MXPA06002440A - Conjugados de polimero biodegradable-ligando y sus usos en el aislamiento de subpoblaciones celulares y en crioconservacion, cultivo y transplante de celulas. - Google Patents

Abstract

La invencion describe una composicion de particula-celula biodegradable que tiene por lo menos una particula biodegradable, al menos un grupo respectivo covalentemente unido a la misma, y una celula fija a la misma; la particula puede ser polilactida, un copolimero de polilactida-lisina, un copolimero de polilactida-lisina-polietilenglicol, almidon, o colageno; el grupo receptor puede ser un anticuerpo, un fragmento de un anticuerpo, una avidina, una streptavidina y una porcion de biotina; ademas, la particula tambien puede tener componentes matriz extracelulares diferentes al colageno; las composiciones de particula-celula pueden utilizarse para seleccion de celulas a partir de una poblacion, para cultivo celular de celulas dependientes de fijacion, para crioconservacion de celulas dependientes de fijacion, y para transplante como una terapia celular.

Description

CONJUGADOS PE POLIMERO BIODEGRADABLE-LIGANDO Y SUS USOS EN EL AISLAMIENTO DE SUBPOBLACIONES CELULARES Y EN CRIOPRESERVACION, CULTIVO Y TRANSPLANTE DE CELULAS CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se refiere generalmente a dispositivos médicos utilizados in vivo o in vitro para la producción y administración de sustancias médicamente útiles. Más particularmente la invención se refiere a composiciones de resinas naturales o sintéticas biodegradables conjugadas con ligandos reactivos. Además, la invención se refiere a métodos para el uso de dichas composiciones para enriquecimiento para subpoblaciones específicas de células, criopreservación celular, mantenimiento de células ex vivo, y terapia celular.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION Las células eucariontes en cultivo celular aislado son característicamente de dos tipos. Un tipo es capaz de sobrevivir y proliferar en cultivo de suspensión. Entre las células particularmente adecuadas para este modo de superviviencia, se encuentran las células derivadas a partir de cánceres y linfomas, y las células transformadas mediante agentes químicos o virales. En contraste, un segundo tipo de célula es aquel que requiere anclaje a un sustrato para superviviencia y proliferación de las células. Entre las células en esta última categoría se encuentran las células adherentes, tales ¾ como aquellas derivadas a partir de tejidos sólidos y no transformados, tipos celulares adherentes tales como aquellos a partir del hígado, pulmón, cerebro, etc, y especialmente poblaciones de célula progenitora a partir de tejidos sólidos. Frecuentemente, dichas células requieren unión a los componentes de la matriz extracelular y mantenimiento en medio hormonalmente definido, libre de suero para crecer y/o sobrevivir. Los componentes de la matriz pueden ser proteínas tales como colágena o laminina o pueden ser proteoglicanos tales como proteoglicanos heparan sulfato. La composición dei medio hormonalmente definido es única para cada tipo celular y a la etapa de maduración o el linaje del tipo celular; por lo tanto, las células progenitoras de un linaje dado tienen requerimientos que se superponen con los requerimientos de las células maduras del linaje pero éstas tienen ciertos requerimientos que son distintos. Estos requerimientos ex vivo de diversos tipos de célula adherente pueden haber sido definidos pero incluso cuando estén definidos no son fácilmente escalables; es decir, éstos se pueden establecer en cultivos de célula de rutina pero no se utilizan fácilmente en terapias clínicas, en cultivo de célula en masa, o en bioreactores que se pueden utilizar clínicamente o industrialmente. Además, las condiciones que funcionan para el almacenamiento de tipos de células adherentes, tal como criopreservación, no son prácticas cuando las células necesitan recuperarse después del descongelamiento y son utilizadas posteriormente en diversas formas. Por lo tanto, las células adherentes requieren métodos únicos para el almacenamiento de las células a largo plazo, para la separación de un tipo ¾ celular con respecto al otro, y para el manejo de las células en usos médicos anticipados de dichas células. Se han utilizado polímeros biodegradables para ingeniería de tejidos. Entre los polímeros biocompatibles y biodegradables más extensivamente investigados utilizados para la ingeniería genética, se encuentran la familia poli-(hidroxiácido-alfa) de polímeros y co-polímeros relacionados. Algunos de estos polímeros han sido aprobados por la F. D. A. para uso clínico. Por lo tanto, éstos son utilizados como los materiales poliméricos iniciales más viables en la presente invención. No obstante, la unión de las células a dichos polímeros permanece problemática. En la presente invención se describen composiciones y métodos que se dirigen a problemas asociados con las células dependientes de anclaje, por lo tanto satisfaciendo necesidades no alcanzadas relacionadas con la clasificación, preservación celular, propagación celular, y uso médico de las células.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La invención provee una composición de partícula polimérica biodegradable-célula que comprende al menos una partícula biodegradable, al menos un grupo receptivo covalentemente unido a ésta, y una célula anclada a dicho al menos un grupo receptivo. El grupo receptivo puede ser cualquier grupo adecuado, incluyendo, pero no limitado a, un anticuerpo, un fragmento ¾ de anticuerpo, una avidina, una estreptavidina, o una porción de biotina, un carbohidrato, un ligando sintético, proteína A, proteína G, o una combinación de los mismos. El grupo receptivo también puede ser él mismo un ligando capaz de llevar a cabo la interacción ligando-receptor. En otro aspecto, la invención provee un método de criopreservación para células dependientes de anclaje que comprende permitir que las células se anclen a una composición que comprende al menos una partícula biodegradable y congelamiento de la mezcla en la presencia de criopreservadores. Las células se pueden proveer para interactuar con las partículas como una suspensión sustancialmente de célula particular. En incluso otro aspecto, la invención provee un método para la separación de células que comprende proveer una composición que comprende al menos un polímero biodegradable, al menos un grupo receptivo covalentemente asociado al mismo, y al menos una célula anclada a dicho al menos un grupo receptivo, y al menos una célula no anclada a dicho al menos un grupo receptivo, y la remoción de la al menos una célula no anclada al polímero. Además, el polímero se puede ajustar dentro de una macropartícula, micropartícula o nano-partícula con grupos receptores funcionales. En incluso otro aspecto, la invención provee un método de cultivo celular de células dependientes de anclaje que comprende proveer una composición que tiene al menos un polímero biodegradabie, al menos un grupo receptivo covalentemente asociado, y al menos una célula adherente a ¾ dicho al menos un grupo receptivo, y poner en contacto esta composición con medio para cultivo de célula. En incluso otra modalidad, la invención provee un método de cultivo de célula de células dependientes de anclaje que comprende proveer una composición que tiene al menos un polímero biodegradabie, al menos un grupo receptivo covalentemente unido, y al menos una célula adherente a dicho al menos un grupo receptivo; poner en contacto esta composición con medio para cultivo de célula, y en donde la célula comprende al menos uno de un precursor hepático, un precursor hematopoiétlco, un fibroblasto, una célula mesenquimática, una célula cardiaca, una célula endotelial, una célula epitelial, una célula neuronal, una célula glial, una célula endocrina, o combinaciones de las mismas. En incluso otra modalidad, la invención provee un tratamiento de un sujeto que necesita de terapia celular, que comprende la administración al sujeto de una cantidad efectiva de una composición que comprende al menos un polímero biodegradabie, al menos un grupo receptivo covalentemente asociado a éste, y al menos una célula anclada a dicho al menos un grupo receptivo. El polímero para la terapia celular se puede ajustar dentro de una macropartícula, micropartícula o nano-partícula.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS La figura 1 ilustra la conjugación mediante acoplamiento directo con el grupo e-amino de lisina dentro de un receptor de proteína. La figura 2 ilustra la conjugación utilizando un enlace de residuo de polietilenglicol. La figura 3 ilustra la conjugación utilizando un acoplamiento biotina-estreptavidina o biotina-avidina. La figura 4 ¡lustra la conjugación utilizando un enlace al polietilenglicol biotinilado. La figura 5 ilustra la conjugación utilizando un enlace especie-específico, o de anticuerpo secundario.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION La presente invención se refiere a una composición que tiene un polímero biodegradable covalentemente conjugado a un grupo receptivo o ligando. Además, la invención se refiere a esta composición en combinación adicional con una célula. La célula se puede anclar al ligando receptivo o grupo. El ligando receptivo o grupo puede ser un anticuerpo o fragmento de anticuerpo en contra de un antígeno o receptor de superficie celular, una avidina, una estreptavidina, o una porción de biotina. La composición puede comprender adicionalmente uno o más componentes de matriz extracelular, por ejemplo colágena, fibronectina, laminina, o combinaciones de las mismas. La invención también se refiere a métodos de uso de dicha composición para la selección y aislamiento de poblaciones de células, criopreservación de la combinación de partícula celular, y cultivo celular de células dependientes de anclaje.

Definiciones Medio hormonalmente definido, libre de suero para células diploides (HDM-células diploides). Se encontró que este medio induce la expansión clonogénica, formación de colonia o división celular completa de subpoblaciones diploides de células parenquimales de hígado. Este medio consiste de cualquier medio basal rico (por ejemplo RPMI 1640, HAM's F12) que no contiene cobre y contiene poco calcio (< 0.5 mM) y se suplemento adicionalmente con insulina (1-5 ug/ml), transferrina/Fe (1-10 ug/ml), y con una mezcla de lípidos (una mezcla de ácidos grasos libres unidos a albúmina libre de ácido graso, altamente purificada; una adición opcional pero útil también puede ser lipoproteína de alta densidad a 10 ug/ml). Los detalles de la preparación de los ácidos grasos se anexa en la presente invención como el apéndice A. Las células alimentadoras embrionarias estromales como se definen en la presente invención son células alimentadoras mesenquimáticas estromales derivadas a partir del tejido embrionario. El ideal de las células hepáticas son las células estromales derivadas a partir de hígado embrionario; existe cierta evidencia, aunque es evidencia vaga, para la especificidad del tejido. Los inventores han definido la edad límite en ratas pero no en humanos (por ejemplo el estroma embrionario se obtiene idealmente a partir de hígados embrionarios de rata a partir de las edades gestacionales E13- E17). En humanos, nosotros podemos solamente adivinar como las edades gestacionales correspondientes aquellas tales como como hígados embrionarios de humano a partir de la semana 12-18 de gestación. No existen datos a partir del laboratorio de los inventores que confirmen esa especulación. No obstante, de manera más importante estas células alimentadoras son específicas de la edad, y la mayoría de las formas activas son a partir de tejido embrionario. Uno puede utilizar a las células "STO", línea celular estromal embrionaria derivadas a partir de embriones de ratón y utilizada de manera rutinaria para el mantenimiento de las células madre embrionarias (células ES). Las células STO no proporcionan el mismo efecto que el estroma hepático embrionario pero lo hicieron lo suficientemente bien que los investigadores las utilizaron para evitar tener que preparar cultivos primarios de tejidos embrionarias. La expansión clonogénica como se define en la presente invención se refiere a la células que pueden ser subcultivadas y se pueden expander repetidamente incluso a densidades de siembra muy bajas (finalmente 1 célula/plato), La formación de colonia implica la formación de una colonia de células a partir de las células sembradas pero implica un número limitado de divisiones (típicamente 5-7 divisiones celulares) durante un período de tiempo relativamente corto (1-2 semanas). Las células no se pueden subcultivar „ fácilmente, en caso de que se pueda hacer. A diferencia de la expansión clonal, la formación de colonia puede incorporar pasos de diferenciación que impiden la división celular indefinida y subcultivo. Las células madre hepáticas primitivas se definen en la presente invención como células pluripotentes con potencial de expansión clonogénica y con co-expresión de citoqueratina 19 (CK19) y albúmina (por ejemplo marcadores biliares y hepatocíticos, respectivamente) pero no presentan expresión de la alfa-fetoproteína. En los linajes hepáticos de humano a partir de hígados fetales, estas células también co-expresan N-CAM, CA epitelial (EP-CAM), y CD 133 y se expanderán clonogénicamente en artículos plásticos para cultivo celular y en HDM-células diploides. Las células madre hepáticas proximales (también denominadas hepatoblastos) como se definen en la presente invención son células pluripotentes con potencial de expansión clonogénica y con co-expresión de citoqueratina 19 (CK19), albúmina, y alfa-fetoproteína. En los linajes hepáticos de humano a partir de hígados fetales, estas células también co-expresan I- CAM, CAM epitelial (Ep-CAM) y CD133 y se expanderán clonogénicamente sobre células alimentadoras estromales embrionarias (por ejemplo células STO) y en HDM-células diploides. Los progenitores comprometidos como se definen en la presente invención son progenitores unipotenciales que pueden dar lugar ya sea a hepatocitos (progenitores hepatocíticos comprometidos) o células epiteliales biliares (progenitores biliares comprometidos). Estas células formarán colonias sobre células alimentadoras estromales embrionarias y en HDM-células diploides. Aún no está claro si estas células se pueden expander clonogénicamente bajo estas condiciones u otras condiciones. Los hepatocitos adultos diploides (también denominadas "hepatocitos pequeños") como se define en la presente invención son hepatocitos diploides que tienen un intervalo de tamaño de 15-20 um, que expresan diversas funciones específicas de adultos (por ejemplo PEPCK, glicógeno), no expresan EP-CAM, CD133, o N-CAM, y formarán colonias bajo diversas condiciones pero lo hacen así si se siembran idealmente sobre células alimentadoras estromales embrionarias y en HDM-células diploides pero se suplementan adicionalmente con el factor de crecimiento epidérmico (EGF) a 10-50 ng/ml. Los hepatocitos poliploides como se definen en la presente invención son hepatocitos que son poliploides (puede tener un intervalo de tetraploide o 4N hasta 32N dependiendo de las especies de mamífero). Estas son las células maduras del hígado y se ha encontrado que llevan a cabo síntesis de ADN pero con citocinesis limitada, si es que se presenta, bajo condiciones regenerativas. Los progenitores como se define en la presente invención es un término amplio que comprende todas las subpoblaciones de células madre y progenitores comprometidos.

Los precursores como se define en la presente invención es un término funcional que indica que una subpobiación específica de células es un precursor para otra subpobiación de células. Por ejemplo, las células madre hepáticas primitivas son precursoras de los hepatoblastos; los hepatoblastos son precursores de los progenitores comprometidos; los hepatocitos adultos diploides son precursores de los hepatocitos poliploides. Como se utiliza en la presente invención, el término "criopreservación" se refiere al congelamiento de las células y/o tejidos bajo condiciones que mantienen la viabilidad de las células después del descongelamiento subsecuente. Las técnicas generales para criopreservación de células se conocen bien en la técnica; véase, por ejemplo, Doyle et al., (eds.), 1995, Cell & Tissue Culture: Laboratory Procedures, John Wiley & Sons, Chichester; y Ho y Wang (eds.), 1991 , Animal Cell Bioreactors, Butterworth-Heinemann, Boston, los cuales se incorporan en la presente invención como referencias. Los conjugados de polímero biodegradable-ligando de la invención se denominan partículas receptivas a la célula, o más simplemente partículas. Estos términos se utilizan con todas las modalidades de los conjugados de polímero biodegradable-ligando incluyendo, pero no limitados a, conjugados de anticuerpo directo, conjugados a los fragmentos de anticuerpos, conjugados de adivina, conjugados de biotina, conjugados de fibronectina, conjugados de partículas biodegradables y anticuerpo con enlazadores de espaciador grande, taies como, pero no limitados a, enlazadores PEG y conjugados anti-anticuerpo.

) Preparación de polímeros Varios tipos de polímeros biocompatibles y biodegradables son adecuados para uso en la presente invención, incluyendo, pero no limitado a, poliláctido, copolímero poliláctido-lisina, copolímero poliláctido-Iisina-polietileno, almidón, alginato y proteínas. Las proteínas adecuadas son colágena, gelatina, poli-lisina, laminina, fibronectina, o combinaciones de los mismos. Una modalidad de la invención utiliza los copolímeros poli-(hidroxiácido-alfa)-lisina, y/o copolímero poli(láctido-co-glicólido, PLGA). PLGA se puede activar mediante el reactivo de acoplamiento tal como, pero no limitado a, glutaraldehído antes del acoplamiento con ligandos o proteínas que contienen amino (Seifert, Romaniuk y Groth, 1997 Biomaterials 18: 1495-1502). Los polímeros PLGA biodegradables también se pueden acoplar con grupos amino de la proteína A o de la proteína G, o de otros receptores protéicos mediante el enlazador bifuncional tal como (ácido 3[(2-aminoetil)ditio]propiónico, AEDP) que es un enlazador comercialmente disponible. En la presente invención, la familia de polímeros y copolímeros poli-(hidroxiácido-alfa) también se utiliza para preparar glóbulos biocompatibles y biodegradables sin grupos reactivos en la superficie, por lo tanto proveyendo la estructura núcleo de partículas poliméricas degradables.

Como se utiliza en la presente invención, un polímero, o matriz polimérica, es "biocompatible" si el polímero, y cualesquiera productos de degradación del polímero, son sustancialmente no tóxicos al recipiente y tampoco presentan efectos deletéreos o adversos significativos sobre el cuerpo del recipiente, tal como una reacción inmunológica significativa en el sitio de la inyección. Como se utiliza en la presente invención, "biodegradable" significa que la composición se degradará o corroerá in vivo para formar especies químicas pequeñas. La degradación puede resultar, por ejemplo, mediante procesos enzimáticos, químicos y/o físicos. Los polímeros biocompatibles, biodegradables adecuados incluyen, por ejemplo, y no a manera de limitación, poli(láctidos), poli(glicólidos), poli(láctido-co-glicóiidos), poli(ácido láctico)s, poli(ácido glicóIico)s, poli(ácido láctico-co-ácido glicólico)s, policaprolactona, policarbonatos, poli(aminoácidos), poliortoésteres, polieterésteres, copolímeros de polietileno y poliortoéster, mezclas y copolímeros de los mismos. Por ejemplo, y no a manera de limitación, los polímeros biocompatibles, no biodegradables adecuados para uso en la presente invención incluyen polímeros no biodegradables seleccionados a partir del grupo que consiste de poliacrilatos, polímeros de etilen-vinil acetatos y otros acetatos de celulosa sustituidos con acilo, poliuretanos no degradables, poliestirenos, cloruro de polivinilo, fluoruro de polivinilo, poli(vinil imidazol), clorosulfonato de poliolefinas, óxido de polietileno, mezclas y copolímeros de los mismos. Adlcionalmente, se pueden modificar las funcionalidades terminales de un polímero. Por ejemplo, los poliésteres pueden ser bloqueados, no bloqueados o una mezcla de poliésteres bloqueados y no bloqueados. Un poliéster bloqueado es como se define clásicamente en la técnica, específicamente que tienen grupos carboxílico terminal bloqueados. Generalmente, el grupo bloqueador se deriva a partir del iniciador de la polimerización y típicamente es un grupo alquilo. Un poliéster no bloqueado clásicamente es como se define en la técnica, específicamente teniendo grupos carboxílico terminal libres. Los pesos moleculares aceptables para los polímeros utilizados en la presente invención se pueden determinar por una persona experta en la técnica tomando en consideración factores tales como la velocidad deseada de degradación de polímero, propiedades físicas tales como fuerza mecánica, y velocidad de disolución del polímero en el solvente. Típicamente, un intervalo de pesos moleculares aceptables es de aproximadamente 2,000 Daltones a aproximadamente 2,000,000 Daltones. En una modalidad preferida, el polímero es un polímero biodegradable o copolímero. En una modalidad más preferida, el polímero es un poli(láctido-co-glicólido) (en adelante "PLGA") o derivados con una relación láctido:glicólido de aproximadamente, pero no limitado a, 1. y un peso molecular de aproximadamente 5,000 Daltones a aproximadamente 70,000 Daltones. En una modalidad incluso más preferida, el peso molecular del PLGA utilizado en la presente invención tiene un peso molecular de aproximadamente 5,000 Daltones a aproximadamente 42,000 Daltones. En una modalidad, los copolímeros que contienen aminoácidos con cadenas laterales reactivas, tal como lisina, están co-polimerizados con un monómero que contiene ácido láctico, el monómero que contiene ácido glicóllco, o cualquier otro monómero con un mecanismo similar de polimerización. Como ejemplos, el monómero que contiene ácido láctico puede ser un láctido y el monómero que contiene ácido glicólico puede ser un glicólido. Los sitios reactivos en los aminoácidos están protegidos con grupos protectores estándares. De manera similar, el polímero con grupos laterales protegidos se puede desproteger para generar grupos amino reactivos. El copolímero poli ácido (láctico)-lisina desprotegido se puede acoplar covalentemente con agentes receptivos mediante la conjugación del grupo amino épsilon de los residuos de lisina para formar conjugados directamente unidos después de la elaboración del copolímero poli ácido (láctico)-Iisina dentro de las partículas porosas deseables. En algunas modalidades el grupo receptivo puede ser una proteína incluyendo, pero no limitado a, un anticuerpo, fragmento de anticuerpo, colágena, laminina, fibronectina, avidina o estreptavidina, o un grupo ligando de molécula pequeña incluyendo, pero no limitado a, biotina y péptidos que contienen RGD, proteína A o proteína G. Como se utiliza en la presente invención, los anticuerpos contemplados para uso en la presente invención incluyen, pero no se limitan a anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales (mAbs), anticuerpos humanizados o quiméricos, anticuerpos de cadena sencilla, fragmentos Fab, fragmentos F(ab').sub.2, fragmentos producidos por una librería de expresión de Fab, anticuerpos anti-idiotípicos (anti-ld), y fragmentos de unión al epítope de cualesquiera de los anteriores. Como se utiliza en la presente invención, un grupo ligando de moléculas pequeñas es uno que tiene un peso molecular no mayor de 10,000 daltones, más preferiblemente menos de 5,000 daltones. Por ejemplo, las tecnologías combinatoriales se pueden emplear para construir librerías combinatoriales de moléculas orgánicas pequeñas o péptidos pequeños. Véase generalmente, por ejemplo, Kenan et al., Trends Biochem. Se, 19: 57-64 (1994); Gallop et al., J. Med. Chem., 37: 1233-1251 (1994); Gordon et al., J. Med. Chem., 37: 1385-1401 (1994); Ecker et al., Biotechnology, 13: 351-360 (1995). Dichas librerías combinatoriales de compuestos se pueden utilizar como el grupo receptivo en la presente invención. Los péptidos al azar se pueden proveer en, por ejemplo, librerías recombinantemente expresadas (por ejemplo, librerías de exhibición de fago), o librerías basadas en traducción in vitro (por ejemplo, librerías de exhibición de ARNm, véase Wilson et al., Proc Nati Acad Sci 98: 3750-3755 (2001)). Los ligandos de moléculas pequeñas también incluyen aquellas moléculas tales como carbohidratos, y compuestos tales como aquellos descritos en la Patente de E.U.A No. 5,792,783 (ligandos de molécula pequeña se definen en la presente invención como moléculas orgánicas con un peso molecular de aproximadamente 1000 daltones o menos, los cuales sirven como ligandos para un blanco vascular o marcador de célula vascular), péptidos seleccionados mediante técnicas de exhibición de fago tales como aquellas descritas en Patente de E.U.A No. 5,403,484, y péptidos diseñados de novo a ser complementarios a los receptores expresados por tumor; determinantes antigénicos; u otros grupos direccionadores del receptor. Como se utiliza en la presente invención, el término "RGD" se refiere no solamente a la secuencia peptídica Arg-Gly-Asp, se refiere genéricamente a la clase de secuencias peptídicas mínimas o núcleo que median las interacciones específicas con las integrinas. Por lo tanto, una "secuencia que direcciona RDG" abarca todo el género de dominios para unión a la integrina. Se sabe que el direccionamiento de una molécula a la superficie de la célula facilita la toma de la molécula, presumiblemente a través de medios endocíticos. Véase, por ejemplo, Hart et al., J. Biol. Chem. 269: 12468-74 (1994) (internalización de! fago que contiene RGD); Goldman et al, Gene Ther. 3: 811-18 (1996) (infección adenoviral mediada por RGD) y Hart et al., Gene Ther. 4: 1225-30 (1997) (transfección mediada por RGD). Por lo tanto, un dominio direccionador en muchos casos actuará también como un dominio de internalización. Se conocen en la técnica muchas de dichas señales direccionadoras. Una clase de señales direccionadoras, la cual se une específicamente a las integrinas (puntos de unión a la matriz extracelular), contiene la secuencia señal peptídica basada en Arg-Gly-Asp (RGD). Incluso otra clase incluye péptidos que tienen un núcleo de lle-Lys-Val-Ala-Val (IKVAV). Véase Weeks et al., Cell Inmunol. 153: 94-104 ( 994). La figura 1 se refiere a la naturaleza hidrófila del enlace de lisina que permite la reacción de acoplamiento para proceder en un medio acuoso. Como se ilustra en la figura 2, para extender adicionalmente la capacidad del co-polímero en las proteínas de unión (incluyendo, por ejemplo, anticuerpos), ios enlazadores de polietileno ("PEG") se pueden activar mediante cloruro de sulfonilo y análogos, y se acoplan a los grupos amina primarios, tales como, pero no limitados a, grupo amino épsilon de residuos de lisilo o una proteína, por lo tanto formando un enlace extendido con la distribución tridimensional y características estructurales. Las estructuras enlazadoras de diversas longitudes y linearidades que están comercialmente disponibles, son adecuadas para la invención, de manera que se obtiene una variedad de distribuciones de superficie. Una variedad de enlazadores, tales como, sin limitación, aquellos comercialmente disponibles a partir de, Pierce Chemical Co. son adecuados para uso en los métodos de la presente invención. Alternativamente, dichas estructuras enlazadoras se pueden sintetizar utilizando métodos de química orgánica sintética de rutina disponibles a aquellos expertos en la técnica. La distribución en la superficie de los sitios receptivos es una propiedad importante que afecta la densidad y distribución de las moléculas del receptor direccionador de la célula sobre la superficie de los polímeros novedosos. En cualquier evento, la distribución en la superficie de los sitios receptivos agrupados adoptados debe ser suficiente 9 para permitir los contactos celulares que son Importantes para el crecimiento celular y la diferenciación, movilidad y morfología (por ejemplo, Cima, L. G 994, J. Cellular Biochemistry 56: 155-161). La distribución en la superficie de los sitios receptivos se puede determinar rutinariamente en una base caso a caso para el tipo celular específico que se cosecha utilizando ensayos específicos disponibles a aquellos expertos en la técnica. Dichas caracterizaciones incluyen, sin limitación, determinación de la unión de receptores marcados radiactivamente o fluorescentemente dirigidos por los ligandos sobre la superficie celular (por ejemplo, Rolwey J. A., Madlambayan, G., Mooney, D. J. 1999, Biomaterials 20: 45-53; Massia, S. P., Hubbell, J. A. 991, J. Cell Biology 114: 1089- 100), análisis de reflectividad de rayos X y de neutrón (por ejemplo, Russell, T. P. 1990 Material Science Reports 5: 71-271), y análisis de unión de anticuerpos marcados con inmunofluorescencia de grupos receptivos en la superficie (por ejemplo, Massia, S. P., Hubbell, J. A. 1991, J. Cell Biology 114: 1089-1100. Como se ilustra en la figura 2, dependiendo de la estructura de los enlazadores, los copolímeros terminales pueden tener enlazadores lineales o ramificados con grupos reactivos particulares o múltiples. Los enlazadores preferiblemente son hidrófilos, y se pueden exponer al medio acuoso, haciéndose accesibles a los agentes acopladores que ingresan. 2) Fabricación de polímeros novedosos dentro de andamios o glóbulos Otro aspecto importante la presente invención se refiere a la fabricación de los polímeros biodegradables dentro de partículas, glóbulos, fibra, o andamios. Las partículas porosas de un tamaño hasta aproximadamente 1000 micrómetros (mieras) se pueden preparar con el método de la presente invención. Además, la invención describe maneras para modificar la porosidad de la superficie, la porosidad interna de las partículas, la degradación, y la distribución de los grupos reactivos de la superficie. Las partículas poliméricas más grandes de aproximadamente 500 mieras en diámetro, denominadas macropartículas, se preparan mediante un congelamiento rápido a baja temperatura de las gotas poliméricas embebidas con NaCI o partículas cristalinas similares de un tamaño definido. Las partículas poliméricas pueden tener intervalos de tamaño incluyendo, pero no limitados a, aproximadamente 500 mieras, aproximadamente 550 mieras, aproximadamente 600 mieras, aproximadamente 650 mieras, aproximadamente 700 mieras, aproximadamente 750 mieras, aproximadamente 800 mieras, aproximadamente 850 mieras, aproximadamente 900 mieras, aproximadamente 950 mieras, aproximadamente 1000 mieras, aproximadamente 1050 mieras, aproximadamente 1 ,100 mieras, o más grandes como la necesidad pueda generar. Este método crea una estructura porosa después de lixiviación de los cristales embebidos por un solvente elegido para la disolución del cristal pero no del polímero. Para la fabricación de partículas de un tamaño de aproximadamente 200 a aproximadamente 500 mieras, denominadas micropartículas, una emulsión de un polímero de una formulación definida se dispersa como gotitas finas en un medio acuoso en la presencia de un agente tensioactivo. La dispersión continua de las gotitas permite la extracción y evaporación del solvente, llevando a la formación de partículas poliméricas solidificadas. Las micropartículas poliméricas pueden tener intervalos de tamaño incluyendo, pero no limitados a, aproximadamente 200 mieras, aproximadamente 250 mieras, aproximadamente 300 mieras, aproximadamente 350 mieras, aproximadamente 400 mieras, aproximadamente 450 mieras, aproximadamente 450 mieras, aproximadamente 500 mieras, etc. Las partículas poliméricas pequeñas menores de aproximadamente 200 mieras en diámetro, denominadas nanopartículas, se preparar mediante la rápida dispersión de la solución polimérica en gotitas finas utilizando fuerzas cortantes ultrasónicas típicamente administradas por un atomizador ultrasónico. En polímero de las partículas pequeñas se solidifica a esas bajas temperaturas y el solvente para el polímero se remueve mediante un segundo o tercer solvente. Las micropartículas poliméricas pueden tener intervalos de tamaño incluyendo, pero no limitado a, aproximadamente 25 mieras, aproximadamente 50 mieras, aproximadamente 75 mieras, aproximadamente 100 mieras, aproximadamente 125 mieras, aproximadamente 150 mieras, aproximadamente 175 mieras, aproximadamente 200 mieras, etc. Por lo tanto, la partícula puede ser una macropartícula, micropartícula, nanopartícula, o cualquier combinación de las mismas. El polímero también se puede formar hacia fibras, incluyendo fibras con orificios. 3) Acoplamiento directo del anticuerpo y otras proteínas sobre el ácidopoliláctico (-lisina copolímero) Las proteínas de interés se pueden conjugar a partículas poliméricas biodegradables o andamio utilizando reactivos para entrecruzamiento. Entre las proteínas adecuadas, pero sin limitación, se encuentran los anticuerpos, avidina, estreptavidina, y proteínas de la matriz extracelular, péptidos que contienen la secuencia RGD, proteína A G. Los anticuerpos que direccionan los marcadores de superficie celular y otras proteínas se pueden conjugar directamente con los grupos amino épsilon de los residuos de iisilo del copolímero presente en la superficie de los glóbulos poliméricos formando así un anticuerpo u otra proteína unida a la superficie. Se puede utilizar una variedad de reactivos para acoplamiento, por ejemplo, pero no limitado a, glutaraldehído, que están comercialmente disponibles (por ejemplo, a partir de Pierce Chemical Co) para acoplar el anticuerpo u otra proteína al polímero biodegradable. Por ejemplo, el clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropiI)carbodiimida se puede hacer reaccionar con regulador de pH en el intervalo de pH 4-6 en la presencia del anticuerpo, u otra proteína, y las partículas. La unión también puede ocurrir en general como un proceso de dos pasos utilizando N-hidroxi succinimida éster del ácido 6-(4-azido-2-nitrofenilamino)hexanóico. En este método, la partícula inicialmente se hace reaccionar en la oscuridad con el reactivo succinimida, a un intervalo de pH de 6.5 a 8.5. Subsecuentemente se añade anticuerpo u otra proteína y el acoplamiento se inicia mediante la irradiación a 250-350 nanometeros para producir un nitreno reactivo. El nitreno se inserta dentro de las moléculas cercanas, incluyendo el anticuerpo. Los reactivos que no reaccionaron se pueden remover subsecuentemente mediante lavado un medio acuoso. Numerosos otros reactivos que entrecruzan los grupos amino primarios son igualmente adecuados para unión del anticuerpo o de otra proteína a las partículas biodegradables, incluyendo: anhídrido S-acetilmercaptosuccínico; N-hidroxi-succinimida éster del ácido S-acetiltioglicólico; N-hidroxi succinimida éster del ácido 4-azidobenzóico; N-(5-azido-2-nitrobenzoiloxi)succinimida; N-hidroxisuccinimida éster del ácido bromoacético; diclorhidrato de dimetil 3,3'-ditio-bis(propionimidato); diclorhidrato de dimetil pimelimidato; diclorhidrato de dimetil suberimidato; 4,4', ditio-bis(fenil azida); N-(hidroxisuccinimida éster) del 3,3', ditio-bis(ácido propiónico); etilen glíco l-bis(N-hid roxi succinimida éster del ácido succínico); N-hidroxisuccinimida éster del ácido 6-(iodoacetamido) capróico; N-hidroxi succinimida éster del ácido iodoacético; N-hidroxisuccinimida éster del ácido 3-maleimidobenzóico; N-hidroxi succinimida éster del ácido gamma- maleimidobutírico; N-hidroxisuccinimida éster del ácido épsílon maleimidocapróico; N-hidroxi succinimida éster del ácido 4-(N-maIeimidometiI) ciclohexan-1-carboxílico; sal sódica del 3-sulfo-N-succinimida éster del ácido 4-(N-maleimidomet¡l)ciclohexan-1-carboxílico; N-hidroxisuccinimida éster del ácido beta maleimidopropiónico; bis(polioxietilenbis[imidazoil carbonil]); N-hidroxisuccinimida éster del ácido 3-(2-piridilditio)prop¡ónÍco; bis(N-hidroxi succinimida éster) del ácido subérico; y bis(sulfosuccinimidil)suberato. El acoplamiento del anticuerpo o de otra proteína a las partículas biodegradables se puede presentar a varias concentraciones de entrecruzamiento de aproximadamente 10"9 a aproximadamente 10"3 M. En una modalidad, se utilizó la concentración aproximadamente 10"5 M. La concentración del anticuerpo puede ser entre aproximadamente 20 ng/ml y aproximadamente 20 mg/ml. La otra concentración de proteína puede ser de entre aproximadamente 5 mg/ml y aproximadamente 50 mg/ml. En una modalidad, la concentración del anticuerpo o de otra proteína para la reacción de acoplamiento es de aproximadamente 2 mg/ml. La concentración de la partícula puede ser entre aproximadamente 10"10 y aproximadamente 10"2 M de equivalentes de lisina. En una modalidad, la concentración de la partículas es de aproximadamente 10"3 M de equivalentes de lisina. La distribución de superficie, la longitud de la unión y la optimización de la interacción entre los anticuerpos, u otras proteínas, y marcadores de superficie celular se pueden modificar por aquellos expertos en la técnica utilizando, por ejemplo, enlazadores de polietiieno (PEG) para acoplamiento del polímero biodegradable al anticuerpo. Uno de dichos enlazadores de polietiieno se describió anteriormente como bis(poli-oxieíileno bispmidazolil carbonilo]). La especificidad de los anticuerpos unidos determina principalmente la selectividad celular de los conjugados de anticuerpo-polímero. Los fragmentos de anticuerpos, por ejemplo Fab o fragmentos Fab, incluyendo Fab', son adecuados para unión al polímero biodegradable. Los anticuerpos monoclonales para uso en los métodos de la presente invención se pueden obtener mediante cualquier técnica la cual se provee para la producción de moléculas de anticuerpo por líneas celulares continuas en cultivo. Estas incluyen, pero no se limitan a la técnica de hibridoma de Kohler y Milstein, (Nature, 256: 495-497,1975; y Patente de E.U.A No. 4,376,110), la técnica de hibridoma de célula B de humano (Kosbor et al., Immunology Today, 4: 72, 1983; Colé et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 80: 2026-2030, 1983), y la técnica de hibridoma BV (Colé et al., Monoclonal Antibodies And Cáncer Therapy (Alan R. Liss, Inc. 1985), pp. 77- 96. Dichos anticuerpos pueden ser de cualquier clase de ¡nmunoglobulina incluyendo IgG, IgM, IgE, IgA, IgD y cualquier subclase de los mismos. El hibridoma que produce los mAb de esta invención se pueden cultivar ¡n vitro o in vivo. La producción de altos títulos de mAbs in vivo hace a éste el método de producción actualmente preferido. Además del uso de anticuerpos monoclonales en el método de la presente invención, también se pueden utilizar los anticuerpos quiméricos y anticuerpo de cadena sencilla. Un anticuerpo quimérico es una molécula en la cual diferentes porciones se derivan a partir de diferentes especies animales, tales como aquellas que tienen una región variable derivada a partir de un mAb de murino y una región constante derivada a partir de una inmunoglobulina de humano. Los "anticuerpos quiméricos" se puedan realizar mediante el procesamiento alternativo de los genes a partir de una molécula de anticuerpo de ratón de especificidad antigénica apropiada junto con los genes a partir de una molécula del anticuerpo de humano de actividad biológica apropiada (véase, Morrison et al., Proc. Nati. Acad. Sci., 81 : 6851-6855, 1984; Neuberger et al., Nature, 312: 604-608, 1984; Takeda et al., Nature, 314: 452-454, 1985; y Patente de E.U.A No. 4,816,567). Alternativamente, las técnicas descritas para la producción de anticuerpos de cadena sencilla (por ejemplo, Patente de E.U.A No. 4,946,778; Bird, Science, 242: 423-426,1988; Huston et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 85: 5879-5883, 988; y Ward et al., Nature, 334: 544-546, 1989), y para la elaboración de anticuerpos monoclonales humanizados (Patente de E.U.A No. 5,225,539), se pueden utilizar para producir anticuerpos de cadena sencilla para uso en los métodos de la presente invención. En una modalidad, las partículas se revisten con una matriz extracelular natural, permisiva al crecimiento ("ECM") y entrecruzada para formar una superficie de matriz para el anclaje de las células a la matriz. Por lo tanto, estas partículas revestidas con ECM proveen un soporte de anclaje para las células dependientes de anclaje. Los entrecruzamientos anteriormente mencionados se utilizan para unir la ECM a las partículas utilizando métodos estándares en la técnica. La ECM puede incluir T cualesquiera de las variantes de colágena, fibronectina, laminina, o combinaciones de las mismas. En otra modalidad, la avidina o estreptavidina se conjugan a las partículas biodegradables mediante entrecruzamiento con entrecruzadores utilizando métodos estándares en la técnica. Las moléculas poliméricas se pueden entrecruzar a la proteína de cualquier manera adecuada para formar un conjugado activo de conformidad con la presente invención. Por ejemplo, los polímeros biodegradables pueden ser entrecruzadores utilizando agentes entrecruzadores bi- o poli-funcionales los cuales se unen covalentemente a dos o más moléculas poliméricas y protéicas. Los agentes entrecruzadores bifuncionales incluyen derivados de aldehidos, epoxis, succinimidas, carbodiimidas, maleimidas, azidas, carbonates, isocianatos, divinil sulfona, alcoholes, aminas, imidatos, anhídridos, haluros, silanos, diazoacetato, aziridinas, y los similares. Alternativamente, el entrecruzamiento se puede lograr mediante el uso de oxidantes y otros agentes, tales como peryodatos, los cuales activan las cadenas laterales o porciones en el polímero de manera que éstos puedan reaccionar con otras cadenas laterales o porciones para formar los enlaces del entrecruzamiento. Un método adicional de entrecruzamiento comprende la exposición de polímeros y proteínas a radiación, tales como radiación gamma, para activar el polímero lateral para permitir las reacciones de entrecrüzamiento. Los conjugados se pueden formar entre partículas biodegradables y proteínas incluyendo, pero no limitadas a, anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, anticuerpos quiméricos o fragmentos de los mismos, colágena I, colágena III, colágena IV, laminina, fibronectina, avidina, y estreptavidina. 4) Biotinilación de grupos reactivos sobre superficies de glóbulos poliméricos Para preparar una superficie químicamente flexible, fuerte, para el acoplamiento del anticuerpo, la presente Invención contempla el uso del complejo biotina-avidina o biotina-estreptavidina, como un medio de unión el anticuerpo a la superficie de la partícula biodegradable. Con referencia a la figura 3, los grupos épsilon-NHb de lisilo del copolímero son biotinilados utilizando reactivos para biotinilación habituales o comercialmente disponibles. Un equipo reactivo comercial adecuado es Sigma product BK-101 , el cual utiliza un reactivo sulfo-NHS para biotinilación. Para algunos usos, un reactivo para biotinilación que se puede escindir se puede utilizar como se encuentra en, por ejemplo, el equipo comercial BK-200 (Sigma). Después de la incorporación de la biotina dentro del polímero biodegradable, los conjugados de anticuerpo separadamente preparados con avidina o estreptavidina se pueden hacer reaccionar con el polímero bíotinilado. Los conjugados de avidina-anticuerpo o alternativamente conjugados de estreptavidina-anticuerpo se pueden preparar mediante métodos estándares utilizando, por ejemplo, los reactivos para entrecruza miento anteriormente listados. En una modalidad alternativa el polímero biodegradable se enlaza covalentemente a avidina o a estreptavidina utilizando reactivos para entrecruzamiento tales como carbodiimida, u otros reactivos como se listaron anteriormente. El polímero biodegradable enlazado a avidina o a estreptavidina se hace reaccionar entonces con anticuerpo biotinilado para producir un anticuerpo unido, aunque no covalentemente, a la partícula polimérica biodegradable. Con referencia a la figura 4, estos métodos permiten el uso de cualquier anticuerpo biotinilado para asociarse con la estreptavidina en la superficie, produciendo así un anticuerpo unido a la superficie que dirige un marcador de superficie celular. 5) Acoplamiento de anticuerpos mediante conjugación anticuerpo-anticuerpo Con referencia ahora a la figura 5, se ilustra una modalidad alternativa de la invención para el anticuerpo de unión. La figura 5 ilustra el uso de un anticuerpo especie específico dirigido en contra de la porción Fc del anticuerpo direccionador de la célula en una especie animal diferente de aquella utilizada para generar el anticuerpo direccionado a un marcador de superficie celular. Por ejemplo, un anticuerpo en contra de un marcador de superficie celular en el ratón, se enlaza a un anticuerpo monoclonal anti-Fc generado al marcador Fc de ratones. Los anticuerpos anti-Fc se pueden conjugar directamente con el copolímero poli (ácido láctico )-Iisina o enlace PEG activado del copolímero, creando así un anticuerpo de superficie que direcciona a los marcadores de superficie celular respectivos. Alternativamente, estos anticuerpos especie específicos pueden ser biotinilados y posteriormente conjugados con la avidina o estreptavidina de superficie en las partículas poliméricas, como se ilustra en la figura 5. La presente invención crea así un anticuerpo de superficie que reconoce un grupo de anticuerpos que comparten el dominio común Fc. Una ventaja de este método es que los anticuerpos en contra de los marcadores de superficie celular pueden ser unidos sobre la superficie de la partícula polimérica sin la necesidad de modificación química previa. 6) Selección de anticuerpos que díreccionan los marcadores de superficie celular En la presente invención se puede utilizar un amplio intervalo de anticuerpos a los marcadores de superficie de las células hepáticas y células no hepáticas. Estos anticuerpos incluyen anticuerpos comercial mente disponibles, anticuerpos preparados por el inventor, y anticuerpos preparados por otros. Estos anticuerpos pueden incluir anticuerpos a ICAM-1 , anti-RT1Aa,bJ de rata o su equivalente inhumano, anticuerpos anti- HC l, anticuerpos a integrinas, anticuerpos a receptores de factores de crecimiento, y anticuerpos a glicoproteínas.

EJEMPLOS DE LAS COMPOSICIONES Y USOS PE LA INVENCIÓN Los siguientes ejemplos específicos se proveen para auxiliar mejor al lector en los diversos aspectos de la práctica de la presente invención. Puesto que estos ejemplos específicos son meramente ilustrativos, ninguna de las siguientes descripciones debe ser considerada como limitante de la invención de ninguna forma. Por supuesto dichas limitaciones, se definen solamente por las reivindicaciones anexas.

(I) Uso de los conjugados de polímero biodeoxadable-anticuerpo para la unión de células y aislamiento de poblaciones celulares Las partículas poliméricas unidas con anticuerpos que direccionan los marcadores de superficie celular se incuban con suspensiones de una población mezclada de células bajo condiciones cercanas a las fisiológicas. Por lo tanto se utilizan temperaturas entre 0 y 40°C, pH entre aproximadamente 6 y aproximadamente 7.5 y soluciones isotónicas. En una modalidad la células se incuban con conjugados de partícula-anticuerpo a aproximadamente 25°C, pH aproximadamente 7.0 en Hank's BSS por aproximadamente 30 minutos, o más. La interacción anticuerpo-receptor de superficie facilita la unión de las células direccionadas a los glóbulos poliméricos. La invención contempla la interacción de múltiples células con cada partícula polimérica biodegradable, o la interacción de varios glóbulos de micropartículas con una sola célula, o cualquier relación entre estos. Un experto en la técnica puede ajustar la densidad de superficie de los anticuerpos y la longitud de unión para optimizar la interacción de las células y partículas para cualquiera de múltiples finalidades. Mediante estos medios una población particular de células como se identifica por el anticuerpo se enlaza a los conjugados de partícula-anticuerpo. Por lo tanto, las partículas permitan una fácil separación de una de las poblaciones celulares a partir una población mezclada. En otras palabras, la presente invención constituye un método de clasificación positiva y enriquecimiento de una población selecta de células. Los conjugados de partícula-anticuerpo se pueden utilizar igualmente en un procedimiento de clasificación negativa, o eliminación, es decir, para eliminar las poblaciones celulares que no se consideran de interés mediante el uso de anticuerpos seleccionados para aquellas poblaciones particulares. En un ejemplo particular, los conjugados de partícula-anticuerpo se utilizan para aislar células mesenquimáticas, para separarlas de otras células incluyendo progenitores hepáticos. Los conjugados de partícula-anticuerpo preparados con anticuerpos a las células mesenquimáticas se incuban con una población celular mezclada que contiene células mesenquimáticas. Después de la incubación, las partículas con células adherentes son aisladas y sembradas dentro de una cámara para cultivo celular con compartimientos separados. Otras células progenitores, por ejemplo, progenitores hepáticos, se siembran entonces dentro de otros compartimientos. Cuando, en este ejemplo, los compartimientos tienen una conexión contigua de medio, como, por ejemplo, en un plato Transwell®, entonces se observa la interacción remota de los progenitores hepáticos y células madre mesenquimáticas. Las partículas se pueden utilizar para enriquecer una célula en una población celular mediante el anclaje de las células a las partículas. Las células ancladas a las partículas pueden ser células hepáticas, precursores hepáticos, fibroblastos, células endocrinas, células endoteliales, o cualquier célula dependientes de anclaje. Las células no ancladas a la partícula biodegradable puede ser cualquier célula no dependiente de anclaje incluyendo células hematopoiéticas, precursores hematopoiéticos, eritrocitos, células leucémicas, y células linfoides, y células que no tienen los receptores de superficie direccionados por el anticuerpo-polímero de superficie.

(II) Uso de los conjugados de polímero biodeqradable-anticuerpo para cultivo ex vivo de conjugados de partícula-célula v su uso en un bioreactor tridimensional Las partículas biodegradables conjugadas con matriz extracelular, como se describió anteriormente, se incuban con células dependientes de anclaje. El uso de matriz extracelular provee un ambiente favorable para crecimiento a las células dependientes de anclaje y permite la fácil transferencia de las suspensiones celulares de un contenedor a otro. Además, este método permite la fácil expansión de poblaciones celulares y la fácil toma de muestras de las poblaciones celulares.

Muchas variedades de células dependientes de anclaje son adecuadas para uso con los conjugados de partícula biodegradable-matriz extracelular incluyendo precursores hepáticos, células mesenquimáticas, precursores mesenquimáticos, células musculares incluyendo células cardiacas, células neuronales, células gliales, fibroblastos, células madre, células epiteliales, y células endoteliales. Además, las células endocrinas también son adecuadas para crecimiento sobre conjugados de partícula-matriz extracelular. Las combinaciones de partícula-célula también son adecuadas para crecimiento en cultivo tridimensional en bioreactores. Dicho uso se provee para flujo del medio nutriente y gases nutrientes a una población de célula adherente y fácil intercambio de metabolitos y de desechos metabólicos como sea necesario. flll) Uso de conjugados de polímero biodegradable-proteína para criopreservación de células dependientes de anclaje Mediante el anclaje de las células enriquecidas a un soporte de polímero biodegradable, la composición de la presente invención también puede mejorar la supervivencia y recuperación de células criopreservadas. Las metodologías anteriores para la criopreservación de células son exitosas para las células hematopoiéticas que normalmente se encuentran en suspensión, y para líneas celulares, que se adaptan a un cultivo celular, pero no funcionan bien para tipos celulares dependientes de anclaje. La cric-preservación de hepatocitos dependientes de anclaje por los métodos usuales de resuspensión utilizando tripsina u otros agentes para remoción, lleva a una pérdida muy sustancial en la viabilidad celular. Además, las células pierden su carácter diferenciado y se presenta una pérdida de capacidad de anclaje a las superficies sólidas. La presente invención corresponde a partículas biodegradables derivadas para el anclaje de las células. Los conjugados de partícula-matriz extracelular se proveen para anclaje celular, y posteriormente se exponen a una solución de vitrificación, para prevenir la formación de cristales de hielo. Una solución para criopreservación o vitrificación adecuada incluye 5 a 15 por ciento, típicamente 10 por ciento, dimetilsulfóxido (v/v) en medio suplementado con suero. Una solución alternativa para vitrificación comprende diez por ciento (v/v) dimetilsulfóxido en medio definido, es decir, que no contiene suero o plasma. Además, las células unidas a la partícula no tienen que ser removidas a partir de las partículas después del descongelamiento. Esta mejoría es bastante importante, puesto que las células embebidas en materiales alternativos tales como matriz extracelular, o alginato, se deben resuspender después del descongelamiento para que sean de uso práctico para la mayoría de las necesidades de investigación o clínicas. Sin embargo, el tratamiento enzimático de las células inmediatamente después del descongelamiento casi invariablemente resulta en pérdida de sobrevivencia para la mayoría de las células. Las células son especialmente sensibles al manejo y son altamente vulnerables al tratamiento enzimático inmediatamente después de la criopreservación convencional y descongelamiento. Al evitar el tratamiento enzimático después del descongelamiento, las células en los glóbulos son mucho más fuertes. Las células sobre las partículas simplemente se pueden enjuagar con medio para cultivo celular y se utilizan inmediatamente sin ningún manejo adicional. Este procedimiento implica la supervivencia y función de las células dependientes de anclaje criopreservadas y la modernización del trabajo de depósitos celulares y de tipificación celular.

(IV) Uso de los conjugados de polímero biodegradable-proteína para transplante de células En incluso otra modalidad de la presente invención, los métodos de la invención proveen medios fuertes para la preparación de células dependientes de anclaje enriquecidas para transplante. Los conjugados de polímero biodegradable-proteína-células se implantan directamente dentro de los vasos sanguíneos u órganos recipientes. El polímero se diseñó para degradarse hacia moléculas constituyentes que están naturalmente presentes in vivo, en sinergia con el crecimiento y la maduración de las células progenitoras enriquecidas y la formación de la matriz extracelular natural y la estructura del tejido. Además, se considera la disolución y eliminación de los materiales poliméricos para minimizar el problema del rechazo de cuerpo extraño.

(V) Enriquecimiento celular mediante clasificación negativa En los casos en donde un tipo celular deseado no exhibe marcadores únicos identificables de superficie celular, una clasificación negativa, opcionalmente una clasificación negativa iterativa, puede enriquecer el tipo celular deseado en la población. Un caso ejemplar se presente a continuación. Un conjugado de partícula biodegradable-anticuerpo a glicoforina A (partícula-Ab(GA)) se preparó mediante los métodos anteriormente descritos. Una suspensión celular sustancialmente de célula particular de 107 células hepáticas embrionarias a una concentración de 106 céiulas/ml se mezcló con 0.5 g en peso húmedo del conjugado de partícula-Ab(GA). Por "sustancialmente" en este contexto se entiende que al menos aproximadamente 70% de las células no están asociadas con otras células. En una modalidad, una suspensión sustancialmente de célula particular tiene al menos aproximadamente 90% de las células no asociadas con otras células. La mezcla se incubó a 24°C por una hora en medio definido (HDM) que consiste de una mezcla 1 :1 de medio Eagle's modificado por Dulbecco's y Ham's F12 (DMEM/F12, GIBCO/BRL, Grand Island, NY), al cual se le añaden 20 ng/ml de EGF (Collaborative Biomedical Products), 5 µg/ml de insulina (Sigma), 10'7 M de Dexametasona (Sigma), 10 µg/mI de transferrina saturada de hierro (Sigma), 4.4 x 10"3 M de nicotinamida (Sigma), 0.2% (p/v) de albúmina de suero de bovino (Sigma), 5 x 10"5 M de 2-mercaptoetanol (Sigma), 7.6 µeq/l de ácido graso libre, 2 x 10"3 M de glutamina (GIBCO/BRL), 1 x 10"6 M de CuS04, 3 x10"8 M de H2Se03 y antibióticos. Las células remanentes en el sobrenadante y no unidas a los glóbulos se cultivan en > medio fresco o se someten a una clasificación subsecuente.

(VI) Enriquecimiento celular mediante clasificación positiva En los casos en donde un tipo celular deseado exhibe al menos un marcador de superficie celular identificable único, una clasificación positiva, opcionalmente una clasificación positiva iterativa o una combinación de una clasificación positiva y negativa, puede enriquecer para el tipo celular deseado en la población. Un caso ejemplar se presenta a continuación. El conjugado de partícula biodegradable-anticuerpo a ICAM- (partícula-Ab(ICAM-l)) se prepara mediante los métodos anteriormente descritos. Una suspensión de célula particular de 107 células hepáticas embrionarias a una concentración de 106 células/ml se mezclan con 0.5 g en peso húmedo de conjugado de partícula-Ab(ICAM-l). La mezcla se incuba a 24°C por una hora en medio definido (HDM) que consiste de una mezcla 1 :1 de medio de Eagle's modificado por Dulbecco's y Ham's F12 (DME /F12, GIBCO/BRL, Grand Island, NY), al cual se le añaden 20 ng/ml de EGF (Collaborative Biomedical Products), 5 µg/ml de insulina (Sigma), 10"7 M de Dexametasona (Sigma), 10 g ml de transferrina saturada de hierro (Sigma), 4.4 x 10'3 M de nicotinamida (Sigma), 0.2% (p/v) de albúmina de suero de bovino (Sigma), 5 x 0'5 de 2-mercaptoetanol (Sigma), 7.6 µeq/l de ácido graso libre, 2 x 10"3M de glutamina (GIBCO/BRL), 1 x 10~6 M de CuS04, 3 x 10" M de H2Se03 y antibióticos. Las células ancladas a las partículas se cultivan en medio fresco. En otro ejemplo, un conjugado de partícula biodegradable-anticuerpo a EpCAM-1 (partícula-Ab(EpCAM-1))/NCAM-1 (partícula-Ab (NCAM-1)) se prepara mediante los métodos anteriormente descritos. En incluso otra modalidad, un conjugado de partícula biodegradable-anticuerpo a EpCAM-1 (partícula-Ab(EpCAM-1))/ICAM-1 (partícula-Ab (ICAM-1)) se prepara mediante los métodos anteriormente descritos. Dicha partícula biodegradable-anticuerpo con al menos un marcador de superficie celular ¡dentificable único se puede utilizar para enriquecer para el tipo celular deseado en la población.

(VID Cultivo celular sobre conjugados de partícula-ECM Una población de células hepáticas progenitoras enriquecidas mediante cualquier método se incuban con partículas biodegradable conjugadas con colágena IV en HDM. Las colágena IV-partículas se preparan mediante los métodos anteriormente mencionados para producir partículas de 500 mieras de diámetro con una relación de colágena IV a partícula de 0.02 (p/p). Diez gramos totales en peso húmedo de colágena IV-partículas se suspenden en 500 mi de HDM a 37°C, con una atmósfera de 95% (v/v) de aire/5 % (v/v) de C02. Las colágena IV-partículas se siembran con 106 progenitores hepáticos y el medio se cambió cada segundo día. Las partículas se mantuvieron suspendidas mediante agitación suave. El cultivo se monitoreó para metabolismo celular mediante cambios en el pH y concentración de glucosa y para crecimiento celular mediante la determinación del contenido de ADN. Las superficies nuevas en crecimiento se proveen para los cultivos en crecimiento mediante la adición de partículas frescas a la mezcla para cultivo. En incluso otros ejemplos, una población de células hepáticas progenitoras enriquecida mediante cualquier método se incubó con partículas biodegradable conjugadas como cualquier otra matriz química especializada adecuada generalmente presente en, sin limitación, formas fetales de laminina, ácido hialurónico, y heparin glican sulfato como se conoce por aquellos expertos en la técnica .

(VIII) Criopreservación celular utilizando partícula-células adherentes Las células que dependen de anclaje en crecimiento sobre partículas biodegradables, como en el punto 4) anterior, se criopreservan mediante la resuspensión de las partículas con células adherentes en una solución de 10% (v/v) de dimetiisulfóxido en HDM y transfiriendo una alícuota que contiene aproximadamente 1 X 106 células a una ampolleta estéril o vial. La ampolleta o vial se selló de manera apropiada y la temperatura se redujo gradualmente a aproximadamente 1 °C por minuto a entre aproximadamente -80°C y aproximadamente -160°C. Las células se almacenaron a aproximadamente -160°C indefinidamente hasta que fue necesario. Cuando fue necesario, una ampolleta o vial se descongeló rápidamente, como por ejemplo en un baño de agua tibia. Los contenidos se transfieren entonces de manera aséptica a un recipiente para cultivo con un medio de cultivo, HDM.

(IX) Transplante de progenitores hepáticos en un modelo de insuficiencia renal Un modelo de insuficiencia renal en rata se utilizó para evaluar la terapia de transplante de célula heteróloga. La insuficiencia hepática se modela mediante remoción quirúrgica de aproximadamente 70% del hígado y/o ligación de ducto biliar común en un grupo experimental de diez ratas machos (125 a 160 g de peso corporal). Un grupo control sin afección de diez ratas coincidentes en edad y en sexo se sometió a anestesia similar, laparotomía en la línea media, y manipulación del hígado, pero sin ligación de los ductos biliares y sin hepatectomía. Una población enriquecida de precursores hepáticos anclados a ios glóbulos biodegradables se preparó como se describió anteriormente. En breve, los hígados de 12 crías de ratas embrionarias (día embrionario 14) se removieron asépticamente, se cortaron, se enjuagaron en EDTA 1 mM en Hank's BSS sin calcio o magnesio, pH 7.0, posteriormente se incubaron por hasta 20 minutos en Hank's BSS que contenía 0.5 mg/ml de colagenasa para producir una suspensión celular casi particular. Los conjugados asépticos de partículas biodegradables con anticuerpo a ICAM-1 se prepararon como se mencionó anteriormente. La suspensión de célula hepática particular a partir de doce crías se Incubó con 1.5 mi de volumen empaquetado de ICAM-1-micropartículas por una hora a 25°C. Posteriormente las partículas se diluyeron en diez volúmenes de HDM y se decantaron después de reposar a 1 x g por cinco minutos. Posteriormente el procedimiento se repitió. Las partículas se resuspendieron suavemente en HDM fresco y se incubaron a 37°C en una atmósfera de 95% de aire, 5% de C02 (v/v) por cinco días. Al día tres después de la hepatectomía o de la operación sin afección, las ratas, tanto experimentales como control sin afección, se sometieron a una incisión abdominal de 5 mm para exponer el bazo. La mitad de cada uno de los grupos de ratas experimentales y control sin afección, se eligieron al azar, y se Inyectaron con 0.1 mi cada una con una composición de partícula biodegradable-ICAM-l-célula hepática embrionaria, directamente dentro del bazo. Todas las incisiones se cerraron con grapas quirúrgicas. El inmunosupresor ciclosporina A, 1 mg/kg de peso corporal, se administró diariamente de manera intraperitoneal. Los niveles sanguíneos de bilirrubina, las actividades de gamma glutamil transferasa y alanina aminotranferasa se moniíorearon dos días antes de la hepatectomía o de la operación de hepatectomía sin afección y a los 3, 7, 14, y 28 días post operación. Se registraron el peso corporal, consumo de agua, y una inspección virtual de la letargía a los mismos días. A los 28 días post hepatectomía todos los animales supervivientes se sacrificaron para evaluación histológica del bazo y del hígado.

Todas las publicaciones, patentes, y publicaciones de patente referidas en la presente invención se incorporan en la presente invención en sus respectivas totalidades como referentes. La invención se ha descrito con referencia a las modalidades y métodos precedentes específicos y preferidos. No obstante, se debe entender que se pueden hacer muchas variaciones que permanezcan dentro del espíritu y alcance de la invención. Por lo tanto, los ejemplos precedentes no son limitantes, y se pretende que el alcance de la invención se limite solamente por las siguientes reivindicaciones.

Apéndice A CUADRO 1 Preparación de una mezcla de ácido graso libre (FFA) Fuente de ácidos grasos purificados: véase el cuadro 2 Preparación de soluciones para almacenamiento. Los ácidos grasos libres se prepararon mediante la disolución de cada componente individual en 100% de etanol. Los comentarios son los siguientes: Acido palmítico (sólido) Solución para almacenamiento 1 M; soluble en alcohol caliente Acido palmitoléico Solución para almacenamiento 1 M; fácilmente soluble en alcohol Acido oléico Solución para almacenamiento 1 M; fácilmente soluble en alcohol Acido linoléico Solución para almacenamiento 1 M; fácilmente soluble en alcohol Acido linolénico Solución para almacenamiento 1 M; fácilmente soluble en acohol Acido esteárico (sólido) Solución para almacenamiento 51 mM, soluble en alcohol a 1 gramo en 21 mis y se debe calentar.

Estas soluciones para almacenamiento se pueden estabilizar mediante burbujeo de nitrógeno a través de cada una de éstas y luego almacenándolas a -20°C. La solución para almacenamiento de mezcla de ácido graso libre: Esto produce un combinado total de ácido graso libres 100 mM. Esta solución para almacenamiento con todos los ácidos grasos libres también se puede estabilizar mediante burbujeo a través de nitrógeno y luego almacenándola a -20 C.

Solución final: Añadir 76 µ?_ de la solución para almacenamiento de mezcla de ácido graso libre por litro de medio de cultivo para lograr una concentración final de 7.6 µ??. Los ácidos grasos libres son tóxicos a menos que se presenten con albúmina de suero libre de endotoxina, libre de ácido graso, purificada (por ejemplo Pentex albúmina tipo V). La albúmina se preparó en el medio basal o PBS a ser utilizado en una concentración típica de 0.1-0.2%.

CUADRO 2 Fuentes de medio basal, factores de crecimiento, componentes de ta matriz y otros componentes de cultivo FACTORES VENDEDOR(ES) Factores de Sigma-Aldrich crecimiento/Hormonas US Biological Cortex Biochemicals Inc. ICN Biomedicals Prolactina (Hormona luteotrópica) Factor de crecimiento epidérmico Collaborative Biomedicals (EGF) Ratón; grado receptor Sigma-Aldrich Recombinante de humano Pepro Tech Upstate Biologicals Accurate Chemicals Clonetics Products Antigenix America Inc. Recombinante de ratón Accurate Chemicals Antigenix America Inc. Transferrina: Saturada con holo- Sigma-Aldrich hierro de bovino, humano Clonetics Somatotropina: Hormona de crecimiento Pituitaria de humano Sigma-Aldrich Accurate Chemicals Recombinante de humano ICN Biomedicals Hidrocortisona Sigma-Aldrich Clonetics Calbiochem Alfa Aesar Bishop Canadá ICN Biomedicals Dexametasona Sigma-Aldrich Clonectics Amersham Pharmacia Biotech Accurate Chemicals Calbiochem ICN Biomedicals Glucagon Sigma-Aldrich Páncreas de porcino BIOTREND Chemikalien Otros suplementos HDL: Lipoproteína de alta Sigma-Aldrich densidad Chemicon International Plasma de humano Blodesign International Per Immune BioResource Technology Academy Biomedical Co. Biodesign International Acidos grasos libres Linoléico Sigma-Aldrich Altech Associates Inc., ICN Biomedicals Linolénico Sigma-Aldrich Altech Associates Inc. Oléico Sigma-Aldrich Altech Associates Inc., ICN Biomedicals Palmítico Sigma-Aldrich Altech Associates Inc., ICN Biomedicals Esteárico ICN Biomedicals Sigma-Aldrich Altech Associates Inc., Albúmina de suero de bovino V Sigma-Aldrich Acidos grasos libres Genmini Bio-Products Nicotinamida (Niacinamlda) Sigma Calbiochem ICN Biomedicals Spectrum Laboratory Products TCI America Putrescina Sigma-Aldrich Advanced ChemTech Inc.

Crescent Chemicals ICN Biomedicals Spectrum Laboratory Products 3\3\5'-Triiodo-L-tironina (T3) Sigma-Aldrich Toronto Research Chemicals ICN Biomedicals Novabiochem TCI America Elementos traza Cobre pentahidratado Sigma-Aldrich Chem Services Inc. Crescent Chemicals Gallade Chemical, Inc. ICN Biomedicals MV Laboratories, Inc. Specturm Laboratory Products Strem Chemicals, Inc. Sulfato de zinc heptahidratado Sigma-Aldrich Crescent Chemicals ICN Biomedicals MV Laboratories, Inc. Acido selenioso: Sigma-Aldrich ICN Biomedicals MV Laboratories Spectrum Laboratory Products Medio basal DMEM/F12 Gibco BRL BioWhittaker Mediatech Inc. Specialty Media-Division of Cell & Molecular Technologies RPMI 1640 Gibco BRL Biólogos Inc. BioSource International ICN Biomedicals BioWhittaker Medio para hepatocito Sigma, Clonetics Medio basal para queratinocito Clonetics Componentes de la matriz extracelular Fibronectina Sigma-Aldrich Collaborative Biomedical De bovino Accurate Chemicals De Humano Biosource International De bovino, humano, rata, ratón BIOTREND Chemikalien humano Chemicon International De bovino, pollo, caballo, humano, Calbiochem ratón, De bovino, humano, ratón De salmón, rata Laminina Sigma-Aldrich Collaborative Biomedical De ratón EY Laboratories Alexis Corp.

De humano BioSource International Alexis Corp. Chemicon International BIOTREND Chemikalien Colágena Tipo 1 Collaborative Biomedical Sigma-Aldrich BioShop Canadá BIOTREND Chemikalien Colágena Tipo II Sigma-Aldrich Chemicon International, Inc. Accurate Chemicals Colágena Tipo III Chemicon International, Inc. Accurate Chemicals BIOTREND Chemikalien Colágena Tipo IV Collaborative Biomedical Sigma-Aldrich BIOTREND Chemikalien Matrígel Collaborative Biomedical Clonetics Heparinas no blanqueadas Sigma BioChemika Clonetics CarboMer, Inc. Alfa Aesar poliSciences, Inc Heparan sulfatos Sigma-Aldrich BioChemika CarbMer, Inc. US Biologicals Seikagaku USA Calbiochem ICN Biomedicals Carragenanos (reactivos Sigma-Aldrich semejantes a heparina purificados BioChemika a partir de alga marina. Existen Carbo er, Inc. tres formas disponibles: lamda, ICN Biomedicals kappa e iota que varían en su TCI America solubilidad) Suramina (molécula semejante a Sigma-Aldrich heparina que se ha encontrado BioChemika que tiene una potente actividad Calbiochem anti-microbiana y actividad anti- Alexis Corp. tumoral) BIOMOL Research Laboratories, Inc. ICN Biomedicals A. G. Scientifics American Qualex International Inc.

Proteoglicano heparan sulfato Collaborative Biomedical (HS-PG) a partir del tumor EHS Sigma- Aldrich Chemicon International

Claims (1)

1. NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES 1.- Una composición que comprende al menos una partícula biodegradable, al menos un grupo receptivo covalentemente asociado a ésta, y al menos una célula anclada a dicho al menos un grupo receptivo. 2. - La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque el grupo receptivo comprende un anticuerpo, un fragmento de un anticuerpo, una avidina, una estreptavidina, una porción de biotina, o combinaciones de los mismos. 3. - La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la partícula comprende poliláctido, copolímero poliláctido-lisina, copolímero poliláctido-lisina-polietileno, almidón, o proteína. 4.- La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque comprende adicionalmente una matriz extracelular. 5. - La composición de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada además porque la matriz extracelular comprende colágena, fibronectina, laminina, o combinaciones de las mismas. 6. - La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la partícula es una macropartícula, micropartícula, o nanopartícula. 7. - La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la célula se selecciona a partir del grupo que consiste de célula hepática, precursor hepático, y precursor hematopoiético. 8. - La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la partícula es biocompatible. 9. - La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque el grupo receptivo es estable en al menos uno de solventes acuosos u orgánicos. 10. - Un método de criopreservación de células dependientes de anclaje que comprende (a) permitir que las células se anclen a una composición que comprende al menos una partícula biodegradable para formar una mezcla, y (b) congelar la mezcla, (c) descongelar y recuperar las células a partir de los conjugados de células-partícula polimérica. 1 . - El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque la partícula biodegradable comprende adicionalmente un grupo receptivo covalentemente enlazado a la partícula. 12. - El método de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizado además porque el grupo receptivo comprende un anticuerpo, un fragmento de un anticuerpo, una avidina, una estreptavidina, una porción de biotina, o combinaciones de los mismos. 13. - El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque comprende adicionalmente una matriz extracelular. 14. - El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque comprende adicionalmente una solución para criopreservacion. 15. - El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque la solución para criopreservación comprende 10 % (v/v) de dimetilsulfóxido. 16 - Un método para la separación de células que comprende: (a) proveer una composición que comprende al menos una partícula biodegradable, al menos un grupo receptivo covalentemente asociado a éste, al menos una célula anclada a al menos un grupo receptivo, y al menos una célula no anclada a éste, y (b) remover al menos una célula no anclada a la partícula biodegradable. 17. - El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque el grupo receptivo es un anticuerpo, un fragmento de un anticuerpo, una avidina, una estreptavidina, una porción de biotina, o combinaciones de los mismos. 18. - El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque la célula anclada a la partícula biodegradable comprende una célula hepática o un precursor hepático. 19.- El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque la célula no anclada a la partícula biodegradable comprende un precursor hematopoiético. 20.- Un método de cultivo celular de células dependientes de anclaje que comprende (a) proveer una composición que comprende al menos una partícula biodegradable, al menos un grupo receptivo covalentemente asociado a éste, y ai menos una célula adherente a dicho al menos un grupo receptivo; y (b) poner en contacto la composición con medio de cultivo para célula. 21- El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado además porque la composición comprende adicionalmente matriz extracelular. 22.- El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado además porque la célula comprende al menos uno de un precursor hepático, un precursor hematopoiético, un fibroblasto, una célula mesenquimática, una célula cardiaca, una célula endotelial, una célula epitelial, una célula neuronal, una célula glial, una célula endocrina, o combinaciones de los mismos. 23.- El uso de al menos una partícula biodegradable, al menos un grupo receptivo covalentemente asociado a ésta, y al menos una célula anclada a dicho al menos un grupo receptivo, para preparar una composición para el tratamiento de un sujeto que necesita de terapia celular. 24.- El uso que se reclama en la reivindicación 23, en donde la célula comprende un progenitor hepático. 25.- El uso que se reclama en la reivindicación 23, en donde la composición es administrable intravenosamente, intra-arterialmente, intramuscularmente, parenteralmente, o en cualquier combinación de los mismos. 26.- El uso que se reclama en la reivindicación 23, en donde la cantidad efectiva cae en el intervalo de aproximadamente 02 a aproximadamente 1011 células.