificación taxonómica actual, la persona experta se dará cuenta de que puede cambiar con el tiempo a medida que nuevas vistas conducen a la reclasificación en nuevos u otros grupos taxonómicos. Sin embargo, ya que esto no cambia el repertorio de la proteína del organismo incluido, solamente su clasificación, tales organismos reclasificados se consideran dentro del alcance de la invención. Esto es específicamente relevante para tales familias cercanamente relacionadas como Babesiidae y Theileriidae. Por ejemplo: Babesia equi se reclasifica recientemente como Theileria equi. Para ser antigénico, un fragmento de una proteína necesita ser de una cierta longitud; fragmentos demasiado pequeños no se procesarán por células que presentan antígeno en fragmentos que son capaces, como tales, de asociarse con moléculas MHC, tal asociación se requiere para presentación del antígeno apropiada en linfocitos. El receptor MHC I uniendo un fragmento de antígeno que comprende el epítopo consiste de al menos 8-1 1 aminoácidos, y para receptor MHC II uniendo al menos 1 1 -15 aminoácidos (revisado por ejemplo, por R. N. Germain & D. H. Margulíes, 1993, Annu. Rev. Immunol. , vol. 1 1 , p. 403-450, en:"The biochemistry and cell biology of antigen processing and presentation"). Los fragmentos de proteína más cortos que éste pueden no ser antigénicos como tales: no necesitan acoplarse a un vehículo, tal como KLH, BSA o lo similar, utilizando técnicas conocidas en la materia. Cuando se acoplan tales fragmentos cortos pueden ser capaces de inducir una respuesta inmune que está dentro del alcance de la invención.

Para la invención, un "epítopo" es esa parte de una molécula antigénica que reacciona con el receptor de antígeno de un linfocito T y/o B. Un epítopo de acuerdo con la invención por lo tanto inducirá y/o activar las células T y/o B específicas de manera que estas células dan origen a una reacción inmune que interfiere con el curso de una infección o enfermedad. De esta manera, a través de tales epítopos, una proteína puede inducir los anticuerpos y/o generar una respuesta inmune. Un "fragmento inmunogénico" se entiende por un fragmento antigénico que contiene epítopo de una proteína de Piroplásmido que tiene la capacidad de inducir respuestas inmunes dirigidas contra tales proteínas de piroplásmido, con la provisión de que tales anticuerpos son capaces de interferir con el proceso de invasión. Se explicará abajo como tales fragmentos inmunogénicos pueden encontrarse. Un fragmento ¡nmunogénico de una proteína de piroplásmido de acuerdo a la invención comprende al menos 10 aminoácidos tomados de la secuencia de aminoácidos de una proteína de piroplásmido de acuerdo a la invención. Preferentemente tal fragmento comprende 12, 1 5, 20, 30, 40, 50, 75, 1 00, 150, 200 o 300 aminoácidos, en ese orden de preferencia, tomados de la secuencia de aminoácidos de una proteína de piroplásmido de acuerdo a la invención. Por ejemplo, un fragmento inmunogénico de una proteína de piroplásmido de acuerdo a la ¡nvención se forma por una parte de la proteína que carece de la secuencia de señal de terminal N y/o la secuencia de terminal C. Otros fragmentos son, por ejemplo, aquellos comprendiendo un epítopo específico de una proteína de Piroplásmido HA. Tales epítopos pueden determinarse por los métodos subrayados abajo. Tales fragmentos ¡nmunogénicos se encuentran dentro del alcance de la invención. La identificación de fragmentos inmunogénicos y/o epítopos de una proteína de Piroplásmido de acuerdo a la invención, puede realizarse fácilmente por una variedad de técnicas directas, por ejemplo, por el método PEPSCAN así llamado, o a través de algoritmos de computadora que hacen comparaciones con fragmentos conocidos y/o epítopos. El método PEPSCAN (WO 84/03564, y WO 86/06487, y H. Geysen eí al, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 1984, vol. 81 , p. 3998-4002, y J. of Immunol. meth. 1987, vol. 102, p. 259-274), es un ensayo para realizar, un método rápido y bien establecido para la detección de determinantes inmunológicos de una proteína. Comprende la síntesis de una serie de fragmentos de péptido progresivamente cubriendo la proteína bajo estudio, y prueba subsiguiente de estos polipéptidos con anticuerpos específicos a la proteína para identificar cual de estos son capaces de unirse al receptor de antígeno de los linfocitos T y/o B. Tales anticuerpos para las proteínas de acuerdo a la invención pueden obtenerse al hacer anticuerpos policlonales o monoclonales, al utilizar técnicas bien conocidas en la materia. El uso de algoritmos de computadora en la designación de fragmentos de proteína específicos como los epítopos inmunológicamente importantes en la base de su acuerdo secuencial y/o estructural con epítopos que se conocen, también es una técnica bien conocida. La determinación de estas regiones puede basarse en una combinación de los criterios de hidrofilicidad de acuerdo a Hopp and Woods (Proc. Nati. Acad. Sci. USA 1981 , vol. 78, p. 3824-3828), y los aspectos de la estructura secundaria de acuerdo a Chou and Fasman (Advances in Enzymology 1987, vol. 47, p. 45-148, y Patente de EE. UU. 4,554, 1 01 ). Los epítopos inmunogénicos pueden, del mismo modo, predecirse de la secuencia de aminoácidos de la proteína por computadora con la ayuda de criterio de anfificlicidad de Berzofsky (Science 1987, vol. 235, p. 1059-1 062 y solicitud de patente de EE. UU. NTIS US 07/005,885). Una revisión condensada del uso de estos métodos se encuentra en Shan Lu (principios comunes: Tibtech 1991 , vol. 9, p. 238-242) , Lu (revisión: Vaccine 1992, vol. 1 0, p. 3-7), and Berzofsky (epítopos de VIH; 1991 , The FASEB Journal, vol. 5, p. 2412-2418). Una ilustración de la efectividad de utilizar estos métodos se publica por H. Margalit eí al (J. of Immunol. 1 987, vol. 138, p. 2213-2229) que describe las tasas de éxito de 75 % en la predicción de epítopos de célula T utilizando tales métodos. Aún una prueba adicional es la predicción exitosa de los 6 péptidos antigénicos de BI IA1 and BIIA2, como se subraya en el Ejemplo 1 , sección 1 .1 . 5. Subsiguientemente, debe determinarse si un epitopo encontrado utilizando los métodos descritos arriba es, sin embargo, capaz de interferir con el proceso de invasión. Sin embargo, esto puede hacerse, muy rápida y fácilmente en un experimento de inhibición de invasión in vitro, simple. Tal experimento se describe en el Ejemplo 1 .1 .1 1 . El porcentaje de similitud de una secuencia de aminoácidos con una proteína de acuerdo a la invención debe determinarse por la alineación del aminoácido a la secuencia de aminoácidos de longitud completa de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, o 10. El porcentaje de similitud con una proteína de acuerdo a la invención debe determinarse con el programa de computadora "BLAST 2 SEQUENCES" al seleccionar el subprograma: "BlastP" (T. Tatusova & T. Madden, 1999, FEMS Microbiol. Letters, vol. 174, p. 247-250), que puede encontrarse en www. ncbi. nlm.nih. gov/blast/bl2seq/bl2. html. La matriz de comparación que se utilice es: "Blosum62", con los parámetros de falla: penalidad de espacio abierto 1 1 ; penalidad de espacio de extensión: 1 ; y espacio x_caída: 50. Este programa lista el porcentaje de aminoácidos que son idénticos como "identidades", y el porcentaje de aminoácidos que son similares como "positivos", Los aminoácidos "similares" son aquellos aminoácidos que son idénticos más a aquellos que son equivalentes, los aminoácidos "equivalentes" se describen abajo. Se entenderá que, para una proteína de Piroplásmido particular, las variaciones naturales existen entre las proteínas asociadas con cepas o especies individuales de Piroplásmidos. Estas variaciones pueden demostrarse por (una) diferencia(s) de aminoácidos en la secuencia total o por eliminaciones, substituciones, inserciones, inversiones o adiciones de (un) aminoácido(s) en dicha secuencia. Las substituciones de aminoácidos, que no alteran significativamente las actividades biológicas e inmunológicas, se han descrito, por ejemplo, por, Neurath et al. (1979, en:"The Proteins", Academic Press New York). Los reemplazos de aminoácidos entre los aminoácidos relacionados o reemplazos que han ocurrido frecuentemente en evolución son: es decir, Ser/Ala, Ser/Gly, Asp/Gly, Asp/Asn, lleNal (ver Dayhof, M. D. , 1978, "Atlas of protein sequence and structure", Nat. Biomed. Res. Found. , Washington D. C. vol. 5, suppl. 3). Otras substituciones de aminoácidos comunes incluyen Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, AlaNal, Thr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Leu/lie, LeuNal y Ala/Glu. Tales aminoácidos comúnmente relacionados y substituidos se denominan "equivalentes". En base a esta información, Lipman y Pearson desarrollaron un método para comparación de proteína rápida y sensible (Science 1985, vol. 227, p. 1435-1441 ) y determinar la similitud funcional entre las proteínas. Tales substituciones de aminoácido de las modalidades ejemplificativas de esta ¡nvención, así como también variaciones teniendo eliminaciones y/o inserciones se encuentran dentro del alcance de la invención siempre que las proteínas resultantes retienen la capacidad de inducir respuestas inmunes que inhiben la proliferación del parásito de Piroplásmido, por ejemplo, anticuerpos que inhiben la invasión por el parásito de Piroplásmido. Tales variaciones en la secuencia de aminoácidos de una cierta proteína de Piroplásmido de acuerdo a la invención se consideran como homólogos biológicos o funcionales, y se encuentran dentro del alcance de la invención. Esto explica el porque una proteína de Piroplásmido de acuerdo a la invención, cuando se aisla de diferentes especies de Piroplásmido, puede tener una similitud debajo del 70% con, por ejemplo, las secuencias de aminoácidos representadas en SEQ I D NO: 2, 4, 6, 8, o 1 0 mientras aún se represente la misma proteína con las mismas características, en el ejemplo presentado: para ser capaz de inducir los anticuerpos que inhiben la invasión de parásito de Piroplásmido. Cuando se compara con las proteínas de píroplásmido de acuerdo a la invención entre ellas mismas, las proteínas de Piroplásmido de acuerdo a la invención obtenidas de diferentes organismos de Piroplásmido típicamente tienen más del 50% de similitud de aminoácidos; cuando se obtienen de diferentes especies Babesia, tales proteínas típicamente tendrán más del 85% de similitud, y cuando se obtienen de diferentes aislados de ß. Bovis, tales proteínas típicamente tendrán más del 95% de similitud de aminoácidos. La manera preferida de producir las proteínas de Piroplásmido de acuerdo a la invención es al utilizar las técnicas de ingeniería genética y sistemas de expresión recombinante. Estas pueden comprender utilizar ácidos nucleicos, fragmentos de cADN, moléculas de ADN recombinante, vehículos recombinantes vivos y/o células huésped. Por lo tanto, otro aspecto de la invención se refiere a un ácido nucleico, caracterizado porque dicho ácido nucleico codifica una proteína de Piroplásmido de acuerdo a la invención, o un fragmento inmunogénico de dicha proteína. En una modalidad el ácido nucleico de acuerdo a la invención comprende la secuencia de ácidos nucleicos representada en SEQ ID NO: 1 , 3, 5,7, o 9. El término "ácido nucleico" se entiende que incorpora una cadena molecular de ácidos ribonucleótidos o desoxi. Un ácido nucleico no es de una longitud específica, por lo tanto, los polinucleótidos, genes, estructuras de lectura abierta (ORF's), sondas, cebadores, enlazadores, espaciadores y adaptadores, consistiendo de AND y/o ARN, se incluyen dentro de la definición o ácido nucleico. Un ácido nucleico puede ser de origen biológico y/o sintético. El ácido nucleico puede ser una forma de un solo filamento o de doble filamento. El filamento único puede estar en la orientación se sentido o anti-sentido. También se ¡ncluye dentro de la definición los ARNs o ADNs modificados. Las modificaciones en las bases del ácido nucleico pueden hacerse, y bases tales como Inopina pueden incorporarse. Otras modificaciones pueden incluir, por ejemplo, modificaciones de la estructura. El término "codifica" significa incorporar: proporcionando la posibilidad de expresión de proteína, es decir, a través de la transcripción y/o traslación cuando se acerca al contexto correcto.

Un ácido nucleico de acuerdo a la invención codifica una proteína de Piroplásmido según la invención, o codifica un fragmento inmunogénico de dicha proteína. Un ácido nucleico de acuerdo a la invención tiene una longitud mínima de 30 nucleótidos. Preferentemente un ácido nucleico de acuerdo a la invención comprende 40, 50, 100, 250, 500, 1000, o 1500 nucleótidos en ese orden de preferencia. Un ácido nucleico de acuerdo a la invención, por ejemplo, es un ácido nucleico que codifica una proteína de Piroplásmido de acuerdo a la invención que carece de la secuencia de señal de terminal N y/o la secuencia de terminal C. Otros ácidos nucleicos pueden comprender una secuencia que codifica un epítopo específico de una proteína de Piroplásmido. Tales ácidos nucleicos se encuentran dentro del alcance de la invención. Excluidas de los ácidos nucleicos de acuerdo a la invención se encuentran las siguientes secuencias: • con respecto a BIIA1 (SEQ ID NO: 1 ), las secuencias EST: o B_bovis-1 1 e05. plc o B_bovis-344e09.qlc o B_bovis-384f06.qlc o B_bovis-261 d05.qlc o B_bovis-5e5.plc o B_bovis-373g01 .qlc o B_bovis-418b06.qlc o B_bovis-375d02.qlc o Bbovis-407d03.qlc o B_bovis-284-f07.qlc • con respecto a BI IA1 (SEQ ID NO: 1 ), las contigs ensambladas: o Bbovis. CONTIG.1029 o Bbovis. CONTIG. 227 • con respecto a BI IA2 (SEQ ID NO: 5) las secuencias EST: o B_bovis-417g 12.qlc o B_bovis-376a10.qlc • con respecto a TI IA2 (SEQ I D NO: 7), la contig ensamblada: o gnl|Sanger_5874|Contig1548 • con respecto a TI IA1 (SEQ ID NO: 3), la contig ensamblada: o gnljSanger_5874|Contig 1 Las secuencias EST y contig considerando BI IA1 y BIIA2 se encuentran disponibles a través de la página de Internet www. sanger. ac. uk/proiects/b bovis/. Las secuencias contig considerando TI IAI y TIIA2 se encuentran disponibles a través del servidor NCBI BLAST al seleccionar Apicomplexa de la página de internet: http://www. ncbi.nlm.nih.gov/sutils/genom tree.cgi?orqanism=euk. El porcentaje de identidad entre los ácidos nucleicos de acuerdo a la invención se determina con el programa de computadora "BLAST 2 SEQUENCES" al seleccionar el sub_programa: "BlastN" (T. Tatusova & T. Madden, 1999, FEMS Microbiol. Letters, vol. 174, p. 247-250) , que puede encontrarse en www.ncbi.nlm.nih. gov/blast/b!2seq/bl2. html. Los parámetros que se utilizan son parámetros de falla: recompense por un acoplamiento: +1 ; penalidad por una diferencia: -2; penalidad de espacio abierto: 5; penalidad de espacio de extensión: 2 ; y espacio x_caída: 50. A pesar de la salida del programa BlastP descrito arriba, el programa BlastN no enlista similitudes, solamente identidades; el porcentaje de nucleótidos que son idénticos se indican como "identidades". Se sabe bien en la materia, que muchos ácidos nucleicos diferentes pueden codificar una y la misma proteína. Este es un resultado de lo que se conoce en biología molecular como "temblado" o la "degeneración del código genético", en donde varios codones o tripletes de mARN causarán que el mismo aminoácido se una a la cadena de aminoácidos desarrollándose en el ribosoma durante la traslación. Es más prevalerte en la segunda y especialmente la tercer base de cada triplete codificando un aminoácido. Este fenómeno puede resultar en una heterología de aproximadamente 30% para dos ácidos nucleicos diferentes que aún codifican la misma proteína. Por lo tanto, dos ácidos nucleicos teniendo una identidad de secuencia de nucleótido de aproximadamente 70% aún puede codificar una y la misma proteína. Otro planteamiento para decidir si una cierta secuencia de ácidos nucleicos es o no una secuencia de ácidos nucleicos de acuerdo a la invención, se refiere a la cuestión si esa cierta secuencia de ácidos nucleicos se hibridiza bajo condiciones exigentes a cualquiera de las secuencias de nucleótidos representada en SEQ ID NO: 1 , 3, 5, 7, y 9.

Si una secuencia de ácidos nucleicos se hibridiza bajo condiciones exigentes a la secuencia de nucleótidos como se representa en SEQ ID NO: 1 , 3, 5, 7, y 9, se considera que es una secuencia de ácidos nucleicos de acuerdo a la invención. La definición de condiciones exigentes se sigue de la fórmula para la temperatura de fusión Tm de Meinkoth and Wahl (1984, Anal. Biochem. , vol. 138, p. 267-284): Tm = [81 .5°C + 16.6(log M) + 0.41 (%GC) -0.61 (% formamida)-500/L]- 1 °C/1 % diferencia. En esta fórmula, M es molaridad de cationes monovalentes; %GC es el porcentaje de nucleótidos de guanosina y citosina en el AND; L es la longitud del híbrido en pares bases; y diferencia es la falta de parecido idéntico. Las condiciones exigentes son aquellas condiciones bajo las cuales las secuencias de ácidos nucleicos o fragmentos de la misma aún se hibiridizan, si tiene una diferencia de 30% (es decir, si son solamente el 70% idénticas) a la secuencia de ácidos nucleicos como se representa en cualquiera de las SEQ ID NO's: 1 , 3, 5, 7, y 9. Los ácidos nucleicos que codifican las proteínas de Piroplásmído de acuerdo a la invención pueden obtenerse de especies de miembros de la Piroplásmida. Sin embargo, en una modalidad más preferida, los ácidos nucleicos que codifican una proteína de Piroplásmido o fragmentos inmunogénicos de dicha proteína de acuerdo con la ¡nvención se caracterizan en que se obtienen de un organismo seleccionado del grupo que consiste de las especies Babesia divergens, B. Bovis, B. motasi, B. caballi, B. equi, B. canis, B. rossi, B. vogeli, B. felis, B. cati, B. ovis, B. trautmanni, B. bigemina, B. microti, B. gibsoni, Theileria annulata, T. parva, T. equi, T. felis, T. canis y T. sergenti. Más preferentemente los ácidos nucleicos se obtienen de un organismo seleccionado del grupo que consiste de las especies Babesia bovis,, B. caballi, B. equi, B. canis, B. rossi, B. bigemina, Theileria annulata, T. parva y T. equi. La posibilidad de que las especies se reclasifiquen taxonómicamente o describen como nuevas especies se ha tratado arriba. Ya que esto no cambia el genoma del organismo, tales organismos reclasificados también se encuentran dentro del alcance de la invención. También dentro del alcance de la ¡nvención se encuentran las Proteínas de Piroplásmido, fragmentos inmunogénicos de dichas proteínas y ácidos nucleicos que codifican tales Proteínas de Piroplásmido o fragmentos de las mismas de Piroplásmidos no mamíferos, debido a la alta conservación de los genes y proteínas de las Proteínas de Piroplásmido de acuerdo a la invención. Tales proteínas relacionadas o sus genes pueden llamarse parálogos u ortólogos. Los ácidos nucleicos que codifican una Proteína de Piroplásmido de acuerdo a la invención pueden obtenerse, manipularse y expresarse por técnicas de biología molecular estándar que se conocen bien por los expertos en la material, y se explican en mayor detalle en libros de texto estándar como Sambrook & Russell: "Molecular cloning: a laboratory manual" (2001 , Cold Spring Harbour Laboratory Press; ISBN: 0879695773). Tal tipo de manipulaciones es la síntesis de un fragmento de cADN de ARN, preferentemente de mARN que puede aislarse de parásitos, o células infectadas por parásitos u organismos por técnicas conocidas en la materia. Por lo tanto, en otro aspecto, la invención se refiere a un fragmento de cADN de acuerdo a la invención. El método preferido para obtener un fragmento de cADN por transcripción inversa es a través de una técnica de reacción en cadena de polimerasa (PCR). Técnicas estándar y procedimientos para realizar PCR, se describen por ejemplo, extensamente en C. Dieffenbach & G. Dveksler: "PCR primers: a laboratory manual" (1 995, CSHL Press, ISBN 879694473). En una modalidad preferida, la invención se refiere a una molécula de ADN recombinante que comprende un ácido nucleico de acuerdo a la invención, o un fragmento de cADN de acuerdo a la invención, dicho ácido nucleico o dicho fragmento de cADN estando bajo el control de un promotor funcionalmente enlazado. Para construir una molécula de ADN recombinante de acuerdo a la ¡nvención, preferentemente los plásmidos de ADN se emplean. Tales plásmidos son útiles, por ejemplo, para aumentar la cantidad de inserción de ADN, como una sonda, y como herramienta para manipulaciones adicionales. Ejemplos de tales plásmidos para clonar son plásmidos de las series pBR, pUC, y pGEM; todas estas son variables de varios proveedores comerciales. El ácido nucleico que codifica una proteína de Piroplásmido de acuerdo a la invención o un fragmento inmunogénico de dicha proteína, puede clonarse en plásmidos separados y modificarse para obtener la confirmación deseada utilizando técnicas bien conocidas en la materia. Sin embargo, también pueden combinarse en una construcción para propósitos de expresión y clonación mejorados. Las modificaciones a las secuencias de codificación que codifican una proteína de Piroplásmido de acuerdo a la invención o un fragmento inmunogénico de la misma puede realizarse, por ejemplo, al utilizar la digestión de la enzima de restricción, por mutaciones dirigidas de sitio, o por técnicas de reacción en cadena de polimerasa (PCR). Para los propósitos de detección o purificación de proteína, o mejora del nivel de expresión, ácidos nucleicos adicionales pueden agregarse. Esto puede resultar en el ácido nucleico final comprendido en el fragmento de cADN, o en la molécula de ADN recombinante siendo más larga que las secuencias requeridas para codificar una proteína de Piroplásmido. Cuando tales elementos adicionales se insertan en la estructura, estos se vuelven una parte integral de la proteína de Piroplásmido que se expresa. Tales proteínas fusionadas también se encuentran dentro del alcance de la invención. Un requerimiento esencial para la expresión de un ácido nucleico, fragmento de cADN, o molécula de ADN recombinante es que se enlazan operativamente a una secuencia reguladora transcripcional de manera que es capaz de controlar la transcripción del ácido nucleico, cADN, o ADN recombinante. Las secuencias reguladoras transcripcionales se conocen bien en la materia y comprenden, es decir, promotores y aumentadores. Es obvio para aquellos expertos en la materia que la elección de un promotor se extiende a cualquier promotor eucariótico, procariótico o viral capaz de dirigir la transcripción genética, siempre que el promotor sea funcional en el sistema de expresión utilizado. En una modalidad más preferida, la invención se refiere a un vehículo recombinante vivo que comprende un ácido nucleico de acuerdo a la invención o un fragmento de cADN de acuerdo a la invención, dicho ácido nucleico o dicho fragmento de cADN estando bajo el control de un promotor funcionalmente enlazado, o una molécula de ADN recombinante de acuerdo a la invención. Tales vehículos recombinantes vivos (LRC's) son, por ejemplo, microorganismos tales como bacterias, parásitos y virus en los cuales la información genética adicional se ha clonado, en este caso un ácido nucleico, un cADN, o una molécula de ADN recombinante, codificando una proteína de Piroplásmido de acuerdo a la invención o un fragmento inmunogénico del mismo. Los mamíferos objetivo inoculados con tales LRC's producirán una respuesta inmunogénica no solamente contra los inmunogenes del vehículo, sino que también contra la(s) proteína(s) heteróloga(s) o fragmento(s) inmunogénico(s) para los cuales el código genético se clona adicionalmente en LRC, por ejemplo, una secuencia que codifica una proteína de Piroplásmido de acuerdo a la ¡nvención, o un fragmento inmunogénico de la misma. Como un ejemplo de LRC's bacterianos, las cepas de Salmonella atenuadas conocidas en la materia pueden utilizarse de manera atractiva. Alternativamente, los parásitos del vehículo recombinante se han descrito por Vermeulen, A. N. (I nt. Journ. Parasitol. 1998, vol. 28, p. 1 121 -1 130). Los virus LRC pueden utilizarse como una manera de transportar un ácido nucleico en una célula objetivo. Los virus del vehículo recomblnante vivo también se llaman virus de vector. Los virus con frecuencia utilizados como vectores son virus Vaccinia (Panicali eí al. 1 982, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, vol. 79, p. 4927), Herpesvirus (EP 0473210-A2), y Retrovirus (Valerio, D. et al. 1 989, en: Baum , S. J. , Dicke, K. A. , Lotzova, E. and Pluznik, D. H. (Eds.), "Experimental Haematology today", Springer Verlag, New York: pp. 92-99). La técnica de recombinación homologa in vivo, bien conocida en la materia, puede utilizarse para introducir un ácido nucleico recombinante de acuerdo a la invención en el genoma de una bacteria LCR, parásito o virus de elección, capaz de inducir la expresión del ácido nucleico insertado, cADN o ADN recombinante de acuerdo a la invención en el animal huésped.

Los sistemas de expresión celular bacteriana, de levadura, fúngica, insecto y vertebrado se utilizan como células huésped para propósitos de expresión muy frecuentemente. Tales sistemas de expresión se conocen bien en la materia y generalmente están disponibles, por ejemplo, comercialmente a través de Invitrogen (los Países Bajos). Por lo tanto, en una modalidad aún más preferida, la invención se refiere a una célula huésped que comprende un ácido nucleico de acuerdo a la invención, un fragmento de cADN de acuerdo a la invención, dicho ácido nucleico o dicho fragmento de cADN estando bajo el control de un promotor funcionalmente enlazado, una molécula de ADN recombinante de acuerdo a la invención, o un vehículo recombinante vivo de acuerdo a la invención. Una célula huésped a utilizarse para expresión de una proteína de Piroplásmido de acuerdo a la invención puede ser una célula de origen bacteriano, por ejemplo, de Escherichia coli, Bacillus subtilis, Lactobacillus sp. o Caulobacter crescents, en combinación con el uso de plásmidos derivados de bacteria o bacteriófagos para expresar la secuencia que codifica una proteína de Piroplásmido. La célula huésped también puede ser de origen eucariótico, por ejemplo, células de levadura en combinación con moléculas de vector específicas de levadura, o células eucarióticas más altas, como células de insecto (Luckow et al. , 1988, Bio-technology, vol. 6, p. 47-55) en combinación con vectores o baculovirus recombinantes; células vegetales en combinación, por ejemplo, vectores a base de plásmido Ti o vectores virales de planta (Barton, K. A. et al. , 1 983, Cell, vol.32, p. 1033); o células de mamífero como células Hela, células de ovario de hámster chino o células de riñon de felino Crandell-Rees, también con vectores apropiados o virus recombinantes. Después de estos sistemas de expresión, la célula vegetal, o sistemas de expresión a base de parásito son sistemas de expresión atractivos. Los sistemas de expresión de parásito son, por ejemplo, descritos en la Solicitud de Patente Francesa, número de publicación 2 714 074, y en la publicación NTIS de EE. UU. no. US 08/0431 09 (Hoffman, S. & Rogers, W. , 1993). Los sistemas de expresión de célula vegetal para polipéptidos para aplicación biológica son, por ejemplo, tratados en R. Fischer et al. (Eur. J. of Biochem. 1999, vol. 262, p. 810-816), y J. Larrick et al. (Biomol. Engin. 2001 , vol. 1 8, p. 87-94). La expresión también puede realizarse en los así llamados sistemas de expresión libres de célula. Tales sistemas comprende todos los factores esenciales para expresión de un ácido nucleico recombinante apropiado, operativamente enlazado a un promotor que funcionará en ese sistema particular. Ejemplos son el sistema de lisato E. coli (Roche, Basel, Suiza), o el sistema de lisato de reticulocito (Promega corp. , Madison, USA). La proteína de piroplásmido de acuerdo a la ¡nvención o fragmentos inmunogénicos de dicha proteína se adecúan bien para producción de una vacuna. Tales proteínas o fragmentos pueden obtenerse de parásitos, o de animales o células infectadas con parásitos de Piroplásmido. Sin embargo, mucho más conveniente es el uso de los ácidos nucleicos que codifican la proteína de Piroplásmido de acuerdo a la invención o un fragmento inmunogénico de dicha proteína, en un sistema de expresión. Esto se sigue por la recolección de las proteínas o fragmentos producidos y formulando estos en una vacuna de subunidad de proteína, por ejemplo, mezclando una proteína de piroplásmido de acuerdo a la invención un fragmento inmunogénico de dicha proteína, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Por lo tanto, aún otro aspecto de la invención se refiere a una vacuna que comprende una proteína de acuerdo a la invención o un fragmento inmunogénico de dicha proteína, un ácido nucleico, un fragmento de cADN, una molécula de ADN recombinante, un vehículo recombinante vivo, o una célula huésped de acuerdo a la invención, o una combinación de los mismos, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Como se describe arriba, una proteína de Piroplásmido o un fragmento inmunogénico de dicha proteína puede utilizarse ventajosamente para vacunación. Sirve ya sea para interferir con la proliferación del parásito de Piroplásmido (por ejemplo, inhibición de invasión de célula huésped), o inducirá las respuestas inmunes protectoras (por ejemplo, anticuerpos específicos o linfocitos activados) que interferirán con la proliferación del parásito, o las señales clínicas que produce. Si tales proteínas o fragmentos no producen la respuesta deseada ellas mismas, pueden acoplarse a un vehículo tal como KLH, BSA o lo similar, utilizando técnicas conocidas en la material. El acoplamiento de la proteína o fragmentos de la misma también pueden hacerse para aumentar o modificar la respuesta inmune inducida. Por ejemplo, es de práctica común acoplar los fragmentos de proteína a toxoide de Tétanos para aumentar la respuesta de las células T. También las moléculas efectuoras específicas pueden agregarse, tal como una toxina, para mejorar la muerte de las células objetivo. Tales acoplamientos pueden realizarse químicamente, por acoplamiento, conjugación o degradación, a través de deshidratación, esterificación, etc, de las secuencias de aminoácidos ya sea directamente o a través de una estructura intermedia. físicamente, por acoplamiento a través de la captura en o en una estructura macromolecular, o preferentemente por fusión biológica molecular, a través de la combinación de moléculas de ácido nucleico recombinante que comprenden fragmentos de ácido nucleico capaz de codificar cada una de las dos, de manera que un producto de expresión continuo único se produce finalmente. Tales técnicas de ingeniería genética se prefieren.

Una manera alternativa y eficiente de vacunación es por vacunación directa con ADN que codifica el epítopo o antígeno relevante. La vacunación directa con proteínas que codifican ADN ha sido exitosa para muchas proteínas diferentes, como se revisa por ejemplo, en Donnelly eí al. (The Immunologist 1993, vol. 2, p. 20-26). Por ejemplo, en el campo de vacunas anti-parásitas, la protección contra por ejemplo, Plasmodium yoelii se ha obtenido con la vacunación de AND con el gen de circumsporozoita de P. yoelii (Hoffman, S. et al. 1994, Vaccine, vol. 12, p. 1529-1533), y protección contra Leishmania major se ha obtenido con la vacunación de ADN con el gen gp63 de glicoproteína de superficie L. major (Xu & Liew 1994, Vaccine, vol. 12, p. 1534-1536). Tal vacunación de ADN puede realizarse con un ácido nucleico, un fragmento de cADN, o preferentemente con una molécula de ADN recombinante de acuerdo a la invención. Por lo tanto, una modalidad preferida se refiere a una vacuna de acuerdo a la invención, caracterizada porque comprende un ácido nucleico, un fragmento de cADN, o una molécula de ADN recombinante de acuerdo a la invención. Alternativamente, una vacuna de acuerdo a la invención puede comprender vehículos recombinantes vivos como se describe arriba, capaces de expresar la proteína de Piroplásmido de acuerdo a la ¡nvención o fragmentos inmunogénicos de dicha proteína. Tales vacunas, por ejemplo, en base a un vector o vehículo bacteriano, parásito o viral tienen la ventaja sobre las vacunas de subunidad que imitan mejor la manera natural de infección por Piroplásmida. También, la presentación de los antígenos por células infectadas con los vehículos se parece a la vía de una proteína de Piroplásmido de acuerdo a la invención o fragmentos inmunogénicos de dicha proteína se presentan al sistema inmune en una infección natural. Además, su auto-propagación es una ventaja ya que solamente bajas cantidades del vehículo recombinante son necesarias para inmunización, De esta manera, otra modalidad preferida se refiere a una vacuna de acuerdo a la ¡nvención, que comprende un vehículo recombinante vivo y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Las células huésped como se describen arriba pueden utilizarse para expresar una proteína de Piroplásmido de acuerdo a la invención o un fragmento inmunogénico de dicha proteína como un sistema de expresión. Después de la expresión el producto proteínico puede recolectarse, pero alternativamente el medio de cultivo o las células huésped completas por si mismas pueden utilizarse en una vacuna. Esto tiene el beneficio de omitir etapas de purificación, pero por su puesto requiere algo de tolerancia por los mamíferos objetivo para los componentes de medios y/o componentes de células huésped. También dentro del alcance de la invención se encuentra una vacuna de acuerdo a la ¡nvención que comprende una combinación de dos o más tipos de moléculas de la proteína de Piroplásmido de acuerdo a la invención o un fragmento inmunogénico de dicha proteína, o un ácido nucleico, cADN, molécula recombinante, vehículo recombinante vivo, o células huésped de acuerdo a la invención. Para tales vacunas de acuerdo a la invención los componentes pueden combinarse en una dosis única o en dosis separadas, y estas pueden darse al mismo tiempo o secuencialmente. Por ejemplo, una vacuna de combinación de un cebador inicial con un plásmido de ADN recombinante llevando la secuencia de codificación de una proteína de Piroplásmido, seguida de algún tiempo después por una vacunación repetidora con una proteína de piroplásmido puede utilizarse ventajosamente. Las vacunas de acuerdo con la invención, pueden administrarse en cantidades conteniendo entre 0.1 y 1000 µg de una proteína de Piroplásmido de acuerdo a la invención o un fragmento inmunogénico de dicha proteína por un objetivo mamífero. Las dosis más pequeñas o más grandes pueden en principio utilizarse; preferentemente una dosis de entre 50 y 200 µg de una proteína de Piroplásmido o un fragmento inmunogénico de la misma se utiliza. Para vacunas de vector viral vivo la tasa de dosis por animal puede variar de 1 a 1010 pfu, preferentemente 10-1 05 se utilizan. Un vehículo farmacéuticamente aceptable se entiende que es un compuesto que no afecta de manera adversa la salud del animal a vacunarse, al menos no al grado que el efecto adverso es pero que los efectos observados cuando el animal no se vacunaría. Un vehículo farmacéuticamente aceptable puede ser, por ejemplo, agua estéril o una solución de sal fisiológica estéril. En una forma más compleja el vehículo, puede ser, por ejemplo, un regulador. Con frecuencia, una vacuna se mezcla con estabilizadores, por ejemplo, para proteger a los componentes propensos a degradación a degradarse, para mejorar la vida en el estante de la vacuna, o para mejorar la eficiencia de liofilización. Los estabilizadores útiles son SPGA (Bovarnik et al. 1950, J. Bacteriology, vol. 59, p. 509), leche descremada, gelatina, albúmina de suero de bovino, carbohidratos, por ejemplo, sorbitol, manitol, trehalosa, almidón, sucrosa, dextran o glucosa, proteínas tales como albúmina o caseína o productos de degradación de la misma, y reguladores, tales como fosfatos de metal álcali. La vacuna de acuerdo a la ¡nvención puede comprender adicionalmente un así llamado "vehículo". Un vehículo es un compuesto al cual las proteínas, fragmentos de proteína, ácidos nucleicos o partes de los mismos, cADN's, moléculas recombinantes, portadores recombinantes vivos, y/o células huésped de acuerdo a la invención se adhieren, si unirse covalentemente a ella. Tales vehículos son, por ejemplo, bio-microcápsulas, micro-alginatos, liposomas, macrosoles, hidróxido de aluminio, sílice de fosfato, sulfato u óxido, Kaolín® y Bentonita®, todos conocidos en la materia. Un ejemplo es un vehículo en el cual el antígeno se incrusta parcialmente en un complejo estimulante inmune, el así llamado ISCO® (EP 109.942, EP 180.564, EP 242.380). Además, la vacuna de acuerdo a la invención puede comprender uno o más compuestos activos en superficie o emulsificadores, por ejemplo, Span® o Tween®. Los sujetos objetivo para la vacuna de acuerdo a la invención son preferentemente mamíferos, por ejemplo, humanos o animales mamíferos de importancia veterinaria. El objetivo puede estar saludable o enfermo, y puede ser seropositivo o negativo para parásitos de Piroplásmido o para anticuerpos para parásitos de Piroplásmido. El sujeto objetivo puede ser de cualquier edad a la cual es susceptible para la vacunación. Los mamíferos objetivo más preferido para la vacuna de acuerdo a la invención son bovinos, equinos, caninos y felinos. La vacuna de acuerdo a la invención puede utilizarse igualmente como tratamiento profiláctico y terapéutico, e interfiere con el establecimiento y/o con la progresión de una infección o sus síntomas clínicos de enfermedad. Por lo tanto, un aspecto de la ¡nvención se refiere al uso de una secuencia de ácido nucleico de acuerdo a la ¡nvención, un fragmento de cADN de acuerdo a la invención, una molécula de ADN recombinante de acuerdo a la ¡nvención, un portador recombinante vivo de acuerdo a la invención, o una célula huésped de acuerdo a la invención para la fabricación de una vacuna para tratamiento profiláctico o terapéutico de una infección o sus señales clínicas causadas por un organismo de Piroplásmido. La vacuna de acuerdo a la invención previene o reduce la difusión de infección de Piroplásmido a través de la población o al ambiente.

La vacuna de acuerdo a la invención puede estar en varias formas, por ejemplo, un líquido, un gel, una pomada, un polvo, una tableta, o una cápsula, dependiendo del método deseado de aplicación al objetivo. Preferentemente, la vacuna está en la forma de un líquido inyectable. La vacuna de acuerdo a la invención puede administrarse a un objetivo mamífero de acuerdo a los métodos bien conocidos en la materia. Por ejemplo, por aplicaciones parenterales tales como a través de todas las vías de inyección o a través de la piel, por ejemplo, intramuscular, intravenosa, intraperitoneal, ¡ntradérmica, submucosal o subcutánea. Las vías alternas de aplicación que son factibles son por aplicación tópica como una gota, rocío, gel o pomada para el epitelio mucosal del ojo, nariz, boca, ano o vagina, o sobre la epidermis de la piel externa en cualquier parte del cuerpo; por rocío como aerosol, o polvo. Alternativamente, la aplicación puede ser a través de la vía alimenticia, al combinar con el alimento, comida o agua para beber, por ejemplo, como un polvo, un líquido, una tableta, o por administración directamente en la boca como un líquido, un gel, una tableta, o una cápsula, o al ano como un supositorio. La vía de aplicación preferida es por inyección intramuscular o subcutánea. Es decir que la vía óptima de aplicación dependerá de las particularidades específicas de la infección parásita o enfermedad clínica que está por prevenirse o mejorarse, en las características de la formulación de vacuna que se utiliza, y en la característica particular de las especies objetivo. El esquema de la aplicación de la vacuna de acuerdo a la invención para el mamífero objetivo puede ser en dosis única o múltiple, que puede darse al mismo tiempo o secuencialmente, en una manera compatible con la dosificación y formulación, y en tal cantidad ya que será inmunológicamente efectiva. Las vacunas de la invención se aplican ventajosamente en una dosis única por año. En una modalidad preferida, la vacuna de acuerdo a la ¡nvención se caracteriza en que comprende un adyuvante. Un adyuvante en general es una substancia que boosts la respuesta inmune del objetivo en una manera no específica. Muchos adyuvantes diferentes se conocen en la materia. Ejemplos de adyuvantes son adyuvante completo e incompleto de Freund, vitamina E, polímeros de bloque no iónico y poliaminas tales como dextransulfato, carbopol y piran. También son muy adecuadas las saponinas, que son los adyuvantes preferidos. Las saponinas se agregan preferentemente a la vacuna a un nivel entre 1 0 y 10.000 ug/ml. Dentro del grupo de saponinas, la saponina Quil A®; es el adyuvante más preferido. Los componentes de saponina y vacuna pueden combinarse en un ISCOMS®; (EP 109.942, EP 180.564, EP 242.380). Además, los péptidos tales como muramildipéptidos, dimetilglicina, tufstina, con frecuencia se utilizan como adyuvante, y aceite mineral, por ejemplo, Bayol® o Markol®, aceites vegetales o emulsiones de los mismos y DiluvacForte® puede utilizarse ventajosamente. Es decir, las otras maneras de auxiliar, agrega compuestos vehículo o diluyentes, emulsionar o estabilizar una vacuna también se encuentran dentro del alcance de la invención. Tales adiciones son, por ejemplo, descritas en los manuales bien conocidos tales como: "Remington: the science and practice of pharmacy" (2000, Lippincot, USA, ISBN: 683306472), y: "Veterinary vaccinology" (P. Pastoret eí al. ed. , 1997, Elsevier, Amsterdam, ISBN 0444819681 ). La vacuna de acuerdo a la invención puede combinarse ventajosamente con otro antígeno, o con un componente inmunoactivo. Esto puede agregarse en la forma de si ácido nucleico de codificación. Por lo tanto, en una modalidad más preferida la vacuna de acuerdo a la invención se caracteriza en que comprende un componente inmunoactivo adicional o un ácido nucleico que codifica dicho componente inmunoactivo adicional. EI(Ios) componente(s) inmunoactivo(s) adicional(es) puede ser un antígeno, una substancia de intensificación inmune, y/o una vacuna; cualquiera de estos puede comprender un adyuvante. El(los) componente(s) inmunoactivo(s) adicional(es) cuando están en la forma de un antígeno pueden consistir de cualquier componente antigénico de importancia humana o veterinaria. Puede, por ejemplo, comprender una molécula sintética o biológica tal como una proteína, un carbohidrato, un lipopolisacárido, un ácido nucleico que codifica un antígeno proteínico, o una molécula de ácido nucleico recombinante que contiene tal ácido nucleico operativamente enlazado a una secuencia reguladora transcripcional. También una célula huésped comprendiendo tal ácido nucleico, una molécula de ácido nucleico recombinante, o un LRC conteniendo tal ácido nucleico, puede ser una manera de suministrar el ácido nucleico o el componente inmunoactívo adicional. Alternativamente, puede comprender un microorganismo muerto o fraccionado tal como un parásito, bacteria o virus, El(los) componente(s) inmunoactivo(s) adicional(es) pueden estar en la forma de una substancia intensificadora inmune, por ejemplo, una qulmoquina, o un ácido nucleico inmunoestimulador, por ejemplo, un motivo CpG. Alternativamente, la vacuna de acuerdo a la invención, puede agregarse por sí misma a una vacuna. Por ejemplo, una vacuna de acuerdo a la invención puede combinarse con una preparación de una proteína de vacuna de subunidad Babesia, no siendo una proteína de Piroplásmido de acuerdo a la invención o un fragmento inmunogénico de dicha proteína, para formar una vacuna de subunldad de combinación contra la infección del Piroplásmido o señales clínicas asociadas de enfermedad. Alternativamente, la vacuna de acuerdo a la invención puede combinarse ventajosamente con un componente farmacéutico tal como un antibiótico, una hormona, o un fármaco inflamatorio. En una modalidad más preferida, la vacuna de acuerdo a la invención se caracteriza en que dicho componente inmunoactivo adicional o ácido nucleico que codifica dicho componente inmunoactivo adicional se obtiene de un organismo infectivo para: caninos: complejo de Ehrlichia canis, Babesia gibsoni, B. vogeli, B. rossi, Leishmania donovani, parvovirus canino, virus distemper canino, Leptospira interrogans serovars canjeóla, icterohaemorrhagiae, pomona, grippotyphosa, bratislava, virus de hepatitis canina, virus de parainfluenza canina, virus de la rabia, Hepatozoon canis y Borrelia burgdorferi; para bovinos: virus de herpes bovino, virus de diarrea viral bovina, virus de Parainfluenza tipo 3, paramixovirus bovino, virus de enfermedad de pies y boca, Pasteurella haemolytica, virus sincitial respiratorio bovino, Theileria sp. , Babesia sp. , Trypanosoma sp. , Anaplasma sp. , Neospora caninum, Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, Mycoplasma, E. coli, Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter, Cryptosporidium, Salmonella y Streptococcus dysgalactiae; y para equinos: Streptococcus equi, Streptococcus zooepidemicus, Rhodococcus equi, Corynebacterium pseudotuberculosis, Pseudomonas mallei, Actinobacillus equili y Pasteurella multocida, agente de fiebre Potomac, Clostridium tetanii, Mycobacterium pseudomallei, virus estomaca vesicular, virus de enfermedad Boma, virus de influenza equino, virus de enfermedad de caballo africano, virus de arteritis equino, virus de herpes equino 1 -4, virus de anemia infecciosa, virus de encefalomielitis equino y virus de encefalitis Japonesa B. La proteína de Piroplásmido de acuerdo a la invención, o el fragmento inmunogénico de dicha proteína, el ácido nucleico, cADN, o molécula recombinante, vehículo recombinante vivo, y/o las células huésped de acuerdo a la invención por la primer vez, permiten la generación eficiente de anticuerpos específicos contra una proteína de Piroplásmido, o un fragmento inmunogénico de dicha proteína. Esto hace a la vacuna de acuerdo a la ¡nvención adecuada como vacuna marcadora, ya que permite la diferenciación entre objetivos mamíferos vacunados e infectados parásitos, a través de métodos conocidos en la materia. Alternativamente, estos anticuerpos específicos pueden utilizarse como una vacuna ellos mismos, para así llamada "vacunación pasiva". Por lo tanto, otro aspecto de la ¡nvención se refiere a una vacuna, caracterizada porque comprende un anticuerpo contra una proteína de acuerdo a la invención, o un anticuerpo contra un fragmento inmunogénico de dicha proteína, o una combinación de los mismos, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. El anticuerpo puede ser de origen natural o sintético. El anticuerpo puede estar en la forma de un antisuero o anticuerpo purificado. Tales anticuerpos purificados pueden obtenerse ventajosamente de un sistema de expresión.

Los métodos para producción a gran escala de anticuerpos de acuerdo a la invención se conocen bien en la materia. Tales métodos yacen en la clonación de (fragmentos de) la información genética que codifica la proteína de acuerdo a la invención en un fago filamentoso para despliegue de fago. Tales técnicas se describen en "Antibody Engineering Page" bajo "despliegue de fago filamentoso" en http://aximt1 . imt.uni-marburg.de/-rek/aepphage. html. , y en papeles de revisión por Córtese, R. et al. , (1 994) en Trends in Biotechn. , vol. 12, p. 262-267; por Clarckson, T. & Wells, J. A. (1994) en Trends in Biotechn. , vol. 12, p. 173-183; Marks, J. D. et al. , (1 992) J. Biol. Chem . , vol. 267, p. 16007-1601 0; Winter, G. eí al. , (1994) Annu. Rev. Immunol. , vol. 12, p.433-455, y por Little, M. eí al, (1994) Biotechn. Adv. , vol. 12, p. 539-555. Los fagos se utilizan subsiguientemente para seleccionar las bibliotecas de expresión camelida expresando anticuerpos de cadena pesada de camelida (Muyldermans, S. and Lauwereys, M. , Journ. Molec. Recogn. , vol. 12, 131 -140 (1999) and Ghahroudi, M. A. et al. , FEBS Letters, vol. 414, p. 512-526 (1997)). Las células de la biblioteca que expresan los anticuerpos deseados pueden replicarse y pueden utilizarse subsiguientemente para expresión a gran escala de anticuerpos. Una combinación en una vacuna de un antígeno 'cargado' con anticuerpos contra ese antígeno es conocida en la materia como una vacuna "compleja". Tales vacunas de acuerdo a la ¡nvención pueden utilizarse ventajosamente.

Por razones, por ejemplo, de estabilidad o economía de la proteína de Piroplásmido de acuerdo con la invención o fragmentos inmunogénicos de dicha proteína, o ácidos nucleicos, cADN's, moléculas recombinantes, vehículos recombinantes vivos, células huésped o vacunas de acuerdo a la invención pueden liofilizarse. En general permitirá el almacenamiento prolongado a temperaturas arriba de cero °C, por ejemplo, 4°C. Los procedimientos para liofilizar son conocidos por las personas expertas en la materia, equipo para liofilizar a diferentes escalas se encuentra disponible comercialmente. Por lo tanto, en una modalidad más preferida, las vacunas de acuerdo con la invención se caracterizan en que dichas vacunas se encuentran en una forma liofilizada. Para reconstituir una vacuna liofilizada, puede suspenderse en un diluyente fisiológicamente aceptable. Tal diluyente puede, por ejemplo, ser tan simple como el agua estéril, o una solución de sal fisiológica. En una forma más compleja puede suspenderse en una emulsión como se subraya en PCT/EP99/101 78. Todavía otro aspecto de la invención se refiere a un método para la preparación de una vacuna de acuerdo a la ¡nvención, dicho método comprendiendo la mezcla de una proteína de acuerdo a la invención o un fragmento inmunogénico de dicha proteína, un ácido nucleico, un fragmento de cADN, una molécula de ADN recombinante, un vehículo recombinante vivo, o una célula huésped de acuerdo a la invención, o una combinación de los mismos, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Todavía otro aspecto de la invención se refiere a un método para la preparación de una vacuna de acuerdo a la invención, dicho método comprendiendo la mezcla de un anticuerpo contra una proteína de acuerdo a la ¡nvención o un anticuerpo contra un fragmento inmunogénico de dicha proteína, o una combinación de los mismos, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Como se subraya arriba, una vacuna obtenible por los métodos de acuerdo a la ¡nvención pueden utilizarse igualmente como tratamiento profiláctico o terapéutico, e interferirá con ambos con el establecimiento y/o con la progresión de una infección o sus señales clínicas de la enfermedad. Por lo tanto, un aspecto adicional de la ¡nvención se refiere al uso de una proteína de acuerdo con la invención o un fragmento inmunogénico de dicha proteína, para la fabricación de una vacuna para tratamiento profiláctico o terapéutico de una infección o sus señales clínicas causadas por un organismo de la Piroplásmida. De nuevo un aspecto adicional de la invención se refiere a una prueba de diagnóstico para la detección de un ácido nucleico asociado con un organismo de Piroplásmido, caracterizado porque la prueba comprende un ácido nucleico, dicho ácido nucleico siendo al menos 70%, preferentemente 75%, más preferentemente 80, 85, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, 99, o 100% en ese orden de preferencia, similar a la secuencia de ácidos nucleicos representada en la SEQ ID NO: 1 , 3, 5, 7, o 9 o un ácido nucleico que es complementario a dicho ácido nucleico, en donde cualquiera de los ácidos nucleicos tienen una longitud de al menos 15 nucleótidos, preferentemente 17, más preferentemente 18, 1 9, 20, 24, 28, 32, 35 o 40 nucleótidos, en ese orden de preferencia. Todavía un aspecto adicional de la ¡nvención se refiere a una prueba de diagnóstico para la detección de anticuerpos contra un organismo de Piroplásmido, caracterizado porque dicha prueba comprende una proteína de acuerdo a la invención o un fragmento inmunogénico de dicha proteína, o una combinación de los mismos. Por ejemplo, BIIA1 o BIIA2 o un fragmento inmunogénico de cualquiera se acopla a un vehículo de fase sólida, es decir se incuba con una muestra a probarse, se enjuaga, y presencia de anticuerpos unidos se detecta. El método de diagnóstico preferido es por ELISA. Todavía un aspecto adicional de la invención se refiere a una prueba de diagnóstico para la detección de material antigénico de un organismo de Piroplásmido, caracterizado porque dicha prueba comprende un anticuerpo contra una proteína de acuerdo a la ¡nvención o un anticuerpo contra un fragmento inmunogénico de dicha proteína, o una combinación de los mismos. Por ejemplo los anticuerpos contra BI IA1 o BIIA2 o un fragmento inmunogénico de cualquiera se acoplan a un vehículo de fase sólida, es decir se incuba con una muestra a probarse, se enjuaga, y presencia de proteína unida se detecta. El método de diagnóstico preferido es por ELISA.

La invención se describirá además con referencia a los siguientes ejemplos no limitantes. EJEMPLOS EJEMPLO I 1 .1 . TÉCNICAS UTILIZADAS 1 .1 .1 . Cultivo in vitro B. Bovis El aislado de ß. ßo s de Israel (línea clonal C6141 1 ) se cultiva in vitro como se describe previamente (Levy & Ristic 1980, Science, vol. 207, p. 1218-1220). Brevemente, los cultivos B. Bovis se mantienen en placas de 24 cavidades (1 .2 ml volumen total) o en botellas de 25 cm2 (15 ml volumen total) conteniendo medio M199 (Cambrex Bioscience, Bélgica), con 40% suero de bovino (de una vaca donadora adulta), 50 µgml"1 Gentamicin (Gibco BRL), 25 mM bicarbonato de sodio, y eritrocitos bovinos a 5% de volumen de célula empacada (PCV). Los cultivos se incuban a 37°C, 5% CO2 en aire, y parasitemia se mantiene entre 1 % y 12% por dilución diaria. El aislado de ß. ßow's de México (línea clonal C9.1 ) se cultiva de acuerdo al mismo procedimiento como se utiliza para la línea clonal C6141 1 (aislado de Israel) excepto que los cultivos se mantienen a 90% N2, 5% CO2, 5% O2 en lugar de 5% CO2 en aire. 1 .1 .2. Construcción de biblioteca de cADN y genómica de B. Bovis La biblioteca de cADN se construye de 5 µg mARN B.

Bovis utilizando el equipo de síntesis ?ZAP-cADN® (Stratagene) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Fragmentos de cADN de 0.5 a 4 kb se recolectan por filtración de gel en una columna de sefarosa CL4B columna y se ligan en el sitio EcoRI I Xhol del vector ?uniZAP-XR Express. Giga paquete l l l Gold como se utiliza para empacarse en partículas de fago seguido por la transformación de células Escherichia coli XL-1 Blue MRF'. 1 .2 x 106 placas se obtienen de las cuales se hace una biblioteca amplificada. Las corridas de secuencia de un solo paso se realizan en 15000 clones de cADN que se recogen automáticamente al azar de la biblioteca de cADN en placas para establecer un conjunto de datos EST. A partir de este conjunto de datos EST una base de datos consistiendo de 12892 secuencias de alta calidad (longitud promedio 476 bp) se construye. Para construir la biblioteca genómica, 600 µg de AND de ß. Bovis se digieren parcialmente con EcoRI (150 unidades o 250 unidades) por 1 h a 37°C. El ADN digerido se fracciona en tamaño en una Columba de Sefarosa CL-4B. Los fragmentos de 0.5 kb a 8 kb se ligan en el sitio EcoRI de ?-ZAPI I-Express, empacado utilizando un extracto de empacado utilización Gigapack I I I Gold y se transforma en células competentes E. coli XL1 -Blue MRF. 2. 5 x 106 placas se obtienen de las cuales se hace una biblioteca amplificada. Las bibliotecas de cADN se seleccionan con una sonda producida a través de PCR con cebadores específicos para BI IA1 o para BI IA2. 1 .1 .3. Selección de biblioteca de cADN y genómica de ß. ßoWs para los genes para BI IA1 and BI IA2 Las bibliotecas de cADN y genómica de ß. ßoWs se seleccionan para aislar los clones para los genes de BI IA1 y BHA2 con una sonda específica hecha por PCR. Los cebadores específicos utilizados fueron: para el gen BI IA1 : cebador 1 : 5'-CCACGGCTCTGGAATCTATGTC-3' (SEQ I D NO: 1 1 ) cebador 2: 5'-CAAAAGGATACCTATATTTGGTAC-3' (SEQ ID NO: 12), y para el gen BI IA2: cebador 3: d'-TGTGGTAGATGAATCtGCTAGTATATC-S' (SEQ ID NO: 13) cebador 4: d'-CTATGCCACGGCATTCAGCAACATTTA-S' (SEQ ID NO: 14) Ambos pares de cebadores se utilizan para amplificar un fragmento de un clon de la base de datos EST de ß. Bovis, por PCR en un volumen de 50 µl conteniendo 0.2 mM dNTP, 20 µmol/µl de cada cebador, 100 ng B. Bovis ADN genómico total y 0.5 U Taq ADN polimerasa en regulador estándar (Promega). La amplificación se realice por 30 ciclos con las condiciones para la sonda BI 1A1 a: 92°C por 30 s, 58°C por 30 s, y 72°C por 30 s, y para la sonda BHA2 a: 95°C por 1 min, 58°C por 1 min, y 72°C por 10 min. Estos ciclos se preceden por desnaturalización inicial por 3 min a 95°C y un alargamiento final a 72°C por 10 min. Ambas sondas se purifican de gel de azarosa y se marcan con 50 µCi 32P-dATP (3000 Ci/mmol), utilizando un equipo de marcado de Cebador Aleatorio (Roche). E total 4.106 cADN y 4.105 placas de biblioteca de AND genómica se seleccionan por procedimientos estándar (Sambrook & Russell, supra) para clonar el cADN BI IA1 ; mientras que 5.1 05 cADN y un número igual de placas de biblioteca de ADN genómica se seleccionan para clonación del cADN BIIA2. Después de 2 ciclos de purificación de placa, todos los clones se cortaron in vivo para aislamiento de las inserciones de fagemido como se describe en las instrucciones del fabricante (Stratagene) y se secuencia en ambos filamentos, utilizando la secuenciación de ciclo con el método de finalizador de tinte (equipo finalizador de tinte ABI PRISM®;, Pharmacia). Para obtener los cADNs de BI IA1 y BI IA2 de longitude completa, los extremos 5' sin codificación se identifican con 5'-RACE (equipo GeneRacer, Invitrogen; L1502-01 , de acuerdo a las instrucciones del fabricante). Los clones de longitud completa obtenidos se insertan en plásmidos de clonación pCR2.1 y se secuencian en ambos filamentos, como se describe arriba. Las secuencias resultantes se presentan en SEQ ID NO: 1 (BIIA1 ) y SEQ ID NO: 5 (BIIA2). 1 . 1 .4 Expresión de BI IA1 recombinante en E. coli Los clones de BI IA1 en BI IA2 se subclonan por PCR de los plásmidos de clonación pCR2.1 . Los cebadores utilizados para subclonar BI IA1 fueron: cebador 5: 5'-CCCGGATCCATGCAGTTACATAACAAA-3' (SEQ ID NO: 15) cebador 6: 5'-GGGAAGCTTCTGAGCAAAGGAAATAGG-3' (SEQ ID NO: 16) Estos cebadores para BI IA1 introdujeron un sitio de enzima de restricción antes de la base 1 (numerado desde la primer base del codón de inicio) y un sitio hindi después de la base 1504. Los cebadores utilizados para subclonar BIIA2 fueron: cebador: Cebador 7: S'-CCCGAATTCGTGGTAGATGAATCTGCT-S1 (SEQ I D NO: 17) cebador 8: 5'-CCCGTCGACTGCCTCGCCCCAAATGTTGT-3' (SEQ ID NO: 18) Estos cebadores para BIIA2 introdujeron un sitio Eco Rl, y un sitio Sal I . Después de PCR (30 ciclos de 1 mln 94°C, 1 min 55°C, 1 min 72°C), los fragmentos se purifican por gel, templan al vector pET-32a y utilizan para transformación en cepa E. coli NovaBlue®. Los plásmidos conteniendo la inserción apropiada se utilizan para transformar en cepas de huésped de expresión, BL21 (DE3). Las proteínas de fusión con tioredoxina se obtienen con producción máxima después de la inducción con 1 mM de isopropil-ß-D tiogalactosidasa (IPTG) por 4 hr a 37°C como se muestra por análisis de muestras de célula total a 0 y 4 hr después de inducción. Las pastillas bacterianas se hierven a 95°C en SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE) regulador muestra conteniendo 2% (v/v) ß-mercaptoetanol, corrida en 1 0% SDS-PAGE minigeles, y se coloreó con Azul brillante Coomassie para confirmar la expresión (Figures 1 and 2). 1 .1 .5 Selección de péptido y generación de antisuero monoespecífico Después de que los genes BI IA1 y BI IA2 se secuenciaron completamente, los péptidos se seleccionaron de secuencias traducidas por computadora, para inducción de anticuerpos policlonales específicos a través de inmunización de animales de prueba. El programa de análisis de secuencia Protean de ADN Star® se utiliza para seleccionar las regiones del péptido que tienen una buena probabilidad de superficie y contiene regiones alifáticas alfa. Los péptidos seleccionados de BI IA1 (SEQ ID NO: 2) fueron: péptido 1 : aa números 46-60: cisteína-AFHKEPNNRRLTKRS, péptido 2: aa números 395-409: cisteína-RGVGMNWATYDKDSG, péptido 3: aa números 453-467: cisteína-YVEPRAKNTNKYLDV. Los péptidos seleccionados de BIIA2 (SEQ ID NO: 6) fueron: péptido 4: aa números 255-269: cisteína-PGKRTRALLDLRMIE, péptido 5: aa números 424-439: cisteína-RVGNTDEEHNHRKDMD, péptido 6: aa números 547-561 : cisteína-VYDDHPEESENTGIN. Después de la síntesis de los péptldos, se acoplaron a una proteína portadora: Hemocianina de linfeto clave activada por maleimida (KLH) (Pierce; 77605) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. El conjugado de péptido-vehículo se utiliza para generar antisuero policlonal de conejo. Para ese propósito tres grupos de conejos NZW (cada grupo contuvo 2 conejos) se inmunizan cinco veces de manera subcutánea con un intervalo de 3 semanas entre inmunizaciones consecutivas. Antes de la inmunización el suero sanguíneo se recolecta de cada conejo, que se utiliza como control negativo. Cada conejo se inyecta con 250 µg de péptido acoplado a KLH que se toma en un volumen igual de adyuvante Stimune®; (ID-DLO, Lelystad, los Países Bajos) . El volumen total que se Inyecta en cada conejo fue 1000 µl . Los sueros se prueban periódicamente para reactividad por ELISA. Las plasmaforesas se hacen una semana después de la última inmunización y se recolecta suero. 1 .1.6 ELISA La respuesta de anticuerpo se evalúa por ELISA, placas de microconcentración de noventa y seis cavidades se reviste con 150 ng de ya sea el péptido 1 o péptido 2 por cavidad, incuba 30 min a 37°C, bloquea por 1 h con PBS/BSA. Las diluciones consecutivas (1 : 50 a 1 :50.000) de suero de conejo individual se incuban por 1 h a 37°C. Las placas se enjuagan, y 1 :2000 de anticuerpo secundario conjugado HRP anti conejo y puerco se incuba por 1 h. Las placas se enjuagan y desarrollan por 45 min con substrato ABTS [ácido 2,2'-azinobis(3-etilbenztiazolinasulfónico]-peroxidasa (Roche biochemicals) . OD405 se registra, y se calculan concentraciones ELISA comparativas. 1 .1 .7 Ensayo de inmunofluorescencia El reconocimiento de merozoitos de B. Bovis por anti-sueros contra péptidos de BI IA1 y BIIA2 se prueban por ensayo de inmunofluorescencia indirecta (I FA). Los smear de sangre delgados se fijan con metanol enfriado. La incubación primaria con anti-BIIA1 de conejo policlonal (1 :40) o antl-BHA1 de ratón pollclonal (1 :5 a 1 : 160) por 30 min se sigue por tres etapas de lavado de 5 min. Los portaobjetos se incuban con 1 :80 de inmunoglobullna G anti-conejo de cabra (IgG) anticuerpos marcados con isotiocianato de fluoresceína (Nordic) por 30 min. Los portaobjetos se enjuagan de nuevo, y la solución Vectashield® (laboratorios Vector) se aplica, los objetos se cubren con una cubierta de vidrio y se visualizan en un microscopio de fluorescencia UV con filtros FITC (450-480/515-565 nm) . Las concentraciones I FA se determinan como la última dilución de suero con un reconocimiento positivo del parásito en comparación con el suero pre-inmune negativo diluido 1 :5. 1 .1 .8 Preparación de extractos de proteína de merozoito total y proteínas solubilizadas en invasión 800 µl de muestras de merozoitos, preparadas como se describe arriba para invasión in Vitro, se separan parcialmente de espectros de eritrocito por filtración sobre prefiltros de 1 .2 µM de polipropileno (Millipore, AN 1202500). Los merozoitos filtrados se agrupan y enjuagan dos veces en 20 volúmenes de PBS conteniendo 25 mM de bicarbonato de sodio (pH 8.0) seguido por centrifugación a 2000 g por 20 min a 4°C. Después del segundo enjuague la pastilla se resuspende en un volumen igual de PBS (pH 8.0) y divide en alícuotas de 200 µl que se centrifugan (1 0.000xg, 5 min a 4°C) y almacena como pastillas celulares de 100 µl (2x109 merozoitos) a - 20°C después del retiro de sobrenadante. Las pastillas de merozoito congeladas se descongelan justo antes de uso y lisan, reducen y alquilan al utilizar un equipo de extracción de membrana Proteoprep® (Sigma) de acuerdo a las instrucciones del fabricante y finalmente se obtuvieron en 1 .7 ml de regulador compatible con aplicación directa en geles SDS-poliacrilamida o cintas de iso-electroenfoque (IEF). El material insoluble se remueve por centrifugación a 16.000xg por 3 min a 4°C. La concentración de proteína se determina por el método Bradford (Anal. Biochem. 1976, vol. 72, p. 248-254). Ya que los extractos contienen cantidades considerables de proteínas de eritrocito, los extractos de control se preparan de la misma manera pero iniciando con un cultivo de eritrocitos no infectados. Las proteínas solubilizadas en la invasión se obtienen al remover suavemente el regulador de recubrimiento después de 1 h de invasión in Vitro como se describe arriba. Las muestras se centrifugan (2000xg , 10 min, 4°C) después de lo cual la pastilla (que fue invisible) se descarta y el sobrenadante se centrifuga de nuevo a alta velocidad para retiro de fragmentos de membrana (20 min, 12.000xg, 4°C). El sobrenadante final se dializa (Pierce; entubado de diálisis en placas Snakeskin®, 68035) durante la noche contra 10 mM KHPO , pH 7.5. La hemoglobina residual se remueve en grupos al incubar 50 mi del sobrenadante dializado con 6.5 ml DEAE sefarosa de flujo rápido (Amersham Biosciences) equilibrado en regulador de diálisis por 920 min a 4°C en una plataforma giratoria. La suspensión se centrifuga por 5 min a 3000xg a 4°C después de lo cual la DEAE sefarosa se enjuaga 4 veces por adición de 50 ml de regulador diálisis seguido por centrifugación por 5 min a 3000xg a 4°C. Las proteínas unidas se eluyen por la adición de 6 ml de regulador de elusión (350 mM KCl, 10 mM KHPO4, pH 7.5) e incubación por 5 min seguido por centrifugación por 5 min a 3000xg a 4°C. El sobrenadante se concentra y desala sobre filtros 10 kDa (YM-1 0, Millipore). 1 .1 .9 Electroforesis SDS-poliacrilamida y Western blotting Las proteínas se resuelven en la presencia o ausencia de ß-mercaptoetanol y se separan en un SDS-PAGE al 10% y transfieren electroforéticamente a una membrana !mmobilon™-P (Millipore). La mancha se bloquea con 5% de leche descremada diluida en 0.5% Tween® 20 conteniendo salina regulada por fosfato (PBST) por 1 h a 37°C. Una dilución apropiada (1 :500) de anticuerpo primario en 2% de leche descremada en PBST se incuba por 1 h durante la noche. La mancha se enjuga a con PBST y después se incuba con 1 : 10.000 dilución de anticuerpo secundario conjugado (DAKO) con peroxidasa de rábano picante anti-conejo (HRP) por 1 h a 37°C. Después de enjugarse con PBST, la macha se desarrolla con un equipo substrato TMB MB (Lucron Bioproducts BV; KPL 50-77-00) o con quimioluminescencia aumentada (ECL)+ (Amersham; RPN2132). 1 .1 .1 0 Enfoque ¡so-eléctrico El extracto de merozoito total, sobrenadante de Invasión, y muestras de proteína BI IA1 se resuspenden en solución de rehidratación (7 M urea, 2 M tiourea, 4% CHAPS, 2% mezcla de anfolito portador pH 4-7 NL (regulador I PG y 20 mM DTT). Las muestras de proteína BI IA2 se separan en la primer dimensión utilizando la mezcla de anfolito portadora pH 3-10NL. Instrumentación I EF, geles I PG y reactivos utilizados fueron de Amersham Biosciences, al menos que se indique de otra manera. 35 µg de proteína de merozoito total o 35 µg de sobrenadante de invasión con inhibidor de proteasa (Complete, Roche) se carga en cintas de 7 cm (pH 4-7 NL). Para cintas de 13 cm, 150 µg de proteínas de merozoito totales o 150 µg de sobrenadante de invasión se cargan. Las cintas se rehidratan (10-14 h) y enfocan durante la noche (14-17 h) en una corrida automática (1 min 300 V, 90 min durante los cuales el voltaje se eleva a 3500 V, seguido por enfoque continuo a 3500 V, a un total de 35-40 KVh, o IPGPhor™). Después del enfoque ¡so-eléctrico, las proteínas se reducen y unen a SDS al equilibrar cada cinta por 15 min en 10 ml de regulador de equilibrio SDS (50 mM Tris, 6M urea, 2% SDS, 30% glicerol, pH 8.8) conteniendo 30 mM DTT (agregado fresco antes de uso). Una segunda etapa de equilibrio en regulador de equilibrio SDS conteniendo 2.5% yodoacetamida (también recientemente agregado) en lugar de ditiotreitol, se realiza para prevenir la reoxidación de proteína y para minimizar las reacciones de residuos de cisterna. El segundo gel de electroforesis SDS dimensional se lleva a cabo en un sistema Hoefer SE600. La coloración de plata se utiliza para visualizar proteínas después de electroforesis 2-D. Las imágenes de los geles se adquieren utilizando software LabScan® v3.0 en un escáner Umax de lecho plano y se analizan utilizando el software I mageMaster® 2D v3.01 (Amersham Biotech). Para manchado inmune, las proteínas en las cintas de 7 cm se separan en un gel SDS-PAGE al 10% o cintas de 1 3 cm se separan en gel de proteína 2-D y se transfieren a una membrana lmmobilon™-P (Millipore; IPVH001 0). El procedimiento seguido por dos manchas bidimensionales fue el mismo que aquel para manchas 1 -D. 1 .1 .1 1 Ensayo de invasión in vitro B. Bovis La invasión se realiza como se describe previamente (Fransen eí al., 2003, Microbes Infecí. Vol. 5, p. 365-372) con ligeras modificaciones, los glóbulos rojos infectados de B. Bovis en 6 a 8% de parasitemia, se centrifugan a 2000xg, 1 0 min, 1 5°C, y resuspenden en un volumen igual de regulador VyMs (Vega & Martínez, ver Fransen, supra). Muestras de 800 µl se someten a cinco impulsos de alto voltaje intermitentes (10 segundos, a 0°C entre impulsos). (2.5 kV, 200 O, 25 µF) en cubetas de 4 mm BioRad (165-2088) utilizando un BioRad Gene Pulser® con controlador de impulsos. 8 ml de PBS conteniendo 25 mM bicarbonato de sodio (pH 8.0, 20°C) se agrega a cada muestra de 800 µl seguida por centrifugación (1 800xg) por 10 min a 1 5°C. Un segundo enjuague idéntico se realiza, excepto que la centrifugación se hace a 1300xg después de lo cual la pastilla de merozoito se resuspende en 800 µl PBS conteniendo 25 mm de bicarbonato de sodio (pH 8.0, 20°C). La invasión se inicia por la adición de 1 volumen de merozoitos resuspendidos a 9 volúmenes de eritrocitos de bovino suspendidos (5.5% PVC en PBS pH 8.0 conteniendo 25 mM bicarbonato de sodio, pre-incubado por 30 min a 37°C en CO2 en aire) y se realiza en placas de 24 cavidades (volumen final, 1 .2 ml) en matraces de 25 cm2 (15 ml) o en matraces de 80 cm2 (50 ml) a 37°C, 5% CO2 en aire. Los portaobjetos coloreados Glemsa se preparan después de 1 h y se contaron eritrocitos con parásitos de un total de 5000 eritrocitos. 1 .1 .12 I nhibición in vitro de invasión por antisuero de conejo policlonal 200 µl de merozoitos de ß. Bovis, liberados por impulso a alto voltaje y respuspendidos en PBS conteniendo 25 mm de bicarbonato de sodio (pH 8.0) como se describe arriba, se incuban con 40 µl de antisuero de conejo por 1 h a 20°C. Después de 1 h, 960 µl de eritrocitos bovinos suspendidos (6.25% PCV) en PBS pH 8.0 conteniendo 25 mM bicarbonato de sodio, pre-incubado por 30 min a 37°C en CO2 en aire) se agregan, seguido por 1 h de incubación después de lo cual los portaobjetos coloreados con Giemsa se preparan y cuentan para determinar el nivel de invasión. Los antisueros de conejo utilizados se elevaron contra péptidos sintéticos derivados de secuencias de aminoácidos BI IA1 y BIA2 y un suero de control elevado contra un péptido de control sin relacionar (YAGRLFSKRTAATAYKLQ). Los péptidos se han enlazado a hemocianina de linpet clave (KLH) antes de inmunización. Los sueros pre-inmunes también se incluyen en la prueba. 1 .2 Resultados del Ejemplo 1 1 .2.1 Identificación y clonación de un cADN de longitud completa que codifica BI IA1 v BI IA2 Probar la biblioteca de cADN de ß. bovis con sondas PCR (350 bp para BI IA1 y 450 bp para BI IA2), resultó en la clonación y secuenciación de un cADN de 21 81 bp para BI IA1 y de 2385 bp para BIIA2. Ambos contuvieron una estructura de lectura abierta y una región de no codificación 3' que termina en una parte posterior poliA. Para determinar el extremo cubierto 5' del mARN de longitud completa, mARN total se desfosforila después de lo cual las tapas 5', que se dejan intactas, se remueven por pirofosfatasa de ácido de tabaco seguido por ligación de un oligonucleótido de ARN específico. Subsiguientemente, PCR enlazado en el cADN del primer filamento dejo la clonación y secuenciación de un fragmento que representa el extremo 5' del mARN de B. bovis para BI IA1 y para BI IA2. La traducción por computadora del ORF 1 815 bp de BIIA1 predijo un 67.2 kDa; traducción de ORF 1965 bp para BI IA2 predijo una proteína 65.6 kDa. 1 .2.2 Reconocimiento de BIIA1 y BI IA2 recombinante por antisuero contra péptidos derivados Para permitir estudios adicionales en las proteínas BI IA, los conejos se inmunizan con péptidos sintéticos enlazados a KLH 1 -6 (supra). Todo el antisuero reconoció específicamente un producto de fusión recombinante de tioredoxina y la parte de las proteínas BIIA que se expresa en células E. coli BL21 (Figuras 1 y 2). La electroforesis de gel de poliacrilamida de lisatos celulares totales obtenidos antes (vía 1 ) y después (vía 2) de inducción con IPTG identificó el producto de fusión recombinante para BIIA1 y BIIA2. Rec BIIA1 y BIIA2 se reconocen ambos por los tres sueros inmunes (vías 5, 8, 1 1 ) y no por los sueros pre-inmunes (vías 6, 9, 12) en inmunomanchas. El reconocimiento inmune fue especifico para la parte Bl IA del producto de fusión como una proteína de control, un producto de fusión recombinante de rab5 B. bovis (vía 3, Asp-5 a Lys-208, GenBank Acc No. 324137.1 ) expresado en PET32 no se reconoció (vías 7, 1 0, 13) por estos sueros. También, el reconocimiento inmune fue específico de péptido y no se debe a anticuerpos inducidos por la proteína portadora KLH utilizada para inmunización como antisuero elevado contra un péptido sintético enlazado a KHL sin relacionar con BIIA1 o BIIA2 no reconoció el producto de fusión recombinante BI IA1 (vía 13). 1 .2.3 Microscopía de inmunofluorescencla Para localizar las proteínas BHA en el parásito, los estudios de inmunofluorescencia utilizando antisuero de conejo contra los seis péptidos enlazados a KLH de BI IA1 y BI IA2 se realizan en cultivos in vitro B. bovis unidos a portaobjetos de vidrio por fijación con metanol (Figuras 3 y 4). La incubación con suero pre-inmune (paneles A, C, E) no resultó en ninguna coloración específica de parásitos arriba de una señal anterior de fluorescencia faint derivada de eritrocitos infectados como no infectados. En contraste, los sueros inmunes resultaron en coloración específica de parásitos en cualquier campo microscópico examinado (paneles B, D, F). Los parásitos fluorescentes fueron detectables con antisueros contra tres péptidos a una dilución de 1 :5. Aunque los parásitos B. bovis intra-eritrocíticos y merozoitos libres son pequeños (+ 1 por 2 µm) una magnificación máxima permitió una clara visualización del patrón de coloración. 1 .2.4 Inhibición de invasión in vitro por antisuero específico de péptido Un ensayo de invasión in vitro de B. bovis, dejando el estudio de la invención de eritrocitos por merozoitos libres en un regulador libre de proteína dentro de un periodo de tiempo de 1 h, se utiliza para valorar el efecto de antisueros dirigidos contra los 6 péptidos derivados de diferentes dominios de BI IA1 y BI IA2. Los merozoitos libres se pre-incubaron por 1 h a 20°C con los antisueros anti-péptido y con el suero de control dirigido contra un péptido no relacionado después de lo cual la invasión se inició por la adición de eritrocitos. Todos los antisueros contra los péptidos BI IA dieron origen a inhibición significativa de invasión mientras que los sueros pre-inmunes y antisuero de control no tuvieron efecto significativo en la eficiencia de invasión (Figuras 5 y 6). Para BI IA1 , el efecto más fuerte de 65 + 1 0% inhibición de invasión se observa por el antisuero dirigido contra el péptldo 1 ; para BI IA2, el efecto más fuerte de 70 + 10% inhibición de invasión se observa por el antisuero dirigido contra péptido 4, 1 .2.5 Trazado de proteínas BHA en geles 2-D Para determinar si BI IA1 y BI IA2 se exponen en el medio como proteínas solubles durante la invasión de eritrocitos, constituyendo así parte del SPA arriba mencionado, el inmunomanchado de sobrenadantes de invasión se realiza. BIIA1 y BI IA2 se localizan en inmunomanchas de dos dimensiones. 50 µg de sobrenadante de invasión concentrado se separa por iso-electroenfoque seguido por electroforesis en geles de SDS-poliacrilamida. Las proteínas se manchan en membranas PVDF. Las partes cortadas de las membranas (45 a 90 kDa) se incuban con antisuero de péptido anti-BI IA1 contra péptidos 1 o 3 (Figura 7, paneles A y C, respectivamente) así como también con antisueros de péptido anti-BI IA2 contra péptidos 4 y 6 (Figura 8, paneles A y C respectivamente). Para ambas proteínas, los anticuerpos contra los péptidos 1 y 4 se unieron a los mismos spots específicos (flechas) además de una coloración específica de proteínas que también se presentan en manchas de control. Estas se han preparado de sobrenadantes de glóbulos rojos no infectados (RBC) preparados bajo condiciones idénticas pero en ausencia de merozoitos (Figura 7 y 8, paneles B y D). Los spots localizados por inmunomanchado se ajustan subsiguientemente en un gel de proteína 2-D coloreado con plata de una muestra similar que se obtiene de un experimento paralelo en el cual el uso se hace de parásitos que se marcan metabólicamente con 35S-Met antes de invasión. La figura 9 despliega el patrón obtenido después de la exposición a película mostrando exclusivamente proteínas de ß. bovis como proteínas de eritrocito no tienen marca incorporada. Al utilizar el software de formación de imágenes, los spots detectados por inmunomanchado con antisueros de péptido anti-BI IA1 podrían ajustarse a una fila de + 70 kDa manchas en la autoradiografía y en el gel coloreado con plata (ver flechas de la Figura 9). BI IA2 se representa por manchas de menor intensidad indicando una abundancia inferior de la proteína nativa. EJEMPLO I I . Clonación, expresión, y caracterización de BI IA3 ADN amplificado total de la biblioteca de cADN de ß. bovis descrita en § 1 .1 .2 se selecciona para el gen BI IA3 con los siguientes cebadores: cebador 9: 5'-CCCGAATTCCATGATGGTGAAGTTCCACAC-3' (SEQ I D NO: 19) cebador 10: 5'-CCCGTCGACGTTGGCCCCCTTTCGGTGAT-3' (SEQ I D NO: 20) PCR se realiza como se describe en § 1 .1 .3. El fragmento PCR se secuencia directamente, la secuencia resultante se presenta en SEQ ID NO: 9 (BI IA3). El fragmento PCR del cADN BI IA3 se clona en el vector de expresión pET-32a, como se describe en § 1 .1 .4. Los cebadores 9 y 10 proporcionaron sitios de restricción Eco Rl y Sal I. La secuencia traducida por computadora de la proteína BI IA3 se presenta en SEQ I D NO: 10. El ORF de 1635 nucleótidos en cADN BI IA3 codifica una proteína 61 .0 kDa. Los péptidos se predicen de esta proteína para inducción de anticuerpos específicos en animales de prueba, como se describe en § 1 .1 .5. Los péptidos seleccionados de proteína BI IA3 son: péptido 7: aa números 122-136 cisteína-GELKKLSDNIPTKMP, péptido 8: aa números 385-399 cisteína-SGSARVETSLESSVP. Los péptidos se acoplaron a KLH, y utilizaron para generar anticuerpos policlonales de conejo como se describe en § 1 .1 .5. El suero de conejo se evalúa por ELISA, como se describe en § 1 .1 .6. El antisuero de anti-péptido policlonal de conejo fueron para detectar recBI IA3 (proteína BI IA3 fusionado a tioredoxina expresada en E. coli) en Western blot 1 -D. Los resultados se representan en la Figura 1 0, panel A: Rec BI IA3 se reconoce por antisuero contra ambos péptidos 7 y 8, mientras que los sueros preinmunes no reconocen Rec BI IA3. Antisuero policlonal contra BHA3 (y contra BÍÍA1 y BIIA2) se originó en ganado, como se describe en el Ejemplo l l l . Este antisuero bovino también se utiliza en un Western blot 1 -D en recBI IA3. Los resultados se representan en la Figura 10, panel B: suero de dos animales reconocidos recBI I IA3, mientras que ei suero de bovino pre-inmune no. El antisuero bovino contra recBIIA3 también se utiliza en un gel 2-D de proteínas B. bovis nativas como se describe en § 1 .1 .8 y 1 .1 .9. Los resultados se muestra en la Figura 1 1 . El suero de bovino preinmune reaccionó con varios spots de origen de glóbulo rojo (panel A). Para columna de sefarosa de panel B se utilizó IgG inmune a recBIIA3 purificada. Esto reconoció específicamente (grupos de) spots de ~95 kDa, ~75 kDa y ~30 kDa (ver flechas). Aparentemente, las formas multiméricas y procesadas de BI IA3 nativo también se reconocen. El anticuerpo policlonal de conejo contra el péptido 7 se demuestra por tener propiedades que inhiben la invasión, ver figura 12. IgG purificada de Sefarosa G se utiliza en tres concentraciones diferentes, conduciendo a una inhibición máxima de 65%. IgG no inmune, y PBS no resulta en inhibición (columna de control). El antisuero policlonal de conejo dirigido contra el péptido 7 también se utiliza para determinar la localización subcelular de BI IA3 en merozoitos de ß. bovis en el eritrocito infectado, por inmunofluorescencia indirecta. La detección fue por microscopía de multifotón. Smears de sangre delgados se fijan en acetona por 10 min y se secan al aire. La incubación primaria con suero de conejo anti péptido 7 (1 :20) por 30 min se sigue por tres etapas de enjuague de 5 min con PBS. Los portaobjetos se incuban entonces con IgG anti-conejo de cabra conjugado con Alexa 488 (20 µg/ml, Molecular Probes Inc. , Eugene, USA) por 30 min y se enjuaga con PBS. Subsecuentemente, para marcado dual, los portaobjetos se Incuban con DAPI (0.5 µM, Molecular Probes Inc.) por 20 min y se enjuagan. La solución FluorSave® se aplica y los portaobjetos se dejan durante la noche a temperatura ambiente, cubren en una posición horizontal. Las señales fluorescentes se visualizan utilizando un sistema de multifotones y Bio-Rad Radiante 21 00MP equipado con un microscopio invertido Nikon TE300. La excitación de las sondas DAPI se logra por excitación de multifotón a 780 nm utilizando un láser Titanio-Zafiro en modo fijo (Tsunami, Spectra-Physics) bombeado por un láser de estado sólido de 10 W (Milennia Xs, Spectra-Physics), mientras que la sonda Alexa 488 se excita por un láser de Argón a 488 nm. Los resultados I FT multifotón mostraron que coloración específica BI IA3 estuvo presente en la región apical del parásito Babesia. EJEMPLO I I I Generación y uso de antisueros bovinos contra BI IA1 , BI IA2 y BI IA3 recombinantes Los productos de expresión recombinantes de BI IA1 , BI IA2 y BI IA3 se generan en E. coli como se describe en la sección 1 .1 .4. Las bacterias se forman en pastillas y solubilizan en 6M HCl de guanidio. El lisato celular total se centrifuga a 9000 rpm por 1 0 min, y el lisato soluble fue unido a una suspensión de Ni-NTA azarosa en GuHCL. Las perlas se enjuagan tres veces con 8M urea, y antígeno específico se eluye subsiguientemente con 250 mM imidazol en 3M Urea. Cada dosis de vacuna contuvo 100 µg de antígeno recBI IA purificado y se formula con adyuvante de separación en una dosis final de 2 ml. Las vacunas se aplican intramuscularmente en el cuello de la oveja competente inmunológica, cada grupo numeró 5 animales. semanas después de la cebación se da una vacunación repetidora con la misma formulación. 3 semanas después la sangre repetidora se toma y el suero se prepara para análisis. La purificación de IgG específico de bovino se realiza al incubar 5 ml de antisuero con 2 mi de Sefarosa GammaBind Plus® (Amersham-biosciences) por 1 h a 20°C en regulador de unión (0.01 M fosfato de sodio pH 7.4, 0.15 M NaCI, 0.01 M EDTA). La columna se enjuaga con regulador de unión e IgG se eluye, 5 ml 0.5 M Nac pH 3.0, y se neutraliza inmediatamente con TrisHcl pH 9.0. IgG se concentra y dializa contra PBS pH 7.4. La inhibición de invasión in vitro por IgG total purificado de anticuerpos de bovino se originó contra BI IA1 , BI IA2 y BI IA3 recombinante (clonados de cepa de Israel) se realiza como se describe para antisuero de conejo policlonal (§ 1 .1 .1 1 y 1 .2.4) utilizando concentraciones de IgG de bovino final de 0.15 µg/µl o 0.75 µg/µl durante preincubación. Todas las pruebas se realizan dos veces utilizando anticuerpos de dos animales diferentes para cada antígeno. Los resultados mostrados en la figura 1 3 despliegan los datos combinados de los antisueros individuales por antígeno. La desviación estándar se indica. Para mostrar que la inhibición también es efectiva en invasión de una cepa Babesia heteróloga, una línea clona (C9.1 ) derivada de aislado Mexicano (MO7) de B. bovis se prueba. La efectividad de la inhibición de invasión de eritrocito por ambas cepas Babesia es comparable. La efectividad de BI IA1 y BI IA2 (entre 3 y 12%) parece aún más alta que aquella de BI IA3 (23-25%). LEYENDA DE LAS FIGURAS Figura 1 : Vía 1 : pET-BI IA1 antes de inducción con IPTG. Vía 2: pET-BI IA1 4 h después de inducción con IPTG. Vía 3: pET-Rab5 4 h después de inducción. Vías 4, 5, 6 se incubaron con anti-péptido 1 ; Vías 7, 8, 9 se incubaron con anti-péptido 2; Vías 1 0, 1 1 , 12 se incubaron con anti-péptido 3. Vías 4, 7, 10 contienen pET-BHA1 4 h después de inducción, se incubaron con suero pre-inmune; Vías 5, 8, 1 1 las mismas como en las Vías 4, 7, y 1 0, pero se incubaron con sueros inmunes. Vías 6, 9, 12 contienen pET-Rab5 4 h después de inducción se incubaron con sueros inmunes. Vía 13: pET-BI IA1 4h después de inducción, y se incubaron con antisuero de nuevo con péptido enlazado a KLH sin relacionar con B. Bovis. Figura 2: Vía 1 : pET-BI IA2 antes de inducción con I PTG. Vía 2: pET-BI IA2 4 h después de inducción con I PTG. Vía 3: pET-Rab5 4 h después de inducción. Vías 4, 5, 6 se incubaron con anti-péptido 4; Vías 7, 8, 9 se incubaron con anti-péptido 5; Vías 10, 1 1 , 12 se incubaron con anti-péptido 6. Vías 4, 7, 1 0 contienen pET-BI IA2 4 h después de Inducción, se incubaron con suero pre-inmune de conejos; Vías 5, 8, 1 1 las mismas como en las Vías 4, 7, y 1 0, pero se incuban con sueros inmunes. Vías 6, 9, 12 contienen pET-Rab5 4 h después de inducción, se incuban con sueros inmunes. Vía 1 3 contiene pET-BI IA2 4h después de inducción, y se incuba con antisuero de nuevo con péptido enlazado a KLH sin relacionar con ß. Bovis. Figura 3: Los paneles A, C y E despliegan cultivos in vitro fijados con metanol de B. bovis incubado con antisueros de conejo pre-inmune contra péptidos 1 , 2 y 3 de BI IA1 respectivamente. Los paneles B, D, F, son similares a A, C y E pero se incuban con los sueros inmunes correspondientes. Para propósitos reproductivos los colores se han invertido. Figura 4: Los paneles A, C y E despliegan cultivos in vitro fijados con metanol de B. bovis incubado con antisueros de conejo pre-inmunes contra péptido 4, 5 y 6 de BIIA2 respectivamente. Los paneles B, D, F, son similares a A, C y E pero se incuban con los sueros inmunes correspondientes. Para propósitos reproductivos los colores se han invertido. Figura 5: Las columnas de control representan una pre-incubación con antisuero contra un péptido no relacionado que no da inhibición. Los antisueros (barras abiertas) así como también sueros de conejo pre-inmunes (barras negras) contra péptidos 1 , 2 y 3 de BIIA1 se prueban dos veces en triplo. Figura 6: Las columnas de control representan una pre-incubación con antisuero contra un péptido no relacionado que no da inhibición. Los antisueros (barras abiertas) así como también sueros pre-inmunes (barras negras) contra péptidos 4, 5 y 6 de BIIA2 se prueban dos veces en triplo. Figura 7: Paneles A y C: ¡nmunomanchas 2-D con suero inmune contra péptidos BIIA1 péptidos 1 y 3 respectivamente. Los Paneles B y D: ¡nmunomanchas 2-D con suero pre-inmune de conejos inmunizados con péptidos 1 y 3 de BIIA1 respectivamente. Las flechas indican spots específicos para antisueros contra el péptido 1 así como también el péptido 3. Figura 8: Paneles A y C: inmunomanchas 2-D con suero inmune contra péptidos BI IA2 péptidos 4 y 6 respectivamente. Los Paneles B y D: inmunomanchas 2-D con suero pre-inmune de conejos inmunizados con péptidos 4 y 6 de BI IA2 respectivamente. Las flechas indican spots específicos para antisueros contra el péptido 4 así como también el péptido 6. Figura 9: Autoradiografía de un gel 2-D como se utilice par alas inmunomanchas presentadas en las figures 7 y 8, desplegando solamente proteínas derivadas de ß. bovis que se marcan con 35S-Met por marcado metabólico antes de la invasión. Las flechas indican los spots que se han identificado como BIIA1 al acoplarse con ¡nmunomanchas mostradas en la figura 7 utilizando software de formación de imágenes. Figura 1 0: Western blot 1 -D de recBI IA3 expresado con E. coli, reconocido por antisueros de conejo policlonal originado contra péptidos 7 y 8. Panel A: los antisueros anti-péptido de conejo: vía 1 : anti-péptido 7; vía 3: anti-péptido 8; ambas en dilución de suero 1 : 2000. Vías 2 y 4: suero pre-inmune de ambos donadores de conejo antisuero de péptido. Panel B: antisuero anti-recBI IA3 de bovino: vías 1 , y 2: IgG inmune purificada en 1 : 200.000 de dos animales; vía 3, suero de bovino pre-inmune. Figura 1 1 : Western blot 2-D de proteínas de B. Bovis nativas reconocidas por antisuero policlonal de bovino dirigido contra recBHA3. Panel A: suero de bovino pre-inmune. Panel B: IgG inmune purificado por Sefarosa G, a 0.8 µg/ml. Las flechas indican reconocimiento de anticuerpo específico BIIA3. Figura 12: El ensayo de inhibición por invasión de IgG inmune de anti-péptido 7 policlonal de conejo, inhibiendo la invasión de aislado de ß. bovis de Israel en eritrocitos de bovino. La inhibición por control (suero pre-inmune) se estableció al 100%. El eje horizontal: concentración de IgG inmune purificado, eje vertical; % relativo de eficacia de inhibición por invasión, con desviación estándar (n=3). Figura 13: Ensayo de inhibición por invasión de IgG inmune políclonal de bovino contra recBI IAI , recBI IA2, y recBI IA3, inhibiendo la invasión de aislados de ß. bovis de Israel y de México en eritrocitos bovinos. Inhibición por control (suero pre-inmune) se estableció al 100%. Eje horizontal; concentración de IgG final en µg/µl; eje vertical, % relativo de eficacia de invasión por invasión, con desviación estándar (n=2 x 2).

Claims (9)

1. REIVINDICACIONES 1 . Proteína de piroplásmido, caracterizada porque dicha proteína comprende una secuencia de aminoácidos teniendo una similitud de al menos 70% con la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 2 o 4, o un fragmento inmunogénico de dicha proteína.
2. 2. Proteína de piroplásmido, caracterizada porque dicha proteína comprende una secuencia de aminoácidos teniendo una similitud de al menos 70% con la secuencia de aminoácidos representada en SEQ I D NO: 6 u 8, o un fragmento inmunogénico de dicha proteína.
3. 3. Proteína de piroplásmido, caracterizada porque dicha proteína comprende una secuencia de aminoácidos teniendo una similitud de al menos 70% con la secuencia de aminoácidos representada en SEQ I D NO: 10, o un fragmento inmunogénico de dicha proteína.
4. 4. Ácido nucleico, caracterizado porque dicho ácido nucleico codifica una proteína según la reivindicación 1 , o un fragmento inmunogénico de dicha proteína.
5. 5. Ácido nucleico, caracterizado porque dicho ácido nucleico codifica una proteína según la reivindicación 2, o un fragmento inmunogénico de dicha proteína.
6. 6. Ácido nucleico, caracterizado porque dicho ácido nucleico codifica una proteína según la reivindicación 3, o un fragmento inmunogénico de dicha proteína.
7. 7. Fragmento de cADN comprendiendo un ácido nucleico según una o más de las reivindicaciones 4-6.
8. 8. Molécula de ADN recombinante comprendiendo un ácido nucleico según una o más de las reivindicaciones 4-6 o un fragmento de cADN según la reivindicación 7, dicho ácido nucleico o dicho fragmento de cADN estando bajo control de un promotor funcionalmente enlazado.
9. 9. Vehículo recombinante vivo comprendiendo un ácido nucleico según una o más de las reivindicaciones 4-6, un fragmento de cADN según la reivindicación 7, dicho ácido nucleico o dicho fragmento de cADN estando bajo control de un promotor funcionalmente enlazado, o una molécula de ADN recombinante según la reivindicación 8. 1 0. Célula huésped comprendiendo un ácido nucleico según una o más de las reivindicaciones 4-6, un fragmento de cADN según la reivindicación 7, dicho ácido nucleico o dicho fragmento de cADN estando bajo control de un promotor funcionalmente enlazado, una molécula de ADN recombinante según la reivindicación 8, o un vehículo recombinante vivo según la reivindicación 9. 1 1 . Vacuna comprendiendo una proteína según una o más de las reivindicaciones 1 -3 o un fragmento inmunogénico de dicha proteína, un ácido nucleico según una o más de las reivindicaciones 4-6, un fragmento de cADN según la reivindicación 7, una molécula de ADN recombinante según la reivindicación 8, un vehículo recombinante vivo según la reivindicación 9, o una célula huésped según la reivindicación 10, o una combinación de los mismos, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. 12. Vacuna de acuerdo a la reivindicación 1 1 , caracterizada porque dicha vacuna comprende un adyuvante. 13. Vacuna según una o más de las reivindicaciones 1 1 -12, caracterizada porque dicha vacuna comprende un componente inmunoactivo adicional o un ácido nucleico codificando dicho componente inmunoactivo adicional. 14. Vacuna, caracterizada porque dicha vacuna comprende un anticuerpo contra una proteína según una o más de las reivindicaciones 1 -3 o un anticuerpo contra un fragmento inmunogénico de dicha proteína, o una combinación de los mismos, y un vehículo farmacéutico aceptable. 15. Método para la preparación de una vacuna según la reivindicación 1 1 , dicho método comprendiendo la mezcla de una proteína según una o más de las reivindicaciones 1 -3, o un fragmento inmunogénico de dicha proteína, un ácido nucleico según una o más de las reivindicaciones 4-6, un fragmento de cADN según la reivindicación 7, una molécula de ADN recombinante según la reivindicación 8, un vehículo recombinante vivo según la reivindicación 9, o una célula huésped según la reivindicación 10, o una combinación de los mismos, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. 16. Uso de una proteína según una o más de las reivindicaciones 1 -3 o un fragmento inmunogénico de dicha proteína para la fabricación de una vacuna para tratamiento profiláctico o terapéutico de una infección o sus señales clínicas causadas por un organismo de Piroplásmido. 17. Uso de una secuencia de ácidos nucleicos según una o más de las reivindicaciones 4-6, un fragmento de cADN según la reivindicación 7, una molécula de ADN recombinante según la reivindicación 8, un vehículo recombinante vivo según la reivindicación 9, o una célula huésped según la reivindicación 1 0 para la fabricación de una vacuna para tratamiento profiláctico o terapéutico de una infección o sus señales clínicas causadas por un organismo de Plásmido. 18. Prueba de diagnóstico para la detección de un ácido nucleico asociado con un organismo de Piroplásmido, caracterizada porque la prueba comprende un ácido nucleico, dicho ácido nucleico siendo al menos 70 % similar a la secuencia de ácidos nucleicos representada en SEQ ID NO: 1 , 3, 5, 7, o 9 o un ácido nucleico que es complementario a dicho ácido nucleico, en donde cualquiera de los ácidos nucleicos tienen una longitud de al menos 1 5 nucleótidos. 19. Prueba de diagnóstico para la detección de anticuerpos contra un organismo de Piroplásmido, caracterizada porque dicha prueba comprende una proteína según una o más de las reivindicaciones 1 -3, o un fragmento inmunogénico de dicha proteína, o una combinación de los mismos. 20. Prueba de diagnóstico para la detección de material antigénico de un organismo de Piroplásmido, caracterizada porque dicha prueba comprende un anticuerpo contra una proteína según una o más de las reivindicaciones 1-3 o un anticuerpo contra un fragmento inmunogénico de dicha proteína, o una combinación de los mismos. RESU EN La invención se refiere a una proteína de Piroplásmido o un fragmento inmunogénico de dicha proteína, y a un ácido nucleico que codifica dicha proteína de Piroplásmido o dicho fragmento inmunogénico. Además, la invención se refiere a fragmentos de cADN, moléculas de ADN recombinantes y vehículos recombinantes vivos comprendiendo dicho ácido nucleico. También la invención se refiere a células huésped comprendiendo dichos fragmentos de cADN, moléculas de ADN recombinantes y vehículos recombinantes vivos. Finalmente, la invención se refiere a vacunas comprendiendo una proteína de Piroplásmido o un fragmento inmunogénico de dicha proteína, a métodos para la preparación de tales vacunas, al uso de tales proteínas o fragmentos para propósitos de vacuna, y a pruebas de diagnóstico.