MXPA06001764A

MXPA06001764A - Composiciones y vacunas que contienen antigeno(s) de cryptosporidium parvum y de otro patogeno.

Info

Publication number: MXPA06001764A
Application number: MXPA06001764A
Authority: MX
Inventors: Francis William Milward
Original assignee: Merial Ltd
Priority date: 2003-08-14
Filing date: 2004-08-12
Publication date: 2006-07-03
Also published as: WO2005016383A1; JP2007502292A; CA2535618A1; AU2004264355A1; EP1654000A1

Abstract

Se divulgan y reclaman composiciones de combinacion que incluyen antigeno(s) de C. parvum o epitope(s) de interes con al menos otro antigeno o epitope de interes de un patogeno que causa infeccion enterica y/o sintomas y/o recombinante(s) y/o vector(es) y/o plasmido(s) que expresa(n) tal(es) antigeno(s) o epitope(s) de interes y la administracion de tales composiciones tal como a mamiferos prenados y/o recien nacidos o mamiferos jovenes, por ejemplo, vacas prenadas y/o crias tal como dentro del primer mes de nacimiento.

Description

COMPOSICIONES Y VACUNAS QUE CONTIENEN ANTIGENO(S) DE CRYPTOSPORIDIÜM PARVUM Y DE OTRO PATOGENO CAMPO DE LA INVENCION La invención se relaciona a antigeno (s) /epitope (s) de Cryptosporidium parvum y/o patógenos entéricos (tales como otros patógenos entéricos) , composiciones y métodos que comprenden o utilizan los mismos para inducir una respuesta inmune contra, o para la prevención, tratamiento, o control de infecciones por Cryptosporidium parvum y/o entéricas, y usos de los mismos. La invención además se relaciona a métodos y/o composiciones, y/o usos de tales composiciones o componentes de las mismas en la formulación de tales composiciones, para inducir una respuesta inmune contra y/o para la prevención y/o tratamiento y/o control de infecciones entéricas en animales, por ejemplo mamíferos, tales como bovinos, felinos, caninos o equinos o especies de los mismos. La invención se relaciona también a métodos y/o composiciones, y/o usos de tales composiciones o componentes de las mismas en la formulación de tales composiciones, para inducir una respuesta inmune contra y/o para la prevención y/o tratamiento y/o control de la infección por Cryptosporidium parvum. La invención también se relaciona al uso concurrente de una vacuna de Cryptosporidium parvum monovalente con vacunas entéricas por ejemplo, entéricas bovinas (por ejemplo, rota/coronavirus, E. col!) y/o el uso de una vacuna de combinación que contiene Cryptosporidium parvum + rota/coronavirus, E. col!, asi como a la prevención, control o tratamiento o inducción de una respuesta inmune para reducir la exacerbación de las enfermedades entéricas, por ejemplo, entéricas bovinas, debido a la co-infección con Cryptosporidium parvum. La inmunidad inducida por la vacunación contra Cryptosporidium parvum, puede reducir significativamente la severidad de la enfermedad inducida por los patógenos entéricos mencionados en la presente. Una vacuna de combinación que contiene Cryptosporidium parvum es útil para una prevención más completa de la enfermedad entérica multietiológica en animales recién nacidos, tales como crias, causados por rota y/o coronavirus y E. coli K99 y Fil. ' Esta invención también pertenece a los efectos de la co-infección de Cryptosporidium parvum en otros patógenos entéricos, por ejemplo, entéricos bovinos. Cryptosporidium parvum comúnmente se encuentra en las heces de animales recién nacidos tales como mamíferos, por ejemplo, crías. Cryptosporidium parvum es capaz de producir signos clínicos de enfermedad entérica por sí mismo, sin considerar la presencia o ausencia de otros virus y bacterias potencialmente patogénicos en el . intestino . Los virus, tales como coronavirus y bacterias tales como E. coli por ejemplo,. Fil., que se han reconocido en el campo como muy patogénicos no son capaces de causar signos clínicos importantes de enfermedad en modelos de estimulación experimentales. Así, la invención puede relacionarse a la dirección de la co-infección del ganado vacuno con Cryptosporidium parvum ya que la co-infección puede exacerbar la enfermedad causada por otros patógenos entéricos' tales como coronavirus, rotavirus y E. coli, por ejemplo F41. , ANTECEDENTES DE LA INVENCION La enfermedad entérica bovina es el resultado de una infección intestinal enteropanogénica que más frecuentemente se manifiesta por sí misma en alguna forma de diarrea. Esta enfermedad también comúnmente referida como diarrea de ternero neonatal, es responsable para la pérdida económica sustancial en la industria ganadera. La morbosidad de las crías, junto con la necesidad para la intervención terapéutica y los efectos per udiciales a largo plazo posibles sobre los animales, son los factores principales responsables para la carga económica sobre el granjero. Un estimado indica que la diarrea de cría neonatal es responsable por aproximadamente 75% de la muerte de las crías lecheras bajo 3 semanas de edad. Radostits, OM, y colaboradores, Herd Health Food Animal Production Medicine, 2a ed., Sounders, Philadelphia, pp. 184-213, 1994. El manejo de la diarrea de la cria neonatal es difícil por razones múltiples, algunas de las más importantes que incluyen: (1) el involucramiento de múltiples agentes en la patogénesis de la enfermedad; (2) la no especificidad de los signos clínicos; (3) el descubrimiento de que algunas infecciones pueden ser asintomáticas; y, (4) el involucramiento de factores del hospedero tal como la nutrición y la inmunidad endógena. Monn, HW, y colaboradores, JAVMA 173 (5) : 577-583 (1978). Viring, S. y colaboradores, Acta Vet. Scand. 34:271-279 (1999) . El desarrollo de una estrategia para prevenir o tratar la enfermedad entérica bovina ha sido muy difícil puesto que mientras que es conocido que múltiples enteropatógenos están presentes durante la infección, no es conocido qué patógeno o combinación de patógenos es realmente responsable para la enfermedad." Los estudios epidemiológicos en los Estados Unidos así como en otras partes del mundo muestran que los enteropatógenos más prevalentes asociados con la diarrea de cría neonatal incluyen, pero no están limitados a, Cryptosporidium parvum, rotavirus, coronavirus y E. cali. Mientras que en la mayoría de los casos, varios de estos enteropatógenos son aislados de brotes de la enfermedad, la . prevalencia de cada uno de los agentes no es consistente con una población de enfermedad individual o entre múltiples manadas infectadas.

Tradicionalmente, los estudios encontraron que el rotavirus es el enteropatógeng, más prevalente en la crías diarreicas. Por ejemplo, en un estudio de crias diarreicas en Gran Bretaña, el rotavirus y Cryptosporidíum parvum se detectaron en 42 y 23% de la población,- respectivamente. Veinte por ciento de las crias se infectaron con más de un patógeno. Sin embargo, reportes más recientes indican que el Cryptosporidium parvum es el patógeno predominante en las infecciones bovinas -entéricas. En un estudio reciente que evalúa las infecciones por Cryptosporidium parvum y concurrentes por otros enteropatógenos mayores en crías neonatales, Cryptosporidium parvum fue el único enteropatógeno encontrado, en 52.3% de la población, seguido por infecciones individuales con rotavirus en 42.7%. de la Fuente y colaboradores, Preventive Veterinary Medicine 36:145-152(1998). La infección concurrente con dos agentes ocurrieron en el 21.6% de este grupo de estudio mientras que la infección con tres y cuatro patógenos se encontraron en 6% y 0.5%, respectivamente. La infección mezclada más común en este estudio fue una combinación de Cryptosporidium-rotavirus . Hay información limitada disponible en la función de los patógenos entéricos individuales en la diarrea de cría neonatal. Además, los mecanismos combinados de patogénesis viral, bacteriana y protozoaria que implica la enfermedad entérica bovina en animales neonatales aun son muy pobremente entendidos. Sin embargo, sin considerar la falta de entendimiento del mecanismo de patogénesis, la infección con más de un patógeno tiende a conducir a un efecto clínico más severo que las infecciones causadas por un enteropatógeno individual . Actualmente no hay método de tratamiento que proporcione la protección adecuada contra la diarrea de cría neonatal. No hay un solo fármaco o 'combinación de agentes quimioterapéuticos útiles en el tratamiento de esta enfermedad. Mientras que las vacunas están disponibles con la enfermedad entérica bovina objetivo, ellas se han satisfecho con éxito limitado y aceptación. Actualmente disponibles están las vacunas que contienen antígenos a tres enteropatógenos encontrados que están asociados con la enfermedad, específicamente rotavirus, coronavirus y E. coli. La eficacia de los componentes individuales de estas vacunas entéricas bovinas comercialmente disponibles (rota/corona, E. coli) se ha mostrado que protege en modelo de estimulación experimental. A pesar de la disponibilidad de tales vacunas, bajo ¦ las condiciones en campo de la diarrea neonatal, la diarrea de la cría y la disentería de invierno continúan afectando el ganado engordado, los lotes de alimentación y las operaciones de crías de vacas. Los productores permanentemente cuestionan la eficacia de las vacunas entéricas actuales que contienen. E. coli K99, rota y coronavirus bajo las condiciones en campo como es reflejado por la baja utilización de las vacunas combo entéricas en el mercado de los Estados Unidos (solamente 4% de los animales preñados son vacunados anualmente con estos productos) . Más recientemente, una vacuna experimental monovalente contra Cryptosporidium parvum se ha desarrollado y mostrado que protege contra una estimulación experimental con Cryptosporidium parvum. Sin embargo, los múltiples enteropatógenos involucrados en la enfermedad entérica no pueden ser afectados por el tratamiento con una vacuna de Cryptosporidium parvum sola. También, la infección enteropatogénica se presenta que es universal; esta se encuentra por todo el mundo y la mayoría de los vertebrados son susceptibles a tal infección. Por lo tanto, una necesidad para combatir la infección enteropatogénica no está limitada a las especies bovinas. Además, la enfermedad entérica es difícil de controlar; este es probablemente multifactorial; Cryptosporidium p' arvum puede ser un factor, pero hasta ahora no hay demostración definitiva de Cryptosporidium parvum en realidad incrementa la enfermedad entérica o que se usa en una combinación inmunogénica, inmunológica o de vacuna de composición incrementa la prevención de la enfermedad entérica . Además, un problema encontrado en la preparación y el uso de vacunas de combinación es el fenómeno llamado "interferencia de eficacia" en donde la eficacia de un antigeno en la combinación es disminuida o reducida, que se cree que es del dominio por otro antigeno en la vacuna de combinación; cf. Paoletti y colaboradores, patente norteamericana No. 5,.843, 456. Este fenómeno se ha observado que las vacunas de combinación que emplean antigeno o antigenos de E. coli; por ejemplo, antigenos bacterianos individuales o múltiples pueden interferir con otros antigenos en las vacunas de combinación. Asi, se cree que hasta ahora el problema de Cxyptosporidíum parvum que contribuye a las infecciones entéricas y síntomas, o la manera en la cual este problema es ¦en la presente dirigido, por ejemplo, no se ha divulgado o sugerido las composiciones de combinación que incluyen antígeno(s) o epítope(s) de Cryptosporidlum parvum de interés con por lo menos otro antígeno o epítope de interés de un patógeno que causa infección entérica y/o síntomas y/o recombinante (s) y/o vector (s) y/o plásmido(s) que expresa tal antígeno (s) o epítope (s) de interés y la administración de tales composiciones a mamíferos preñados tales como vacas preñadas y/o mamíferos recién 'nacidos o jóvenes tales como crías dentro del primer mes de nacimiento, y que se dirigen a algún problema potencial de la interferencia de eficacia. OBJETOS Y BREVE DESCRIPCION DE IA INVENCION Un objeto de la invención puede ser las composiciones inmunológicas o de vacuna entéricas mej oradas, especialmente aquellas que pueden ser utilizadas en el campo veterinario, por ejemplo para mamíferos, tales como bovinos, caninos, felinos o equinos o especies de los mismos. Otro objeto de la invención pueden ser tales composiciones inmunológicas o de vacuna que pueden ser utilizadas de manera efectiva para inmunizar animales recién nacidos y/o jóvenes,' tal como para inmunizar pasivamente animales recién nacidos, por ejemplo, mamíferos, por ejemplo, bovinos, caninos, felinos o equinos o especies de los mismos; ventajosamente bovinos. Todavía otro objeto de la invención pueden ser las composiciones inmunológicas o de vacunas mejoradas contra Cryptosporidium parvum, por ejemplo, particularmente para ser utilizadas en el campo veterinario, tal como para el uso con mamíferos, por ejemplo, para caninos, felinos o equinos o especies de los mismos, especialmente bovinos o especies de los mismos. Todavía otro objeto de la invención pueden ser métodos mejorados para inmunizar animales recién nacidos y/o jóvenes, tal como para inmunizar pasivamente animales recién nacidos, por ejemplo, mamíferos, tales como caninos, felinos o equinos o especies de los mismos especialmente bovinos o especies de los mismos. Aun todavía adicionalmente, los objetos de la invención pueden involucrar métodos para inducir una respuesta inmune contra Cryptosporidium parvum o patógenos entéricos incluyendo Cryptosporidium parvum o para controlar, prevenir y/o tratar infecciones entéricas y/o síntomas incluyendo Cryptosporidium parvum; por ejemplo, que comprende administrar una composición inventiva; así como métodos para preparar tales composiciones, usos de componentes de tales composiciones para formular tales composiciones, ínter alia. La vacunación o inmunización contra patógenos entéricos, tales como patógenos entéricos que incluyen Cryptosporidium parvum es grandemente e inesperadamente mejorado al usar una composición inmunológica o de vacuna que incluye una combinación de por lo menos dos antígenos de Cryptosporidium parvum o epítopes de los mismos y/o vector (es) que expresan por lo menos dos antígenos de Cryptosporidium parvum o epítopes de los mismos, por ejemplo, P21 o un epítope del mismo y/o un vector que expresa P21 o un epítope del mismo o Cp23 o un epítope del mismo y/o un vector que expresa Cp23 o un epítope del mismo Cpl5/60 o un epítope del mismo y/o un vector que expresa Cpl5/60 (por ejemplo, una composición que contiene por lo menos un epítope de Cp23 y por lo menos un epítope de C-pl5/60; y se observa que el antígeno Cp23 o proteína puede incluir P21) . La combinación de ambos antígenos (o epítope (s) de interés y/o vectores que expresan los antígenos y/o epitope(s)) conduce un efecto sinergis ico con una producción mejorada o útil de una respuesta inmune, por ejemplo, anticuerpos, respuestas celulares o ambos, contra la infección por Cryptosporidium parvum y/o entérica o patógenos o síntomas tal como una producción muy alta de anticuerpos contra Cryptosporidium parvum. Esto también permite la preparación de composiciones inmunológicas o de vacunas eficientes, útiles para protección de animales recién nacidos o jóvenes o mamíferos, por ejemplo, caninos, felinos o equipos o especies de los mismos; especialmente bovinos. Por ejemplo, las composiciones que contienen antigenos y/o epítope(s) de interés se pueden emplear venta osamente en inocular madres o hembras preñadas, por ejemplo, para inducir una respuesta inmune que puede ser pasada a los descendientes nacidos y a animales recién nacidos o jóvenes por la vía de la leche o calostro durante el amamantamiento yr composiciones que contiene (n) vector (es) que expresa (n) antígenos y/o epítope(s) puede ser ventajosamente empleado en inocular machos y hembras de todas las edades, por ejemplo tales como aquellos que no están preñados y/o son animales recién nacidos o jóvenes, y la inoculación de animales recién nacidos o jóvenes se puede hacer solo o ventajosamente en conjunción con la inoculación de las madres o hembras preñadas, por ejemplo, para permitir que las respuestas inmunes sean generadas en los animales jóvenes o recién nacidos mientras que ellos también reciben anticuerpos u otros agentes inmunológicos por la vía de la leche o calostro durante la lactancia. La combinación en una composición inmunológica o de vacuna de (los) antigeno (s) y/o epitope (s) de interés contra Cryptosporidium parvum con por lo menos otro antigeno o epitope de interés contra por lo menos otro patógeno entérico de la especie de animales (y ventajosamente una pluralidad de antigeno (s) y/o epitope (s) de interés de una pluralidad de patógeno (s) , por ejemplo, patógenos entéricos) puede incrementar significativamente la protección contra las patologías entéricas. Una composición inmunológica o de vacuna inventiva especialmente ventajosa puede ser contra Cryptosporidium parvum y puede comprender (i) por lo menos un antígeno Cp23 o epitope de interés del mismo y/o por lo menos un vector que expresa por lo menos un antígeno Cp23 o epitope de interés del mismo o por lo menos un antígeno P21 o epitope de interés del mismo y/o por lo menos un vector que exprésa por lo menos un antígeno P21 o epitope de interés del mismo y (ii) por lo menos un antígeno Cpl5/60 o epitope de interés del mismo y/o por lo menos un vector que expresa por lo menos un vector Cpl5/60. La composición ventajosamente puede además comprender por lo menos un antígeno epitope adicional de interés de otro patógeno entérico y/o vector que expresa por lo menos un antigeno adicional (que puede ser el mismo vector que expresa el antigeno Cp23 o P21 o epitope de interés 'y/o el antigeno Cpl5/60 o epitope, de interés, por ejemplo, la composición puede comprender un vector que co-expresa el antigeno Cp23 o P21 de epitope de . interés y el antigeno Cpl5/60 o epitope de interés, y opcionalmente el antigeno o epitope adicional, opcional de interés) . Otro antigeno de Cryptosporidíum parvum es el antigeno CP41 descrito en Mark C. Jenkins y colaboradores, Clinical and Dignostic Laboratory Immunology, Nov. 1999, 6,6:912-920. Las composiciones inmunológicas o de vacuna de acuerdo con la invención pueden comprender este antigeno o epitope de interés del mismo y/o un vector que expresa el antigeno o epitope del mismo, posiblemente y de preferencia en asociación con por lo menos otro Cryptosporidíum parvum como es descrito en la presente tal como Cp23, P21 y Cpl5/60, por ejemplo, en combinación con Cp23 o P21 y/o Cpl5/60. Para la expresión de este- antigeno, uno puede adicionar un codón de inicio corriente arriba de la secuencia de nucleótidos que aparece en la Figura 2 de esta publicación, y un codón de detención corriente abajo de esta secuencia. Un composición inmunológica o de vacuna eficiente contra enteritis también es producida al utilizar . solamente uno de: el Cp23 o un epitope del mismo o un vector que expresa el antigeno o epitope, o P21 o un epitope del mismo o un vector que expresa el antigeno o epitope, o Cpl5/60 o un epitope del mismo o un vector que expresa el antigeno o epitope del mismo, o CP41 o un epitope del mismo o un vector que expresa el antigeno o epitope, tal como el antigeno de Cryptosporidium parvum o epitope de interés, venta osamente en combinación con por lo menos otro antigeno de Cryptosporidium parvum o epitope de interés o vector que expresa tal antigeno o epitope de interés; y, esta composición además puede comprender por lo menos un antigeno o epitope adicional de interés de otro patógeno entérico y/o vector que expresa por lo menos un antigeno adicional (y este vector puede co-expresar antigeno (s) y/o epitope (s) ) . La invención además comprende métodos para inducir una respuesta inmunológica o protectora (vacuna) o para controlar, prevenir y/o tratar patógenos o entéricos o infecciones entéricas o síntomas entéricos incluyendo Cryptosporidium parvum} por ejemplo, que comprende la administración de una composición inventiva. Una composición inventiva puede ser administrada a un mamífero preñado, tal como una vaquilla o una vaca (después en la presente llamada vaca) , perro, gato o caballo durante el período de gestación; por ejemplo, una vez o dos veces durante el período de gestación típico (para una vaca, típicamente un período de gestación de 9 meses o 170 días) , tal como una primera administración de aproximadamente 1 a aproximadamente 2.5 o aproximadamente 3 meses antes del parimiento y una segunda o sola administración cercana al parimiento, por ejemplo, en las últimas 3 semanas antes del parimiento, de preferencia aproximadamente 3 a aproximadamente 15 días antes del parimiento. De esta manera, la hembra puede transferir inmunidad pasiva al recién nacido, por ejemplo, crias después del nacimiento por la via de la leche o calostro. Ventajosamente, las composiciones que comprenden antigeno (s) y/o epitope(s) de interés (opuesto a las composiciones que comprenden vector (es)-, recombinante (s) y/o plásmido(s) de DNA) se administran- a. mamíferos preñados en cuanto a como se desea inducir una respuesta de anticuerpo. Y, en contraste, tales composiciones que comprenden vector (es) , recombinante (s) y/o plásmido (s) de DNA que expresa (n) el antigeno (s) y/o epitope(s) de interés in vivo se administran ventajosamente a un mamífero recién nacido muy joven (por ejemplo, un mamífero que es susceptible a la enfermedad entérica, tal como un bovino durante aproximadamente su primer mes de vida y otro mamífero durante períodos análogos en su vida) , como una respuesta celular y/o de anticuerpo puede ser útil para prevenir, tratar y/o controlar las condiciones entéricas, las infecciones o síntomas en tales animales recién nacidos y/o muy jóvenes. Los animales recién nacidos y/o muy jóvenes pueden recibir un refuerzo de una composición antigénica y/o epitópica y/o de vector/recombinante/plásmido de DNA durante el periodo de susceptibilidad; y, su madre, opcionalmente y ventajosamente, también puede haber sido vacunado durante la preñes, como es descrito en la presente, tal que el animal recién nacido y/o muy joven puede estar recibiendo una respuesta inmunológica por · medio de la administración directamente a éste y pasivamente. Una composición inventiva particular puede comprender uno o más antigenos de E. coli (por ejemplo, pili que lleva E. coli inactivado, tal como, K99, Y, 31A, y/o F41 y/o estos pilis en forma subunitaria o recombinantemente expresados in vivo) y/o uno o más antigenos rotavirus (por ejemplo, rotavirus ventajosamente inactivados) , y/o uno o más antigenos de coronavirus (por ejemplo, antigeno de coronavirus bovino, ventajosamente tal como coronavirus inactivado) , en combinación con uno o más' antigenos de Cryptosporidium parvum, tal como P21 y/o Cp23 y/o Cpl5/60. (Y, como se mencionó previamente, uno o más de estos antigenos puede ser un epitope de interés contenido dentro del antigeno; y, uno o más de estos antígenos o epitopes de interés pueden ser expresados in vivo mediante un recombinante o un plásmido) . Asi, una composición inventiva particular puede comprender (i) uno o más antigenos de Cryptosporidium parvum tal como P21 y/o Cp23 y/o Cpl5/60 y/o CP41 y ventajosamente P21 y/o Cp23 y Cpl5/60, y (ii) por lo menos un antigeno de E. coli (por ejemplo, por lo menos uno o todos de K99, Y, 31?, F41 y otros pilis portados por E. ¦ coli inactivado o como subunidades o como es expresado in vivo; K99 y/o F41 de preferencia están presentes y Y y/o 31A están ventajosamente también presentes) , y/o antigeno de coronavirus y/o rotavirus, tal como uno o más antigenos de C. parvum, tal como P21 y/o Cp23 y/o Cpl5/60 -y/o CP41 y ventajosamente P21 y/o Cp23 y Cpl5/60 y uno o más antigenos de rotavirus tal como rotavirus inactivado, o uno o más antigenos de C. parvum, tal como P21 y/o Cp23 y/o Cpl5/60 y/o CP41 y ventajosamente P21 y/o Cp23 y/o Cpl5/60 y uno o más antigenos de coronavirus tal como el coronavirus inactivado, por ejemplo, coronavirus de bovino inactivado, o uno o más antigenos de C. parvum, tal como P21 y/o Cp23 y/o Cpl5/60 y/o CP41 y ventajosamente P21 y/o Cp23 y Cpl5/60 y uno o más antigenós de E. coli tales como K99, Y, 31A y F41 y otros pili portados por E. coli inactivado o como subunidades o como es expresado in vivo, por ejemplo, como una combinación de K99, Y, .31A'y/o F41. Un antigeno de E. coli ejemplar útil en la invención puede ser pili como pili de E. coli puede evitar la interferencia de la eficacia. En una composición ejemplar puede comprender uno o más antigenos de C. parvum, tal como P21 y/o Cp23 y/o Cpl5/60 y/o CP41 y ventajosamente es P21 y/o Cp23 y Cpl5/60 y „por lo menos un antigeno de E. colif y por lo menos un antigeno de coronavirus, y por lo menos un antigeno de rotavirus, por ejemplo P21 y/o Cp23 y/o Cpl5/60 y/o CP41 y ventajosamente P21 y/o Cp23 y Cpl5/60 y rotavirus inactivado, y coronavirus inactivado y por lo menos un antigeno de E. coli, ventajosamente pili o de preferencia por lo menos uno o más de K99, Y, 31? y F41 o una combinación de K99, Y, 31? y F41. (Y, como se mencionó previamente, uno o más de estos antigenos puede ser un epitope de interés contenido dentro del antigeno; y, uno o más de estos antigenos o epitopes de interés puede ser expresado in vivo mediante un recombinante o un plásmido) . Con respecto a la interferencia de eficacia potencial por las bacterias individuales o múltiples, los inventores han encontrado que al incrementar la cantidad de otros antigenos presentes en una vacuna de combinación, se evita cualquier interferencia de eficacia potencial; y, que el uso de pili como un antigeno de E. coli también evita la interferencia de la eficacia. En estas composiciones inventivas, una sola dosis puede tener el antigeno de E. coli (o cada antigeno de E. coli, en el caso de múltiples antigenos de E. coli) presente en una cantidad usualmente encontrada en vacunas contra patógenos entéricos tal como una cantidad para obtener un titulo de suero en conejillos de indias de por lo menos 0.9 log 10; el antigeno de rotavirus puede estar presente en una cantidad típicamente encontrada en vacunas contra patógenos entéricos, tal como una cantidad para obtener un titulo de suero en conejillos de indias de por lo menos 2.0 log 10, y el antigeno de coronavirus puede estar presente en una cantidad típicamente encontrada en vacunas contra patógenos entéricos, tal como una cantidad para obtener un título de suero en conejillos de indias en por lo menos 1.5 log 10; y, las composiciones inventivas pueden incluir un adyuvante, tal como hidróxido de aluminio, que puede estar presente en una sola dosis en una cantidad típicamente encontrada en vacunas tal como de preferencia una cantidad de aproximadamente 0.7 a aproximadamente 0.9 mg. Por consiguiente, en un aspecto de la invención proporciona una composición inmunológica, inmunogénica o de vacuna entérica combinada que comprende un primer antígeno o epítope de interés de Cryptosporidium parvum y/o un primer vector que expresa el primer antígeno o epítope de interés, y un segundo antígeno o epítope de interés de otro patógeno entérico y/o el primer vector que expresa el primer antígeno o epítope de interés también expresa el segundo antígeno o epítope de interés y/o un segundo vector que expresan el segundo antígeno o epítope de interés, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. La composición puede comprender antígeno, que puede ser de Cryptosporidium parvum y un antígeno de otro patógeno entérico. La composición puede comprender un antígeno de Cryptosporidium y un antigeno "de otro patógeno entérico de una especie de bovino; o una especie de canino; o de una especie de felino; o de una especie de equino. El antigeno del patógeno entérico puede ser elegido del grupo que consiste de los antigenos de E. coli, rotavirus, coronavirus, Clostridium spp. y mezclas de los mismos. El patógeno entérico puede ser E. coli. El antigeno de E. coli puede ser seleccionado del grupo que consiste de E. coli que lleva el antigeno K99, E. coli que lleva el antigeno F41, E. coli que lleva el antigeno Y, E. coli que lleva el antigeno 31A, antigeno K99, antigeno F41, antigeno Y, antigeno 31A y mezclas de los mismos. El patógeno entérico puede comprender coronavirus bovino; y/o rotavirus bovino y/o Clostridium perfringens. El antigeno del patógeno entérico puede comprender Clostridium perfringens de toxoides de tipo C y D. En ciertas modalidades, el patógeno entérico puede comprender E. coli, rotavirus bovino, coronavir»us bovino y Clostridium perfringens o E. coli, rotavirus bovino, coronavirus bovino. Todavía adicionalmente, en ciertos aspectos la invención puede comprender una composición en donde el antígeno del patógeno entérico comprende antígenos de E. coli seleccionados del grupo que consiste de E. coli que lleva antígeno K99, E. coli que lleva antígeno F41, E. coli que lleva antígeno Y, E. coli que lleva antígeno 31A, antígeno K99, antigeno F41, antigeno Y, antigeno 31A, y mezclas de los mismos; coronavirus de bovino inactivado; rotavirus de bovino inactivado y Clostridium perfríngens de toxoides tipo C y D; o antigenos de E. coli seleccionado del grupo que consiste de E. coli .que lleva antigeno K99, E. coli que lleva antigeno F41, E. coli que lleva antigeno Y, E. coli que lleva antigeno 31A, antigeno K99, antigeno F41, antigeno Y, antigeno 31A y mezclas de los mismos; coronavirus de bovino inactivado; y rotavirus bovino inactivado. La composición inventiva ventajosamente puede comprender antigenos de Cryptosporidium parvum subunitarios seleccionados del grupo que consiste de P21, Cp23, Cpl5/60, CP41 y mezclas de los mismos, tal como Cp23 y Cpl5/60 o P21 y Cpl5/60. En las composiciones inventivas que asocian antigenos de Cryptosporidium parvum y por lo menos un patógeno entérico, el antigeno de Cryptosporidium parvum también puede comprender o se constituido por, oocistos inactivados o atenuados vivos, o subunidades obtenidas de oocistos . Las composiciones inventivas pueden incluir un adyuvante tal como saponina o hidróxido de aluminio; y, las composiciones inventivas pueden estar en la forma de una emulsión de aceite en agua. La invención además contempla una composición inmunológica, inmunogénica o de vacuna contra Cryptosporidium parvum, que comprende un primer antigeno que comprende un antigeno P21 o Cp23 o un epitope del mismo o un primer vector que expresa el primer antigeno y un segundo antigeno que comprende antigeno Cpl5/60 o epitope del mismo o el primer vector en donde el primer vector expresa tanto el primero y el segundo antigeno o un segundo vector que expresa el segundo antigeno, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. La composición puede comprender antígeno Cp23 y Cpl5/60 que están la forma de proteínas de fusión separadas. La composición puede comprender un vector que expresa Cp23 y Cpl5/60. La composición puede comprender un primer vector recombinante que expresa Cp23 y un segundo vector recombinante que expresa Cpl5/60. Y, la composición puede comprender P21 y Cpl5/60. Estas composiciones además pueden comprender un adyuvante. Todavía adicionalmente, la invención comprende una composición inmunológica, inmunogénica o de vacuna contra Cryptosporidium parvum, que comprende un primer antígeno que comprende un antígeno P21 o Cp23 o Cpl5/60 o CP41 o un epitope del mismo o un primer vector que expresa el primer antígeno y un segundo antígeno que comprende un segundo antígeno o epitope del mismo de Cryptosporidium parvum o el primer vector en donde el primer vector expresa tanto el primero como el segundo antígeno o un segundo vector que expresa el segundo antigeno, en donde el primero y el segundo antigeno son diferentes entre si, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. La invención también comprende un método de inmunización bovina de una cria recién nacida contra la enfermedad entérica que comprende administrar una composición inventiva a una cría hembra preñada antes del suministro, de modo que la cría recién nacida recibe anticuerpos maternales contra Cryptosporidium parvum a través del calostro y/o la leche. El método además puede comprender la alimentación a la cría recién nacida con calostro y/o leche de vaca(s) que se ha(n) administrado la composición mediante la preñes. El método puede comprender la administración de la composición a la cría recién nacida. La composición administrada a la hembra preñada puede comprender antígenos o epítopes de los mismos y la composición administrada a la cría puede comprender vectores. Así, la invención también contempla un método de inmunización activa de crías adultas y recién nacidas, que comprende administrar a las crías una composición inventiva. La invención también comprende un método de inmunización bovina de una cría recién nacida, que comprende alimentar a la cría recién nacida calostro y/o leche de vacas que se han administrado con la composición durante la preñes. De manera similar, en un sentido más amplio, la invención comprende un método de inmunización de un mamífero recién nacido que comprende alimentar „al recién nacido calostro y/o leche de un mamífero hembra que se ha administrado con la composición durante la preñes; y, el mamífero es ventajosamente, un bovino, un felino, un canino o un equino. Todavía adicionalmente, la invención puede comprender un método para preparar una composición inventiva que comprende mezclar los mezclar los antígenos o epítopes o vectores y el portador. Y, la invención puede incluir un equipo para preparar una composición inventiva que comprende los antígenos, epítopes o vectores, cada uno en un contenedor separado o contenedores (algunos antígenos, epítopes o vectores pueden estar conjuntamente en un contenedor, tal como los antígenos, epítopes o vectores de Cryptosporidium parvum pueden estar conjuntamente en un contenedor, y los otros antígenos, epítopes o vectores en uno o más de otros contenedores, o ¦ el portador, diluyente y adyuvante puede estar en contenedores separados), opcionalmente empaquetados conjuntamente; y además opcionalmente con instrucciones para la mezcla y/o administración.. En esta descripción, "comprende", "que comprende" y "que contiene" y "que tiene" y los similares pueden tener significado adscrito a estos en la ley de patente norteamericana y pueden significar "incluye", "que incluye" y los similares; "que consiste esencialmente de" o "consiste esencialmente" del mismo modo que tiene el significado adscrito en la ley de patentes norteamericanas y el término es de extremo abierto, permitiendo la presencia de más de lo que es mencionado mientras que las características básicas o novedosas de lo que es mencionado no se ha cambiado por la "presencia de más de lo que es mencionado, pero excluye las modalidades de la técnica previa. Otros aspectos de la invención se describen en o son obvios de (y dentro del ámbito de la invención) la siguiente descripción. BREVE DESCRIPCION DE IAS FIGURAS La siguiente Descripción Detallada, dada a manera de ejemplo, pero no propuesta" para limitar la invención a modalidades específicas descritas, puede ser entendida en conjunción con los dibujos acompañantes, incorporados en la presente por referencia. Varios aspectos y modalidades preferidas de la presente invención ahora serán descritas a manera de ejemplo no limitativo y con referencia a los dibujos acompañantes en los cuales: La Figura 1 muestra un mapa físico y de restricción del plásmido pJCAl55; La Figura 2 muestra un mapa físico y de restricción del plásmido pJCA!56; La Figura 3 muestra un mapa físico y de restricción del plásmido pJCA157; La Figura 4 muestra un mapa físico y de restricción del plásmido pJCA158; La Figura 5 muestra un mapa físico y de restricción del plásmido pJCA159; La Figura 6 muestra un mapa físico y de restricción del plásmido pJCA160; La Figura 7 muestra el conteo de oocistos comparativos en las heces en crías estimuladas ya sea con C. parvum, o rotavirus bovino, o ambos, o no estimulados (ejemplo 12) ; La Figura 8 muestra la expresión de rotavirus comparativo en las heces en crías de acuerdo con el ejemplo 12; La Figura 9 muestra la condición general del animal comparativo para crías de acuerdo con el ejemplo 12; La Figura 10 muestra el estado de deshidratación del animal comparativo en crías de acuerdo con el ejemplo 12; La Figura 11 muestra el conteo comparativo de heces líquidas para crías de acuerdo con el ejemplo 12; La Figura 12 muestra el estado de anorexia comparativo para crías de acuerdo con el ejemplo 12; y La Figura 13 muestra la evolución de la temperatura rectal comparativa en crías de acuerdo con el ejemplo 12. La Figura 14 representa los niveles de anticuerpo de calostro P21 (P21) promedio .por grupo de vacuna. La Figura 15 muestra los niveles de anticuerpo de calostro Cpl5/60 promedio por grupo de vacuna. La Figura 16 muestra los niveles de anticuerpo del suero P21 (P21) promedio por grupo de vacuna. La Figura 17 representa los niveles de anticuerpo Cpl5/60 promedio por grupo de vacuna. La Figura 18 representa los niveles hematocritos que comparan los animales estimulados y no estimulados . La Figura 19 ilustra las diferencias diarias en el % de materia seca fecal por grupo y por los puntos del tiempo de colección diaria. La Figura 20 es' una gráfica que muestra los resultados de un ensayo de detección de anticuerpo por ELISA indirecta de P21. La Figura 21 muestra los resultados de un ensayo de detección de anticuerpo por ELISA de Cpl5/60. La Figura 22 es un diagrama de registro que representa la enfermedad total de los animales para todas las vacunas a través del tiempo . La Figura 23 es un diagrama que representa la enfermedad total de los animales para las vacunas GST-.15/60 y de placebo solamente. La Figura 24 es un diagrama sombreado que muestra el registro de diarrea para todas las vacunas .

La Figura 25 es un diagrama sombreado que muestra el registro de anorexia para todas las vacunas. La Figura 26 muestra un diagrama sombreado que muestra el registro de depresión para todas las vacunas. La Figura 27 es un diagrama sombreado que muestra la materia seca fecal para todas las vacunas. La Figura 28 representa la caída del oocisto para todas las vacunas usadas en este estudio. La Figura 29 es una gráfica que muestra la evolución media de las temperaturas rectales . La Figura 30 muestra la reacción local promedio para la primera vacunación (cripto + combo; combo solamente) . La Figura 31 muestra la reacción local promedio en la segunda vacunación (cripto + combo; combo solamente) . La Figura 32 es una gráfica que muestra los títulos de anticuerpo Cpl5/60 de ELISA promedio. La Figura 33 muestra los títulos de anticuerpo de ELISA para el coronavirus bovino. La Figura 34 muestra los títulos de anticuerpo neutralizantes del virus para el coronavirus bovino. La Figura 35 muestra los títulos de anticuerpo de ELISA para el rotavirus bovino. La Figura 36 ilustra los títulos de anticuerpo neutralizantes del virus para el rotavirus bovino. La Figura 37 representa los títulos de anticuerpo de ELISA para el antigeno K99 de E. coli. La Figura 38 representa los títulos de anticuerpo de ELISA para el antígeno F41 de E. coli. DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Un aspecto de la invención de esta manera es una composición inmunológica, inmunogénica o de vacuna entérica combinada que comprende por lo menos un antígeno de epítope de interés de por lo menos un Cryptosporidium spp. , que de preferencia incluye Cryptosporidium parvum, y por lo' menos un antígeno de por lo menos otro patógeno entérico,, ventajosamente un patógeno que infecta la especie de animal que es protegida, tal como una especie canina, felina, equina o bovina y más venta osamente una especie bovina; /o un vector o vectores y/o un recombinante o recombinantes y/o un plásmido o plásmidos que expresan el antígeno de Cryptosporidium spp. o epítope de interés y/o por lo menos uno del (los) antígeno (s) o epítope (s) de interés del otro patógeno entérico; y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Las composiciones inmunológicas, inmunogénicas o de vacuna universales también se contemplan como patógenos entéricos ya que frecuentemente infectan varias especies de animales (más de una) . Una composición inmunológica induce una respuesta inmunológica-local o sistémica. Una composición inmunogénica del mismo modo induce una respuesta inmunológica local o sistémica. Una composición de vacuna induce una respuesta protectora local o sistémica. Por consiguiente, los términos "composición inmunológica" y "composición inmunogénica" incluyen una "composición de vacuna" (ya que los dos primeros términos pueden ser composiciones protectoras). Los antígenos de Cryptosporldivm parvum que pueden ser utilizados en esta invención comprenden de preferencia: (1) Una proteina de 148 aminoácidos llamada Cpl5/60 (Ver, por ejemplo, la patente norteamericana No. 5,591,434). Esta proteina es representada en US-A-5, 591, 434 en la SEQ ID NO: 2 con 10 aminoácidos adicionales en el extremo 5' y, corriente arriba de la metionina (Met) . Está dentro del alcance de la presente invención utilizar un antigeno que comprende o que consiste esencialmente de la secuencia de 148 aminoácidos de Cpl5/60 o de una secuencia de aminoácidos más larga que incluye estos 148 aminoácidos, por ejemplo la secuencia completa representada en la SEQ ID NO: 2 en US-A-5, 591, 34 o cualquier polipéptido que comprende un fragmento de la secuencia de 148 o 158 aminoácidos que comprenden un epitope de la misma, ventajosamente un epitope que induce protección o un epitope que tiene la inmunogenicidad de la secuencia de longitud completa) y/o (2) Cp23„ /o P21. (Cp23 es un antigeno de aproximadamente 23 kDa ver Perryman y colaboradores, Molec Biochem Parasitol 80:137-147 (1996); WO-A-980732C y L.E. Perryman y colaboradores, Vaccine 17 (1999)2142-2149. La 3L parte mayor de esta proteina (187 aminoácidos) es en la presente llamada P21 y tiene una secuencia de aminoácidos homologa a la secuencia de aminoácidos de la proteina C7, que es divulgada como SEQ ID NO:' 12 en O-A-98 07320. Para ser expresados, uno o dos o más aminoácidos pueden ser adicionados al extremo de P21, tal como, Met-, o Met-Gly- o aminoácidos similares. Está dentro del alcance de la presente invención utilizar un antigeno que comprende o que consiste esencialmente de o que consiste de la secuencia de 187 aminoácidos o una secuencia de aminoácidos más larga, o un polipéptido que comprende un fragmento de la secuencia de 187 aminoácidos que comprende un epitope del mismo, ventajosamente un epitope que induce protección o un epitope que tiene la inmunogenicidad de la secuencia de longitud completa. La secuencia de aminoácidos entera de Cp23 y la secuencia · de nucleótidos correspondiente es fácilmente obtenible. La proteina P21 representa la parte mayor del extremo C-terminal y de Cp23. La secuencia de nucleótido P21 puede ser utilizada como una sonda para clasificar una librería de DNA, por ejemplo, una librería como es divulgado en el Ejemplo 1. Esta metodología es bien conocida para un experto en la técnica. En la base del peso molecular de Cp23, se puede averiguar que aproximadamente 25-35 aminoácidos están perdidos en el extremo N-termínal de P21 para tener la secuencia de aminoácido Cp23 completa. Esta información da a aquellos expertos en la técnica los medios para encontrar fácilmente el codón de inicio y asi el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos Cp23 y la secuencia de aminoácidos N-terminal. Los antigenos o epitopes de interés pueden ser utilizados individualmente o en combinación en composiciones de la invención, por ejemplo, una composición inventiva puede incluir (1) o (2) o ambos de (1) y (2) . Otro antígeno posible es el antigeno CP41 como es divulgado supra . De acuerdo con la modalidad preferida, estos antigenos o epitopes de interés se incorpora en la composición como proteínas o antígenos subunitarios . Ellos pueden ser producidos mediante síntesis química o mediante la expresión in vitxo. Los ejemplos describen como obtener las secuencias que codifican Cpl5/60 y P21 y como construir vectores que los expresan. Estas secuencias pueden ser clonadas en vectores de clonación o expresión adecuados. Estos vectores luego se utilizan para transfectar células hospederas adecuadas. Los antígenos codificados por la secuencia de nucleótidos que es insertada en el vector, por ejemplo, Cp23 y/o P21 y/o Cpl5/60, se producen al cultivar las células hospederas transformadas por los vectores de expresión bajo condiciones mediante las cuales se produce el antígeno. Esta metodología es bien conocida para un experto en la técnica. Las células hospederas pueden ser ya sea procarióticas o eucarióticas, por ejemplo, Escherichia coli (E. coli), levaduras tal como Saccharomyces cerevisiaer células de animales, en particular lineas de células de animales. El experto en la técnica reconoce los vectores que pueden ser utilizados con una célula hospedera dada. Los vectores pueden ser elegidos tal que una proteina de fusión es producida la cual puede ser utilizada para recuperar fácilmente el antigeno. Además, con respecto a las secuencias, las secuencias de ácido nucleico útiles para expresar el antigeno de C. parvum o epitope de interés puede incluir secuencias de ácido nucleico que son capaces de hibridar bajo condiciones de alta severidad o aquellas que tienen una alta homología con moléculas de ácido nucleico empleadas en la invención (por ejemplo, moléculas de ácido nucleico en documentos mencionados en la presente) ; y "hibridación bajo condiciones de alta severidad", puede ser sinónimo con "condiciones de hibridación severas", un término que es bien conocido en la técnica; ver, por ejemplo, Sambrook y colaboradores, ""Molecular Cloning, A Laboratory Manual" Second ed., CSH Press, Cold Spring Harbor, 1989; "Nucleíc Acid Hibridisation, A Practical Approach", Hames and Higgins eds., IRL Press, Oxford, 1985; ambas incorporadas en la presente por referencia.

Con respecto a las moléculas de ácido nucleico y polipéptidos que pueden ser utilizados en la práctica de la invención, las moléculas de ácido nucleico y polipéptidos ventajosamente tienen por lo menos aproximadamente 75% o más grande homología o identidad, ventajosamente 80% o más grande homología o identidad, más ventajosamente 85% más grande homología o identidad, tal como por lo menos aproximadamente 85% o aproximadamente 86% o aproximadamente 87% o aproximadamente 88% o- aproximadamente- 89% de homología o identidad, por ejemplo por lo "menos aproximadamente 90% de homología o identidad - o más grande, tal como por lo menos aproximadamente 91%, o aproximadamente 92%, o aproximadamente 93%, o aproximadamente 94% de identidad u homología, más ventajosamente por lo menos aproximadamente 95% a 99% de homología o identidad o más grande, tal como por lo menos aproximadamente 95% de homología o identidad o más grande por ejemplo, por lo menos aproximadamente 96%, o aproximadamente 97%, o aproximadamente 98%, o aproximadamente 99%, .o aun aproximadamente 100% de identidad u homología, o de aproximadamente 75%, ventajosamente de aproximadamente 85% a aproximadamente 100% o de aproximadamente 90% a aproximadamente 99% o aproximadamente 100% o de aproximadamente 95% a aproximadamente 99% o aproximadamente 100% de identidad u homología, con respecto a las secuencias expuestas en los documentos citados en la presente (incluyendo subsecuencias de las mismas discutidas en la presente) ; y así, la invención comprende un vector .que codifica' un epítope o región epitópica de un aislado C. parvum o a una composición que comprende tal epítope, composiciones que comprenden un epítope o región epitópica de un aislado de C. parvum, y métodos para hacer y utilizar tales vectores y composiciones, por ejemplo, la invención también comprende que estas moléculas de ácido nucleico y polipéptidos pueden ser utilizados de la misma manera como las moléculas de ácido nucleico mencionados en la presente, fragmentos de las mismas y polipéptidos . La homología de secuencias de nucleótidos puede ser determinada utilizando el programa "Align" de Myers y Miller, ("Optimal Alignments in Linear Space", CABIOS 4, 11-17, 1988, incorporada en la presente por referencia) y disponible en NCBI. Alternativamente o adicionalmente, el término "homología" o "identidad", por ejemplo, con respecto a una secuencia de nucleótidos o de aminoácidos, puede indicar una medición cuantitativa de la homología entre dos secuencias . El por ciento de homología de secuencia puede ser calculado como · (Nref-Ndi.f) *100/Nref, en donde Ndif es el número total de residuos no idénticos en las dos secuencias cuando se alinean y en donde Nref es el número de residuos en una de las secuencias. Por consiguiente, las secuencias de DISiA AGTCAGTC tendrán una similitud de secuencia de 75% con la secuencia AATCAATC (Nrer=8; Ndif=2) . Alternativamente o adicionalmente, "homología" o "identidad"' con respecto a secuencias pueden referirse al número de posiciones con nucleótidos o aminoácidos idénticos divididos entre el número de nucleótidos o aminoácidos en la más corta de las dos secuencias en donde la alineación de las dos secuencias puede ser determinado de acuerdo con el algoritmo de Wilbur y Lipman (Wilbur y Lipman, 1983 PNAS USA 80:726, incorporado en la presente por referencia), por ejemplo, usando un tamaño de ventana de 20 nucleótidos, una longitud de palabra de 4 nucleótidos, y una sanción de espacio dé 4, y el análisis asistido por computadora y la interpretación de los datos de secuencia que incluyen la alineación puede ser convenientemente' realizado usando programas . comercialmente disponibles (por ejemplo, Intelligenetics™ Suite, Intelligenetics Inc. CA) . Cuando las secuencias de RNA se dice que son similares, o tiene un grado de identidad de homología de secuencia con una secuencia de DNA, timidina (T) en la secuencia de DNA se considera igual a uracilo (U) en la secuencia de RNA. las secuencias de RNA dentro del alcance de la invención' pueden ser derivadas de secuencias de DNA, por timidina (T) en la secuencia de DNA que se considera igual a uracilo (U) en las secuencias de RNA. Adicionalmente o alternativamente, la similitud o identidad de la secuencia de aminoácidos u homología puede ser determinado usando el programa BlastP (Altschul y colaboradores, Nucí. Acids . Res. 25, 3389-3402, incorporada en la presente por referencia) y disponible en NCBI (usado en la determinación de la homología de secuencia, como es mostrado en Appendix I; ver también los Ejemplos). Las siguientes referencias (cada una incorporada en la presente por referencia) también proporciona algoritmos para comparar la identidad u homología relativa de los residuos de aminoácido de dos proteínas, y adicionalmente o alternativamente con respecto a lo anterior, las enseñanzas en esta referencia pueden ser usadas para determinar el por ciento de homología o identidad: Needleman SB y Wunsch CD, " general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequences of two proteins", J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970); Smith TF y Waterman S, "Comparison of Bio-sequences", Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981) ; Smith TF, Waterman MS y Sadler JR, "Statistical characterization of nucleic acid sequence functional domains", Nucleic Acids Res. 11:2205-2220 (1983); Feng DF y Dolittle RF, "Progressive sequence alignment as a prerequisite to correct phylogenetic trees", J. of Molec-. Evol . , 25:351-360 (1987); Higgins DG y Sharp PM, "Fast and sensitive múltiple sequence alignment on a microcomputer", CABIOS, 5:151-153 (1989); Thompson JD, Higgins DG y Gibson TJ, "ClusterW: improving the sensitivity of progressive múltiple sequence alignment through sequence weighing, positions-specific gap penalties and weight matrix choice, Nucleic Acid Res. 22:4673-480 (1994); .y Devereux J. Haeberlie P y Smithies O, WA comprehensive set of sequence analysis program for the VAX", Nucí. Acids. Res. 12:387-395 (1984). Además, en cuanto a las moléculas de ácido nucleico usadas en esta invención (por ejemplo, como los documentos citados en la presente) , la invención comprende el uso de moléculas de ácido nucleico equivalentes' a codón. Por ejemplo, si la invención comprende la proteina ?" (por ejemplo, P21 y/o Cp23 y/o Cpl5/60 y/o CP41) que tiene la secuencia de aminoácido ???" y codificada por la molécula de ácido nucleico "N", la invención comprende moléculas de ácido nucleico que también codifican" la proteina X por la via de uno o más de diferentes codones que en la molécula de ácido nucleico N. El antigeno o epitope de interés usado en la práctica de la invención puede ser obtenido del (los) patógeno (s) particular (es) , por ejemplo, C. parvum, E. col , rotovirus, coronavirus y los similares o se puede obtener de la expresión recombinante in vitro y/o. ,in vivo de gen (es) o porciones de los mismos. Los métodos para hacer y/o utilizar vectores (o recombinantes ) para la expresión pueden ser mediante o análogos a los métodos divulgados en: patentes norteamericanas Nos. 4,603,112, 4,769,330, 5,174,993, 5,505,941, 5,338,683, 5,494,807, 4,722,848, 5,942,235, las publicaciones de PCT WO 94/16716, O 96/39491, Paoletti, "Applications of pox virus vectors to vaccination: An update", PNAS USA 93:11349-11353, octubre de 1996, Moss, "Genetically engineered poxviruses for récombinant gene expression, vaccination, and safety" PNAS USA 93:11341-11348, octubre de 1996, Smith y colaboradores, patente norteamericana No, 4,745,051 (récombinant baculovirus) , Richardson, C.D. (Editor), Methods in Molecular Biology 39, "Baculovirus Expression Protocols" (1995 Humana Press Inc.), Smith. colaboradores, "Production of Huma Beta Interferon in Insect Cells Infected with a Baculovirus Expression Vector", Molecular and Cellular Biology, diciembre, 1983, Vol. 3, No. 12, p. 2156-2165; Pennock y colaboradores, "Strong and Regulated Expression of Eschexichia coli B-Galactosidase in Infect Cells with a Baculovirus vector", Molecular and Cellular Biology marzo. 1984, Yol. 4, No. 3, p. 399-306; EPA 0 370 573, solicitud norteamericana No. de Serie 920,197, presentada el 16 de octubre de 1986, publicación de patente Europea No. 265785, patente norteamericana No. 4,769,331 (herpes virus recombinante) , Roizman, "The function of herpes simplex virus genes: A primer for genetic engineering Of novel vectors", PNAS USA 93:11307-11312, octubre de 1996, Andreansky y colaboradores, "The application of genetically engineered herpes simplex viruses to the treatment of experimental brain tumors", PNAS USA 93:11313-1318, octubre de 1996, Robertson y colaboradores, "Epstein-Barr virus vectors for gene delivery to B lymphocytes", PNAS USA 93:11334-11340, octubre de 1996, Frolov y colaboradores, "Alphavirus-based expression vectors: Strategies and applications", PNAS USA 93:11371-11377, octubre de 1996, Kitson y colaboradores, J. Virol. 65, 3068-3075, 1991; patentes norteamericanas Nos. 5,591,439, 5,552,143, solicitudes norteamericanas permitidas No. de Serie 08/675,556 y 08/675,566, presentadas el 3 de julio de 1996 (adenovirus recombinante) , Grunhaus y colaboradores, 1992, "Adenovirus as cloning vectors". Seminars in Virology (Vol. 3)· p. 237-52, 1993, Ballay y colaboradores EMBO Journal, vol. 4, p. 3861-65, Graham, Tibtech 8, 85-87, abril, 1990, Prevec y colaboradores, J. Gen Virol. 70, 429-434, PCT W091/11525, Felgner y colaboradores (1994), J. Biol. Chem. 269, 2550-2561, Science, 259:1745-49, 1993 y McClements y colaboradores, "Immunization with DNA vaccines encoding glycoprotein D or glycoprotein B, alone or in combination, induces protective immunity in animal models of herpes simplex virus-2 disease", PNAS USA 93:11414-11420, octubre de 1996 y las patentes norteamericanas Nos. 5,591,639, 5,589,466 y 5,580,859 relacionadas con vectores de expresión de DNA, ínter, alia. Ver también WO 98/33510; Ju y colaboradores, Diabetologia, 41:736-739, 1998 (sistema de expresión lentiviral) , Sanfor y colaboradores, patente norteamericana No. 4,945,050; Fischbach y colaboradores (Intracel) , WO 90/01543; Robinson y colaboradores, seminarios en I MUNOLOGY, vol. 9, pp. 271-283 (1997) (sistemas de vector DNA) ; Szoka y colaboradores, patente norteamericana No, 4,394,448 (método de inserción de DNA en células vivas) ; McCormick y colaboradores, patente norteamericana No. 5,677,178 (uso de virus citopático) ; patente norteamericana No. 5, 928,913 (vectores para el suministro del gen)" y Tartaglia y colaboradores, patente norteamericana No. 5,990,091 (vectores que tienen expresión mejorada), asi como otros documentos citados en la presente. Un vector viral, por ejemplo, seleccionado de virus de herpes, adenovirus, poxvirus, especialmente virus de vaccinia, virus de avipox, virus de canaripox, asi como vectores de DNA (plásmidos de DNA) se emplean ventajosamente en la práctica de la invención, especialmente para la expresión in vivo (mientras que los sistemas bacterianos y de levadura se emplean ventajosamente para la expresión in vitro) . Si la combinación de hospedero-vector conduce a la producción de antigeno sin excreción, para la conveniencia de • su . producción, y su recuperación, estos antigenos de preferencia están bajo la forma de proteínas de fusión (por ejemplo, un HIS tag) . En otras palabras, el antigeno puede comprender el antigeno per se y aminoácidos foráneos. Las técnicas para la purificación y/o aislamiento de proteina de esta descripción y los documentos citados en la presente, Ínter alia, y de esta manera dentro del ámbito de la persona experta, pueden ser utilizadas, sin experimentación indebida, para purificar y/o aislar productos de expresión recombinante o de vector y/o antigeno (s) , en la práctica de la invención y tales técnicas, en general, pueden incluir: la precipitación al tomar ventaja de la solubilidad de la proteina de interés en concentraciones de sal variables, precipitación con solventes orgánicos, polímeros y otros materiales, precipitación por afinidad y desnaturalización selectiva, cromatografía en columna, incluyendo la cromatografía líquida de alto desempeño (HPLC) , intercambio iónico, afinidad, inmunoafinidad o cromatografía de tinte-ligando; inmunoprecipitación y el uso de filtración en gel, métodos electroforéticos, ultrafiltración y enfocamiento isoeléctrico, Inter alia. Como se mencionó en la presente, de acuerdo con otro aspecto, la invención comprende que los antígenos y/o epítopes de interés no son incorporados como subunidades en la composición, sino más bien que son expresados in vivo; por ejemplo, la invención comprende que la composición comprende vector (es) recombinante (s) que expresa (n) los antígenos in vivo cuando se administran al animal. El vector puede comprender un plásmido de vector de DNA, un virus de herpes, un adenovirus, un poxvirus, incluyendo un virus de vaccinia, un virus de avipox, un virus canaripox y un virus de swinepox y los similares, las composiciones basadas en el vector pueden comprender un vector que contiene y expresa una secuencia de nucleótidos del ahtigeno que es expresado, por ejemplo, Cpl5/60 y/o Cp23 para Cryptosporidium parvum. La palabra plásmido se propone para incluir cualquier unidad de transfección de DNA en la forma de una secuencia de polinucleotido que comprende la secuencia que es expresada. Ventajosamente, el plásmido incluye elementos necesarios para su expresión; por ejemplo, la expresión in vivo. La forma de plásmido circular, superespiral o de otra manera, es ventajosa, y la forma lineal también está incluida dentro del alcance de la invención. El plásmido puede ser ya sea plásmido desnudo o plásmido formulado, por ejemplo, dentro de lipidos o liposomas, por ejemplo, liposomas catiónicos (ver, por ejemplo, WO-A-90 11082; WO-A-92 19183; WO-A-96 21797; WO-A-95 20660). La composición inmunológica o de vacuna de plásmido puede ser administrada por medio de una pistola génica, o intramuscularmente, o nasalmente, o por cualquier otro medio que permite la expresión in vivo, y ventajosamente una respuesta inmunológica o protectora. La referencia también se hace a las solicitudes norteamericanas Nos. de serie 09/232,278, 09/232,468, 09/232,477, 09/232 ,'279, 09/232,478 y 09/232, 469, cada una presentada el 15 de enero de 1999 (e incorporada en la presente por referencia) y a las solicitudes norteamericanas Nos. de Serie 60/138,352 y 60/138,478, cada una presentada el 10 de junio de 1999 (e incorporada en la presente por referencia) , ya que estas solicitudes involucran vacunas de DNA y/o de vector o composiciones inmunogenicas o inmunológicas para felinos, caninos, bovinos y equinos, y las composiciones inventivas pueden incluir vacunas de DNA y/o vector o composiciones inmunogénicas o inmunológicas a partir de estas solicitudes y/o composiciones inventivas pueden ser preparadas y/o formuladas y/o administradas de una manera análoga en las composiciones de estas solicitudes. Las composiciones para uso en la invención se pueden preparar de acuerdo con técnicas estándares bien conocidas para aquellos expertos en las técnicas veterinarias o farmacéuticas o médicas. Tales composiciones se pueden administrar en dosificaciones y por técnicas bien conocidas para aquellos expertos en las técnicas veterinarias tomando en consideración tales factores como la edad, sexo, peso, condición y tratamiento particular del animal, y la ruta de administración. Los componentes de las composiciones inventivas · se pueden administrar solos, o se pueden co-administrar o administrar secuencialmente con otras composiciones (por ejemplo, el (los) antigeno (s) de C. parvum y/o epitope(s) se pueden administrar solos, y seguido por la administración de manera secuencial y antigeno (s) y/o epitope(s) de otros patógenos entéricos, o composiciones que comprenden un (os) antigeno (s) entérico o epitope(s) pueden incluir vectores o recombinantes o plásmidos que también expresan antigeno (s) entérico (s) o epitope(s) de los mismos o diferentes patógenos) o con otras composiciones profilácticas o terapéuticas (por ejemplo, otras composiciones inmunogénicas, inmunológicas o »de vacuna) . Asi, la invención proporciona composiciones multivalentes o vde cóctel" o de combinación y métodos que las emplean. Los ingredientes y la ¦manera (secuencial, por ejemplo, como parte de un régimen de principio-refuerzo, o como parte de un programa de refuerzo en donde la composición inmunogénica, inmunológica o de vacuna es administrada periódicamente durante la vida del animal tal como programa de refuerzo anual, estacionario, bianual y los similares; o con la administración) de la administración, asi como dosificaciones, pueden ser determinadas, tomando en consideración tales factores como la edad, sexo, peso, condición y tratamiento particular del animal, por ejemplo vaca, y, la ruta de administración. ? esta respecto, la referencia se hace a la patente norteamericana No. 5,843,456 incorporada en la presente por referencia, y dirigidas a composiciones de rabia y composiciones de combinación y usos de las mismas.

Las composiciones de la invención se pueden utilizar para la administración parenteral o mucosal, de preferencia mediante rutas intradérmicas , subcutáneas o intramusculares. Cuando se utiliza la administración mucosal, es posible utilizar las rutas oral, nasal o vaginal. En tales composiciones, el (los) vector (es) o antigeno (s) o epitope(s) de interés puede estar en mezcla con un portador adecuado, diluyente, excipiente tal como agua estéril, solución salina fisiológica, glucosa a los similares. Las composiciones también pueden ser liofilizadas . Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares tales como agentes reguladores del pH, adyuvantes, conservadores, excipientes poliméricos utilizados para las rutas mucosales, y los similares, dependiendo de la ruta de administración y la preparación deseada. Textos estándares,, tal como ^RE INGTON' S PHARMACEUTICAL SCIENCE", 17a edición, 1985, incorporada en la presente por referencia, se pueden consultar para preparar preparaciones adecuadas, sin experimentación indebida. Las dosificaciones adecuadas también se pueden basar en el texto en la presente y los documentos» citados en la presente. Los adyuvantes son sustancias que aumentan la respuesta inmune a los antigenos. Los adyuvantes, pueden incluir el óxido de aluminio y fosfato de aluminio, saponinas, por ejemplo, Quil A, emulsiones de aceite mineral, polímeros plurónicos con emulsión de aceite mineral o metabolizable, el adyuvante de agua en aceite, el adyuvante de aceite en agua, polímeros sintéticos (por ejemplo, homo- y copolímeros de ácido láctico o glicólico, que se han utilizado para producir microesferas que encapsulan antígenos, ver Eldridge y colaboradores, Mol. Immunol. 28:287-294 (1993), por ejemplo, microesferas biodegradables), copolímeros de bloque no iónicos, copolímeros de bajo peso molecular en emulsiones basadas en aceite (ver Hunter y colaboradores, The Theory and Practical Application of Adjuvants (Ed. Stewart-Tull, D. E. S.). John Wiley y Sons, NY, pp 51-94 (1995)), copolímeros de alto peso molecular en formulaciones acuosas (Todd y colaboradores, Vaccine 15: 564-570 (1997) ) , citoquinas tal como IL-2 y IL-12 (ver, por ejemplo, la patente norteamericana No. 5,334,379), y GM-CSF (macrófago de granulocito-factor de estimulación de colonia; ver, generalmente las patentes norteamericanas Nos. 4,999,291 y 5,461,663, ver también Clark y colaboradores, Science 1987, 230:1229; Grant y colaboradores, Drugs, 1992, 53:516), ventajosamente GM-CSF de la especie de animal que es vacunado, inter alia. Ciertos adyuvantes pueden ser expresados in vivo con antígeno(s) y/o epítope(s); por ejemplo, citoquinas, GM-CSF (ver, por ejemplo, C.R. Malisze ski y colaboradores, olec Immunol 25(9): 843-50 (1988); S.R. Leong, Vet Immunol and Immunopath 21:261-78 (1989), concernientes al GM-CSF bovino. ün plásmido que codifica GM-CSF puede ser modificado para contener y expresar DNA que codifica un antigeno de un patógeno bovino de acuerdo con la presente invención o un epitope del mismo opcionalmente también con DNA que codifica un antigeno y/o epitope de otro patógeno bovino, o se puede utilizar en conjunción con tal plásmido) . Un ejemplo adicional de un adyuvante es un compuesto seleccionado de los polímeros de ácido acrílico o metacrílico y los copolimeros de anhídrido maleico y derivado de alquenilo. Los compuestos adyuvantes ventajosos son los polímeros de ácido acrílico o metacrílico, que son reticulados, especialmente con éteres de polialquenilo de azúcares o polialcoholes . Estos compuestos son conocidos por el término carbómero (Phameuropa Vol. 8, No. 2, junio de 1996) . Las personas expertas en la técnica también pueden referirse a la patente norteamericana No. 2,909,462 (incorporada en la presente por referencia) que describe tales polímeros acrílicos reticulados con un compuesto polihidroxilado que tiene por lo menos 3 grupos hidroxilo, de preferencia no más de 8, los átomos de hidrógeno de por lo menos tres hidroxilos que son reemplazados por radicales alifáticos insaturados que tienen por lo menos 2 átomos de carbono. Los radicales preferidos son aquellos que contienen de 2 a 4 átomos de carbono, por ejemplo, vinilos, alilos y otros grupos etilénicamente insaturados. Los radicales insaturados por si mismos pueden contener otros sustituyentes, tal como metilo. Los productos vendidos bajo el nombre Carbopol® (BF Goodrich, Ohio, USA) son particularmente apropiados. Ellos son reticulados con alil sacarosa o con alil pentaeritritol . Entre esto, se pueden mencionar Carbopol® 974P, 934P y 971P. Entre los copolimeros de anhídrido maleico y derivados de alquenilo, los copolimeros ???® (Monsanto) , que son copolimeros de anhídrido maleico y etileno, lineales o reticulados, por ejemplo, reticulados con éter di inilico, son preferidos. La referencia se puede hacer a J. Fields y colaboradores, Nature, 186: 778-780, 4 de junio de 1960, incorporado en la presente por referencia. Desde el punto de vista de su estructura, los polímeros de ácido acrílico o metacrílico y los copolimeros EMA® de preferencia se forman de unidades básicas de la siguiente fórmula: en la cual: Ri y que son idénticos o diferentes, representan H o CH3, x = 0 o 1, de preferencia x=l; y y = 1 o 2, con x + y = 2. Para los copolímeros ???®, x=0 y y==2. Para los carbómeros, x=y=l . La disolución de estos polímeros en agua conduce a una solución ácida que será neutralizada, de preferencia a pH fisiológico, con el fin de dar la solución de adyuvante en la cual la composición inmunogénica, inmuriológica o de vacuna misma será incorporada. Los grupos carboxilo del polímero luego están parcialmente en formas C00~. De preferencia, una solución de adyuvante de acuerdo con la invención, especialmente de carbómero, se prepara en agua destilada, de preferencia en la presencia de cloruro de sodio, la solución obtenida que está a pH acidico. Esta solución de extracto se diluye al adicionarle a la cantidad deseada (para obtener la concentración final deseada) , o a una parte sustancial de la misma, de agua cargada con NaCl, de preferencia solución salina fisiológica (NaCl 9 g/1) todo a la vez en varias porciones con neutralización concomitante o subsecuente (pH 7.3 a 7.4), de preferencia con NaOH. Esta solución a pH fisiológica será utilizada como se encuentra para el mezclado con la vacuna', que puede ser especialmente almacenada en forma deshidratada por congelación, liquida o congelada. La concentración de polímero en la composición de vacuna final puede ser de 0.01% a 2% w/v, por ejemplo, 0.06 a 1% w/v, tal como 0.1 a 0.6% w/v. La adición de adyuvante a las composiciones inmunogénicas y vacunas de acuerdo con la invención también se puede hacer con la formulación de éstos en la forma de emulsiones, en particular emulsiones de aceite en agua, por ejemplo una emulsión tal como la emulsión SPT descrita p 147 en "Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach" editado por M. Powell, M. ewman, Plenum Press 1995, o la emulsión MF59 descrita pl83 en el mismo libro. En particular, la emulsión de aceite en agua puede estar basada en aceite de parafina liquido claro (de acuerdo con la Farmacopea Europea) , aceite isoprenoide, tal como escualano, escualeno; aceite obtenido mediante la oligomerizacion de alquenos, en particular de isobutileno o de deceno; ésteres de ácido de alcohol con grupos alquilo lineales, particularmente aceites vegetales, oleato de etilo, propilenglicol di (caprilato/caprato) , glicerol tri (caprilato/caprato) , dioleato de propilenglicol; ésteres de ácidos grasos ramificados o alcoholes, en particular éteres de ácido isosteárico. El aceite se utiliza en combinación con emulsificantes para formar la emulsión. Los emulsificantes de preferencia son surfactantes no iónicos, en particular ésteres de sorbitán, ésteres de manuro, ésteres de glicerol, ásteres de poliglicerol, ésteres 'de propilenglicol o ésteres de ácido oleico, de ácido isosteárico, ele ácido ricinoleico, de ácido hidroxiesteárico, posiblemente etoxilado, copolimeros de bloque tal como polioxipropileno-polioxietileno, en particular los productos llamados Pluronic, específicamente Pluronic L121. ? partir de esta descripción y el conocimiento en la técnica, la persona experta puede seleccionar un adyuvante adecuado, si es deseado, y la cantidad del mismo para emplearse en una composición inmunológica, inmunogénica o de vacuna de acuerdo con la invención, sin experimentación indebida . Las composiciones inmunológicas, inmunogénicas o de vacuna de acuerdo con la invención se pueden asociar a por lo menos la vacuna atenuada viva, inactivada, o subunitaria, o la vacuna recombinante (por ejemplo poxvirus como vector o plásmido de DNA) que expresa por lo menos un inmunógeno, antígeno o epitope de interés a partir de otro patógeno. Las composiciones en formas para varias rutas de administración son contempladas por la invención. Nuevamente, la dosificación efectiva y ruta de administración son determinadas por factores conocidos, tal como la edad,, peso. Las dosificaciones de cada agente activo, por ejemplo, de cada antígeno de C. parvum o epitope de interés y/o de cada antigeno o epitope de cada patógeno entérico pueden estar como los documentos citados en la presente o como es mencionado de otra manera en la presente y/o pueden variar de uno a unos cuantos cientos o miles de microgramos, por ejemplo 1 ]xg a 1 mg, para una composición inmunogénica subunitaria, inmunológica o de vacuna; y, 104 a 1010 TCID50 ventajosamente 106 a 108 TCID50, antes de la inactivación,-para una composición inmunogénica, inmunológica o de vacuna inactivada. Los recombinantes o vectores se pueden administrar en una cantidad adecuada para obtener la expresión in vivo correspondiente a las dosificaciones descritas en la presente y/o en los documentos citados en la presente. Por ejemplo, los intervalos adecuados para las suspensiones virales se pueden. determinar empíricamente. Él vector viral o recombinante de la invención puede ser administrada al animal o infectado o transfectado en células en una cantidad de por lo menos aproximadamente 10* pfu; más de preferencia aproximadamente 104 pfu a aproximadamente 1010 pfu, por ejemplo, aproximadamente 105 pfu a aproximadamente 109 pfu, por ejemplo, aproximadamente 106 pfu a aproximadamente 103 pfu, con dosis que generalmente varían de aproximadamente 10° a aproximadamente 1010, de preferencia aproximadamente 1010 pfu/dosis, y ventajosamente aproximadamente 108 pfu por dosis de aproximadamente 1 mi a aproximadamente 5 mi, ventajosamente aproximadamente 2 mi. Y, si más de un producto de gen es expresado por más que un recombinante, cada recombinante puede ser administrado en estas cantidades; of cada recombinante puede ser administrado tal que hay, en combinación, una suma de recombinantes que comprenden estas cantidades. En composiciones de plásmido empleadas en la invención, las dosificaciones pueden ser como es descrito en los documentos citados en la presente como es descrito en la presente. Ventajosamente, la dosificación debe ser una cantidad suficiente de plásmido para inducir una respuesta análoga a las composiciones en donde el (los) antigeno (s5 o epitope(s) de interés están directamente presentes; o para tener análogos de expresión a dosificaciones 'en tales composiciones, o para tener análogos de expresión para la expresión obtenida' in vivo mediante composiciones recombinantes. Por ejemplo, las cantidades adecuadas de cada DNA de plásmido y las composiciones de plásmido pueden ser de 1 ]ig a 2 mg, de preferencia 50 µg a 1 mg. Los documentos citados en la presente que consideran vectores de plásmido de DNA pueden ser consultados por la persona experta para averiguar otras dosificaciones adecuadas para las composiciones de vector de plásmido de DNA de la invención, sin experimentación indebida . Sin embargo, la dosificación ¦ de la(s) composición (es) , concentración de componentes en la misma y la ' sincronización de la administración de la(s) composición (s) , que inducen una respuesta inmunológica adecuada, puede ser determinado por métodos tal como las titulaciones de anticuerpo de suero, por ejemplo, mediante el análisis de ensayo de ELISA y/o seroneutralización y/o seroprotección. Tales determinaciones no requieren experimentación indebida a partir del conocimiento de la persona experta, esta descripción y los documentos citados en la presente. Y, el tiempo para las administraciones secuenciales puede ser averiguado del mismo modo con métodos averiguables a partir de esta descripción y el conocimiento en la técnica, sin experimentación indebida. De preferencia, la composición inmunológica, inmunogénica o de. vacuna entérica, combinada, comprende ambos antigenos de Cryptosporidium parvum como es definido en lo anterior. Los antigenos o epitopes de patógenos entéricos venta osamente combinados con antigeno (s) de Cryptosporidium o epitope(s) (ventajosamente P21 y/o Cp23 y/o Cpl5/60 y/o CP41 tal como P21 o Cp23 y Cpl5/60, o epitope(s) de los mismos) comprenden de preferencia uno o más antigenos o epitopes de interés de E. coli, y/o rotavirus; .y/o coronavirus, y/o Clostridium spp. , tal como Cl. perfringens; por ejemplo, por lo menos un antigeno o epitope de interés de E. coli, rotavirus y coronavirus. Los antigenos de E. coli incluyen de preferencia uno, de preferencia varios (más de uno) , más de preferencia todos, los antigenos llamados K99, F41, Y y 31A y/o epitopes de los mismos. Los antigenos preferidos son K99 y F41. üna composición asi ventajosamente comprende uno de K99 y F41, de preferencia ambos. También se prefiere una composición que comprende también Y y/o 31?, ventajosamente Y y 31A. Por ejemplo, estos antigenos pueden ser incorporados como subunidades o pueden ser portados por las bacterias de E. coli. De preferencia las composiciones de acuerdo con la invención comprenden por lo menos un antigeno seleccionado del grupo que consiste de E. coli que lleva antigeno K99, E. coli que lleva antigeno F41, E. coli que lleva antigeno Y, E. coli que lleva antigeno 31A, antigeno K99, antígeno F41, antigeno Y, antigeno 31A y cualquiera de las mezclas de los mismos. Como se mencionó en la presente, E. coli se puede utilizar para producir antigenos de Cryptosporidium parvum o epitopes. Los antigenos de Cryptosporidium parvum o epitopes pueden ser expresados en una cepa de E. coli que expresa por lo menos uno de los antigenos de E. coli de modo que la expresión simultánea de E. coli y antigenos de Cryptosporidium parvum es realizada. Para la expresión in vitro, las células luego pueden ser interrumpidas como es usual y los antigenos de E: coli y Cryptosporidium parvum o epitopes recuperados; ventajosamente, si hay una expresión interna o no de superficie de los antigenos o epitopes, los antigenos o epitopes se expresan como proteínas de fusión o con etiquetas, por ejemplo etiquetas HI3. Para la expresión in vivo, venta osamente las moléculas de ácido nucleico que codifica los antígenos o epitopes están enlazados a una secuencia de señal de modo que hay expresión extracelular de los antígenos o epitopes; y, ventajosamente, el E. coli no es patogénico. Así, E. coli puede ser, en ciertas modalidades, el vector y el antígeno o epítope de interés . Los antígenos de Cryptosporidium perf ingens son de preferencia toxoides de tipo C. y/o D, más de preferencia toxoides de tipo C y D. ün aspecto particular de la invención es una composición inmunológica, inmunogénica o de vacuna entérica, combinada para especies de bovinos, que comprende por lo menos un antígeno o epítope de por lo menos un Cryptosporidium spp, de preferencia que incluye Cryptosporidium parvum, ventajosamente P21 y/o Cp23 y/o Cpl5/60 y/o CP41 tal como P21 o Cp23 y Cpl5/60 y/o un epítope de interés del mismo, y por lo menos un antígeno o epítope de por lo menos un patógeno entérico bovino, adicional tal como E. coli, rotavirus bovino, coronavirus bovino y Clostridium perfringens, o combinaciones de" los mismos, y de preferencia que incluyen por lo menos un antígeno o epítope de- cada uno de estos patógenos o por lo menos un antígeno o epítope de E. coli, rotavirus y coronavirus. Con respecto a un epitope de interés de un antigeno deseado y como determinar qué porción de un _ antigeno es un epitope de interés, la referencia se hace a la patente norteamericana No. 5,990,091 y la solicitud norteamericana Nos. de serie 08/675,566 y 08/675,556, asi como otros documentos citados en la presente. A partir de la descripción en la presente y el conocimiento en la técnica, tal como los documentos citados en la presente, no hay experimentación indebida necesaria para averiguar un epitope de interés, o para formular una composición dentro de la invención que comprende antigeno (s) y/o epitope (s) y/o vector (s) que expresan antigeno (s) y/o epitope (s) . De acuerdo con una modalidad preferida, la invención proporciona una composición inmunológica, inmunogénica o de vacuna entérica bovina que comprende antigeno de E. coli como es descrito en la presente tales como los antigenos K99, F41, Y y 31A, asi como coronavirus bovino inactivado, rotavirus bovino inactivado. Esta composición además puede incluir toxoides de tipo C y D de Clostridium perfringens. De preferencia, la valencia de E. coli comprende ya sea E. coli inactivado que lleva antigeno K99, E. coli inactivado que lleva antigeno F41, E. coli inactivado que lleva antigeno Y y E. coli inactivado que lleva antigeno 31A, o, un antigeno K 9, antigeno F41, antigeno Y y antigeno 31A. Otro aspecto de la presente invención es una composición inmunológica, inmunogénica o de vacuna contra Cryptosporidium parvumt que comprende los antigenos Cp23 o P21 y Cpl5/60 o epitopes de los mismos, y un vehículo farmacéuticamente aceptable . De' acuerdo con una modalidad ventajosa, estos antígenos se incorporan en la composición como proteínas o antígenos sub-unitarios . Ellos se pueden producir mediante la síntesis química o mediante la expresión in vitro. Para la conveniencia de producción mediante la expresión en un hospedero adecuado y su recuperación, estos antígenos de preferencia están bajo la forma de proteína de fusión (por ejemplo, con etiqueta HIS) . En otras palabras , el antígeno puede comprender el antígeno per se y los aminoácidos foráneos . De acuerdo con otra modalidad, estos antígenos no se incorporan como subunidades en la composición, sino la composición comprende ya sea en un vector recombinante ¦ que expresa Cp23 o P21 y Cpl5/50 o un epítope del mismo o un vector recombinante que expresa Cp23 o P21 o un epítope del mismo y un vector recombinante que expresa Cpl5/60 o un epítope del mismo, en donde estos vectores expresan el (los) antígeno (s) o epítope (s) in vivo cuando se administran al animal. La composición puede contener un antígeno o epítope y un vector que expresa el otro antígeno o epitope. Un aspecto todavía adicional de la presente invención es los métodos de vacunación en donde se administra a un animal objetivo una composición inmunologica o de vacuna entérica, combinada o una composición inmunologica o de vacuna contra Cryptosporidíum parvum de acuerdo con la invención. La invención puede incumbir un método de inmunización de una cría recién nacida contra la enfermedad entérica, que comprende administrar una composición inmunologica . o de vacuna que comprende los antigenos Cp23 o P21 y Cpl5/60 de Cryptosporidium parvum o epítopes de los mismos y un vehículo farmacéuticamente aceptable, a la vaca preñada o vaquilla preñada antes del suministro de modo que la cría recién nacida tiene anticuerpos maternales contra Cryptosporidium parvum. De preferencia, el método comprende la alimentación de la cría recién nacida con calostros y/o leche que proviene de una vaca, por ejemplo, la madre, que ha sido de esta manera vacunada. Para la vacunación o inmunización contra la enfermedad entérica, se puede utilizar solamente una composición de vacuna, inmunogénica o inmunologica combinada, que contiene las diversas valencias, pero también composiciones de vacuna, inmunogénícas o inmunológicas separadas que pueden ser administradas por separado, por ejemplo,, secuencialmente, o que pueden ser mezcladas antes del uso.

Los antigenos y epitopes de interés útiles en las composiciones inventivas y los métodos se pueden producir usando cualquier método adecuado para un experto en la técnica y por ejemplo usando los métodos en US-A-5, 591, 434 y WO-A-9807320. Además, se pueden obtener antigenos de otros patógenos entéricos a partir de fuentes comercialmente disponibles, tal como TRIVACT0N®6; por ejemplo, Cp23 y/o P21 y/o Cpl5/60 o un epitope del mismo, por ejemplo, P21 o Cp23 y Cpl5/60 o un epitope del mismo, o un vector que expresa estos antigeno (s) o epitope (s) se pueden adicionar a TRIVACTON®6, en cantidades especificadas en la presente. Los toxoides C y D de Clostridium perfringens venta osamente se pueden adicionar a TRIVACTON®6. También, el E. colí inactivado que lleva pili puede ser reemplazado en TRIVACTON®6 por el pili aislado. Tal composición de vacuna, inmunogénica o inmunológica (con E. coli inactivado o pili aislado) al cual el (los) antigeno (s) de C. Parvu o epitope (s) y/o antigeno (s) de Clostridium perfringens o epitope (s) se adiciona (n)' y métodos para ser y utilizar tal composición y equipos para los mismos también están dentro de la invención. Además, en cuanto a la valencia de E. coli y/o antigeno (s) y/o epitope (s) útiles en la práctica de la invención, la referencia se hace a EP-A-80,412, EP-A-60,129/ GB-A-2, 094, 314, y patentes norteamericanas Nos.' 4,298,597, 5,804,198, 4,788,056, 3,975,517, 4,237,115, 3,907,987, 4,338,298, 4,443,547, 4,343,792, 4,788, 056,· y 4,311,797. En cuanto a antígeno(s) de rotavirus y/o epitope(s), la referencia se hace a P.S. Paul and Y.S. Lyoo, Vet Microb 37:299-317 (1993) y las patentes norteamericanas Nos. 3,914,408 y 5,620,896. Con respecto a antigeno (s) de coronavirus /o epitope(s), la referencia se hace a WO-A-98 40097, WO-A-96 41874, y las patentes norteamericanas Nos. 3,914,408 y 3,919,413. Para Clostridium, por ejemplo, Cl. perfringens, el (los) antigeno(s) y/o epitope(s), la referencia se hace a WO-A-94 22476, EP-A-734, 731, WO-A-98 27964, GB-A-2, 050, 830, GB-A-1, 128 , 325, D. Calméis y Ph. Desmettre, IV Symposium of the Commission for the study of animal diseases caused by anaerobes, Paris, Nov. 16-18, 1982, patentes norteamericanas * Nos . 5,178,860, 4, 981,684, y 4,292,307; y, a ????????® (MERIAL, Lyon, Francia) (que contiene los toxoides de perfringens tipos B, C, D, Cl de Cl. septicum, Cl. novyl, Cl. tetan! y cultivo de Cl. chauvoei) . Y, además de TRIVACT0NCD6, se pueden utilizar otras vacunas combinadas comerciales a las cuales se puede adicionar la valencia de C. parvum, de acuerdo con esta invención; por ejemplo, SCOURGUARD 3 (K) /C® (Smith line Beecham) que contiene rotavirus y coronavirus bovino inactivado, bacterina de E. col! K99 y toxoide tipo C y Cl . perfringens. Un método preferido ' para obtener antigenos o epitopes de interés es clonar la secuencia de DNA que codifica el antigeno o epitope de interés en un plásmido de fusión o no de fusión y tener su expresión en E. coli. Los plásmidos de fusión (por ejemplo, aquellos que expresan el (los) antigeno (s) o epitope (s) con una etiqueta tal como una etiqueta His) son preferidos ya que ellos permiten recuperar fácilmente el antigeno producido . Los plásmidos adecuados son descritos en los ejemplos. La producción de antigenos mediante síntesis química también está dentro del alcance de la invención. La invención además comprende métodos para utilizar los antígenos o epitopes discutidos en la presente o vectores que expresan tales antígenos o epitopes para la preparación de una composición de vacuna, inmunológica o inmunogénica, por ejemplo, contra C. parvum o contra la enfermedad entérica; por ejemplo, al mezclar los antígenos, los epitopes o vectores con un portador o diluyente adecuado o aceptable y opcionalmente también con un adyuvante. Las composiciones pueden ser liofilizadas para la reconstitución. La invención además comprende un equipo para la preparación de una composición inventiva. El equipo puede comprender el (los) antígeno(s) o epitope (s) y/o vector (s), portador - ylo diluyente y opcionalmente adyuvante; los ingredientes pueden estar en contenedores separados. Los contenedores que contienen los ingredientes pueden estar dentro de más de un paquete; y el equipo puede incluir instrucciones para la mezcla de los ingredientes y/o composición de vacuna, inmunogénica o inmunológica. Otro aspecto de la invención es la producción de calostro y/o leche hiperinmune; por ejemplo, mediante la hiperiinmunización . del mamífero hembra preñada (tal como una vaca) por al menos 1, ventajosamente por al menos 2, y más ventajosamente por lo menos 3, administraciones de la(s) composición (es) inventiva (s) (por ejemplo, la composición de C. parvum o la composición entérica combinada de acuerdo con la invención) . Opcionalmente, pero ventajosamente, el calostro y/o leche asi producido luego puede ser tratado para concentrar las inmunoglobulinas y para eliminar los componentes del calostro o leche que no contribuye a la respuesta inmunológica, inmunogénica y/o de vacuna deseada o al valor nutricional del calostro o la leche. Ese tratamiento puede comprender ventajosamente la coagulación del calostro o la leche, por ejemplo con cuajo, y la fase liquida que contiene las inmunoglobulinas recuperadas . La invención también comprende el calostro o leche hiperinmune o mezcla de las mismas y/o composiciones que comprenden el calostro o leche hiperinmune o mezclas de los mismos. Además, la invención contempla el uso del calostro o leche hiperinmune o mezclas de los mismos o composición que comprende la misma para prevenir o tratar la infección por C. parvum y/o entérica en un animal joven, tal como un recién nacido; por ejemplo, una cria. Los siguientes ejemplos se exponen para proporcionar a aquellos de habilidad ordinaria en la técnica con una divulgación y descripción completa de cómo hacer y utilizar las células de la invención, y no se proponen para limitar el alcance de lo que los inventores consideran como su invención. EJEMPLOS Listas de secuencias : SEQ ID NO:l oligonucleótido JCA295 SEQ ID NO: 2 oligonucleótido JCA296 SEQ ID NO: 3 oligonucleótido JCA297 SEQ ID NO: 4 oligonucleótido JCA298 SEO ID NO: 5 oligonucleótido JCA299 SEQ ID NO: 6 oligonucleótido JCA300 SEQ ID NO: 7 oligonucleótido JCA301 SEQ ID NO: 8 oligonucleótido JCA302 SEQ ID NO: 9 oligonucleótido JCA303 SEQ ID NO: 10 oligonucleótido JCA304 Todas las construcciones de plásmido se han hecho utilizando técnicas de biología molecular estándar (clonación digestión de restricción, reacción en cadena de polimerasa (PCR) ) como es descrito en -Sambrook J. y colaboradores (Molecular Cloning: A Labortory Manual, 2a Edición. Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor. New York. 1989) . Todos los fragmentos de restricción de DNA generados y utilizados por la presente invención, así como los fragmentos de PCR, se han aislado y purificado utilizando el equipo "Geneclean®" (BIO101 Inc. La Jolla, CA) . Ejemplo 1: Clonación de los genes P21 y Cpl5/60 de C. parvum Oocistos de Cryptosporidium parvum se aislan de una cría infectada y se purifica de las muestras fecales bovinas como es descrito por Sagodira S. y colaboradores (Vacciner 1999, 17. 2346-2355). Los oocistos purificados luego se almacenan en agua destilada +4°C. Para el uso como una plantilla para reacciones de PCR, el RNA genómico se libera de los oocistos purificados como es descrito por Iochmann S. y colaboradores (microbial Patogénesis 1999. 26.307-315). Üna' fuente alternativa para DNA de C, parvum es constituida por las librerías genómicas EcoRI para los aislados Iowa (A) , Uowa (I) , KSU-1 y KSU-2 de Cryptosporidium parvum de la colección de Cultivos de Tejido Americana (ATCC número 87667, 87668, 87439 y" 87664 respectivamente) . Los genes P21 y Cpl5/60 específicos se aislan como sigue: La secuencia que codifica la proteína P21 se amplifica mediante una reacción en cadena de polimerasa (PCR) utilizando DNA de C. parvum y los siguientes cebadores: oligonucleótido JCA295 (35 mer) SEO ID NO:l 5'TTT TTT CCA TGG GGC TCG AGT TTT CGC TTG TGT TG 3' y oligonucleótido JCA296 (33 mer) SEQ ID NO: 2 5'TTT ??? GAA TTC ??? GGC ATC AGC TGG CTT GTC 3' . Esta PCR genera un fragmento de aproximadamente 585 bp del fragmento de PCR. Este fragmento de PCR luego se digiere con las enzimas de restricción Ncol y EcoRI para aislar, después de la electroforesis en gel de agarosa y la recuperación con el equipo de GeneClean (BIO101 Inc.)/ u fragmento de restricción de 575 bp NcoI-EcoRI (= fragmento ?) . La secuencia de este fragmento codifica una proteina homologa a la secuencia descrita como SEQ ID NO: 12 en la solicitud de patente WO 98/07320 (PCT/US97/1483 ) . . Una segunda PCR es corrida para amplificar la secuencia que codifica la proteína Cpl5/60 y para adicionar sitios de restricción convenientes en 5' y 3' para la clonación adicional. La PCR se hace usando el DNA de C. ¦ parvum y los siguientes cebadores: oligonucleótido JCA297 (35 mer) SEQ ID NO: 3 5'TTT TTT CTC GAG ATG GGT AAC TTG AAA TCC TGT TG 3' y oligonucleótido JCA298 (42 mer) SEQ ID NO: 4 5' TTT TTT GAA TTC TTA GTT AAA GTT TGG TTT GAA TTT GTT TGC 3' . Esta PCR genera un fragmento de aproximadamente 465 bp. Este fragmento se purifica luego se digiere con Xhol y EcoRI con el fin de obtener, después de la electroforesis en gel de agarosa y la' recuperación con el equipo GeneClean (BIO101 Inc.), el fragmento de 453 bp Xhol-EcoRI (= fragmento B) . La secuencia amplificada es homologa para ser similar a la secuencia definida del nucleótido #31 a #528 de la SEQ ID N0:1 en la patenté norteamericana # 5,591,434 y las secuencias depositadas en GenBank bajo los Números de Acceso U22892 y AAC47447. Example 2: Construcción del plásmido pJCA155 (proteína de fusión GST-P21 en el vector pBAD/HisA) Las secuencias requeridas para expresar la proteína de fusión GST-P21 se amplifican mediante PCR con el fin de generar 2 fragmentos que pueden ser clonados fácilmente con el vector de plásmido de expresión pBAD/HisA (Cat # V430-01 InVitrogen Corp., Carlsbad, CA 92008, USA) . La primera PCR se hace usando el plásmido pGEX-2T (Cat # 27-4587-01 Amersham-Pharmacia Biotech) y los siguientes cebadores: oligonucleótido" JCA299 (35 mer) ' SEQ ID NO: 5 5'TTT TTT CCA TGG GGT CCC CTA TAC TAG GTT ATT GG 3' y oligonucleótido JCA300 (45 mer) SEQ ID NO: 6 5l TTT TTT CTC GAG CCT GCA GCC CGG GGA TCC AAC AGA TGC ACG ACG 3' . Esta PCR genera un fragmento de aproximadamente 720 bp que codifica la porción GST con la adición de un sitio' de restricción Xhol . en el extremo 5' para propósitos de clonación en pBAD/HisA; esta modificación adiciona un codón de Glicina a la proteína de fusión GST-P21) . Este fragmento de PCR luego se digiere con Ncol y Xhol con el fin de " obtener, después de la electroforesis en gel de agarosa y la recuperación con el equipo GeneClean (BIO101 Inc.)/ el fragmento de 710 bp Ncol-Xhol (= fragmento C) . La segunda PCR se nape usando DNA de .C. parvum y los siguientes cebadores: oligonucleótido JCA301 (33 mer) SEQ ID NO: 7 5'??? TTT CTC GAG TTT TCG CTT GTG TTG TAC AGC 3' y oligonucleótido JCA295 (33 mer) SEQ ID NO: 2. Esta PCR genera un fragmento de aproximadamente 580 Bp que codifica la porción P21 con la adición de los sitios de restricción Xhol y EcoRI en los extremos 5' · y 3' respectivamente . Este fragmento de PCR luego se digiere con Xhol y EcoRI con el fin de obtener, después de la electroforesis en gel de agarosa y la recuperación con el equipo GeneClean (BIO101 Inc.) , el fragmento de 572 bp Xhol-EcoRI (= fragmento D) . El plásmido pBAD/HisA (Cat # V430-01, InVitrogen Corp.) se digiere con Ncol y EcoRI. los fragmentos digeridos se separan mediante la electroforesis en gel de agarosa con el fin de recuperar (GeneClean kit, BIO101 Inc.) el fragmento de restricción # 3960 bp NcoI-EcoRI (= fragmento E) . Los fragmentos C, D y E luego se ligan conjuntamente para generar el plásmido JCA155. Este plásmido tiene un tamaño total de 5243 bp (Figura 1) y codifica una proteina de fusión GST-P21 de 425 aminoácidos.

Ejemplo 3: Construcción del plásmido pJCA156 (proteína de fusión His6-P21 en el vector pBAD/HisA) El vector pBAD/HisA (Cat # V430-01, InVitrogen) se digiere con Ncol y EcoRI y el fragmento de restricción # 3960 bp NcoI-EcoRI (= fragmento E) se recupera y se aisla como es descrito en el Ejemplo 2. üna PCR se hace para amplificar la secuencia que codifica la fusión His6-P21 y para adicionar los sitios de restricción Ncol y EcoRI respectivamente en 5' y 3' con el fin de ' subclonar este fragmento de PCR en el vector de plásmido pBAD/HisA. La PCR se hace usando DNA de C. parvum y los siguientes cebadores: oligonucleótido JCA302 (65 mer) SEO ID NO: 8 5 'TTT TTT CCA TGG GGG GTT CTC ATC ATC ATC ATC ATC ATG GTC TCG AGT ' TT CGC TTG TGT ,TGT AC 3' y oligonucleótide JCA296 (33 mer) SEQ ID NO: 2. Esta PCR genera un fragmento de aproximadamente 610 bp. Este fragmento se purifica, y luego se digiere con Ncol y EcoRI con el fin de aislar, después de la electroforesis en gel de agarosa y la recuperación con el equipo GeneClean (BIO101 Inc.), El' fragmento de 600 bp NcoI-EcoRI (= fragmento F) . Los fragmentos E y F se ligan conjuntamente para generar el plásmido pJCA156. Este plásmido tiene un tamaño total de 4562 bp (Figure 2) y codifica una proteina de fusión His-6/P21 de 199 aminoácidos. Example 4: Construcción del plásmido pJCA157 (proteina P21 sola en el vector pBAD/HisA El vector pBAD/HisA (Cat # V430-01, InVitrogen Corp. ) se digiere con Ncol y EcoRI y el fragmento de restricción # 3960 bp NcoI-EcoRI (= fragmento E) se recupera y se aisla como es descrito en el Ejemplo 3. Una PCR se hace para amplificar la secuencia que codifica la proteina P21 para adicionar los sitios de restricción Ncol y EcoRI respectivamente en 5' y 3' con el fin de subclonar este fragmento de PCR en el vector de plásmido pBAD/HisA. La PCR se hace utilizando DNA de C. parvum y los siguientes cebadores: oligonucleótido JCA295 (35 mer) SEQ ID NO: 1 y oligonucleótido JCA295 (33 mer) SEQ ID NO: 2 para obtener, como es descrito en el Ejemplo 1, un fragmento de 575 bp NcoI-EcoRI (fragmento ?) . Los fragmentos E y A se ligan conjuntamente con el fin de generar un plásmido pJCA157. Este plásmido tiene un tamaño total de 4535 bp (Figura 3) y codifica 189 aminoácidos incluyendo la proteina P21. Example 5: Construcción del plásmido pJCA!58 (proteina de fusión GST-Cpl5/60 y el vector pBAD/HisA) Una PCR se hace para amplificar la ' secuencia que codifica la proteina GST para adicionar los sitios de restricción convenientes en 5' ,y 3' con el fin de subclonar el fragmento de PCR en el vector de plásmido pBAD/HisA final. La PCR usa el DNA del plásmido pGEX-2TK (Cat # 27-4587-01, Amersham-Pharmacia Biotech) como una plantilla y los siguientes cebadores: oligonucleótido JCA299 (35 mer) SEQ ID NO: 5 y oligonucleótido JCA300 (45 mer) SEQ ID NO: 6 para obtener, como es descrito en el ejemplo 2, un fragmento de 710 bp Ncol-Xhol (= fragmento C) . El vector pBAD/HisA (Cat # V430-01, InVitrogen) se digiere con Ncol y EcoRI y el fragmento de restricción # 3960 bp NcoI-EcoRI (= fragmento E) se recupera y se aisla como es descrito en el Ejemplo 2. Los fragmentos C, E y B (Ejemplo 1) se ligan con untamente con el fin de generar el plásmido pJCA158. Este plásmido tiene un tamaño total de 5132 bp (Figura 4) y expresa una proteina de fusión GST-Cpl5/60 de 388 aminoácidos . Ejemplo 6: Construcción del plásmido pJCA159 (proteina de fusión His6-Cpl5/60 en el vector pBAD/HisA) El vector pBAD/HisA (Cat # V430-01, InVitrogen Corp.) se digiere con Ncol y EcoRI y el fragmento de restricción # 3960 bp NcoI-EcoRI (= fragmento E) se recupera y se aisla como es descrito en el Ejemplo. 2. Una PCR se corre para amplificar la secuencia que codifica la fusión His6-Cpl5/60 y para adicionar los sitios de restricción convenientes en 5' y 3" con el fin de subclonar este fragmento de PCR en el vector de plásmido pBAD/HisA. La PCR se hace usando ya sea DNA de C. parvum y los siguientes cebadores: oligonucleótidó JCA303 (64 mer) SEQ ID NO: 9 5 '??? TTT CCA TGG GGG GTT CTC ATC ATC ATC ATC ATC ATG GTA TGG GTA ACT TGA AAT CCT GTT G 3' . y oligonucleótidó JCA298 (42 mer) SEQ ID NO: . Esta PCR genera un fragmento de aproximadamente 495 bp. Este fragmento se purifica y luego se digiere con Ncol y EcoRI con el fin de obtener, después de la électroforesis en gel de agarosa y la recuperación con el equipo GeneClean (BIO101 Inc.), el fragmento de 483 bp NcoI-EcoRI (= fragmento G) . Los fragmentos E y G se miden conjuntamente con el fin de generar el plásmido pJCA159. Este plásmido tiene un tamaño total de 4445 bp (Figure 5) y expresa una proteína de fusión His-6/Cpl5/60 de 159 aminoácidos. Ejemplo 7: Construcción del plásmido pJCA160 (proteina Cpl5/60 sola en el vector pBAD/HisA El vector pBAD/HisA (Cat # V430-01, InVitrogen Corp.) se digiere con Ncol y EcoRI y el fragmento de restricción # 3960 bp NcoI-EcoRI (= fragmento E) se recupera y se aisla como es descrito en el Ejemplo 2. Una PCR se corre para amplificar la secuencia que codifica' la proteína Cpl5/60 y para adicionar sitios de restricción convenientes en 5' y 3' con el fin de subclonar este fragmento de PCR en el vector de plásmido pBAD/HisA. La PCR se hace usando DNA de C. parvum y los siguientes cebadores: oligonucleótido CA304 (31 mer) SEQ ID NO: 10 5'TT TTT CCA TGG GTA ACT TGA AAT CCT GTT G 3' y oligonucleótido CA298 (42 mer) SEQ ID NO: . Esta PCR genera un fragmento de aproximadamente 460 bp. Este fragmento se purifica y luego se digiere con Ncol y EcoRI con el fin de obtener, después de la electroforesis en gel de agarosa y la recuperación con el equipo de GeneClean (BIO101 Inc.), el fragmento de 450 bp NGOI-ECORI (= fragmento H) . Los fragmentos E y H se ligan conjuntamente con el fin de generar plásmido pJCA160. Este plásmido tiene un tamaño total de 4412 bp (Figura 6) y expresa una 'proteína Cpl5/60 de 148 aminoácidos. Ejemplo 8: Cultura de clones recombinantes de JE?, coli y la inducción de proteínas recombinantes El DNA de plásmido (Ejemplos 2 a 7) se transforma en DH5 de Escherichia coli (o cualquier otra cepa K12 de E. coli adecuada bien conocida para aquellos expertos en la técnica, tal como APIO de C. coli (Cat # C4040-03 InVitrogen Corp. ) ) y se cultiva en placas de agar del medio Luria-Bertani (LB) con 50 g/ml de ampicilina. Una colonia es recolectada- para cada plásmido» que transforma la población E. coli y se coloca en 10 mi del medio LB con ampicilina (u otro antibiótico apropiado) para el crecimiento durante la noche, ün mi del cultivo durante la noche se adiciona a un litro de medio LB y se cultiva a +30 °C hasta que ODSOonm alcanza aproximadamente 3.0. La producción de proteina se induce con diferentes concentraciones finales de DL-arabinosa (Cat# A9524, Sigma, St Louis, MO) (intervalo de 0.002% a 0.2% para determinar la concentración para el rendimiento óptimo) se adicionan cultivos e incuba a +30°C durante 4-6 horas. Ejemplo 9: Extracción y purificación de las proteínas de fusión recombinantes Al final de la inducción (Ejemplo 8) , las células se recolectan mediante centrifugación (3000 g, 10 minutos, + 4°C) y se resuspenden en solución reguladora de lisis (Tris 50 mM pH 8.0, EDTA 1 'mM, PMSF 1 µ?, 1 mg/ml de lisosima) y se sónica 25 veces durante 30 segundos con 1 minuto de pausa entre las interacciones. Tritón X-100 se adiciona a una concentración final de 0.1%. Los residuos celulares se remueven por centrifugación. Si es necesario-, técnicas alternativas (conocidos para aquellos de habilidad en la . técnica (pueden ser utilizados para la lisis de células bacterianas. 9.1. Proteínas recombinantes de GST-fusión: Las proteínas recombinantes de GST-fusión (producidas por E. colí transformado con los plásmidos pJCA155 or pJCA158) se purificaron por afinidad de los lisados bacterianos, se prepararon como es descrito en el Ejemplo 8, usando una glutationa-agarosa (Cat # G4510, Sigma) o glutationa-Sefarosa 4B (Cat # 17-0756-01, Amersham-Pharmacia Biotech) . Los lisados bacterianos y la glutationa-agarosa se incubaron durante 4 horas a +4°C. Las proteínas de GST-fusión luego se eluyeron de la agarosa en un formato de lotes con 10 mM de forma reducida de glutationa (Cat # G4705, Sigma) bajo condiciones moderadas (K. Johnson y D. Smith Gene. 1988.67. 31-40) . (Referencia: Anonymous. GST gene . fusión system: technical manual. 3rd edition. Arlington Heights, IL: Amersham-Pharmacia Biotech, 1997). Cualquier experto en la técnica puede lograr la escalación de este proceso para purificar grandes cantidades de proteína de GST-fusión, a partir de esa descripción y el conocimiento en la técnica, sin experimentación indebida. 9.2. Proteina recombinante His6-fusión: Las proteínas recombinantes His6-fusión todas se han preparado y purificado usando la resina Ouelante de Níquel ProBond™ (Cat# R801-15, InVitrogen Corp.) siguiendo las instrucciones del fabricante. La preparación del lisado de célula de E. coli nativo (proteína recombinante soluble) : las células bacterianas de 1 litro de culifivo de E. col! (transformado con el plásmido pJCA156 o pJCAl59) se recolectan mediante centrifugación (3000 g durante 5 minutos) . La pelotilla se resuspende en 200 mi de Solución Reguladora de Enlace Nativa (fosfato 20 mM, NaCl 500 mM, pH 7.8) La pelotilla resuspendida luego se incuba con lisosima de huevo -a una concentración final de 100 g/ml durante 15 minutos sobre hielo. Esta mezcla luego se sónica con 2-3 interacciones de 10 segundos en la intensidad del medio mientras que se obtiene la suspensión en hielo. La mezcla luego se somete a una serie de ciclos de congelación/descongelación para completar la lisis y los residuos celulares insolubles finalmente se remueven mediante centrifugación en 3000 g durante 15 minutos. El lisado se clarifica mediante el paso a través de un filtro de 0.8 pm y se almacena en hielo o en -20°C hasta la purificación. La proteina recombinante soluble His6-fusión presente en el lisado claro se "enlaza por lote a una columna de resina ProBond™ pre-equilibrada en 50 mi (Cat # .R640-50 y R801-15, InVitrogen Corp.) con dos alícuotas de lisado de 100 mi. La columna se oscila sola durante 10 minutos para conservar la resina resuspendida y permitir que la proteina marcada con polihistidina se enlace completamente. La resina se asienta por gravedad o centrifugación a baja velocidad (800 g) y el sobrenadante se aspira cuidadosamente. Un ciclo idéntico se repite con la segunda alicuota. Lavado en columna y elución: 4 etapas sucesivas se hacen de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Anonymous . Xress™ System Protein Purification-? Manual of Methods for Purification of Polyhistidine-Containing Recombinant Proteins. InVitrogen Corp. Editor. Versión D. 1998) : 1. La columna se lava con 100 mi de. Solución Reguladora de Enlace Nativa pH 7.8, al resuspender la' resina, oscilando durante 2 minutos y luego separando la resina del sobrenadante por gravedad o centrifugación. Este procedimiento se repite 2 veces más (total de 3 lavadas) . 2. La columna se lava con 100 mi de Solución Recriadora de Lavado nativa pH 6.0 al resuspender la resina, oscilando durante 2 minutos y luego separando la resina del sobrenadante por gravedad o centrifugación. Este procedimiento se repite por lo menos 3 veces más hasta que la OD280 es menor que 0.01. 3. La columna se lava con 100 mi de Solución Reguladora de Lavado Nativa pH 5.5 al resuspender la resina, oscilando durante 2 minutos y luego separando la resina del sobrenadante por gravedad o centrifugación. Este proceso se repite una vez (total de 2 lavados) . 4. La columna luego se sujeta en posición vertical y la tapa se destapa sobre el extremo inferior. La proteina recombinante se eluye con 150 mi de' la Solución Reguladora de pH nativo. Se recolectan fracciones de 10 mi. La elusión se monitorea al tomar lecturas de OD280 de las fracciones. Si es necesario, la proteina recombinante eluida puede ser concentrada ya sea mediante diálisis, o mediante precipitación con sulfato de amonio. La concentración final del lote de proteina recombinante se mide mediante lecturas de OD280- Cualquier experto en la técnica puede lograr la escalacion de este proceso para purificar grandes cantidades de proteínas de His6-fusión, a partir de esta descripción y el conocimiento en la técnica, sin experimentación indebida. Ejemplo 10: Extración y purificación de las proteínas no de fusión recombinantes P21 y Cpl5»de C. parvum Las células bacterianas de E-. coli (transformada con los plásmidos pJCA157 o pJCA160) se cultivan en 4 litros del medio mínimo M9 (complementado con los aminoácidos apropiados) (Sambrook J. y colaboradores {Molecular Cloning: A Laboraary Manual. 2a Edición. Cold Spring Harbor Laboraary. Cold Spring Harbor. New York. 1989) a 30 °C hasta que la OD600nm alcanza aproximadamente 3.0 y se inducen como es descrito en el Ejemplo 8. Las células bacterianas luego se interrumpen al pasar a través de un homogenizador RA NIE de alta presión Mini-Lab tipo 8.30 H con un flujo máximo de 10 litros por hora y la presión de trabajo ' entre 0 y 1000 bars. El lisado se clarifica mediante la filtración a través de un filtro CUNO Zeta plus, tipo LP y luego se concentra 50 veces sobre un ultrafiltro PALL Filtron (referencia OS010G01) UF 10 kDa. El concentrado de suspensión de proteina se carga en una columna de cromatografía de exclusión de tamaño con gel Sephacryl S-100 de Alta Resolución bajo un volumen correspondiente a 2-3% del volumen de la columna. La elusión se hace con una solución reguladora de PBS. Las" fracciones recolectadas correspondientes al. peso molecular esperado para las proteínas de vacunas subunitarias se concentra 10 veces en un cartucho de fibras huecas A/G cartucho Technology tipo Midgee modelo UFP-10-C-MB01 o modelo UFP-10-E-MB01) . Las muestras concentradas se almacenan a 70 °C hasta su utilización. Las proteínas recombinantes C. parvum específicas luego se pueden mezclar en las proporciones apropiadas a la vacuna asociada final (ver el Ejemplo 11) . Ejemplo 11: Formulación de vacunas; vacunación de vacas preñadas; inmunización pasiva y experimentos de estimulación en crías recién nacidas Los productos (con adyuvante o sin adyuvante) se administra intramusculármente (IM) , subcutáneamente (SO) o intradérmicamente (ID) para inducir la respuesta de anticuerpo de suero contra C. parvum. Cuando se administra dos veces a los animales preñados este induce una respuesta de anticuerpo de suero que será transferida pasivamente al" recién nacido por la vía del calostro y la leche. El protocolo de vacunación para los animales preñados puede comprender 2 dosis dadas cuando la preñes es diagnosticada y el parimiento, tal como aproximadamente 1 mes antes del parimiento y aproximadamente 3 a 5 dias antes del parimiento; o, 2 meses antes del parimiento (que coincide con la etapa estéril en vacas lecheras) y refuerzo antes del parimiento (por ejemplo, cualquiera de 3 semanas a 1 semana antes del parimiento) , dependiendo de las prácticas del manejo (sin embargo, estos programas favorecen la eficacia máxima) . Las prácticas de manej5 actual favorecen lo que son productos administrados en el último trimestre . El volumen del producto puede ser de 1 mi a 5 mi, tal como 2 mi. Las vacunas de combinación pueden tener una porción liofilizada y una porción liquida que puede ser mezclada antes de la inyección. Para proporcionar la protección máxima bajo condiciones en campo el antigeno de Cryptosporidium se puede adicionar como un componente de una vacuna de combinación de E. coli/Rota/Corona . Los siguientes estudios son conducidos : Estudio A: C. parvam aumenta la patogenicidad del virus entérico y/o bacteria La estimulación por experimental utilizando 3 crias recién nacidas por grupo es como sigue: 1. Coronavirus solamente 2. Coronavirus más C. parvum 3. E. coli F41 solamente 4. E. coli F41 más C. parvum 5. C. parvum solamente 6. Controles sin estimulación Las crias se estimulan dentro de 24 horas de que son nacidas, por la ruta oral. La cantidad de material de estimulación utilizado es lo que es necesario para producir signos clínicos (depresión, diarrea, deshidratación) y puede depender del tipo de animal (gnotobiótico artificialmente criado o la convencional criada con sus madres) . Los signos químicos comunes (temperatura, semblante, hidratación, registros de diarrea, etc.) son recolectados. Se recolecta la información serológica y sombreada adicional. Efecto Las estimulaciones experimentales monovalentes con coronavirus o E. coli F41 no producen signos clínicos de enfermedad entérica en crías recién nacidas . La estimulación doble con coronavirus o E. coli F41 con C. parvum, a una dosis de C. parvum que normalmente no causa enfermedad clínica, producirá signos clínicos significantes de enfermedad entérica.

Estudio B: Una vacuna combo (E. colí 99/F41 , rota y coronavirus) que contiene C. parvum proporciona protección aumentada contra la enfermedad entérica causada por la infección concurrente de múltiples virus entéricos y/o bacterias en crias recién nacidas . Los grupos de tratamiento son 30 vacas preñadas vacunadas con: 1. Combo (rota y coronavirus, E. coli K99 y F41) , 8 animales : 2. Combo más Cripto, 8 animales; 3. Controles no vacunados, 14 animales. Estimulaciones experimentales como sigue: 1. Estimulación múltiple (coronavirus y F41 más C. parvum a niveles clínicos) ; 2. Animales vigilantes 3. Sin estimulación Las crías reciben calostros (inanualmente alimentado o permitiendo que la cría se amamante de la madre) y dosis que son estimulados, son estimulados dentro de 24 horas de ser nacidos, por la ruta oral. La cantidad de material de estimulación es una cantidad necesaria para producir signos clínicos (por ejemplo, como es determinado en el Estudio A, y como es mencionado bajo el Estudio A, puede variar dependiendo del tipo de animal utilizado (por ejemplo, artificialmente creado gnotobiótico o crías convencionales que se amamantan de sus madres) . Se recolectan' los signos clínicos comunes (temperatura, semblante, registros de diarreas) . La información serológica y de sombreado adicionales se recolecta. Diseño : 6 crias nacidas de vacas vacunadas (combo y combo más Cripto) o de control se estimulan con una estimulación que contiene 3 componentes (coronavirus y F41 más C. parvum) y 3 crias (de vacas de control no vacunadas) permanecen vigilantes. Efecto El uso de una vacuna combo que contiene C. parvum produce una mejor protección que una vacuna combo sola bajo una múltiple situación de estimulación (coronavirus y ?. ' coli F41 con C. parvum en una dosis subclinica) . Ejemplo 12: Efecto de la infección doble con C. parvum y rotavirus bovino en un modelo de estimulación experimental en crias recién nacidas Este estudio se diseña para comparar la severidad de los signos clínicos y la expresión fecal en crías después de la estimulación monovalente con C. parvum o rotavirus bovino y después de una estimulación doble con rotavirus bovino más C. parvum. Cuatro grupos de seis crías se utilizan con el fin de producir suficiente datos para ser capaces de detectar diferencias e incidencia de los signos clinicos entre los grupos . Las vacas se alojan individualmente en corrales o apacentaderos. Las crias recién nacidas se separan de sus madres tan pronto como sea posible después del nacimiento, se inspeccionan para eliminar las heces o la suciedad sobre la cria y su cordón umbilical se sumerge en solución de yodo de aproximadamente al 7%. Ellos luego se transfieren inmediatamente a lugares de contención y se alojan individualmente en banastas metabóllcas . Las crias se estimulan dentro de 6 horas después del nacimiento. Las crias se alimentan uno o dos cuartos por alimentación o en 10% del peso del cuerpo, dos veces al dia para el experimento completo usando un reemplazo de leche de cria comercial con 30% de sustituto de calostro. Se le da cuidado especial para evitar la administración de leche dentro de 2 horas antes o después de la estimulación. La ruta de infección natural es la oral; por lo tanto, todas las estimulaciones serán administradas oralmente utilizando un tubo esofágico. Grupo A: Pruebas de control no estimuladas. Grupo B: l-3xl05 oocistos de C. parvum (cepa Beltsville) , diluidos en 60 mi de leche de soya libre de antibióticos comercial.

Grupo C. Coinoculación - de l-3xl05 oocistos de C. parvum (raza Beltsville) diluida en 60 mi de leche de soya libre de antibióticos comercial, de 10 mi de inoculum de rotavirus bovino (cepa IND BRV G6P5) diluida en 40 mi de PBS. Grupo D: 10 mi de filtrado fecal de crias infectadas con rotavirus bovino (cepa IND BRV. G6P5) diluido en 40 mi de PBS. Las muestras fecales se recolectan de la charola de recolección una vez al dia después del mezclado completo para asegurar que se obtenga una muestra representativa. Oocistos se separan de las heces de las crias mediante centrifugación sobre almohadillas de sacarosa y se cuentan usando una cámara" de control de células (hemocitómetro) bajo un microscopio. Para el sombreo de rotavirus, las heces se diluyen en solución reguladora y el antigeno de rotavirus se cuantifica utilizando un equipo ELISA de Le Centre d'Economie Rurale (CER) 1 rué du Carmel, B6900 Marloie, Belgium. Las crias se observan para los signos clínicos antes de la estimulación y luego dos veces al dia durante 10 dias de post-estimulación. Las observaciones incluyen la temperatura rectal, la condición general, anorexia, diarrea, deshidratación y muerte.

La depresión, diarrea y deshidratación se clasifican como sigue: Condición general: La anorexia se determina . en base a si la cria se amamanta con menos de 2 litros de leche. - Durante las Ia 48 horas de vida, las crias pueden ser alimentadas por la vía de un tubo esofágico. El registro se deriva para cada cría en cada día basado en la presencia de signos clínicos (clasificado 1) o ausencia (clasificado 0) para la categoría de somnolencia. La temperatura rectal se registra en grados Fahrenheit. Dos crias murieron en el Grupo C los dias 7 y 8, dos en el Grupo B en el día 7, ninguna en el Grupo D y uno en el Grupo A en el día 3. Los resultados se muestran en las Figuras 7 a 13. Un efecto sinergistico sobre los signos clínicos y la excreción de microorganismos en las heces se observa cuando ambos microorganismos se administran comparado con las administraciones individuales. Ejemplo 13: Producción de Calostro Bovino que Contiene Anticuerpos para las Proteínas Subunitarias C7 (P21) y/o Cpl5/60 de C. parvum expresado en E. coli Vacas lecheras preñadas de 4 diferentes manadas se asignaron aleatoriamente a uno de 6 grupos vacunados : GST-P21; 6His-P21; GST-CP15/60; 6His . -CP15/60; GST-P21 + GST-CP15/60, y controles de placebo. Al entrar en fertilidad, cada vaca recibió tres dosis de 5 mi de la vacuna asignada subcutáneamente, con cada dosis dada cuarenta dias por separado. El calostro de cada vaca se recolectó 3 veces durante las primeras 24-36 horas después del parimiento y se marcó; una muestra de 10-20 mi se retiró y el resto se congeló en contenedores individuales en cada recolección. El calostro se analizó para los niveles de IgG totales mediante RIDA. ELISA analizó para los anticuerpos de la proteína subunitaria P21 y CP15/60. El análisis de serología mediante ELISA se condujo para los mismos anticuerpos de la proteína subunitaria, tanto inmediatamente antes de la vacunación y en el tiempo del parimiento. Las heces se recolectaron antes de la vacunación y se probaron con el equipo de prueba ProSpect para la presencia del C. parvum. Todas las muestras probadas fueron negativas para C. parvum. Anticuerpos de calostro para P21 Una respuesta de anticuerpo especifica de P21 se detectó en todos los grupos vacunados con el antigeno P21. En contraste, los grupos vacunados con CP15/60 y el grupo de placebo no tuvo respuesta de anticuerpo detectable para P21 (ver la Figura 14) . De manera interesante, el grupo "combo" (vacunado con 0.25 mg de GST-P21 en combinación con 0.25 mg de GST-CP15/60) tuvo una respuesta P21 muy similar como es comparada con el grupo GST-P21 monovalente (vacunado con 0.5 mg de GST-P21) . El grupo que recibe 0.5 mg de His-P21 tuvo una respuesta de P21 que fue ligeramente, pero consistentemente, menor que los grupos que reciben 0.5 mg de GST-P21, la diferencia más grande se encontró en la segunda producción de leche. El análisis adicional de los valores individuales muestra que el grupo His-P21 contuvo dos vacas no respondedoras (G418 y M26) y un valor sobresaliente para la vaca JG4 en la 2a producción de leche (Ia producción de leche = 0.055; 2a producción de leche = 0.296 y 3a producción de leche = 0.055) . Se debe observar que ambas de las vacas no responderoras también tuvieron un nivel de IgG total inusualmente bajo. Si los valores correspondientes a las no respondedoras y los sobresalientes se excluyeron del análisis, la media del grupo del grupo His-P21 llega a ser muy similar a los grupos GST-P21. Anticuerpos de calostro para Cpl5/60 Una respuesta de anticuerpo especifica de C15/60 se ha detectado en todos los ¦ grupos que contiene el antigeno CP15/60 (Figura 15) . En contraste, los grupos vacunados con P21 o el grupo de placebo no tuvo respuesta de anticuerpo detectable para CP15/60. El grppo His-CP15/60 del grupo que contiene 0.25 mg de GST-P21 en combinación con 0.25 mg de GST-GP15/60 (grupo combo) tuvo respuestas muy similares. Aunque el grupo GST-CP15/60 monovalente tuvo dos veces la cantidad de antigeno GST-CP15/60 como el grupo combo (0.5 mg contra 0.25 mg) , su respuesta fue consistentemente menor que el grupo combo. Se plantea que como hipótesis que este efecto inesperado es debido a las diferencias genéticas entre estos dos grupos, con las vacas GST-15/60 monovalentes que producen un calostro de menor calidad cómo es comparado con el grupo combo . Anticuerpos de Suero para P21 Todos los grupos fueron seronegativos en el Dia 0. Todos los grupos vacunados con P21 desarrollaron respuestas de anticuerpos específicos de P21 similares con excepción del grupo His-P21, que tuvo un nivel de anticuerpos significativamente inferior que los grupos GST-P21 en el día 14 (ver la Figura 16) . En contraste , los grupos vacunados con CP15/60 y el grupo de placebo no tuvieron respuesta de anticuerpo detectable para P21. Como se observa con el calostro, la vacuna de combina-ción que contiene 0.25 mg de GST-P21 se desempeñó precisamente también como la vacuna GST-P21 monovalente que contiene 0.5 mg de GST-P21. Aquellos grupos que reciben ya sea la vacuna GST-P21 alcanzaron una meseta después de la primera inyección, con los valores del dia 14 y el día 28 que son muy similares. El grupo His-P21, sin embargo, no alcanzó este valor máximo antes del Día 28. Como se muestra con los calostros, el análisis adicional de los valores individuales mostró que las vacas G418 y M24 fueron respondedoras bajas. Si los valores correspondientes se excluyeron del análisis, el medio de grupo del grupo His-P21 llega a ser muy similar de los grupos GST-P21. Finalmente, una disminución similar en el título se observó en todos los grupos P21 en el tiempo de. emparimiento . Esto es probablemente debido a las exportaciones activas de inmunoglobulinas en los calostros y la inmunosupresión de periparto . Anticuerpos de suero para CP15/60 Todos los grupos fueron seronegativos en el Día 0. Los controles de placebo permanecen negativos por todo el estudio. Los grupos vacunados con P21 fueron débilmente positivos en el Día 14 y Dia 28. Esto es probable que refleje un artefacto experimental (antecedente no especifico) . Los grupos vacunados con Cpl5/60 seroconvertidos después de una vacunación (Figura 17). La segunda .inyección reforzó la respuesta de anticuerpo. El grupo His-CP15/60 tuvo respuestas de anticuerpo similares. Finalmente, una disminución similar en el titulo se observó en todos los grupos CP15/60 en el tiempo de parimiento. Esto es probablemente debido a la exportación activa de inmunoglobulinas en los calostros y la inmunosupresión de periparto. Ejemplo 14: Estimulación experimental de C. parvum en Crias Recién Nacidas Ocho crias de ternero privadas de calostro obtenidas mediante parto inducido se dividieron uniformemente en dos grupos y cada grupo se colocó en un cuarto de aislamiento para el periodo de estudio de 6 dias. Cada cria ocupó una jaula de metabolismo." Cada grupo se alimentó con 2 botellas (~960 mi) de calostro en 3 y 12-15 horas después del parto. En 24 horas después del parto, todas las crias tuvieron niveles de IgG en la sangre>1000 mg/dL como es detectado por RIDA (Radial Immunodiffusión Assay) . Cada cria en el grupo de estimulación se estimuló oralmente con 108 oocistos de C. parvum. Las muestras de sangre se recolectaron diariamente y se probaron para los anticuerpos de suero para los antigenos P21 y CP15/60 de C. parvum, hematocrito y proteina total. Las heces (per rectum) se recolectaron 3 veces al día y se midió el contenido de materia seca. La caída de oocistos en las heces se determinó diariamente mediante el equipo ProSpecT ELISA. Los signos clínicos incluyendo la temperatura del cuerpo, condición general (depresión, etc.), anorexia, estado de hidratación consistencia fecal (diarrea, etc.), y muerte se evaluaron diariamente (ver el Ejemplo 12 para el registro de signos clínicos) . Todas las crías que murieron o se eutanizaron se sometieron a necropsia y análisis del intestino y el contenido de intestino para el rotavirus bovino, coronavirus, E. colLr Salmonella spp. , y C. parvum. Caida de Oocisto La Tabla 1 muestra la detección de la caída de oocisto de C. parvum mediante la ELISA de oocisto completo. +· 205 206 207 208 20S 210 211 212 control Día + - - - - - - - -0 Día + - - - - NS - -1 Día + - - - - - + - -2 Día + - - - + - + - + 3 Dia + - +* - + - + - + 4 Dia + - D - D - D - + 5 Dia + - D - D - D - + 6 D = muerte +* heces recolectadas antes de la muerte en el Dia NS = ninguna muestra de evacuación IDs de número par = no estimulada Signos Clínicos Todos los " controles ' sin estimular permanecieron sanos durante el período de estudio. Todas las crías en el grupo estimulado desarrollaron signos clínicos consistentes con criptosporidosis mediante la post-estimulación del día 4. Tres crías en el grupo estimulado murieron antes del final del estudio (1 en el Día 4 y 2 en el Día 5) . La 4a cría en el grupo estimulado se eütanizó y la terminación del estudio (día 6) ya que cumplió los criterios para la eutanasia como se establecieron previamente. La temperatura, depresión, diarrea, anorexia y deshidratación se monitorean y se caracterizaron como es descrito en el Ejemplo 15. La temperatura medía entre los grupos varían menor que 1°F en cualquier punto del tiempo y varió entre 101.57 -103.5°F en el grupo estimulado y entre 101.53 - 102-78°F en el grupo no estimulado, todo dentro de los limites clínicamente normales. Todas las crías no estimuladas permanecieron brillantes y alertas. Las crías estimuladas comenzaron a mostrar depresión en el día 2 (-2/4) y en los días 2-5, las 3 crías restantes en el grupo estimulado continuaron exhibiendo depresión. La única cría restante en el día 6 fue aun deprimida al final del estudio. Todas las crías en el grupo estimulado exhibieron una diarrea consistente con criptosporidiosis : amarillosa, espumosa, aguada y en grandes volúmenes. La diarrea en este grupo inició en el Día 2 y continuó hasta el final del estudio. En una diarrea transiente en una de las crías no estimuladas en el Día 3 y nuevamente en el Día 5, que se resolvió al final del estudio. La diarrea fue probablemente el resultado de la captación nutricional puesto que la cría no exhibió otros' signos de criptosporidiosis. Todas las crías en el grupo no estimulado, excepto una en el Día 3, tuvieron buenos apetitos y se amamantaron agresivamente (botella de cría) . La cría que fue anoréxica en el Día 3 (correspondiente con su 1° día de diarrea) se alimentó con un alimentador esofágico en ese día solamente, y luego regresó a las alimentaciones de botella de cría normales. Todas las crías en el grupo estimulado fueron anoréxicas por el Dia 3 y continuaron siendo anoréxicas hasta el final del estudio. Ninguna de las crias en el grupo no estimulado exhibieron deshidratación clínica. Una cría en el grupo estimulado, comenzó a exhibir deshidratación clínica en el día 2 y todas las crías en ese grupo fueron clínicamente deshidratadas por el Día 3 y permanecieron de esta manera hasta el final del estudio. Los resultados de los parámetros hematológicos que - induzcan la deshidratación (hematocrito) como se muestra en la Figura 18. Los niveles de hematocrito en las crías no estimuladas permaneció constante después del Día 1, mientras que el hematocrito en las crías estimuladas se incrementó en el Día 2 y permaneció más alto que en las crías de control en los Días 4, 5 y 6. En el día de nacimiento (Día - 1), el hematocrito medio de las crías no estimuladas fue de 41.0%. Este disminuyó en el Día 0 y mantuvo en niveles de entre 32.0 - 37.5% para el resto del período del estudio. Las crías estimuladas tuvieron un hematocrito medio de 37.8% en el día de nacimiento (Día - 1) que luego descendió en los días 0-3 a entre 29.5-35-0%. En el día 4 después de la estimulación, el hematocrito medio tuvo un incremento clínicamente significante a 41.7%. La Figura 18 muestra las diferencias diarias en hematocrito por grupo. Los valores para los Días 5 y 6 representan los resultados para una cría.

La proteína de plasma total (TP) en las crías no estimuladas permaneció constante a través del estudio, que varía de una media de 6.45 en el Día - 1 (pre-estimulación) a una baja de 5.85 en el Día 0 (tiempo de estimulación 24 horas de edad) . Las crías estimuladas iniciaron 6.4 en el Día-1 y alcanzaron su nivel más alto en el Día 2 (7.0) y permanecieron más altas que las crías de control por todo el período del estudio. El contenido de materia seca fecal, como un % de volumen, permaneció casi constante en las crías de control, mientras que las crías estimuladas comenzaron a tener una-tendencia hacia abajo (menor % de diarrea que iguala la materia seca) en el Día 2, que continua a través del final del estudio. Las crías estimuladas tuvieron consistentemente menor contenido de materia seca, por 6-39%, que las crías de control. El contenido de materia seca fecal media en las crías no estimuladas varía de 39.9% en el punto de tiempo de pos-parto de 24 horas a 51.7% en la recolección de la muestra de la mañana del Día 2. El contenido de materia seca fecal media en las crías estimuladas varía de 28.4% en el punto de tiempo de pos-parto de 24 horas a 41.0% en la recolección de muestras de la mañana del Día 2, disminuyendo permanentemente después a una media baja de 9.6% en la recolección de muestra e La tarde del Día 4. La Figura 19 ilustra las diferencias diarias en el % de materia seca fecal por grupo.

Las crias de control permanecieron negativas a la infección de C. parvum por todo el periodo del estudio. Las crias estimuladas dejaron caer oocistos de C. parvum y las crias estimuladas con C. parvum desarrollaron signos clínicos de criptosporidiosis . Los controles no estimulados permanecieron sanos . Ejemplo 15: Demostración de la eficacia de varias vacunas de proteínas subunitarias de C. parvum por la vía de la estimulación de la cría Basado en los signos clínicos significativamente menos severos observados en las crías alimentadas con calostro de vacas vacunadas contra crías alimentadas con calostros de vacas de control, seis grupos de crías se seleccionaron: GST-P21 (grupo 1); His-P21 (grupo 2); GST-15/60' (grupo 3); His-15/60 (grupo 4); GST-C& + GST-C15/60 (grupo 5) ; vacuna de Placebo (grupo 6) . Aproximadamente ocho animales estuvieron en cada grupo de tratamiento. Antes de la primera toma de calostro, las crías recién nacidas se sangraron para serología, y se observaron para el peso del cuerpo, temperatura del cuerpo, materia fecal y otras observaciones clínicas (es decir, anorexia, depresión, diarrea) . El primer calostro se alimentó en aproximadamente 3 horas de edad mediante amamantamiento de la cría o tubo esofágico. El segundo calostro se administró aproximadamente 12 horas después. La estimulación de C. parvum (107 oocistos) se proporcionó en aproximadamente 24 horas de edad. La observación de las crias ocurrió cuatro veces al día, tiempo durante el cual las muestras de sangre se obtuvieron, la temperatura del cuerpo y las observaciones clínicas se monitorearon y se realizó la recolección de las heces. Todas las crías se estimularon mediante la administración oral de 108 oocistos de C. parvum 24 horas después del tiempo de nacimiento. Sesenta a 100 mi del reemplazador de leche de cría se administró a la cría por la vía del cuidador de la cría limpia o el tubo esofágico limpio .inmediatamente antes de la estimulación. Esto fue seguido por el material de estimulación, que luego ' fue seguido por un enjuague de 40-100 mi de agua o el reemplazador de leche de cría. Las crías se observaron para signos clínicos inmediatamente antes de la estimulación y luego cuatro veces al día en aproximadamente al mismo tiempo cada día durante 6 días de ' post-estimulación. Las observaciones clínicas incluyeron la temperatura rectal, condición general, anorexia, diarrea, deshidratación y muerte. Serología La ELISA de detección de anticuerpo P21 usada para generar los datos para la gráfica mostrada en la Figura 20 es una ELISA competitiva indirecta, que significa que OD' s más altos corresponden por niveles de anticuerpo más bajos, y OD' s más bajo corresponden con niveles de anticuerpo más alto. Las crias en este estudio fueron naive en el día-1, pero mostraron seroconversión después de recibir los calostros de prueba que contienen anticuerpos P21 (GST-P21, His-P21, y el combo) . Las crias que recibieron calostro que contiene GST-15/60, His-15/60 y anticuerpos de placebo todos permanecieron negativos para los anticuerpos P21 por todo el periodo de observación de 6 días. La ELISA de detección de anticuerpo- CP15/60 es una ELISA directa, de esta manera OD' s altos corresponden con altos niveles de anticuerpo y OD' s bajo corresponden con bajos niveles de anticuerpo (Figura 21) . Todas las crías fueron naive en el Día-1. Las crías que recibieron calostro que contiene anticuerpos 15/60 (GST-15/60, His-15/60 y el combo) todos mostraron seroconversión rápida. Los valores ligeramente incrementados para la cría que reciben calostros que contienen P21 y anticuerpos de placebos es común, y se planteó como hipótesis que es antecedente debido a la reactividad cruzada, una limitación de la ELISA. Sin considerar, las crias que recibieron el calostro que contiene P21 y los anticuerpos de placebo permanecieron negativos por todo el período de observación de 6 días. Diagrama de Registro de Enfermedad Total El registro de enfermedad total es una acumulación de todos los signos clínicos (diarrea, anorexia y depresión) observados en este estudio durante un período de 6 dias (cuatro observaciones por dia) . Este diagrama, en conjunción con otros datos, indicó que las vacunas GST-P21 y His-P21 no tuvieron efecto protector. Sin" embargo, la vacuna GST-15/60 muestra una reducción no moderada pero significante en los signos clínicos. Esta protección puede ser observada más claramente en la Figura 22. Con los otros datos de vacuna removidos, es evidente que las crías que recibieron calostros que contienen anticuerpos GT-15/60 fueron consistentemente menos enfermos (es decir, mostraron menos signos clínicos) por toda la mayoría del período de observación de 6 días (Figura 23) . Diarrea Cuatro veces al día a las crías se les dio un registro que se correlaciona con el tipo de diarrea observada. En la observación 10, hubo cuatro crías en el grupo de placebo con registro de diarrea de uno, así el registro total para esa observación es 4. Todas las crías llegaron a ser sintomáticas para diarrea, sin considerar de que grupo estuvieron, pero para la mayoría del estudio de 6 días, el grupo GT-15/60 registró menor que el grupo de placebo. La diferencia entre los grupos fue especialmente evidente en las observaciones 6-11. La Figura 24 es un diagrama sombreado que muestra la distribución relativa de diarrea para todas las crías en el estudio. El diagrama sombreado muestra la distribución relativas de todas las crias y se generó al promediar los 24 registros de enfermedad para cada cria (cada circulo negro lleno representa una cria en ese grupo de tratamiento) , y entonces el promedio y sus valores para obtener un promedio para el grupo de tratamiento (representado por un cuadro púrpura lleno) . Si más que un punto de dato ocupa el mismo espacio, el número de puntos de" datos sobrepuesto es indicado por el sobreindice. El promedio para GST-15/60 es menor que aquel del placebo y los valores de GST-15/60 están más estrechamente agrupados (cuatro de los puntos de datos se sobreponen con el promedio para el grupo) . El grupo His-15/60 también se mantuvo bien, teniendo un promedio mucho menor que el placebo o los otros grupos, aunque el agrupamiento total de los valores no es tan cercano como GST-15/60. Anorexia Después del segundo dia de estudio, cualquier cria que se amamanta con menos de 2 litros de leche y que requiere un tubo esofágico se registró como anoréxico (las observaciones de anorexia durante los primeros dos días de vida se registraron, pero no se analizaron) . Las crias en el grupo GST-15/60 no tuvieron anorexia por toda la mayoría del estudio, en contraste con el grupo de placebo, que frecuentemente contuvo dos o tres crias anoréxicas . La Figura 25 muestra un diagrama sombreado que representa la distribución relativa de todos los registros de anorexia totales de las crias, para todas las vacunas. El GST-15/60 tiene el agrupamiento más cercano asi como el promedio más bajo de todos los grupos en el estudio. Depresión Cuatro veces al dia, las crias se observaron y se les dio un registro que se correlaciona con su condición. El número de crias sanas en el grupo de GST-15/60 fue mayor que aquel del grupo de placebo. Se debe observar que ninguna de las crias en cualquier grupo registró más alto que un registro de condición de „ 1 . (apático) en cualquier observación. Asi, el registro de 3 en la observación 21 para el grupo de placebo indica tres crias con registros de 1, ninguna cria con un registro de 3. La Figura 26 muestra la distribución de los registros de condición general totales para cada cria. El grupo GST-15/60 muestra un aditamento mucho más cercano que los otros grupos de vacuna, asi como tener una ocurrencia promedio muy baja como e's comparado con el placebo. De manera interesante, el grupo de vacuna combo (que consistió de GST-P21 y GST-15/60) también se muestra bien, aunque los resultados para la vacuna de GST-P21 se miran similares a aquellas del placebo. Los resultados sugieren que la vacuna GST-15/60 mejora la condición general. Materia Seca Fecal La materia fecal total se recolectó (cuatro veces al día), se acumuló y se secó para ese día. La cantidad de materia seca total fue ligeramente más alta en el grupo GST-15/60 que en el grupo de placebo para la mayor parte del estudio, indicando una ocurrencia reducida de diarrea en el grupo GST-15/60, aunque todos los animales llegaron a ser sintomáticos. La Figura 27 es un diagrama sombreado que muestra el registro de materia seca fecal promedio para cada cria, para todas las vacunas. Los grupos de vacuna que contienen 15/60 todos muestran agrupamiento cercano y una cantidad promedio más alta que el grupo placebo. Calda de Qocistos La Figura 28 muestra la calda de oocistos como es determinado por el equipo de ELISA ProSpect (nada de conteo de oocistos microscópicos directos) . Como se observa antes en otros signos clínicos (tal como la diarrea) , todos los animales en el estudio llegaron a ser sintomáticos. Sin embargo, la caía del oocisto en el grupo His-15/60 se presenta que es retardado como es comparado con el grupo de placebo . Ejemplo 16: Ihmu ogenicidad y Seguridad de Vacunas que Contienen Rotavirus, Coronavirus, E. coli K99 y F41 y que Contienen el Antígeno GST-CP15/60 de C. parvum El objetivo de este estudio fue estimar, en crías susceptibles, la seguridad y la respuesta de anticuerpo inducida por dos vacunas de combinación. Un objetivo especifico del estudio fue determinar si la adición de un antigeno de subunidad de C. parvum interfiere con la respuesta inmune a otros antigenos, tal como el rotavirus bovino, coronavirus bovino, y antígenos K99 y F41 de E. colí. Para contestar estas preguntas, dos vacunas se probaron : ambas fueron adicionadas con adyuvante de aluminio/saponina y contuvieron los siguientes antigenos inactivados: rotavirus bovino, coronavirus bovino, E. coli K99 y E. coli F41. Adicionalmente, una de las vacunas contuvo un antígeno subuntiario GST-CP15/60 crudo de C. parvum, producido en E. coli. Dos grupos de crias se vacunaron dos veces con 5 mi de su tratamiento respectivo, en un intervalo de 28 dias . Otras 2 crias sirvieron como controles ambientales. Temperaturas Rectales La Figura 29 muestra la evolución de la temperatura rectal promedio en animales vacunados y controles después de la primera y la segunda vacunación, üna fase transiente de hipertemia se observó, en los "dos grupos vacunados, con un máximo dentro de 24 horas después de la primera y la segunda vacunación. El incremento máximo promedio de la temperatura rectal después de la Ia vacunación (Amax 1= T° en máximo 1-T° a DO) fueron de 1.4 y 1.3°C para la combinación + cripto y para el combó solo, respectivamente. Ninguna de las crias tuvo un Amax = 2.0°C. El incremento máximo promedio de la temperatura rectal después de la segunda vacunación (Amax2=T° en máximo 2-Tc en D28) fueron 1.4 y 1.1°C. Ninguna de las crias tuvo un Amax = 2.0°C. De manera interesante, las crias de control también tuvieron un incremento a temperatura después de las vacunaciones. El incremento fue limitado (0.4 a 0.5°C en promedio) y fueron probablemente debido al manejo de los animales . Esto sugiere que la hipertemia máxima específicamente atribuible a las vacunas es de aproximadamente 1.0°C. Reacciones Locales (in vivo) La Figura 30 muestra la evolución del tamaño promedio de las reacciones locales después de la primera vacunación. La figura 31 muestra la evolución del tamaño promedio con las reacciones locales después de la segunda vacunación. Con la excepción de la primera vacunación en una cría que recibe el combo +'-cripto en una reacción local fuerte apareció en corto después de ambas inyecciones en todos los animales vacunados. Las reacciones locales fueron máximas aproximadamente 24-48 horas después de la vacunación y permanecieron fuertes durante una semana.- Luego, una reducción rápida del tamaño de reacción se observó. En todos los casos, las reacciones locales han desaparecido, o fueron más limitadas, 3 semanas después de la vacunación. Las reacciones locales fueron alguna vez acompañadas con un agrandamiento transiente ligero del nodo linfático drenado.

Los grupos vacunados se compararon mediante ANOVA para la reacción local en diferentes puntos del tiempo (Ia inyección Di, D21; 2a inyección D29, D49) . Ninguna de las diferencias fueron significantes. Serologia Los títulos de anticuerpo de . C. parvum medios se representa en la Figura 32. Como es esperado, todas las crías vacunadas sin cripto permanecieron negativos para los anticuerpos a C. parvum. La seroconversión se observó en 3 de los 6 animales cripto vacunados después de la primera vacunación. Catorce días después de la segunda vacunación, una fuerte seroconversión ser observó en todas las crías vacunadas. En el día 42, los títulos de anticuerpo CP15/60 promedio fueron de 2.66; una cría que es un deficiente respondedor con un título de 1.4. Los resultados de ELISA para las respuestas de anticuerpo a coronavirus bovino (BCV) se muestra en la Figura 33. Las seroconversiones se observaron en todas las crías vacunadas 14 días después de la primera vacunación. En D42 (14 -días después de ,1a vacunación de refuerzo) todas las crías vacunadas tuvieron títulos de anticuerpo ELISA muy altos. En los ensayos de seroneutralización, el suero de casi todas las crías neutralizó el virus en todas las diluciones probadas (título > 3.84 (log CCID 50/ml) (Figura 34). Los títulos de anticuerpo de ELISA medios a BCV fueron de aproximadamente 10% menores que la vacuna de Combo + Cripto como es comparado con la vacuna, combo sola en cada punto del tiempo. Esta diferencia fue significante (p=0.01) a D49. Los resultados de ELISA para la respuesta de anticuerpo a rotavirus bovino (BRV) se muestran en la Figura . En D28, las seroconversiones fueron detectables en 4/6 y 5/5 de los animales vacunados del grupo combo + cripto y -el grupo combo, respectivamente. En D49, todas las crías vacunadas tuvieron títulos de anticuerpo de ELISA altos. Los títulos de ELISA en D49 fueron más homogéneos en el grupo Combo (StD=0.12) que en el grupo Combo + Cripto (StD=0.46) y los títulos de ELISA medios fueron de aproximadamente 15% más altos. Las diferencias entre los grupos (ANOVA=mediciones repetidas) fueron significantes (p=0.05). La evolución de los títulos de neutralización para BRV se muestra en la Figura 36. Todas las crías vacunadas tuvieron títulos de anticuerpo anormalmente altos en D14. Esos títulos se redujeron a valores más normales en D28, con todas las crías que se han seroconvertido en ese tiempo. En D49, el título promedio (log CCID 50/ml) fue de 1.9 para el combo + cripto y 2.2 para el grupo combo solamente. Esta diferencia de aproximadamente 18% fue significante (p=0.01). Evolución de títulos de ELISA para F5-K99 de E. col! se presenta en la Figura 37. En D28, las seroconversiones fueron detectables en 4/6 y 3/5 de los animales vacunados del grupo combo + cripto y el grupo combo, respectivamente. Sin embargo, los títulos de ELISA de las crías que se han seroconvertido fueron mucho más altas en el grupo combo. En D49, el título promedio (log OD 50%) fueron de 2.56 para el combo + cripto y 3.91 para el grupo combo solo. Esta diferencia de aproximadamente 40% fue altamente significante (p=0.002). La evolución de títulos de ELISA para E. coli F41 se presenta en la Figura 38. En D28, las seroconversiones fueron detectables en todos los animales vacunados de ambos grupos. En D49, los títulos fueron mucho más homogéneos y fueron más altos en el grupo combo solamente. Los títulos promedio en D49 (log OD 50%) fueron 2.57 para el combo + cripto y 3.67 para el grupo combo solo. Esta diferencia de aproximadamente 40% fue altamente significante (p=0.005). En promedio, ambas vacunas indujeron una hipertemia transiente moderada después de cada una de las inyecciones. No se observó otra reacción sistémica. Ambas vacunas indujeron fuertes reacciones locales que se redujeron a tamaño muy aceptables dentro de 2 semanas . Las reacciones fueron más pronunciadas en la segunda vacunación, sin considerar la naturaleza de la vacuna. Ambas vacunas indujeron la producción de anticuerpos contra todos sus componentes de antígenos respectivos. Con la excepción de anticuerpos para C. parvum. las respuestas de anticuerpo fueron siempre más altas con ' la vacuna sola de combo que con la vacuna de combo + cripto.

Esta diferencia es muy particularmente clara cuando se observa los anticuerpos para E. coli K99 y para E. coli F41, para la cual la adición del antigeno Cripto en la vacuna estuvo asociado con una reducción de 40% (en log) de ' la respuesta de anticuerpo. Estos resultados claramente sugieren que la interferencia del antígeno cripto (especialmente en E. coli K99 y F41, y posiblemente las respuestas de anticuerpo BRV) es significante, y podría impactar la protección .

Consecuentemente, esta adición puede requerir la redefinición de la dosis de antígeno para las fracciones de E. coli K99, F41 y BRV. Aunque la invención anterior se ha descrito en algún detalle a manera de ilustración y ejemplo para propósitos de claridad y entendimiento, será evidente para aquellos expertos en la técnica que ciertos cambios y modificaciones pueden .ser practicados. Por lo tanto, la descripción y los ejemplos no deben ser considerados como limitativos del alcance de la invención, que es delineado por las reivindicaciones adjuntas. REFERENCIAS Tzipori S. The relative importance of enteric pathogens affecting neonates of domestic animáis.. Adv Vet Sci Corp Med, 29 ():103-206. 1985 Angus K W. Crypasopridiosis in Ruminants. In: Crypasopridiosis of man y animáis (Edited by Dubey J P, Speer C A & Fayer R) , pp 83-103. CRC Press, Bosan. 1990. De la Fuente R; Luz'on M; Ruiz-Santa-Quiteria JA; García A; Cid D; Orden JA; García S; Sanz R; Gómez-Bautista M.

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Claims

]¾EIVIKPIC¾.CIONES 1. Una composición inmunológica, inmunogénica o de vacuna entérica, combinada, caracterizada porque comprende un primer antigeno o epitope de interés de Cryptosporidium y/o un primer vector que expresa el primer antigeno o epitope de interés, y un segundo antigeno o epitope de interés de otro patógeno entérico y/o el primer vector que expresa el primer antigeno o epitope de interés también expresa el segundo antigeno o epitope de interés y/o un segundo vector que expresa el segundo antigeno o epitope de interés y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
2. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque comprende un antigeno de Cryptosporidium parvum y un antigeno de otro patógeno entérico.
3. La composición de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque comprende un antigeno de Cryptosporidium y un antigeno de otro patógeno entérico de una especie bovina.
4. La composición de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque comprende un antigeno de Cryptosporidium y un antigeno de un patógeno entérico de una especie canina.
5. La composición de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque comprende un antigeno de Cryptosporidium y un antigeno de un patógeno entérico de una especie felina.
6. La composición de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada" porque comprende un antigeno de Cryptosporidium y un antigeno de un patógeno entérico de una especie equina.
7. ' La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el antigeno del patógeno entérico se selecciona del grupo que consiste de los antigenos de E. coli,. rotavirus, coronavirus, Clostridium spp y mezclas de los mismos.
8. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el patógeno entérico comprende E. coli.
9. La composición de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque el antigeno de E. coli comprendé un antigeno seleccionado del grupo que consiste de E. coli inactivado que lleva antigeno K99, E. coli inactivado que lleva antigeno F41, E. coli inactivado que lleva antigeno Y, E. coli inactivado que lleva antigeno 31A, antigeno K99f antigeno F41, antigeno Y, antigeno 31A y mezclas de los mismos .
10. La composición de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque el antigeno de E. coli comprende un antigeno 99 seleccionado del grupo que consiste de E. coli inactivado que lleva el antigeno K99, antigeno K99 y mezclas de los mismos; y/o un antigeno F41 seleccionado del grupo que consiste de JE. coli inactivado que lleva el antigeno F41, antigeno F41 y mezclas de los mismos.
11. La composición de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque el patógeno entérico comprende coronavirus bovino.
12. La composición de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque el patógeno entérico comprende rotavirus bovino.
13. La composición de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque el patógeno entérico comprende Clostridium perfringens .
14. La composición de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque el antigeno del patógeno entérico comprende toxoides tipo C y/o D de Clostridium perfringens .
15. La composición de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque el patógeno entérico comprende E. coli, rotavirus bovino, coronavirus bovino, y Clostridium perfringens o E. coli, rotavirus bovino/ coronavirus bovino .
16. La composición de conformidad con - la reivindicación 15, caracterizada porque el antigeno del patógeno entérico comprende antigenos E. coli seleccionados del grupo que consiste de E. coli inactivado que lleva antigeno K99, E. coli inactivado que lleva antigeno F41, E. coli inactivado que lleva antigeno Y, E. coli inactivado que lleva antigeno 31A, 'antigeno K99, antigeno F41, antigeno Y, antigeno 31A y mezclas de los mismos; coronavirus bovino inactivado; rotavirus bovino inactivado y toxoides tipo C y/o D de Clostridium perfringens; o antigenos de E. coli seleccionados del grupo que consiste de E. coli inactivado que lleva antigeno 99, E. coli inactivado que lleva antigeno F41, E. coli inactivado que lleva antigeno Y, E. coli inactivado que lleva antigeno 31A, antigeno K99, antigeno F41, antigeno Y, antigeno 31? y mezclas de los mismos; ¦ coronavirus bovino inactivado; y rotavirus bovino inactivado.
17. La composición de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada porque el antigeno de E. coli comprende un antigeno K99 seleccionado del grupo que consiste de E. coli inactivado que lleva el antigeno K99, antigeno K99 y mezclas de los mismos; y/o un antigeno F41 seleccionado del grupo que consiste de E. coli inactivado que lleva antigeno F41, antigeno F41 y mezclas de los mismos.
18. La composición de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque comprende antigenos subunitarios de Cryptosporidium parvum seleccionados del grupo que consiste de P21, Cp23, Cpl5/60, CP41 y mezclas de los mismos .
19. La composición de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque comprende antigenos subunitarios de Cryptosporidium parvum seleccionados del grupo que consiste de P21, Cp23, Cpl5/60, CP41 y mezclas de los mismos.
20. La composición de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada porque comprende antigenos subunitarios de Cryptosporidium parvum seleccionados del grupo que consiste de P21, Cp23, Cpl5/60, CP41 y mezclas de los mismos.
21. La composición de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada porque comprende Cp23 y Cpl5/60.
22. La composición de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada porque comprende Cp23 y Cpl5/60.
23. La composición de conformidad con la reivindicación 20, caracterizada porque comprende Cp23 y Cpl5/60.
24. La composición de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada porque comprende P21 y Cpl5/60.
25. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque además comprende un adyuvante .
26. La composición de conformidad con la reivindicación 15 caracterizada porque además comprende un adyuvante .
27. La composición de conformidad con la reivindicación 26, caracterizada porque el adyuvante comprende saponina.
28. La composición de conformidad con la reivindicación 26, caracterizada porque el adyuvante comprende hidróxido de aluminio.
29.. La composición de conformidad con la reivindicación 26, caracterizada porque la composición está en la forma de una emulsión de aceite en agua.
30. Una composición inmunológica, inmunogénica o de vacuna contra Cryptosporidium parvum, caracterizada porque comprende un primer antígeno que comprende un antígeno P21 o Cp23 o un epítope del mismo o un primer vector que expresa el primer antigeno y un segundo antígeno que comprende antígeno Cpl5/60 o epítope del mismo o el primer vector en donde el primer vector expresa tanto el primero como el segundo antígeno o un segundo vector que expresa el segundo antígeno, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
31. La composición de conformidad con la reivindicación 30, caracterizada porque los antígenos P21 o Cp23 y Cpl5/60 están en la forma de proteínas de fusión separadas .
32. La composición de conformidad con la reivindicación 30, caracterizada porque comprende un vector que expresa P21 y Cpl5/60.
33. La composición de conformidad con la reivindicación 30, caracterizada porque comprende un vector recombinante que expresa P21 y un vector recombinante que expresa Cpl5/60.
34. La composición de conformidad con la reivindicación 30, caracterizada porque comprende Cp23 y Cpl5/60.
35. La composición de conformidad con la reivindicación 30, caracterizada porque además comprende un adyuvante .
36. Una composición inmunológica, inmunogénica o de vacuna contra Cryptosporidium parvum, caracterizada porque comprende un primer antigeno que comprende un antigeno P21 o Cp23 o Cpl5/60 o CP41 o un epitope del mismo o un primer vector que expresa el primer antigeno y un segundo antigeno que comprende un segundo antigeno epitope del mismo de Cryptosporidium parvum o el primer vector en donde el primer vector expresa tanto el primero como el segundo antigeno o un segundo vector que expresa el segundo antigeno, en donde el primero y el segundo antigeno son diferentes, entre si y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
37. Un método de inmunización bovina de una cria recién nacida contra enfermedad entérica, caracterizado porque comprende administrar la composición de conformidad con la reivindicación 1 a una vaca preñada antes del parimiento, de modo que la cría recién nacida tiene anticuerpos maternales contra Cryptosporidium parvum.
38. El método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado porque además comprende la alimentación a la cría recién nacida de calostro y/o leche de la vaca que se le ha administrado la composición durante la preñez. ·
39. Un método de inmunización activa de bovinos .adultos y recién nacidos, caracterizado porque comprende administrar a los bovinos una composición de conformidad con la reivindicación 1.
40. El método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado porque además comprende administrar la composición a la cría recién nacida.
41. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque además comprende administrar la composición a la cría recién nacida.
42. El método de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque la composición administrada a la vaca comprende antígenos o epítopes de los mismos y la composición administrada a la cría comprende vectores .
43. El método de conformidad con la reivindicación 41, caracterizado porque la composición administrada a la vaca comprende antígenos o epitopes de los mismos y la composición administrada a la cria comprende vectores.
44. Un método para preparar una composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende mezclar los antigenos o epitopes o vectores y el portador. .
45. Un equipo para preparar una composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende los antigenos, epitopes o vectores cada uno en un recipiente o recipientes ° separados, opcionalmente empaquetados conjuntamente; y además opcionalmente con instrucciones para la mezcla y/o administración.
46. Una composición de calostro y/o leche hiperinmunizada, caracterizada porque se obtiene al administrar una composición de conformidad con la reivindicación 1 a una vaca preñada y después remover el calostro y/o leche.de la vaca.
47. La composición de conformidad con la reivindicación 46, caracterizada porque la composición comprende inmunoglobulinas concentradas obtenidas mediante la coagulación del calostro y/o leche y la recuperación de inmunoglobulinas .
48. Un método para prevenir, tratar y/o. controlar la enfermedad entérica, síntoma (s) y/o condición (es) y/o patógeno (s) responsables para tal enfermedad, síntom (s) y/o condición (es) y/o C. parvum, caracterizado porque comprende la administración a una cria recién nacida de la composición de la reivindicación 46.
49. Un método para prevenir, tratar y/o controlar la enfermedad entérica, síntoma (s) y/o condición (es ) y/o patógeno (s) responsables para tal enfermedad, síntoma (s) y/o condición (ess) y/o C. parvum, caracterizado porque comprende la administración a una cría recién nacida de la composición de la reivindicación 47.
50. El método .dé conformidad con la reivindicación 48, caracterizado porque la administración es por administración oral.
51. El método de conformidad con la reivindicación 49, caracterizado porque la administración es por administración oral.
52. El método de conformidad con la reivindicación 50, caracterizado porque la administración oral es mediante el amamantamiento de la cría recién nacida a partir de la vaca.
53. ün método para preparar una composición de calostro y/o leche hiperinmunizada, caracterizado porque comprende administrar una composición de conformidad con la reivindicación 1 a una vaca preñada y después remover el calostro y/o leche a partir de la vaca. 5 . El método de conformidad con la reivindicación 53, caracterizado porque además comprende concentrar las inmunoglobulinas en la leche y/o calostro obtenido de la vaca mediante la coagulación del calostro y/o leche y la recuperación de inmunoglobulinas, mediante lo cual la composición comprende las inmunoglobulinas . 55. Un método para usar un primer antigeno o epitope de Cryptosporidium y/o un vector que expresa tai antigeno o epitope, y un segundo antigeno o epitope de otro patógeno entérico y/o' un vector que expresa tal antigeno o epitope, para la preparación de una composición inmunogénicá o de vacuna contra infecciones entéricas, caracterizado porque comprende mezclar el primer antigeno o epitope y/o vector y el segundo antigeno o epitope y/o vector.